JPS6188880A - 形質導入方法 - Google Patents
形質導入方法Info
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- JPS6188880A JPS6188880A JP59209060A JP20906084A JPS6188880A JP S6188880 A JPS6188880 A JP S6188880A JP 59209060 A JP59209060 A JP 59209060A JP 20906084 A JP20906084 A JP 20906084A JP S6188880 A JPS6188880 A JP S6188880A
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- Japan
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- phage
- plasmid
- strain
- medium
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、形質導入可能な複合シラスミドに関し、更
に詳しくは、コリネホルムグルタミン酸生産性細菌を宿
主とする形質導入可能な複合プラスミドに関する。
に詳しくは、コリネホルムグルタミン酸生産性細菌を宿
主とする形質導入可能な複合プラスミドに関する。
コリネホルムグルタミン酸生産菌には大量のＬ−グルタ
ミン酸を生産するもの及び特にその変異株はリジン等の
アミノ酸、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産す
るものが知られていて工業的に重要な微生物である。最
近、ＤＮＡ組換え技術による工業微生物の育種・改良が
試みられており、コリネホルムグルタミン酸生産菌につ
いても、組換えＤＮＡ技術の開発が進められつつある。
ミン酸を生産するもの及び特にその変異株はリジン等の
アミノ酸、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産す
るものが知られていて工業的に重要な微生物である。最
近、ＤＮＡ組換え技術による工業微生物の育種・改良が
試みられており、コリネホルムグルタミン酸生産菌につ
いても、組換えＤＮＡ技術の開発が進められつつある。
例えば昭和５８年度日本農芸化学会大会講演要旨集３３
３頁（１９８３） 、昭和５８年度日本醗酵工学会大会
講演要旨集２８３頁、２８４頁（１９８３）にそれぞれ
コリネバクテリウム・グルタミクムの宿主−ベクター系
の開発、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
宿主−ベクター系の開発とスレオニ／生産菌育種の例が
報告されている。
３頁（１９８３） 、昭和５８年度日本醗酵工学会大会
講演要旨集２８３頁、２８４頁（１９８３）にそれぞれ
コリネバクテリウム・グルタミクムの宿主−ベクター系
の開発、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
宿主−ベクター系の開発とスレオニ／生産菌育種の例が
報告されている。
しかるに従来知られているコリネホルムグルタミン酸生
産゛性細菌の宿主−ベクター系においては、いずれもベ
クターとしてプラスミドを用いるものであり１従って、
このプラスミドベクターを宿主に移入せしめるためには
、先ずこのプラスミドベクターを分離し、ついでプロト
プラスト法、カルシウム処理法などの煩頂な形質転換手
段が必要である。
産゛性細菌の宿主−ベクター系においては、いずれもベ
クターとしてプラスミドを用いるものであり１従って、
このプラスミドベクターを宿主に移入せしめるためには
、先ずこのプラスミドベクターを分離し、ついでプロト
プラスト法、カルシウム処理法などの煩頂な形質転換手
段が必要である。
ところでエシェリヒアコリにおいてはラムダフアージ由
来の付着末端（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ：Ｃｏ５）を
含むＤＮＡ領域をもつ組換えプラスミドであるいわゆる
コスミドが構築されている。（Ｆｕｋｕｍａｋｉ ＊
Ｙ、 ＋Ｓｈ１ｍａｄａ ＋ Ｋ−＋ Ｔａｋａｇ％＋
Ｙ：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、。
来の付着末端（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ：Ｃｏ５）を
含むＤＮＡ領域をもつ組換えプラスミドであるいわゆる
コスミドが構築されている。（Ｆｕｋｕｍａｋｉ ＊
Ｙ、 ＋Ｓｈ１ｍａｄａ ＋ Ｋ−＋ Ｔａｋａｇ％＋
Ｙ：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、。
７３ 、３２３８ （１９７６） 、 Ｃｏ１１ｉｎｓ
、Ｊ、Ｈｏｈｎ 、 Ｂ：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｌ、 ７５ 、４２４２ （１９７８） ）こ
のコスミドは、ファージを用いた形質導入法（ここでは
形質導入法はファージを介した遺伝子の移入と定義づけ
る（蛋白質核酸酵素別冊″′細菌・ファージ遺伝実験法
”Ｐ ６４ （１９７２） ）でその保持菌株から容易
に別の菌株に移入せしめることができるのが特長である
。即ちコスミド保持株にファージを感染させると一定の
割合でコスミドＤＮＡを含む偽ファージ粒子が形成され
、この粒子は新たな宿主菌にコスミドＤＮＡを導入する
活性をもつというものである。コスミＰを用いると、供
与菌のファージ溶菌液を調製後受容菌と混合し、感染さ
せればよ〈従来のプラスミドを用いる場合に比べ迅速か
つ簡便にプラスミドの移入を達成することができる。
、Ｊ、Ｈｏｈｎ 、 Ｂ：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｌ、 ７５ 、４２４２ （１９７８） ）こ
のコスミドは、ファージを用いた形質導入法（ここでは
形質導入法はファージを介した遺伝子の移入と定義づけ
る（蛋白質核酸酵素別冊″′細菌・ファージ遺伝実験法
”Ｐ ６４ （１９７２） ）でその保持菌株から容易
に別の菌株に移入せしめることができるのが特長である
。即ちコスミド保持株にファージを感染させると一定の
割合でコスミドＤＮＡを含む偽ファージ粒子が形成され
、この粒子は新たな宿主菌にコスミドＤＮＡを導入する
活性をもつというものである。コスミＰを用いると、供
与菌のファージ溶菌液を調製後受容菌と混合し、感染さ
せればよ〈従来のプラスミドを用いる場合に比べ迅速か
つ簡便にプラスミドの移入を達成することができる。
しかしながら、コリネホルムグルタミン酸生産菌に卦い
ては、このような形質導入できるようなベクターの例は
なく、形質導入法によるプラスミドの移入はできなかっ
た。
ては、このような形質導入できるようなベクターの例は
なく、形質導入法によるプラスミドの移入はできなかっ
た。
本発明者らは叙上のような状況下においてコリネホルム
グルタミン酸生産菌を宿主とするプラスミドとコリネホ
ルムグルタミン酸生産菌全宿主とするファージのＤＮＡ
断片をくみ合わせて形質導入可能な複合シラスミドを作
成するのに成功した。
グルタミン酸生産菌を宿主とするプラスミドとコリネホ
ルムグルタミン酸生産菌全宿主とするファージのＤＮＡ
断片をくみ合わせて形質導入可能な複合シラスミドを作
成するのに成功した。
即ちこの発明は、（１）コリネホルムグルタミン酸生産
性細菌の細胞内で増殖できるプラスミドの少なくとも複
製開始点を含むＤＮＡ及び、（２）該細菌が該細菌の細
胞内で増殖できるファージに感染したとき該ファージ粒
子内に取り込まれるような該ファージのＤＮＡ領域を少
くとも含むＤＮＡよりなる形質導入可能な複合ベクター
である。
性細菌の細胞内で増殖できるプラスミドの少なくとも複
製開始点を含むＤＮＡ及び、（２）該細菌が該細菌の細
胞内で増殖できるファージに感染したとき該ファージ粒
子内に取り込まれるような該ファージのＤＮＡ領域を少
くとも含むＤＮＡよりなる形質導入可能な複合ベクター
である。
この複合シラスミドは、コリネホルムグルタミン酸生産
性細菌細胞に形質導入法によシ、きわめて簡便迅速に移
入することができ、組換えＤＮＡ法による有用菌株の育
種に際しきわめて有利である。
性細菌細胞に形質導入法によシ、きわめて簡便迅速に移
入することができ、組換えＤＮＡ法による有用菌株の育
種に際しきわめて有利である。
コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽性桿菌で
あり、非抗酸性でパーデース・マニユアル・オブ・デタ
ーミネイティブバクテリオロジー第８版５９９頁（１９
７４）に記載されている。
あり、非抗酸性でパーデース・マニユアル・オブ・デタ
ーミネイティブバクテリオロジー第８版５９９頁（１９
７４）に記載されている。
本発明のコリネホルム・グルタミン酸生産性細菌はこれ
らのコリネホルム・バクテリアの内に大量のグルタミン
酸を生産するもの又はそれより誘導したグルタミン酸生
産性を失った変異株であり、その野性株の例としては次
のようなものがあげられる。
らのコリネホルム・バクテリアの内に大量のグルタミン
酸を生産するもの又はそれより誘導したグルタミン酸生
産性を失った変異株であり、その野性株の例としては次
のようなものがあげられる。
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣ
Ｃ１４０２０ブレビバクテリウム・サラカロリティクム
ＡＴＣＣ１４０６６ブレピパクテリウム・インマ
リオフィルム ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ブ
レピノぐクテリウム・ロゼラム ＡＴ
ＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・フラバム
ＡＴＣｏ １３８２６ブレビパクテリウム・
チオグニタリス ＡＴＣＣ１９２４０コリネバ
クテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣ（１’
１３８７０コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ＡＴＣＣ１５８０６コリネパクテリウム・カルナ
エ ＡＴＣＣ１５９９１コリネバクテリ
ウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２，
１３０６（１コリネバクテリウム・リリウム
ＡＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メラセ
コーラ ＡＴＣＣ１７９６５ミクロバクテ
リウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４
コリネホルム・グルタミン酸生産性細菌にはグルタミン
酸生産性を失なった変異株、あるいは、リジン、アルギ
ニン等のアミノ酸、イノシン等のゾリンヌクレオシド、
イノシン５′−モノりん酸等のプリンヌクレオチＰ１又
はその他の生産物を生産する変異株も含まれる。
Ｃ１４０２０ブレビバクテリウム・サラカロリティクム
ＡＴＣＣ１４０６６ブレピパクテリウム・インマ
リオフィルム ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ブ
レピノぐクテリウム・ロゼラム ＡＴ
ＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・フラバム
ＡＴＣｏ １３８２６ブレビパクテリウム・
チオグニタリス ＡＴＣＣ１９２４０コリネバ
クテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣ（１’
１３８７０コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ＡＴＣＣ１５８０６コリネパクテリウム・カルナ
エ ＡＴＣＣ１５９９１コリネバクテリ
ウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２，
１３０６（１コリネバクテリウム・リリウム
ＡＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メラセ
コーラ ＡＴＣＣ１７９６５ミクロバクテ
リウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４
コリネホルム・グルタミン酸生産性細菌にはグルタミン
酸生産性を失なった変異株、あるいは、リジン、アルギ
ニン等のアミノ酸、イノシン等のゾリンヌクレオシド、
イノシン５′−モノりん酸等のプリンヌクレオチＰ１又
はその他の生産物を生産する変異株も含まれる。
これらコリネホルムグルタミン酸生産性・細菌の細胞内
で増殖できるプラスミドとしては、どのようなものでも
よく、例えばｐＡＭ３３０ 、 ｐＡＭ２８６ （特開
昭５８−６７６９９参照）、Ｉ）ＨＭ１５１９ （＠１
昭５８−７７８９５参照）、ｐＡＪ６５５ 、 ｐＡＪ
６１１ 。
で増殖できるプラスミドとしては、どのようなものでも
よく、例えばｐＡＭ３３０ 、 ｐＡＭ２８６ （特開
昭５８−６７６９９参照）、Ｉ）ＨＭ１５１９ （＠１
昭５８−７７８９５参照）、ｐＡＪ６５５ 、 ｐＡＪ
６１１ 。
ｐＡＪ１８４４ （特開昭５８−１９２９００参照）、
りＣＧＩ （特開昭５７−１３４５００参照）、ｐＣＧ
２（特開昭５８−３５１９７参照）、ｐＣＧ４ 、 ｐ
ｃＧｌｌ（特開昭５７−１８３７９９参照）などがおる
。
りＣＧＩ （特開昭５７−１３４５００参照）、ｐＣＧ
２（特開昭５８−３５１９７参照）、ｐＣＧ４ 、 ｐ
ｃＧｌｌ（特開昭５７−１８３７９９参照）などがおる
。
コリネホルムグルタミン酸生産性細菌のＡヨ胞内で増殖
できるファージも又どのようなものでもよく、例えばＣ
Ｐ−２、ＣＰ−３、ＣＰ−５、ＣＰ−７などＪ。
できるファージも又どのようなものでもよく、例えばＣ
Ｐ−２、ＣＰ−３、ＣＰ−５、ＣＰ−７などＪ。
Ｇｅｎ、Ａｐｐｌ、Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ、、 ２２ １
１９ （１９７６）に記載されているファージ、コリネ
バクテリウム・グルタミクムを宿主として見出されたφ
ＣＧＩ、φＣＧ２ 。
１９ （１９７６）に記載されているファージ、コリネ
バクテリウム・グルタミクムを宿主として見出されたφ
ＣＧＩ、φＣＧ２ 。
φＣＧ３ 、φＣＧ４ 、φＣＧ５など（日本農芸化学
会昭和５８年度大会要旨集Ｐ３３２）”発酵と工芸”誌
３５巻、１９８頁、２９４頁、３９２貞、４７３頁（１
９７７）に記載のファージなどがある。
会昭和５８年度大会要旨集Ｐ３３２）”発酵と工芸”誌
３５巻、１９８頁、２９４頁、３９２貞、４７３頁（１
９７７）に記載のファージなどがある。
本発明の複合プラスミドは、上記シラスミドＤＮＡの全
部を複合シラスミドの一部として含んでいてもよいが、
少くとも複↓開始点を含んでいる必要がある。また、上
記ファージについてもそのＤＮＡの全部を本発明の複合
シラスミＰの一部として含んでいてもよいが、少くとも
コリネホルムグルタミン酸生産性細菌がこのファージに
より感染せしめられたとき、ファージ粒子内に取り込ま
れるようなりＮＡ領域を少くとも含んでいる必要がある
。ファージにより宿主が感染せしめられたときファージ
粒子内に取勺込まれるようなりＮＡ領域は、付着末端（
ＣＯＳ ）を有していることが多い。
部を複合シラスミドの一部として含んでいてもよいが、
少くとも複↓開始点を含んでいる必要がある。また、上
記ファージについてもそのＤＮＡの全部を本発明の複合
シラスミＰの一部として含んでいてもよいが、少くとも
コリネホルムグルタミン酸生産性細菌がこのファージに
より感染せしめられたとき、ファージ粒子内に取り込ま
れるようなりＮＡ領域を少くとも含んでいる必要がある
。ファージにより宿主が感染せしめられたときファージ
粒子内に取勺込まれるようなりＮＡ領域は、付着末端（
ＣＯＳ ）を有していることが多い。
プラスミドＤＮＡ及びファージＤＮＡは通常の方法によ
シ分離することができる。ついで、ファージＤＮＡ及び
プラスミドＤＮＡはそれぞれ制限酵素を用いて一９ＪＩ
ｆｆｒする。ファージＤＮＡの切断断片を分画せずに全
断片を出発材料としても、目的の形質導入可能なグラス
ミドを得ることができるが、エシェリヒアコリのコスミ
ドの例（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
シ分離することができる。ついで、ファージＤＮＡ及び
プラスミドＤＮＡはそれぞれ制限酵素を用いて一９ＪＩ
ｆｆｒする。ファージＤＮＡの切断断片を分画せずに全
断片を出発材料としても、目的の形質導入可能なグラス
ミドを得ることができるが、エシェリヒアコリのコスミ
ドの例（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７３ ３２３８ （１９７６） ）
で知られるように、ファージの付着端（ＣＯＳ ）を含
むＤＮＡ断片のグラスミドへの挿入によシ目的が達せら
れる場合には、以下のように付着末端を含む断片を単離
して用いればより効率よく目的の組換えプラスミドを得
ることができる。即ち、ファージＤＮＡの付着端は通常
一本鎖相補性末端釦なっており、水素結合により付着端
同士対合するが、加熱急冷操作によシ容易に離れること
が知られる。従って加熱急冷操作前後のＤＮＡ断片をア
がロースグル電気泳動により解析すれば付着末端を持つ
ＤＮＡ断片を容易に同定しうる。付着末端を持つＤＮＡ
断片を同定したならばこの断片を電気泳動後のアがロー
スグルより通常の方法で抽出Ｂ製することができる。
で知られるように、ファージの付着端（ＣＯＳ ）を含
むＤＮＡ断片のグラスミドへの挿入によシ目的が達せら
れる場合には、以下のように付着末端を含む断片を単離
して用いればより効率よく目的の組換えプラスミドを得
ることができる。即ち、ファージＤＮＡの付着端は通常
一本鎖相補性末端釦なっており、水素結合により付着端
同士対合するが、加熱急冷操作によシ容易に離れること
が知られる。従って加熱急冷操作前後のＤＮＡ断片をア
がロースグル電気泳動により解析すれば付着末端を持つ
ＤＮＡ断片を容易に同定しうる。付着末端を持つＤＮＡ
断片を同定したならばこの断片を電気泳動後のアがロー
スグルより通常の方法で抽出Ｂ製することができる。
かくして得られたファージＤＮＡ断片と切断されたシラ
スミドＤＮＡとを連結せしめる方法は、リガーゼを用い
る通常の方法が使用できる。
スミドＤＮＡとを連結せしめる方法は、リガーゼを用い
る通常の方法が使用できる。
一方、ターミナルトランスフエラーゼヲ用いて、染色体
ＤＮＡ断片と開裂したベクターＤＮＡとにデオキシグア
ニル酸とデオキシチシジル酸、または、デオキシグアニ
ル酸とデオキシチシジル酸をそれぞれ付加し、混合した
のち、アニーリングして連結せしめる方法も利用しうる
。
ＤＮＡ断片と開裂したベクターＤＮＡとにデオキシグア
ニル酸とデオキシチシジル酸、または、デオキシグアニ
ル酸とデオキシチシジル酸をそれぞれ付加し、混合した
のち、アニーリングして連結せしめる方法も利用しうる
。
このようにして得られた、ファージＤＮＡとプラスミド
ＤＮＡ （！：の連結物のコリネホルムグルタミン酸生
産性細菌１て属する受容菌への導入は、エシェリヒア・
コＩＪ Ｋ −１２について報告されている様な（Ｍａ
ｎｄｅｌ 、 Ｍ、ａｎｄ Ｈｉｇａ ＋ Ａｎ ＋
、Ｌ ＭＯＩＩＩ Ｂｉｏｌ、 ＋５３．１５９（１９
７６））受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡ
の透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリスにつ
いて翅失すれている様に（Ｄｕｎｃａｎ ＋ Ｃ−Ｈ，
＋ Ｗｉｌｓｏｎ ＊ Ｇ、 Ａ、 ａｎｄ Ｙｏｕｎ
ｇ。
ＤＮＡ （！：の連結物のコリネホルムグルタミン酸生
産性細菌１て属する受容菌への導入は、エシェリヒア・
コＩＪ Ｋ −１２について報告されている様な（Ｍａ
ｎｄｅｌ 、 Ｍ、ａｎｄ Ｈｉｇａ ＋ Ａｎ ＋
、Ｌ ＭＯＩＩＩ Ｂｉｏｌ、 ＋５３．１５９（１９
７６））受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡ
の透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリスにつ
いて翅失すれている様に（Ｄｕｎｃａｎ ＋ Ｃ−Ｈ，
＋ Ｗｉｌｓｏｎ ＊ Ｇ、 Ａ、 ａｎｄ Ｙｏｕｎ
ｇ。
Ｆ、Ｅ、、 Ｇｅｎｅ、 １ 、１５３（１９７７））
細胞がＤＮＡを取り込み得る様になる増殖段階（いわゆ
るコンピテントセル）に導入する方法により可能である
。あスす るいは、バチルス・−ブチリス、放線菌類および（酵母
について知られている様に（Ｃｈａｎｇ、 Ｓ、 ａｎ
ｄＣｈｏｅｎ、Ｓ、Ｎ、、Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｏｎ
ｅｔ、、 １６８＋１１１（１９７９） ： Ｂｉｂｂ
、 Ｍ、 Ｊ、 、 Ｗａｒｄ＋ Ｊ、Ｍ、 ａｎｄ
Ｈｏｐｗｏｏｄ。
細胞がＤＮＡを取り込み得る様になる増殖段階（いわゆ
るコンピテントセル）に導入する方法により可能である
。あスす るいは、バチルス・−ブチリス、放線菌類および（酵母
について知られている様に（Ｃｈａｎｇ、 Ｓ、 ａｎ
ｄＣｈｏｅｎ、Ｓ、Ｎ、、Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｏｎ
ｅｔ、、 １６８＋１１１（１９７９） ： Ｂｉｂｂ
、 Ｍ、 Ｊ、 、 Ｗａｒｄ＋ Ｊ、Ｍ、 ａｎｄ
Ｈｏｐｗｏｏｄ。
０゜Ａ、 、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２７４ 、３９８ （
１９７８） ： Ｈｌｎｎｅｎ、 Ａ、 ｐＨ１ｃｋｓ
、 Ｊ、 Ｂ、 ａｎｄ Ｆｉｎｋ ｅ Ｇ、 Ｒ，
ｐ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
１９７８） ： Ｈｌｎｎｅｎ、 Ａ、 ｐＨ１ｃｋｓ
、 Ｊ、 Ｂ、 ａｎｄ Ｆｉｎｋ ｅ Ｇ、 Ｒ，
ｐ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
ＳｃＬ ＵＳＡ、 ７５１９２９ （１９７８） ）、
ＤＮＡ受容菌を、プラスミドＤＮＡを容易に取り込むプ
ロトプラストまたはスフェロプラストにしてプラスミド
をＤＮＡ受容菌に導入することも可能である。
ＤＮＡ受容菌を、プラスミドＤＮＡを容易に取り込むプ
ロトプラストまたはスフェロプラストにしてプラスミド
をＤＮＡ受容菌に導入することも可能である。
プロトシラスト法では上記のバチルス・ズブチリスの方
法でも充分高い頻度を得ることができるし、特開昭５７
−１８３７９９に記載されたコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム屑のプロトシラストにポリエチレ
ングリコールまたは一すピニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にＤＮＡをとシ込ませる方法も当然利用
できる。
法でも充分高い頻度を得ることができるし、特開昭５７
−１８３７９９に記載されたコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム屑のプロトシラストにポリエチレ
ングリコールまたは一すピニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にＤＮＡをとシ込ませる方法も当然利用
できる。
ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの
カワリに、カルブキシメチルセルロース、デキストラン
、フィコール、プルロニックＦ６８（セルパ社）などの
添加によってＤＮＡのとり込みを促進させる方法でも同
等の結果が得られる。
カワリに、カルブキシメチルセルロース、デキストラン
、フィコール、プルロニックＦ６８（セルパ社）などの
添加によってＤＮＡのとり込みを促進させる方法でも同
等の結果が得られる。
形質導入可能な組換えシラスミドを保有する菌株の選択
は以下の方法で達せられる。形質転換後適当な培地上で
一部コロニーを形成させたのち、これらのコロニーを混
合して、ファー−７を感染させて溶菌せしめ、ファージ
液を調製する。これをプラスミドを含まな１新た々宿主
菌に感染させたのち、シラスミドが導入された菌株を検
紫すればよい。プレスミド上に薬剤耐性遺伝子などが存
在する場合にはこの形質を選択的に用いることができ、
容易に目的のプラスミドを保有する菌株を得ることがで
きる。
は以下の方法で達せられる。形質転換後適当な培地上で
一部コロニーを形成させたのち、これらのコロニーを混
合して、ファー−７を感染させて溶菌せしめ、ファージ
液を調製する。これをプラスミドを含まな１新た々宿主
菌に感染させたのち、シラスミドが導入された菌株を検
紫すればよい。プレスミド上に薬剤耐性遺伝子などが存
在する場合にはこの形質を選択的に用いることができ、
容易に目的のプラスミドを保有する菌株を得ることがで
きる。
目的の組換えプラスミドを保有する菌株よシブラスミド
ＤＮＡを単離する方法は、例えば菌体をリゾチーム・Ｓ
ＤＳ処理により溶菌させフェノール処理ののち、２容の
エタノールを加えてＤＮＡを沈澱回収するというような
通常の方法で達せられる。
ＤＮＡを単離する方法は、例えば菌体をリゾチーム・Ｓ
ＤＳ処理により溶菌させフェノール処理ののち、２容の
エタノールを加えてＤＮＡを沈澱回収するというような
通常の方法で達せられる。
実施例
（１）Ｆ＋ ファージＤＮＡの調製
複合プラスミド造成に用いた７アージＦ１はブレビバク
テリウム働ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９を
宿主菌として新たに分離した。
テリウム働ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９を
宿主菌として新たに分離した。
Ｆ、ファージＤＮＡは以下の方法により調製した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ’
１３８６９を１！のｅＭＧ培地（ベゾトン１１１／ｄ
ｉ。
１３８６９を１！のｅＭＧ培地（ベゾトン１１１／ｄ
ｉ。
酵母エキス１１ｋ、グルコース０．５１／ｄｔ 、及び
ＮａＣｔｏ、 ５ Ｅ／ｄｉを含み、−７，２にｉｍ、
１したもの）に植菌し、３０℃で約１時間振盪培養を行
なったのち、Ｆ、ファージを多重感染度（−ｎｏｌ ）
が約０．１になるように加え更に５時間振盪培養を継続
し、これにより７アージによる溶菌をおこさせた。溶菌
液をハイフロス−パーセル（純正化学製）で濾過し菌体
残渣を除去後、濾液にデオキシＩＪ ｚヌクレアーゼＩ
とり？ヌクレアーゼＡ（シグマｉｆ）を各々１０μｙ７
ｍｔ添加し、この濾液を３０℃に２０分間保った。更に
濾液に／４’ンクレアチン２００μ７７／ｍｌを加えて
３０℃に２０分間保った後、塩化ナトリウムを最終濃度
０．５ Ｍ 、 ｙｌ？ｌエリレングリコール６０００
を最終濃度１０％になるようにそれぞれ濾液に添加し、
ついでこれを４℃に１日置き、Ｆｌ ファージ粒子を
沈澱させた。５０００ｒｐｍ １０分の遠心により沈澱
を回収後、１係のＳＤＳを含むＴＥＮ緩備液（２０ｍＭ
）リス塩酸塩、２０ｍＭＮａＣ４，１ｍＭＥＤＴＡ
（ｐ）４８．０ ） ） １０ｍｌに溶解せしめた。こ
れより通常のフェノール処理法によ’）ｓ Ｆｔ ファ
ージＤＮＡを抽出、精製し、最終的に約５１ｎ９のＤＮ
Ａを得た。
ＮａＣｔｏ、 ５ Ｅ／ｄｉを含み、−７，２にｉｍ、
１したもの）に植菌し、３０℃で約１時間振盪培養を行
なったのち、Ｆ、ファージを多重感染度（−ｎｏｌ ）
が約０．１になるように加え更に５時間振盪培養を継続
し、これにより７アージによる溶菌をおこさせた。溶菌
液をハイフロス−パーセル（純正化学製）で濾過し菌体
残渣を除去後、濾液にデオキシＩＪ ｚヌクレアーゼＩ
とり？ヌクレアーゼＡ（シグマｉｆ）を各々１０μｙ７
ｍｔ添加し、この濾液を３０℃に２０分間保った。更に
濾液に／４’ンクレアチン２００μ７７／ｍｌを加えて
３０℃に２０分間保った後、塩化ナトリウムを最終濃度
０．５ Ｍ 、 ｙｌ？ｌエリレングリコール６０００
を最終濃度１０％になるようにそれぞれ濾液に添加し、
ついでこれを４℃に１日置き、Ｆｌ ファージ粒子を
沈澱させた。５０００ｒｐｍ １０分の遠心により沈澱
を回収後、１係のＳＤＳを含むＴＥＮ緩備液（２０ｍＭ
）リス塩酸塩、２０ｍＭＮａＣ４，１ｍＭＥＤＴＡ
（ｐ）４８．０ ） ） １０ｍｌに溶解せしめた。こ
れより通常のフェノール処理法によ’）ｓ Ｆｔ ファ
ージＤＮＡを抽出、精製し、最終的に約５１ｎ９のＤＮ
Ａを得た。
（２）Ｆｓ ファージ付着末端（ＣＯＳ）を含むＤＮＡ
断片の調製 Ｆ、ファージＤＮＡ約５μｇを含む緩衝液に制限エンド
ヌクレアーゼＨ１ｎｄ ＩＩＩを加えて３７℃に２時間
保ちＤＮＡ鎖を完全に切断した。反応液の一部をとって
７０℃に１０分間加熱後急冷し、熱処理を施さない反応
液と同時Ｋ Ｏ，８％のアがロースグル電気泳動にかけ
た７渋動の枯−早、Ｈ１ｎｄｒｌｌ帆理ｆｒわ生じたＦ
１ファージＤＮＡ断片のうち、約２、ｌｋｂの断片が熱
処理によシ約１．６ ｋｂと約０．５ｋｂの断片に分離
し、この２．１ ｋｂ断片中に付着端（ＣＯＳ ）が存
在することが明らかとなった。そこでこの２１ｋｂ断片
をアガロースグルよシ抽出精製し、ＤＮＡ約０．４μｇ
を得た。
断片の調製 Ｆ、ファージＤＮＡ約５μｇを含む緩衝液に制限エンド
ヌクレアーゼＨ１ｎｄ ＩＩＩを加えて３７℃に２時間
保ちＤＮＡ鎖を完全に切断した。反応液の一部をとって
７０℃に１０分間加熱後急冷し、熱処理を施さない反応
液と同時Ｋ Ｏ，８％のアがロースグル電気泳動にかけ
た７渋動の枯−早、Ｈ１ｎｄｒｌｌ帆理ｆｒわ生じたＦ
１ファージＤＮＡ断片のうち、約２、ｌｋｂの断片が熱
処理によシ約１．６ ｋｂと約０．５ｋｂの断片に分離
し、この２．１ ｋｂ断片中に付着端（ＣＯＳ ）が存
在することが明らかとなった。そこでこの２１ｋｂ断片
をアガロースグルよシ抽出精製し、ＤＮＡ約０．４μｇ
を得た。
（３）プラスミドＤＮＡの調製
ベクターとしてｐＡＪ４３ （ブレビバクテリウム・ラ
クトフェルメンタムＡＪ １１９９７ ＦＥＲＭ −Ｐ
６８５７として寄託されている）（分子量３．４メが
ダルトン）を用いた。
クトフェルメンタムＡＪ １１９９７ ＦＥＲＭ −Ｐ
６８５７として寄託されている）（分子量３．４メが
ダルトン）を用いた。
ＰＡＪ６５５ （特開昭５８−１９２９００参咥）ヨり
次のようにしてｐＡＪ４３を造成した。
次のようにしてｐＡＪ４３を造成した。
ｐＡＪ６５５ ｅ保持するブレビバクテリウム・ラクト
２エルメンタムＡ６４はクロラムフェニコール１００ｔ
４／ｕｌ ｆ含むＣＭＧ寒天培地（ベプトｙ １０ ｇ
／Ｚ。
２エルメンタムＡ６４はクロラムフェニコール１００ｔ
４／ｕｌ ｆ含むＣＭＧ寒天培地（ベプトｙ １０ ｇ
／Ｚ。
酵母エキス１０１／Ｉ＝、グ” コース５ ｌｉｅ ｓ
ＮａＣ１５ｇ／！、寒天２０Ｉβを含み−７，２に調
辺したもの）上で生育不可能であるが、本菌をＣＭＧ培
地で培養シ、クロラムフェニコール１００μ、ｊｉ’％
ｉｃ ｆ 含むＣＭＧ液体培地に３０℃で一晩培養後、
同濃度のクロラムフェニコールを含むＣＭＧ培地に適当
１−塗布し３０℃１〜２日間培養することによりクロラ
ムフェニコール１００μｉ／ｍｌに耐性を示す株を１採
得た。不味のクロラムフェニコール耐性度ｔＣＰｖＴＧ
培地で調べたところ２００μ、９ＡＩＬｔまで耐性を示
した。
ＮａＣ１５ｇ／！、寒天２０Ｉβを含み−７，２に調
辺したもの）上で生育不可能であるが、本菌をＣＭＧ培
地で培養シ、クロラムフェニコール１００μ、ｊｉ’％
ｉｃ ｆ 含むＣＭＧ液体培地に３０℃で一晩培養後、
同濃度のクロラムフェニコールを含むＣＭＧ培地に適当
１−塗布し３０℃１〜２日間培養することによりクロラ
ムフェニコール１００μｉ／ｍｌに耐性を示す株を１採
得た。不味のクロラムフェニコール耐性度ｔＣＰｖＴＧ
培地で調べたところ２００μ、９ＡＩＬｔまで耐性を示
した。
上記の結果、得られたクロラムフェニコール高濃度耐性
株からｐＡＪ４３をＤＮＡ次のようにして調製した。ま
ず本株をクロラムフェニコー＃ｔ−１０ｐＪｉＪｒｕｔ
含ム１．６ ノＣＭＧ液体培地に接種シ、３０℃で対数
増殖期後期まで培養し、集菌した。常法によりリゾチー
ムとＳＤＳにょシ溶菌せしめた後、３０．０００Ｘ、？
、３０分の超遠心により上清を得た。これにポリエチレ
ングリコール（最終濃度１０係）を添加してＤＮＡを沈
澱せしめ、これを濃縮後、沈澱物をトリス・ＥＤＴＡ−
Ｎａｃｔバッファー（ｐＨｓ、ｏ ） １０ｒｎｌに溶
解した。ＤＮＡをすｙｔ？３Ｅクレアーゼで処理（リボ
ヌクレアーゼ１５０μｇ、、’ｍｔ テ３７℃、３０分
間反応）後、フェノール抽出し、ついで２倍量のエタノ
ールを加ｔ−２０℃でＤＮＡを沈澱させ、沈澱物を１ｒ
ｎ１．のトリス・ＥＤＴＡ−Ｎａｃｔバッファーに溶解
した。このＤＮＡ溶液をアがロースダル電気泳動法（電
圧グル１ｃｍ当り５Ｖ、１５時間）によって最終１５０
μｙの純粋なｐＡＪ４３ ｆラスミドＤＮＡを分画採取
した。
株からｐＡＪ４３をＤＮＡ次のようにして調製した。ま
ず本株をクロラムフェニコー＃ｔ−１０ｐＪｉＪｒｕｔ
含ム１．６ ノＣＭＧ液体培地に接種シ、３０℃で対数
増殖期後期まで培養し、集菌した。常法によりリゾチー
ムとＳＤＳにょシ溶菌せしめた後、３０．０００Ｘ、？
、３０分の超遠心により上清を得た。これにポリエチレ
ングリコール（最終濃度１０係）を添加してＤＮＡを沈
澱せしめ、これを濃縮後、沈澱物をトリス・ＥＤＴＡ−
Ｎａｃｔバッファー（ｐＨｓ、ｏ ） １０ｒｎｌに溶
解した。ＤＮＡをすｙｔ？３Ｅクレアーゼで処理（リボ
ヌクレアーゼ１５０μｇ、、’ｍｔ テ３７℃、３０分
間反応）後、フェノール抽出し、ついで２倍量のエタノ
ールを加ｔ−２０℃でＤＮＡを沈澱させ、沈澱物を１ｒ
ｎ１．のトリス・ＥＤＴＡ−Ｎａｃｔバッファーに溶解
した。このＤＮＡ溶液をアがロースダル電気泳動法（電
圧グル１ｃｍ当り５Ｖ、１５時間）によって最終１５０
μｙの純粋なｐＡＪ４３ ｆラスミドＤＮＡを分画採取
した。
ｐＡＪ４３ Ｑ：） 分子ｉｔの決定はアガロースゲル
電気泳動によった。
電気泳動によった。
アガロースダル電気泳動はシャープ（Ｐ、Ａ。
５ｈａｒｐ ）らの方法（Ｂｌｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ
１２ ｒ ３０５５（１９７３））により、０８優グル
を用い、ｒル長さα当ｂ、ｓｖで１５時間、定電圧で泳
動した。分子量はｐＡＪ４３を１ケ所切断する制限酵素
Ｈ１ｎｄ ｍｏ、５ユニツトをｐＡＪ４３ 、０．５μ
ｌに３７℃、１時間反応させ、切断し、直線状にした後
、分子量既知の分子量マーカー、λファージのＨｉｎｄ
ｍフラグメン） （ＢＲＬから購入）との移動度の比
較によって算出し、３．４ Ｍｄと計算された。
１２ ｒ ３０５５（１９７３））により、０８優グル
を用い、ｒル長さα当ｂ、ｓｖで１５時間、定電圧で泳
動した。分子量はｐＡＪ４３を１ケ所切断する制限酵素
Ｈ１ｎｄ ｍｏ、５ユニツトをｐＡＪ４３ 、０．５μ
ｌに３７℃、１時間反応させ、切断し、直線状にした後
、分子量既知の分子量マーカー、λファージのＨｉｎｄ
ｍフラグメン） （ＢＲＬから購入）との移動度の比
較によって算出し、３．４ Ｍｄと計算された。
制限酵素切断後のＤＮＡ断片を７ガロースダル電気泳動
で解析した結果、ｐＡＪ４３はｐＡＪ６５５から１ｎｖ
ｌｖｏでｄｅｌｅｔｉｏｎによシ生じたｐＢＲ３２５の
クロラムフェニコール耐性遺伝子領域を含む約Ｉ Ｍｄ
とｐＡＭ３３０の複製維持に必須の領域を含む約２．４
Ｍｄの７ラグメントから成る小型プラスミドであるこ
とが判明した。′ 、（４）Ｆｓ ファージのｃｏｓを含むＤＮＡ断片のベ
クターへの挿入 （３）で得たプラスミドｐＡＪ４３約１μＩを制限エン
ドヌクレアーゼＨ１ｎｄ Ｉ［Ｉで３７℃で２時間保ち
、完全に切断した。６５℃、１０分間の熱処理後、（２
）で得た２、１ｋｂのＤＮＡ断片を加え、ＡＴＰ及びジ
チオスレイトール存在下、Ｔ４７アージ由来のＤＮＡリ
ガーゼによって１０℃、２４時間ＤＮＡ鎖の連結反応を
行った。反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応
終了後のＤＮＡを沈澱採取した。
で解析した結果、ｐＡＪ４３はｐＡＪ６５５から１ｎｖ
ｌｖｏでｄｅｌｅｔｉｏｎによシ生じたｐＢＲ３２５の
クロラムフェニコール耐性遺伝子領域を含む約Ｉ Ｍｄ
とｐＡＭ３３０の複製維持に必須の領域を含む約２．４
Ｍｄの７ラグメントから成る小型プラスミドであるこ
とが判明した。′ 、（４）Ｆｓ ファージのｃｏｓを含むＤＮＡ断片のベ
クターへの挿入 （３）で得たプラスミドｐＡＪ４３約１μＩを制限エン
ドヌクレアーゼＨ１ｎｄ Ｉ［Ｉで３７℃で２時間保ち
、完全に切断した。６５℃、１０分間の熱処理後、（２
）で得た２、１ｋｂのＤＮＡ断片を加え、ＡＴＰ及びジ
チオスレイトール存在下、Ｔ４７アージ由来のＤＮＡリ
ガーゼによって１０℃、２４時間ＤＮＡ鎖の連結反応を
行った。反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応
終了後のＤＮＡを沈澱採取した。
得られたＤＮＡを少量のＴＥＮ緩衝液に溶解し以下の形
質転換に用いた。
質転換に用いた。
（５）形質転換
形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。受容菌とじて用いたブレビバ
クテリウムラクトファーメンタムＡＪ１２０３６ （Ｆ
ＥＲＭ Ｐ １５４４）はブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株よりストレプトマ
イシン耐性株として分離した。まず、この受容菌を５１
！ＬｌのＣＭＧ液体培地で対数増殖期の初期まで培養し
、培地にペニシリンＧを０．６ユニツト／ｄ添加後、さ
らに１．５時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め
た。菌体ｆｃ０．５ Ｍシェークロース、２０ｍＭマレ
インＷｌ 、２０ ｍＭ 塩化マグネシウム、３．５４
ベナ、セイブロス（Ｄｌｆｃｏ ）がラナルＳＭＭＰ培
地（ｐ）（６，５）Ｏ１５ｍｌで洗浄した。次いで１０
η／ｍｌのリゾチームを含むＳＮＭＰ培地に憑濁し３０
℃で２０時間プロトプラスト化を図った。
ーメーション法を用いた。受容菌とじて用いたブレビバ
クテリウムラクトファーメンタムＡＪ１２０３６ （Ｆ
ＥＲＭ Ｐ １５４４）はブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株よりストレプトマ
イシン耐性株として分離した。まず、この受容菌を５１
！ＬｌのＣＭＧ液体培地で対数増殖期の初期まで培養し
、培地にペニシリンＧを０．６ユニツト／ｄ添加後、さ
らに１．５時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め
た。菌体ｆｃ０．５ Ｍシェークロース、２０ｍＭマレ
インＷｌ 、２０ ｍＭ 塩化マグネシウム、３．５４
ベナ、セイブロス（Ｄｌｆｃｏ ）がラナルＳＭＭＰ培
地（ｐ）（６，５）Ｏ１５ｍｌで洗浄した。次いで１０
η／ｍｌのリゾチームを含むＳＮＭＰ培地に憑濁し３０
℃で２０時間プロトプラスト化を図った。
６０００Ｘ、Ｆ、１０分間遠心分離後、プロトプラスト
をＳＭＭＰで洗浄し、０．５ｍ４の８ＶＭＰに再度懸濁
した。この様にして得られたプロトプラストと（４）で
調製したＤＮＡ約１μＩを５ｒｒＩＭＥＤＴＡ存在下で
混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が３０係に
なる様に添加した後、ＤＮＡをプロトプラストに取シ込
ませる為に室温に２分間放置した。このデロトゾラスト
をＳＭＭＰ培地１ゴで洗浄後、ＳＭＭＰ培地１Ｍに再懸
濁し、形質発現の為、３０℃で２時間培養した。この培
養液をｐＨ７，０のプロトシラスト再生培地上に塗布し
た。プロトプラスト再生培地は蒸留水１！あたりトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２ ＦｌＫＣｔｏ
、５ Ｆ、グルコース１０ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０８
，１１！、ＣａＣ４２’ ２Ｈ２０２，２ｇ、Ｋプトン
４ｇ１粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸（Ｄｊｆｃｏ社
） １．９． Ｋ２ＨＰＯ４０，２，９’、コ／％り
酸ナトリウム１３５．９．寒天８ｇ及びクロラムフェニ
コール３μｌ／ｍｌを含む。
をＳＭＭＰで洗浄し、０．５ｍ４の８ＶＭＰに再度懸濁
した。この様にして得られたプロトプラストと（４）で
調製したＤＮＡ約１μＩを５ｒｒＩＭＥＤＴＡ存在下で
混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が３０係に
なる様に添加した後、ＤＮＡをプロトプラストに取シ込
ませる為に室温に２分間放置した。このデロトゾラスト
をＳＭＭＰ培地１ゴで洗浄後、ＳＭＭＰ培地１Ｍに再懸
濁し、形質発現の為、３０℃で２時間培養した。この培
養液をｐＨ７，０のプロトシラスト再生培地上に塗布し
た。プロトプラスト再生培地は蒸留水１！あたりトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２ ＦｌＫＣｔｏ
、５ Ｆ、グルコース１０ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０８
，１１！、ＣａＣ４２’ ２Ｈ２０２，２ｇ、Ｋプトン
４ｇ１粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸（Ｄｊｆｃｏ社
） １．９． Ｋ２ＨＰＯ４０，２，９’、コ／％り
酸ナトリウム１３５．９．寒天８ｇ及びクロラムフェニ
コール３μｌ／ｍｌを含む。
３０℃で１０日間培養後、約１，０００個のクロラムフ
ェニコール耐性コロニーが出現してきた。
ェニコール耐性コロニーが出現してきた。
（６）形質導入
これらのコロニーを全部まとめてかきとって生理食塩水
に懇濁し、その一部をＦ１ファージ約１０５と共に２係
寒天、１０μｊｉ／ｆｎｌクロラムフエニコールを含む
ＣＭＧ培地平板１枚に塗布し、３０℃にて１日間培養し
た。平板上でＦｌ ７アージによる溶菌現象が確認され
たので５ ａｔの生理食塩水を平板上に加えファージ粒
子を懸濁した。１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心によ
り菌体残渣を除去後、除菌フィルター（ポアサイズ０．
２２μ）を通して生菌を除−た。
に懇濁し、その一部をＦ１ファージ約１０５と共に２係
寒天、１０μｊｉ／ｆｎｌクロラムフエニコールを含む
ＣＭＧ培地平板１枚に塗布し、３０℃にて１日間培養し
た。平板上でＦｌ ７アージによる溶菌現象が確認され
たので５ ａｔの生理食塩水を平板上に加えファージ粒
子を懸濁した。１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心によ
り菌体残渣を除去後、除菌フィルター（ポアサイズ０．
２２μ）を通して生菌を除−た。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０
３６の対数増殖期の菌体的１０に対し上記のファージ液
Ｑ、ｌ ｍｅを加え、３０℃で９０分ゆるやかに振盪し
、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心にて、菌体を回収し、
これを２回生理食塩水で洗浄した。
３６の対数増殖期の菌体的１０に対し上記のファージ液
Ｑ、ｌ ｍｅを加え、３０℃で９０分ゆるやかに振盪し
、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心にて、菌体を回収し、
これを２回生理食塩水で洗浄した。
洗浄菌体を、２俤寒天及び１０μｐ７ｍｔクロラムフェ
ニコールを含むＣＭＧ培地平板に塗布した。３０℃で２
日培善すると３コロニーが生じた。これらの３株をそれ
ぞれ生理食塩水に懸濁後、上記と同様にＦ’ｌ ファー
ジとともに寒天平板上で培養してファージ液を調製しＡ
Ｊ１２０３６株−＼の形質導入を行なった。
ニコールを含むＣＭＧ培地平板に塗布した。３０℃で２
日培善すると３コロニーが生じた。これらの３株をそれ
ぞれ生理食塩水に懸濁後、上記と同様にＦ’ｌ ファー
ジとともに寒天平板上で培養してファージ液を調製しＡ
Ｊ１２０３６株−＼の形質導入を行なった。
その結果ベクターのｐＡＪ４３を保持する菌株より得た
ファージ液には形質導入能は全く検出されないが上記の
３株ではいずれから調製したファージ液によっても高頻
度にクロラムフェニコール耐性コロニーが生じこのうち
ＡＪ １２１３６ （ＦＥＲＭ −Ｐ１５４５ ）より
得た７アージ約１０ を受容菌ＡＪ１２０３６株約１０
に感染させた場合には約１０ のクロラムフェニコー
ル耐性コロニーが生シタ。これらの耐性コロニー及びＡ
Ｊ １２１３６株からは約４．８Ｍｄのプラスミドが検
出され、このプラスミドがベクターのｐＡＪ４３ （３
，４Ｍｄ ）とＦｌ ファージのＣｏｓ部位を含むＤＮ
Ａ断片（１，４Ｍｄ ）とからなり、形質導入可能なコ
スミＦであることは明らかである。
ファージ液には形質導入能は全く検出されないが上記の
３株ではいずれから調製したファージ液によっても高頻
度にクロラムフェニコール耐性コロニーが生じこのうち
ＡＪ １２１３６ （ＦＥＲＭ −Ｐ１５４５ ）より
得た７アージ約１０ を受容菌ＡＪ１２０３６株約１０
に感染させた場合には約１０ のクロラムフェニコー
ル耐性コロニーが生シタ。これらの耐性コロニー及びＡ
Ｊ １２１３６株からは約４．８Ｍｄのプラスミドが検
出され、このプラスミドがベクターのｐＡＪ４３ （３
，４Ｍｄ ）とＦｌ ファージのＣｏｓ部位を含むＤＮ
Ａ断片（１，４Ｍｄ ）とからなり、形質導入可能なコ
スミＦであることは明らかである。
ＡＪ １２１３６株より見出されたコスミドをｐＡＪ６
６７と名付けた。ＡＪ １２１３６より得たファージ液
を用いコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３
０６０株へのｐＡＪ６６７の導入をはかった。
６７と名付けた。ＡＪ １２１３６より得たファージ液
を用いコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３
０６０株へのｐＡＪ６６７の導入をはかった。
約１０ ファージ粒子を用いた時、４９コのクロラムフ
ェニコール耐性株が得られた。これからはいずれも４，
８メがダルトンのｐＡＪ６６７グラスミＰＤＮＡが検出
された形質導入によりｐＡＪ６６７がコリネバクテリウ
ム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０６０株にも導入された
のは明らかである。
ェニコール耐性株が得られた。これからはいずれも４，
８メがダルトンのｐＡＪ６６７グラスミＰＤＮＡが検出
された形質導入によりｐＡＪ６６７がコリネバクテリウ
ム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０６０株にも導入された
のは明らかである。
なお、プラスミドベクターとしてｐＡＪ１８４４ （特
開昭５８−１９２９００参照）、ファージにｃｐ −２
３フアージ（Ｊ、 Ｇｅｎ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ、 、 ２２１１９ （１９７６）参照）を用いた
場合にも同様にして形質導入可能な組換えプラスミドｐ
ＡＪ６６８が得られた。
開昭５８−１９２９００参照）、ファージにｃｐ −２
３フアージ（Ｊ、 Ｇｅｎ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ、 、 ２２１１９ （１９７６）参照）を用いた
場合にも同様にして形質導入可能な組換えプラスミドｐ
ＡＪ６６８が得られた。
本発明に用いたＦ１ファージはＡＪ １２１３６株に溶
原化しており、自然誘発またはマイトマイシンＣを０．
０５〜０．２μＩＩ／ｙｔｌを含むＣＭＧ液体液体中地
中盪培養することによシ、培地中に放出されてくる。
原化しており、自然誘発またはマイトマイシンＣを０．
０５〜０．２μＩＩ／ｙｔｌを含むＣＭＧ液体液体中地
中盪培養することによシ、培地中に放出されてくる。
これは例えばプレバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＴＣＣ１３８６９株に感染させれば容易に高い収量で
ファージ粒子が得られる。ｐＡＪ４３を含む菌株ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１９９７は
ＦＥＲＭ −Ｐ ６８５７として寄託されている。
ＡＴＣＣ１３８６９株に感染させれば容易に高い収量で
ファージ粒子が得られる。ｐＡＪ４３を含む菌株ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１９９７は
ＦＥＲＭ −Ｐ ６８５７として寄託されている。
実施例２
（１） ｐＵＣ４に由来カナマイシン耐性遺伝子を含
むＤＮＡ断片の調製 ＰＵＣ４Ｋ （ファルマシア社製、Ｇｅｎｅ 、１黒２
５９（１９８２） ） ５ ｔｉｌｌを制限エンドヌク
レアーゼＢ ａ ｍ Ｈｒで３７℃、２時間保ち、完全
に切断後、０．８’ｌのアガロースデル電気泳動にかけ
た。泳動の結果Ｂａｍ ＨＩ処理により生じた約１．３
ｋｂ断片中にカナマイシン耐性遺伝子が存在すること
は明らかであり、この１．３ｋｂ断片をアがロースダル
抽出ｆＦ［し、ＤＮＡ約０．５μｙを得た。
むＤＮＡ断片の調製 ＰＵＣ４Ｋ （ファルマシア社製、Ｇｅｎｅ 、１黒２
５９（１９８２） ） ５ ｔｉｌｌを制限エンドヌク
レアーゼＢ ａ ｍ Ｈｒで３７℃、２時間保ち、完全
に切断後、０．８’ｌのアガロースデル電気泳動にかけ
た。泳動の結果Ｂａｍ ＨＩ処理により生じた約１．３
ｋｂ断片中にカナマイシン耐性遺伝子が存在すること
は明らかであり、この１．３ｋｂ断片をアがロースダル
抽出ｆＦ［し、ＤＮＡ約０．５μｙを得た。
（２） カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片の
コスミドｐＡＪ６６７への挿入 実施例１の（３）で述べた方法により調製したコスミド
ｐＡＪ６６７ （ｉ １図に制限酵素切断地図を示した
）約１μＩを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで３７
℃に２時間保ち、完全に切断した。６５℃、１０分間の
熱処理後、（１）で得た１、３ｋｂのＤＮＡ断片を加え
、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファーゾ
由来のＤＮＡ ＩＪガーゼによって１０℃、２４時間Ｄ
ＮＡ鎖の連結反応を行った。反応液に２倍容のエタノー
ルを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採取した＠ 得られたＤＮＡを少量のＴＥＮ緩衝液に溶解し以下の形
質転換に用いた。
コスミドｐＡＪ６６７への挿入 実施例１の（３）で述べた方法により調製したコスミド
ｐＡＪ６６７ （ｉ １図に制限酵素切断地図を示した
）約１μＩを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで３７
℃に２時間保ち、完全に切断した。６５℃、１０分間の
熱処理後、（１）で得た１、３ｋｂのＤＮＡ断片を加え
、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファーゾ
由来のＤＮＡ ＩＪガーゼによって１０℃、２４時間Ｄ
ＮＡ鎖の連結反応を行った。反応液に２倍容のエタノー
ルを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採取した＠ 得られたＤＮＡを少量のＴＥＮ緩衝液に溶解し以下の形
質転換に用いた。
（３）形質転換
形質転換の方法としては、ゾロドプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。受容菌として用いたブレピノ
々クテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２０３６
（ＦＥＲＭ−Ｐ １５４４）はブレピノぐクテリウム
・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株よりスト
レプトマイシン耐性株として分離した。まず、この受容
菌を５ｄのＣＭＧ液体培地で対数増殖期の初期まで培養
し、培地にペニシリンＧ ｉ Ｏ，６ユニツト／ゴ添加
後、さらに１．５時間振盪培養し、遠心分離によシ菌体
を集めた。菌体を０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマ
レイン酸、２０ｍＭ塩化マグネシウム、３．５１−２ナ
ツセイブロス（Ｄｌｆｃｏ ）からなるＳＭＶＰ培地（
ｐＨ６，５）０．５ｄで洗浄した。次いで１０■肩のリ
ゾチームを含むＳＭＭＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間
プロトプラスト化を図った。
ーメーション法を用いた。受容菌として用いたブレピノ
々クテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２０３６
（ＦＥＲＭ−Ｐ １５４４）はブレピノぐクテリウム
・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株よりスト
レプトマイシン耐性株として分離した。まず、この受容
菌を５ｄのＣＭＧ液体培地で対数増殖期の初期まで培養
し、培地にペニシリンＧ ｉ Ｏ，６ユニツト／ゴ添加
後、さらに１．５時間振盪培養し、遠心分離によシ菌体
を集めた。菌体を０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマ
レイン酸、２０ｍＭ塩化マグネシウム、３．５１−２ナ
ツセイブロス（Ｄｌｆｃｏ ）からなるＳＭＶＰ培地（
ｐＨ６，５）０．５ｄで洗浄した。次いで１０■肩のリ
ゾチームを含むＳＭＭＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間
プロトプラスト化を図った。
６０００Ｘ１！、１０分間遠心分離後、グロトゾラース
トをＳＭＭＰで洗浄し、０，５ゴのＳＭＭＰに再度懸濁
したーこの様にして得られたプロトプラストと（２）で
調製したＤＮＡ約１ ｐｇを５ ｍＭ ＥＤＴＡ存在
下で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が３０
係になる様に添加した後、ＤＮＡをプロトプラストに取
り込ませる為に室温に２分間放置した。このプロトプラ
ストをＳＭＭＰ培地１−で洗浄後、ＳＭＭＰ培ｊ４１
ｒＬＬｌに再懸濁し、形質発現の為、３０℃で２時間培
養した。この培養液をｐＨ７，０のプロトシラスト再生
培地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留水１
にあたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２
Ｎ、ＫＣ２０，５ｆＩ、グルコース１０ｇ、ＭｇＣｌ２
−６Ｈ２０８，１，９、ＣａＣ４２”２Ｈ２０２，２１
１ペプトン４１１、粉末酵母エキス４ｇ、カザミ“ノｌ
Ａ’ｌ （Ｄｌｆｃｏ社）１ｇ、Ｋ２）（ＰＯ４０，２
ｇ、コノ・り酸ナトリウム１３５ｇ、寒天８Ｉ及びカナ
マイシン１００ ｔｄ／ｍＡを含む。
トをＳＭＭＰで洗浄し、０，５ゴのＳＭＭＰに再度懸濁
したーこの様にして得られたプロトプラストと（２）で
調製したＤＮＡ約１ ｐｇを５ ｍＭ ＥＤＴＡ存在
下で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が３０
係になる様に添加した後、ＤＮＡをプロトプラストに取
り込ませる為に室温に２分間放置した。このプロトプラ
ストをＳＭＭＰ培地１−で洗浄後、ＳＭＭＰ培ｊ４１
ｒＬＬｌに再懸濁し、形質発現の為、３０℃で２時間培
養した。この培養液をｐＨ７，０のプロトシラスト再生
培地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留水１
にあたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２
Ｎ、ＫＣ２０，５ｆＩ、グルコース１０ｇ、ＭｇＣｌ２
−６Ｈ２０８，１，９、ＣａＣ４２”２Ｈ２０２，２１
１ペプトン４１１、粉末酵母エキス４ｇ、カザミ“ノｌ
Ａ’ｌ （Ｄｌｆｃｏ社）１ｇ、Ｋ２）（ＰＯ４０，２
ｇ、コノ・り酸ナトリウム１３５ｇ、寒天８Ｉ及びカナ
マイシン１００ ｔｄ／ｍＡを含む。
３０℃で６日間培養後、約３０個のカナマイシン耐性コ
ロニーが出現してきた。その中からカナマイシン２５μ
ダ／ｍｌを含むＣＭＧ寒天培地（認ゾトン１０ｇ／：＃
１酵母エキス１０９／Ｚ 、 ！ ルコ−ス５Ｅ／Ａ、
ＮａＣ２５！ｊ／ｌ 、寒天２０１〃を含みｐＨ７，２
に調整したもの）上で生育した１株、即ちＡＪ １２１
７３（ＦＥＲＭ−Ｐ ７ｅｆ”、？ｔ＞からは約５．７
Ｍｄのプラスミドが検出された。このプラスミドがベ
クターのｐＡＪ６６７（４，８Ｍｄ）とｐＵＣ４に由来
カナマイシン耐性遺伝子を含ｊ７ ＤＮＡ断片０．９
Ｍｄとからなることは、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ
ＨＩで３７℃、２時間反応させ、分子量既知の分子量マ
ーカー、λファージのＨ１ｎｄ１７ラグメン） （ＢＲ
Ｌから購入）との移動度の比較により確認した。ＡＪ
１２１７３株よ如見出されたこのプラスミドをｐＡＪ６
７０と名づけた。第１図にＰＡＪ６７０の制限酵素切断
地図を示した。
ロニーが出現してきた。その中からカナマイシン２５μ
ダ／ｍｌを含むＣＭＧ寒天培地（認ゾトン１０ｇ／：＃
１酵母エキス１０９／Ｚ 、 ！ ルコ−ス５Ｅ／Ａ、
ＮａＣ２５！ｊ／ｌ 、寒天２０１〃を含みｐＨ７，２
に調整したもの）上で生育した１株、即ちＡＪ １２１
７３（ＦＥＲＭ−Ｐ ７ｅｆ”、？ｔ＞からは約５．７
Ｍｄのプラスミドが検出された。このプラスミドがベ
クターのｐＡＪ６６７（４，８Ｍｄ）とｐＵＣ４に由来
カナマイシン耐性遺伝子を含ｊ７ ＤＮＡ断片０．９
Ｍｄとからなることは、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ
ＨＩで３７℃、２時間反応させ、分子量既知の分子量マ
ーカー、λファージのＨ１ｎｄ１７ラグメン） （ＢＲ
Ｌから購入）との移動度の比較により確認した。ＡＪ
１２１７３株よ如見出されたこのプラスミドをｐＡＪ６
７０と名づけた。第１図にＰＡＪ６７０の制限酵素切断
地図を示した。
（４）形質導入
ｐＡＪ ６７０を保持するＡＪ １２１７３の対数増殖
期の菌体的１０ をＦ４ファージ約１０ と共に２係寒
天、２５μｌ／／ｍ、ｌカナマイシンを含むＣＭＧ培地
平板１枚に塗布し、３０℃にて１日間培養した。平板上
で′Ｆ！ファーノによる溶菌現象が確認されたので５ｍ
ｌの生理食塩水を平板上に加え７ア一ジ粒子を懸濁した
。１５０００ ｒｐｍ、１０分間の遠心により葭体残直
を除去後、除菌フィルター（ポアサイズ−０，２２μ）
を通して生菌を除いた。
期の菌体的１０ をＦ４ファージ約１０ と共に２係寒
天、２５μｌ／／ｍ、ｌカナマイシンを含むＣＭＧ培地
平板１枚に塗布し、３０℃にて１日間培養した。平板上
で′Ｆ！ファーノによる溶菌現象が確認されたので５ｍ
ｌの生理食塩水を平板上に加え７ア一ジ粒子を懸濁した
。１５０００ ｒｐｍ、１０分間の遠心により葭体残直
を除去後、除菌フィルター（ポアサイズ−０，２２μ）
を通して生菌を除いた。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０
３６の対数増殖期の菌体的１０に対し上記のファージ液
０．１ｍ／！（１０ｐｆｕ）を加え、３０℃で９０分ゆ
るやかに振盪し、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心にて、
一体を回収し、これを２回生理食塩水で洗浄した。洗浄
菌体を２チ寒天及び２５μｐ／ｍｌカナマイシンを含む
ＣＭＧ培地平板に塗布した。３０℃で２日培養すると約
１０ カナマイシン耐性コロニーが生じた。これらの耐
性コロニーからは約５、７ ＭｄのシラスミドＩ）ＡＪ
６７０が検出され形質導入によ＃）ＰＡＪ６７０がｐ、
Ｊ １２０３６株に導入されたのは明らかである。（な
お、ｐＡＪ６７０の形質導入頻度はｐＡＪ６６７と同じ
オーダーであった。）本発明に用いたＦ１ファージはＡ
Ｊ １２１７３株に溶原化しており、自然誘発またはマ
イトマイシンＣを０．０５〜０．２μｇ〜を含むＣＭＧ
液体培地中で振盪培養することにより、培地中に放出さ
れている。
３６の対数増殖期の菌体的１０に対し上記のファージ液
０．１ｍ／！（１０ｐｆｕ）を加え、３０℃で９０分ゆ
るやかに振盪し、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心にて、
一体を回収し、これを２回生理食塩水で洗浄した。洗浄
菌体を２チ寒天及び２５μｐ／ｍｌカナマイシンを含む
ＣＭＧ培地平板に塗布した。３０℃で２日培養すると約
１０ カナマイシン耐性コロニーが生じた。これらの耐
性コロニーからは約５、７ ＭｄのシラスミドＩ）ＡＪ
６７０が検出され形質導入によ＃）ＰＡＪ６７０がｐ、
Ｊ １２０３６株に導入されたのは明らかである。（な
お、ｐＡＪ６７０の形質導入頻度はｐＡＪ６６７と同じ
オーダーであった。）本発明に用いたＦ１ファージはＡ
Ｊ １２１７３株に溶原化しており、自然誘発またはマ
イトマイシンＣを０．０５〜０．２μｇ〜を含むＣＭＧ
液体培地中で振盪培養することにより、培地中に放出さ
れている。
これを例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムＡＴＣＣ１３８６９株に感染させれば容易に高い収量
でファージ粒子が得られる。ｐＡＪ６６７を含む菌株ブ
レピノぐクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２
１３６はＦＥＲＭ−Ｐ １５４５として寄託されている
。
ムＡＴＣＣ１３８６９株に感染させれば容易に高い収量
でファージ粒子が得られる。ｐＡＪ６６７を含む菌株ブ
レピノぐクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２
１３６はＦＥＲＭ−Ｐ １５４５として寄託されている
。
第１図は、複合シラスミドｐＡＪ６６７及びｐＡＪ６７
０の制限酵累切断地図である。
０の制限酵累切断地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 コリネホルムグルタミン酸生産性細菌の細胞内で増殖で
きるプラスミドの少なくとも複製開始点を含むＤＮＡ及
び、 該細菌が該細菌の細胞内で増殖できるファージに感染し
たとき該ファージ粒子内に取り込まれるような該ファー
ジのＤＮＡ領域を少くとも含むＤＮＡよりなる形質導入
可能な複合ベクター。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59209060A JPH0734745B2 (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | 形質導入方法 |
| EP85104144A EP0158940B1 (en) | 1984-04-04 | 1985-04-04 | Transducible composite plasmid |
| DE8585104144T DE3584848D1 (de) | 1984-04-04 | 1985-04-04 | Zusammengesetztes transduzierbares plasmid. |
| US07/135,481 US4822738A (en) | 1984-04-04 | 1987-12-21 | Transducible composite plasmid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59209060A JPH0734745B2 (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | 形質導入方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6188880A true JPS6188880A (ja) | 1986-05-07 |
| JPH0734745B2 JPH0734745B2 (ja) | 1995-04-19 |
Family
ID=16566587
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59209060A Expired - Lifetime JPH0734745B2 (ja) | 1984-04-04 | 1984-10-05 | 形質導入方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0734745B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02504461A (ja) * | 1987-03-02 | 1990-12-20 | ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ | 組換えミコバクテリア・ワクチン |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60210987A (ja) * | 1984-04-04 | 1985-10-23 | Ajinomoto Co Inc | 形質導入可能な複合プラスミド |
-
1984
- 1984-10-05 JP JP59209060A patent/JPH0734745B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60210987A (ja) * | 1984-04-04 | 1985-10-23 | Ajinomoto Co Inc | 形質導入可能な複合プラスミド |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02504461A (ja) * | 1987-03-02 | 1990-12-20 | ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ | 組換えミコバクテリア・ワクチン |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0734745B2 (ja) | 1995-04-19 |
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