JPS6188880A - 形質導入方法 - Google Patents
形質導入方法Info
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- JPS6188880A JPS6188880A JP59209060A JP20906084A JPS6188880A JP S6188880 A JPS6188880 A JP S6188880A JP 59209060 A JP59209060 A JP 59209060A JP 20906084 A JP20906084 A JP 20906084A JP S6188880 A JPS6188880 A JP S6188880A
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- Japan
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- phage
- plasmid
- strain
- medium
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、形質導入可能な複合シラスミドに関し、更
に詳しくは、コリネホルムグルタミン酸生産性細菌を宿
主とする形質導入可能な複合プラスミドに関する。
に詳しくは、コリネホルムグルタミン酸生産性細菌を宿
主とする形質導入可能な複合プラスミドに関する。
コリネホルムグルタミン酸生産菌には大量のL−グルタ
ミン酸を生産するもの及び特にその変異株はリジン等の
アミノ酸、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産す
るものが知られていて工業的に重要な微生物である。最
近、DNA組換え技術による工業微生物の育種・改良が
試みられており、コリネホルムグルタミン酸生産菌につ
いても、組換えDNA技術の開発が進められつつある。
ミン酸を生産するもの及び特にその変異株はリジン等の
アミノ酸、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産す
るものが知られていて工業的に重要な微生物である。最
近、DNA組換え技術による工業微生物の育種・改良が
試みられており、コリネホルムグルタミン酸生産菌につ
いても、組換えDNA技術の開発が進められつつある。
例えば昭和58年度日本農芸化学会大会講演要旨集33
3頁(1983) 、昭和58年度日本醗酵工学会大会
講演要旨集283頁、284頁(1983)にそれぞれ
コリネバクテリウム・グルタミクムの宿主−ベクター系
の開発、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
宿主−ベクター系の開発とスレオニ/生産菌育種の例が
報告されている。
3頁(1983) 、昭和58年度日本醗酵工学会大会
講演要旨集283頁、284頁(1983)にそれぞれ
コリネバクテリウム・グルタミクムの宿主−ベクター系
の開発、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
宿主−ベクター系の開発とスレオニ/生産菌育種の例が
報告されている。
しかるに従来知られているコリネホルムグルタミン酸生
産゛性細菌の宿主−ベクター系においては、いずれもベ
クターとしてプラスミドを用いるものであり1従って、
このプラスミドベクターを宿主に移入せしめるためには
、先ずこのプラスミドベクターを分離し、ついでプロト
プラスト法、カルシウム処理法などの煩頂な形質転換手
段が必要である。
産゛性細菌の宿主−ベクター系においては、いずれもベ
クターとしてプラスミドを用いるものであり1従って、
このプラスミドベクターを宿主に移入せしめるためには
、先ずこのプラスミドベクターを分離し、ついでプロト
プラスト法、カルシウム処理法などの煩頂な形質転換手
段が必要である。
ところでエシェリヒアコリにおいてはラムダフアージ由
来の付着末端(Cohesive end:Co5)を
含むDNA領域をもつ組換えプラスミドであるいわゆる
コスミドが構築されている。(Fukumaki *
Y、 +Sh1mada + K−+ Takag%+
Y:Proc、Natl、Acad、Sei、。
来の付着末端(Cohesive end:Co5)を
含むDNA領域をもつ組換えプラスミドであるいわゆる
コスミドが構築されている。(Fukumaki *
Y、 +Sh1mada + K−+ Takag%+
Y:Proc、Natl、Acad、Sei、。
73 、3238 (1976) 、 Co11ins
、J、Hohn 、 B:Proc、Natl、Aca
d、Scl、 75 、4242 (1978) )こ
のコスミドは、ファージを用いた形質導入法(ここでは
形質導入法はファージを介した遺伝子の移入と定義づけ
る(蛋白質核酸酵素別冊″′細菌・ファージ遺伝実験法
”P 64 (1972) )でその保持菌株から容易
に別の菌株に移入せしめることができるのが特長である
。即ちコスミド保持株にファージを感染させると一定の
割合でコスミドDNAを含む偽ファージ粒子が形成され
、この粒子は新たな宿主菌にコスミドDNAを導入する
活性をもつというものである。コスミPを用いると、供
与菌のファージ溶菌液を調製後受容菌と混合し、感染さ
せればよ〈従来のプラスミドを用いる場合に比べ迅速か
つ簡便にプラスミドの移入を達成することができる。
、J、Hohn 、 B:Proc、Natl、Aca
d、Scl、 75 、4242 (1978) )こ
のコスミドは、ファージを用いた形質導入法(ここでは
形質導入法はファージを介した遺伝子の移入と定義づけ
る(蛋白質核酸酵素別冊″′細菌・ファージ遺伝実験法
”P 64 (1972) )でその保持菌株から容易
に別の菌株に移入せしめることができるのが特長である
。即ちコスミド保持株にファージを感染させると一定の
割合でコスミドDNAを含む偽ファージ粒子が形成され
、この粒子は新たな宿主菌にコスミドDNAを導入する
活性をもつというものである。コスミPを用いると、供
与菌のファージ溶菌液を調製後受容菌と混合し、感染さ
せればよ〈従来のプラスミドを用いる場合に比べ迅速か
つ簡便にプラスミドの移入を達成することができる。
しかしながら、コリネホルムグルタミン酸生産菌に卦い
ては、このような形質導入できるようなベクターの例は
なく、形質導入法によるプラスミドの移入はできなかっ
た。
ては、このような形質導入できるようなベクターの例は
なく、形質導入法によるプラスミドの移入はできなかっ
た。
本発明者らは叙上のような状況下においてコリネホルム
グルタミン酸生産菌を宿主とするプラスミドとコリネホ
ルムグルタミン酸生産菌全宿主とするファージのDNA
断片をくみ合わせて形質導入可能な複合シラスミドを作
成するのに成功した。
グルタミン酸生産菌を宿主とするプラスミドとコリネホ
ルムグルタミン酸生産菌全宿主とするファージのDNA
断片をくみ合わせて形質導入可能な複合シラスミドを作
成するのに成功した。
即ちこの発明は、(1)コリネホルムグルタミン酸生産
性細菌の細胞内で増殖できるプラスミドの少なくとも複
製開始点を含むDNA及び、(2)該細菌が該細菌の細
胞内で増殖できるファージに感染したとき該ファージ粒
子内に取り込まれるような該ファージのDNA領域を少
くとも含むDNAよりなる形質導入可能な複合ベクター
である。
性細菌の細胞内で増殖できるプラスミドの少なくとも複
製開始点を含むDNA及び、(2)該細菌が該細菌の細
胞内で増殖できるファージに感染したとき該ファージ粒
子内に取り込まれるような該ファージのDNA領域を少
くとも含むDNAよりなる形質導入可能な複合ベクター
である。
この複合シラスミドは、コリネホルムグルタミン酸生産
性細菌細胞に形質導入法によシ、きわめて簡便迅速に移
入することができ、組換えDNA法による有用菌株の育
種に際しきわめて有利である。
性細菌細胞に形質導入法によシ、きわめて簡便迅速に移
入することができ、組換えDNA法による有用菌株の育
種に際しきわめて有利である。
コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽性桿菌で
あり、非抗酸性でパーデース・マニユアル・オブ・デタ
ーミネイティブバクテリオロジー第8版599頁(19
74)に記載されている。
あり、非抗酸性でパーデース・マニユアル・オブ・デタ
ーミネイティブバクテリオロジー第8版599頁(19
74)に記載されている。
本発明のコリネホルム・グルタミン酸生産性細菌はこれ
らのコリネホルム・バクテリアの内に大量のグルタミン
酸を生産するもの又はそれより誘導したグルタミン酸生
産性を失った変異株であり、その野性株の例としては次
のようなものがあげられる。
らのコリネホルム・バクテリアの内に大量のグルタミン
酸を生産するもの又はそれより誘導したグルタミン酸生
産性を失った変異株であり、その野性株の例としては次
のようなものがあげられる。
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATC
C14020ブレビバクテリウム・サラカロリティクム
ATCC14066ブレピパクテリウム・インマ
リオフィルム ATCC14068ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム ATCC13869ブ
レピノぐクテリウム・ロゼラム AT
CC13825ブレビバクテリウム・フラバム
ATCo 13826ブレビパクテリウム・
チオグニタリス ATCC19240コリネバ
クテリウム・アセトアシドフィルム ATC(1’
13870コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC15806コリネパクテリウム・カルナ
エ ATCC15991コリネバクテリ
ウム・グルタミクム ATCC13032,
1306(1コリネバクテリウム・リリウム
ATCC15990コリネバクテリウム・メラセ
コーラ ATCC17965ミクロバクテ
リウム・アンモニアフィラム ATCC15354
コリネホルム・グルタミン酸生産性細菌にはグルタミン
酸生産性を失なった変異株、あるいは、リジン、アルギ
ニン等のアミノ酸、イノシン等のゾリンヌクレオシド、
イノシン5′−モノりん酸等のプリンヌクレオチP1又
はその他の生産物を生産する変異株も含まれる。
C14020ブレビバクテリウム・サラカロリティクム
ATCC14066ブレピパクテリウム・インマ
リオフィルム ATCC14068ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム ATCC13869ブ
レピノぐクテリウム・ロゼラム AT
CC13825ブレビバクテリウム・フラバム
ATCo 13826ブレビパクテリウム・
チオグニタリス ATCC19240コリネバ
クテリウム・アセトアシドフィルム ATC(1’
13870コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC15806コリネパクテリウム・カルナ
エ ATCC15991コリネバクテリ
ウム・グルタミクム ATCC13032,
1306(1コリネバクテリウム・リリウム
ATCC15990コリネバクテリウム・メラセ
コーラ ATCC17965ミクロバクテ
リウム・アンモニアフィラム ATCC15354
コリネホルム・グルタミン酸生産性細菌にはグルタミン
酸生産性を失なった変異株、あるいは、リジン、アルギ
ニン等のアミノ酸、イノシン等のゾリンヌクレオシド、
イノシン5′−モノりん酸等のプリンヌクレオチP1又
はその他の生産物を生産する変異株も含まれる。
これらコリネホルムグルタミン酸生産性・細菌の細胞内
で増殖できるプラスミドとしては、どのようなものでも
よく、例えばpAM330 、 pAM286 (特開
昭58−67699参照)、I)HM1519 (@1
昭58−77895参照)、pAJ655 、 pAJ
611 。
で増殖できるプラスミドとしては、どのようなものでも
よく、例えばpAM330 、 pAM286 (特開
昭58−67699参照)、I)HM1519 (@1
昭58−77895参照)、pAJ655 、 pAJ
611 。
pAJ1844 (特開昭58−192900参照)、
りCGI (特開昭57−134500参照)、pCG
2(特開昭58−35197参照)、pCG4 、 p
cGll(特開昭57−183799参照)などがおる
。
りCGI (特開昭57−134500参照)、pCG
2(特開昭58−35197参照)、pCG4 、 p
cGll(特開昭57−183799参照)などがおる
。
コリネホルムグルタミン酸生産性細菌のAヨ胞内で増殖
できるファージも又どのようなものでもよく、例えばC
P−2、CP−3、CP−5、CP−7などJ。
できるファージも又どのようなものでもよく、例えばC
P−2、CP−3、CP−5、CP−7などJ。
Gen、Appl、Mlcroblol、、 22 1
19 (1976)に記載されているファージ、コリネ
バクテリウム・グルタミクムを宿主として見出されたφ
CGI、φCG2 。
19 (1976)に記載されているファージ、コリネ
バクテリウム・グルタミクムを宿主として見出されたφ
CGI、φCG2 。
φCG3 、φCG4 、φCG5など(日本農芸化学
会昭和58年度大会要旨集P332)”発酵と工芸”誌
35巻、198頁、294頁、392貞、473頁(1
977)に記載のファージなどがある。
会昭和58年度大会要旨集P332)”発酵と工芸”誌
35巻、198頁、294頁、392貞、473頁(1
977)に記載のファージなどがある。
本発明の複合プラスミドは、上記シラスミドDNAの全
部を複合シラスミドの一部として含んでいてもよいが、
少くとも複↓開始点を含んでいる必要がある。また、上
記ファージについてもそのDNAの全部を本発明の複合
シラスミPの一部として含んでいてもよいが、少くとも
コリネホルムグルタミン酸生産性細菌がこのファージに
より感染せしめられたとき、ファージ粒子内に取り込ま
れるようなりNA領域を少くとも含んでいる必要がある
。ファージにより宿主が感染せしめられたときファージ
粒子内に取勺込まれるようなりNA領域は、付着末端(
COS )を有していることが多い。
部を複合シラスミドの一部として含んでいてもよいが、
少くとも複↓開始点を含んでいる必要がある。また、上
記ファージについてもそのDNAの全部を本発明の複合
シラスミPの一部として含んでいてもよいが、少くとも
コリネホルムグルタミン酸生産性細菌がこのファージに
より感染せしめられたとき、ファージ粒子内に取り込ま
れるようなりNA領域を少くとも含んでいる必要がある
。ファージにより宿主が感染せしめられたときファージ
粒子内に取勺込まれるようなりNA領域は、付着末端(
COS )を有していることが多い。
プラスミドDNA及びファージDNAは通常の方法によ
シ分離することができる。ついで、ファージDNA及び
プラスミドDNAはそれぞれ制限酵素を用いて一9JI
ffrする。ファージDNAの切断断片を分画せずに全
断片を出発材料としても、目的の形質導入可能なグラス
ミドを得ることができるが、エシェリヒアコリのコスミ
ドの例(Proe、Natl、Acad。
シ分離することができる。ついで、ファージDNA及び
プラスミドDNAはそれぞれ制限酵素を用いて一9JI
ffrする。ファージDNAの切断断片を分画せずに全
断片を出発材料としても、目的の形質導入可能なグラス
ミドを得ることができるが、エシェリヒアコリのコスミ
ドの例(Proe、Natl、Acad。
Sci、 USA 73 3238 (1976) )
で知られるように、ファージの付着端(COS )を含
むDNA断片のグラスミドへの挿入によシ目的が達せら
れる場合には、以下のように付着末端を含む断片を単離
して用いればより効率よく目的の組換えプラスミドを得
ることができる。即ち、ファージDNAの付着端は通常
一本鎖相補性末端釦なっており、水素結合により付着端
同士対合するが、加熱急冷操作によシ容易に離れること
が知られる。従って加熱急冷操作前後のDNA断片をア
がロースグル電気泳動により解析すれば付着末端を持つ
DNA断片を容易に同定しうる。付着末端を持つDNA
断片を同定したならばこの断片を電気泳動後のアがロー
スグルより通常の方法で抽出B製することができる。
で知られるように、ファージの付着端(COS )を含
むDNA断片のグラスミドへの挿入によシ目的が達せら
れる場合には、以下のように付着末端を含む断片を単離
して用いればより効率よく目的の組換えプラスミドを得
ることができる。即ち、ファージDNAの付着端は通常
一本鎖相補性末端釦なっており、水素結合により付着端
同士対合するが、加熱急冷操作によシ容易に離れること
が知られる。従って加熱急冷操作前後のDNA断片をア
がロースグル電気泳動により解析すれば付着末端を持つ
DNA断片を容易に同定しうる。付着末端を持つDNA
断片を同定したならばこの断片を電気泳動後のアがロー
スグルより通常の方法で抽出B製することができる。
かくして得られたファージDNA断片と切断されたシラ
スミドDNAとを連結せしめる方法は、リガーゼを用い
る通常の方法が使用できる。
スミドDNAとを連結せしめる方法は、リガーゼを用い
る通常の方法が使用できる。
一方、ターミナルトランスフエラーゼヲ用いて、染色体
DNA断片と開裂したベクターDNAとにデオキシグア
ニル酸とデオキシチシジル酸、または、デオキシグアニ
ル酸とデオキシチシジル酸をそれぞれ付加し、混合した
のち、アニーリングして連結せしめる方法も利用しうる
。
DNA断片と開裂したベクターDNAとにデオキシグア
ニル酸とデオキシチシジル酸、または、デオキシグアニ
ル酸とデオキシチシジル酸をそれぞれ付加し、混合した
のち、アニーリングして連結せしめる方法も利用しうる
。
このようにして得られた、ファージDNAとプラスミド
DNA (!:の連結物のコリネホルムグルタミン酸生
産性細菌1て属する受容菌への導入は、エシェリヒア・
コIJ K −12について報告されている様な(Ma
ndel 、 M、and Higa + An +
、L MOIII Biol、 +53.159(19
76))受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNA
の透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリスにつ
いて翅失すれている様に(Duncan + C−H,
+ Wilson * G、 A、 and Youn
g。
DNA (!:の連結物のコリネホルムグルタミン酸生
産性細菌1て属する受容菌への導入は、エシェリヒア・
コIJ K −12について報告されている様な(Ma
ndel 、 M、and Higa + An +
、L MOIII Biol、 +53.159(19
76))受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNA
の透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリスにつ
いて翅失すれている様に(Duncan + C−H,
+ Wilson * G、 A、 and Youn
g。
F、E、、 Gene、 1 、153(1977))
細胞がDNAを取り込み得る様になる増殖段階(いわゆ
るコンピテントセル)に導入する方法により可能である
。あスす るいは、バチルス・−ブチリス、放線菌類および(酵母
について知られている様に(Chang、 S、 an
dChoen、S、N、、Mo1ec、Gen、Gon
et、、 168+111(1979) : Bibb
、 M、 J、 、 Ward+ J、M、 and
Hopwood。
細胞がDNAを取り込み得る様になる増殖段階(いわゆ
るコンピテントセル)に導入する方法により可能である
。あスす るいは、バチルス・−ブチリス、放線菌類および(酵母
について知られている様に(Chang、 S、 an
dChoen、S、N、、Mo1ec、Gen、Gon
et、、 168+111(1979) : Bibb
、 M、 J、 、 Ward+ J、M、 and
Hopwood。
0゜A、 、 Nature、 274 、398 (
1978) : Hlnnen、 A、 pH1cks
、 J、 B、 and Fink e G、 R,
p Proc、 Natl、 Acad。
1978) : Hlnnen、 A、 pH1cks
、 J、 B、 and Fink e G、 R,
p Proc、 Natl、 Acad。
ScL USA、 751929 (1978) )、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込むプ
ロトプラストまたはスフェロプラストにしてプラスミド
をDNA受容菌に導入することも可能である。
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込むプ
ロトプラストまたはスフェロプラストにしてプラスミド
をDNA受容菌に導入することも可能である。
プロトシラスト法では上記のバチルス・ズブチリスの方
法でも充分高い頻度を得ることができるし、特開昭57
−183799に記載されたコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム屑のプロトシラストにポリエチレ
ングリコールまたは一すピニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にDNAをとシ込ませる方法も当然利用
できる。
法でも充分高い頻度を得ることができるし、特開昭57
−183799に記載されたコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム屑のプロトシラストにポリエチレ
ングリコールまたは一すピニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にDNAをとシ込ませる方法も当然利用
できる。
ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの
カワリに、カルブキシメチルセルロース、デキストラン
、フィコール、プルロニックF68(セルパ社)などの
添加によってDNAのとり込みを促進させる方法でも同
等の結果が得られる。
カワリに、カルブキシメチルセルロース、デキストラン
、フィコール、プルロニックF68(セルパ社)などの
添加によってDNAのとり込みを促進させる方法でも同
等の結果が得られる。
形質導入可能な組換えシラスミドを保有する菌株の選択
は以下の方法で達せられる。形質転換後適当な培地上で
一部コロニーを形成させたのち、これらのコロニーを混
合して、ファー−7を感染させて溶菌せしめ、ファージ
液を調製する。これをプラスミドを含まな1新た々宿主
菌に感染させたのち、シラスミドが導入された菌株を検
紫すればよい。プレスミド上に薬剤耐性遺伝子などが存
在する場合にはこの形質を選択的に用いることができ、
容易に目的のプラスミドを保有する菌株を得ることがで
きる。
は以下の方法で達せられる。形質転換後適当な培地上で
一部コロニーを形成させたのち、これらのコロニーを混
合して、ファー−7を感染させて溶菌せしめ、ファージ
液を調製する。これをプラスミドを含まな1新た々宿主
菌に感染させたのち、シラスミドが導入された菌株を検
紫すればよい。プレスミド上に薬剤耐性遺伝子などが存
在する場合にはこの形質を選択的に用いることができ、
容易に目的のプラスミドを保有する菌株を得ることがで
きる。
目的の組換えプラスミドを保有する菌株よシブラスミド
DNAを単離する方法は、例えば菌体をリゾチーム・S
DS処理により溶菌させフェノール処理ののち、2容の
エタノールを加えてDNAを沈澱回収するというような
通常の方法で達せられる。
DNAを単離する方法は、例えば菌体をリゾチーム・S
DS処理により溶菌させフェノール処理ののち、2容の
エタノールを加えてDNAを沈澱回収するというような
通常の方法で達せられる。
実施例
(1)F+ ファージDNAの調製
複合プラスミド造成に用いた7アージF1はブレビバク
テリウム働ラクトファーメンタムATCC13869を
宿主菌として新たに分離した。
テリウム働ラクトファーメンタムATCC13869を
宿主菌として新たに分離した。
F、ファージDNAは以下の方法により調製した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC’
13869を1!のeMG培地(ベゾトン111/d
i。
13869を1!のeMG培地(ベゾトン111/d
i。
酵母エキス11k、グルコース0.51/dt 、及び
NaCto、 5 E/diを含み、−7,2にim、
1したもの)に植菌し、30℃で約1時間振盪培養を行
なったのち、F、ファージを多重感染度(−nol )
が約0.1になるように加え更に5時間振盪培養を継続
し、これにより7アージによる溶菌をおこさせた。溶菌
液をハイフロス−パーセル(純正化学製)で濾過し菌体
残渣を除去後、濾液にデオキシIJ zヌクレアーゼI
とり?ヌクレアーゼA(シグマif)を各々10μy7
mt添加し、この濾液を30℃に20分間保った。更に
濾液に/4’ンクレアチン200μ77/mlを加えて
30℃に20分間保った後、塩化ナトリウムを最終濃度
0.5 M 、 yl?lエリレングリコール6000
を最終濃度10%になるようにそれぞれ濾液に添加し、
ついでこれを4℃に1日置き、Fl ファージ粒子を
沈澱させた。5000rpm 10分の遠心により沈澱
を回収後、1係のSDSを含むTEN緩備液(20mM
)リス塩酸塩、20mMNaC4,1mMEDTA
(p)48.0 ) ) 10mlに溶解せしめた。こ
れより通常のフェノール処理法によ’)s Ft ファ
ージDNAを抽出、精製し、最終的に約51n9のDN
Aを得た。
NaCto、 5 E/diを含み、−7,2にim、
1したもの)に植菌し、30℃で約1時間振盪培養を行
なったのち、F、ファージを多重感染度(−nol )
が約0.1になるように加え更に5時間振盪培養を継続
し、これにより7アージによる溶菌をおこさせた。溶菌
液をハイフロス−パーセル(純正化学製)で濾過し菌体
残渣を除去後、濾液にデオキシIJ zヌクレアーゼI
とり?ヌクレアーゼA(シグマif)を各々10μy7
mt添加し、この濾液を30℃に20分間保った。更に
濾液に/4’ンクレアチン200μ77/mlを加えて
30℃に20分間保った後、塩化ナトリウムを最終濃度
0.5 M 、 yl?lエリレングリコール6000
を最終濃度10%になるようにそれぞれ濾液に添加し、
ついでこれを4℃に1日置き、Fl ファージ粒子を
沈澱させた。5000rpm 10分の遠心により沈澱
を回収後、1係のSDSを含むTEN緩備液(20mM
)リス塩酸塩、20mMNaC4,1mMEDTA
(p)48.0 ) ) 10mlに溶解せしめた。こ
れより通常のフェノール処理法によ’)s Ft ファ
ージDNAを抽出、精製し、最終的に約51n9のDN
Aを得た。
(2)Fs ファージ付着末端(COS)を含むDNA
断片の調製 F、ファージDNA約5μgを含む緩衝液に制限エンド
ヌクレアーゼH1nd IIIを加えて37℃に2時間
保ちDNA鎖を完全に切断した。反応液の一部をとって
70℃に10分間加熱後急冷し、熱処理を施さない反応
液と同時K O,8%のアがロースグル電気泳動にかけ
た7渋動の枯−早、H1ndrll帆理frわ生じたF
1ファージDNA断片のうち、約2、lkbの断片が熱
処理によシ約1.6 kbと約0.5kbの断片に分離
し、この2.1 kb断片中に付着端(COS )が存
在することが明らかとなった。そこでこの21kb断片
をアガロースグルよシ抽出精製し、DNA約0.4μg
を得た。
断片の調製 F、ファージDNA約5μgを含む緩衝液に制限エンド
ヌクレアーゼH1nd IIIを加えて37℃に2時間
保ちDNA鎖を完全に切断した。反応液の一部をとって
70℃に10分間加熱後急冷し、熱処理を施さない反応
液と同時K O,8%のアがロースグル電気泳動にかけ
た7渋動の枯−早、H1ndrll帆理frわ生じたF
1ファージDNA断片のうち、約2、lkbの断片が熱
処理によシ約1.6 kbと約0.5kbの断片に分離
し、この2.1 kb断片中に付着端(COS )が存
在することが明らかとなった。そこでこの21kb断片
をアガロースグルよシ抽出精製し、DNA約0.4μg
を得た。
(3)プラスミドDNAの調製
ベクターとしてpAJ43 (ブレビバクテリウム・ラ
クトフェルメンタムAJ 11997 FERM −P
6857として寄託されている)(分子量3.4メが
ダルトン)を用いた。
クトフェルメンタムAJ 11997 FERM −P
6857として寄託されている)(分子量3.4メが
ダルトン)を用いた。
PAJ655 (特開昭58−192900参咥)ヨり
次のようにしてpAJ43を造成した。
次のようにしてpAJ43を造成した。
pAJ655 e保持するブレビバクテリウム・ラクト
2エルメンタムA64はクロラムフェニコール100t
4/ul f含むCMG寒天培地(ベプトy 10 g
/Z。
2エルメンタムA64はクロラムフェニコール100t
4/ul f含むCMG寒天培地(ベプトy 10 g
/Z。
酵母エキス101/I=、グ” コース5 lie s
NaC15g/!、寒天20Iβを含み−7,2に調
辺したもの)上で生育不可能であるが、本菌をCMG培
地で培養シ、クロラムフェニコール100μ、ji’%
ic f 含むCMG液体培地に30℃で一晩培養後、
同濃度のクロラムフェニコールを含むCMG培地に適当
1−塗布し30℃1〜2日間培養することによりクロラ
ムフェニコール100μi/mlに耐性を示す株を1採
得た。不味のクロラムフェニコール耐性度tCPvTG
培地で調べたところ200μ、9AILtまで耐性を示
した。
NaC15g/!、寒天20Iβを含み−7,2に調
辺したもの)上で生育不可能であるが、本菌をCMG培
地で培養シ、クロラムフェニコール100μ、ji’%
ic f 含むCMG液体培地に30℃で一晩培養後、
同濃度のクロラムフェニコールを含むCMG培地に適当
1−塗布し30℃1〜2日間培養することによりクロラ
ムフェニコール100μi/mlに耐性を示す株を1採
得た。不味のクロラムフェニコール耐性度tCPvTG
培地で調べたところ200μ、9AILtまで耐性を示
した。
上記の結果、得られたクロラムフェニコール高濃度耐性
株からpAJ43をDNA次のようにして調製した。ま
ず本株をクロラムフェニコー#t−10pJiJrut
含ム1.6 ノCMG液体培地に接種シ、30℃で対数
増殖期後期まで培養し、集菌した。常法によりリゾチー
ムとSDSにょシ溶菌せしめた後、30.000X、?
、30分の超遠心により上清を得た。これにポリエチレ
ングリコール(最終濃度10係)を添加してDNAを沈
澱せしめ、これを濃縮後、沈澱物をトリス・EDTA−
Nactバッファー(pHs、o ) 10rnlに溶
解した。DNAをすyt?3Eクレアーゼで処理(リボ
ヌクレアーゼ150μg、、’mt テ37℃、30分
間反応)後、フェノール抽出し、ついで2倍量のエタノ
ールを加t−20℃でDNAを沈澱させ、沈澱物を1r
n1.のトリス・EDTA−Nactバッファーに溶解
した。このDNA溶液をアがロースダル電気泳動法(電
圧グル1cm当り5V、15時間)によって最終150
μyの純粋なpAJ43 fラスミドDNAを分画採取
した。
株からpAJ43をDNA次のようにして調製した。ま
ず本株をクロラムフェニコー#t−10pJiJrut
含ム1.6 ノCMG液体培地に接種シ、30℃で対数
増殖期後期まで培養し、集菌した。常法によりリゾチー
ムとSDSにょシ溶菌せしめた後、30.000X、?
、30分の超遠心により上清を得た。これにポリエチレ
ングリコール(最終濃度10係)を添加してDNAを沈
澱せしめ、これを濃縮後、沈澱物をトリス・EDTA−
Nactバッファー(pHs、o ) 10rnlに溶
解した。DNAをすyt?3Eクレアーゼで処理(リボ
ヌクレアーゼ150μg、、’mt テ37℃、30分
間反応)後、フェノール抽出し、ついで2倍量のエタノ
ールを加t−20℃でDNAを沈澱させ、沈澱物を1r
n1.のトリス・EDTA−Nactバッファーに溶解
した。このDNA溶液をアがロースダル電気泳動法(電
圧グル1cm当り5V、15時間)によって最終150
μyの純粋なpAJ43 fラスミドDNAを分画採取
した。
pAJ43 Q:) 分子itの決定はアガロースゲル
電気泳動によった。
電気泳動によった。
アガロースダル電気泳動はシャープ(P、A。
5harp )らの方法(Bloehemistry
12 r 3055(1973))により、08優グル
を用い、rル長さα当b、svで15時間、定電圧で泳
動した。分子量はpAJ43を1ケ所切断する制限酵素
H1nd mo、5ユニツトをpAJ43 、0.5μ
lに37℃、1時間反応させ、切断し、直線状にした後
、分子量既知の分子量マーカー、λファージのHind
mフラグメン) (BRLから購入)との移動度の比
較によって算出し、3.4 Mdと計算された。
12 r 3055(1973))により、08優グル
を用い、rル長さα当b、svで15時間、定電圧で泳
動した。分子量はpAJ43を1ケ所切断する制限酵素
H1nd mo、5ユニツトをpAJ43 、0.5μ
lに37℃、1時間反応させ、切断し、直線状にした後
、分子量既知の分子量マーカー、λファージのHind
mフラグメン) (BRLから購入)との移動度の比
較によって算出し、3.4 Mdと計算された。
制限酵素切断後のDNA断片を7ガロースダル電気泳動
で解析した結果、pAJ43はpAJ655から1nv
lvoでdeletionによシ生じたpBR325の
クロラムフェニコール耐性遺伝子領域を含む約I Md
とpAM330の複製維持に必須の領域を含む約2.4
Mdの7ラグメントから成る小型プラスミドであるこ
とが判明した。′ 、(4)Fs ファージのcosを含むDNA断片のベ
クターへの挿入 (3)で得たプラスミドpAJ43約1μIを制限エン
ドヌクレアーゼH1nd I[Iで37℃で2時間保ち
、完全に切断した。65℃、10分間の熱処理後、(2
)で得た2、1kbのDNA断片を加え、ATP及びジ
チオスレイトール存在下、T47アージ由来のDNAリ
ガーゼによって10℃、24時間DNA鎖の連結反応を
行った。反応液に2倍容のエタノールを加えて連結反応
終了後のDNAを沈澱採取した。
で解析した結果、pAJ43はpAJ655から1nv
lvoでdeletionによシ生じたpBR325の
クロラムフェニコール耐性遺伝子領域を含む約I Md
とpAM330の複製維持に必須の領域を含む約2.4
Mdの7ラグメントから成る小型プラスミドであるこ
とが判明した。′ 、(4)Fs ファージのcosを含むDNA断片のベ
クターへの挿入 (3)で得たプラスミドpAJ43約1μIを制限エン
ドヌクレアーゼH1nd I[Iで37℃で2時間保ち
、完全に切断した。65℃、10分間の熱処理後、(2
)で得た2、1kbのDNA断片を加え、ATP及びジ
チオスレイトール存在下、T47アージ由来のDNAリ
ガーゼによって10℃、24時間DNA鎖の連結反応を
行った。反応液に2倍容のエタノールを加えて連結反応
終了後のDNAを沈澱採取した。
得られたDNAを少量のTEN緩衝液に溶解し以下の形
質転換に用いた。
質転換に用いた。
(5)形質転換
形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。受容菌とじて用いたブレビバ
クテリウムラクトファーメンタムAJ12036 (F
ERM P 1544)はブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムATCC13869株よりストレプトマ
イシン耐性株として分離した。まず、この受容菌を51
!LlのCMG液体培地で対数増殖期の初期まで培養し
、培地にペニシリンGを0.6ユニツト/d添加後、さ
らに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め
た。菌体fc0.5 Mシェークロース、20mMマレ
インWl 、20 mM 塩化マグネシウム、3.54
ベナ、セイブロス(Dlfco )がラナルSMMP培
地(p)(6,5)O15mlで洗浄した。次いで10
η/mlのリゾチームを含むSNMP培地に憑濁し30
℃で20時間プロトプラスト化を図った。
ーメーション法を用いた。受容菌とじて用いたブレビバ
クテリウムラクトファーメンタムAJ12036 (F
ERM P 1544)はブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムATCC13869株よりストレプトマ
イシン耐性株として分離した。まず、この受容菌を51
!LlのCMG液体培地で対数増殖期の初期まで培養し
、培地にペニシリンGを0.6ユニツト/d添加後、さ
らに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め
た。菌体fc0.5 Mシェークロース、20mMマレ
インWl 、20 mM 塩化マグネシウム、3.54
ベナ、セイブロス(Dlfco )がラナルSMMP培
地(p)(6,5)O15mlで洗浄した。次いで10
η/mlのリゾチームを含むSNMP培地に憑濁し30
℃で20時間プロトプラスト化を図った。
6000X、F、10分間遠心分離後、プロトプラスト
をSMMPで洗浄し、0.5m4の8VMPに再度懸濁
した。この様にして得られたプロトプラストと(4)で
調製したDNA約1μIを5rrIMEDTA存在下で
混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が30係に
なる様に添加した後、DNAをプロトプラストに取シ込
ませる為に室温に2分間放置した。このデロトゾラスト
をSMMP培地1ゴで洗浄後、SMMP培地1Mに再懸
濁し、形質発現の為、30℃で2時間培養した。この培
養液をpH7,0のプロトシラスト再生培地上に塗布し
た。プロトプラスト再生培地は蒸留水1!あたりトリス
(ヒドロキシメチル)アミノメタン12 FlKCto
、5 F、グルコース10g、MgCl2・6H208
,11!、CaC42’ 2H202,2g、Kプトン
4g1粉末酵母エキス4g、カザミノ酸(Djfco社
) 1.9. K2HPO40,2,9’、コ/%り
酸ナトリウム135.9.寒天8g及びクロラムフェニ
コール3μl/mlを含む。
をSMMPで洗浄し、0.5m4の8VMPに再度懸濁
した。この様にして得られたプロトプラストと(4)で
調製したDNA約1μIを5rrIMEDTA存在下で
混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が30係に
なる様に添加した後、DNAをプロトプラストに取シ込
ませる為に室温に2分間放置した。このデロトゾラスト
をSMMP培地1ゴで洗浄後、SMMP培地1Mに再懸
濁し、形質発現の為、30℃で2時間培養した。この培
養液をpH7,0のプロトシラスト再生培地上に塗布し
た。プロトプラスト再生培地は蒸留水1!あたりトリス
(ヒドロキシメチル)アミノメタン12 FlKCto
、5 F、グルコース10g、MgCl2・6H208
,11!、CaC42’ 2H202,2g、Kプトン
4g1粉末酵母エキス4g、カザミノ酸(Djfco社
) 1.9. K2HPO40,2,9’、コ/%り
酸ナトリウム135.9.寒天8g及びクロラムフェニ
コール3μl/mlを含む。
30℃で10日間培養後、約1,000個のクロラムフ
ェニコール耐性コロニーが出現してきた。
ェニコール耐性コロニーが出現してきた。
(6)形質導入
これらのコロニーを全部まとめてかきとって生理食塩水
に懇濁し、その一部をF1ファージ約105と共に2係
寒天、10μji/fnlクロラムフエニコールを含む
CMG培地平板1枚に塗布し、30℃にて1日間培養し
た。平板上でFl 7アージによる溶菌現象が確認され
たので5 atの生理食塩水を平板上に加えファージ粒
子を懸濁した。15000rpm、10分間の遠心によ
り菌体残渣を除去後、除菌フィルター(ポアサイズ0.
22μ)を通して生菌を除−た。
に懇濁し、その一部をF1ファージ約105と共に2係
寒天、10μji/fnlクロラムフエニコールを含む
CMG培地平板1枚に塗布し、30℃にて1日間培養し
た。平板上でFl 7アージによる溶菌現象が確認され
たので5 atの生理食塩水を平板上に加えファージ粒
子を懸濁した。15000rpm、10分間の遠心によ
り菌体残渣を除去後、除菌フィルター(ポアサイズ0.
22μ)を通して生菌を除−た。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ120
36の対数増殖期の菌体的10に対し上記のファージ液
Q、l meを加え、30℃で90分ゆるやかに振盪し
、3000rpm、10分間遠心にて、菌体を回収し、
これを2回生理食塩水で洗浄した。
36の対数増殖期の菌体的10に対し上記のファージ液
Q、l meを加え、30℃で90分ゆるやかに振盪し
、3000rpm、10分間遠心にて、菌体を回収し、
これを2回生理食塩水で洗浄した。
洗浄菌体を、2俤寒天及び10μp7mtクロラムフェ
ニコールを含むCMG培地平板に塗布した。30℃で2
日培善すると3コロニーが生じた。これらの3株をそれ
ぞれ生理食塩水に懸濁後、上記と同様にF’l ファー
ジとともに寒天平板上で培養してファージ液を調製しA
J12036株−\の形質導入を行なった。
ニコールを含むCMG培地平板に塗布した。30℃で2
日培善すると3コロニーが生じた。これらの3株をそれ
ぞれ生理食塩水に懸濁後、上記と同様にF’l ファー
ジとともに寒天平板上で培養してファージ液を調製しA
J12036株−\の形質導入を行なった。
その結果ベクターのpAJ43を保持する菌株より得た
ファージ液には形質導入能は全く検出されないが上記の
3株ではいずれから調製したファージ液によっても高頻
度にクロラムフェニコール耐性コロニーが生じこのうち
AJ 12136 (FERM −P1545 )より
得た7アージ約10 を受容菌AJ12036株約10
に感染させた場合には約10 のクロラムフェニコー
ル耐性コロニーが生シタ。これらの耐性コロニー及びA
J 12136株からは約4.8Mdのプラスミドが検
出され、このプラスミドがベクターのpAJ43 (3
,4Md )とFl ファージのCos部位を含むDN
A断片(1,4Md )とからなり、形質導入可能なコ
スミFであることは明らかである。
ファージ液には形質導入能は全く検出されないが上記の
3株ではいずれから調製したファージ液によっても高頻
度にクロラムフェニコール耐性コロニーが生じこのうち
AJ 12136 (FERM −P1545 )より
得た7アージ約10 を受容菌AJ12036株約10
に感染させた場合には約10 のクロラムフェニコー
ル耐性コロニーが生シタ。これらの耐性コロニー及びA
J 12136株からは約4.8Mdのプラスミドが検
出され、このプラスミドがベクターのpAJ43 (3
,4Md )とFl ファージのCos部位を含むDN
A断片(1,4Md )とからなり、形質導入可能なコ
スミFであることは明らかである。
AJ 12136株より見出されたコスミドをpAJ6
67と名付けた。AJ 12136より得たファージ液
を用いコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13
060株へのpAJ667の導入をはかった。
67と名付けた。AJ 12136より得たファージ液
を用いコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13
060株へのpAJ667の導入をはかった。
約10 ファージ粒子を用いた時、49コのクロラムフ
ェニコール耐性株が得られた。これからはいずれも4,
8メがダルトンのpAJ667グラスミPDNAが検出
された形質導入によりpAJ667がコリネバクテリウ
ム・グルタミクムATCC13060株にも導入された
のは明らかである。
ェニコール耐性株が得られた。これからはいずれも4,
8メがダルトンのpAJ667グラスミPDNAが検出
された形質導入によりpAJ667がコリネバクテリウ
ム・グルタミクムATCC13060株にも導入された
のは明らかである。
なお、プラスミドベクターとしてpAJ1844 (特
開昭58−192900参照)、ファージにcp −2
3フアージ(J、 Gen、Appl、Microbi
ol、 、 22119 (1976)参照)を用いた
場合にも同様にして形質導入可能な組換えプラスミドp
AJ668が得られた。
開昭58−192900参照)、ファージにcp −2
3フアージ(J、 Gen、Appl、Microbi
ol、 、 22119 (1976)参照)を用いた
場合にも同様にして形質導入可能な組換えプラスミドp
AJ668が得られた。
本発明に用いたF1ファージはAJ 12136株に溶
原化しており、自然誘発またはマイトマイシンCを0.
05〜0.2μII/ytlを含むCMG液体液体中地
中盪培養することによシ、培地中に放出されてくる。
原化しており、自然誘発またはマイトマイシンCを0.
05〜0.2μII/ytlを含むCMG液体液体中地
中盪培養することによシ、培地中に放出されてくる。
これは例えばプレバクテリウム・ラクトファーメンタム
ATCC13869株に感染させれば容易に高い収量で
ファージ粒子が得られる。pAJ43を含む菌株ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11997は
FERM −P 6857として寄託されている。
ATCC13869株に感染させれば容易に高い収量で
ファージ粒子が得られる。pAJ43を含む菌株ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11997は
FERM −P 6857として寄託されている。
実施例2
(1) pUC4に由来カナマイシン耐性遺伝子を含
むDNA断片の調製 PUC4K (ファルマシア社製、Gene 、1黒2
59(1982) ) 5 tillを制限エンドヌク
レアーゼB a m Hrで37℃、2時間保ち、完全
に切断後、0.8’lのアガロースデル電気泳動にかけ
た。泳動の結果Bam HI処理により生じた約1.3
kb断片中にカナマイシン耐性遺伝子が存在すること
は明らかであり、この1.3kb断片をアがロースダル
抽出fF[し、DNA約0.5μyを得た。
むDNA断片の調製 PUC4K (ファルマシア社製、Gene 、1黒2
59(1982) ) 5 tillを制限エンドヌク
レアーゼB a m Hrで37℃、2時間保ち、完全
に切断後、0.8’lのアガロースデル電気泳動にかけ
た。泳動の結果Bam HI処理により生じた約1.3
kb断片中にカナマイシン耐性遺伝子が存在すること
は明らかであり、この1.3kb断片をアがロースダル
抽出fF[し、DNA約0.5μyを得た。
(2) カナマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片の
コスミドpAJ667への挿入 実施例1の(3)で述べた方法により調製したコスミド
pAJ667 (i 1図に制限酵素切断地図を示した
)約1μIを制限エンドヌクレアーゼBamHIで37
℃に2時間保ち、完全に切断した。65℃、10分間の
熱処理後、(1)で得た1、3kbのDNA断片を加え
、ATP及びジチオスレイトール存在下、T4ファーゾ
由来のDNA IJガーゼによって10℃、24時間D
NA鎖の連結反応を行った。反応液に2倍容のエタノー
ルを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採取した@ 得られたDNAを少量のTEN緩衝液に溶解し以下の形
質転換に用いた。
コスミドpAJ667への挿入 実施例1の(3)で述べた方法により調製したコスミド
pAJ667 (i 1図に制限酵素切断地図を示した
)約1μIを制限エンドヌクレアーゼBamHIで37
℃に2時間保ち、完全に切断した。65℃、10分間の
熱処理後、(1)で得た1、3kbのDNA断片を加え
、ATP及びジチオスレイトール存在下、T4ファーゾ
由来のDNA IJガーゼによって10℃、24時間D
NA鎖の連結反応を行った。反応液に2倍容のエタノー
ルを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採取した@ 得られたDNAを少量のTEN緩衝液に溶解し以下の形
質転換に用いた。
(3)形質転換
形質転換の方法としては、ゾロドプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。受容菌として用いたブレピノ
々クテリウム・ラクトファーメンタムAJ 12036
(FERM−P 1544)はブレピノぐクテリウム
・ラクトファーメンタムATCC13869株よりスト
レプトマイシン耐性株として分離した。まず、この受容
菌を5dのCMG液体培地で対数増殖期の初期まで培養
し、培地にペニシリンG i O,6ユニツト/ゴ添加
後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離によシ菌体
を集めた。菌体を0.5Mシュークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.51−2ナ
ツセイブロス(Dlfco )からなるSMVP培地(
pH6,5)0.5dで洗浄した。次いで10■肩のリ
ゾチームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時間
プロトプラスト化を図った。
ーメーション法を用いた。受容菌として用いたブレピノ
々クテリウム・ラクトファーメンタムAJ 12036
(FERM−P 1544)はブレピノぐクテリウム
・ラクトファーメンタムATCC13869株よりスト
レプトマイシン耐性株として分離した。まず、この受容
菌を5dのCMG液体培地で対数増殖期の初期まで培養
し、培地にペニシリンG i O,6ユニツト/ゴ添加
後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離によシ菌体
を集めた。菌体を0.5Mシュークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.51−2ナ
ツセイブロス(Dlfco )からなるSMVP培地(
pH6,5)0.5dで洗浄した。次いで10■肩のリ
ゾチームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時間
プロトプラスト化を図った。
6000X1!、10分間遠心分離後、グロトゾラース
トをSMMPで洗浄し、0,5ゴのSMMPに再度懸濁
したーこの様にして得られたプロトプラストと(2)で
調製したDNA約1 pgを5 mM EDTA存在
下で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が30
係になる様に添加した後、DNAをプロトプラストに取
り込ませる為に室温に2分間放置した。このプロトプラ
ストをSMMP培地1−で洗浄後、SMMP培j41
rLLlに再懸濁し、形質発現の為、30℃で2時間培
養した。この培養液をpH7,0のプロトシラスト再生
培地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留水1
にあたりトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン12
N、KC20,5fI、グルコース10g、MgCl2
−6H208,1,9、CaC42”2H202,21
1ペプトン411、粉末酵母エキス4g、カザミ“ノl
A’l (Dlfco社)1g、K2)(PO40,2
g、コノ・り酸ナトリウム135g、寒天8I及びカナ
マイシン100 td/mAを含む。
トをSMMPで洗浄し、0,5ゴのSMMPに再度懸濁
したーこの様にして得られたプロトプラストと(2)で
調製したDNA約1 pgを5 mM EDTA存在
下で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が30
係になる様に添加した後、DNAをプロトプラストに取
り込ませる為に室温に2分間放置した。このプロトプラ
ストをSMMP培地1−で洗浄後、SMMP培j41
rLLlに再懸濁し、形質発現の為、30℃で2時間培
養した。この培養液をpH7,0のプロトシラスト再生
培地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留水1
にあたりトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン12
N、KC20,5fI、グルコース10g、MgCl2
−6H208,1,9、CaC42”2H202,21
1ペプトン411、粉末酵母エキス4g、カザミ“ノl
A’l (Dlfco社)1g、K2)(PO40,2
g、コノ・り酸ナトリウム135g、寒天8I及びカナ
マイシン100 td/mAを含む。
30℃で6日間培養後、約30個のカナマイシン耐性コ
ロニーが出現してきた。その中からカナマイシン25μ
ダ/mlを含むCMG寒天培地(認ゾトン10g/:#
1酵母エキス109/Z 、 ! ルコ−ス5E/A、
NaC25!j/l 、寒天201〃を含みpH7,2
に調整したもの)上で生育した1株、即ちAJ 121
73(FERM−P 7ef”、?t>からは約5.7
Mdのプラスミドが検出された。このプラスミドがベ
クターのpAJ667(4,8Md)とpUC4に由来
カナマイシン耐性遺伝子を含j7 DNA断片0.9
Mdとからなることは、制限エンドヌクレアーゼBam
HIで37℃、2時間反応させ、分子量既知の分子量マ
ーカー、λファージのH1nd17ラグメン) (BR
Lから購入)との移動度の比較により確認した。AJ
12173株よ如見出されたこのプラスミドをpAJ6
70と名づけた。第1図にPAJ670の制限酵素切断
地図を示した。
ロニーが出現してきた。その中からカナマイシン25μ
ダ/mlを含むCMG寒天培地(認ゾトン10g/:#
1酵母エキス109/Z 、 ! ルコ−ス5E/A、
NaC25!j/l 、寒天201〃を含みpH7,2
に調整したもの)上で生育した1株、即ちAJ 121
73(FERM−P 7ef”、?t>からは約5.7
Mdのプラスミドが検出された。このプラスミドがベ
クターのpAJ667(4,8Md)とpUC4に由来
カナマイシン耐性遺伝子を含j7 DNA断片0.9
Mdとからなることは、制限エンドヌクレアーゼBam
HIで37℃、2時間反応させ、分子量既知の分子量マ
ーカー、λファージのH1nd17ラグメン) (BR
Lから購入)との移動度の比較により確認した。AJ
12173株よ如見出されたこのプラスミドをpAJ6
70と名づけた。第1図にPAJ670の制限酵素切断
地図を示した。
(4)形質導入
pAJ 670を保持するAJ 12173の対数増殖
期の菌体的10 をF4ファージ約10 と共に2係寒
天、25μl//m、lカナマイシンを含むCMG培地
平板1枚に塗布し、30℃にて1日間培養した。平板上
で′F!ファーノによる溶菌現象が確認されたので5m
lの生理食塩水を平板上に加え7ア一ジ粒子を懸濁した
。15000 rpm、10分間の遠心により葭体残直
を除去後、除菌フィルター(ポアサイズ−0,22μ)
を通して生菌を除いた。
期の菌体的10 をF4ファージ約10 と共に2係寒
天、25μl//m、lカナマイシンを含むCMG培地
平板1枚に塗布し、30℃にて1日間培養した。平板上
で′F!ファーノによる溶菌現象が確認されたので5m
lの生理食塩水を平板上に加え7ア一ジ粒子を懸濁した
。15000 rpm、10分間の遠心により葭体残直
を除去後、除菌フィルター(ポアサイズ−0,22μ)
を通して生菌を除いた。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ120
36の対数増殖期の菌体的10に対し上記のファージ液
0.1m/!(10pfu)を加え、30℃で90分ゆ
るやかに振盪し、3000rpm、10分間遠心にて、
一体を回収し、これを2回生理食塩水で洗浄した。洗浄
菌体を2チ寒天及び25μp/mlカナマイシンを含む
CMG培地平板に塗布した。30℃で2日培養すると約
10 カナマイシン耐性コロニーが生じた。これらの耐
性コロニーからは約5、7 MdのシラスミドI)AJ
670が検出され形質導入によ#)PAJ670がp、
J 12036株に導入されたのは明らかである。(な
お、pAJ670の形質導入頻度はpAJ667と同じ
オーダーであった。)本発明に用いたF1ファージはA
J 12173株に溶原化しており、自然誘発またはマ
イトマイシンCを0.05〜0.2μg〜を含むCMG
液体培地中で振盪培養することにより、培地中に放出さ
れている。
36の対数増殖期の菌体的10に対し上記のファージ液
0.1m/!(10pfu)を加え、30℃で90分ゆ
るやかに振盪し、3000rpm、10分間遠心にて、
一体を回収し、これを2回生理食塩水で洗浄した。洗浄
菌体を2チ寒天及び25μp/mlカナマイシンを含む
CMG培地平板に塗布した。30℃で2日培養すると約
10 カナマイシン耐性コロニーが生じた。これらの耐
性コロニーからは約5、7 MdのシラスミドI)AJ
670が検出され形質導入によ#)PAJ670がp、
J 12036株に導入されたのは明らかである。(な
お、pAJ670の形質導入頻度はpAJ667と同じ
オーダーであった。)本発明に用いたF1ファージはA
J 12173株に溶原化しており、自然誘発またはマ
イトマイシンCを0.05〜0.2μg〜を含むCMG
液体培地中で振盪培養することにより、培地中に放出さ
れている。
これを例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムATCC13869株に感染させれば容易に高い収量
でファージ粒子が得られる。pAJ667を含む菌株ブ
レピノぐクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 12
136はFERM−P 1545として寄託されている
。
ムATCC13869株に感染させれば容易に高い収量
でファージ粒子が得られる。pAJ667を含む菌株ブ
レピノぐクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 12
136はFERM−P 1545として寄託されている
。
第1図は、複合シラスミドpAJ667及びpAJ67
0の制限酵累切断地図である。
0の制限酵累切断地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 コリネホルムグルタミン酸生産性細菌の細胞内で増殖で
きるプラスミドの少なくとも複製開始点を含むDNA及
び、 該細菌が該細菌の細胞内で増殖できるファージに感染し
たとき該ファージ粒子内に取り込まれるような該ファー
ジのDNA領域を少くとも含むDNAよりなる形質導入
可能な複合ベクター。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59209060A JPH0734745B2 (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | 形質導入方法 |
EP85104144A EP0158940B1 (en) | 1984-04-04 | 1985-04-04 | Transducible composite plasmid |
DE8585104144T DE3584848D1 (de) | 1984-04-04 | 1985-04-04 | Zusammengesetztes transduzierbares plasmid. |
US07/135,481 US4822738A (en) | 1984-04-04 | 1987-12-21 | Transducible composite plasmid |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59209060A JPH0734745B2 (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | 形質導入方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6188880A true JPS6188880A (ja) | 1986-05-07 |
JPH0734745B2 JPH0734745B2 (ja) | 1995-04-19 |
Family
ID=16566587
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59209060A Expired - Lifetime JPH0734745B2 (ja) | 1984-04-04 | 1984-10-05 | 形質導入方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0734745B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02504461A (ja) * | 1987-03-02 | 1990-12-20 | ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ | 組換えミコバクテリア・ワクチン |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60210987A (ja) * | 1984-04-04 | 1985-10-23 | Ajinomoto Co Inc | 形質導入可能な複合プラスミド |
-
1984
- 1984-10-05 JP JP59209060A patent/JPH0734745B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60210987A (ja) * | 1984-04-04 | 1985-10-23 | Ajinomoto Co Inc | 形質導入可能な複合プラスミド |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02504461A (ja) * | 1987-03-02 | 1990-12-20 | ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ | 組換えミコバクテリア・ワクチン |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0734745B2 (ja) | 1995-04-19 |
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