JPH05507614A - インターフェロンα及びβに対して高親和性を有する水溶性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターフェロンα　び　に　して　を　する１並見二１ｆ上 本発明は新規水溶性ポリペプチド、ＤＮＡ配列、新規細胞、前記ポリペプチドの 製造方法、医薬としてのその適用及び前記ポリペプチドを含有する組成物に係る 。

インターフェロンα及びβは、種々の生物学的特性を有しており且つを椎動物細 胞に抗ウィルス及び抗増殖状態を誘発する能力により特徴付けられる一群の分泌 タンパク質を形成する（Ｊ、Ｇｒｅｓｓｅｒ及びＭ、Ｇ、Ｔｏｖｅｙ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　５１６：２３／１９７８）。

インターフェロンαは細胞及び体液の免疫系、特にＢ細胞のポリクローナル活性 化（Ｍ、Ｐｅｔｅｒｓ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３７：３１５３／１９８６） −Ｔ細胞の機能の阻害（Ｊ、Ｋｎｏｐら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

、１３３：２４１２／１９８４）及び組織適合抗原の発現の変調（Ｍ、Ｆｅ１ｌ ｏｕｓら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、９：４４６／１９７９）に重要な影 響を及ぼす。これらの全プロセスは自己免疫の形成に関与する。

インターフェロンは生物に有益な因子であるとみなされているが、インターフェ ロンの異常産生はある種の疾患の病因となることがあり、従って、種々の所謂自 己免疫疾患に結び付けられる。例えば、紅斑性狼癒、リウマトイド関節炎、ベー チェット病、真性糖尿病、斑状硬化症、骨髄形成不全症及び重度の多発性免疫不 全症のような種々の疾患に罹患した患者の血清又は組織中には高率のインターフ ェロンが存在する。このインターフェロンαの率とＡＩＤＳの疾患進行の重度予 後との間には直接の相関関係が存在する（Ｅ、Ｂｕｉｍｏｖｉｖｉ−Ｋｌｅｉｎ ら、ＡＩＤＳＲｅｓ、、２：９９／１９８６）。

ヒトの紅斑性狼櫂の動物モデルとして使用される疾患である特発性疾患に罹患し た特定のマウス系（ＮＺＢ）において、インターフェロンα又はβを投与すると 疾患の進行が悪化することが報告されている（Ｈ，Ｈｅｒｅｍａｎｓら、ｒｎｆ ｅｃｔ、ｉｍｍｕｎ、、２１：９２５／１９７８；　Ｃ，Ａｄａｍら、Ｃ１１ｎ 、Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、４０：３７３／１９８０）。

幼マウスに大量のインターフェロンを投与すると、成長抑制症候群、肝臓壊死及 び致死を誘発する（１．Ｇｒｅｓｓｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５８ニア６／１９ ７５）。

同様に新生児期のマウスがある種のウィルス（例えばＰｉｃｈｉｎｄｅリンパ球 性脈絡髄膜炎ウィルス又はレオウィルス）に感染すると、同一の致死性症候群を 引き起こす大量の内因性インターフェロンの産生を伴う、抗インターフェロンα 又はβ抗体を投与すると、誕生時に上記症候群ウィルスに感染した幼マウスを保 護することができる（Ｙ、　Ｒｉｖｉａｒｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７４　二　２１３５／１９７７；　Ｙ、Ｒｉｖｉａｒｅら 、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１５２：６３３／１９８０；　Ｔ、Ｃ１ａｒｋら、Ｊ 、Ｖｉｒｏｌ。

５９ニア２８／１９８６）、この実験は、この疾患の病因論においてインターフ ェロンの有害な役割の説得力のある論証である。

また、ＮＫ細胞の活性化及び組織適合抗原の発現の変調はいずれもインターフェ ロンα又はβにより調節され、骨髄移植片拒否反応に重要な役割を果たす（Ｃ， ０ｈｉｅｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４６：６６６／１９８９）。

実際に、インターフェロンα又はβの産生は親骨髄の移植片に対するハイブリッ ドマウスＦ１の耐性に必須の要素の１３４　：　３７３９／１９８５）、従って 、Ｆ１マウス又は同種マウスをマウス抗インターフェロンα又はβ血清で処置す ると、親又は同種骨髄の移植及び増殖が可能である（Ａｆｉｆｉら、１９８５） 。

インターフェロン及びそのサブタイプの生物学的作用が細胞表面に対して高親和 性の特異的受容体との反応により生じることも知られている（Ｍ、Ａｇｕｅｔ及 びに、Ｅ。

Ｍｏｇｅｎｓｅｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｌｏｎｄｏｎ、　１９８３）。

自己免疫疾患及び自己免疫疾患の血族を有する疑いのある他の疾患（例えば斑状 硬化症）に対する有効な治療法は現状では存在しない、自己免疫型の疾患の現在 の処置は不十分であり、毒性作用がある。「抗拒否」療法で使用される処置はこ れらの病状が現れるのを阻止するが、その原因を阻止することはできず、非常に 高い毒性を有する。従って、自己免疫疾患及び器官拒否反応に対して治療効果と 低毒性とを有する医薬を提供できるならば非常に望ましい。

従って、自己免疫型疾患を治療し、移植片拒否反応を阻止するために治療薬とし て有益であり得るアンタゴニストを注射することによりインターフェロン（α又 はβ）の作用を阻止することができるならば非常に望ましい、しかしながら、外 来免疫グロブリンの注射によるこのようなアプローチはその効力を実証されてい るが、人体での治療には非実用的である。

従って本発明は、インターフェロンα又はβの作用を阻止するためのアンタゴニ ストとしてインターフェロンαの特異的受容体の可溶性形態の使用に基づく新規 アプローチに係る。遺伝子工学技術により製造された天然受容体のこれらの変異 体は、循環又は局在する内因性インターフェロンαを固定する能力を維持し、細 胞表面に固定する部分を欠失している。これらの変異体は自由に循環し、その特 異性によりインターフェロンα又はβのみと結合する。

インターフェロンα又はβの固定により、前記変異体は抗体と同様に生物中でイ ンターフェロンα又はβの作用を阻止することが可能である。

従って、インターフェロンα及び／又はβの活性を阻止することが可能な生成物 を提供することが望ましい。

従って本発明は、インターフェロンα及びβに対して高親和性を有することを特 徴とする水溶性ポリペプチドに係る。

「高親和性」なる用語は、解離定数が１０１Ｍ以下であることを意味する。

「水溶性」なる用語は、該ポリペプチドが人体のような生物中で循環し、その後 、細胞に固定できることを意味する。

本明細書中及び以下の文中で「ハイブリッド」なる用語は、本発明の水溶性ポリ ペプチド（天然受容体の「可溶性ｊ部分、修飾された完全受容体又は例えば置換 により修飾された天然受容体の「可溶性」部分）と、特にポリペプチド種の他の 分子（例えばイムノグロブリン又はイムノグロブリンフラグメント）との融合（ 又は結合）産物を意味する。

「インターフェロンα及びβ（又はインターフェロン）の可溶性受容体」なる用 語は、上記のような水溶性ポリペプチドの１種を意味する。

以下の文中では記載を簡単にするために、「インターフェロンα及びβの受容体 」と言わずに一般に「インターフェロンの受容体」と記載する。

上記のようなポリペプチドのうちで、本発明は特に図１に示す式に対応すること を特徴とする水溶性ポリペプチドに係る。

このポリペプチドはインターフェロンα又はβの天然受容体の細胞外可溶性部分 に対応する。

当然のことながら、上記ポリペプチド以外のポリペプチドでもインターフェロン に対して高親和性を維持するものがある。従って、図１に示すポリペプチドは特 に、同様に本発明の目的の一部を形成する置換又は欠失変異体により置き換える ことができる。

欠失に関しては、インターフェロンα及びβに対する親和性を不利に修飾しない ように、図１に対応するポリペプチドの１又は複数のアミノ酸を欠如させること ができる。

欠失は、例えば細胞膜に固定する能力を失わせ、循環できるように、完全及び天 然受容体を特に可溶性部分のレベルで操作してもよい。

図２に示すインターフェロンの天然且つ完全な受容体の配列から出発する場合に は、例えばその配列のトランスメンブラン及び細胞質ドメインを削除することが できる。

可溶性（循環）形態を得るためには、例えばトランスメンブラン領域に対応する 残基４３７〜４５７及び残基４５８〜５５７（細胞質領域）を欠失させる。

インターフェロンα及びβの完全受容体をコードするアミノ酸及びヌクレオチド の完全配列を図２に示す。

トランスメンブラン及び細胞質（又はｍ胞及び細胞内）ドメインに欠失を導入す る場合には、潜在的に免疫性のエピトープを避けることができる。トランスメン ブラン領域を欠如したインターフェロンα及びβの天然受容体の利点は、組換宿 主細胞の培養培地の上清中に分泌できるという点にある。

従って本発明は、図１又は図２の式に対応するポリペプチドの欠失に由来するこ とを特徴とする水溶性ポリペプチドに係る。

置換変異体も本発明の目的の一部を形成する。

この場合、インターフェロンの受容体の配列中の１又は複数のアミノ酸を除去し 、別のアミノ酸で置換することができ、合計アミノ酸数は維持される。

置換は好ましくはインターフェロンの受容体の可溶性部分に関する。受容体の可 溶性部分の免疫学的機能及び同一性を変化させるには、置換部位の近傍にポリペ プチドの三次元構造を維持し、分子もしくは側鎖の大部分の結合又は疎水性を維 持する特性において最も詔著に非保存性の置換及びポリペプチドに元々存在する ものと異なるアミノ酸残基又は配列を選択する。

受容体の特性を最も修飾する置換は特に、例えばセリル又はトレオニルのような アミノ酸残基を、例えばロイシル、インロイシル、フェニルアラニル、アラニル 又はバリルのような疎水性残基により置換するか、システイニルを任意の残基に より置換するか、リシル、アルギニル又はヒスチジニルのような電気的に陽性の 側頭を有する残基を、例えばグルタミル又はアスパルチルのような電気的に陰性 の残基により置換するか、大きい側鎖を有する残基（例えばフェニルアラニル） を、このような側鎖を欠失する残基により置換することにより得られる。

置換変異体は、インターフェロンの完全受容体の構造にも係り、特にトランスメ ンブラン領域に係る。実際にこのレベルでの置換は、細胞又は脂質膜に対する前 記ポリペプチドの親和性を低下させることにより、インターフェロンα及びβの 受容体の可溶性形態をもたらす。

トランスメンブランドメインは例えば異なるアミノ酸配列、例えばホモポリヌク レオチドＤＮＡ配列、又は５〜５０個の同一アミノ酸（例えばセリン、リシン、 アルギニン、グルタミン及びアスパラギン酸）もしくは組換宿主細胞の培養培地 に可溶性受容体を分泌することが可能な他の親水性アミノ酸を含む任意の配列に より置換され得る。

従って本発明は、図１又は図２の式に対応するポリペプチドの置換に由来するこ とを特徴とする水溶性ポリペプチドにも係る。

上記データは、置換又は欠失及びこのような修飾の組み合わせも可能であること を示す。

一般に、こうして得られる変異体は機能的トランスメンブランドメインをもたず 、好ましくは細胞内（細胞質）部分をもたない。

上記水溶性ポリペプチドの他の変異体は、特にインターフェロンα及びβの受容 体の特徴を改善するように化学的に修飾することにより製造され得る。

このようなポリペプチドは、リシンのような遊離アミノ基又はシスティンのよう なスルフヒドリル基を含むアミノ酸上にグラフトされたポリエチレングリコール のような親水性ポリマーを包含し得る。

これらの修飾は特に、本発明のポリペプチドの血漿中半減期を増加し、溶解率を 増加し、該ポリペプチドの免疫原特徴を低下させることができる。

これらの修飾は、例えば米国特許第４１７９３３７号に記載されているようなそ れ自体周知の方法により実施され得る。

本発明は更に、ハイブリダイズ（又は結合すなわちハイブリッド形成）されてい ることを特徴とする上記ポリペプチドに係る。

結合はコンピテント免疫ポリペプチド、例えばハイブリッドポリペプチドが投与 される動物に免疫応答を生じることが可能なポリペプチド又はインターフェロン の可溶性受容体に対応しないポリペプチドの部分に対する全抗体に結合すること が可能なポリペプチドを包含し得る。

一般に、前記受容体に対応しないエピトープは、既存抗体、例えばβ−ガラクト シダーゼのような細菌のポリペプチドフラグメントにより認識される抗原を含む 。

免疫結合は、免疫原ポリペプチドをコードするＤＮＡにより形質転換された組換 細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ交差連結又は培養により実施され得る。

好適条件下で可溶性受容体に対応するエピトープ及び該受容体に外来性の少なく とも１個のエビトー１を含む直鎖状ポリペプチド鎖を得るように、ポリペプチド 結合により可溶性受容体又は可溶性受容体から誘導されるフラグメントに免疫原 物質を挿入又は結合する。これらのエピトープは、受容体又はそのフラグメント の適合可能なポリペプチド鎖の他の任意の場所に導入され得る。

このようなハイブリッドは、インターフェロンの受容体に対する抗体を生成する ために、薬理的に許容可能なキャリヤーを含む組成物を動物に投与する場合に特 に有用であり得る。これらの抗体は、診断薬として又はインターフェロンの天然 受容体もしくは可溶性受容体の精製用としてそれ自体有用である。

免疫原であり得る他の結合ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのＣ末端領域 に結合しておいた水溶性ポリペプチド以外に、ペンタヒスチジンのようなホモポ リマーを含むハイブリッドを含む、従って、不純な混合物からハイブリッドを吸 着して溶離させることが可能な支持体に固定された亜鉛イオンのようなキレート 化剤を使用することにより、ハイブリッドを容易に単離することができる。その 後、可溶性受容体を例えば酵素切断により回収することができる。

可溶性受容体の分泌を改善するために他のハイブリッドを製造できる。この場合 は、異種シグナルポリペプチドを可溶性受容体のポリペプチドに置換し、合成ハ イブリッドは宿主細胞により認識されると、宿主細胞により使用され、受容体が 分泌される。

シグナルポリペプチドの分泌は、使用される宿主細胞の特徴に基づいて実施され 得、細菌、酵母、劃り植物、哺乳動物又はウィルスの配列を含み得る。

好適条件下で上記ポリペプチドは、特に人体における分解を遅らせ得る構造を有 するポリペプチドに結合される。

特に受容体自体の可溶性部分よりも長い血漿中半減期を有する血漿タンパク質（ 一般にこれらの血漿タンパク質では２０時間以上）を本発明の可溶性ポリペプチ ドとハイブリダイズすると、可溶性ポリペプチドの作用時間を延長することがで きる。

このような血漿タンパク質は例えば、血清アルブミン、アポリポタンパク質、ト ランスフェリン及び好ましくは特にＧ型、特にＧｌ型イムノグロブリンを含む。

好ましくは、このようなハイブリッドはこれらのハイブリッドが使用される動物 又は人体において非免疫原性であり、前記血漿タンパク質は固有の通常生物学的 活性により患者に有害に副作用を生じない。

好適使用条件下では、本発明の水溶性ポリペプチドはイムノグロブリン、特にそ の不変部のレベルに結合する。好適イムノグロブリンはＧ型、特にＧ１型である 。

イムノグロブリン及びその変異体のいくつかは知られており、多くは組換細胞の 培養により製造されている（Ｋｉ１５ｈｌｅｒら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、７７、　 ２１９７（１９８０；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、２．　２３９（１９８４））。

インターフェロンα及びβの天然受容体の細胞外部分の活性を有する本発明のポ リペプチドは、そのＣ末端を介してＬｊｌｉ又はＨ鎖の不変部のＮ末端に結合さ れ得る。

従って、可変部を置換することができ、ＨＭの不変部の少なくともＣＨ２及びＣ Ｈ３ヒンジ部は機能的に活性な形態で維持される。

このため、適切なりＮＡ配列を構築し、組換培養細胞中でこの配列を発現させる ことができる。

特にインターフェロンα及びβの可溶性受容体よりも長い血漿中半減期を有する イムノグロブリン及び他のポリペプチドは、同一方法に従って該受容体及びその 変異体に結合され得る。

インターフェロンの受容体の細胞外部分は最初のメチオニンから最大４２７〜４ ３６個のアミノ酸を含む（図１）。

一般に、固定領域を含む細胞領域を含む配列はイムノグロブリンの配列に結合さ れる。

厳密な結合部位は重要ではない、上記限度は指標に過ぎず、インターフェロンα 及びβの可溶性受容体の分泌又は固定特徴を最適にするようにインターフェロン の可溶性受容体の他の隣接部位を選択してもよい、最適部位は従来の実験により 決定することができる。

一般に、ハイブリッドが細胞中で発現されることは知られているが、組換宿主細 胞の分泌度には多少の相違がある。

以下の表は、得られたイムノグロブリン−インターフェロンの受容体の種々の融 合を示す。

（ａ）ＲＣＩ （ｂ）（Ｒｃｌ）２ （ｃ）（ＲＣｈ）２ （ｄ）（ＲＣｌ　）２　（ＲＣｈ）２ なお、Ｒは固定部位を含むインターフェロンα及びβの可溶性受容体の細胞外ド メインの一部を表し、Ｃｔ及びｃｈはヒトイムノグロブリンのＬ鎖及びＨｇの夫 々の不変ドメインを表す、上記構造は単に主要構造を表すものであり、例えばイ ムノグロブリンの接合領域（Ｊ）又は他のドメインやジスルフィド架橋は示さな い、このようなドメインが結合活性に必要な場合は、これらのドメインはインタ ーフェロンα及びβの可溶性受容体、インターフェロンα及びβの免疫受容体又 はイムノグロブリン中で天然に占有するような位置に存在しなければならない。

これらの例は、イムノグロブリンｖｈｃｈが所定の抗原に結合し得る異なるリガ ンド−受容体部位を含む二官能性異種抗体の代表例である。他の類のイムノグロ ブリン（例えばＩｇＭ、ＩｇＧ２，３，４．ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、好ましく はＩｇＧ１）のＨＭを使用することにより、より複雑な構造が得られる。

好適ハイブリッドは、インターフェロンα及びβのリガンドの結合部位を含むイ ンターフェロンα及びβの可溶性受容体のＮ末端と、イムノグロブリンＧ１のエ フェクター機能を含む抗体のＣ末端部分Ｆｃとの融合により得られる。

このような例は追って実験部分で説明する。

このようなハイブリッドは典型的には、Ｃ末端を介してＫｌ又はＧ１鎖の不変部 に結合したインターフェロンα及びβの可溶性部分の最初から４３６個のアミノ 酸又は最初から４２７個のアミノ酸を含む０図１に示すインターフェロンα及び βの可溶性受容体をコードするＤＮＡは、ＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　 Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ：　Ｒ，に、５ａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　２ ３９．４８７−４９１　（１９８８）参照）と実施例に説明するような適切な制 限酵素による消化とを組み合わせて使用することにより合成される０図２に示す 配列に基づくことにより、ＩＦＮ（ａ／ｂ）受容体のｃＤＮＡの５′末端及び所 定の下流部位のｃＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを使用した。

ＰＣＲ反応の鋳型としては、完全ｃＤＮＡを含むプラスミド（Ｕｚｅら）又はλ バクテリオファージを使用した。

市販のｃＤＮＡバンクを使用することもできる。更に、全ＲＮＡ又は周知方法に 従って製造されたポリＡ＋ＲＮＡから直接ｃＤＮＡフラグメントを合成すること もできる（０゜０ｈａｒａら、ＰＮＡＳ　８６．　５６７３−７７（１９８９） 、Ｊ、Ｄｅｌｏｒｔら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄＲｅｓ、　１７．　６４３９−６４ ４８（１９８９））。

ｃＤＮＡバンク又はＲＮＡは、Ｄａｕｄｉ、Ｎａｍａｌｗａのようなヒト細胞又 はほぼ同一結果を有するヒト牌臓のような器官から得られる。

インターフェロンの受容体はユニークポリペプチドであるように思われる。しか しながら、その配列は多少の対立遺伝子相違を示す。

ＤＮＡフラグメントは、イムノグロブリンのＬＭ又はＨめに人体で融合を行う場 合、このイムノグロブリンは好ましくはヒトイムノグロブリンである。

イムノグロブリンをコードするＤＮＡは市販されているし、合成することもでき る〈例えばＡｄａｍｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９．　２７１１−２７ １９　（１９８０）；　Ｇｏｕｇｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９、　２７ ０２−２７１０　（１９８０）；　Ｄｏｔｂｙら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７７、　 ６０２７−６０３１（１９８０）；　Ｒｉｃｅら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７９、　 ７８６２−７８６５　＜１９８２）；　Ｆａｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　２９ ８．　２８６−２６６（１９８２）及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、２．　２３９−２５６（１９８４）参照）。

好ましくは、ハイブリッドをコードするＤＮＡをその発現のために宿主細胞にト ランスフェクトする。

宿主がトランスフェクション前に既にイムノグロブリンのＨＩＥを産生じている 場合には、二官能性異種抗体を産生ずるようにインターフェロンα及びβの可溶 性受容体−り鎖ハイブリッドをトランスフェクトすれば十分である。同様に、宿 主ａｍが既にＬＭを既に発現している場合には、インターフェロンα及びβの可 溶性受容体−Ｈ鎖ハイブリッドをコードするＤＮＡをトランスフェクトし、二官 能性抗体を産生させる。インターフェロンα及びβの固定部位を含む１又は複数 の鎖と可変部を含む１又は複数の鎖とを含む二官能性イムノグロブリンは、イン ターフェロンα及びβと所定の抗原とに対する二重の特異性を有する。該イムノ グロブリンは上記方法又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ方法により製造される。後者の場合 、例えばハイブリッドのＦ　（ａｂ）２フラグメントはそれ自体公知の方法に従 って製造される（例えば米国特許第４４４４８７８号参照）。

二官能性抗体を製造するための別の方法は、Ｂ細胞又は所望の抗原に対する特異 性を有する抗体を分泌するハイブリドーマを、イムノグロブリンインターフェロ ンα及びβの可溶性受容体のハイブリッドを産生ずる細胞、例えばミエローマと 融合させる。二官能性抗体はこのようなハイブリドーマの培養上清から回収され 得る。

本発明は更に、上記水溶性ポリペプチド又は特にポリペプチドとのそのハイブリ ッドをコードすることを特徴とするＤＮＡ配列にも係る。

哺乳動物のインターフェロンα及びβに対して高親和性を有するポリペプチドの 例は例えば、霊長類のインターフェロンα及びβの可溶性受容体、ヒト、マウス 、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ及びブタのインターフェロンα及びβの可溶性受容体 である。これらのポリペプチドをコードするこれらのＤＮＡ配列は所定数の用途 を有する。より特定的には、これらの配列又は配列の部分又はその合成もしくは 半合成コピーを使用して、ヒト又は動物の他のｃＤＮＡ又はゲノムバンクをスク リーニングし、インターフェロンα及びβの可溶性受容体に類似する他のＤＮＡ 配列をハイブリダイゼーションにより選択することができる。このようなりＮＡ 、そのフラグメント又はその合成もしくは半合成コピーは、インターフェロンα 及びβの可溶性受容体の変異体を表し、突然変異により他の変異体を製造するた めの出発材料として使用され得る。このような突然変異は、突然変異したコドン によりコードされるアミノ酸の配列を変化させなくてもよいし、又は逆にアミノ 酸を変化させてもよい。

２種類の突然変異は本発明に従ってインターフェロンα及びβの可溶性受容体を 製造又は使用するために有利であり得る。これらの突然変異は例えば高レベル製 造、より簡単な精製又はより高い結合活性を実現することができる。

ＤＮＡ配列の例としては、図２の１〜１３４３のヌクレオチド配列を挙げること ができる。

インターフェロンα及びβの可溶性天然受容体の変異体をコードするＤＮＡは、 好ましくは着目宿主細胞に対して適合性の哺乳動物、微生物又はウィルスの転写 及び翻訳調節成分の制御下に転写単位で発現させることが可能な形態である。適 切な細胞の形質転換、トランスフェクション又は感染後、このようなベクターは 組換ポリペプチドを発現させることができる。インターフェロンα及びβの天然 可溶性受容体の変異体は、適切なプロモーターの側脚下で哺乳動物、酵母、細菌 細胞又は他の細胞中に発現され得る。

細菌、菌類、酵母又は哺乳動物細胞宿主と併用するためのクローニング及び発現 用ベクターは、Ｐｏｕｗｅ　ｌ　ｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：　Ａ 　１ａｂｏｒａｔ。

ｒｙ　ｍａｎｕｅｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８５）により 記載されており、関連部分を参考として本文中に引用する８発現用ベクターは必 ずしもそうでなくてもよいが、複製部位と、形質転換細胞中で選択できるような １又は複数の選択マーカー配列とを備え得る。

上記ポリペプチドをコードするＤＮＡに導入される変異は読み取り枠を変化させ てはならず、発現に有害な二次構造を形成し得る相補配列を生成してはならない 。

受容体の特徴を変えるため、例えば上記のように特徴を改善させるために変異体 を選択することも可能であるが、インターフェロンの天然可溶性受容体の変異ポ リペプチドは天然受容体とほぼ同一の結合活性を有する。

突然変異部位は決定されているが、突然変異自体は決定されていない０例えば、 所与の部位の突然変異の性能を最適化するためには、コドン又は標的領域をラン ダムに突然変異させ、得られた変異ポリペプチドをスクリーニングし、二次活性 の最適な組み合わせを見いだす、ＤＮＡ中の所与の部位に置換突然変異を導入す るための技術は公知であり、例えばＭ１３系を使用する。ヒト受容体をコードす るＤＮＡは任意の公知方法により得られ、その配列は図２に示す。

一般に、上記ポリペプチドの配列をクローニングするためには原核生物が使用さ れ、例えば大腸菌２９４　（ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６＞が特に有利である。他 の株、特に大腸菌Ｘ　１７７６（ＡＴＣＣＮｏ、３１５３７）を使用してもよい 。

本発明のポリペプチドは、適切なプロモーターの制御下に細菌、酵母、哺乳動物 細胞又は他の型の細胞中に発現され得、例えば大腸菌のような原核生物系を使用 を使用して本発明の組換タンパク質を発現させることができる。大腸菌は典型的 には大腸菌株から誘導されたプラスミドであるｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７，０ １７）の誘導体を使用することにより形質転換される（Ｂｏ　ｌ　１ｖａｒら、 Ｇｅｎｅ　２．　９５（１９７７））、ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラ サイクリン耐性の遺伝子を含み、従って、形質転換された細胞を同定するための 簡単な手段を提供する。プラスミドｐ　ＢＨ３２２又は他の細菌プラスミドは更 に、組換ＤＮＡ構築に一般に使用される発現制御配列を含まなければならないか 、又はこのような配列を含むように修飾されなければならない。

このような制御配列は例えば、ＡＴＣＣＮｏ、３７１２１として入手可能なラク トース（ｌａｃ＞プロモーター（Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、　１． 　１３９−１４７　（１９８１））、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｃｈａｎ ｇら、Ｎａｔｕｒｅ　２７５．　６１５（１９７８）＞−）リプドアｙンプロモ ーター（Ｍｉｏｚｚａｒｉ　Ｊ、Ｂａｃｔ、　１３３．　１４５７−１４６６（ １９７８））及びＡＴＣＣＮｏ、３７１３８として入手可能なｔａｃプロモータ ーのようなハイブリッドプロモーター（Ｈ，ｄｅ　Ｂｏｅｒら、ＰＮＡＳ　ＵＳ Ａ　８０゜２１−２５　（１９８３））を含む、他の代表的且つ非限定的な例は 、例えばｔｒｃプロモーターを含むｐＫＫ２２３−３又はλファージのプロモー ターと熱不安定性リプレッサーｃ１８５７を含むｐＰＬ−λのような市販のベク ター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、 スウェーデン）である。

他の機能性プロモーターも使用できる。ＤＮＡ配列は一般に知られており、従っ て、適切な結合剤又はアダプターを使用することによりインターフェロンα及び βの可溶性受容体の変異体をコードするＤＮＡに結合させることができる。細菌 系のプロモーターは更に、下流の抗原をコードするＤＮＡに作動的に結合した所 謂シャインーダルガルノ（ＳＤ）の配列を含む。

本発明は更に、精製されたインターフェロンα及びβの可溶性受容体の変異体を 有効量製造するための発現ベクターに係る。

適切な宿主株を形質転換させ、該宿主株を適切な培養密度まで培養後、選択され たプロモーターを適切な手段（例えば温度上昇又は化学的誘発）により抑制解除 し、微生物を再培養する。微生物を典型的には遠心分離により収集し、物理的又 は化学的手段により溶解させ、抽出物を回収して更に精製する。

例えば増殖、最大曝気及び激しい撹拌の条件を使用することにより１０リットル 容発酵器で微生物を発酵させる。

好ましくは消泡剤を使用する。培養物は、Ｍｏｔｔら。

ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８２．　８８（１９８５）により記載されているように再誘 発培地中で３０℃で発酵し、温度を４２℃に上昇させることにより５〜６の吸光 度Ａ６００に対応する培養密度で抑制解除し、温度変化から２〜２０時間後、好 ましくは３〜６時間後から収集する。微生物塊をまず最初に濾過又は他の手段に より濃縮し、次に１００００Ｇで４℃で１０分間遠心分離し、その後、沈渣を迅 速に凍結する。沈渣の抽出後、１又は複数の濃縮、脱塩又はイオン交換もしくは 排除クロマトグラフィ一段階を実施することにより、細菌培養で産生された組換 タンパク質を単離する。

インターフェロンα及びβの可溶性受容体の変異体の発現に使用される微生物は 、音波処理、機械的破壊又は化学物質の使用による凍結−解凍サイクルを含む適 切な任意の方法により溶解され得る。インターフェロンα及びβの可溶性受容体 は、凝集物を形成する傾向が多少あるので、Ｔｗｅｅｎ８０又はＴｒｉｔｏｎ　 Ｘ１００のような界面活性剤の存在下で抽出及び精製を実施することによりこの 傾向を減少させる。

メチオニンから開始しないＤＮＡ配列を有する本発明の水溶性ポリペプチドでは 、開始シグナルは生成物のＮ末端残基を表す上流の付加的メチオニンアミノ酸に 由来する。

付加的Ｎ末端メチオニンを有するこのような生成物を、本発明の組成物及び方法 で直接使用してもよいが、一般にはこのメチオニンは予め除去したほうが望まし い、このようなＮ末端メチオニンをｉｎ　ｖｉｖｏ又はｅｘ　ｖｉｔｒＯで除去 するための従来方法はこの分野で公知である。

好ましくは市販のＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ種を使用することにより、酵母系を使用して本発明のポリペプチドを発現させ ることもできる。

一般に、有用な酵母ベクターは複製起点と、酵母及び大腸菌の形質転換を可能に する選択マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子及びトリプトファン 中で発酵できない酵母の突然変異株（ＡＴＣＣＮｏ、４４０７６として入手可能 ）の選択マーカーを提供するＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｔｒｐｌ遺伝子と、上 流遺伝子の転写を誘導するために酵母中で過剰発現された遺伝子から得られるプ ロモーターとを含む、酵母宿主に適切なプロモーターの配列は、３−ホスホグリ セリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロ モーター（例えばＰＨ０５＞、α型接合因子のプロモーターを含む。誘発され得 る酵母の他のプロモーターは、アルコール−２−デヒドロゲナーゼのようなプロ モーター領域である（Ｒｕｓｓｅ　１１ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８， ２６７４、１９８２）。シグナルペプチド、例えば酵母の異種タンパク質の分泌 を可能にするα因子のシグナルペプチドを、プロモーターと上流で発現させるべ き構造遺伝子との間に挿入する（Ｂｉｔｔｅｒら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ。

８２、　５３３０．　１９８４）、酵母の形質転換方法は当業者に公知であり、 代表的な方法はＨｉｎｎｅｎら。

ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、７５．　１９２９（１９７８）に記載されており、この方法 によると、０．６７％含窒素酵母ベース、０゜５％カザミノ酸、２％グルコース 、１０μｇ／　ｍ　＋ウラシルを含有する選択培地でｔｒｐ十形質転換細胞を選 択する。プロモーターＰＨ０５を有するベクターを含む形質転換宿主株をまず栄 養培地で予備培養し、その後、培地中の無機リン酸濃度を減少させることにより 抑制解除する０株は、従来方法を使用することにより培養される。

組換ポリペプチドは、グルコシダーゼで酵素消化後に界面活性剤で処理するか、 又は例えばフレンチプレスなどで機械的力を加えた後、１もしくは複数の濃縮、 脱塩、イオン交換もしくは排除クロマトグラフィ一段階を実施することにより溶 解され得る細胞残渣の抽出により得られる。ポリペプチドがペリプラズムに分泌 される場合には、膜の外層を損傷させて組換ポリペプチドを遊離させる化学的物 質（例えばＥＤＴＡ）で処理後に回収される。ポリペプチドが培養培地中に分泌 される場合には、直接回収することができる。

適切なプロモーターの制御下で本発明のポリペプチドを発現させるために哺乳動 物細胞も使用できる０本発明で構築されたＤＮＡから誘導されるＲＮＡを使用し て哺乳動物のインターフェロンα及びβの可溶性受容体を産生させるために無細 胞系を使用することもできる。

哺乳動物の宿主細胞における発現を調節するプロモーターは種々のソースから得 られ、例えばウィルスゲノム（例えばポリオーマ、シミアンウィルスＳＶ４０、 アデノウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎のサイトメガロウィルス）、哺乳動 物プロモーター（例えばヒトβグロブリンの遺伝子のＤＮＡ５　ｅ　Ｉに対して 感受性の部位を含むプロモーター）又は昆虫ウィルスプロモーター（例えばバキ ュロウィルス系の多面体のプロモーター）から得られる。動物細胞中で発現させ るためには、２−アデノウィルスの後期主要プロモーターから誘導される制御領 域を使用すると好適である。

ＳＶ４０の初期及び後期領域はウィルスの複製起点を含む制限フラグメントとし てＳＶ４０ウィルスから好都合にも単離されている（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒ ｅ　２７３、　１１３．　１９７８）。

ヒトサイトメガロウィルスの初期領域は、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩＥ制限フラグメント として単離されている（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ　Ｐ、Ｊ、ら、Ｇｅｎｅ　１８．　 ３５５６３６０、　１９８２）。２−アデノウィルスの後期プロモーターは、８ 〜１７のマツプ単位を含むＨｉｎｄ　ＩＩＩ制限フラグメントとして単離されて いる（Ｓ、Ｈｕ　＆Ｊ、Ｌ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ ｃｉｅｎｃｅｓ　（ＵＳＡ）　７８．　８２０−８２４、　１９８１）。親種の 細胞起源の真核プロモーターも有用である。

真核生物の発現ベクターにおいて、転写はプロモーター以外にアクチベータを含 む配列を挿入することにより増加する。アクチベータはシス位で作用し且つ約１ ０〜３００ｂｐを含むＤＮＡエレメントであり、プロモーターの転写開始能力を 増加する。これらのアクチベータの多くは哺乳動物遺伝子で公知である（グロビ ン、エラスターゼ、アルブミン、インシュリン等）。しかしながら、一般には真 核細胞に感染するウイルスアクチベータを使用する。例えば、複製起点の後期側 のＳＶ４０のアクチベータ（ｂｐｌｏ。

〜２７０）　、サイトメガロウィルスの前初期プロモーターのアクチベータ、複 製起点の後期側のポリオーマのアクチベータ及びアデノウィルスのアクチベータ を挙げることができる。真核細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト）で使 用される発現用ベクターは更に、スプライシングとｍＲＮＡの発現に影響し得る 因子の転写の終結とに必要な配列を含み得る０発現用ベクターは選択遺伝子を含 む。

哺乳動物細胞の選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）　 、チミジンキナーゼ又はネオマイシンである。このような選択マーカーを宿主哺 乳動物細胞にトランスフェクトすると、形質転換された細胞は選択圧下にある限 り生存し続けることができる。一般に、２種の選択方法が使用される。まず一方 では、例えばＣＨＯＤＨＦＲ細胞又はマウスＬＴＫ細胞のように所定の成分を補 充した培地に依存して増殖する突然変異系を使用する。これらの細胞はチミジン 又はヒボキサンチンを加えないと発酵することができず、これらの細胞はＤＨＦ Ｒ又はＴＫの機能遺伝子がトランスフェクションにより導入されるならば生存す る。従って、ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子により形質転換されない細胞は非補充培地 中で発酵しない。

他方では突然変異細胞を必要としない優性選択を利用し、例えばトランスフェク ト細胞を毒性物質に対して耐性にするような遺伝子をトランスフェクト及び発現 させる（Ｓ。

ｕｔｈｅｒｎ　＆　Ｂｅｒ、ｇ、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、１． 　３２７（１９８２）；　Ｍｕｌｌｉｇａｎ　＆　Ｂｅｒｇ　５ｃｉｅｎｃｅ、 ２０９゜１４２２（１９８０）；　Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ ｌ、５，４１０−４１３（１９８５）参照）。

細胞の染色体の所定の領域の増加又は複製は増幅と呼称され、例えばＤＨＦＲを 不活化するメトトレキサート（ＭＴＸ）のような選択物質を使用することにより 誘導され得る。ＤＨＦＲ遺伝子のコピーの増幅又は増加は、より大量のＭＴＸの 存在下におけるＤＨＰＲの大量産生の結果として生じる。増幅度は培養培地中の ＭＴＸ濃度と共に増加する。所望の遺伝子の増幅は、染色体に同時に取り込まれ る所望の遺伝子とＤＨＦＲの遺伝子との同時トランスフェクションにより得られ る。所望の遺伝子及びＤＨＦＲ遺伝子の同時増幅後、所望のタンパク質をコード する遺伝子は所望のタンパク質を更に発現する。

本発明のインターフェロンの可溶性受容体の変異体の発現に好適な宿主細胞は、 サルの胸Ｊｉ細胞を含む哺乳動物細胞である（ＣＯ３−７，ＡＴＣＣＣＲＬ　１ ６５１及びチャイニーズハムスターＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞、Ｕｒｌａｕｂ　＆　 Ｃｈａｓｉｎ、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、７７、　４２１６．　１９８０）。

哺乳動物細胞の形質転換方法は公知であり、好適方法はリン酸カルシウムでＤＮ Ａを沈殿させるＧｒａｈａｍ　Ｆ。

＆　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２゜４５６−４５７．　１９ ７３）により記載されている方法である。別の方法は、Ｇ、Ｃｈｕら、Ｎｕｃｌ 、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１５．　１３１１−１３２６．　１９８７により記載され ているようなエレクトロポレーションである。

例えば核への注入やプロトプラストとの融合のような他のトランスフェクション 方法も使用できる。

所望の制御配列及びコーディング配列を含む発現ベクターの構築は、公知方法を 使用することにより実施される（例えばＭａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、ら、Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　１３３−１３４　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　１９８２；　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ。

ｇｙ、　Ａｕ５ｕｂｅｌら編、１９８７．　ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ 　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　＆　Ｗｉ　１ｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊参照 ）１プラスミド又は単離されたＤＮＡフラグメントを切断し、所望の形態にスプ ライシングする。

プラスミドの正確な配列は大腸菌ＨＢＩＯＩ又は大腸菌に１２　２９４（ＡＴＣ Ｃ３１４４６）中で連結混合物で形質転換後に決定される。アンピシリン耐性形 質転換細胞が選択される。プラスミドは形質転換細胞から単離され、制限酵素又 は公知方法による配列決定により解析される（Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌ、Ａ ｃ１ｄ　Ｒｅｓ、９゜３０９　（１９８２）又はＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５．　４９９（１９８０）参照）。

一般に、宿主細胞は発現ベクターにより形質転換された後、プロモーターの発現 を誘導し、形質転換細胞を選択するか又は遺伝子を増幅するための物質を含む適 切な培地で培養される。温度、ＰＨ等のような培養条件は、発現のために選択さ れた培地で使用される条件であり、当業者の知識の範囲内である。

本発明のポリペプチドは、組換宿主細胞の上清から単離及び精製される。典型的 には、上清を限外ｒ過により濃縮し、イオン交換クロマトグラフィー又はイムノ アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、所望のポリペプチドを吸着し て溶離させる。抗原は凝集物を形成する傾向が大きい、従って、Ｔｗｅｅｎ　８ ０．　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘｌ００又はＣＨＡＰＳのような界面活性剤を精製中に加 えると有利である。界面活性剤を含有するか又は含有しないアルブミンのような タンパク質により最終産物を安定化させる。

もっとも、発現制御ベクター又は配列及び全宿主細胞が全発現系に等しく機能す る訳でないことは自明である。しかしながら、当業者は本発明の範囲内でこれら のベクター、発現制御配列及び宿主細胞から選択できよう１例えば、選択される ベクターとの適合性、本発明のＤＮＡ配列によりコードされる生成物の毒性、分 泌特徴、タンパク質の正確な折り畳み特徴、発酵の必要及び本発明のＤＮＡ配列 による発現後の組換産物の精製し易さを考慮するならば、単細胞宿主を選択すべ きである。

これらのパラメータから、当業者は例えばＣＨＯ又はＣ０９−７細胞のような動 物細胞の大規模発酵又は培養により本発明のＤＮＡ配列を発現するベクター系／ 発現制御系／宿主細胞の種々の組み合わせを選択することができる。

本発明のＤＮＡ配列の発現後に産生されるポリペプチドは、動物細胞の発酵又は 培養から単離され得、適切な方法の組み合わせにより精製され得る。当業者は本 発明の範囲から離れることなく最適な単離及び精製方法を選択することができよ う。

従って、本発明は上記ポリペプチドを発現することを特徴とする細胞、及び適切 な栄養培地中で該ポリペプチドを発現することが可能な細胞を培養することを特 徴とする該ポリペプチドの製造方法にも係る。

本発明のポリペプチドは特に免疫変調剤、より特定的には免疫抑制剤として有用 であり、自己免疫疾患及び移植片拒否反応の治療に使用される。

従って本発明は、上記のような水溶性ポリペプチドにより構成されることを特徴 とする医薬にも係る。

本発明は更に、上記のような医薬を有効成分として含有することを特徴とする医 薬組成物にも係る。

精製ポリペプチドは薬理的に許容可能な適切な形態に調合され得る。本発明の成 分は、免疫治療薬として有効な量の本発明のポリペプチドと、薬理的に許容可能 なキャリヤーとを含有する０本発明の成分は、固体、半固体及び液体等の種々の 形態であり得、タブレット、ビル、粉末、注射溶液又は潅流溶液として調製され 得る。好適形態は投与方法及び治療用途に依存する。一般に本発明の医薬組成物 は、医薬上重要な他のポリペプチドに使用される方法及び組成物と同様の方法及 び組成物を使用することにより投与される。従って、ポリペプチドを凍結乾燥形 態で保存し、投与直前に滅菌水で復元し、通常経路、即ち皮下、静脈内、筋肉内 又は病巣内経路により非経口投与することができる。

有効投与量は約１〜５ｍｇ／ｋｇ体重／日であり得る。当然のことながら、これ 以下の投与量でもよいし、上限の２倍以上であっても毒性作用なしに注射できる 。

本発明の医薬は、例えば紅斑性狼癒、ベーチェット病、骨髄形成不全症、真性糖 尿病、斑状硬化症、リウマトイド関節炎もしくは重度の多発性免疫不全症のよう な疾患におけるようにインターフェロンα及びβの異常産生が病因である患者又 はＡＩＤＳ患者に投与され得る。更に、本発明の成分はＮＫ細胞の活性化又は組 織適合抗原の発現のような免疫活性を変調できるため、器官移植片拒否反応患者 の治療薬としても投与される。

本発明の組成物はその性質及び作用機序により、グルココルチコイドのような化 学的免疫抑制剤のように全身毒性がなく、従って臨床用として現在使用されてい る医薬、例えば細胞***及び免疫系の全成分のサイトカイン合成を抑制するアド レナルコルチコステロイドもしくはシクロスポリンのような免疫抑制物質又はそ の誘導体や、免疫系の活性化を選択的に抑制し、票著な改善を示すが、多数の非 免疫毒性作用を有する環状ウンデカペプチド（Ｎ、Ｅｎｇｌ。

Ｊ、Ｍｅｄ、、３２１：２５．　１７２５−１７３８゜１９８９参照）等の医薬 に比較して著しい改善を示す。

本発明の成分は更に、インターフェロンα及びβと異なるアゴニスト又はアンタ ゴニストをＭ２Ｒするためにも使用され得る。

精製形態の本発明の成分は、インターフェロンα及びβの可溶性受容体の固定部 位の三次構造、免疫抑制剤として治療上有用なアンタゴニスト又は抗ウィルス及 び抗腫瘍剤として有用なアゴニストの合成用モデルとして使用される構造を推定 するように分子設計するための予備条件を決定するのにも有効である。

従って本発明は、診断剤として及び抗インターフェロンα又はβ抗体の製造にお ける上記のようなポリペプチドの適用にも係る。

以下の実施例は、本発明を非限定的に説明する。

叉ＪＬ［ ンターフェロンα　の口　に− の　゛　ためのべ ２」シ＝！ロー第 欠）」仁ｌ之」２ ン　−フェロン　ｔ・めのブース≧ドの箔 ＰＣＲ反応を使用することにより、完全ｃＤＮＡを含み且つ天然インターフェロ ンα及びβの受容体をコードするＤＮＡフラグメントを合成した６図２に示すイ ンターフェロンα及びβの受容体のｃＤＮＡの完全長を含む＾ＺＡＰバクテリオ ファージを鋳型及び反応のためのプライマーの特異的オリゴヌクレオチドとして 使用した。特に、ｃＤＮＡの５°末端の逆方商値に相補的であり、配列：オリゴ Ｏ：　５’−ＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧ −３’を有するオリゴヌクレオチドと、ｃＤＮＡの３゛末端の順方向値に相補的 であり、配列： オリゴ１：　３’−Ｃ＾＾＾＾＾にＴＣＧＴＣＣＴＣ＾＾ＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧ （：ＣＣ−５゜を有するオリゴヌクレオチドとから構成される１対の合成オリゴ ヌクレオチドと共にバクテリオファージλＺＡＰをインキュベートした。

オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応の終了後に得られる二重ＨＤＮＡフラグメン トが５′末端にＰｓｔＩび３′末端にＫｐｎＩ制限酵素切断部位を含むように構 築した。

ＰＣＲ反応はＰＣＲ［衝液中で１００μｌの反応容量で行い、各々１ｍＭのプラ イマー、１１００ｐのλＺＡＰバクテリオファージ及び１単位のＴａｑポリメラ ーゼを含有するようにした０反応条件は、１サイクルが９５℃で１分間（変性） 、３７〜４０℃で３分間（ハイブリダイゼーション）、次いで７２℃で４分間（ 重合）のインキュベーションを含む２５サイクルとした。最後のサイクル後、反 応を７２℃で１０分間続け、サンプルを４℃で保存した０反応産物をクロロホル ムで抽出し、エタノール沈殿後、該産物をＫｐｎｌ及びＰｓｔｒで順次消化した 。低融点アガロースによる電気泳動後、１．７ｋｂフラグメント（フラグメント １）を回収し、発現ベクターｐｓＶＡｄｐＡ１に連結した。

ｐｓＶＡｄｐＡｌは次のように構築した。

配列ＳＶ４０はプラスミドｐＳＶ２ＤＨＦＲから得た（Ｓｕｂｒａｍｉら、Ｍｏ １ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ。

１、　８５４−８６４（１９８１））、該配列は複製起点、アクチベータ、初期 及び後期プロモーター（Ｐｖ［−Ｈｌｎｄｌｌ［フラグメント）、スプライシン グ部位（ドナー及びアクセプター）により囲まれたｔ抗原のイントロン、及び初 期領域（ＢｇｌＩ［ＥｃｏＲＩフラグメント）のポリアデニル化部位を含む。

２−アデノの後期主要プロモーターの領域はプラスミドｐＡｄＤ２６ＳｖｐＡか ら得た（ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ　Ｉ７ラグメント）（Ｋａｕｆｍａｎ　＆　Ｓｈｉ ｍｋｅ、Ｐ。

Ａ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１５９．　６０１−６２１　（１９８２））、 該領域はプロモーター、３分節系リーダー（Ｚａｉｎら、Ｃｅｌ　１．　１６． 　８５１゜１９７９）並びに２−アデノのドナースプライシング部位及びイムノ グロブリンの可変部のアクセプタースプライシング部位から構成されるハイブリ ッドスズライジング部位を含む。

多重クローニング部位はプラスミドｐＵｃ１８に見いだされるものと同様である 。該部位はＰｓｔＩ、５ａｌｉ。

Ａｃｃｌ、Ｈｉｎｃｌｌ、Ｘｂａｌ、ＢａｍＨｉ。

Ｘｍａ■、Ｓｍａ）、Ｋｐｎｌ、５ａｃｊ、ＢａｎＩ［、ＥｃｏＲＩの切断部位 を含む。

プラスミドは大腸菌の複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含み、プラスミド ｐＭＬから誘導した（Ｌｕｓｋｙ＆　Ｂｏｔｃｈａｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２９３． 　７９−８１．　１９８１）。

ｐｓＶＡｄｌをＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで順次消化した後、ホスファターゼで処理 し、プラスミドの主要部分を含むフラグメント（フラグメント２）を低融点アガ ロースによる電気泳動により単離した。フラグメント２をフラグメント１に連結 し、固定混合物をコンピテント大腸菌ＨＢ１０１細胞にトランスフェクトした。

培養培地中にアンピシリンを含むベトリ皿に形質転換した培養物を注ぎ、アンピ シリン耐性コロニーを選択した。これらの形質転換細胞からプラスミドＤＮＡを 調製し、制限酵素により正確なインサートの存在を分析し、配列決定により５′ 及び３′末端のインサートの接合部を分析し、配列が正しいことを確認した。

プラスミドｐｓＶＡｄｌＦＲｐＡを使用して哺乳動物細胞中で天然細胞受容体を 発現させた。

るためのプラスミドの ＰＣＲ反応を使用することにより、種々のカルボキシル末端を有する受容体の種 々の欠失を含み且つ受容体の分泌形をコードするＤＮＡフラグメントを合成した 。具体的には、受容体の完全ｃＤＮＡを含むλＺＡＰバクテリオファージを、５ ゛末端の逆方向値に相補的であり且つ配列＝５′末端オリゴ：５°−ＣＣＧＧＣ ＴＧＣＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧ−３゜を有するオリゴヌ クレオチドと、ｃＤＮＡの種々の位置の順方商値に相補的であり且つ配列： ３′末端オリゴ１：　３’−にＣＴＣＣＴＴＴＡＴにＧＡＣＡＴＴＴＡＣＴＣＣ ＡＴにＧＣＣ−５’３゛末端オリゴ２：　３’−ＴＣＡＣＴＩＩ：Ｃ（：ＡＣＡ ＴＡＣＡＣＴＣＡＣＴＣＣＡＴＧにＣＣ−５゜３′末端オリゴ３：３″−ＧＴＣ ＡにＡＣＣＴＴＴにＴにＣＧに＾＾ＣＴＣＣＡＴＧＧＣＣ−５゜３′末端オリゴ ４：３′−ＧＴＣＡＣＡＣＡＣ＾＾＾ＧＣＡＧＴＴＴＡＣＴＣＣＡＴににＣＣ− ５゜３′末端オリゴ５：　３’−ＣＴＣＴにＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡにＡＴＡＣＴ ＣＣＡＴＧにＣＣ−５’を有するオリゴヌクレオチドの１種とを含む種々の固定 用合成オリゴヌクレオチド対と共にインキュベートした。

オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応の終了後に得られる二重ｇＤＮＡフラグメン トが５′末端Ｐｓｔｌ及び３′末端Ｋｐｎ■制限酵素の切断部位を含むように構 築した。

ＰＣＲ反応はＰＣＲ＊衝液中で１００μｌの反応容量で実施し、各々１μＭの１ ライマー、ｔｏｏｐｇのλＺＡＰバクテリオファージ及び１単位のＴａｑポリメ ラーゼを使用した０反応条件は、１サイクルが９５℃で１分間（変性）、３７〜 ４０℃で３分間（ハイブリダイゼーション）、次いで７２℃で４分間（重合）の インキュベーシミンを含む２５サイクルとした。最後のサイクル後、反応を７２ ℃で１０分間続け、サンプルを４℃で保存した０反応産物をクロロホルムで抽出 し、エタノール沈殿後、該産物をＫｐｎ■及びＰｓｔ　Ｉで順次消化させた。低 融点アガロース上で電気泳動後に所望のフラグメントを回収した０回収したフラ グメントの長さはほぼ、反応１（５′末端オリゴ＋３′末端オリゴ１）が１．３ ｋｂ　（フラグメント３）、反応２（５°末端オリゴ＋３゛末端オリゴ２）が１ ．３ｋｂ　（フラグメント４）、反応３（５°末端オリゴ＊３′末端オリゴ３） が１．１ｋｂ（フラグメント５）、反応４（５′末端オリゴ＋３°末端オリゴ４ ）が０．９ｋｂ（フラグメント６）、反応５（５′末端オリゴ＋３′末端オリゴ ５）が０．６ｋｂ　（フラグメント７）であった。

ＤＮＡフラグメント３〜７を各々別々に発現ベクターｐＳＶＡｄｐＡＩＧ、ｌ結 した。

プラスミドｐｓＶＡｄｌを順次Ｋｐｎｉ及びＰｓｔｌで消化させ、その後、ホス ファターゼで処理し、プラスミドの主要部分を含むフラグメント（フラグメント ２）を低融点アガロース上で電気泳動により単離した０次に、フラグメント２を 別々に各々フラグメント３〜７に連結し、固定混合物をコンピテント大腸菌細胞 ＨＢ　１０１にトランスフェクトした。アンピシリンを含有する増殖培地を収容 するベトリ皿に形質転換した培養物を注ぎ、耐性コロニーを選択した。これらの 形質転換細胞からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素により正確なインサート の存在を分析し、配列決定により５”及び３°末端のインサートの接合部を解析 し、配列が正しいことを確認した。

プラスミドをｐＳＶＡｄｓ　ＩＦｌｐＡ、　ｐＳＶＡｄｓ　ＩＦＲ２ｐＡ、ｐＳ ＶＡｄｓ　ＩＦＲ３ｐＡ、ｐＳＶＡｄｓ　ＩＦＲ４ｐ４．ｐＳＶＡｄｓＩＦＲ５ ｐＡと命名した。これらのプラスミドを使用して可溶性受容体及び可溶性受容体 のフラグメントを哺乳動物細胞中で発現させた。

Ｋ１透ｌ ＣＨ○　にお番る 試験した可溶性受容体が一時的に発現されたら、可溶性受容体を連続的に発現す る安定細胞系を樹立した。このために、細胞宿主としてジヒドロ葉酸レダクター ゼ欠失系であるＣＨＯ系ＤＵＫ−Ｘ　（Ｆ、Ｋａｏら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、６４ ．　１２８４−９１．　１９６９；　Ｃｈａｓｉｎ　Ｌ、、＆　Ｕｒｌａｕｂ　 Ｇ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７７、　４２１６−８０゜１９８０）を使用した 。この系を使用することにより、インターフェロンα及びβの可溶性受容体の構 築物の各々を、マウスのＤＨＦＲ遺伝子を含むｐＳＶ２ＤＨＦＲと共に同時トラ ンスフェクトした（Ｓｕｂｒａｍｉら、Ｍ。

１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１．　８５４−８６４゜１９８１）、この同時 トランスフェクションを行う前に、全プラスミドを制限酵素で切断することによ り直鎖化し、トランスフェクションに先立って、プラスミドＩＦＲに対する５Ｖ ２ＤＨＦＲのモル比が１：１０となるように、各１ラスミドを別々に１ラスミド ｐＳＶ２ＤＨＦＲと混合した。こうしてトランスフェクタント細泡によりＩＦＨ の遺伝子のコピー数を最大にした。プラスミドを細胞中で連結し、組換により細 胞宿主の染色体に組み込まれ得るポリマーを形成した（Ｈａｙｎｅｓ　＆　Ｗｅ ｉｓｓｍａｎｎ。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、　１１．　６８７−７０６．　１９８３；　５ ｃａｈｉｌｌ　Ｓ、Ｊ、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 、　８０゜４６５４−５８．　１９８３）、ヌクレオチドを含まない培養培地で あるα培地中でマウスＤＨＦＲを発現するトランスフェクトントを選択した０次 に、高レベルのＤＨＦＲを発現する細免を選択するために、メトトレキセート（ ＭＴＸ）（ＤＨＦＲに結合する葉酸の毒性類似体）を加えた。

ＭＴＸ耐性はＤＨＦＲの高発現レベルに起因し、多くの場合、「増幅単位」と呼 称される長い染色体セグメントを含み得るＤＨＦＲの遺伝子の増幅の結果である （Ｋａｕｆｍａｎ　＆　５ｈａｒｐ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉ。

１．１．　１０６９−１０７６．１９８１）、従って、ＤＨＦＲの配列とインタ ーフェロンα及びβの可溶性受容体との同時組み込みにより、インターフェロン α及びβの可溶性受容体の遺伝子を増幅することができる。

１０％ウシ胎児血清を補充した選択的増殖培地（ＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２　１ ：１（Ｇｉｂｃｏ））でクローニングすることにより、安定的にトランスフェク トされた細胞系を単離した０次に、クローンをスクリーニングし、３ＳＳ−シス ティンでｉｎ　ｖｉｖｏ標識後にならし培地の免疫沈降によりインターフェロン α及びβの可溶性受容体の大部分を発現するクローンを選択した。特に、ｐＳＶ ＡｄＩ　ＦＲｐＡ、ＰＳＶＡｄｓ　Ｉ　ＦＲＩ　ｐＡ、ｐＳＶＡｄｓ　ＩＦＲ２ ｐＡ、ｐＳＶＡｄｓ　ＩＦＲ３ｐＡ、ｐＳＶＡｄｐＡ又はｐＳＶ２ＤＨＦＲによ り同時トランスフェクトした約１０７個のＣＨＯ細胞を４ｍｌのＲＰＭＪシス培 地（Ｇｉｂｃｏ）中１００ｍＣｔ／ｍｌの３５Ｓ−システィン（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ）と共に５時間３７℃でインキュベートした。

このような細胞の標識後、濾過したならし培地１ｍｌを０゜５ｍＭのフッ化フェ ニルメチルスルホニルで調節し、上述のように免疫沈降させた。沈殿を７．５％ ＰＡＧＥゲル上で還元条件下で電気泳動により分画した（Ｕ、に、Ｌａｅｍｍｌ 　ｔ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７．　６８０−８５゜１９８０）。

Ｋ急■ユ ン　−フエロンα　のロ　の 構築物ｐＳＶＡｄｓＩＦＲ３ｐＡの組換インターフェロンα及びβの可溶性受容 体を発現するＣＨＯＩＩＩ胞のクローンを選択し、４本の回転瓶（Ｂｅｃｔｏｎ 　＆　Ｄｉｃｋｉ　ｎ５ｏｎ）中で１％ＦＣ８、Ｉｇ／ｌグルコース、ストレプ トマイシンやペニシリンのような抗生物質（Ｌｏｏｍｇ／ｍ　１　）及び０．５ ｍＭ　ＭＴＸを補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２　（１：　１）培地で８日間 培養した。上清を回収し、０．２μｍのマキシカプセル（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃ１ ｅｎｃｅｓ）で濾過し、アニオン交換カラムＦＰＬＣｍｏｎｏ　Ｑ（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）で分泌タンパク質を濃縮した。１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７，１ ０％グリセロール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、４０ ０阻害単位のカリクレイン／ｍｌアプロチニンを含む緩衝液でカラムを濯ぎ、Ｎ ａＣ１の不連続勾配（０，２〜１．０Ｍ）で溶離させた。可溶性受容体はインタ ーフェロンを固定することが可能であり、従って、ヨウ素１２５で標識したイン ターフェロンの固定を使用して受容体の精製を行うことができる。

受容体を含有する材料をカラムｍｏｎｏ　Ｑで溶離させ、透析し、Ｍｔｃｒｏ− Ｐｒｏｄｉｃｏｎ型の装置で濃縮した。１００００ダルトン以上の分子量のタン パク質を保持する膜を使用した。０．１％ＳＤＳを使用して３ｍｍのポリアクリ ルアミドの７．５％ゲルに濃縮材料を堆積した。

同時に、サンプル（約１０μｇ）を同一ゲル上に隣接して堆積した。を気泳動後 、ゲルのこの部分をニフッ化ポリビジニル膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気的に 転移させ、ヨウ素１２５で標識した組換ヒトインターフェロンα８とハイブリダ イズさせた。このように、可溶性受容体の位置を電気泳動後に同定することがで きる０次に可溶性受容体を含むゲルの部分を切断し、電気溶離によりタンパク質 を回収し、分子限外−過により濃縮し、透析してＳＤＳを除去°した。

Ｋ五■Ａ ヒト　ムノ　ロブ１ンにの１　ヒ　ム　ロブ１ン　の１　に　ム　ｔ・　ン　− 　エロンα　ロ゛　六　の　ためのブース々゛の に１ム曵皇遣 イムノグロブリンにの不変部に融合した細胞外領域の種々の長さを有するインタ ーフェロンα及びβの可溶性受容体を発現させるための１ラスミドを構築した。

これらのプラスミトヲ以下ノ文中ではｐＳＶＡｄｓ　ＩＦＲＩＫ、ｐＳＶＡｄｓ ｌＦＲ２Ｋ及びｐＳＶＡｄｓ　Ｉ　ＦＲ３にと呼称する。

プラスミドｐｓＶＡｄｓＩＦＲＩＫは、メチオニンの開始コドンから、リシン４ ３６のコドンの後でヒトイムノグロブリンにのスレオニン１０９のコドンから開 始するイムノグロブリンにの不変部の配列の直前に位置する融合点までのＮ末端 部分を含む（Ｋａｂａｔら；　Ｈｅ１ｔｅｒ。

Ｐ、Ａ、ら、Ｃｅ１ｌ　２２．　１９７−２０７．　１９８０）。

同様にプラスミドｐＳＶＡｄｓＩＦＲ２にはメチオニンの開始コドンから、グル タミン４２７のコドンの後でヒトイムノグロブリンにのスレオニン１０９のコド ンから開始するイムノグロブリンにの不変部の配列の直前に位置する融合点まで のＮ末端部分を含む（Ｋａｂａｔら；　Ｈｉｅｔｅｒ、Ｐ、Ａ、ら、Ｃｅ１ｌ　 ２２．　１９７−２０７、　１９８０）。

これらのプラスミドは次のように構築した。

イムノグロブリンにのＤＮＡフラグメントは、ヒト膵臓のｃＤＮＡバンクから合 成した（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）、所望の ｃＤＮＡを合成するために、公知ＤＮＡ配列（Ｈｉｅｔｅｒ、Ｐ、Ａ。

ら、Ｃｅ　１１　２２．　１９７−２０７．　１９８０）に基づいて所定の領域 に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをＰＣＢ反応のプライマーとして使 用した。５′末端のオリゴヌクレオチドは配列：５′−＾ＣＴ（：ＴＧにＣＴＧ ＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣ＾−３°を有しており、３°末端のオリゴヌクレ オチドは配列：　３’−ＣＣＣＴＣＴＣＡＣ＾＾ＴＣＴＣＣＣＴＣＣＡＴＧにＣ ＣＡＧ−５°を有していた。

鋳型として１μｇのプラスミドを使用し１反応後、混合物を４種のヌクレオシド 三リン酸の存在下でクレノーポリメラーゼで処理して２つの鎖の末端を修復した 以外は、実施例１に記載したようにＰＣＲ反応を実施した。ＤＮＡを制限酵素Ｋ ｐｎＩで消化し、低融点アガロース上で電気泳動により所望のフラグメントを単 離した。

インターフェロンα及びβの可溶性受容体のフラグメントをコードするＤＮＡフ ラグメントを同様に合成した。５°末端のオリゴヌクレオチドは実施例１に記載 したと同一、即ち５”−ＣＣＧＧＣ丁ＣＣＡＧＧにＡＴＣＴＧＣＣにＣにＧＣＴ ＣＣＣＡＧ〜３“であり、３′末端のオリゴヌクレオチドは、３’　−ＣＴＣＴ ＴＴＴＧＴＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴ＾ＴＧＧＡＧＡＴＴＴ−５’　（オリゴ１） 、３°−ＴＣＧＴＣＡＣ＾＾＾＾＾ＴＣＡＣＡＣＣＧＡＣＡＴＡＣ＾ＣＴＣ−５ ’　（オリゴ２）、３’　−ＣＣＡＣ（、Ａｔ；ＧＴＴＴＴ（：ＴＣＡＧＡＣＣ ＴＴＴＧＴＧＣＧＧ＾−５′（オリゴ３）であった。

最後の反応サイクル後に反応産物をクレノーポリメラーゼで処理し、２つの鎖の 端部を修復し、その後、制限酵素Ｐｓｔｌで処理してフラグメントＩＦＲＩ、Ｉ ＦＲ２及びＩ　ＦＲ３を得た以外は、実施例１に記載したようにＰＣＲ反応を行 った。

発現ベクターｐｓＶＡｄＡ１を順次Ｋｐｎｌ及びＰｓｔＩ、次いでホスファター ゼで消化し、プラスミドの最大部分を含むフラグメントＰを低融点アガロース上 で電気泳動により単離した。

３成分を含む反応でフラグメントＰをイムノグロブリンのフラグメント及びｓ　 Ｉ　ＦＲＩのフラグメントに連結した。

同様に、フラグメントＰをイムノグロブリンのフラグメント及びｓ　Ｉ　ＦＲ２ のフラグメントに連結し、最後にフラグメントＰをイムノグロブリンのフラグメ ント及び５ＩＦＲ３のフラグメントに連結した。

連結混合物をコンピテント大腸菌ＨＢＩＯＩで各々別々に形質転換させ、培養培 地中にアンピシリンを含むベトリ皿に形質転換した培養物を注ぎ、アンピシリン 耐性コロニーを選択した。プラスミドを形質転換細胞から単離し、制限酵素によ り分析してインサートを決定するか、又は配列決定によりインサートの接合部の ＤＮＡ配列を確認した。

これらのプラスミドを使用してインターフェロンα及びβの可溶性受容体の融合 物を発現させた。

比１段員遣 イムノグロブリンｇ１の不変部に融合した細胞外領域の種々の長さを有するイン ターフェロンα及びβの可溶性受容体を発現させるためのプラスミドを構築した 。これらのプラスミドを以下の文中ではｐ　Ｓ　Ｖ　Ａ　ｄ　ｓ　Ｉ　Ｆ　Ｒ１ ｇ　１　。

ｐｓＶＡｄｓＩＦＲ２ｇｌ及びｐｓＶＡｄｓＩＦＲ３ｇｌと呼称する。

プラスミドｐｓＶＡｄｓＩＦＲ１ｇｌはメチオニンの開始コドンから、リシン４ ３６のコドンの後でヒトイムノグロブリンｇ１のアラニン１１３のコドンから開 始するイムノグロブリンｇ１の不変部の配列の直前に位置する融合点までのＮ末 端部分を含む（Ｋａｂａｔら、Ｅｌｌｉｓ。

ｎＪ、Ｗ、ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１０゜４０７１−４０７９．　１ ９８２）。

同様にプラスミドｐＳＶＡｄｓ　ＩＦＲ２ｇｌは、メチオニンの開始コドンから 、グルタミン［４２７のコドンの後でヒトイムノグロブリンｇ１のアラニン１１ ３のコドンから開始するイムノグロブリンｇ１の不変部の配列の直前に位置する 融合点までのＮ末端部分を含む（Ｋａｂａｔら。

Ｅｌｌｉｓｏｎ　Ｊ、Ｗ、ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄＲｅｓ、１０．　４０７１− ４０７９．　１９８２）。

プラスミドｐｓＶＡｄｓＩＦＲ３ｇｌは、メチオニンの開始コドンから、プロリ ン３６０のコドンの後でヒトイムノグロブリンｇ１のアラニン１１３のコドンか ら開始するイムノグロブリンｇ１の不変部の配列の直前に位置する融合点までの Ｎ末端部分を含む（Ｋａｂａｔら、Ｅｌｌｉｓｏｎ　Ｊ、Ｗ、ら、Ｎｕｃｌ、Ａ ｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１０、　４０７１−４０７９．　１９８２）。

これらのプラスミドは次のように構築した。

イムノグロブリンＧ１をコードする配列はヒト牌臓のＣＤＮＡバンクから合成し た（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）、所望のｃＤＮＡを合成するために、公知のＤＮ Ａ配列（Ｅｌｌｉｓｏｎら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１０．　４０７１ −４０７９、　１９８２＞に基づいて所定の領域に相補的な配列を有するオリゴ ヌクレオチドをＰＣＲ反応の固定剤として使用した。５′末端のオリゴヌクレオ チドは配列＝５°−ＧＣＣＴＣＣＡＣＣ＾＾ＧＧＧＣＣＣＡＴＣにＧＴＣＴＴＣ ＣＣＣ−３’を有しており、３′末端のオリゴヌクレオチドは配列：　３’　− ＧＡＣＡＣＡＣＧＣＣＣＡＴＴＴＡＣＴＣＡＣＣ＾ＴＣＧＣＣＡＧ−５°を有し ていた。

ＰＣＲ反応は次のように行った。

フラグメント５ＩＦＲ１，５ＩＦＲ２ｓ及びＩ　ＦＲ３は上記フラグメントと同 一であり、発現ベクターはＬ鎖融合　゛に関して上述したと同様に構築した。

え族１ ｓＩＦＲを大腸菌で発現させるために発現ベクターｐＨＲ１４８を使用した。ｐ ＨＲ１４８はＲｉｎｋら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１２．　６３６９−６ ３８７゜１９８４に記載されている。プラスミドＨＲ１４８を順次制限酵素Ｎｃ ｏ■、次いで２本鎖の末端を修復するために４種のヌクレオシド三リン酸の存在 下でクレノーポリメラーゼで消化し、次いでＫｐｎｌで消化した。ホスファター ゼで処理後、プラスミドの最大部分を含むＤＮＡフラグメント（フラグメント１ ）を低融点アガロース上で電気泳動により単離した。鋳型として完全ｃＤＮＡを 含むプラスミド（Ｕｚ！ら、Ｃｅ１１．）を使用し、プライマーとして１対のオ リゴヌクレオチドを使用することにより、成熟した可溶性インターフェロンα及 びβの受容体をコードするＤＮＡフラグメント、即ちシグナルペプチドをもたな いフラグメントを合成した。（インターフェロンのＮ末端領域から誘導される） ５末端のオリゴヌクレオチドは配列：　５’　−ＧＧＴにＧ＾＾＾＾＾＾ＴＣＴ ＾＾＾＾ＴＣＴＣＣＴＣ＾＾＾＾＾に−３’　（オリゴ１）を有しており、（イ ンターフェロンのトランスメンブラン領域の直前の領域から誘導される）３′末 端のオリゴヌクレオチドは配列：　３’　−ＴＣＡＣＴＧＣ（：ＡＣＡＴＡＣＡ ＣＴＣＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣＣ−５’　（オリゴ２）を有していた。

ＰＣＲ融合後に合成されたフラグメントが３°末端にＫｐｎＩ制限酵素部位を含 み且つ５゛末端に「平滑」端を含むようにオリゴヌクレオチドを選択した。

ＰＣＲ反応は、反応後、産物をクレノーポリメラーゼで処理して２本鎖の末端を 修復し、その後、酵素Ｋｐｎｌで処理した以外は、実施例１に記載したように実 施した。低融点アガロースで電気泳動により１．３ｋｂのフラグメントを単離し 、フラグメント１に連結した。

＾＾＾ＡＴＣＴＣＣＴＣ＾＾＾＾＾Ｇ−３゛に置き換えた以外は同様に第２のＤ ＮＡフラグメントを合成した。

連結産物を大腸菌ＨＢＩＯＩで形質転換させ、培養培地中にアンピシリンを含む ペトリ皿に、形質転換した培養物を注いだ、アンピシリン耐性コロニーを選択し 、プラスミドを形質転換細胞から単離し、制限酵素消化及び配列決定により解析 し、インサートの融合点の配列を確認した。

これらの２種のプラスミドｐｔｒｐＩＦＲ１及びｐｔｒ”ｐｌＦＲ２を使用して 大腸菌中で可溶性受容体を発現させた１組換タンパク質を発現させるために、形 質転換細胞をＭ９培地（Ｒｉｎｋら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。

１２、　６３６９−６３８７．　１９８４＞中の２０〜５０ｍ１の培養培地に入 れ、１．０の吸光度（Ａ６５０）を得た０次に細胞を遠心分離、洗浄し、インタ ーフェロンの可溶性受容体を砕いた精製細胞から抽出した。インターフェロンα 及びβの可溶性受容体は後述するようにウェスタンプロット又はドツトプロット により定量した。

え１■亙 ヒ　ン　−フェロンαの目゛　六　の　゛可溶性受容体の定量方法は、受容体が ヒトインターフエロンαを特異的に固定する能力に基づいて行った。

ＬＬ免簸孟１ ヒトインターフェロンα及びβの可溶性受容体の定量は、”’Ｉ　−Ｉ　ＦＮが インターフェロンα２の末端アミノ部分に対するモノクローナル抗体に固定する のを阻止するように、可溶性受容体とヨウ素１２５で標識したヒトインターフェ ロンα８との複合体を形成することにより実施した（Ｈ、Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　８０：２５３９［１９８３］）。

分子の末端アミノ部分は、インターフェロンをその受容体固定した後では抗体に アクセスすることができない（Ｈ。

Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、　［１９８３］）、遊離１２うＩ−ＩＦＮを抗ＩＦＮ抗 体に結合し、次いで、プロティンＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）を添加することにより沈降させた。抗ＩＦＮ抗体を製造業者の指示に従って プロティンＡに結合した。

定量すべき可溶性受容体をｐＨ８，３の硼酸緩衝液（０゜ＩＭ　Ｈ２ＰＯ４，０ ，０２５Ｍ　Ｎａ　２Ｂ＜（）、、　ｏ。

０７５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％　ＮＰ４０）５０μｌで希釈した連続希釈液を、 ｆｍｏ１当たり８１Ｂｑの比活性を有するヨウ素１２５で標識した一定量（７５ ｐｍｏ　ｌ　）のインターフェロンα２のと混合しくＫ、Ｅ、Ｍｏｇｅｎｓｅｎ 及びＧ、Ｕｚｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１１９Ｃ：２６７　 ［１９８６］）、４℃で１時間インキュベートした。一定量のプロティンＡ−抗 ■ＦＮを５０μｍ容量に取り、ｐＨ８，３のホウ酸緩衝液５０μｌ　（０，２Ｍ 　Ｈ３ＢＯ，，０，０５Ｍ　Ｎａ２Ｂ、Ｏ，。

０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％　ＮＰ４０）を加えた。

混合物を１時間４℃で撹拌した後、エッペノドルフ型のマイクロ遠心機で１００ ００ｘで１分間遠心分離し、上滑を除去した０次に沈殿をホウ酸緩衝液ｐＨ８， ３（０，１ＭＨコＢＯｉ、０．　０２５Ｍ　Ｎａ２Ｂ４０ｔ、ＬＭ　ＮａＣ１， ０，５％、ＮＰ４０）で６回、ｐＨ８の４０ｍＭ　ＨＥＰＦ、Ｓ及び２％グリセ ロールで２回、次いでｐＨ８の４０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ及びＩＭ尿素１回、最後に ｐＨ８の４０ｍＭ　ＨＥＰＥＳで２回洗った。沈殿中の免疫複合体の放射活性を 計数することにより、インターフェロン−抗インターフェロン複合体の形成阻害 曲線を参考にして、こうして試験したサンプルのインターフェロンα及びβの可 溶性受容体の量を決定することができる。

ｂ　、インターフェロンα　の　の に　ヒトイン　−フェロンα　び　のａ　のヨウ素１２５（放射比活性２５Ｂｑ ／ｆｍｏｌ）で標識した可変濃度（０，５０，１００，１２５，５００，１００ ０及び２０００ＵＩ／ｍｌ）の組換ヒトインターフェロンα８と共に、インター フェロンα及びβの可溶性受容体の連続希釈液を４℃で３０分間インキュベート した０次にＤａｕｄｉヒトリンパ球を”’Ｉ−ＩＦＮ可溶性受容体の種々の混合 物に最終濃度１０７細胞／　ｍ　１まで加え、４℃で２時間インキュベートした １次に細胞を遠心分離（８００ｇで１０分間）し、上清を除去した。０．５％の ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ　１６４０培地（ＦＩＯＷＬａｂｏｒａｂｏｒ ｉｅｓ）で細胞を３回洗い、ＬＫＢ　１２７０型のγカウンターで計数すること により、細胞に結合した放射活性を決定した。

インターフェロンとその細胞受容体との特異的固定の阻害曲線からインターフェ ロンα及びβの可溶性受容体の量を決定した（特異的固定は、＋２’Ｉ−ＩＦＮ 単独の固定曲線と、１００倍の非原識インターフェロンの存在下の固定曲線の差 である）。

Ｃ「ウェス　ンプロット　こ　ヒト　ン　−フェロンα　の目　の ３００００ダルトン以上の分子量のタンパク質を保持するＡｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎ ｔｒｉｃｏｎ　３０型の膜を使用することにより、インターフェロンαの受容体 の存在について定量すべきサンプルを濃縮した１次に、緩衝液（６０ｍＭ　Ｔｒ ｆｓ−ＨＣＩ　ｐＨ６，８，１，２５％　ＳＤＳ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ及び４００ 阻害単位カリクレイン／ｍｌアプロチニン）中にサンプルを取り、０．１％ＳＤ Ｓを添加した７、５％ポリアクリルアミドゲル上に堆積した。標準条件で電気泳 動後、３９ｍＭグリシン、４８ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩基　ｐＨ８，３及び１８％メ タノールを含有するＭｌｌ液中”Ｃ２００ｍＡ″ｃ１　＃ｆｍ　’半乾燥」型ノ ミ気転移装置（Ｎｏｖａ　Ｂｌｏｔ、ＬＫＢ）でニフッ化ポリビニジル膜（Ｍｉ 　１１１ｐｏｒｅ）にサンプルを移した。転移後、膜を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩 基、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０．　ｐＨ７，８及び１０％脱脂乳（Ｒａｇｉｌａｆ ｔ、フランス）を含むＭｉｌｌ液で４時間、２５℃で撹拌下に処理した０次に同 一緩衝液中で２５℃で撹拌下に２時間、農を１０−”Ｍ　（比活性５０ＢＰ／ｆ ｍｏｌ）の１２５Ｉ−インターフェロンα８とハイブリダイズした０次に農を同 一緩衝液のアリコートで５回洗い、風乾し、Ｘ線感光フィルムに暴露した。

従来記載されているクロラミンＴ法（Ｋ、Ｅ、Ｍｏｇｅｎｓｅｎ及びＧ、Ｕｚ４ ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１１９Ｃ：２６７　［１９８６コ ）の変法により、組換ヒトインターフェロンα８（αＢ）をヨウ素１２５で標識 した。これは２５Ｂｑ／ｆｍｏｌ又は５Ｂｑ／インタ一フエロン国際単位の比放 射活性に対応する。

ｄ　「ド・・　プロ・・ト　こ　ヒト　ン　−フェロンαロ　μ　の ５０μｌのＭ＠液（３９ｍＭグリシン、４８ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩基ｐＨ８，３） 中で定量すべき可溶性受容体の調製物の連続希釈液を調製し、ニフッ化ポリビニ ジル膜（Ｍｉ　１１１ｐｏｒｅ）を充填したＢｉｏ−Ｂｌｏｔ型の装置（Ｂｉｏ ｒａｄ）の皿に堆積した。

次に膜を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩基、０．２％　Ｔｗｅｅｎ２０ｍＭ、ｐＨ７ ，８及び１０％脱脂乳（Ｒｅｇｉｌａｉｔ、フランス）の緩衝液で２５℃で撹拌 下に４時間処理した１次に膜を同一緩衝液中で撹拌下に２５℃で２時間１０−” Ｍ　（比活性２５Ｂｑ／ｆｍｏりの１２ｓｉ　ｉｐ’Ｎ　αＢとハイブリダイズ した０次に、膜を撹拌下に同一緩衝液のアリコートで５回洗い、Ｘ線感光フィル ムに暴露した。較正曲線を参照しながらオートラジオグラフィーを解析すると、 膜に結合した”Ｊ−ＩＦＮの量を決定し、従って試験したサンプル中の可溶性受 容体の濃度を推定することができる。

組換ヒトインターフェロンα８（αＢ）をクロラミンＴ法（Ｋ、Ｅ、Ｍｏｇｅｎ ｓｅｎ及びＧ、Ｕｚ６．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｏｍｏｌ、　１１９Ｃ ：２６７［１９８６］）の変形によりヨウ素１２５で標識した。これは２５Ｂｑ ／ｆｍｏｌ又は６Ｂｑ／インタ一フエロン国際単位の比放射活性に対応する。

Ｋ１■ユ １１旦盈１ 実施例３の生成物１００ｍｇ、注射可能な調製物の斌形剤２ｍｌを含有する注射 用組成物を調製した。

Ｆｉｇ、１Ａ ＣｒＧＣＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧｉｎ工ｌｅ　Ｇｌｙ 　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ 　Ａｓｐ　ＬｙｓＡＴａ　ＴＧＧ　ａｃｒ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　ＴＥＡ　 ｘｃｃγπＡＣＡ　ＴＡＴ　ＡＧＣＴＴＡ　ＣＴＴＭＥＴ　Ｔｒｐ　Ａｌａしｍ ｕ　Ａｓｐ　ＧＩＹ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｓａｒし鬼− ｕＦｉｇ、１Ｂ Ｖａｌ　Ｇｉｎ　入Ｓｎ　Ｇｌｎ　ＡＳｎ　Ｑｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｌｙｇ　Ｔ ｒＰ　Ａｔ−ｐ　Ｔ’ｙｒ　Ｔｈｒ　ＴｙｒＬｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌ７Ｂ　Ｇｌｎ工 １ａＣＣｒ　ＧＡＣＴＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＧＴＣＡＡＡ　ＡＣＴ　ＡＣＣＧ ＡＧ　ＴＧＴ　ＧＴＣＴＴＴ　ＣＣＴＰｒｏ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ 　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｐｒ。

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Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．インターフェロンα及びβに対して高親和性を有することを特徴とする水溶 性ポリペプチド。
2. ２．図１の式に対応することを特徴とする請求項１に記載の水溶性ポリペプチド 。
3. ３．図１又は図２の式に対応するポリペプチドから置換により誘導されることを 特徴とする請求項１に記載の水溶性ポリペプチド。
4. ４．図１又は図２の式に対応するポリペプチドから欠失により誘導されることを 特徴とする請求項１に記載の水溶性ポリペプチド。
5. ５．図１の配列によりコードされることを特徴とする水溶性ポリペプチド。
6. ６．別のポリペプチドにハイブリダイズされていることを特徴とする請求項１か ら５のいずれか一項に記載の水溶性ポリペプチド。
7. ７．別のポリペプチドが、人体中における水溶性ポリペプチドの分解を遅らせ得 る構造を有することを特徴とする請求項６に記載の水溶性ポリペプチド。
8. ８．別のポリペプチドがイムノグロブリンであることを特徴とする請求項７に記 載の水溶性ポリペプチド。
9. ９．イムノグロブリンがＧ型、好ましくはＧ１型であることを特徴とする請求項 ８に記載の水溶性ポリペプチド。
10. １０．請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードすることを 特徴とするＤＮＡ配列。
11. １１．請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現することを特 徴とする細胞。
12. １２．請求項６から９のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現することを特 徴とする細胞。
13. １３．請求項１から９のいずれか一項に記載の水溶性ポリペプチドの製造方法で あって、該ポリペプチドを発現させることが可能な細胞を適切な栄養培地で培養 することを特徴とする方法。
14. １４．請求項１から９のいずれか一項に記載の水溶性ポリペプチドから構成され ることを特徴とする医薬。
15. １５．請求項１から９のいずれか一項に記載の水溶性ポリペプチドを有効成分と して含有することを特徴とする医薬組成物。
16. １６．診断薬としての請求項１から９のいずれか一項に記載の水溶性ポリペプチ ドの適用。
17. １７．抗インターフェロンα又はβ抗体の製造における請求項１から９のいずれ か一項に記載の水溶性ポリペプチドの適用。