JPH07284397A - ラミナリトリオースの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 食品及び医農薬品に直接又は中間体としてラ
ミナラミナリトリオースを効率的に製造する方法を提供
する。 【構成】 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化
合物に、これらの糖化合物に作用してグルコースを遊離
させる能力を有するエキソ型β−１，３グリコシル糖分
解酵素、及び糖鎖が４糖以上のオリゴ糖を遊離させる能
力を有するβ−１，３グリコシル糖分解酵素を作用させ
て得られることを特徴とするラミナリトリオースの製造
法。 【効果】 オリゴ糖同士を分離する煩雑な精製方法を行
う事なく、簡便な精製法で高純度のラミナリトリオース
を速やかに得ることが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】食品の甘味剤、増量剤、賦形剤、
包括剤として食品、医薬品及び種々の工業製品に利用可
能であり、抗腫瘍活性、抗細菌感染症作用、免疫系に及
ぼす作用等を有する医農薬品の中間体として有用なラミ
ナリトリオースを製造することに関する。

【０００２】

【従来の技術】これまでラミナリトリオース（グルコー
スがβ−１，３グリコシド結合で３糖つながっている
糖）は、グルコースがβ−１，３位で結合している部分
を有する多糖、例えばパキマンやラミナリンを酸で加水
分解した後クロマト的に分離する方法により得られてい
る。しかしこのように分解したものはオリゴ糖混合物と
なり、この中からラミナリトリオースを得るには、現在
最も有効とされる活性炭クロマトグラフィーにより分画
する方法によっても、分離に手間がかかる上、高純度の
オリゴ糖を得ようとすると回収のロスが多いという欠点
がある。

【０００３】例えば、酸による加水分解は特開平２−２
４３６９７号公報に開示されているように制限条件下に
おいても、単一のオリゴ糖純度を２０％以上にすること
は困難である。

【０００４】一方、本願発明者を含む発明者によるレバ
ウディオサイドＡの製造法（特開昭６２−１４６５９９
号公報）において、ラミナリペンタオース （グルコー
スがβ−１，３グリコシド結合で５糖つながっている
糖）にエキソタイプのβ−１，３グルカナーゼを作用さ
せることでグルコースとラミナリトリオースが生成され
ることは知られているが、そこからラミナリトリオース
を単独で採取することは開示されておらず、ラミナリペ
ンタオースにエキソ型β−１，３グルカナーゼを作用さ
せる方法は、あらかじめラミナリペンタオースを得る操
作が必要な上、反応速度が遅いので効率的ではない。

【０００５】又、酵素による選択的な方法としては高純
度のラミナリビオースの製造法（特開昭５９−１６２８
９７号公報）やラミナリペンタオースの製造法（特公平
４−３７７１９号公報）が公知となっているがこれらの
酵素からはラミナリトリオースは生成されない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、高純度のラミナリトリオースを効率的に製
造する方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率的に
ラミナリトリオースを製造する方法を鋭意研究した結
果、糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物
に、これらの糖化合物に作用して糖鎖が４糖以上のオリ
ゴ糖を生成させるβ−１，３グルコシル糖分解酵素を作
用させた後か、もしくは同時にエキソ型β−１，３グリ
コシル糖分解酵素を作用させると速やかに最終分解物と
してグルコースとラミナリトリオースを蓄積するため、
簡便な方法でラミナリトリオースを分離精製できること
を見いだし本発明を完成した。

【０００８】即ち本発明は、糖鎖が５糖以上のβ−１，
３グリコシル糖化合物に、これら糖化合物に作用してグ
ルコースを遊離させる能力を有するエキソ型β−１，３
グリコシル糖分解酵素及び、４糖以上のオリゴ糖を遊離
する能力を有するβ−１，３グリコシル糖分解酵素を作
用させて得る事をと特徴とするラミナリトリオースの製
造方法を提供するものである。

【０００９】以下本発明を詳細に説明する。本発明で言
う糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物（以
下単にβ−１，３グリコシル糖化合物と称する）とは、
β−１，３位で結合されたグルコース（即ちβ−１，３
グルコシド結合をしたグルコース）の重合度が少なくと
も５糖以上、好ましくは６糖以上の糖化合物であれば、
β−１，３グリコシル糖鎖が主鎖にあるものでも、側鎖
にあるものでも良い。例えばβ１，３−グリコシル結合
を有するオリゴ糖類、多糖類、配糖体、糖脂質、糖蛋白
等が挙げられ、またこれらの部分分解物も用いる事がで
きる。本目的のためにはβ−１，３グリコシル糖を主鎖
又は側鎖に有するオリゴ糖または多糖が好ましい。オリ
ゴ糖としては例えば、β−１，３グルコシド糖鎖のみか
らなるいわゆるラミナリオリゴ糖がより好ましい。多糖
類としては、重合度が５糖以上、好ましくは６糖以上の
β−１，３グルコシル結合を有するものであればいずれ
の多糖類であっても良いが、例えば、カードラン、ラミ
ナリン、パキマン、酵母細胞壁等が比較的長いβ−１，
３グルコシド結合を有しているのでより好ましい。

【００１０】次に、本発明に使用する酵素について説明
する。本発明で用いるエキソ型β−１，３グリコシル糖
分解酵素（以下単にエキソ型分解酵素と称する）とは、
上記で述べたβ−１，３グリコシル糖化合物に作用して
グルコースを遊離させる能力を有し、しかもラミナリト
リオースに対しては作用しないか非常に作用しにくい酵
素であればいかなる酵素でも良く、微生物、動物及び植
物のいずれの起源からのものであっても良い。好ましく
はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属
に属する微生物が生産する酵素が挙げられ、特に好まし
くはストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩＣ−１０８）
が生産する酵素が挙げられる。

【００１１】又、他の好ましいものとしては上記の菌株
を人工的に変異処理即ち化学、物理的手段による変異誘
発処理を行うことにより得られる人為的突然変異株、あ
るいは自然変異株等から得られる酵素もすべて含まれ
る。

【００１２】糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖
化合物に作用して４糖以上のオリゴ糖を生成する能力を
有するβ−１，３グルコシル糖分解酵素（以下オリゴ糖
生成酵素と称する）は、このような能力を有する酵素で
あればエンド型であってもエキソ型であってもいずれで
も良く、微生物、動物及び植物のいずれの起源のものか
らであっても本発明を完成することができる。オリゴ糖
分解酵素は分解の対象となるβ−１，３グリコシル糖化
合物の重合度より小さい糖に分解する酵素であり、４糖
に近い重合度のオリゴ糖を遊離する能力を有するものが
効率的にラミナリトリオースを製造できるため好まし
い。好ましくは５糖に分解する酵素が挙げられ、特にス
トレプトマイセス属に属する微生物が生産する酵素が好
ましく、その中でもストレプトマイセス・エスピー Ｄ
ＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩ
Ｃ−１０８）より生産される酵素が特に好ましい。

【００１３】又、他の好ましいものとしては上記の菌株
を人工的に変異処理即ち化学、物理的手段による変異誘
発処理を行うことにより得られる人為的突然変異株、あ
るいは自然変異株等から得られる酵素もすべて含まれ
る。

【００１４】このストレプトマイセス・エスピー ＤＩ
Ｃ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩＣ
−１０８）は、本発明に適したエキソ型糖分解酵素（以
下エキソグルカナーゼＳＴと呼ぶ）とオリゴ糖生成酵素
（この酵素はカードラン等に作用してラミナリペンタオ
ース（Ｇ５）を遊離させる能力を有する酵素であり、以
下Ｇ５生成酵素と呼ぶ）を同時に菌体外に生産するので
本発明では好ましく用いられるが、本発明に使用できる
酵素はこれに限定されるものではない。

【００１５】本発明で特に好ましく用いられるエキソグ
ルカナーゼＳＴ及びＧ５生成酵素の性質を以下に示す。 〔エキソグルカナーゼＳＴの酵素学的性質〕 （１） 作用；β−１，３グリコシル糖化合物、例えば
カードラン、ラミナリン、パキマン、酵母細胞壁及びそ
れらの部分加水分解物に作用して、グルコースを遊離さ
せる。ラミナリオリゴ糖に作用させたときの最終生産物
はグルコースとラミナリトリオースである。 （２） 作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ； ｐＨ３〜９
まで作用し、最適作用ｐＨは６である。 （３） 作用温度範囲及び最適作用温度； 約２０℃〜
約７０℃まで作用し、最適作用温度は約６０℃である。 （４） 熱安定性； ０．０１Ｍ酢酸緩衝液中では４５
℃、１時間の熱処理で完全に失活するが、０．１Ｍリン
酸緩衝液中では６０℃、１時間の熱処理で約６０％失活
する。 （５） 精製方法； 本酵素は菌体除去後の培養濾液よ
り限外濾過膜（分画分子量１万）で濃縮後、ＤＥＡＥセ
ルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍト
リス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）を行い、塩化ナトリ
ウム濃度０．１Ｍで溶出される画分を集める。脱塩後Ｃ
Ｍセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１
Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を行って塩化ナトリウム
０．２Ｍ溶液で溶出される画分を集めることにより活性
的にほぼ単一な酵素を得ることができる。 （６） 分子量；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）による分子
量は約５５０００である。

【００１６】〔Ｇ５生成酵素の酵素学的性質〕 （１） 作用； β−１，３グリコシル糖化合物、例え
ばカードラン、ラミナリン、パキマン、酵母細胞壁又は
その部分分解物等よりラミナリペンタオースを生成す
る。 （２） 作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ； ｐＨ３〜９
の範囲に作用し、最適ｐＨは５付近である。 （３） 作用温度範囲及び最適作用温度； 約７０℃ま
で作用し、最適作用温度は約６０℃である。 （４） 精製方法； 本酵素は菌体除去後の培養濾液よ
り限外濾過膜（分画分子量１万）で濃縮後ＤＥＡＥセル
ロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）を行い、その未吸着画
分を集める。次いでＣＭセルロファインカラムクロマト
グラフィー（０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）を行
い、０．１Ｍで溶出される画分を集めることにより活性
的に単一な酵素を得ることができる。 （５） 熱安定性； ０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．
０）中では７０℃、９０時間の加熱で完全に失活する
が、５０℃では３０％の失活である。 （６） 分子量； ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は約
４００００と推定できる。

【００１７】本発明で好ましく使用される前述のストレ
プトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩＣ−１０８）菌株の菌学的
性質は特開昭５９−１７９９６号公報に既に記載されて
いるが、詳細には以下のような性質を有するものであ
る。なお本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託申請し、微工研条寄第２５３号（ＦＥＲＭ ＢＰ
−２５３）として国際寄託されている。

【００１８】〔ストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ
−１０８の菌学的性質〕 （１） 形態的特徴 使用した培地（ＩＳＰ培地を含む）上での栄養菌糸の生
育は優れており、デンプン無機塩、オートミール寒天、
イースト麦芽寒天培地上で豊富な気菌糸を形成する。胞
子形成気菌糸は直状又は直曲状である。胞子は楕円体で
大きさは、短径×長径０．７〜０．８μ×１．０〜１．
２μである。走査型電子顕微鏡による観察では胞子の表
面構造はイボ状（Ｗａｒｔｙ）である。

【００１９】（２） 各種培地における生育状態 （ａ）シュークロース硝酸塩寒天培地（３７℃） 薄茶色の基生菌糸状に灰色の気菌糸を形成し、溶解性色
素は認められない。 （ｂ）グルコース・アスパラギン寒天培地（３７℃） 薄黄白色の生育で気菌糸の形成は認められない。又溶解
性色素は認められない。 （ｃ）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ培地
−Ｎｏ．５ ３７℃）薄黄色の生育で気菌糸の着生は認
められない。又、溶解性色素は認められない。 （ｄ）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ培地 ３７
℃） 無色の発育上に緑灰色の気菌糸を着生し、溶解性色素は
認められない。 （ｅ）チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地−７ ３７℃） 薄茶色の生育上に培養７日目では気菌糸は着生せず、１
４日目で白灰色の気菌糸を着生する。溶解性色素は認め
られない。 （ｆ）栄養寒天培地（３７℃） 緑灰黒色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生し、溶解性
色素は認められない。 （ｇ）イースト麦芽寒天培地（ＩＳＰ培地−２ ３７
℃） 薄茶色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生する。水溶性
色素の生成は認められない。 （ｈ）オートミール寒天培地（ＩＳＰ培地−３ ３７
℃） 無色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生し、水溶性色素
の生成は認められない。

【００２０】（３） 生理的性質 （ａ）生育温度範囲 酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生育試験では、
３０〜５０℃で生育するが、至適温度は３７〜４５℃で
ある。 （ｂ）ゼラチンの液化：陰性 （ｃ）脱脂乳の凝固及び脱脂乳のペプトン化：陰性 （ｄ）メラニン色素の生成（ペプトン・イースト・鉄寒
天培地 ＩＳＰ培地６）：陰性 （ｅ）デンプンの分解性：陽性（分解ゾーンに白いリン
グを形成） （ｆ）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培
地−９ ３７℃） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ
−マンニトール、Ｄ−ガラクトースをよく利用して生育
し、シュクロース、ラフィノース、サリシンは利用しな
い。 （ｇ）細胞壁組成 ＩＳＰに記載されている糖組成Ｔｙｐｅとしては、Ｔｙ
ｐｅ１に属する。

【００２１】本発明に使用する酵素生産のための該菌株
の培養は、通常の個体培地又は液体培地が使用され、液
体培養のための炭素源としては例えばグルコースやフラ
クトース等が用いられるが、酵素誘導炭素源としてはβ
−１，３グルコシル糖化合物が望ましい。例えばカード
ラン、パキマン、ラミナリン、リケナン、酵母細胞壁又
はその部分分解物、リュウコシン、カロース、パラミロ
ン等があげられ、又窒素源としては、硫酸、塩酸、リン
酸等のそれぞれアンモニウム塩や硝酸ナトリウム、尿
素、ペプトン、カゼイン等、有機窒素、無機窒素のいず
れも利用できる。天然栄養源としては、例えば各種糖
蜜、コーンスティープリカー、オートミール、味液、魚
粉、肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエキス、麦芽
エキス等があげられる。

【００２２】無機物としては、例えばリン酸２カリウ
ム、リン酸１ナトリウム、硫酸マグネシウム、微量金属
類等があげられる。その他必要に応じてビタミン類を添
加することもできる。これらの使用濃度としては０．１
〜４０重量％が用いられる。又発酵中の発泡を抑制する
ため、０．０００１〜１．０重量％の消泡剤を添加して
もよい。消泡剤としてはシリコーン、大豆油、界面活性
剤等通常の消泡剤を用いる。培養方法は、振とう培養、
通気培養等の好気的液体培養が適しており、ｐＨ５〜
９、培養温度２０℃〜５０℃で１日〜６日、望ましくは
ｐＨ６〜８で３５℃〜４０℃で２日前後培養する。

【００２３】本発明に使用できる酵素は、該菌体外に生
産される酵素であるので、培養終了後、濾過又は遠心分
離して除菌し、上清液を回収する。そして必要に応じて
濃縮し、硫安、硫酸ナトリウムによる塩析、又はイオン
交換やゲル濾過等のクロマト手法により精製し、又凍結
乾燥等で乾燥後保存することができる。

【００２４】本発明の製造法としては、例えば重合度が
大きいカードラン等の多糖に、５糖に分解するオリゴ糖
生成酵素と、エキソ型分解酵素を順次又は好ましくは同
時に作用させる事で、オリゴ糖成分がグルコースとラミ
ナリトリオースのみからなる反応液を得る事が出来る。
その後、常法によりラミナリトリオースを分離精製する
ことで、効率よくラミナリトリオースを製造することが
できる。

【００２５】重合度の大きい多糖やラミナリペンタオー
スのようなオリゴ糖に、直接エキソ型分解酵素のみを作
用させてもラミナリテトラオースを製造する事が出来る
が、この方法はオリゴ糖精製酵素を併用する場合と比較
して反応速度の点において劣るため好ましくない。即ち
本発明は２種類の酵素を併用することが特徴である。

【００２６】本発明の製造法によりラミナリトリオース
を得るには、例えばまず水又は緩衝液に溶解させた前述
の５糖以上のβ−１，３グルコシル糖化合物の１〜１０
重量％懸濁液に対し、Ｇ５生成酵素を０．５〜３μｇ／
反応液ｍｌ加え、ｐＨ３〜９、好ましくは５〜７、反応
温度３０℃〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃の反応条
件で３０分〜５０時間好ましくは１０〜２４時間反応さ
せた後、この系内にエキソグルカナーゼＳＴ１〜５μｇ
／反応液ｍｌ添加して、ｐＨ４〜９、好ましくは５〜
７．５、反応温度３０〜７０℃、好ましくは４０〜６０
℃の反応条件で３〜２０日、好ましくは１０〜１８日反
応させることにより得られる。この時オリゴ糖成分とし
てグルコースとラミナリトリオースのみが存在する。

【００２７】好ましくは上記２種の酵素を同時に添加し
て反応させても本発明のラミナリトリオースを製造する
ことができる。他の酵素を用いて反応させる場合は、そ
の酵素に最適な温度、ｐＨに調節すれば良い。

【００２８】本発明の方法で得られた反応液中にはラミ
ナリトリオースとグルコースが存在しているのでその後
の精製はグルコースを除去するだけでよい。グルコース
を除去する方法としてはクロマトグラフィーによる方法
があり、例えば活性炭クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィー等
が挙げられる。この中では活性炭クロマトグラフィーが
大量の糖を処理できる点で優れている。この場合、ラミ
ナリトリオースのみが活性炭に吸着され、グルコースは
吸着されないので水洗浄で溶出される。活性炭に吸着さ
れたラミナリトリオースは通常１０〜２０％のエタノー
ル等で溶出し回収することができる。又、微生物による
方法、例えばラミナリトリオースとグルコースの混合液
に、適当な窒素源あるいは微量栄養源等を添加してサッ
カロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属やクル
ベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵
母を生育させると、通常グルコースのみを資化しラミナ
リトリオースはそのまま残るので菌体の除去後はイオン
交換精製等により糖以外の成分を取り除くことで精製で
きる。

【００２９】

【実施例】以下に実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 （参考例１）〔エキソグルカナーゼＳＴの調製〕 ９０Ｌ容ジャーファメンター（丸菱製）を用いて酵素生
産培養を行った。即ち、グルコース ０．５％、ポリペ
プトン ０．２％、酵母エキス ０．２％、Ｋ ₂ＨＰＯ₄
０．２％、 ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．１％からなる
液体培地（ｐＨ７．０）を４７Ｌ仕込み、１２１℃で３
０分殺菌後温度が４０℃まで下がった時点でカードラン
０．５％を添加した。これに同培地組成で２日間、３５
℃で培養したストレプトミセス・エスピー ＤＩＣ−１
０８（微工研条寄第２５３号）の種菌２Ｌを接種し、３
５℃、攪拌３００回転／ｍｉｎ、通気量４８Ｌ／ｍｉ
ｎ．の条件で４０時間培養した。培養終了後、培養液は
ボルテックスフロー式限外濾過膜装置（丸菱製）にて分
画分子量１０万の膜で菌体を除去し、次いで分画分子量
１万の限外濾過膜にて濃縮した。この粗酵素溶液約２Ｌ
のうち８００ｍｌ（蛋白量２６９．７ｍｇ）についてＤ
ＥＡＥセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．
０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）を行い０．
１Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出される画分（蛋白量１２５ｍ
ｇ）を集める。同上限外濾過膜装置にて脱塩後、ＣＭセ
ルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍ酢
酸緩衝液、ｐＨ５．０）を行い、０．３Ｍ ＮａＣｌ溶
液で溶出される画分を回収した。この画分中に主成分と
してエキソグルカナーゼＳＴが含有しており、蛋白量は
７５ｍｇであった。この酵素液を７０μｇ／ｍｌの濃度
に調製した。

【００３０】（参考例２）〔Ｇ５生成酵素の調製〕 参考例１で得られた粗酵素溶液の８００ｍｌ（蛋白量２
６９．７ｍｇ）についてＤＥＡＥセルロファインカラム
クロマトグラフィー（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝
液、ｐＨ７．４）を行い、未吸着画分（蛋白量４１ｍ
ｇ）を集め、次いでＣＭセルロファインカラムクロマト
グラフィー（０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）を行
い、０．２Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出される画分を回収し
た。この画分中に主成分としてＧ５生成酵素が含有して
おり、蛋白量は３１ｍｇであった。この酵素液を１８０
μｇ／ｍｌの濃度に調製した。

【００３１】（実施例１）〔カードランよりラミナリト
リオースの製造〕 ２５ｍｌ容のサンプル瓶に、カードラン ５００ｍｇ、
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ ６．８）９ｍｌ、参考
例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５
００μｌ、及び参考例２で得られたＧ５生成酵素を１８
μｇ／１００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。
これを５５℃の恒温機中で反応させた。反応経時の糖変
化はＨＰＬＣ法により行った。

【００３２】〔ＨＰＬＣ条件〕 カラム：アミド−８０（４．６φ×２５０ｍｍ，トーソ
ー製） 溶媒 ：アセトニトリル：水＝６０：４０ 流速： １．０ｍｌ／ｍｉｎ． カラム温度：５０℃ 検出器：ＲＩ 反応１日目ではラミナリペンタオース（Ｇ５）、ラミナ
リテトラオース（Ｇ４）、ラミナリトリオース（Ｇ
３）、グルコースの４成分の生成が見られるが、反応１
５日目にはラミナリトリオースの生成量が２２．２ｍｇ
／ｍｌとグルコース２７．１ｍｇ／ｍｌのみの反応液が
得られた。この時のカードランからのラミナリトリオー
スの収率は４４．４％であった。この反応液８ｍｌを活
性炭カラム（ｖｏｌ．２５ｍｌ）に通過させ、蒸留水１
００ｍｌで洗浄した。洗浄液中にはグルコースが検出さ
れた。次いで１０％ｖ／ｖのエタノール溶液５０ｍｌで
吸着されたラミナリトリオースを溶出し、エバポレータ
でエタノールを留去後凍結乾燥した。得られたラミナリ
トリオースは純度９８％、収量１７５ｍｇ（カードラン
からの収率は４３．８％）であった。

【００３３】（実施例２）〔カードランよりラミナリト
リオースの製造〕 ２５ｍｌ容のサンプル瓶に、カードラン５００ｍｇ、
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）９ｍｌ、参考例
２で得られたＧ５生成酵素を１８μｇ／１００μｌ加え
た後、蒸留水で９．５ｍｌとした。これを５５℃の恒温
機中で１日反応させた。生成糖の変化を実施例１に示し
たＨＰＬＣによる方法で測定したところ、ラミナリペン
タオース（Ｇ５）が３０．１ｍｇ／ｍｌ生成されてい
た。この反応系に参考例１で得られたエキソグルカナー
ゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ添加して再び５５℃の恒
温機中で反応させたところ、反応１５日目にはラミナリ
トリオースとグルコースのみとなった。この反応液８ｍ
ｌを実施例１と同様に活性炭カラムクロマトグラフィー
を行い、純度９９％のラミナリトリオース１７０ｍｇ
（カードランからの収率は４２．５％）を得た。

【００３４】（実施例３）〔高度ラミナリオリゴ糖より
ラミナリトリオースの製造〕 ２５ｍｌ容のサンプル瓶に、ラミナリオリゴ糖（１０糖
３７％、１１糖６０％）２００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸
緩衝液（ｐＨ ６．０）９ｍｌ、参考例１で得られたエ
キソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ及び参考
例２で得られたＧ５生成酵素１８μｇ／１００μｌ加え
た後、蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機
中で反応させた。糖変化は実施例１と同様の方法で測定
した。反応２日目でグルコース、ラミナリトリオース及
びラミナリテトラオースがそれぞれ１２ｍｇ／ｍｌ、
２．７ｍｇ／ｍｌ及び２．７ｍｇ／ｍｌであった。その
後１０日目にはグルコース１４ｍｇ／ｍｌとラミナリト
リオース３．８ｍｇ／ｍｌとなった。この反応液８ｍｌ
を実施例１と同様の方法で活性炭クロマトを行い、純度
９９％のラミナリトリオース２８．２ｍｇ（ラミナリオ
リゴ糖からの収率は１７．６％）を得た。

【００３５】（実施例４）〔パキマンよりラミナリトリ
オースの製造〕 ２５ｍｌ容のサンプル瓶に、パキマン（ブクリョウより
常法にて調製）５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ６．８）９ｍｌ、参考例１で得られたエキソグル
カナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ及び、参考例２で
得られたＧ５生成酵素１８μｇ／１００μｌ加えた後、
蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で反
応させた。糖変化をＨＰＬＣにて測定したところ、反応
１５日目でラミナリトリオースとグルコースのみの反応
液が得られ、ラミナリトリオースの生成量は１１．５ｍ
ｇ／ｍｌであった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様
の方法で活性炭クロマトを行い、純度９８．２％のラミ
ナリトリオース９０ｍｇ（パキマンからの収率は２２．
５％）を得た。

【００３６】（実施例５）〔酵母細胞壁よりラミナリト
リオースの製造〕 ２５ｍｌ容のサンプル瓶に、酵母細胞壁（パン酵母より
常法にて調製）５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ６．８）９ｍｌ、参考例１で得られたエキソグル
カナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ及び、参考例２で
得られたＧ５生成酵素１８μｇ／１００μｌ加えた後、
蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で反
応させた。糖変化をＨＰＬＣにて測定したところ、反応
１５日目でラミナリトリオースとグルコースのみの反応
液が得られ、ラミナリトリオースの生成量は４．８ｍｇ
／ｍｌであった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様の
方法で活性炭クロマトを行い、純度９９％のラミナリト
リオース３７．５ｍｇ（酵母細胞壁からの収率は９．４
％）を得た。

【００３７】（比較例１）〔ラミナリペンタオースより
ラミナリトリオースの製造〕 ２５ｍｌ容のサンプル瓶にラミナリペンタオース ５０
０ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）９ｍ
ｌ、実施例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５
μｇ／５００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。
これを５５℃の恒温機で反応させた。糖変化は実施例１
と同様の方法で測定したところ、反応１５日目でまだラ
ミナリテトラオース（Ｇ４）が１．４ｍｇ／ｍｌ存在し
ており、結局ラミナリテトラオースが消滅するまで反応
２４日目を要した。そのときラミナリトリオースとグル
コースの生成量は２５．３ｍｇ／ｍｌと２２．３ｍｇ／
ｍｌであった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様の方
法で活性炭クロマトを行い、純度９９％のラミナリトリ
オース１９５ｍｇ（ラミナリペンタオースからの収率は
４８．８％）を得た。

【００３８】

【発明の効果】本発明の製造法によると、従来の酸によ
る加水分解と比べ、反応系内にオリゴ糖成分としてグル
コースとラミナリトリオース以外は存在しないため、オ
リゴ糖同士を分離する煩雑な精製方法を行う事なく、簡
便な精製法で高純度のラミナリトリオースを得ることが
出来る。また、エキソ型分解酵素とオリゴ糖分解酵素を
併用することにより、エキソ型分解酵素のみを使用した
場合に比べて、速やかにラミナリトリオースを得る事が
できる。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル
   糖化合物に、これらの糖化合物に作用してグルコースを
   遊離させる能力を有するエキソ型β−１，３グリコシル
   糖分解酵素、及び糖鎖が４糖以上のオリゴ糖を遊離させ
   る能力を有するβ−１，３グリコシル糖分解酵素を作用
   させて得られることを特徴とするラミナリトリオースの
   製造法。
2. 【請求項２】 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル
   糖化合物に作用して４糖以上のオリゴ糖を遊離させるβ
   −１，３グリコシル糖分解酵素がラミナリペンタオース
   を遊離させるβ−１，３グルコシル糖分解酵素である請
   求項１に記載の製造法。
3. 【請求項３】 エキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵
   素がストレプトマイセス属より得られたものである請求
   項２に記載の製造法。
4. 【請求項４】 エキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵
   素がストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８菌
   株（微工研条寄第２５３号）より得られたものである請
   求項３記載の製造法。
5. 【請求項５】 エキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵
   素及び４糖以上のオリゴ糖を遊離させる能力を有するβ
   −１，３グリコシル糖分解酵素がストレプトマイセス属
   より得られたものである請求項１に記載の製造法。
6. 【請求項６】 エキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵
   素及び４糖以上のオリゴ糖を遊離させる能力を有するβ
   −１，３グリコシル糖分解酵素がストレプトマイセス・
   エスピー ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３
   号）より得られたものである請求項５記載の製造法。
7. 【請求項７】 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル
   糖化合物が、β−１，３グリコシル糖を主鎖又は側鎖に
   有するオリゴ糖又は多糖である請求項１〜６のいずれか
   １に記載の製造法。
8. 【請求項８】 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル
   糖化合物がβ−１，３グリコシル糖鎖のみからなるオリ
   ゴ糖又は多糖である請求項１〜６のいずれか１に記載の
   製造法。
9. 【請求項９】 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル
   糖化合物がカードラン、パキマン、ラミナリオリゴ糖又
   は酵母細胞壁である請求項７記載の製造法。
10. 【請求項１０】 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシ
    ル糖化合物がカードランである請求項９記載の製造法。