JPH0523183A - 新規なα−ガラクトシダーゼ及びそれを用いた糖類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 工業的に有利に生産できる菌体外分泌型の新
規なα−ガラクトシダーゼと、この酵素を用いてガラク
トマンナンからマンノオリゴ糖、マンノース、ガラクト
ース等の糖類を効率的に製造する方法を提供する。 【構成】 バチルス・ステアロサーモフィラス JD-72株
（Bacillus stearothermophilus JD-72 、微工研菌寄第
12274 号）を培養して、α−ガラクトシダーゼを菌体外
に生産させ、培養上清中からα−ガラクトシダーゼを採
取する。ガラクトマンナンに、このα−ガラクトシダー
ゼと、マンナナーゼ及び／又はマンノシダーゼとを作用
させて、マンノオリゴ糖、マンノース、ガラクトース等
の糖類を生産させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なα−ガラクトシ
ダーゼと、この酵素を用いてガラクトマンナンからマン
ノオリゴ糖、マンノース、ガラクトース等の糖類を製造
する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、低う蝕性であり、腸内菌叢を改善
する等の機能を有する機能性食品として各種のオリゴ糖
が注目されている。これらのうち、β−ガラクトシダー
ゼの転移反応を利用して製造されるβ−ガラクトオリゴ
糖はすでに市販されている。これは、β−ガラクトシダ
ーゼは、工業的に容易に、効率よく、安価に製造するこ
とができるからである。

【０００３】一方、ガラクトマンナンは、例えばイナゴ
マメやグアーの種子に含まれる粘質物、すなわちローカ
ストビーンガム、グアーガムなどとして得られ、天然界
に比較的多量に存在する。このガラクトマンナンは、澱
粉と同様に、そのまま、又は化学的改質処理を施した
後、糊料、増粘剤、食品材料等として、繊維、化粧品、
食品、農薬等の各分野において広く利用されている。

【０００４】ところで、ガラクトマンナンを効率よく加
水分解する酵素が得られれば、これを分解してマンノオ
リゴ糖、マンノース、ガラクトース等の糖類とし、これ
らの糖類をより付加価値の高い製品に利用することがで
き、また、ガラクトマンナン自体として利用した後に、
これを分解、除去するという分野にも応用できる。

【０００５】このような目的に沿って、近年、β−マン
ナナーゼ及びβ−マンノシダーゼが開発され、既に工業
化されようとしている（特開昭63-56289号、 特開昭63-3
6779号、特開昭63-49093号参照）。

【０００６】しかしながら、ガラクトマンナンは、マン
ノースがβ-1,4結合した主鎖に、ガラストースがα-1,4
結合した側鎖を有する構造をなすので、上記のようなβ
−マンナナーゼやβ−マンノシダーゼを作用させたと
き、側鎖の近傍で反応が中断されてしまい、分解効率、
経済性の観点からは満足の行くものではなかった。

【０００７】このような観点から、本発明者らは、ガラ
クトマンナンに、マンナンの主鎖を実質的に分解するこ
となく、側鎖のガラクトースを遊離させることができる
酵素を作用させれば、マンノオリゴ糖、マンノース、ガ
ラクトースなどの糖類を効率よく回収、利用することが
できると考えた。

【０００８】このような酵素としては、α−ガラクトシ
ダーゼが考えられる。α−ガラクトシダーゼは、メリビ
オース、ラフィノース、スタキオースなどのα−Ｄ−ガ
ラクトシドに作用し、これを加水分解してガラクトース
を遊離する酵素である。

【０００９】これまでに知られているα−ガラクトシダ
ーゼは、植物、細菌、酵母及び高等動物臓器由来のもの
である。これらのうち、糸状菌、放線菌、バクテリア由
来のα−ガラクトシダーゼは、従来より甜菜糖工業にお
いて自家生産され、甜菜より抽出した糖液中に含まれる
ラフィノースの分解に用いられてきた。

【００１０】また、後述するように、バチルス・ステア
ロサーモフィラスに属し、α−ガラクトシダーゼ生産能
を有する菌株についての報告もいくつかなされている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記し
たα−ガラクトシダーゼは、いずれもα−Ｄ−ガラクト
シダーゼ力価が低く、培養法、精製法が煩雑なものが多
く、工業的に安価に生産することは困難であるという問
題を有し、したがってその用途も、甜菜糖工業以外には
研究用に若干用いられているにすぎなかった。

【００１２】また、前記バチルス・ステアロサーモフィ
ラスに属し、α−ガラクトシダーゼ生産能を有する菌株
は、そのほとんどが、α−ガラクトシダーゼを菌体内に
生産するものであり、培養物から酵素を容易に分離精製
することができず、工業的な利用には適していなかっ
た。

【００１３】したがって、本発明の目的は、工業的に有
利に生産できる菌体外分泌型の新規なα−ガラクトシダ
ーゼと、この酵素を用いてガラクトマンナンからマンノ
オリゴ糖、マンノース、ガラクトース等の糖類を効率的
に製造する方法を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明者らは、工業的に有利な菌体外分泌型で力価
の高いα−ガラクトシダーゼを生産する微生物を得るべ
く広く天然界を検索した結果、静岡県函南町畑毛温泉の
源泉付近の土壌中から採取したバチルス属に属するある
種の微生物が、上記要件を備えた新規なα−ガラクトシ
ダーゼを量産性よく産生することを見出し、本発明を完
成するに至った。

【００１５】すなわち、本発明の新規なα−ガラクトシ
ダーゼは、下記の理化学的性質を有することを特徴とす
る。

【００１６】（イ）作用：メリビオース、ラフィノー
ス、スタキオースなどのオリゴ糖及びガラクトマンナン
など側鎖にガラクトシル基を有するヘテロ多糖類の側鎖
に存在するガラクトピラノシド結合を特異的に加水分解
し、ガラクトースを生成する。

【００１７】（ロ）基質特異性：メリビオースを完全に
分解し、ラフィノース、スタキオースなど非還元末端に
ガラクトースを含むオリゴ糖に作用しガラクトースを遊
離する。ｐ−ニトロフェニル−グルコシドのα−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドを基質となし得るが、β−Ｄ−ガラク
トピラノシド、α−Ｌ−アラビノピラノシド、α−及び
β−Ｄ−グルコシド、α−及びβ−Ｄ−キシロシド、α
−及びβ−Ｌ−フコシド、β−Ｄ−フコシド、α−及び
β−Ｄ−マンノシドを基質となし得ない。

【００１８】（ハ）至適pH及び安定pH範囲：至適pHは6.
0 であり、45℃、20分間の加熱条件下ではpH６〜８の範
囲内で安定である。

【００１９】（ニ）温度に対する安定性：pH7.0 、20分
間の加熱条件下では45℃まで安定である。

【００２０】（ホ）作用適温の範囲：55℃近傍に至適作
用温度を有する。

【００２１】（ヘ）失活条件：45℃、20分間の処理条件
下では、pH3.0 及び10.0で完全に失活する。また、pH7.
0 、20分間の処理では、70℃で完全に失活する。

【００２２】（ト）阻害及び活性化：塩化第二水銀及び
鉛、亜鉛、銅、第一鉄、ｐ−クロロマーキュリベンゾエ
ート、Ｎ−ブロモサクシニミドにより阻害を受ける。

【００２３】（チ）等電点電気泳動による等電点： 5.
6

【００２４】（リ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量： 約80,000

【００２５】また、本発明の糖類の製造法は、ガラクト
マンナンに、上記のα−ガラクトシダーゼと、β−マン
ナナーゼ及び／又はβ−マンノシダーゼとを作用させる
ことを特徴とする。

【００２６】以下、本発明について好ましい態様を挙げ
て更に詳細に説明する。

【００２７】本発明のα−ガラクトシダーゼは、本発明
者らによって静岡県函南町畑毛温泉の源泉付近の土壌中
から新たに分離された新規な微生物である、バチルス・
ステアロサーモフィラス JD-72株によって生産される。
この菌株は、α−ガラクトシダーゼを菌体外に生産する
能力を有している。

【００２８】このバチルス・ステアロサーモフィラス J
D-72株の菌学的諸性質は、以下の通りである。

【００２９】 １．形態学的性質 形状 桿菌 サイズ 0.8 〜1.2 ×3.0 〜4.0 運動性 有り（周鞭毛） グラム染色 陽性 胞子嚢 膨らまないか僅かに膨らんでいる 胞子の形 楕円形で末端 胞子のサイズ 0.8 〜1.0 ×1.7 〜2.0

【００３０】 ２．各種培地での生育 肉汁寒天平板培養 白色を呈し、円形状の集落を形成。表 面の***は偏平状。周縁は糸状。 肉汁寒天斜面培養 拡布状に生育 肉汁ゼラチン穿刺培養 液化しない グルコース肉汁液体培地による 嫌気的生育 − 硝酸塩からの嫌気的ガスの生成 − 5.0 ％食塩肉汁液体培地 − 7.5 ％食塩肉汁液体培地 −

【００３１】３．生化学的性質 ゼラチンとカゼインの加水分解 − 澱粉の加水分解 ＋ クエン酸の利用 − 硝酸塩の還元 ＋ ＶＰ−テスト − インドールの生成 − 硫化水素 ＋ 無機窒素源の利用 ＋ 色素の生成 − ウレアーゼ ＋ オキシダーゼ − カタラーゼ ＋ 酸素に対する態度 好気

【００３２】４．生育のpHと温度 生育pH 5.0 〜8.0 生育温度 30〜70℃

【００３３】５．糖の資化 Ｌ−アラビノース、Ｌ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトー
ス、マルトース、蔗糖、乳糖、メリビオース、ラフィノ
ース、澱粉、グリセリンを資化する。また、Ｌ−アラビ
ノース、Ｌ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノ
ース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトースから酸を生
成し、ガスは生成しない。

【００３４】 ６．ＧＣ含量 52.4％

【００３５】なお、上記２、３の項目において、＋は生
育する又は陽性、−は生育しない又は陰性を表わす。

【００３６】この菌株を、バージェーズ マニュアル
オブ システマチック バクテリオロジー（Bergey's M
annual of Systematic Bacteriology)、第１版、及びザ
・ジーナス・バチルス［The Genus Bacillus: 米国農務
省（Dept.of Agriculture)刊行］に従って同定すると、
好気性有胞子桿菌であり、運動性があり、周鞭毛を有
し、グラム染色陽性であることから、バチルス属（Baci
llus sp.) に属することが明らかとなった。また、カタ
ラーゼ陽性、Ｖ−Ｐ反応陰性で、65℃以上で生育するこ
とから、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus
stearothermophilus) と同定された。

【００３７】一方、α−ガラクトシダーゼ生産能を有す
るバチルス・ステアロサーモフィラスとしては、これま
でにも次のものが報告されている。 ＳＢＴＦ株 「J.Delente et al, Biotech. Bioeng.,16, 1227-1243
(1974)」 ＡＴ−７株 「D.M.Pederson et al, Canadian J.Microbiol., 26, 9
78-984(1980)」 ＫＶＥ３９株 「C.Ganter et al, J.Biotechnol., 8, 301-310(1988)
」 （ＡＴＣＣ）株 「G.Talbot et al, Appl. Environ. Microbiol., 56, 3
505-3510(1990)」

【００３８】しかしながら、上記〜の菌株は、α−
ガラクトシダーゼを菌体内に生産するのに対し、本発明
者らが分離した上記菌株は、α−ガラクトシダーゼを菌
体外に生産する点で異なっている。また、上記の菌株
は、α−ガラクトシダーゼとともに、β−マンナナーゼ
を生産するが、上記菌株は、β−マンナナーゼを生産し
ない点で異なっている。上記の菌株は、α−ガラクト
シダーゼとともに、β−マンナナーゼを生産するので、
粗酵素として使用する場合、両酵素が同時に存在するこ
とにより、使用量のコントロールが難しいという欠点が
ある。

【００３９】以上の検討結果により、上記菌株は、バチ
ルス・ステアロサーモフィラスに属する新菌株であると
判断された。この菌株は、工業技術院微生物工業技術研
究所に、「Bacillus stearothermophilusJD-72 」、微
工研菌寄第12274 号として寄託されている。

【００４０】本発明のα−ガラクトシダーゼは、上記の
バチルス・ステアロサーモフィラスJD-72株を培養し、
この培養物から採取することができる。

【００４１】培養を行なう培地は、炭素源と、窒素源
と、必要に応じて無機塩、微量栄養素等とを含むものが
好ましい。

【００４２】炭素源としては、ガラクトース、アラビノ
ース、乳糖が好ましく、そのほか、玉蜀黍種子外皮及び
そのアルカリ抽出物、グアガム部分分解物、コプラミー
ル等も用いることができる。

【００４３】また、窒素源としては、酵母エキス、コー
ンスティープリカー、脱脂大豆粉等が好ましく用いられ
る。なお、有機態窒素源は炭素源にもなることは言うま
でもない。

【００４４】更に、必要に応じて添加される無機塩、微
量栄養素等としては、一般に使用されている各種のもの
を用いることができ、例えば、マグネシウム塩、カリウ
ム塩、燐酸塩、鉄塩等の無機塩、ビタミン等を用いるこ
とができる。

【００４５】上記成分を含有する培地として、具体的に
は、例えば、１％の乳糖、２％の脱脂大豆粉、0.2 ％の
K₂HPO₄、及び0.02％のMgSO₄・7H₂Oを含有する液体培地を
用いることができる。

【００４６】培養は、バッチ式、連続式のいずれの方法
によっても行なうことができる。

【００４７】上記のような培地は、pHを5.0 〜7.5 、好
ましくは6.5 〜7.0 に調整した後、バチルス・ステアロ
サーモフィラス JD-72株を接種し、37〜60℃、好ましく
は45℃付近の温度下に、72時間前後、好気的に培養する
のが好ましい。このようにして培養すると、培養液中
に、菌体外分泌型酵素として、α−ガラクトシダーゼが
生成、蓄積される。

【００４８】生成、蓄積されたα−ガラクトシダーゼの
分離・精製は、例えば以下のようにして実施することが
できる。

【００４９】まず、培養液中の菌体を、遠心分離、濾過
等の公知の手段により菌体と濾液とに分離する。

【００５０】こうして得られた濾液には、α−ガラクト
シダーゼが含まれており、この濾液をそのまま、マンノ
オリゴ糖の加水分解反応、ガラクトオリゴ糖の転移反応
などに使用することも可能であり、これは経済的に有利
である。

【００５１】また、上記濾液からα−ガラクトシダーゼ
を更に精製することもでき、その方法としては、例え
ば、硫安による塩析、エタノール、アセトン、イソプロ
パノール等による溶媒沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過
法、イオン交換樹脂等による一般的な酸素精製法等が採
用される。

【００５２】本発明のα−ガラクトシダーゼは、より具
体的には、次のような方法によって製造することができ
る。

【００５３】バチルス・ステアロサーモフィラス JD-72
株を、前述した液体培地に植菌し、45℃で、72時間好気
的に培養して得られる培養液を、４℃で、10,000g ×20
分間遠心分離して菌体を除き、上澄み液を得る。次い
で、この上澄み液に、硫酸アンモニウムを加えて90％飽
和とし、４℃で、一夜放置して塩析を行う。生じた沈殿
を、遠心分離して集め、pH7.0 の20mM燐酸緩衝液に溶解
させ、４℃で、一夜、上記と同じ緩衝液に対して透析す
る。

【００５４】透析により生じた沈殿を、遠心分離して除
き、上澄み液を、前記と同様の燐酸緩衝液で平衡化した
「DEAE−トヨパール650M」（商品名、東ソー株式会社
製）に吸着させた後、０〜0.5Mの塩化ナトリウムを含有
する前記と同様の燐酸緩衝液の濃度勾配法によって、酵
素を溶出させる。

【００５５】上記で溶出した活性画分を集め、この画分
を平均分画分子量10,000の限外濾過膜を用いて濃縮し、
0.2Mの塩化ナトリウムを含む前記と同様の燐酸緩衝液で
平衡化した「セファクリルS-300HR 」（商品名、ファル
マシア株式会社製）に充填し、溶出する。得られた活性
画分を、再度、「DEAE−トヨパール650M」及び「セファ
クリルS-300HR 」で処理した後、活性画分を濃縮し、次
いで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にかけて、均
一なバンドからなる精製酵素を得る。

【００５６】本発明において、α−ガラクトシダーゼ活
性の測定法及び活性表示法は、以下の通りである。

【００５７】2mM のｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラ
クトピラノシドを含むpH6.0 の50mMの燐酸緩衝液1.0mL
（ミリリットル）に、酵素液50μL （マイクロリット
ル）を混合し、50℃で、10分間反応させた後、0.2Mの炭
酸ナトリウム水溶液1.0mL を添加して酵素を失活させ、
反応を停止する。得られた溶液の着色度を、１μmol/mL
のｐ−ニトロフェノールを標準として、波長420nm の紫
外光により測定する。

【００５８】また、酵素活性の単位は、上記条件下で、
１分間に１μmol のｐ−ニトロフェノールを遊離させる
酵素量を１単位として表示する。

【００５９】こうして得られた本発明のα−ガラクトシ
ダーゼは、前述したような理化学的性質を有しており、
これまでに報告されているα−ガラクトシダーゼのいず
れとも相違し、新規な酵素であると判断された。因み
に、本発明のα−ガラクトシダーゼと、前述した（ＡＴ
ＣＣ）株が生産するα−ガラクトシダーゼとを比較する
と表１に示す通りである。

【００６０】

【表１】 （なお、表中、pNP-α-Galは、ｐ−ニトロフェニル−α
−Ｄ−ガラクトピラノシドを意味する。）

【００６１】次に、本発明の糖類の製造法は、ガラクト
マンナンに、上記のα−ガラクトシダーゼと、β−マン
ナナーゼ及び／又はマンノシダーゼとを反応させて、マ
ンノオリゴ糖、マンノース、ガラクトースなどの糖類を
製造する方法である。

【００６２】ガラクトマンナンにα−ガラクトシダーゼ
を作用させると、マンノースの側鎖となっているガラス
トースを遊離させることができる。そして、β−マンナ
ナーゼを作用させると、マンナンの主鎖がいくつかの分
子量単位にランダムに分解されて、マンノースが２〜９
分子連結されたマンノオリゴ糖が生成される。また、β
−マンノシダーゼを作用させると、マンナンの主鎖が端
から１分子ずつ分解されて、マンノースが生成される。

【００６３】したがって、マンノオリゴ糖を得たい場合
には、α−ガラクトシダーゼと、マンナナーゼとを作用
させることが好ましく、マンノースを得たい場合には、
α−ガラクトシダーゼとマンノシダーゼとを作用させる
か、あるいはα−ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ及
びマンナナーゼを作用させることが好ましい。これらの
酵素は、反応系に全てを同時に添加して反応させてもよ
いが、最初にα−ガラクトシダーゼを反応させ、次いで
β−マンナナーゼ及び／又はマンノシダーゼを反応させ
てもよい。

【００６４】本発明において、β−マンナナーゼとして
は、特開昭63-56289号に開示された酵素が好ましく用い
られる。また、β−マンノシダーゼとしては、特開昭63
-36779号に開示された酵素が好ましく用いられる。これ
らの酵素の調製方法については、上記公報に詳細に説明
されているので、その説明を省略する。

【００６５】基質をなすガラクトマンナンとしては、例
えばローカストビーンガム、グアガムなど、各種植物由
来のものを利用することができる。反応液中における基
質濃度は、特に限定されないが、１〜100mg/mLとするこ
とが好ましい。

【００６６】反応液中の各酵素の濃度は、基質１g に対
して、α−ガラクトシダーゼについては10〜1000 U（単
位）、β−マンナナーゼについては100 〜10000 U 、β
−マンノシダーゼについては100 〜10000 U が好まし
い。

【００６７】また、反応液のpHは５〜７が好ましく、反
応温度は40〜60℃が好ましく、反応時間は１〜72時間が
好ましい。

【００６８】こうして酵素反応を行わせた後、例えば脱
色、脱塩、各種カラムによる分画処理、濃縮、乾燥など
の常法によって処理することにより、マンノオリゴ糖、
マンノース、ガラクトースなどの糖類を、個別にあるい
は混合した状態で、濃縮液、粉末などとして得ることが
できる。

【００６９】

【作用】本発明のα−ガラクトシダーゼは、菌体外に生
産されるので、酵素の分離、精製が極めて容易であり、
労力、製造コストの点で、工業的に非常に有利である。
また、この酵素は、高温安定性に優れ、ほぼ中性領域に
酵素反応の至適pHを有するので、希アルカリで抽出され
たガラクトマンナン液に対し、わずかなpH調節を施した
後、次の分解反応に移行することができる。更に、この
酵素は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ力価が高く、メリビ
オース、ラフィノース、スタキオースなどのオリゴ糖、
及びガラクトマンナンなど側鎖にガラクトシル基を有す
るヘテロ多糖類の側鎖に存在するガラクトピラノシド結
合を特異的に加水分解し、ガラクトースを生成するの
で、各種糖類の製造に応用することができる。

【００７０】また、本発明の糖類の製造方法によれば、
ガラクトマンナンにα−ガラクトシダーゼを作用させる
ことにより、ガラクトマンナンの側鎖のガラクトースを
遊離させることができる。そして、α−ガラクトシダー
ゼとともに、β−マンナナーゼを作用させると、マンナ
ンの主鎖がいくつかの分子量単位にランダムに分解され
て、マンノオリゴ糖が生成され、また、β−マンノシダ
ーゼを作用させると、マンナンの主鎖が端から１分子ず
つ分解されて、マンノースが生成される。この場合、α
−ガラクトシダーゼにより側鎖であるガラクトースが遊
離されるので、β−マンナナーゼやβ−マンノシダーゼ
が立体障害を受けることなく、ガラクトマンナンを効率
よく分解することが可能となる。

【００７１】

【実施例】

実施例１ 乳糖1.0 ％、酵母エキス1.0 ％、燐酸二カリウム（無水
塩）0.1 ％、硫酸マグネシウム（７水塩）0.02％を含む
液体培地250mL を、２Ｌ（リットル）容の三角フラスコ
に入れ、バチルス・ステアロサーモフィラス JD-72株を
植菌し、45℃で、72時間、180 回転／分で回転振盪培養
した。

【００７２】次いで、この培養液を、４℃で、10,000ｇ
×20分間遠心分離して菌体を除去し、培養上澄み液を回
収した。得られた上澄み液のα−ガラクトシダーゼの活
性を測定した結果、14.6単位/mL であった。

【００７３】この上澄み液に、硫酸アンモニウムを加え
て90％飽和とし、４℃で、一夜放置して沈殿を生じさせ
た。この沈殿を、遠心分離して集め、pH7.0 の20mM燐酸
緩衝液に溶解させ、４℃で、一夜、上記と同じ緩衝液に
対して透析した。

【００７４】透析により生じた沈殿を、遠心分離して除
き、上澄み液を、前記と同様の燐酸緩衝液で平衡化した
「DEAE−トヨパール650M」（商品名、東ソー株式会社
製）に吸着させた後、０〜0.5Mの塩化ナトリウムを含有
する前記と同様の燐酸緩衝液の濃度勾配法によって、酵
素を溶出させた。

【００７５】上記で溶出した活性画分を集め、平均分画
分子量10,000の限外濾過膜を用いて濃縮し、0.2Mの塩化
ナトリウムを含む前記と同様の燐酸緩衝液で平衡化した
「セファクリルS-300HR 」（商品名、ファルマシア株式
会社製）に充填し、溶出した。得られた活性画分を、再
度、「DEAE−トヨパール650M」及び「セファクリルS-30
0HR 」で処理した後、活性画分を濃縮し、次いで、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により、均一なバンドか
らなる酵素標品0.624mg を得た。活性収率は4.8 ％であ
った。

【００７６】実施例２ 実施例１で得られた酵素標品を用いて、その作用に関す
る実験を行った。 （１）各種多糖類に対する作用 起源を異にする各種の多糖類の1.0 ％水溶液（pH6.0 ）
１mLに、実施例１で得た精製α−ガラクシトダーゼを3.
3 単位添加し、50℃で24時間反応させ、その後、100 ℃
で３分間加熱失活し、遊離されたガラクトースを、乳糖
／ガラクトース分析用Ｆキット（ベーリンガーマンハイ
ム社製）を用いて定量した。その結果を表２に示す。

【００７７】

【表２】

【００７８】表２の結果から、この酵素は、ガラクトマ
ンナンなど側鎖にガラクトシル基を有するヘテロ多糖類
の側鎖に存在するガラクトピラノシド結合を特異的に加
水分解し、ガラクトースを生成することがわかる。

【００７９】（２）基質特異性 ２mMの各種ｐ−ニトロフェニル誘導体、あるいは10mMの
各種糖液を含む50mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.0)１mL
に0.16単位のα−ガラクトシダーゼを添加し、50℃で10
分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノ
ールあるいはガラクトースを定量し、比較した。各種合
成基質について測定した結果を表３に示す。また、その
中で基質となり得たもの及び天然少糖類について反応速
度を測定した結果を表４に示す。

【００８０】

【表３】

【００８１】

【表４】

【００８２】（３）至適pH及び安定pH範囲 各pHの50mM緩衝液に溶解させた２mMのpNP-α-D- ガラク
トピラノシドに、本発明の精製酵素液50μL を混合し、
前述した方法で活性測定し、最大活性を100 とする相対
活性を求めた。この結果を図１左欄に示す。なお、使用
した緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液（〜pH6.0 ）、燐
酸ナトリウム緩衝液（pH6.0 〜8.0 ）、グリシン−NaCl
−NaOH緩衝液（pH8.0 〜）である。

【００８３】また、pH4.0 〜10.0の範囲で前記の緩衝液
を用いて、各pHで45℃、20分間の加熱処理を行い、その
残存活性を測定し、前記と同様に最大活性を100 とする
相対活性を求めた。この結果を図１右欄に示す。

【００８４】（４）作用適温の範囲及び温度に対する安
定性 精製酵素の活性をpH6.0 において各温度で測定した。こ
の結果を図２左欄に示す。

【００８５】また、精製酵素を40〜80℃の各温度で、pH
7.0、20分間の加熱処理後の残存活性を測定した。この
結果を図２の右欄に示す。

【００８６】（５）阻害及び活性化 20mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH7.0 ）に溶解した精製酵素液
に、終濃度0.01〜１mMとなるように各種金属の塩化物を
添加し、20℃で20分間処理後、その活性を測定し、無添
加時の活性を100 として相対活性を求めた。この結果を
表５に示す。

【００８７】同様に、各種酵素阻害剤について測定した
結果を表６に示す。

【００８８】

【表５】

【００８９】

【表６】

【００９０】（６）等電点 セルバ社製セルバライトプレコート（ＰＩ ３〜10）を
用いる等電点電気泳動法により、本発明のα−ガラクト
シダーゼの等電点を求めた。この結果は、図３に示す通
りであり、5.6 であった。

【００９１】（７）分子量 第一化学薬品製のＳＤＳ−ＰＡＧプレート（４／２０）
を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分子量を求めた。この結果は、図４に示す通りであ
り、約80,000であった。

【００９２】実施例３ １％のガラクトマンナン溶液（pH6.0 ）に、市販工業用
マンナナーゼ（ノボ社製、商品名「ガマナーゼ」）5,00
0 VHCU/g-ds 及び本発明のα−ガラクトシダーゼ100 U/
g-dsを添加し、50℃で48時間反応させた。反応液に少量
の活性炭を加えて煮沸し、0.45μｍのメンブレンフィル
ターで濾過し、サンプルとした。バイオラッド社製の高
速液体クロマトグラフィー用カラム（商品名「アミネッ
クスＨＰＸ４２Ａ」）を用いて、上記サンプルの糖組成
を分析した。

【００９３】ガラクトマンナンとしてローカストビーン
（イナゴマメ）ガム及びグアガムを用い、それぞれ本発
明のα−ガラクトシダーゼを添加した場合としなかった
場合の比較を行った結果を、表７、８に示す。

【００９４】

【表７】

【００９５】

【表８】

【００９６】表７、８に示されるように、ガラクトマン
ナンに、マンナナーゼとともに、本発明のα−ガラクト
シダーゼを添加すると、α−ガラクトシダーゼを添加し
た場合に比べて、ガラクトース、マンノース、分子数２
〜４のマンノオリゴ糖などの糖類の生成量が増大するこ
とがわかる。

【００９７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明のα−ガラ
クトシダーゼは、菌体外分泌型の酵素であるため、酵素
の分離、精製が極めて容易であり、工業的生産に適して
いる。また、この酵素は、α-D- ガラクトシダーゼ力価
が高く、高温安定性に優れており、ほぼ中性領域に酵素
反応の至適pHを有するので、希アルカリで抽出されたガ
ラクトマンナン液に対して、わずかなpH調節を施した
後、次の分解反応に移行できるなど、優れた特性を有し
ている。また、本発明の糖類の製造法によれば、ガラク
トマンナンの側鎖であるガラクトースをα−ガラクトシ
ダーゼで遊離させるとともに、マンナナーゼやマンノシ
ダーゼを作用させるので、ガラクトマンナンを効率的に
分解して、マンノオリゴ糖、マンノース、ガラクトース
などの糖類の生成量を増大させることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のα−ガラクトシダーゼの至適pH及び安
定pH範囲を示す図である。

【図２】本発明のα−ガラクトシダーゼの作用適温の範
囲及び温度に対する安定性を示す図である。

【図３】本発明のα−ガラクトシダーゼの等電点電気泳
動法による等電点測定結果を示す図である。

【図４】本発明のα−ガラクトシダーゼのＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動による分子量測定の結果を
示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の理化学的性質を有することを特徴
   とする新規なα−ガラクトシダーゼ。 （イ）作用：メリビオース、ラフィノース、スタキオー
   スなどのオリゴ糖及びガラクトマンナンなど側鎖にガラ
   クトシル基を有するヘテロ多糖類の側鎖に存在するガラ
   クトピラノシド結合を特異的に加水分解し、ガラクトー
   スを生成する。 （ロ）基質特異性：メリビオースを完全に分解し、ラフ
   ィノース、スタキオースなど非還元末端にガラクトース
   を含むオリゴ糖に作用しガラクトースを遊離する。ｐ−
   ニトロフェニル−グルコシドのα−Ｄ−ガラクトピラノ
   シドを基質となし得るが、β−Ｄ−ガラクトピラノシ
   ド、α−Ｌ−アラビノピラノシド、α−及びβ−Ｄ−グ
   ルコシド、α−及びβ−Ｄ−キシロシド、α−及びβ−
   Ｌ−フコシド、β−Ｄ−フコシド、α−及びβ−Ｄ−マ
   ンノシドを基質となし得ない。 （ハ）至適pH及び安定pH範囲：至適pHは6.0 であり、45
   ℃、20分間の加熱条件下ではpH６〜８の範囲内で安定で
   ある。 （ニ）温度に対する安定性：pH7.0 、20分間の加熱条件
   下では45℃まで安定である。 （ホ）作用適温の範囲：55℃近傍に至適作用温度を有す
   る。 （ヘ）失活条件：45℃、20分間の処理条件下では、pH3.
   0 及び10.0で完全に失活する。また、pH7.0 、20分間の
   処理では、70℃で完全に失活する。 （ト）阻害及び活性化：塩化第二水銀及び鉛、亜鉛、
   銅、第一鉄、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、Ｎ−
   ブロモサクシニミドにより阻害を受ける。 （チ）等電点電気泳動による等電点： 5.6 （リ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
   分子量： 約80,000
2. 【請求項２】 バチルス・ステアロサーモフィラス JD-
   72株 (Bacillus stearothermophilus JD-72 、微工研菌
   寄第12274 号）により生産された菌体外分泌型酵素であ
   る請求項１記載の新規なα−ガラクトシダーゼ。
3. 【請求項３】 ガラクトマンナンに、請求項１記載のα
   −ガラクトシダーゼと、β−マンナナーゼ及び／又はβ
   −マンノシダーゼとを作用させることを特徴とする糖類
   の製造法。