JPH07298886A - インターフェロンα／β結合タンパク質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、それらをコ
ードするＤＮＡ分子および製造法、それらを含有する医
薬組成物、それらに対する抗体、それらを発現しうる複
製可能な発現ビヒクルならびに該ビヒクルで形質転換さ
れた宿主細胞を提供する。 【構成】 ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、
それらの前駆体、ムテイン体、融合タンパク質、機能的
誘導体および活性画分ならびに該結合タンパク質の塩か
ら選択されるＩＦＮ−α／β結合タンパク質、それらを
コードするＤＮＡ分子および製造法、それらを含有する
医薬組成物、それらに対する抗体、それらを発現しうる
複製可能な発現ビヒクルならびに該ビヒクルで形質転換
された宿主細胞。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、インターフェロン−β
（以下、ＩＦＮ−βと略す）の活性のみならず、種々の
インターフェロン−α（以下、ＩＦＮ−αと略す）サブ
タイプの活性を調節(modulating)しうる、新規のＩＦＮ
−α／β結合タンパク質に関する。さらに詳しくは、本
発明は、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ分子の
クローニング、宿主細胞中でのそれらの発現およびこれ
らのタンパク質に対する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】イス
ラエル国特許出願第１０３０５２号明細書では、モノク
ローナルの抗ＩＦＮ−αレセプター抗体を用いるウェス
タンブロット法により同定された、分子量約４５,００
０の可溶性ＩＦＮ−αのレセプタータンパク質が記載さ
れ、クレームされている。前記明細書には、¹²⁵Ｉ−Ｉ
ＦＮ−α２を用いるクロスリンキング(cross-linking)
および抗ＩＦＮ−αモノクローナル抗体を用いる免疫沈
降により同定された、約４０,０００の分子量を有する
異なる可溶性ＩＦＮ−α結合タンパク質についても記載
され、クレームされている。血清からえたばあいは、こ
の種は５０Ｋの分子量を有していた。イスラエル国特許
出願第１０６５９１号明細書には、均一な状態で尿から
えられ、他の既知のあらゆるタンパク質とも異なる配列
を有する前記の分子量４０,０００のＩＦＮ−α結合タ
ンパク質（以下、「尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰ」または
「ＩＦＮＡＢ−ＢＰII」と称する）が記載され、クレー
ムされている。ＩＦＮＡＢ−ＢＰはＩＦＮ−βのみなら
ず種々のＩＦＮ−αサブタイプに結合してそれらの活性
をブロックする。この点において、ＩＦＮＡＢ−ＢＰの
結合特性は、既に記載されているヒトインターフェロン
−αＢに対してのみ反応する細胞表面インターフェロン
レセプターの結合特性とは著しく異なる。

【０００３】本発明ではＩＦＮＡＢ−ＢＰの前駆体をコ
ードする２種のｃＤＮＡ分子をクローン化し、それらの
塩基配列を決定した。両者はおそらく同一の遺伝子に由
来（たとえば、択一的スプライシング(alternative spl
icing)による）する。また、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよび
ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIと称される、２種の組換えタンパク
質のホ乳動物およびそのほかの宿主細胞における産生に
ついても記載する。本発明ではさらにＩＦＮレセプター
のブロッキングに有用であり、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよ
びＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの免疫検定法および免疫精製（im
munopurification）に有用であるＩＦＮＡＢ−ＢＰに対
するポリクローナルおよびモノクローナル抗体について
も開示する。

【０００４】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰIIは、ＩＦＮ−βならびにＩ型インターフェロン類、
すなわちＩＦＮ−αの種々のサブタイプの活性を調節す
ることができる。このように、これらはＩ型インターフ
ェロン類の望ましくない効果を阻害しうる。

【０００５】Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）類（ＩＮ
Ｆ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−ω）はウイルス感染
に対する耐性を与えるというそれらの能力によって通常
定義され、構造的に関連するサイトカインのファミリー
からなる。Ｉ型インターフェロン類のほかの多くの生物
学的活性が報告されているが、それらは細胞増殖の阻
害、ＭＨＣクラスＩ抗原の誘導およびほかの数種の免疫
調節活性（文献１）があげられる。ＩＦＮ−αおよびＩ
ＦＮ−βは、ヘアリー細胞白血病（文献６）、慢性の骨
髄性白血病（文献７）およびカポジ肉腫（文献８）のよ
うなある種の悪性腫瘍ならびにＣ型肝炎（文献２および
３）およびウイルスいぼ(viral warts)（文献４および
５）を含む数種のウイルス疾患の治療に有用である。

【０００６】ＩＦＮ−αは、エイズ患者（文献１０）な
らびに全身性紅斑性狼瘡（文献９）のような自己免疫疾
患を有する多種の患者の血清中に検出された。ＩＦＮ−
αは若年性糖尿病(juvenile diabetes)の進行に関係し
ていた（文献１１）。また、白質マイクログリア(white
matter microglia)での増加したＩＦＮ−αの発現は、
アルツハイマー病の病理学に寄与しているという報告も
ある（文献５１）。さらには、ＩＦＮ−αによる治療
は、発熱および脳神経学的疾患を含む望ましくない副作
用を導く一部の症例においても示されている（文献１
２）。このように、ＩＦＮ−αの活性を中和することが
患者にとって有益かもしれない病理学的状況もある。

【０００７】ほかのサイトカイン類のばあいのように、
ＩＦＮ−αは、ＩＦＮ−βに対するのと同様にすべての
ＩＦＮ−αサブタイプに対して特異的である細胞表面レ
セプターに結合することによってその生物学的活性を発
揮する（文献１３）。ヒトＩＦＮ−αのレセプター（Ｉ
ＦＮＡＲ）が同定され、Ｄａｕｄｉ（ダウディ）細胞か
らクローン化された（文献１４）。クローン化されたレ
セプターは単一の膜貫通型ドメイン、細胞外ドメインお
よび細胞内ドメインを有する。このレセプターはネズミ
の細胞で発現されると、ヒトＩＦＮ−αＢに反応する
が、ほかのＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β種には顕著には
反応しない。このことはＩＦＮ−βおよび種々のＩＦＮ
−αサブタイプに対する反応には付加的な成分が関係し
ているかもしれないということを示している。

【０００８】ほかのいくつかの研究によれば、ＩＦＮ−
αおよびＩＦＮ−βの結合に関係している付加的な成分
またはレセプターサブユニットが存在することが示され
ている（文献１５、１６、１７）。さらには、すでに記
載したレセプター（文献１４）はすべてのＩＦＮ−αお
よびＩＦＮ−β種の結合に関係していると報告されてい
る（文献１８）。

【０００９】サイトカイン結合タンパク質（可溶性サイ
トカインレセプター）は、それらの各自の細胞表面サイ
トカインレセプターの細胞外リガンド結合ドメインに対
応する。それらは、細胞表面レセプターに共通するｍＲ
ＮＡ前駆体のほかのスプライシングによるかまたは細胞
表面レセプターのタンパク質分解切断により生じる。こ
れらの可溶性レセプターは、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γ
（文献１９、２０、２１）、ＴＮＦ（文献２２、２３、
２４）、ＩＬ−１（文献２５、２６、２７）、ＩＬ−４
（文献２５、２８）、ＩＬ−２（文献２９、３０）、Ｉ
Ｌ−７（文献３１）およびＩＦＮ−α（文献３２）のほ
かの可溶性レセプターとともに既に記載されている。

【００１０】本発明は既知のＩＦＮ−α／β結合タンパ
ク質（イスラエル国特許出願第１０６５９１号明細書参
照)をコードするＤＮＡ分子を提供する。これらＤＮＡ
分子は、２種の異なるタンパク質、すなわちＩＦＮＡＢ
−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを実際にコードして
おり、おそらく同一のｍＲＮＡ前駆体に由来し、択一的
スプライシングにより２種のｍＲＮＡ分子を生ずるので
あろうと考えられる。ｍＲＮＡの一方は約１.５ｋｂの
大きさを有し、もう一方は約４.５ｋｂの大きさを有す
る。そして各々ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩをコードする１.５
ｋｂのｍＲＮＡおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードする
４.５ｋｂのｍＲＮＡであり、前記結合タンパク質のう
ちの１つをコードする。「ＩＦＮＡＢ−ＢＰ」という用
語はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの両
者に対応する。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰはＩＦＮＡＢ
−ＢＰIIとして同定される。

【００１１】このように、本発明はＩＦＮＡＢ−ＢＰ
Ｉ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩ
ＦＮＡＢ−ＢＰIIの融合タンパク質およびムテイン体、
それらの機能的誘導体ならびにそれらの活性画分から選
ばれるＩＦＮ−α／β結合タンパク質をコードするＤＮ
Ａ分子を提供する。

【００１２】さらに本発明は前記ＤＮＡ分子を含有する
複製可能な発現ビヒクル(replicable expression vehic
le)、それらビヒクルで形質転換された宿主、前記の形
質転換された宿主によって産生されたタンパク質を提供
する。「ＤＮＡ分子」という用語はゲノムＤＮＡ、ｃＤ
ＮＡ、合成ＤＮＡおよびそれらの組合せを含む。

【００１３】本発明は、また、厳密な条件下で前記ＤＮ
Ａ分子とハイブリダイズし、ＩＦＮＡＢ−ＢＰ類と同様
の生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
分子に関する。

【００１４】本発明は、機能的ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよ
びＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの融合タンパク質、ムテ
イン体または活性画分を産生しうる宿主細胞の製造法を
も提供する。

【００１５】本発明はさらに組換え体ＩＦＮＡＢ−ＢＰ
ＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの融合タンパク
質、ムテイン体または活性画分、これらすべての塩、な
らびにＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰI
I、これらの融合タンパク質、ムテイン体、活性画分ま
たはこれらすべての塩を含有する医薬組成物を提供す
る。

【００１６】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰIIは、組換え体ヒトＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、Ｉ
ＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−βと同様に、天然型のヒト白
血球インターフェロンおよび線維芽細胞インターフェロ
ンの生物学的活性を阻害する。ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩはリ
ガンド結合ＩＦＮ−α／βレセプターである新規の膜貫
通型タンパク質に相当する。ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIは細胞
外の、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのリガンド結合ドメインの細
胞外に本質的に相当する可溶性レセプターである。

【００１７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、Ｉ
ＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆
体、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの融
合タンパク質もしくはムテイン体、それらの機能的誘導
体またはそれらの活性画分から選ばれる、ＩＦＮ−α／
β結合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、ＩＦＮＡＢ
−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、融合
タンパク質およびムテイン体、それらの機能的誘導体ま
たはそれらの活性画分と同一または類似の生物学的活性
を有するタンパク質をコードし、前記ＤＮＡ分子と厳密
な条件下でハイブリッド形成しうるＤＮＡ分子、成熟Ｉ
ＦＮＡＢ−ＢＰＩをコードする配列からなるＤＮＡ分
子、成熟ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードする配列からなる
ＤＮＡ分子、前述のいずれかのＤＮＡ分子からなり、形
質転換体である宿主細胞において、前記ＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、それらの
融合タンパク質、それらのムテイン体、それらの機能的
誘導体、それらの活性画分、ならびに前記ＩＦＮＡＢ−
ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、それら
の融合タンパク質およびムテイン体、それらの機能的誘
導体もしくはそれらの活性画分と同一または類似の生物
学的活性を有するタンパク質のいずれかを発現しうる、
複製可能な発現ビヒクル、前記のいずれかの発現ビヒク
ルで形質転換された宿主細胞、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、Ｉ
ＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、融合タンパク質、
ムテイン体、機能的誘導体および活性画分から選ばれる
組換えＩＦＮ−α／β結合タンパク質の製造法であっ
て、前記のいずれかの形質転換された宿主細胞を培養
し、前記ＩＦＮ−α／β結合タンパク質を回収すること
からなる、前記ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の製造
法、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それら
の前駆体、ムテイン体、融合タンパク質、機能的誘導体
および活性画分ならびに該結合タンパク質の塩から選択
されるＩＦＮ−α／β結合タンパク質、前記のいずれか
のＩＦＮ−α／β結合タンパク質からなる医薬組成物な
らびにＩＦＮ−α／β結合タンパク質に対する抗体に関
する。

【００１８】

【実施例】イスラエル国特許出願第１０６５９１号明細
書によれば、分子量４０,０００を有するＩＦＮ−α／
β結合タンパク質（ＩＦＮＡＢ−ＢＰ）が２つのクロマ
トグラフィーの工程により正常の尿から単離された。Ｉ
ＦＮ−α２が結合しているアガロースからなるカラムに
粗尿由来タンパク質を流した。カラムを洗浄して関連し
ないタンパク質を除去し、つぎに結合しているタンパク
質を低ｐＨで溶出した。ついで、溶出されたタンパク質
をサイズ排除ＨＰＬＣ（size exclusion HPLC）により
分析していくつかのタンパク質のピークをえた。そのう
ちの１つは、¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２と特異的に反応し、
ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの抗ウイルス活性をブロッ
クするというその能力によって特徴づけられた。さらに
このタンパク質は、Ｎ末端のマイクロシークエンシング
分析（N-terminal microsequenceanalysis）により、そ
のＮ末端ドメインに以下で示される主な配列（配列番号
１）がえられると特徴づけられた。

【００１９】 Asp Ser Pro Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Arg Thr Phe Lys Ile Arg Leu 1 5 10 15 Arg

【００２０】主な配列に対応して、マイナーなポリペプ
チド配列ではあるが、３つの過剰なアミノ酸残基（Ｉｌ
ｅ−ＸＸＸ−Ｔｙｒ）を前記配列番号１のＮ末端にもつ
配列が検出された（ＸＸＸは同定されていないアミノ酸
を示す）。えられた配列を既知のＩＦＮ−αＢレセプタ
ーの配列（文献１４）と比較すると全く異なっているこ
とがわかった。それは、ほかのあらゆる既知のタンパク
質とも異なり、ファストＡ（Fast A）プログラムを用い
てスイスプロットおよびゲンバンクデータライブラリー
（Swissprot and Genbank data libraries）と比較する
ことによって決定したところ、既知のＤＮＡ配列のいず
れによってもコードされていなかった（文献３３）。

【００２１】尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのサンプルをＣ
ＮＢｒで分解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけポリビニリデ
ンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜にエレクトロブロット
し、そしてえられた分解画分をタンパク質のマイクロシ
ークエンシング分析に付した。画分の１つは１０Ｋより
小さい分子量を有し、以下の配列番号２で示される内部
の配列を有することがわかった（Ｍｅｔは実際の配列に
先行する）。

【００２２】 Met Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Glu Glu Glu Leu Gln Phe Asp Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln Ser Glu Gly Ile 20 25

【００２３】この内部の配列は適切な制限部位が加えら
れたセンスおよびアンチセンスプライマーに逆翻訳され
た。ヒトの細胞から全ＲＮＡを精製し、プライマーとし
てアンチセンスオリゴヌクレオチド混合物またはオリゴ
ｄ（Ｔ）のいずれかを用いて、逆転写酵素により第１の
ｃＤＮＡ鎖を生じさせた。えられたｃＤＮＡ断片は、つ
いで組合わされたセンスおよびアンチセンス変性プライ
マーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。３％アガロース
ゲル上でのＰＣＲ産物の分析により、特定の１０１ｂｐ
オリゴヌクレオチドのバンドが示された。このＤＮＡは
制限酵素により分解され、クローニングベクターである
pBluescript（ストラタジーン(Stratagene)社製）に挿
入された。このベクターを用いてコンピテント細胞であ
る大腸菌をトランスフェクトした。数種の独立したクロ
ーンの配列が決められた。センスおよびアンチセンスの
変性プライマーによるフランキング領域の配列は不変で
あり、前述の尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＣＮＢｒペプ
チド（ＣＮＢｒにより分解されたペプチド）（ｃｂ７）
から予測される配列をコードしていた。この変性してい
ない内部の配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成
し、末端を標識してｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ングに用いた。

【００２４】ヒトＨｅＬａ細胞のλｇｔ１１ ｃＤＮＡ
ライブラリー（クローンテック社製）のスクリーニング
により、数種の陽性クローンがえられた。これらのクロ
ーンのうち、ｑ１０と称されるクローンは、シグナルペ
プチドに対応するオープンリーディングフレーム、細胞
外ドメイン、膜貫通型ドメインおよび短い細胞質ドメイ
ンを有していた。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰからえたペ
プチドの配列は、ｑ１０によってコードされている細胞
外ドメインにすべて存在していた。ペプチド配列のうち
少数のアミノ酸残基がタンパク質のシークエンス技術の
限界のためにまちがっていた（主に、Ｃｙｓは同定でき
ずＳｅｒに対応するピークが低レベルである）。

【００２５】ＤＮＡ鋳型としてクローンｑ１０を用い
て、ＰＣＲにより特定のプローブを調製するために、ク
ローンｑ１０のヌクレオチド配列２１９〜６１３（図２
参照）の末端に対応するセンスおよびアンチセンスプラ
イマーを用いた。えられたＤＮＡを［³²Ｐ］で標識し、
２種のヒト細胞系統からえたポリＡ＋鎖ｍＲＮＡのノー
ザンブロット法によるハイブリダイゼーションに用い
た。両方のばあいにおいて、２種の特異的なバンドが観
察された。一方は１.５ｋｂのｍＲＮＡに相当し、もう
一方は４.５ｋｂのｍＲＮＡに相当した。１.５ｋｂのｍ
ＲＮＡの一次翻訳産物をＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ前駆体と称
する。そして４.５ｋｂのｍＲＮＡの一次翻訳産物をＩ
ＦＮＡＢ−ＢＰII前駆体と称する。

【００２６】前述の特定のプローブを追加のヒトｃＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングに用い、２つのグルー
プのｃＤＮＡクローンを同定した。１つのグループ（約
２０の個々のクローン）は１.５ｋｂの長さを有し、ク
ローンｑ１０によってコードされる膜貫通型タンパク質
の同一の前駆体がコードされていた。もう一方のグルー
プ（２つの個々のクローン）は４.５ｋｂの長さを有し
ていた。これらの大きさは２種のｍＲＮＡ種の大きさと
同一であり、したがって１.５ｋｂのｃＤＮＡクローン
はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩをコードし、一方の４.５ｋｂの
ｃＤＮＡクローンはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードしてい
る。４.５ｋｂのクローンを配列決定することにより、
それらはクローンｑ１０の１〜２３９コドンに相当す
る、切断された可溶性レセプター(truncated soluble r
eceptor)の前駆体をコードしていることが示された。し
かしながら、２３８および２３９のコドンは異なってお
り、終止コドンに続いていた。尿由来の分子量４０,０
００のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＣ末端をタンパク質のシーク
エンシング分析すると、最後の２アミノ酸残基により決
定されるように、これは４.５ｋｂのｃＤＮＡにコード
されていることが示された。したがって尿由来のＩＦＮ
ＡＢ−ＢＰはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIであると同定された。
ここで、「前駆体」とは、シグナルペプチドを含む一次
翻訳産物として定義する。

【００２７】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの切断された可溶性形
態である前駆体をコードするＤＮＡをＰＣＲにより産生
した。えられたＰＣＲ産物は、ホ乳類の発現ベクターに
挿入され、サルＣＯＳ細胞のような種々のホ乳類細胞へ
のトランスフェクションに用いられた。このような細胞
は高レベルの生物学的活性を有する組換え体可溶性ＩＦ
ＮＡＢ−ＢＰＩを発現した。

【００２８】同様に、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの前駆体をコ
ードするＤＮＡをＰＣＲで産生した。えられたＰＣＲ産
物をホ乳類の発現ベクターに挿入し、サルＣＯＳ細胞の
種々のホ乳類細胞へのトランスフェクションに用いた。
このような細胞は高レベルの生物学的活性を有する組換
え体ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを発現した。

【００２９】同様に、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの全前駆体を
コードするＤＮＡをＰＣＲ法により産生した。えられた
ＰＣＲ産物をホ乳類の発現ベクターに挿入し、マウスＮ
ＩＨ−３Ｔ３細胞のような種々のホ乳類細胞へのトラン
スフェクションに用いた。このような細胞は高レベルの
ヒトＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現した。この細胞はヒトＩ
ＦＮ−α２に高親和性（Ｋｄ＝３.６×１０^-9Ｍ）で結
合することができた。ヒトＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよび従
来クローン化されているヒトＩＦＮ−αＢレセプターＩ
ＦＮＡＲ（文献１４）の両者は、マウスＮＩＨ−３Ｔ３
細胞で共に発現される（co-express）が、混成レセプタ
ーの親和性は約１０倍（Ｋｄ＝４×１０^-10Ｍ）まで増
加した。それに対して、マウス細胞でヒトＩＦＮＡＲの
みが発現されるばあいは、ヒトＩＦＮ−α２の結合を立
証することはできなかった。したがって、２種の結びつ
けられたポリペプチド（一方はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまた
はＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのリガンド結合ドメインを有し、
もう一方はＩＦＮＡＲの細胞外ドメインを有する第２の
ポリペプチド）を含有する混成タンパク質は、ＩＦＮＡ
Ｂ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰII単独と比べてＩＦ
Ｎ−αへのより高い親和性を示すであろう。

【００３０】尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのヒトＩＦＮ
−α２への親和性は、ＢＩＡコアシステム（BIAcore sy
stem）、（ファルマシア社製、スウェーデン国）によっ
て決定された。ＩＦＮ−α２をセンサーのチップに固定
し、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを結合させた。KonおよびKoff
値にもとづき、３.１２×１０^-9ＭのＫｄ値をえた。こ
の値はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細
胞を用いてえられた値ときわめて近似している。

【００３１】前記クローニング、クローンの単離、同
定、特徴づけおよび配列決定手順は以下の実施例におい
てさらに詳細に記載する。

【００３２】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰIIは、ほかのタイプの組換え細胞、たとえば大腸菌の
ような原核細胞もしくはＣＨＯ、酵母または昆虫細胞の
ようなほかの真核細胞などによっても産生されうる。組
換え体ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを
産生するため、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−
ＢＰIIのいずれかをコードするＤＮＡを有し、（たとえ
ば、大腸菌や酵母細胞を）形質転換するまたは昆虫細胞
に感染するのに適する、適切なベクターを構築する方法
は、当業者によく知られている。たとえば、アウスベル
（Ausubel）ら編、「カレント プロトコルズ イン
モレキュラー バイオロジー（CurrentProtocols in Mo
lecular Biology）」、カレント プロトコルズ（Curre
nt Protocols）（１９９３）およびサムブロック（Samb
rook）ら編、「モレキュラークローニング：ア ラボラ
トリー マニュアル」第２版、コールド スプリングハ
ーバー プレス（Cold Spring Harbor Press）（１９８
９）を参照されたい。

【００３３】本発明はさらにＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよび
ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの活性ムテイン体および活性画分に
関し、野生型のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−
ＢＰIIからなる融合タンパク質、または、ほかのポリペ
プチドまたはタンパク質と融合し、ＩＦＮ−αおよびＩ
ＦＮ−βの生物学的活性またはインターフェロンα／β
レセプターを共有するほかのサイトカインの生物学的活
性をブロックする類似の能力を示す、それらの活性ムテ
イン体またはそれらの活性画分に関する。

【００３４】実用的に関連した転写および翻訳調節シグ
ナルならびにＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰII、それらの活性画分、ムテイン体もしくは融合タン
パク質をコードするＤＮＡを、所望の遺伝子配列を宿主
細胞の染色体に組込むことのできる真核のベクターに挿
入する。導入されたＤＮＡをそれらの染色体に安定に組
込んだ細胞を選択できるようにするために、発現ベクタ
ーを含む宿主細胞の選択を可能にする１またはそれより
多くのマーカーを用いる。マーカーは栄養素要求性宿主
への原栄養、抗生物質などの生物致死剤耐性または銅な
どの重金属に対する耐性などを提供してもよい。選択し
うるマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に
直接連結するか、またはコトランスフェクション（cotr
ansfection）により同一細胞に導入されうる。一本鎖の
結合タンパク質をコードするｍＲＮＡの最適合成のため
にさらなる要素が必要とされてもよい。これらの要素は
転写プロモーター、エンハンサーおよび終止シグナル(t
erminalion signals)と同様にスプライスシグナルを含
有してもよい（文献３４）。

【００３５】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰIIタンパク質、それらの活性画分または誘導体の発現
のために、選択される細胞に導入されるべきＤＮＡ分子
は、レシピエント宿主（recipient host）中で自律的複
製が可能なプラスミドまたはウイルスベクターに取込ま
れるのが好ましいであろう。

【００３６】特定のプラスミドまたはウイルスベクター
を選択する際に重要な要因は以下のことが含まれる。ベ
クターを含むレシピエント細胞が認識され、ベクターを
含まないレシピエント細胞から選択されうることが容易
であること、特定の宿主でベクターのコピー数が希望ど
おりになること、および異なる種の宿主細胞間でベクタ
ーを「シャトル（shuttle）」できることを望むかどう
かである。好ましい原核ベクターは、たとえばｐＢＲ３
２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４な
どの大腸菌中で複製しうるプラスミド（文献３５）、ｐ
Ｃ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などのバチルス（Ba
cillus）プラスミド（文献３６）、ｐＩＪ１０１を含む
ストレプトマイセス（Streptomyces）プラスミド（文献
３７）、φＣ３１などのストレプトマイセス（Streptom
yces）バクテリオファージ（文献３８）およびシュード
モナス（Pseudomonas）プラスミド（文献３９、４０）
などがあげられる。好ましい真核プラスミドとしては、
ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２−ミクロンサークル
などやそれらの誘導体などがあげられる。このようなプ
ラスミドは当業者によく知られているものである（文献
４１、４２、４３、４４、４５）。

【００３７】一旦構築物（construct(s)）を含有するベ
クターまたはＤＮＡ配列が発現のために調製されると、
この発現ベクターは、形質転換、トランスフェクショ
ン、リポフェクション（lipofection）、接合、プロト
プラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシ
ウム沈降、ダイレクトマイクロインジェクションなどの
種々の適切な手段のいずれかにより適切な宿主細胞に導
入されうる。

【００３８】本発明で用いられる宿主細胞は原核細胞ま
たは真核細胞のいずれでもよい。好ましい原核細胞の宿
主としては、大腸菌、バチルス、ストレプトマイセス、
シュードモナス、サルモネラ（Salmonella）、セラチア
（Serratia）などの細菌があげられる。最も好ましい原
核細胞の宿主は大腸菌である。とくに興味深い細菌の宿
主としては、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４
４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３７）、
大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ^-、λ^-、光合成(phototropic)
（ＡＴＣＣ ２７３２５））、サルモネラ チフィムリ
ウム（Salmonellatyphimurium）もしくはセラチア ナ
ルセッセンス（Serratia narcescens）などの他の腸内
細菌および様々のシュードモナス種があげられる。この
ような条件下ではタンパク質はグリコシル化されないで
あろう。原核細胞の宿主は発現プラスミドのレプリコン
およびコントロール配列に適合しなければならない。

【００３９】しかしながら、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよび
ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIはグリコシル化されるタンパク質な
ので、真核細胞の宿主は原核細胞の宿主よりも好まし
い。好ましい真核細胞の宿主としては、たとえばヒト、
サル、マウス、チャイニーズハムスターオーバリー（Ｃ
ＨＯ）細胞などのホ乳類の細胞があげられる。なぜな
ら、これらの細胞は、正しい部位でのグリコシル化と同
様、正しい折りたたみ、正しいジスルフィド結合形成を
含むタンパク質分子への翻訳後の修飾を行うからであ
る。また、酵母細胞および昆虫細胞は高レベルのマンノ
ースのグリコシル化を含む翻訳後のペプチド修飾を行う
ことができる。酵母細胞でおよび昆虫細胞で所望のタン
パク質の産生のために利用することができる、強力なプ
ロモーター配列と多数のプラスミドのコピーを利用する
多くのＤＮＡ組換え法が存在する。酵母細胞はクローン
化されたホ乳動物の遺伝子産物上のリーダー配列を認識
し、リーダー配列を有するペプチドを分泌する。ベクタ
ーの導入後、宿主細胞はベクター含有細胞の成長を選択
する選択培地で増殖する。クローン化された遺伝子配列
の発現の結果、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−
ＢＰII、それらの融合タンパク質、ムテイン体、活性画
分が産生される。ついで、発現したタンパク質は、抽
出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などの従来の
あらゆる手法により、または抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩモノ
クローナル抗体が固定されたゲルマトリックスを充填し
たカラムを用いてアフィニティクロマトグラフィーを行
うことにより単離され精製される。前記組換え体ＩＦＮ
ＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの活
性画分または誘導体を含有する粗な調製物をカラムに流
すと、不純物はカラムを通過するであろうが、前記組換
え体ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰII、そ
れらの活性画分または誘導体は特異的な抗体によりカラ
ムに結合するであろう。洗浄ののち、溶出のために通常
用いられる条件、すなわち高または低ｐＨ、たとえばｐ
Ｈ１１または ｐＨ２でタンパク質をゲルから溶出す
る。

【００４０】ここで、「ムテイン体」という用語は、野
生型のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰII
またはそれらの活性画分と比較してえられた産物の活性
を著しく変更することなく、天然のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ
もしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分の
１またはそれより多くのアミノ酸残基が異なるアミノ酸
残基によって置換されるか削除される、または１または
それより多くのアミノ酸残基がＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまた
はＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの天然型の配列に追加される、Ｉ
ＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの類似体を
意味する。これらのムテイン体は既知の合成および／ま
たは部位特異的（site-directed）変異誘発技術によっ
て、またはそれらに適したほかの既知の技術により調製
する。このようなムテイン体は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩお
よびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分と実質
的に類似の活性を有するようなＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよ
びＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのアミノ酸と充分に重複するアミ
ノ酸配列を有することが好ましい。ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ
およびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの活性の１つは、組換え体ヒ
トＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩ
ＦＮ−βと同様に、天然のヒト白血球および線維芽細胞
インターフェロンのような１またはそれより多くのＩ型
インターフェロンに結合する能力である。ムテイン体が
１またはそれより多くのこのようなインターフェロンに
対して実質的に結合活性を有するかぎり、アフィニティ
クロマトグラフィーの手段によるなどのそのようなイン
ターフェロンの精製に用いることが可能であり、したが
ってムテイン体がＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ
−ＢＰIIと実質的に類似の活性を有すると考えられう
る。したがって、ラジオイムノアッセイやＥＬＩＳＡの
ような、適切に標識されたインターフェロンにムテイン
体が結合するかどうかを決定するための、たとえば単純
なサンドイッチ競合検定法にそのようなムテイン体を付
すことからなるルーチンの実験手段により、ＩＦＮＡＢ
−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIと実質的に同様な活
性を有するムテイン体がえられたかどうかを決定するこ
とができる。Ｉ型インターフェロンのいかなる種にも結
合するムテイン体はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡ
Ｂ−ＢＰIIの充分な活性を保ち、少なくとも１つのＩＦ
ＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの開示された
有用性をもち、したがってそれらを実質的に類似した活
性をもつので、このテストは数種のＩ型インターフェロ
ンを用いて繰り返し行われるべきである。

【００４１】好ましい具体例では、このようなムテイン
体のいずれもＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰIIのいずれかの配列と少なくとも４０％の同一性また
は相同性を有する。さらに好ましくは、それらと少なく
とも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少
なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同
一性または相同性を有するものである。

【００４２】本発明で用いられうるＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ
またはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのポリペプチドもしくはタン
パク質またはそれらの活性画分のムテイン体、またはそ
れらをコードする核酸は、ここに記載の技術および説明
にもとづいて、過度の実験を行なうことなく当業者によ
って通常通りにえられうる置換ペプチドまたはポリヌク
レオチドのように実質的に対応する限られたセットの配
列を含む。タンパク質の化学的性質および構造の詳しい
記載については、シュルツ、ジーイー（Schulz, G.E.）
ら著、「プリンシプルズ オブ プロテイン ストラク
チャー（Principles of Protein Structure）」スプリ
ンガー−ベーラグ（Springer-Verlag）、ニューヨー
ク、１９７８年およびクリートン、ティー イー（Creig
hton, T.E.）著、「プロテインズ：ストラクチャー ア
ンド モレキュラー プロパティ（Proteins:Structure
and Molecular Properties）」ダブリュー エイチ
フリーマン アンド コー（W.H. Freeman & Co.）、サ
ンフランシスコ、１９８３年を参照されたい。コドン
プリファレンス（codon preference）のようなヌクレオ
チド配列の置換の説明については、アウスベル（Ausube
l）ら著、同上、セクションＡ．１．１〜Ａ．１．２４
およびサムブロックら著、同上、アペンディセス(Appen
dices)ＣおよびＤを参照されたい。

【００４３】本発明のムテイン体に好ましい変更は「保
存的」置換として知られている変更である。ＩＦＮＡＢ
−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのポリペプチドもし
くはタンパク質またはそれらの活性画分の保存的アミノ
酸置換は、充分に類似の物理化学的性質を有する群のう
ちの同義アミノ酸を含む。これは群の構成要素間の置換
は分子の生物学的機能を保つであろうということである
（グランタム（Grantham）著、サイエンス、１８５巻、
８６２〜８６４頁（１９７４年）参照）。アミノ酸の挿
入および削除は、また、それらの機能を変えることな
く、前述で定義した配列で行われてもよく、とくに挿入
または削除が少数のアミノ酸、たとえば３０以下、好ま
しくは１０以下のみであり、機能的なコンホメーション
に重要な（critical）アミノ酸（たとえばシステイン残
基）の除去または置換(displace)がないばあいに行われ
てもよいことは明らかである（アンフィンセン（Anfins
en）著、「プリンシパルズ ザット ガバン ザ ホー
ルディング オブ プロテイン チェインズ（Principl
es That Govern The Folding of Protein Chains）」サ
イエンス、１８１巻、２２３〜２３０頁（１９７３年）
参照）。このような削除および／または挿入によって産
生されたタンパク質およびムテイン体は、本発明の範囲
に含まれる。

【００４４】表１に好ましい同義アミノ酸の群を示す。
さらに、表２により好ましい同義アミノ酸の群を示す。
表３に最も好ましい同義アミノ酸の群を示す。

【００４５】

【表１】

【００４６】

【表２】

【００４７】

【表３】

【００４８】本発明に用いるＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたは
ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIポリペプチドもしくはタンパク質ま
たはそれらの活性画分のムテイン体をうるために用いら
れうるタンパク質において、アミノ酸置換を産生する具
体例としてはマーク(Mark)らによる米国再発行特許第３
３，６５３号、米国特許第４，９５９，３１４号、同第
４，５８８，５８５号および同第４，７３７，４６２号
各明細書、コス(Koths)らによる米国特許第５，１１
６，９４３号明細書、ネーメン(Namen)らによる米国特
許第４，９６５，１９５号明細書、チョン(Chong)らに
よる米国特許第４，８７９，１１１号明細書およびリー
(Lee)らによる米国特許第５，０１７，６９１号明細書
に記載されており、リジン置換タンパク質については、
（ショウ(Shaw)らによる）米国特許第４，９０４，５８
４号明細書に記載されているような既知の方法工程があ
る。

【００４９】本発明のほかの好ましい実施態様におい
て、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIま
たはそれらの活性画分のあらゆるムテイン体はＩＦＮＡ
Ｂ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのアミノ酸配列に
本質的に対応するアミノ酸配列を有する。ここで、「本
質的に対応する」という用語は、天然のタンパク質の基
本的な性質に影響を与えない、とくに、１またはそれよ
り多くのＩ型インターフェロンに結合するそれらの能力
が関与し、それによりin situで天然のＩ型インターフ
ェロンレセプターにＩ型インターフェロンが結合するの
を阻害する能力があるかぎり、天然のタンパク質の配列
のマイナーな変更を有するタンパク質を含むことを意図
する。「本質的に対応する」という表現に含まれると一
般的に考えられる変更のタイプは、結果的にきわめて少
ないマイナーな修飾がおこり、所望の活性を前記方法で
スクリーニングする、通常の突然変異誘発技術をこれら
タンパク質をコードするＤＮＡに用いたばあいにえられ
るであろうタイプである。

【００５０】本発明のムテイン体は、本発明のＩＦＮＡ
Ｂ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードするＤＮ
ＡまたはＲＮＡと厳密な条件でハイブリダイズするＤＮ
ＡまたはＲＮＡのような核酸によりコードされるタンパ
ク質を含む。また、本発明は所望の核酸の同定および精
製にプローブとしても有用である核酸も包含する。さら
に、このような核酸は本発明のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまた
はＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの機能的な活性を保持するポリペ
プチドをコードするかどうかを決定するための重要な候
補となりうる。「厳密な条件」という用語は、当業者が
通常「厳密な（stringent)」として用いている、ハイブ
リダイゼーションおよびそれに続く洗浄の条件のことを
意味する（アウスベルら著、「カレント プロトコルズ
インモレキュラー バイオロジー(Current Protocols
in Molecular Biology)」、同上、インターサイエンス
(Interscience)、ニューヨーク、セクション６．３およ
び６．４（１９８７年、１９９２年）およびサムブロッ
クら著、同上、参照）。限定されないが、厳密な条件の
具体例としては、たとえば２×ＳＳＣおよび０.５％Ｓ
ＤＳ、５分間、２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ、１５
分間、０.１×ＳＳＣおよび０.５％ＳＤＳ、３７℃、３
０〜６０分間そののちに０.１×ＳＳＣおよび０.５％Ｓ
ＤＳ、６８℃、３０〜６０分間における試験下において
理論値Ｔｍのハイブリッドを下まわる１２〜２０℃の洗
浄条件があげられる。また、厳密な条件とは、ＤＮＡ配
列、（１０〜４０塩基のような）オリゴヌクレオチドプ
ローブまたは混合したオリゴヌクレオチドプローブの長
さにも依存すると当業者は理解している。混合プローブ
が用いられるばあいは、ＳＳＣの代わりにテトラメチル
アンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を用いるのが好ま
しい（アウスベル著、同上、参照）。

【００５１】「融合タンパク質」という用語は、たとえ
ば体液中での残存時間が延長された、ほかのタンパク質
と融合されたＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−
ＢＰIIまたはそれらの活性画分もしくはそれらのムテイ
ン体からなるポリペプチドを意味する。ＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画
分は、たとえばイムノグロブリンまたはそれらの断片な
どのほかのタンパク質、ポリペプチドなどと融合しても
よい。

【００５２】ここで「塩」という用語は、ＩＦＮＡＢ−
ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの活性画分、
ムテイン体または融合タンパク質のカルボキシル基の塩
およびアミノ基の酸付加塩の両者を意味する。カルボキ
シル基の塩は、当該技術分野の既知の方法によって形成
されてもよく、たとえばナトリウム、カルシウム、アン
モニウム、鉄または亜鉛などの無機塩および、たとえば
トリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペ
リジン、プロカインなどのようなアミンを用いて形成さ
れたような有機塩基との塩が含まれる。酸付加塩として
は、たとえば塩酸または硫酸などの鉱酸との塩およびた
とえば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩を含む。
もちろん、このようなあらゆる塩は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰ
ＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分
と実質的に同様の活性を有さなければならない。

【００５３】「機能的誘導体」は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ
もしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分、
それらのムテイン体および融合タンパク質の誘導体を含
み、それらは当該技術分野の既知の方法により、残基の
側鎖またはＮ末端基もしくはＣ末端基として生じる機能
性基から調製されてもよく、それらが薬学的に許容しう
るかぎり、すなわちそれらがＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたは
ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの活性と実質的に同様であるタンパ
ク質の活性を壊さず、それを含有する組成物に毒性を与
えないかぎり、本発明に含まれる。これらの誘導体は、
たとえば抗原部位を覆い、体液中でＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ
もしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの活性画分の
残存を延長するポリエチレングリコール側鎖を含んでも
よい。ほかの誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステ
ル、アンモニアとまたは第１級もしくは第２級アミンと
反応することによるカルボキシル基のアミド、アシル部
分（moiety）（たとえば、アルカノイル基またはカルボ
サイクリックアロイル基）と形成されるアミノ酸残基の
遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル部分と形
成される遊離の水酸基（たとえば、セリルまたはスレオ
ニル残基の水酸基）のＯ−アシル誘導体が含まれる。

【００５４】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰII、ムテイン体および融合タンパク質の「活性画分」
とは、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIと
実質的に同様の活性を有し、本発明ではタンパク質分子
またはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰII
のあらゆる断片を含有する融合タンパク質を、単独でま
たは関連する分子もしくはそれらと結合する残基（たと
えば糖またはリン酸塩の残基）が結合したもののポリペ
プチド鎖のあらゆる断片もしくは前駆体または前記タン
パク質分子のあらゆる集合体が含まれる。

【００５５】さらに、本発明は薬学的に許容しうる担体
および本発明のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ
−ＢＰIIまたはそれらの活性ムテイン体、融合タンパク
質およびそれらの塩、それらの機能的誘導体または活性
断片からなる医薬組成物に関する。

【００５６】本発明の医薬組成物は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰ
ＩもしくはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたはそれらの誘導体を
生理学的に許容しうる担体、および／または安定剤およ
び／または賦形剤とを混合することにより、投与用に調
製され、投与形態；たとえば投与バイアルに凍結乾燥す
ることにより調製される。投与方法は同様の薬剤につい
て許容されうる投与形態のいずれでも可能であるが、処
置される条件、たとえば静脈内、筋肉内、皮下に投与、
局所的に注射するかまたは局所的に適用するか、または
点滴によって投与するかなどによる。活性のある化合物
の投与量は投与経路、治療される疾患、患者の状態によ
る。局所的に注射するばあいは、たとえば静脈内注射の
ばあいよりも体重に対してより少量のタンパク質が要求
される。

【００５７】イスラエル国特許出願第１０６５９１号明
細書に記載のとおり、ＩＦＮα／β結合タンパク質（ま
たは本明細書で称されるＩＦＮＡＢ−ＢＰII）は、ＩＦ
Ｎ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−
β（ＩＦＮ−γではない）の抗ウイルス活性を阻害し、
このことはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰ
IIが一般的なＩ型ＩＦＮ結合タンパク質であることを示
している。このように、これらは種々のＩＦＮ−αサブ
タイプおよびＩＦＮ−βの生物学的活性の調節またはブ
ロックに有用である。たとえばＩＦＮ−αまたはＩＦＮ
−βの異常な発現が見られる、Ｉ型糖尿病、種々の自己
免疫疾患、移植拒絶、エイズおよび類似の疾患に有用で
ある。すなわち、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ
−ＢＰIIは過剰のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが細胞内
に産生されるかまたは細胞外から投与される状態に用い
られうる。

【００５８】したがって、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩ
ＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの活性断片、ムテイン体、融
合タンパク質およびそれらの塩、機能的誘導体ならびに
それらの活性断片が、自己免疫疾患の治療、ホ乳類にお
けるほかの炎症の治療、ＩＦＮ−αまたはβを投与する
ことによって生ずる毒性の治療、若年性糖尿病、紅斑性
狼瘡およびエイズの治療に必要であることが示される。

【００５９】また、前述のように本発明のタンパク質
は、Ｉ型インターフェロン類の精製などの非治療的有用
性をも有する。

【００６０】本発明は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡ
Ｂ−ＢＰII、それらのムテイン体、融合タンパク質、
塩、機能的誘導体および活性断片に対する抗体をも含
む。

【００６１】「抗体」という用語は、可溶性または結合
形態で標識されうるポリクローナル抗体類、モノクロー
ナル抗体類（以下、Ｍａｂｓと略す）、キメラ抗体類、
抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を意味
し、また、酵素分解、ペプチド合成または組換え技術に
限られず、既知の技術により提供されるそれらの活性断
片も同様に意味する。

【００６２】ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された
動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。
モノクローナル抗体は抗原に対して特異的な実質的に均
一な抗体の集団であり、この集団は実質的に類似のエピ
トープ結合部位を含む。Ｍａｂｓは当業者に知られてい
る方法によりえられうる（コフラー(Kohler)およびミル
シュタイン(Milstein)著、ネイチャー、２５６巻、４９
５〜４９７頁、１９７５年、米国特許第４，３７６，１
１０号明細書、アウスベルら編、同上、ハーロー(Harlo
w)およびレーン(Lane)、「アンチボディーズ：ア ラボ
ラトリー マニュアル（ANTIBODIES:A LABORATORY MANU
AL)」、コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ー、１９８８年、およびコーリガン(Colligan)ら編、
「カレントプロトコルズ イン イムノロジー (Curren
t Protocols in Immunolgy)」、グリーン パブリッシ
ング アソーシエイト アンド ウィリー インターサ
イエンス(Greene Publishing Assoc.and Wiley Intersc
ience)、ニューヨーク、（１９９２、１９９３年）を全
体的に参照されたい）。このような抗体は、ＩｇＧ、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ギルド(GILD)およびそれらのサ
ブクラスを含むイムノグロブリンのクラスのいずれであ
ってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマはin vitro、in situまたはin vivoで培養
されてもよい。in vivoまたはin situにて高力価のＭａ
ｂｓが産生されることにより、本願発明の方法は現時点
での好ましい産生法であるということが示される。

【００６３】キメラ抗体は、マウスＭａｂ由来の可変領
域とヒトイムノグロブリンの定常領域とを有するよう
な、異なる動物種由来の異なる部分からなる分子であ
る。キメラ抗体は、適用の際には免疫原性を減少させる
ため、そして産生の際には収率を高めるためにおもに用
いられる。たとえば、ハイブリドーマからマウスのＭａ
ｂｓが多量にえられるが、ヒトに対しては免疫原性が高
いばあいに、ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体が
用いられる。キメラ抗体およびそれらの産生法は当該技
術分野で知られている（キャビリー(Cabilly)ら著、プ
ロシーディングナチュラル アカデミー オブ サイエ
ンス(Proc. Natl.Acad.Sci.)、米国、８１巻、３２７３
〜３２７７頁（１９８４年）、モーリソン(Morrison)ら
著、プロシーディング ナチュラル アカデミー オブ
サイエンス、米国、８１巻、６８５１〜６８５５頁
（１９８４年）、ボーリアン(Boulianne)ら著、ネイチ
ャー、３１２巻、６４３〜６４６頁（１９８４年）、キ
ャビリー(Cabilly)ら著、欧州特許出願公開第１２５０
２３号明細書（１９８４年１１月１４日に公開）、ヌー
ベルガー(Neuberger)ら著、ネイチャー３１４巻、２６
８〜２７０頁（１９８５年）、タニグチ(Taniguchi)ら
著、欧州特許出願公開第１７１４９６号明細書（１９８
５年２月１９日に公開）、モーリソンら著、欧州特許出
願公開第１７３４９４号明細書（１９８６年３月５日に
公開）、ヌーベルガーら著、ＰＣＴ出願(PCT Applicati
on)ＷＯ ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日に
公開）、クドー(Kudo)ら著、欧州特許出願公開第１８４
１８７号明細書(１９８６年６月１１日に公開）、モー
リソンら著、欧州特許出願公開第１７３４９４号明細書
（１９８６年３月５日に公開）、サーガン(Sahagan)ら
著、ジェイ イムノル(J. Immunol.)１３７巻、１０６
６〜１０７４頁（１９８６年）、ロビンソン(Robinson)
ら著、国際特許公開(International Patent Publicatio
n)、ＷＯ ９７０２６７１（１９８７年５月７日に公
開）、リウ(Liu)ら著、プロシーディング ナチュラル
アカデミー オブ サイエンス、米国、８４巻、３４
３９〜３４４３頁（１９８７年）、サン(Sun)ら著、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA ８４巻、２１４〜２１８頁
（１９８７年）、ベター(Better)ら著、サイエンス、２
４０巻、１０４１〜１０４３頁（１９８８年）、ハーロ
ーおよびレーン著、アンチボディーズ：ア ラボラトリ
ー マニュアル、同上を全体的に参照されたい）。

【００６４】抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は、抗
体の抗原結合部位と一般的には結合する唯一の決定基を
認識する抗体である。イディオタイプ（Ｉｄ）抗体は、
同じ種および遺伝タイプ（たとえば、マウス系統）の動
物をモノクローナル抗体のソースとして、抗イディオタ
イプが調製されているモノクローナル抗体を用いて免疫
することにより調製されうる。免疫された動物は、これ
らのイディオタイプの決定基に対する抗体を産生するこ
とにより、免疫している抗体のイディオタイプの決定基
を認識し反応するであろう（たとえば、米国特許第４，
６９９，８８０号明細書を全体的に参照されたい）。

【００６５】また、抗イディオタイプ抗体はまた別の動
物における免疫反応を引き起こす「免疫原」として用い
られてもよく、いわゆる抗イディオタイプ抗体に対する
抗体(anti-anti-Id antibody)を産生する。抗イディオ
タイプに対する抗体は抗イディオタイプ抗体に対する抗
体を誘導したオリジナルのモノクローナル抗体とエピト
ープについて同じでありうる。このように、モノクロー
ナル抗体のイディオタイプの決定基に対する抗体を用い
ることによって、同一の特異性を有する抗体を発現する
ほかのクローンを同定することが可能となる。

【００６６】したがって、本発明のＩＦＮＡＢ−ＢＰ
Ｉ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIおよび関連するタンパク質に対
して生じたモノクローナル抗体がＢＡＬＢ／Ｃマウスの
ような適切な動物に抗イディオタイプ抗体を誘導するた
めに用いうる。そのような免疫されたマウスからえた脾
臓細胞を抗イディオタイプＭａｂｓを分泌する抗イディ
オタイプハイブリドーマを産生するために用いる。さら
に、抗イディオタイプＭａｂｓはキーホールリンペット
・ヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体とカップリングさ
せて、さらなるＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫することに用
いることができる。これらのマウスの血清は、ＩＦＮＡ
Ｂ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIエピトープに特異
的なオリジナルのモノクローナル抗体の結合特性を有す
る抗イディオタイプ抗体に対する抗体を含有するであろ
う。

【００６７】このように、抗イディオタイプＭａｂｓ
は、それら自身にイディオタイプのエピトープを有する
か、またはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩもしくはＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰIIのような、評価されているエピトープと構造的に類
似する「イディオトープ」を有する。

【００６８】「抗体」という用語は、抗原と結合しう
る、たとえばＦａｂおよびＦ（ａｂ´）₂ などのそれら
の活性断片と同様に両方のインタクトな分子を含有する
ことをも意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ´）₂ 断片は
インタクトな抗体のＦｃ断片を欠いており、循環血から
より速く消え、インタクトな抗体よりも非特異的に組織
に結合することがないようである（ワール（Wahl）ら
著、ジェー ヌクル メド（J. Nucl. Med.）２４巻、
３１６〜３２５頁（１９８３年）参照）。

【００６９】本発明に有用な抗体のＦａｂおよびＦ（ａ
ｂ´）₂ ならびにほかの断片がインタクトな抗体分子の
ためにここに開示した方法にしたがって、ＩＦＮＡＢ−
ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIおよび関連タンパク質の検
出および定量に用いられうることは明らかであろう。こ
のような断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するた
め）またはペプシン（Ｆ（ａｂ´）₂ 断片を産生するた
め）などの酵素を用いてタンパク質の分解を行なうこと
により典型的に産生される。

【００７０】分子と特異的に反応することができ、それ
により前記分子が抗体と結合するばあい、前記抗体は前
記分子を「結合しうる」といわれる。「エピトープ」と
いう用語は、抗体によって結合されることができ、前記
抗体によっても認識されうる、あらゆる分子の部分を意
味する。エピトープまたは「抗原決定基」は通常、アミ
ノ酸または糖の側鎖などの化学的に活性のある表面の群
性体(grouping)基からなり、特定の電荷特性と同様に特
定の三次元構造の特徴を有する。

【００７１】「抗原」は、動物に付加的に抗原のエピト
ープに結合できる抗体を産生させることができる抗体に
より結合されうる、分子またはその部分である。抗原は
１またはそれより多くのエピトープを有していてもよ
い。前述の特異的な反応とは、高度な選択性で抗原がそ
れに対応する抗体と反応するが、ほかの抗原によって引
き出されうるほかの多数の抗体とは反応しないことを意
味する。

【００７２】本発明に有用な、抗体の断片を含む抗体
は、サンプル中のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰIIまたは関連タンパク質を定量的にまたは定性的に検
出するために、または、本発明のそれらのタンパク質を
発現する細胞の存在を検出するために用いられてもよ
い。これは、蛍光的に標識された抗体（以下参照）を用
いる免疫蛍光法と光学顕微鏡を用いる検出、フローサイ
トメトリックを用いる検出または蛍光光度計を用いる検
出とを組み合わせることにより達成可能である。

【００７３】本発明に有用な抗体（またはそれらの断
片）は、本発明のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰIIおよび関連タンパク質のin situの検出のために免
疫蛍光法または免疫電子顕微鏡(immunoeletron microsc
opy)におけるように組織学的に用いられてもよい。in s
ituの検出は、患者から組織学的標本を採取し、標識さ
れた本発明の抗体をそのような標本に提供することによ
って達成されてもよい。抗体（または断片）は、標識さ
れた抗体（または断片）を生物学的なサンプルに適用す
るかまたはおおう(overlay)ことによって好ましくは提
供される。このような手順を用いることにより、ＩＦＮ
ＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたは関連タンパク
質の存在のみならず検査される組織におけるその分布ま
でも決定することが可能となる。当業者ならば、本発明
を用いると、そのようなin situの検出を行なうために
（染色手順などの）組織学的方法のあらゆる広範な変法
を修飾することができるということを容易に理解するで
あろう。

【００７４】本発明のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ
−ＢＰIIまたは関連タンパク質に対するこれらの検定法
は、典型的には、生物学的液体、組織抽出物、リンパ球
または白血球などの新しく採取した細胞または組織培養
でインキュベートされていた細胞などの生物学的サンプ
ルを、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIまたは
関連タンパク質を同定しうる、検出可能であるように標
識された抗体の存在下で、インキュベートし、当該技術
分野でよく知られている数多くの技術のいずれかにより
抗体を検出することからなる。

【００７５】生物学的サンプルをニトロセルロースなど
の固相支持体または担体、もしくは細胞、細胞粒子また
は可溶性タンパク質を固定化しうるほかの固体の支持体
または担体で処理してもよい。そして支持体または担体
を適切な緩衝液で洗浄したのちに、検出可能なように標
識された本発明の抗体で処理する。そののちに、固相支
持体または担体を結合していない抗体を除去するために
さらに緩衝液で洗浄してもよい。前記固相支持体または
担体上の結合している標識量はついで通常の手段によっ
て検出されてもよい。

【００７６】「固相支持体」、「固相担体」、「固体の
支持体」、「固体の担体」、「支持体」または「担体」
とは、抗原または抗体を結合しうるあらゆる支持体また
は担体を意図する。よく知られた支持体または担体とし
ては、たとえばガラス、ポリスチレン、ポリプロピレ
ン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラー
ゼ、天然のまたは修飾されたセルロース、ポリアクリル
アミド類、アガロースおよび磁鉄鉱などがあげられる。
担体の性質は、本発明の目的のためには、ある程度可溶
性であるかまたは不溶性でありうる。支持体の材料は、
カップリングされる分子が抗原または抗体と結合しうる
限り、実質的に可能なあらゆる構造の形状(configurati
on)を有していてもよい。したがって、支持体または担
体の形状は、ビーズにおけるような球状、もしくは試験
管の内部表面または棒の外部表面におけるような円筒状
であってもよい。また、表面はシート、テストストリッ
プなどのように平らであってもよい。好ましい支持体ま
たは担体としては、たとえばポリスチレンビーズがあげ
られる。当業者であれば、抗体または抗原の結合に適し
たほかの多くの担体を知っているであろうし、またルー
チンの実験作業を用いることにより同じことを突きとめ
ることができるであろう。

【００７７】本発明の所定のロットの抗体の結合活性
は、充分に既知の方法により決定されうる。当業者であ
れば、ルーチンの実験を行なうことにより、各決定に対
して実施できて最適な検定法の条件を決定することがで
きるであろう。

【００７８】洗浄、撹拌、振とう、ろ過などのほかの工
程は、通常どおりにまたは特定の状況に必要な工程を検
定法に追加してもよい。

【００７９】本発明の抗体を検出可能となるように標識
する方法の１つは、抗体と酵素とを結合させることであ
り、これは酵素免疫法（ＥＩＡ）に用いられる。この酵
素は、順次、適切な基質にのちにさらされると、分光光
度手段、蛍光測定手段または視覚的手段により検出され
うる化学部分(chemical moiety)を産生するような様式
で基質と反応する。抗体を検出されうるように標識する
ために用いることができる酵素としては、たとえばリン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デ
ルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデ
ヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナー
ゼ、三炭糖リン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、
グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボ
ヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよび
アセチルコリンエステラーゼなどがあげられる。検出
は、酵素に対して色素の基質を用いる比色法によって達
成されうる。また、検出は基質との酵素反応の程度を類
似して調製された標準品と視覚的に比較することにより
達成されてもよい。

【００８０】検出はほかの免疫検定法のあらゆる変法を
用いて行なわれてもよい。たとえば、抗体または抗体の
断片を放射能で標識することにより、ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）を用いてＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦ
ＮＡＢ−ＢＰIIの検出が可能である。ＲＩＡについての
適切な記載は、ワーク、ティー エス(Work, T.S.)ら
著、「ラボラトリー テクニックズ アンド バイオケ
ミストリー イン モレキュラー バイオロジー(Labor
atory Techniques and Biochemistry in Molecular Bio
logy)」、ノース ホーランド パブリッシング カン
パニー(North Holland Publishing Company)、ニューヨ
ーク（１９７８年）、とくにチャード、ティー(Chard,
T.)による「アン イントロダクション トゥ ラジオ
イムン アッセイ アンド リレイテッド テクニック
ズ（An Introduction to Radioimmune Assay and Relat
ed Techniques)」の章に記載されている。ラジオアイソ
トープは、ガンマカウンターまたはシンチレーションカ
ウンターを用いる手段によるかまたはオートラジオグラ
フィーによって検出されうる。

【００８１】また、本発明の抗体を蛍光化合物で標識す
ることも可能である。蛍光的に標識された抗体が適した
波長の光にさらされると、蛍光のためにその存在が検出
されうる。最も一般的に用いられている蛍光標識化合物
としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダ
ミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコ
シアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレサミンなど
があげられる。 さらに、抗体は¹⁵²Ｅｕ、またはラン
タニド系などの蛍光発光金属を用いて検出可能となるよ
うに標識されうる。これらの金属は、ジエチレントリア
ミンペンタアセティックアシッド（ＥＴＰＡ）のような
金属のキレート基を用いて抗体に結合されうる。

【００８２】抗体は、ビオチンとカップリングすること
により検出可能となるよう標識されうる。ビオチン化抗
体は、ついで蛍光化合物とペルオキシダーゼなどの酵素
と、または放射性アイソトープなどとカップリングされ
るアビジンもしくはストレプトアビジンによって検出さ
れうる。

【００８３】抗体は、化学発光化合物とカップリングす
ることにより、検出可能となるよう標識されることも可
能である。化学発光物が標識された抗体の存在は、つい
で化学反応の過程の間に生ずる発光の存在を検出するこ
とにより決定される。とくに有用な化学発光標識化合物
としては、たとえばルミノール、イソルミノール、セロ
マティックアクリジニウムエステル(theromatic acridi
nium ester)、イミダゾール、アクリジニウム塩および
オキサレートエステルがあげられる。

【００８４】同様に、生物学的発光化合物が本発明の抗
体の標識に用いられてもよい。生物学的発光とは、触媒
のタンパク質が化学発光反応の効率を増大する生物学的
システムにみられる化学発光反応のタイプである。生物
学的発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出するこ
とにより決定される。標識するために重要な生物学的発
光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼまた
はエクオリン(aequorin)などがあげられる。

【００８５】本発明の抗体分子は、「トゥ−サイト(two
-site)」または「サンドイッチ」法としても知られてい
る、免疫測定検定法(immunometric assay)に利用するの
に適用されてもよい。典型的な免疫測定検定法では、標
識していない多量の抗体（または抗体の断片）を固体の
支持体または担体に結合し、検出可能となるように標識
した多量の可溶性抗体を加えて固相抗体、抗原および標
識抗体間で形成された３成分系の複合体を検出および／
または定量する。

【００８６】典型的で好ましい免疫測定検定法として
は、固相に結合した抗体をまず被験サンプルに接触さ
せ、２元の固相、抗体−抗原複合体の形成によってサン
プルから抗原を抽出する、「順向の(forward)」検定法
があげられる。適した期間インキュベートしたのち、固
体の支持体または担体を洗浄して、もしあれば、未反応
の抗原を含む液体サンプルの残りを除去し、そののちに
未知量の標識抗体（「レセプター分子」として働く）を
含む溶液と接触させる。標識されていない抗体により固
体の支持体または担体に結合された抗原と標識抗体とを
複合体にするために２回目のインキュベーションを行な
ったのちに、未反応の標識抗体を除去するためにさらに
洗浄を行なう。

【００８７】本発明の抗原を用いるとまた有用でありう
る、「サンドイッチ」法のほかのタイプでは、いわゆる
「同時の」および「逆の(reverse)」検定法が用いられ
る。「同時の」検定法は、固体の支持体または担体に結
合している抗体と標識抗体とがともに同時に被験される
サンプルに加えられるような、１回のインキュベーショ
ン工程からなる。インキュベーションが完了すると、固
体の支持体または担体を洗浄し、液体サンプルの残渣と
複合体に形成されなかった標識抗体を除去する。そのの
ち、固体の支持体または担体と結合していない標識抗体
の存在を従来の「順向の」サンドイッチ検定法で行なわ
れるように決定する。

【００８８】「逆の」検定法では、まず液体サンプルに
標識抗体の溶液を段階的に加え、適したインキュベーシ
ョン期間ののちに固体の支持体または担体に結合してい
る標識されていない抗体を加える。２回目のインキュベ
ーションののちに、通常の方法で固相を洗浄し、被験さ
れるサンプルおよび未反応の標識抗体の溶液の残りを除
去する。固体の支持体または担体に結合した標識抗体の
決定は、「同時の」検定法および「順向の」検定法にお
けるように行なわれる。

【００８９】本発明は、前述で定めた本発明のタンパク
質のいずれをもコードするＤＮＡ分子類、それらＤＮＡ
分子類のいずれかからなる複製可能な発現ビヒクル類、
それら発現ビヒクルのいずれかで形質転換された、原核
または真核細胞の宿主細胞、好ましくはサルＣＯＳ細胞
を含む宿主細胞をも提供する。

【００９０】さらに、本発明は、本発明の形質転換され
た細胞を培養し、そのような形質転換された宿主細胞内
でＤＮＡ分子および発現ビヒクルにコードされたタンパ
ク質を回収することにより本発明のタンパク質のいずれ
をも産生する方法をも提供する。

【００９１】以下に図面について詳細に説明する。

【００９２】図１は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩとＩＦＮＡＢ
−ＢＰIIのクローニング計画を示す。

【００９３】（ａ）中列 尿由来の分子量４０,０００のＩＦＮＡＢ−ＢＰからえ
られた内部のＣＮＢｒペプチド（２７アミノ酸残基、ｃ
ｂ７）の配列（配列番号２）である。

【００９４】上列および下列 上列には合成センスを、下列にはアンチセンスを示す。
これらはペプチド配列にもとづいて作製され、逆転写
（アンチセンスプライマーのみ）とポリメラーゼ連鎖反
応（以下、ＰＣＲと称す）に用いられる変性オリゴヌク
レオチド混合物である。

【００９５】（ｂ）前記センスおよびアンチセンスプラ
イマーを用いてえられたＰＣＲ産物のアガロースゲル電
気泳動の結果を示す。以下のＲＮＡ類とプライマー類は
ＰＣＲのための鋳型として用いられたｃＤＮＡを産生す
るために用いられた： （１）Ｄａｕｄｉ細胞のポリＡ＋ＲＮＡ、アンチセンス
プライマー （２）Ｄａｕｄｉ細胞のポリＡ＋ＲＮＡ、オリゴｄ
（Ｔ）プライマー （３）ＷＩＳＨ細胞の全ＲＮＡ、アンチセンスプライマ
ー ＤＮＡマーカーの大きさ（bp）は左側に示す。

【００９６】（ｃ）上列 １０１ｂｐのＰＣＲ産物のpBluescriptクローンからえ
られた、配列の非変性部分を示す。

【００９７】下列 えられた非変性ＤＮＡ配列のペプチドｃｂ７（残基９〜
２０）の配列の一部である予測された配列への翻訳の結
果を示す。

【００９８】図２は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのｃＤＮＡを
有するクローンｑ１０のｃＤＮＡおよび翻訳されたポリ
ペプチドの配列（配列番号６）を示す。

【００９９】このクローンは、ヒトＨｅＬａの細胞のｃ
ＤＮＡから作製された、λｇｔ１１ライブラリーから、
図１（ｃ）の非変性ＤＮＡ配列に対応する合成オリゴヌ
クレオチドを用いてスクリーニングすることにより単離
された。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＮ末端およびその
ＣＮＢｒペプチドに相当する配列には下線を引き、対応
する配列名はその線の下に記載している（ｎ１はＮ末端
１、ｎ２はＮ末端２、ｃｂ３はＣＮＢｒペプチド３、ｃ
ｂ６はＣＮＢｒペプチド６、ｃｂ７はＣＮＢｒペプチド
７を表わす）。シグナルペプチドおよび膜貫通型ドメイ
ン（ｔｍ）に相当する疎水性配列には二重線が引かれて
いる。右側の強調した太さの数字（下段）はアミノ酸残
基の数字である。そのままの太さの数字（上段）は、Ａ
ＴＧのイニシエーターＡを１番目とするヌクレオチド残
基に対応する数字である。

【０１００】図３は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮ
ＡＢ−ＢＰIIの配列に共通する特異的なプローブを用い
たノーザンブロッティングによるｍＲＮＡの検出を示
す。

【０１０１】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの２１８〜６１４ヌク
レオチドに対応する３９７塩基対（ｂｐ）プローブを適
切なプライマーを用いてＰＣＲにより調製し、ランダム
プライマー標識法により［³²ｐ］のラベル化を行った。
ヒトＤａｕｄｉ細胞からえられたポリＡ＋ＲＮＡをアガ
ロース（１.５％）上で電気泳動し、ニトロセルロース
にブロッティングし特異的なプローブを用いてハイブリ
ダイズすることにより分析した。ｒＲＮＡの大きさは右
側に示されている。

【０１０２】図４は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩに相当する完
全な１.５kb ｃＤＮＡクローンのヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列（配列番号７）を示す。１つの文字コードで
示されるアミノ酸残基は、翻訳開始コドンから始まって
強調した太さの数字（下段）で番号をつける。疎水性リ
ーダーおよび膜貫通領域には下線を付している。尿由来
のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＮ末端のタンパク質の配列（コド
ン２７から）および内部のＣＮＢｒペプチドはドットの
下線を付している（しかしながら、ＣｙｓおよびＮ−グ
リコシル化されたＡｓｎ残基は検出することができな
い）。Ｎ−グリコシル化シグナルは星印によって示さ
れ、ポリアデニル化シグナルは二重線によって示す。

【０１０３】図５は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIに相当する
４.５ｋｂ ｃＤＮＡクローンの部分的なヌクレオチドお
よびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。１つの文字コ
ードで示されるアミノ酸残基は、翻訳開始コドンから始
まって、強調した太さの数字（下段）で番号がつけられ
ている。疎水性リーダーには下線が付されている。尿由
来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＮ末端のタンパク質の配列（コ
ドン２７から）および内部のＣＮＢｒペプチドにはドッ
トの下線を付している（ＣｙｓおよびＮ−グリコシル化
されたＡｓｎ残基は検出することができない）。Ｎ−グ
リコシル化シグナルおよび終止コドンは星印で示されて
いる。

【０１０４】図６は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの細胞外の、
リガンド結合ドメインの発現のためのホ乳類の発現ベク
ターの構築を示す。

【０１０５】（ａ）ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの細胞外の、リ
ガンド結合ドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲによっ
て調製するために用いられるセンスおよびアンチセンス
の合成オリゴヌクレオチドを示す。

【０１０６】（ｂ）前記センスおよびアンチセンスプラ
イマーならびにクローンｑ１０のＤＮＡを用いて作製さ
れた８５０ｂｐまでのＰＣＲ産物のアガロースゲル電気
泳動の結果を示す。右側の数値の単位はｂｐである。＋
はＤＮＡを用いた完全な反応のレーン、−はＤＮＡのな
いコントロールのレーン、そしてＭはサイズマーカーの
レーンを意味する。

【０１０７】（ｃ）ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの可溶性部分
（ｓＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ）を産生するためのホ乳類の発
現ベクターであるｐＥＦ−ＢＯＳ−ｓＩＦＮＡＢ−ＢＰ
Ｉの構造を示す。

【０１０８】図７は、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮ
ＡＲの種々の細胞における発現を示す。

【０１０９】種々の細胞におけるＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの
発現を、界面活性剤による細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（７.５％アクリルアミド、非還元条件）に付し、続
いてウサギ抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII抗体および¹²⁵Ｉ−プ
ロテインＡを用いてイムノブロッティングすることによ
り示す。クローン３６９.１１はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを
発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。クローン４７０.
６はＩＦＮＡＲを発現しているＮＩＨ−３Ｔ３細胞であ
る。クローン５０８.１２は両方のタンパク質を発現し
ている。コントロールのＮＩＨ−３Ｔ３細胞およびヒト
Ｄａｕｄｉ細胞は充分示されている。ＩＦＮＡＢ−ＢＰ
Ｉの５１ｋＤａ型（マウス細胞における）および１０２
ｋＤの型（Ｄａｕｄｉ細胞における）は矢印で示され
る。分子量マーカーは左側に示される。

【０１１０】図８は、種々の宿主細胞に対する¹²⁵Ｉ−
ＩＦＮ−α２の結合を示している。

【０１１１】（ａ）ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現するＮＩ
Ｈ−３Ｔ３細胞（クローン３６９.１１、黒四角で示
す）およびＩＦＮＡＢ−ＢＰＩとＩＦＮＡＲの両者を発
現する細胞（クローン５０８.１２、黒丸で示す）に対
して¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合が飽和することと、Ｉ
ＦＮＡＲのみを発現する細胞（クローン４７０.６、黒
三角で示す）に対して¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合が生
じないことを示す。

【０１１２】（ｂ）前記細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−
α２結合をスキャッチャード分析したものである。結合
のデータをリガンドプログラムにて解析した。以下の細
胞は高親和飽和結合を示した。ヒトＤａｕｄｉ細胞（黒
三角で示す）、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ陽性細胞（クローン
３６９.１１、黒丸で示す）およびＩＦＮＡＲとＩＦＮ
ＡＢ−ＢＰＩの両者を発現している細胞（クローン５０
８.１２、黒四角で示す）。

【０１１３】図９は、尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＩ
ＦＮ−α２に対する親和性を測定するＢＩＡコアシステ
ムによる実験（ＩＦＮＡＺＫＡ・ＸＬＳ）の結果をまと
めたものである。

【０１１４】ＩＦＮ−α２をセンサーのチップに固定
し、様々な濃度の尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをセンサ
ーのチップに通過させた。「相対的反応と時間の関係」
は結合と解離の経過を示す。みかけの解離定数は３.１
２×１０^-9Ｍである。

【０１１５】図９中、Ｋassは結合速度定数（associati
on rate constant）、Ｋdissは解離速度定数（dissocia
tion rate constant）およびＫｄは解離定数（dissocia
tionconstant)を意味する。

【０１１６】図１０は、尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの
ＥＬＩＳＡの結果を示す。

【０１１７】純粋な尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを連続
して倍数希釈して表示の濃度にし、それらをｍａｂ抗Ｉ
ＦＮＡＢ−ＢＰII抗体で予めコーティングされているミ
クロＥＬＩＳＡプレートに加えた。プレート中でウサギ
抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII抗体と反応させ、つづいて西洋ワ
サビペルオキシダーゼが標識されているヤギ抗ウサギ抗
体（goat anti-rabbit horseradish peroxidase conjug
ate）、さらにはＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂基質を反応させた。
プレートの吸光度をＯＤ４０５／６３０ｎｍで分析し
た。検出限界の下限は３０ｐｇ／ｍｌである。

【０１１８】本発明を以下の実施例によりさらに詳細に
説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるもので
はない。

【０１１９】実施例１ 尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのアミノ酸配列分析 以下のようにイスラエル国特許出願第１０６５９１号明
細書の記載にしたがってＩＦＮＡＢ−ＢＰをえた。製造
業者の指示に従って、アフィゲル−１０(Afiigel-10)
（１ｍｌ、バイオラッド(BioRad)社製、米国）にＩＦＮ
−α２（５ｍｇ）を結合させてカラムにつめた。１０,
０００Ｄａのカットオフの膜（ミリポア(Millipore)社
製、米国）限外ろ過により尿からえられた粗尿タンパク
質（１０００倍濃縮、１０ｇ、２５０ｍｌ）を流速０.
２５ｍｌ／ｍｉｎでカラムに付した。カラムは０.５Ｍ
塩化ナトリウム含有リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）
２５０ｍｌ、つぎにＰＢＳ（１０ｍｌ）を用いて洗浄し
た。そののち結合したタンパク質（７５μｇ）を０.２
５ｍＭクエン酸ｐＨ２.２で溶出し、直ちに１Ｍ炭酸ナ
トリウムで中和した。１ｍｌずつ画分を集めた。その画
分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析し、タ
ンパク量をフルオレスカミン(fluorescamine)（シグマ
(Sigma)社製、米国）を用いて測定した。種々の画分に
ついて、¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２とのクロスリンキング、
免疫沈降ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィ
ーを行なって分析した。未処理尿中ならびにＩＦＮ−α
２−アガロースおよびＩＦＮ−β−アガロースカラム
（ＩＦＮ−β（インターラブ(Interlab)社製、米国）を
アフィゲル−１０に結合することによって調製された）
の両方から溶出した画分中にＩＦＮＡＢ−ＢＰが見出さ
れた。

【０１２０】溶出画分をスペロース１２カラム（１×３
０ｃｍ、ファルマシア社、スウェーデン）に一部（０.
３ｍｌ、１１μｇ）付した。カラムはリン酸緩衝性生理
食塩水および０.０２％アジ化ナトリウムで前もって平
衡化しておき、流速０.５ｍｌ／ｍｉｎにて溶出し、１
分ごとの画分を集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色
により測定すると４０Ｋの均一なタンパク質として画分
２６〜２８（７μｇ）にＩＦＮＡＢ−ＢＰが溶出した。
２５０リットルの尿から約２５μｇの純粋なタンパク質
を回収した。ＩＦＮ−βアガロースカラムに続いてスペ
ロース１２カラムを行なって粗尿タンパク質を精製した
ばあいにも、同様の結果がえられた。えられた純粋なＩ
ＦＮＡＢ−ＢＰをＰＶＤＦ膜（プロスピン(ProSpin)
（登録商標）、アプライド バイオシステムズ（Applie
d Biosystems）社製、米国）に吸着させ、その膜をモデ
ル４７５マイクロシーケンサー（アプライド バイオシ
ステムズ社製）のアミノ酸配列分析にかけた。その結
果、配列番号１で示される主な配列がえられた。

【０１２１】さらに、前記主配列のＮ末端における追加
の３アミノ酸残基（Ｉｌｅ−ｘｘｘ−Ｔｙｒ）を有する
第２のポリペプチドが検出された（ｘｘｘは未同定のア
ミノ酸を表わす）。えられた配列は、すでに知られてい
るＩＦＮ−αＢレセプター（ＩＦＮＡＲ）（文献１４）
の配列とはまったく異なっており、ほかの既知のタンパ
ク質のものとも異なっていた。また、プログラム ファ
スト エイ（Fast A）（ジェネンティック コンピュー
タ グループ インク(Genentic Computer group Inc.)
社製、米国）を用いてスイスプロット(Swissprot)デー
タベース（スイス国、ジュネーブ大学におけるデータベ
ースおよびゲンバンク(Genbank)データベース）を調査
することにより決定されたように（文献３３）、前記配
列は既知のＤＮＡ配列によってコードされるあらゆるタ
ンパク質とも異なっていた。このように、このタンパク
質は新規なＩＦＮ−α結合タンパク質である。以下に記
載するｃＤＮＡクローンの単離の際に、残基１０はＣｙ
ｓでありＡｒｇではないこと、そして残基１５はＳｅｒ
であってＡｒｇではないことが明らかになった。さらに
は、ｘｘｘがＳｅｒと同定された。Ｃｙｓはタンパク質
マイクロシーケンサーによる同定ができず、Ｓｅｒは分
析過程で時々こわされるので、同定されない尿由来のＩ
ＦＮＡＢ−ＢＰのサンプルをＣＮＢｒで分解し、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ上で分解しＰＶＤＦ膜にブロットした。ｃｂ
１〜ｃｂ７と称される、７つの別個のペプチドバンドが
分解されクマシーブルーで染色した際の膜上で検出され
た。各バンドはとり出され(excised)、タンパク質マイ
クロシーケンサーにかけた。そのうちの１つのペプチ
ド、ｃｂ７は１０,０００より小さく、配列番号２で示
される内部配列（Ｍｅｔは実際の配列に先行する）がえ
られた。

【０１２２】一方、別のペプチド、ｃｂ３は、配列番号
３で示される配列（Ｍｅｔは実際の配列に先行する）を
有していた。

【０１２３】残基１３は、ｃＤＮＡ配列（以下参照）か
ら決定されたようにＣｙｓであるとのちに同定された。
Ｃｙｓ残基はタンパク質マイクロシーケンサーでは同定
することができない。

【０１２４】ほかのペプチド、ｃｂ６は、配列番号４で
示される配列（Ｍｅｔは実際の配列に先行する）を有し
ていた。

【０１２５】残基４は、ｃＤＮＡ配列（以下参照）から
決定されたようにＡｓｎとのちに同定された。このＡｓ
ｎ残基は潜在的なグリコシル化シグナル配列（Ａｓｎ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ）の一部であり、タンパク質の配列にお
いてＡｓｎシグナルが欠失していることは、それが実際
にグリコシル化されることを示す。

【０１２６】ほかのペプチドのバンドは、ＣＮＢｒによ
る不完全な分解産物として配列決定により同定された。
これらは従来ＩＦＮＡＢ−ＢＰとしてすでに同定された
Ｎ末端ドメイン配列かもしくはｃｂ３、ｃｂ６またはｃ
ｂ７と同様の内部配列のいずれかを有していた。

【０１２７】実施例２ 尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのＣ末端ペプチドのアミノ酸
配列分析 尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰのサンプル（１０μｇ）をＤ
ＴＴで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、エ
ンドプロテイナーゼ Ｌｙｓ Ｃ（ベーリンガーマンハイ
ム社製、ドイツ国）を用いて、酵素：基質＝１：５０の
比となるようにして分解した。えられたペプチドの混合
物をＲＰ１８カラム（アクアポア(Aquapore)ＲＰ１８
（登録商標）、アプライド バイオシステムズ(Applied
Biosystems Inc)社製）、０.１％トリフルオロ酢酸水
溶液におけるアセトニトリルのグラジエントを用いるＲ
Ｐ−ＨＰＬＣで分解した。各々のピークのペプチドをセ
クアロン ＡＡ(Sequalon AA)膜（登録商標）（ミリポア
（Millipore）社製、ベッドホールド（Bedford）、マサ
チューセッツ州、米国）に共有結合的につけ、前記のよ
うにＮ末端の配列決定に付した。ペプチドのうちの１つ
は、配列番号５で示される配列を有するＣ末端のペプチ
ドとして同定された。

【０１２８】Ｃ末端の配列は４.５ｋｂ ｃＤＮＡクロー
ンのＣ末端の配列と一致し（以下参照）、最後の２アミ
ノ酸残基（Ｓｅｒ−ＡｌａにかえてＰｈｅ１２−Ｓｅｒ
１３）により、１.５ｋｂ ｃＤＮＡよりコードされる推
定タンパク質のＣ末端の配列と区別することができた。
こうして、尿から単離された可溶性レセプターは、ＩＦ
ＮＡＢ−ＢＰIIとして同定された。これは特定の４.５
ｋｂ ｍＲＮＡとは無関係に翻訳され、細胞表面レセプ
ターが除かれること(shedding)によって形成されるので
はない。

【０１２９】実施例３ 変性したセンスおよびアンチセンスプライマーの構築と
ＩＦＮＡＢ−ＢＰ ｃＤＮＡの未変性の配列の同定 ペプチドｃｂ７の配列をセンスプライマー（アミノ酸１
〜８）およびアンチセンスプライマー（アミノ酸２７〜
２０）に逆に翻訳した。ＢａｍＨ ＩおよびＳａｌ Ｉエ
ンドヌクレアーゼの制限配列をそれぞれ含むデカヌクレ
オチドおよびノナヌクレオチドをプライマーのオリゴヌ
クレオチドの５´末端に付加した（図１ａ参照）。Ｄａ
ｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）およびＷＩＳＨ
細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２５）から全ＲＮＡを抽出し、
アンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物またはオリゴ
ｄ（Ｔ）のいずれかをプライマーとして用いて、逆転写
により第１鎖のｃＤＮＡを産生した。つぎに、えられた
ｃＤＮＡ断片を組合わされたセンスおよびアンチセンス
変性プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物
を３％アガロースゲルで分析したところ、１０１ｂｐと
考えられるバンドがＤａｕｄｉ細胞およびＷＩＳＨ細胞
の両者のｃＤＮＡからえられたことが示された（図１ｂ
参照）。１０１ｂｐ断片をＢａｍＨ ＩおよびＳａｌ Ｉ
で切断し、pBluescript II KS⁺（ストラタジーン社製）
でクローン化し、５クローンを配列決定した。センスお
よびアンチセンスプライマーによりフランキングされた
領域の配列は不変で、ペプチドｃｂ７の９〜１９残基の
アミノ酸であると予測される配列をコードしていた（図
１ｃ参照）。ついで、非変性の内部配列に対応する３５
ｂｐのオリゴヌクレオチドを合成し、ｃＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングに用いた。

【０１３０】実施例４ ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの部分的なｃＤＮＡクローンの同定 実施例２の合成３５ｂｐ非変性オリゴヌクレオチドを［
³²Ｐ］で標識し、ヒトＨｅＬａ細胞（クロンテック（Cl
ontech）社製）のλｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーの
スクリーニングに用いた。５つの陽性クローンを同定し
た。これらのクローンのうちの１つは、ｑ１０と称さ
れ、１.４ｋｂの挿入物を含んでいた。クローンｑ１０
の配列決定によりオープンリーディングフレームを有す
る配列がえられた。そこではシグナルペプチド、細胞外
ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの一部
が同定された（図２参照）。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰ
の３つのＣＮＢｒペプチド、ｃｂ３、ｃｂ６およびｃｂ
７の配列と同様に、Ｎ末端のタンパク質の配列をコード
するＤＮＡ配列がクローンｑ１０のＤＮＡによりコード
される細胞外ドメイン内で同定された。いくつかのＣｙ
ｓおよびＳｅｒ残基（図２のドットによるアンダーライ
ン参照）はタンパク質の配列決定からは正しくは同定さ
れなかった。しかしながら、タンパク質の配列決定に用
いられた方法は、Ｃｙｓ残基を同定せず、時折Ｓｅｒ残
基ものがすことは周知のことである。また、ペプチドｃ
ｂ６のＡｓｎ残基は検出されなかったが、これはグリコ
シル化されていることを示している。クローンｑ１０の
ＤＮＡ配列とゲンバンクデータベースのとを比べてみて
も、既知の配列とは同定されなかった。したがってこの
クローンは新規なＤＮＡ配列を含有する。

【０１３１】実施例５ ヒトｍＲＮＡのノーザンブロッティング 放射線で標識されたＤＮＡプローブをクローンｑ１０か
ら調製し、２種のヒト細胞系統Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ２１３）およびＷＩＳＨ（ＡＴＣＣＣＣＬ２
５）細胞からポリＡ＋ｍＲＮＡのノーザンブロットハイ
ブリダイゼーションに用いた。両者ともに２つの特定の
バンドが観察された。そのうちの１つは１.５ｋｂに相
当し、もう一方は４.５ｋｂに相当した。バンドの強さ
にもとづき、１.５ｋｂのｍＲＮＡは４.５ｋｂのｍＲＮ
Ａの約２倍ほど多いと見積もられた。ＷＩＳＨ細胞から
のＲＮＡをもちいてえられたシグナルはほとんどみられ
ないのに対し、Ｄａｕｄｉ細胞からのＲＮＡのシグナル
は検出することができた（図３参照）。１.５ｋｂのｍ
ＲＮＡは細胞表面のインターフェロンレセプターである
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの前駆体に翻訳される。より長いｍ
ＲＮＡは異なる転写を示し、少なくとも約１００アミノ
酸残基をＩＦＮＡＢ−ＢＰＩと分け合う異なるタンパク
質をコードする。このタンパク質は、インターフェロン
α／βレセプターの可溶性形態であるとのちに示され
る、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの前駆体である。

【０１３２】実施例６ ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの完全な
ｃＤＮＡクローンの同定 ファージλｐＣＥＶ９（ミキ トオル博士（ザ ナショ
ナル キャンサー インスティチュート(the National
Cancer Institute)、米国））により提供された）で構
築されたヒト単球（ヒトの末梢血から単離）ｃＤＮＡラ
イブラリー（グッドカインド、ジェイ エス（Gutkind,
J.S.）ら著、モレク セル バイオル（Molec. Cell.
Biol.）第１１巻、１５００〜１５０７頁、１９９１年
参照）を、ついでクローンｑ１０をコードする領域から
ＰＣＲによって作製された３９７ｂｐのプローブでスク
リーニングした。１.５ｋｂの挿入物を有する２２のク
ローンと４.５ｋｂの挿入物を有する２つのクローンを
１０⁶の独立したファージから単離した。２つの４.５ｋ
ｂクローン(λｐＣＥＶ９−ｍ１９およびλｐＣＥＶ９
−ｍ２７）のオープンリーディングフレーム全体に加え
て、２つの１.５ｋｂクローン（λｐＣＥＶ９−ｍ６お
よびλｐＣＥＶ９−ｍ２４）のＤＮＡ配列の分析を行な
った。１.５ｋｂクローンは、３３１コドンのオープン
リーディングフレームを有する、細胞表面レセプターで
あるＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの完全な前駆体をコードしてい
た（図４参照）。尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰからえられ
たタンパク質およびＣＮＢｒペプチド配列（図４のドッ
トのアンダーラインで示される）は、翻訳されたＤＮＡ
配列内ですべて同定された。２つの４.５ｋｂクローン
の部分的な配列決定により、コドン２３９のあとに終止
シグナルを含む異なる配列が続く、１.５ｋｂクローン
に存在するような２３７のコドンの同様の５´配列が明
らかになった（図５参照）。全体的にみて以下のコドン
は異なっていた。コドン１３（ＨｉｓのかわりのＬｅ
ｕ）、コドン１０８（ＩｌｅのかわりのＴｈｒ）および
コドン２３８〜２４０（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒのかわ
りにＰｈｅ−Ｓｅｒ−終了）であった。４.５ｋｂクロ
ーンの両者には、あらゆる３つのリーディングフレーム
において終止コドンを超えるオープンリーディングフレ
ームはみられなかった。このように、４.５ｋｂ ｃＤＮ
Ａは尿から単離されたＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＣ末端配列
と一致する、ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIである端が切り取られ
た可溶性レセプターの前駆体をコードする。ＩＦＮＡＢ
−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの両者の前駆体タン
パク質をコードする２つのｍＲＮＡは、同一の遺伝子に
由来し、おそらく択一的なスプライシングにより生ずる
と考えられる。

【０１３３】実施例７ ホ乳動物の発現ベクターの構築および可溶性ＩＦＮＡＢ
−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの組換え体の産生 ＸｂａＩ制限部位を有する合成センスおよびアンチセン
スプライマー（図６ａ参照）および鋳型としてｑ１０
ＤＮＡを用いて、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（スト
ラタジーン社製）でＰＣＲを行ない、ＩＦＮＡＢ−ＢＰ
Ｉのシグナル配列および細胞外ドメインをコードするＤ
ＮＡを産生した。えられたＰＣＲ産物（図６ｂ参照）
は、ＸｂａＩにより切断され、発現ベクターｐＥＦ−Ｂ
ＯＳ（大阪のエス ナガタ(S. Ngata)博士より提供され
た）に結合され、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ
（図６ｃ参照、文献４６）を産生した。ＤＮＡの配列決
定により構築が確かめられた。コンピテントの大腸菌
（ＢＬ−２１株、ノバゲン インク(Novagen Inc.)社
製、米国）を形質転換し、正しいオリエンテーションで
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの配列を有するクローンを単離し
た。ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの構築物は、
サルＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７細胞、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ１
６５１））のトランスフェクションに用いられた。これ
らの細胞は、細胞培養上清でえられた１２ｎｇ／ｍｌの
可溶性ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの組換え体を発現したこと
が、ＥＬＩＳＡおよびヒトＩＦＮ−αおよびβの生物学
的活性（抗ウイルス活性)を阻害するその能力により決
定された。類似体では、４.５ｋｂクローンにＩＦＮＡ
Ｂ−ＢＰIIをコードするＤＮＡ領域を、ＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰＩの細胞外ドメインを記載したようにホ乳類の発現ベ
クターに挿入し、細胞の形質転換に用いた。これらの細
胞は、前記細胞の培養培地に分泌される活性ＩＦＮＡＢ
−ＢＰIIを産生している。

【０１３４】実施例８ 真核細胞の発現ベクターの構築およびマウス細胞のＩＦ
ＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲの発現 ＸｂａＩ制限部位を有する合成センスおよびアンチセン
スプライマーおよび鋳型としてプラスミドｐＣＥＶ９−
ｍ６を用い、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタ
ジーン社製）でＰＣＲ法を行ない、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ
の全体をコードするＤＮＡを産生した。えられたＰＣＲ
産物をＸｂａＩで切断し、発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ
に結合してｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢＲを産生した。
ＩＦＮＡＲ（文献１４）に対応するｃＤＮＡを特定のオ
リゴヌクレオチドを用いるＲＴ−ＰＣＲ（文献４８）を
用いて産生した。増幅された産物をｐＥＦ−ＢＯＳ発現
ベクター（文献４６）のＸｂａI制限部位にクローン化
し、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＲをえた。これらの構築
物は、ＤＮＡの配列決定をすることによって確かめられ
た。コンピテント大腸菌（ＢＬ−２１株、ノバゲン イ
ンク社製、米国）を形質転換し、正しいオリエンテーシ
ョンでＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲ配列を有す
るクローンを単離した。

【０１３５】クローン化されたＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ ｃ
ＤＮＡを安定した様式で発現するマウス細胞（ＮＩＨ−
３Ｔ３マウス細胞、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ １６５８）を増
殖した。指数的に増殖するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣ
Ｃ（ＣＲＬ １６５８）（１０ｃｍプレートに１.５×
１０⁶細胞）を、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢＲ（１０
μｇ ＤＮＡ）とともにｐＳＶ２ｎｅｏ（クロンテク(Cl
ontech)社製、米国、ｐＭＡＭｎｅｏカタログ番号６１
０４−１）（２μｇ）を用いてリン酸カルシウム沈降法
（文献４９）によりコトランスフェクションした。独立
したＧ４１８耐性コロニーが同定され、サブクローン化
された。高レベルのＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現するクロ
ーンを尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰＩに対する抗体および
¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合（表４参照）により同定し
た。

【０１３６】抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII抗体の結合のため
に、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ（ＣＲＬ １６５
８））からえられた細胞（表４参照）(１×１０⁶細胞)
を３５ｍｍウェル（６ウェルプレート、コースター（Co
star）社製）にまき、コンフルエントまで増殖させた
（２０時間）。細胞を２％ＦＢＳおよび０.１％アジ化
ナトリウムを含むＤＭＥＭ（洗浄培地）で洗浄し、つづ
いて洗浄培地で２０分間インキュベートした。ウサギ抗
ＩＦＮＡＢ−ＢＰII抗体（２ｍｌ、１：５００洗浄培地
中）を洗浄したウェルに加え、２時間、室温でインキュ
ベートした。細胞を３回洗浄し、¹²⁵Ｉ−プロテインＡ
（２ｍｌ、２５０,０００ｃｐｍ洗浄培地中）を加えて
さらに45分間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、
トリプシンを用いて回収し、細胞数を数えた。

【０１３７】¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２を結合するために、
細胞（１×10⁶細胞）を３５ｍｍウェル（６ウェルプレ
ート、コースター社製）にまき、コンフルエントまで増
殖させた（２０時間）。細胞を２％ＦＢＳおよび０.１
％アジ化ナトリウム（洗浄培地）を含むＤＭＥＭで洗浄
し、続いて洗浄培地で２０分間インキュベートした。
¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（２〜３×１０⁵ｃｐｍ、１０⁸単
位／ｍｇ、５×１０⁷ｃｐｍ／μｇ）を加え、２時間、
室温でインキュベーションを続けた。細胞を３回洗浄
し、トリプシンを用いて回収し、細胞数を数えた。

【０１３８】陽性クローン（たとえば、クローン３６
９．１１）の洗剤抽出物（detergentextracts)の非還元
条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それにつづく前記抗体を用
いた免疫ブロッティングにより、約５１ｋＤａの強力な
バンドがえられた（図７参照）。

【０１３９】ＩＦＮＡＲを発現するマウス細胞（ＮＩＨ
−３Ｔ３マウス細胞、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ １６５８））
はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＲとのトランス
フェクションによって同様に増殖した。クローンNo.４
７０．６は、これらの細胞における抗ウイルス反応性を
効果的に誘導するｈｕＩＦＮ−αＢの能力によって決定
されるように、ＩＦＮＡＲ−陽性であった。予測され
た、ほかのＩ型ＩＦＮ類（たとえば、ｈｕＩＦＮ−β）
はクローン４７０．６において活性ではなかった。

【０１４０】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲを発
現する、クローン３６９．１１および４７０．６はつい
で相補的なレセプタータンパク質（それぞれｐＥＦ−Ｂ
ＯＳＩＦＮＡＲおよびｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢＲ）
を用いてトランスフェクトした。安定な共発現(coexpre
ssion)のために、ＩＦＮＡＲまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ
のいずれかを発現するＧ４１８−耐性クローンを前記の
ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＩＦＮＡＢＲまたはｐＥＦ−ＢＯＳ−
ＩＦＮＡＲのいずれかとともに、ｐＳＶ２ｈｙｇｒｏ
（グリッツ(Gritz)およびデイビス(Davies)、ジーン(Ge
ne)、２５巻、１７９〜１８８頁、１９８３年参照）
（２μｇ）を用いてトランスフェクトした。ＩＦＮＡＲ
およびＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを共発現する、ハイブロマイ
シン(hygromycin)およびＧ４１８−耐性クローンを単離
しサブクローン化した。クローン３６９．１１由来のＩ
ＦＮＡＲ−陽性クローンをｈｕＩＦＮ−αＢに対するそ
れらの抗ウイルス反応性によって固定し、またクローン
４７０．６由来の、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ−陽性クローン
を抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII抗体および¹²⁵I-ＩＦＮ−α２
（リプロゲン(Reprogen)社製、イスラエル国、ネスジオ
ナ）の両者の結合により同定した。クローン３６９．１
１由来のクローン５０８．１２およびクローン４７０．
６由来のクローン１３０６は¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２およ
びＩＦＮ−α／βＲ抗体の両者と結合した（表４参
照）。さらに、これらは抗ウイルスアッセイ法でｈｕＩ
ＦＮ−αＢに反応した。したがって、これらのクローン
はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよび機能的ＩＦＮＡＲの両者を
発現すると結論づけられる。

【０１４１】表４に種々の細胞におけるＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰＩの発現を示す。

【０１４２】

【表４】

【０１４３】実施例９ マウス細胞で発現されたＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦ
ＮＡＲの親和性の決定 ＩＦＮＡＲまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのいずれかを発現
するクローンを、¹²⁵Ｉ−ｈｕＩＦＮ−α２の結合につ
いて試験し、結合データをスキャッチャード分析（Scat
chard analysis）で評価した。

【０１４４】ＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞（ＡＴＣＣ(Ｃ
ＲＬ １６５８)、１×１０⁶細胞）を３５ｍｍウェル
（６ウェルプレート、コースター社製）にまき、コンフ
ルエントまで増殖させた（２０時間）。細胞を２％ＦＢ
Ｓおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＤＭＥＭ（洗
浄培地）で洗浄し、つづいて同じ培地で２０分間インキ
ュベートした。¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（２〜３×１０⁵ｃ
ｐｍ、１０⁸単位／ｍｇ、５×１０⁷ｃｐｍ／μｇ）を決
められた濃度の非標識のＩＦＮ−α２とともに加え、２
時間、室温でインキュベートした。細胞を洗浄培地で３
回洗浄し、トリプシンを用いて回収し、細胞数を数え
た。結合データをリガンドプログラム（LIGAND progra
m）（ザ ナショナル インスティチュート オブ ヘ
ルス ユーエスエー（the National Institute of Heal
th USA)、ムンソン、ピージェー(Munson, P.J.)および
ロッドバード、ディ−(Rodbard, D)（１９８０年）、ア
ナルバイオケム（Anal. Biochem.)、１０７巻、２２０
〜２３９巻参考）により分析した（文献５０）。

【０１４５】ＩＦＮＡＲのみを発現する細胞（クローン
４７０．６）は¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の特異的結合を示
さなかったので、このような推定の結合部位のＫｄ値は
えることができなかった。それに対して、クローン４７
０．６とは逆に高親和性で特異的でしかも飽和できる結
合がＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを単独で発現する細胞（クロー
ン３６９．１１）でえられた。この結合のＫｄ値は２３
℃で３.６×１０^-9Ｍであった（表５参照）。

【０１４６】５０８．１２細胞（ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩお
よびＩＦＮＡＲの両者を発現する）に対する¹²⁵Ｉ−Ｉ
ＦＮ−α２の結合を、スキャッチャード分析で評価し、
その結果をクローン３６９．１１(ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ
のみを発現する）のと比較した。ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩお
よびＩＦＮＡＲの共発現の際に、飽和の結合がえられ、
ＩＦＮ−α２に対する親和性がＤａｕｄｉ細胞における
レセプターの親和性と接近して約１０倍高くなった（そ
れぞれ、Ｋｄ＝４.０×１０^-10Ｍ、１.６×１０^-10Ｍ、
表５参照）（図８参照）。この結果はＩＦＮＡＲおよび
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩがともにリガンド結合することを示
す。

【０１４７】表５には種々の宿主細胞の結合特性（リガ
ンド＝¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２）を示す。

【０１４８】

【表５】

【０１４９】実施例１０ 尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの親和性の決定 ＢＩＡコア（ファルマシア社製、スウェーデン）のセン
サーのチップに、製造業者らにより提供された自動操作
により、ヒトＩＦＮ−α２を固定化した。約３０ｆｍｏ
ｌのＩＦＮ−α２を固定した。数種の濃度（２８〜１１
２ｎＭ）までリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈
した尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをセンソグラムのチッ
プ（sensogram chip）に通し、（ＰＢＳ中の）結合(ass
ociation)および解離の程度を記録した。えられたデー
タにもとづき、３.１２×１０^-9ＭのＫｄ値が計算され
た（図９参照）。このように、尿由来のＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰIIの親和性は宿主細胞において発現されたＩＦＮＡＢ
−ＢＰＩの親和性ときわめて類似している。

【０１５０】実施例１１ 大腸菌、酵母および昆虫細胞におけるＩＦＮＡＢ−ＢＰ
ＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの発現 ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを、大腸
菌（ＢＬ−２１株（カタログ番号６９４４９−１）、ノ
バゲン インク(Novagen Inc.)製、米国）のような原核
細胞、酵母（ピキア パストリス(Pichia pastoris)Ｇ
Ｓ１１５株（カタログ番号Ｋ１７１０−０１）、インビ
トロゲン(Invitrogen)社製、米国）および昆虫（Ｓｆ９
昆虫細胞（カタログ番号Ｋ８２２−０３の部分）、イン
ビトロゲン社製、米国）細胞のようなほかの真核細胞な
どのさらなる組換え細胞で産生させた。

【０１５１】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰII組換え体を産生するために、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩま
たはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのいずれかおよびそれらの活性
断片をコードするＤＮＡを有し、大腸菌および酵母細胞
の形質転換または昆虫細胞の感染に適する適切なベクタ
ーを構築するにあたって、既知の方法を利用した。酵母
細胞で発現させるために、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩ
ＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードするＤＮＡ（実施例５および
６）を切り出し、酵母細胞のトランスフェクションに適
する発現ベクターに挿入した。昆虫細胞で発現させるた
めに、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを
コードするＤＮＡをバキュロウイルス（baculo virus)
（カタログ番号Ｋ８２２−０３の部分、インビトロゲン
社製、米国）に挿入し、この組換えバキュロウイルスを
昆虫細胞に感染させた。大腸菌で発現させるために、Ｉ
ＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのいずれか
をコードするＤＮＡを適切なオリゴヌクレオチドを用い
て部位特異的突然変異に付し、開始ＡＴＧコドンを成熟
ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ（図２参照）またはＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰIIの第１のコドンのちょうど前に挿入した。または、
そのようなＤＮＡを適切なセンスおよびアンチセンスプ
ライマーを用いるＰＣＲによって調製することができ
た。えられたｃＤＮＡの構築物は、ついでこの分野でよ
く知られている方法により適切に構築された原核細胞の
発現ベクターに挿入した（文献３５）。

【０１５２】実施例１２ ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの組換え
融合タンパク質の構築 ＩｇＧ１のＨ鎖の定常部で融合させた、ＩＦＮＡＢ−Ｂ
ＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのリガンド結合ドメイン
のいずれかからなるタンパク質の産生を以下の方法で行
なった。

【０１５３】リガンドに結合する細胞外ドメインをコー
ドする配列の直前および直後に独自の制限部位を導入す
るために、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰ
IIのＤＮＡを、適切なオリゴヌクレオチドを用いて部位
特異的突然変異に供した。または、このようなＤＮＡを
制限部位を有する特別に設計されたプライマーを用いる
ＰＣＲにより調製した。ＩｇＧ１ Ｈ鎖の定常部を有す
るほかのプラスミド、たとえばｐＲＫＣＯ４２Ｆｃｌ
（文献４７）（ビルン(Byrn)ら、ネイチャー(Nature)、
３４４巻：６６７頁、１９９０年参照）を、融合タンパ
ク質に一致して翻訳を許容する方法で、できる限りＩｇ
Ｇ１ Ｈ鎖のＡｓｐ２１６に接近した同一の独自の制限
部位を導入するために同様の部位特異的突然変異に供し
た。５´−非翻訳配列からなり、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、
またはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのリガンド結合ドメインのい
ずれかをコードするｄｓ ＤＮＡ断片を、独自の制限部
位で分解することにより調製した。変異したｐＲＫＣＤ
４２Ｆｃｌを同様に分解して、プラスミドおよびＩｇＧ
１配列を含む大きな断片を産生した。つぎに、２つの断
片を、ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、またはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ
のリガンド結合ドメインのいずれかからなるポリペプチ
ドの前駆体および、ＩｇＧ１ Ｈ鎖の約２２７のＣ末端
アミノ酸（ヒンジ領域ならびにＣＨ²およびＣＨ³ドメイ
ン）をコードする新たなプラスミドを産生するために結
合させた。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、適切
な制限酵素で分解することによりプラスミドから単離さ
れ、ついで効率よく原核または真核細胞の発現ベクター
に挿入されうる。

【０１５４】実施例１３ ＩＦＮＡＲとのＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−
ＢＰIIの組換え融合タンパク質の構築 ＩｇＧ１ Ｈ鎖の定常部と融合した、ＩＦＮＡＢ−ＢＰ
ＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIの細胞外ドメインのいずれ
かからなるタンパク質の産生を実施例１２の記載にした
がって行なった。ＩｇＧ１ Ｌ鎖の定常部と融合したＩ
ＦＮＡＲの細胞外ドメインからなるタンパク質の産生を
同様に行なった。ＩｇＧ１ Ｈ鎖の定常部と融合したＩ
ＦＮＡＢ−ＢＰＩのリガンド結合ドメイン、またはＩｇ
Ｇ１ Ｈ鎖の定常部と融合したＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのい
ずれかをコードする真核細胞の発現ベクターを、ＩｇＧ
１ Ｌ鎖の定常部と融合したＩＦＮＡＲの細胞外ドメイ
ンをコードする真核細胞の発現ベクターとともに適切な
ホ乳類宿主細胞のコトランスフェクションに用いた。陽
性のトランスフェクタントは、ＩｇＧ１定常部、ＩｇＧ
１ Ｌ鎖の可変部が置換されているＩＦＮＡＲの細胞外
ドメインおよびＩｇＧ１ Ｈ鎖の可変部が置換されてい
るＩＦＮＡＢ−ＢＰII、またはＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのリ
ガンド結合ドメインのいずれかからなる混成タンパク質
を分泌した。

【０１５５】ほかの具体例では、Ｈ鎖およびＬ鎖の定常
部がスイッチされる。すなわち、ＩＦＮＡＲの細胞外ド
メインがＩｇＧ２ Ｈ鎖の定常部と融合し、一方、ＩＦ
ＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのリガンド結
合ドメインのいずれかが、ＩｇＧ２ Ｌ鎖の定常部と融
合する。

【０１５６】実施例９にもとづき、これら融合タンパク
質はＩＦＮＡＢ−ＢＰＩまたはＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＩ
ＦＮ−αに対する親和性と比べると、約１０倍高い親和
性を有することが期待される。

【０１５７】実施例１４ ＩＦＮＡＢ−ＢＰに対するポリクローナル抗体の調製 完全フロインドアジュバントで乳化された尿由来のＩＦ
ＮＡＢ−ＢＰの純粋な調製物５μｇをまずウサギの皮下
に注射した。３週間後、不完全フロインドアジュバント
中の調製物５μｇを再び皮下に注射した。１０日間の間
隔でＰＢＳ溶液としてさらに４回追加的に注射をした。
最後の免疫の１０日後にウサギから採血をした。４℃、
一晩、ＰＢＳ中ＩＦＮＡＢ−ＢＰ（１μｇ／ｍｌ）でコ
ートした９６ウェルＰＶＣプレートを用いて、固相ラジ
オイムノアッセイ（ｓＲＩＡ）を行なうことにより、抗
体のレベルの発展を測定した。つぎにプレートをウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ、０.５％）、トウィーン２０
（シグマ社製、米国、０.０５％）を含むＰＢＳで４
℃、一晩ブロックした。プレートを５倍希釈したウサギ
抗血清と４時間、室温で反応させ、洗浄し、つぎに¹²⁵
Ｉ−プロテインＡ（１０⁵ｃｐｍ／ウェル）を含むＰＢ
Ｓと４５分間、室温で反応させた。つづいてプレートを
洗浄し、個々のウェルを切り取り、カウントした。力価
を最大希釈の逆数として計算したところ、コントロール
の抗血清よりも10倍高い値がえられた。５回目の注射の
のちの力価は１：60,000よりも大きかった。

【０１５８】また、抗体レベルの発展は、ヒトＩＦＮ−
α２（リプロゲン社製、ネス ジオナ、イスラエル国）
の抗ウイルス活性をブロックする抗血清の能力により測
定した。９６ウェルプレートにあらかじめ形成された単
層のヒトＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２５）を１番
目のウェルで１：２５０の希釈から始まり、２倍希釈の
抗血清と１時間、３７℃でインキュベートした。ＩＦＮ
−α２（１０ｕ／ｍｌ、最終濃度）をつぎに加え、１時
間、３７℃ののちに、水泡性口内炎ウイルス(vesicular
stomatitis virus)を用いて免疫性のテストをした。７
回の免疫ののちの中和された力価は１２０,０００抗ウ
イルス単位／ｍｌであった。

【０１５９】実施例１５ ＩＦＮＡＢ−ＢＰに対するモノクローナル抗体の調製 雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（オーエルエー ラボラトリー
ズ(OLA laboratories)社製、米国）（３月令）に、まず
２μｇの精製ＩＦＮＡＢ−ＢＰを含む完全フロインドア
ジュバントのエマルジョンを注射し、３週間後に不完全
フロインドアジュバントを皮下に注射した。１０日間隔
でさらに３回皮下にＰＢＳに加えて注射をした。１：６
０,０００の結合力価がｓＲＩＡ（実施例９参照）によ
ってえられた。最も高い結合力価を示すマウスに対し
て、融合の４日前および３日前に最終の二次免疫注射を
腹腔内に行なった。融合はＮＳＯ／１ミエローマ細胞系
（ガルフレ アンド マイルシュタイン メソッズ エ
ンザイモル(Galfre and Milstein Methods Enzymol.)、
７３巻：１頁１９８１年参照）と融合パートナーとして
の動物の脾臓およびリンパ節の両方から調製されたリン
パ球を用いて行なわれた。融合細胞を微小培養用プレー
トに分配し、ＨＡＴおよび１５％ウマ血清を加えたＤＭ
ＥＭ中でハイブリドーマを選択した。ＩＦＮＡＢ−ＢＰ
に対する抗体を産生することがわかったハイブリドーマ
を限界希釈法によりサブクローン化し、腹水を産生する
ためにプリスタンで感作されたＢａｌｂ／Ｃマウスに注
射した。市販のＥＬＩＳＡキット（アマシャム（Amersh
am）社製、イギリス国）を用いて抗体のアイソタイプを
規定した。

【０１６０】抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマのスクリーニングをつぎのよう
にして行なった。ハイブリドーマ上清を、倒立固相ラジ
オイムノアッセイ（inverted solid phase radioimmuno
assay(IRIA)）により抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰ抗体が存在す
るかどうか調べた。ＰＶＣマイクロタイタープレート
（ダイナテック ラボラトリー(Dynatech Laboratorie
s)社製、アレクサンドリア、バージニア州）をアフィニ
ティ精製されたヤギ抗マウス血清Ｆ（ａｂ）₂抗体（ジ
ャクソン ラブス(Jackson Labs)社製、米国）（１０μ
ｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）でコーティングした。
一晩４℃でインキュベーションしたのち、プレートを２
回ＢＳＡ（０.５％）およびトウィーン２０（０.０５
％）を含有するＰＢＳで洗浄し、洗浄溶液で少なくとも
２時間、３７℃でブロックした。ハイブリドーマの培養
上清（１００μｌ／ウェル）を加え、プレートを４時
間、３７℃でインキュベートした。つぎにプレートを３
回洗浄溶液で洗浄し、¹²⁵Ｉ−ＩＦＮＡＢ−ＢＰ（１０
０μｌ、１０⁵ｃｐｍ）を加えてさらに１６時間、４℃
でインキュベートした。プレートを３回洗浄し、個々の
ウェルを切り取り、ガンマ−カウンターで計測した。陰
性のコントロール値よりも少なくとも５倍高いカウント
数のあるサンプルを陽性とした（表６参照）。５種の陽
性クローンを選択し、以下の検討のためにサブクローン
化し、特徴づけられた。すべてのクローンはＩｇＧ１ア
イソタイプであった。

【０１６１】表６にＩＦＮＡＢ−ＢＰに対するモノクロ
ーナル抗体を産生するクローン類を示す。

【０１６２】

【表６】

【０１６３】実施例１６ モノクローナル抗体を用いるＩＦＮＡＢ−ＢＰのアフィ
ニティクロマトグラフィー ＩＦＮＡＢ−ＢＰに対する抗体をアフィニティクロマト
グラフィーによりＩＦＮＡＢ−ＢＰの精製に利用した。
この実施例では、モノクローナル抗体番号５．７３をア
フィニティクロマトグラフィーに用いた。ハイブリドー
マ番号５．７３から分泌されるモノクローナル抗体を含
有する腹水を５０％飽和で硫安沈殿することにより精製
し、ＰＢＳに対して充分に(extensively)透析した。製
造者らによって特定されたように、１ｍｌのアフィゲル
（Affigel）１０（バイオ−ラッド（Bio-Rad）社製、米
国）に対して約１０ｍｇのイムノグロブリンが結合し
た。

【０１６４】２５０ｍｌのヒト尿タンパク質（粗尿２５
０リットルに対応する）を、４℃、流速０.２５ｍｌ／
分で０.５ｍｌの抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰ抗体のカラムにか
けた。タンパク質が洗浄液中に検出されなくなるまで、
カラムをＰＢＳで洗浄した。ＩＦＮＡＢ−ＢＰは、２５
ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２.２）（８×１カラム体積
画分）で溶出され、すぐに１Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃で中和され
た。溶出された画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀染色
分析をしたところ、分子量４０,０００の主なバンドが
みられた。この調製物のさらなる精製は、サイズ排除ク
ロマトグラフィーによりえられた。

【０１６５】実施例１７ ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＥＬＩＳＡ試験 マイクロタイタープレート（ダイナテック（Dynatech）
社製またはマキシソーブ(Maxisorb)、ヌンク(Nunc)社
製、デンマーク国）に抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰモノクローナ
ル抗体番号４６．１０（Ｉｇ画分、１２０μｌ／ウェ
ル、ＰＢＳ中に１０μｇ／ｍｌ含有）を一晩、４℃でコ
ーティングした。プレートを、ＢＳＡ(０.５％)、トウ
ィーン２０（０.０５％）およびＮａＮ₃（０.０２％）
を含有するＰＢＳ（ブロッキング溶液）で洗浄し、同じ
溶液で一晩３７℃でブロッキングを行なった。試験され
るサンプルを０.１％ＮＰ４０および０.６５Ｍ ＮａＣ
ｌを含有するブロッキング溶液で連続的に倍数希釈し
（１：４から出発）、４時間、３７℃でウェル（１００
μｌ／ウェル）に加えた。つぎに、０.０５％トウィー
ン２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／トウィーン）でプレ
ートを３回洗浄し、ウサギ抗ＩＦＮＡＢ−ＢＰII血清
（１：１０００ ＮａＮ₃を含有しないブロッキング溶
液、１００μｌ／ウェル）を加え、さらに一晩４℃でイ
ンキュベーションした。プレートをＰＢＳ／トウィーン
（１００μｌ／ウェル）で３回洗浄し、西洋ワサビペル
オキシダーゼが接合したヤギ抗ウサギ抗体（ＨＲＰ、ジ
ャクソン ラブス、１：１０,０００ＰＢＳ／トウィー
ン中、１００μｌ／ウェル）を２時間、室温で加えた。
プレートを３回ＰＢＳ／トウィーンで洗浄し、各ウェル
に１００μｌの新しく調製したＡＢＴＳ（２，２´−ア
ジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫
酸）、シグマ社製、１０ｍｇ、６.４ｍｌのＨ₂Ｏ、２.
２ｍｌの０.２Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１.４ｍｌの０.２Ｍク
エン酸、１μｌのＨ₂Ｏ₂）を基質として加えることによ
り発色させた。３０分間発色させ、０.２Ｍクエン酸を
１００μｌ／ウェル加えることにより反応を停止した。
プレートを自動ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍ
で、非特異的リーディングに対しては６３０ｎｍで読ん
だ。この検定法の下の検出限界は３０ｐｇ／ｍｌであっ
た（図１０参照）。

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ンズ ピューリファイド フロムヒューマン ウリン。
エビデンス ウォー イムノロジカル クロス リアク
ティビティ ウィズ セル サーフェイス チューマー
−ネクローシス ファクター レセプターズ(Two tumor
-necrosis-factor binding proteins purified from hu
man urine. Evidence for immunological cross reacti
vity with cell surface tumor-necrosis-factor recep
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ディング プロテイン ピューリファイド トゥー ホ
モジェナイティ フロム ヒューマン ウリン プロテ
クツ セルズ フロム チューマー ネクローシス フ
ァクター トキシサイティ(A tumor necrosis factor-b
inding protein purified to homogeneity from human
urine protects cells from tumor necrosis factor to
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ンデンボス、ティー(VandenBos, T.)、フレンド、デー
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ーソン、デー(Anderson, D.)、ジャクソン、ジェイ(Jac
kson, J.)、ウィグナール、ジェイ エム(Wignall, J.
M.)、スミス、シー(Smith C.)、ガリス、ビー(Gallis,
B.)、シムズ、ジェイ イー(Sims, J.E.)、ウーダル、
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ディビジャルズ アンド アット エレベーテッド レ
ベルズ イン ペイシャンツ ウィズ アダルト ティ
ー−セル ロイケミア(Soluble TAC peptide ispresent
in the urine of normal individuals and at elevate
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ンターロイキン−７ レセプターズ、デモンストレーシ
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receptors: demonstration of a soluble form and ho
mology to a new receptor superfamily.)セル(Cell) 6
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【０２０７】42. ブローチ、ジェイ アール(Broach, J
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【０２０８】43. ブローチ、ジェイ アール(Broach,
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【０２０９】44. ボロン、デー ピーら(Bollon, D.P.,
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【０２１０】45. マニアティス、ティー(Maniatis,
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【０２１１】46. ミズシマ、エス(Mizushima, S.)およ
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【０２１２】47. ビルン、アール エイら(Byrn R.A. e
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【０２１６】51. ヤマダ、ティーら(Yamada, T. et a
l.,)著、ニューロサイ レット(Neurosci. Lett.,) 18
1，61〜64頁(1994)。

【０２１７】

【発明の効果】本発明によれば、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、
ＩＦＮＡＢ−ＢＰII、それらの前駆体、ムテイン体、融
合タンパク質、機能的誘導体および活性画分ならびに該
結合タンパク質の塩から選択されるＩＦＮ−α／β結合
タンパク質、それらをコードするＤＮＡ分子および製造
法、それらを含有する医薬組成物、それらに対する抗
体、それらを発現しうる複製可能な発現ビヒクルならび
に該ビヒクルで形質転換された宿主細胞を提供すること
ができる。

【０２１８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 起源：ホモサピエンス、尿 配 列 Asp Ser Pro Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Arg Thr Phe Lys Ile Arg Leu 1 5 10 15 Arg

【０２１９】配列番号：２ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 起源：ホモサピエンス、尿 配 列 Met Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Glu Glu Glu Leu Gln Phe Asp Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln Ser Glu Gly Ile 20 25

【０２２０】配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 起源：ホモサピエンス、尿 配 列 Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys Val Val Lys Asn XXX Ala Asn Thr 1 5 10 15 Thr Arg

【０２２１】配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 起源：ホモサピエンス、尿 配 列 Met Ser Gly XXX Phe Thr Tyr Ile Ile Asp Lys Leu Ile Pro Asn Thr 1 5 10 15 Asn Tyr

【０２２２】配列番号：５ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 起源：ホモサピエンス、尿 配 列 Cys Thr Leu Leu Pro Pro Gly Gln Glu Ser Glu Phe Ser 1 5 10

【０２２３】配列番号：６ 配列の長さ：７９５ 配列の型：核酸 起源：ホモサピエンス、尿 配 列 ATG CTT TTG AGC CAG AAT GCC TTC ATC TTC AGA TCA CAT AAT TTG GTT 48 Met Leu Leu Ser Gln Asn Ala Phe Ile Phe Arg Ser His Asn Leu Val 1 5 10 15 CTC ATG GTG TAT ATC AGC CTC GTG TTT GGT ATT TCA TAT GAT TCG CCT 96 Leu Met Val Tyr Ile Ser Leu Val Phe Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Pro 20 25 30 GAT TAC ACA GAT GAA TCT TGC ACT TTC AAG ATA TCA TTG CGA AAT TTC 144 Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Cys Thr Phe Lys Ile Ser Leu Arg Asn Phe 35 40 45 CGG TCC ATC TTA TCA TGG GAA TTA AAA AAC CAC TCC ATT GTA CCA ACT 192 Arg Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Lys Asn His Ser Ile Val Pro Thr 50 55 60 CAC TAT ACA TTG CTG TAT ACA ATC ATG AGT AAA CCA GAA GAT TTG AAG 240 His Tyr Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys 65 70 75 80 GTG GTT AAG AAC TGT GCA AAT ACC ACA AGA TCA TTT TGT GAC CTC ACA 288 Val Val Lys Asn Cys Ala Asn Thr Thr Arg Ser Phe Cys Asp Leu Thr 85 90 95 GAT GAG TGG AGA AGC ACA CAC GAG GCC TAT GTC ATC GTC CTA GAA GGA 336 Asp Glu Trp Arg Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Ile Val Leu Glu Gly 100 105 110 TTC AGC GGG AAC ACA ACG TTG TTC AGT TGC TCA CAC AAT TTC TGG CTG 384 Phe Ser Gly Asn Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ser His Asn Phe Trp Leu 115 120 125 GCC ATA GAC ATG TCT TTT GAA CCA CCA GAG TTT GAG ATT GTT GGT TTT 432 Ala Ile Asp Met Ser Phe Glu Pro Pro Glu Phe Glu Ile Val Gly Phe 130 135 140 ACC AAC CAC ATT AAT GTG ATG GTG AAA TTT CCA TCT ATT GTT GAG GAA 480 Thr Asn His Ile Asn Val Met Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Glu Glu 145 150 155 160 GAA TTA CAG TTT GAT TTA TCT CTC GTC ATT GAA GAA CAG TCA GAG GGA 528 Glu Leu Gln Phe Asp Leu Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln Ser Glu Gly 165 170 175 ATT GTT AAG AAG CAT AAA CCC GAA ATA AAA GGA AAC ATG AGT GGA AAT 576 Ile Val Lys Lys His Lys Pro Glu Ile Lys Gly Asn Met Ser Gly Asn 180 185 190 TTC ACC TAT ATC ATT GAC AAG TTA ATT CCA AAC ACG AAC TAC TGT GTA 624 Phe Thr Tyr Ile Ile Asp Lys Leu Ile Pro Asn Thr Asn Tyr Cys Val 195 200 205 TCT GTT TAT TTA GAG CAC AGT GAT GAG CAA GCA GTA ATA AAG TCT CCC 672 Ser Val Tyr Leu Glu His Ser Asp Glu Gln Ala Val Ile Lys Ser Pro 210 215 220 TTA AAA TGC ACC CTC CTT CCA CCT GGC CAG GAA TCA GAA TCA GCA GAA 720 Leu Lys Cys Thr Leu Leu Pro Pro Gly Gln Glu Ser Glu Ser Ala Glu 225 230 235 240 TCT GCC AAA ATA GGA GGA ATA ATT ACT GTG TTT UUG ATA GCA TTG GTC 768 Ser Ala Lys Ile Gly Gly Ile Ile Thr Val Phe Leu Ile Ala Leu Val 245 250 255 TTG ACA AGC ACC ATA GTG ACA CTG AAA 795 Leu Thr Ser Thr Ile Val Thr Leu Lys 260 265

【０２２４】配列番号：７ 配列の長さ：１２９６ 配列の型：核酸 起源：ホモサピエンス、Ｈｅｌａ細胞 配 列 GCTTTTGTCC CCCGCCCGCC GCTTCTGTCC GAGAGGCCGC CCGCGAGGCG CATCCTGACC 60 GCGAGCGTCG GGTCCCAGAG CCGGGCGCGG CTGGGGCCCG AGGCTAGCAT CTCTCGGGAG 120 CCGCAAGGCG AGAGCTGCAA AGTTTAATTA GACACTTCAG AATTTTGATC ACCTAATGTT 180 GATTTCAGAT GTAAAAGTCA AGAGAAGACT CTAAAAATAG CAAAG ATG CTT TTG AGC 237 Met Leu Leu Ser 1 CAG AAT GCC TTC ATC GTC AGA TCA CTT AAT TTG GTT CTC ATG GTG TAT 285 Gln Asn Ala Phe Ile Val Arg Ser Leu Asn Leu Val Leu Met Val Tyr 5 10 15 20 ATC AGC CTC GTG TTT GGT ATT TCA TAT GAT TCG CCT GAT TAC ACA GAT 333 Ile Ser Leu Val Phe Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Pro Asp Tyr Thr Asp 25 30 35 GAA TCT TGC ACT TTC AAG ATA TCA TTG CGA AAT TTC CGG TCC ATC TTA 381 Glu Ser Cys Thr Phe Lys Ile Ser Leu Arg Asn Phe Arg Ser Ile Leu 40 45 50 TCA TGG GAA TTA AAA AAC CAC TCC ATT GTA CCA ACT CAC TAT ACA TTG 429 Ser Trp Glu Leu Lys Asn His Ser Ile Val Pro Thr His Tyr Thr Leu 55 60 65 CTG TAT ACA ATC ATG AGT AAA CCA GAA GAT TTG AAG GTG GTT AAG AAC 477 Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys Val Val Lys Asn 70 75 80 TGT GCA AAT ACC ACA AGA TCA TTT TGT GAC CTC ACA GAT GAG TGG AGA 525 Cys Ala Asn Thr Thr Arg Ser Phe Cys Asp Leu Thr Asp Glu Trp Arg 85 90 95 100 AGC ACA CAC GAG GCC TAT GTC ACC GTC CTA GAA GGA TTC AGC GGG AAC 573 Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Thr Val Leu Glu Gly Phe Ser Gly Asn 105 110 115 ACA ACG TTG TTC AGT TGC TCA CAC AAT TTC TGG CTG GCC ATA GAC ATG 621 Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ser His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met 120 125 130 TCT TTT GAA CCA CCA GAG TTT GAG ATT GTT GGT TTT ACC AAC CAC ATT 669 Ser Phe Glu Pro Pro Glu Phe Glu Ile Val Gly Phe Thr Asn His Ile 135 140 145 AAT GTG ATG GTG AAA TTT CCA TCT ATT GTT GAG GAA GAA TTA CAG TTT 717 Asn Val Met Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Glu Glu Glu Leu Gln Phe 150 155 160 GAT TTA TCT CTC GTC ATT GAA GAA CAG TCA GAG GGA ATT GTT AAG AAG 765 Asp Leu Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln Ser Glu Gly Ile Val Lys Lys 165 170 175 180 CAT AAA CCC GAA ATA AAA GGA AAC ATG AGT GGA AAT TTC ACC TAT ATC 813 His Lys Pro Glu Ile Lys Gly Asn Met Ser Gly Asn Phe Thr Tyr Ile 185 190 195 ATT GAC AAG TTA ATT CCA AAC ACG AAC TAC TGT GTA TCT GTT TAT TTA 861 Ile Asp Lys Leu Ile Pro Asn Thr Asn Tyr Cys Val Ser Val Tyr Leu 200 205 210 GAG CAC AGT GAT GAG CAA GCA GTA ATA AAG TCT CCC TTA AAA TGC ACC 909 Glu His Ser Asp Glu Gln Ala Val Ile Lys Ser Pro Leu Lys Cys Thr 215 220 225 CTC CTT CCA CCT GGC CAG GAA TCA GAA TCA GCA GAA TCT GCC AAA ATA 957 Leu Leu Pro Pro Gly Gln Glu Ser Glu Ser Ala Glu Ser Ala Lys Ile 230 235 240 GGA GGA ATA ATT ACT GTG TTT TTG ATA GCA TTG GTC TTG ACA AGC ACC 1005 Gly Gly Ile Ile Thr Val Phe Leu Ile Ala Leu Val Leu Thr Ser Thr 245 250 255 260 ATA GTG ACA CTG AAA TGG ATT GGT TAT ATA TGC TTA AGA AAT AGC CTC 1053 Ile Val Thr Leu Lys Trp Ile Gly Tyr Ile Cys Leu Arg Asn Ser Leu 265 270 275 CCC AAA GTC TTG AGG CAA GGT CTC ACT AAG GGC TGG AAT GCA GTG GCT 1101 Pro Lys Val Leu Arg Gln Gly Leu Thr Lys Gly Trp Asn Ala Val Ala 280 285 290 ATT CAC AGG TGC AGT CAT AAT GCA CTA CAG TCT GAA ACT CCT GAG CTC 1149 Ile His Arg Cys Ser His Asn Ala Leu Gln Ser Glu Thr Pro Glu Leu 295 300 305 AAA CAG TCG TCC TGC CTA AGC TTC CCC AGT AGC TGG GAT TAC AAG CGT 1197 Lys Gln Ser Ser Cys Leu Ser Phe Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Lys Arg 310 315 320 GCA TCC CTG TGC CCC AGT GAT TAAGTTTTAT TATGTAGAAA ATAAAGAGCA 1248 Ala Ser Leu Cys Pro Ser Asp 325 330 AACAGTTACA AAAGAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1296

【０２２５】配列番号：８ 配列の長さ：１６７１ 配列の型：核酸 起源：ホモサピエンス、尿 配 列 ATG CTT TTG AGC CAG AAT GCC TTC ATC TTC AGA TCA CTT AAT TTG GTT 48 Met Leu Leu Ser Gln Asn Ala Phe Ile Phe Arg Ser Leu Asn Leu Val 1 5 10 15 CTC ATG GTG TAT ATC AGC CTC GTG TTT GGT ATT TCA TAT GAT TCG CCT 96 Leu Met Val Tyr Ile Ser Leu Val Phe Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Pro 20 25 30 GAT TAC ACA GAT GAA TCT TGC ACT TTC AAG ATA TCA TTG CGA AAT TTC 144 Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Cys Thr Phe Lys Ile Ser Leu Arg Asn Phe 35 40 45 CGG TCC ATC TTA TCA TGG GAA TTA AAA AAC CAC TCC ATT GTA CCA ACT 192 Arg Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Lys Asn His Ser Ile Val Pro Thr 50 55 60 CAC TAT ACA TTG CTG TAT ACA ATC ATG AGT AAA CCA GAA GAT TTG AAG 240 His Tyr Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys 65 70 75 80 GTG GTT AAG AAC TGT GCA AAT ACC ACA AGA TCA TTT TGT GAC CTC ACA 288 Val Val Lys Asn Cys Ala Asn Thr Thr Arg Ser Phe Cys Asp Leu Thr 85 90 95 GAT GAG TGG AGA AGC ACA CAC GAG GCC TAT GTC ACC GTC CTA GAA GGA 336 Asp Glu Trp Arg Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Thr Val Leu Glu Gly 100 105 110 TTC AGC GGG AAC ACA ACG TTG TTC AGT TGC TCA CAC AAT TTC TGG CTG 384 Phe Ser Gly Asn Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ser His Asn Phe Trp Leu 115 120 125 GCC ATA GAC ATG TCT TTT GAA CCA CCA GAG TTT GAG ATT GTT GGT TTT 432 Ala Ile Asp Met Ser Phe Glu Pro Pro Glu Phe Glu Ile Val Gly Phe 130 135 140 ACC AAC CAC ATT AAT GTG ATG GTG AAA TTT CCA TCT ATT GTT GAG GAA 480 Thr Asn His Ile Asn Val Met Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Glu Glu 145 150 155 160 GAA TTA CAG TTT GAT TTA TCT CTC GTC ATT GAA GAA CAG TCA GAG GGA 528 Glu Leu Gln Phe Asp Leu Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln Ser Glu Gly 165 170 175 ATT GTT AAG AAG CAT AAA CCC GAA ATA AAA GGA AAC ATG AGT GGA AAT 576 Ile Val Lys Lys His Lys Pro Glu Ile Lys Gly Asn Met Ser Gly Asn 180 185 190 TTC ACC TAT ATC ATT GAC AAG TTA ATT CCA AAC ACG AAC TAC TGT GTA 624 Phe Thr Tyr Ile Ile Asp Lys Leu Ile Pro Asn Thr Asn Tyr Cys Val 195 200 205 TCT GTT TAT TTA GAG CAC AGT GAT GAG CAA GCA GTA ATA AAG TCT CCC 672 Ser Val Tyr Leu Glu His Ser Asp Glu Gln Ala Val Ile Lys Ser Pro 210 215 220 TTA AAA TGC ACC CTC CTT CCA CCT GGC CAG GAA TCA GAA TTT TCA 717 Leu Lys Cys Thr Leu Leu Pro Pro Gly Gln Glu Ser Glu Phe Ser 225 230 235 TAACTTTTTA GCCTGGCCAT TTCCTAACCT GCCACCGTTG GAAGCCATGG ATATGGTGGA 777 GGTCATTTAC ATCAACAGAA AGAAGAAAGT GTGGGATTAT AATTATGATG ATGAAAGTGA 837 TAGCGATACT GAGGCAGCGC CCAGGACAAG TGGCGGTGGC TATACCATGC ATGGACTGAC 897 TGTCAGGCCT CTGGGTCAGG CCTCTGTCAT CTCTACAGAA TCCCAGTTGA TAGACCCGGA 957 GTCCGAGGAG GAGCCTGAAC TGCCTGAGGT TGATGTGGAG CTCCCCACGA TGCCAAAGGA 1017 CAGCCCTCAG CAGTTGGAAC TCTTGAGTGG GCCCTGTGAG AGGAGAAAGA GTCCACTCCA 1077 GGACCCTCTT CCCGAAGAGG ACTACAGCTC CACGGGGGGG TCTGGGGGCA GAATCACCTT 1137 CAATGTGGAC TTAAACTCTG TGTTTTTGAG AGTTCTTGAT GACGAGGACA GTGACGACTT 1197 AGAAGCCCCT CTGATGCTAT CGTCTCATCT GGAAGAGATG GTTGACCCAG AGGATCCTGA 1257 TAATGTGCAA TCAAACCATT TGCTGGCCAG CGGGGAAGGG ACACAGCCAA CCTTTCCCAG 1317 CCCCTCTTCA GAGGGCCTGT GGTCCGAAGA TGCTCCATCT GATCAAAGTG ACACTTCTGA 1377 GTCAGATGTT GACCTTGGGG ATGGTTATAT AATGAGATGA CTCCAAAACT ATTGAATGAA 1437 CTTGGACAGA CAAGCACCTA CAGGGTTCTT TGTCTCTGCA TCCTAACTTG CTGCCTTATC 1497 GTCTGCAAGT GTTCTCCAAG GGAAGGAGGA GGAAACTGTG GTGTTCCTTT CTTCCAGGTG 1557 ACATCACCTA TGCACATTCC CAGTATGGGG ACCATAGTAT CATTCAGTGG CATTGTTTTA 1617 CAATATTCAA AAGGTGGGCG CCAATTTTGG AAGGGAAGGA ACATGTGCAA CCTT 1671

【図面の簡単な説明】

【図１】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩとＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのク
ローニング計画を示す。 （ａ）中列 尿由来の分子量４０,０００のＩＦＮＡＢ−ＢＰからえ
られた内部のＣＮＢｒペプチド（２７アミノ酸残基、ｃ
ｂ７）の配列（配列番号２）である。 上列および下列 上列には合成センスを、下列にはアンチセンスを示す。 （ｂ）前記センスおよびアンチセンスプライマーを用い
てえられたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果
を示す。 （ｃ）上列 １０１ｂｐのＰＣＲ産物のpBluescriptクローンからえ
られた、配列の非変性部分を示す。 下列 えられた非変性ＤＮＡ配列のペプチドｃｂ７（残基９〜
２０）の配列の一部である予測された配列への翻訳の結
果を示す。

【図２】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのｃＤＮＡを有するクロー
ンｑ１０のｃＤＮＡおよび翻訳されたポリペプチドの配
列（配列番号６）を示す。

【図３】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰII
の配列に共通する特異的なプローブを用いたノーザンブ
ロッティングによるｍＲＮＡの検出を示す。

【図４】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩに相当する完全な１.５kb
ｃＤＮＡクローンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列
（配列番号７）を示す。

【図５】ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIに相当する４.５ｋｂ ｃＤ
ＮＡクローンの部分的なヌクレオチドおよびアミノ酸配
列（配列番号８）を示す。

【図６】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの細胞外の、リガンド結合
ドメインの発現のためのホ乳類の発現ベクターの構築を
示す。 （ａ）ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの細胞外の、リガンド結合ド
メインをコードするＤＮＡをＰＣＲによって調製するた
めに用いられるセンスおよびアンチセンスの合成オリゴ
ヌクレオチドを示す。 （ｂ）前記センスおよびアンチセンスプライマーならび
にクローンｑ１０のＤＮＡを用いて作製された８５０ｂ
ｐまでのＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を
示す。 （ｃ）可溶性ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ（ｓＩＦＮＡＢ−ＢＰ
Ｉ）を産生するためのホ乳類の発現ベクターであるｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ−ｓＩＦＮＡＢ−ＢＰＩの構造を示す。

【図７】ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮＡＲの種々の
細胞における発現を示す。

【図８】種々の宿主細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２
の結合を示している。 （ａ）ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細
胞（クローン３６９.１１、黒四角で示す）およびＩＦ
ＮＡＢ−ＢＰＩとＩＦＮＡＲの両者を発現する細胞（ク
ローン５０８.１２、黒丸で示す）に対して¹²⁵Ｉ−ＩＦ
Ｎ−α２の結合が飽和することと、ＩＦＮＡＲのみを発
現する細胞（クローン４７０.６、黒三角で示す）に対
して¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の結合が生じないことを示
す。 （ｂ）前記細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２結合をス
キャッチャード分析したものである。

【図９】尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＩＦＮ−α２に
対する親和性を測定するＢＩＡコアシステムによる実験
（ＩＦＮＡＺＫＡ、ＸＬＳ）の結果をまとめたものであ
る。

【図１０】尿由来のＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのＥＬＩＳＡの
結果を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/715 8318−4Ｈ 16/28 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｚ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｎ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） 7729−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ダニエラ ノビック イスラエル国、レホボト、ハナッシ ハリ ション ストリート 40 (72)発明者 メナケム ルビンシュタイン イスラエル国、ギバート シュミュエル、 ハトマー ストリート 16

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰ
   II、それらの前駆体、ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩおよびＩＦＮ
   ＡＢ−ＢＰIIの融合タンパク質もしくはムテイン体、そ
   れらの機能的誘導体またはそれらの活性画分から選ばれ
   る、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質をコードするＤＮＡ
   分子。
2. 【請求項２】 ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−ＢＰ
   II、それらの前駆体、融合タンパク質およびムテイン
   体、それらの機能的誘導体またはそれらの活性画分と同
   一または類似の生物学的活性を有するタンパク質をコー
   ドし、請求項１記載のＤＮＡ分子と厳密な条件下でハイ
   ブリッド形成しうるＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 翻訳の際にＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ前駆体を
   提供する約１.５ｋｂのｍＲＮＡ分子、および翻訳の際
   にＩＦＮＡＢ−ＢＰIIを提供する約４.５ｋｂのｍＲＮ
   Ａ分子から選ばれる、ｍＲＮＡ分子を転写の際に提供す
   る請求項１記載のＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩのタンパク質、前駆
   体、融合タンパク質、ムテイン体、機能的誘導体または
   活性画分をコードする請求項１、２または３記載のＤＮ
   Ａ分子。
5. 【請求項５】 配列番号６で示される配列を有する請求
   項４記載のＤＮＡ分子。
6. 【請求項６】 成熟ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩをコードする配
   列からなるＤＮＡ分子。
7. 【請求項７】 ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIのタンパク質、前駆
   体、融合タンパク質、ムテイン体、機能的誘導体または
   活性画分をコードする請求項１、２または３記載のＤＮ
   Ａ分子。
8. 【請求項８】 成熟ＩＦＮＡＢ−ＢＰIIをコードする配
   列からなるＤＮＡ分子。
9. 【請求項９】 請求項１、２、３、４、５、６、７また
   は８記載のＤＮＡ分子からなり、形質転換体である宿主
   細胞において、前記ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−
   ＢＰII、それらの前駆体、それらの融合タンパク質、そ
   れらのムテイン体、それらの機能的誘導体、それらの活
   性画分、ならびに前記ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ
   −ＢＰII、それらの前駆体、それらの融合タンパク質お
   よびムテイン体、それらの機能的誘導体もしくはそれら
   の活性画分と同一または類似の生物学的活性を有するタ
   ンパク質のいずれかを発現しうる、複製可能な発現ビヒ
   クル。
10. 【請求項１０】 請求項３記載のＤＮＡ分子からなり、
    前記形質転換体である宿主細胞においてＩＦＮＡＢ−Ｂ
    ＰＩおよびＩＦＮＡＢ−ＢＰIIから選ばれるＩＦＮ−α
    ／β結合タンパク質を発現しうる請求項９記載の複製可
    能な発現ビヒクル。
11. 【請求項１１】 発現ビヒクルがプラスミドｐＥＦ−Ｂ
    ＯＳ−ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩであり、前記形質転換体であ
    る宿主細胞においてＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ分子を発現しう
    る請求項９記載の複製可能な発現ビヒクル。
12. 【請求項１２】 請求項９、１０または１１記載の発現
    ビヒクルで形質転換された宿主細胞。
13. 【請求項１３】 形質転換された宿主細胞が原核宿主細
    胞である請求項１２記載の宿主細胞。
14. 【請求項１４】 形質転換された宿主細胞が真核宿主細
    胞である請求項１２記載の宿主細胞。
15. 【請求項１５】 真核宿主細胞がサルＣＯＳ細胞である
    請求項１４記載の宿主細胞。
16. 【請求項１６】 前記サルＣＯＳ細胞が請求項１１記載
    の発現ビヒクルを用いて形質転換される請求項１５記載
    の真核宿主細胞。
17. 【請求項１７】 ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−Ｂ
    ＰII、それらの前駆体、融合タンパク質、ムテイン体、
    機能的誘導体および活性画分から選ばれる組換えＩＦＮ
    −α／β結合タンパク質の製造法であって、請求項１
    ２、１３、１４、１５または１６のいずれかに記載の形
    質転換された宿主細胞を培養し、前記ＩＦＮ−α／β結
    合タンパク質を回収することからなる、前記ＩＦＮ−α
    ／β結合タンパク質の製造法。
18. 【請求項１８】 ＩＦＮＡＢ−ＢＰＩ、ＩＦＮＡＢ−Ｂ
    ＰII、それらの前駆体、ムテイン体、融合タンパク質、
    機能的誘導体および活性画分ならびに該結合タンパク質
    の塩から選択されるＩＦＮ−α／β結合タンパク質。
19. 【請求項１９】 請求項１、２、３、４、５、６、７ま
    たは８記載のＤＮＡ分子によってコードされる請求項１
    ８記載のＩＦＮ−α／β結合タンパク質。
20. 【請求項２０】 請求項９、１０または１１記載の複製
    可能な発現ビヒクルに含有されるＤＮＡ配列によりコー
    ドされる請求項１８記載のＩＦＮ−α／β結合タンパク
    質。
21. 【請求項２１】 請求項１２、１３、１４、１５または
    １６記載の宿主細胞において発現され、産生される請求
    項１８記載のＩＦＮ−α／β結合タンパク質。
22. 【請求項２２】 請求項１８、１９、２０または２１記
    載のＩＦＮ−α／β結合タンパク質からなる医薬組成
    物。
23. 【請求項２３】 ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β活性を調
    節するための請求項２２記載の医薬組成物。
24. 【請求項２４】 ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β活性をブ
    ロックするまたは阻害するための請求項２３記載の医薬
    組成物。
25. 【請求項２５】 ＩＦＮ−α／β結合タンパク質に対す
    る抗体。
26. 【請求項２６】 抗体がポリクローナル抗体である請求
    項２５記載の抗体。
27. 【請求項２７】 抗体がモノクローナル抗体である請求
    項２５記載の抗体。
28. 【請求項２８】 抗体がＩＦＮ−α／β結合タンパク質
    に対する抗体である請求項２５、２６または２７記載の
    抗体。
29. 【請求項２９】 抗体が請求項１８記載のＩＦＮ−α／
    β結合タンパク質に対する抗体である請求項２６または
    ２７記載の抗体。
30. 【請求項３０】 抗体が請求項１９記載のＩＦＮ−α／
    β結合タンパク質に対する抗体である請求項２６または
    ２７記載の抗体。
31. 【請求項３１】 抗体がＩＦＮＡＢ−ＢＰIIに対する抗
    体である請求項２７、２８または２９記載の抗体。
32. 【請求項３２】 イムノアッセイに用いられる請求項２
    ５、２６、２７、２８、２９、３０または３１記載の抗
    体。
33. 【請求項３３】 免疫精製に用いられる請求項２５、２
    ６、２７、２８、２９、３０または３１記載の抗体。