JPH0725898A - 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ26k及びその製造法 - Google Patents
均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ26k及びその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新しいタイプのヒト免疫インターフエロンの
サブタイプ及びその製造法が提供される。 【構成】 ヒト免疫インターフエロンを産生する細胞の
培養液を、ガラス吸着剤によるカラムクロマトグラフィ
ー、限外濾過及びイオン交換カラムクロマトグラフィー
に付すことにより26,000ダルトンの分子量を有す
る新しいタイプのヒト免疫インターフエロンが得られ
る。
サブタイプ及びその製造法が提供される。 【構成】 ヒト免疫インターフエロンを産生する細胞の
培養液を、ガラス吸着剤によるカラムクロマトグラフィ
ー、限外濾過及びイオン交換カラムクロマトグラフィー
に付すことにより26,000ダルトンの分子量を有す
る新しいタイプのヒト免疫インターフエロンが得られ
る。
Description
【0001】各種タイプのヒトインターフェロンの中
で、免疫インターフェロン(IFN−γ)は最も特徴付
けされていない。このインターフェロンはリンパ球をマ
イトジエン(有糸***誘発因子)または特異抗原で刺戟
することにより生産されるものであって、ウイルス誘発
α−およびβ−インターフェロンとはその構造および性
質が重大に異なっている。
で、免疫インターフェロン(IFN−γ)は最も特徴付
けされていない。このインターフェロンはリンパ球をマ
イトジエン(有糸***誘発因子)または特異抗原で刺戟
することにより生産されるものであって、ウイルス誘発
α−およびβ−インターフェロンとはその構造および性
質が重大に異なっている。
【0002】近年、Yip等はリンパ球をホルボール
エステル12−o−テトラデカノイル−ホルボール−1
3アセテート(TPA)およびフイトヘムアグルチニン
(植物性血球凝集素)(PHA)の組合せにより刺戟す
ることにもとづくヒトIFN−γの生産方法を報告した
(1)。その後、Yip等は分取Na DodSO4/
ポリアクリルアミド ゲル電気泳動によりIFN−γの
2種のサブタイプを精製することができた。しかしなが
ら、この工程中に生物学的活性のほとんど完全な損失が
生じた(2,3)。このサブタイプは20,000およ
び25,000の見掛分子質量を有し、これはコマシー
ブルー(Coomassie blue)染色性帯に
相当し、そして抗原的に交差活性化性である。約43,
000ダルトンの見掛分子質量を有する第3の少量成分
がまた検出された。
エステル12−o−テトラデカノイル−ホルボール−1
3アセテート(TPA)およびフイトヘムアグルチニン
(植物性血球凝集素)(PHA)の組合せにより刺戟す
ることにもとづくヒトIFN−γの生産方法を報告した
(1)。その後、Yip等は分取Na DodSO4/
ポリアクリルアミド ゲル電気泳動によりIFN−γの
2種のサブタイプを精製することができた。しかしなが
ら、この工程中に生物学的活性のほとんど完全な損失が
生じた(2,3)。このサブタイプは20,000およ
び25,000の見掛分子質量を有し、これはコマシー
ブルー(Coomassie blue)染色性帯に
相当し、そして抗原的に交差活性化性である。約43,
000ダルトンの見掛分子質量を有する第3の少量成分
がまた検出された。
【0003】別の研究において、Gray等はヒト I
FN−γ相補性DNAのクローン化および説明を報告し
ている。ヌクレオチド配列はこのIFN−γが146個
のアミノ酸を有する単純ポリペプチドよりなるものであ
って、17,000ダルトンの計算分子質量を有するこ
とを示した。さらにまた、遺伝子図書館でしらべても、
その他の構造上関連したDNA配列を見出せなかった
(4)。このデータはIFN−γに関して1つだけのポ
リペプチド配列が存在し、そして天然IFN−γは部分
的に二量体化していることがあることを示唆していた。
FN−γ相補性DNAのクローン化および説明を報告し
ている。ヌクレオチド配列はこのIFN−γが146個
のアミノ酸を有する単純ポリペプチドよりなるものであ
って、17,000ダルトンの計算分子質量を有するこ
とを示した。さらにまた、遺伝子図書館でしらべても、
その他の構造上関連したDNA配列を見出せなかった
(4)。このデータはIFN−γに関して1つだけのポ
リペプチド配列が存在し、そして天然IFN−γは部分
的に二量体化していることがあることを示唆していた。
【0004】PestkaおよびRubinstein
は以前に、米国特許第4,289,690号に、IFN
−γを均質にする精製および逆相高性能液クロマトグラ
フィ(HPLC)による8種の異なるサブタイプの分離
を開示している(5,6,7)。この方法はIFN−γ
が有機溶剤および低pHに対して不安定であるために、
IFN−γの精製には適しない。最近利用できるように
なったタンパク質の分別に適するイオン交換HPLCカ
ラムはIFN−γ生産物の高分割クロマトグラフィを可
能にした。
は以前に、米国特許第4,289,690号に、IFN
−γを均質にする精製および逆相高性能液クロマトグラ
フィ(HPLC)による8種の異なるサブタイプの分離
を開示している(5,6,7)。この方法はIFN−γ
が有機溶剤および低pHに対して不安定であるために、
IFN−γの精製には適しない。最近利用できるように
なったタンパク質の分別に適するイオン交換HPLCカ
ラムはIFN−γ生産物の高分割クロマトグラフィを可
能にした。
【0005】IFN−γの生産、精製および構造研究に
関する最近の科学論文は次のとおりにまとめて示すこと
ができる: (1) Yip,Y.K.,Pang,R.H.L.,
Urban,C.およびVilcek,J.(1981
年):Proc.Natl.Acad.Sci.,US
A 78,1601〜1605; (2) Yip,Y.K.,Barrowcloug
h,B.S.,Urban,C.およびVilcek,
J.(1982年):Science215,411〜
413; (3) Yip,Y.K.,Barrowcloug
h,B.S.,Urban,C.およびVilcek,
J.(1982年):Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 79,1820〜1824; (4) Gray,P.W.,Leung,D.N.,
Pennica,D.,Yelverton,E.,N
ajarian,R.,Simonsen,C.C.,
Perynck,R.,Sherwood,P.J.,
Wallace,D.M.,Berger,S.L.,
Levinson,A.D.およびGoeddel,
D.V.(1982年):Nature295,503
〜508; (5) Rubinstein,M.,Rubinst
ein,S.,Familletti,P.C.,Mi
ller,R.S.,Waldman,A.A.および
Pestka,S.(1979年):Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA76,640〜644; (6) Rubinstein,M.(1979年):
Anal.Biochem.97,1〜7; (7) Rubinstein,M.,Levy,W.
P.,Moschera,J.A.,Lai−C.
Y.,Hershberg,R.D.,Bartlet
t,R.およひPeska,S.(1981年):Ar
ch.Biochem.Biophys.210,30
7〜318。
関する最近の科学論文は次のとおりにまとめて示すこと
ができる: (1) Yip,Y.K.,Pang,R.H.L.,
Urban,C.およびVilcek,J.(1981
年):Proc.Natl.Acad.Sci.,US
A 78,1601〜1605; (2) Yip,Y.K.,Barrowcloug
h,B.S.,Urban,C.およびVilcek,
J.(1982年):Science215,411〜
413; (3) Yip,Y.K.,Barrowcloug
h,B.S.,Urban,C.およびVilcek,
J.(1982年):Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 79,1820〜1824; (4) Gray,P.W.,Leung,D.N.,
Pennica,D.,Yelverton,E.,N
ajarian,R.,Simonsen,C.C.,
Perynck,R.,Sherwood,P.J.,
Wallace,D.M.,Berger,S.L.,
Levinson,A.D.およびGoeddel,
D.V.(1982年):Nature295,503
〜508; (5) Rubinstein,M.,Rubinst
ein,S.,Familletti,P.C.,Mi
ller,R.S.,Waldman,A.A.および
Pestka,S.(1979年):Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA76,640〜644; (6) Rubinstein,M.(1979年):
Anal.Biochem.97,1〜7; (7) Rubinstein,M.,Levy,W.
P.,Moschera,J.A.,Lai−C.
Y.,Hershberg,R.D.,Bartlet
t,R.およひPeska,S.(1981年):Ar
ch.Biochem.Biophys.210,30
7〜318。
【0006】前記論文のいくつかはヒト免疫インターフ
ェロンを均質に精製したと主張しているが、生物学的活
性のほとんど完全な損失(80〜90%)が認められて
いる。さらにまた、断言できるほど純粋な化合物の性質
も開示されたことはない。タンパク質の精製に高性能液
クロマトグラフィを使用することは一般的に当業者に既
知である。
ェロンを均質に精製したと主張しているが、生物学的活
性のほとんど完全な損失(80〜90%)が認められて
いる。さらにまた、断言できるほど純粋な化合物の性質
も開示されたことはない。タンパク質の精製に高性能液
クロマトグラフィを使用することは一般的に当業者に既
知である。
【0007】本発明はヒト免疫インターフェロンの改善
された精製方法およびかくして生成された新規な均質ヒ
ト免疫インターフェロン(IFN−γ)に関する。本発
明の改善方法は制御された細孔を有するガラス上におけ
るクロマトグラフィ、限外濾過およびカチオン交換高性
能液クロマトグラフィ工程の組合せを包含し、IFN−
γの効果的な精製を達成させる。
された精製方法およびかくして生成された新規な均質ヒ
ト免疫インターフェロン(IFN−γ)に関する。本発
明の改善方法は制御された細孔を有するガラス上におけ
るクロマトグラフィ、限外濾過およびカチオン交換高性
能液クロマトグラフィ工程の組合せを包含し、IFN−
γの効果的な精製を達成させる。
【0008】IFN−γの精製における処理工程として
制御された細孔を有するガラス上でのクロマトグラフィ
を使用することは当技術で既知であった(前記引用文献
2,3参照)。限外濾過は以前に、タンパク質の濃縮お
よび脱塩に広く使用されていた。かなりの場合に、限外
濾過は限外濾過膜のカット−オフ値より小さい分子量を
有するペプチドおよびタンパク質の除去に使用できる。
Mono−S カチオン交換HPLCカラムは特にタン
パク質の分別用にPharmacia Fine Ch
emicalsにより設計され、市販されているもので
ある。しかしながら、IFN−γの分別用に、制御され
た細孔を有するガラス クロマトグラフィおよび限外濾
過と組合せて、これらのHPLCカラムは使用されたこ
とはないか、またはその使用が示唆されたこともない。
制御された細孔を有するガラス上でのクロマトグラフィ
を使用することは当技術で既知であった(前記引用文献
2,3参照)。限外濾過は以前に、タンパク質の濃縮お
よび脱塩に広く使用されていた。かなりの場合に、限外
濾過は限外濾過膜のカット−オフ値より小さい分子量を
有するペプチドおよびタンパク質の除去に使用できる。
Mono−S カチオン交換HPLCカラムは特にタン
パク質の分別用にPharmacia Fine Ch
emicalsにより設計され、市販されているもので
ある。しかしながら、IFN−γの分別用に、制御され
た細孔を有するガラス クロマトグラフィおよび限外濾
過と組合せて、これらのHPLCカラムは使用されたこ
とはないか、またはその使用が示唆されたこともない。
【0009】IFN−γの国際標準はまだ存在しないの
で、本発明の全体にわたって示されている生物学的活性
はNational Institues of He
alth(Bethesda,Maryland,U.
S.A.)により供給されているインターフェロン−α
参照標準G−023−901−527を基準にし、ヒト
WISH細胞(American Type Cult
ure Collection Cat.NO.CCL
−23)および水胞性口内炎ウイルスをウイルス細胞変
性作用の阻止に基づく分析に使用した。その他のセルラ
イン、その他のウイルス、およびその他の標準の使用が
非常に広範囲の比活性値を与えうることは当業者にとっ
て一般に既知である。もう1つの変数には種々の方法で
測定できるタンパク質含有量がある。本発明におけるタ
ンパク質含有量は絶対方法として広く受容されているア
ミノ酸分析に基づいて測定した。
で、本発明の全体にわたって示されている生物学的活性
はNational Institues of He
alth(Bethesda,Maryland,U.
S.A.)により供給されているインターフェロン−α
参照標準G−023−901−527を基準にし、ヒト
WISH細胞(American Type Cult
ure Collection Cat.NO.CCL
−23)および水胞性口内炎ウイルスをウイルス細胞変
性作用の阻止に基づく分析に使用した。その他のセルラ
イン、その他のウイルス、およびその他の標準の使用が
非常に広範囲の比活性値を与えうることは当業者にとっ
て一般に既知である。もう1つの変数には種々の方法で
測定できるタンパク質含有量がある。本発明におけるタ
ンパク質含有量は絶対方法として広く受容されているア
ミノ酸分析に基づいて測定した。
【0010】粗製IFN−γ製剤に対して制御された細
孔を有するガラス クロマトグラフィを使用すると、約
4倍の精製が達成される。すなわち、この工程により生
成されたIFN−γは約2×105単位/mgの比活性
を有する。制御された細孔を有するガラス(CPG)処
理には、次の方法を使用できる。
孔を有するガラス クロマトグラフィを使用すると、約
4倍の精製が達成される。すなわち、この工程により生
成されたIFN−γは約2×105単位/mgの比活性
を有する。制御された細孔を有するガラス(CPG)処
理には、次の方法を使用できる。
【0011】CPGビーズをポリプロピレン遠心用ビン
中のIFN−γ含有培養物上澄液(3,000〜160
00単位/ml;8〜20×104単位/mg)に1:
100(容量/容量)の比率で加える。混合物を4℃で
3時間攪拌し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去
し、次いでビーズをシリコン化ガラス カラムに詰め
る。このカラムを先ず数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類
溶液で洗浄し、次いでIFN−γを0.5Mテトラメチ
ルアンモニウム クロリド(pH7)により溶出する。
中のIFN−γ含有培養物上澄液(3,000〜160
00単位/ml;8〜20×104単位/mg)に1:
100(容量/容量)の比率で加える。混合物を4℃で
3時間攪拌し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去
し、次いでビーズをシリコン化ガラス カラムに詰め
る。このカラムを先ず数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類
溶液で洗浄し、次いでIFN−γを0.5Mテトラメチ
ルアンモニウム クロリド(pH7)により溶出する。
【0012】テトラメチルアンモニウム クロリドによ
るCPGからの溶出により得られた、生成する精製イン
ターフェロンは約2×105単位/mgの比活性を示
し、回収率は約50〜100%である。CPG−クロマ
トグラフィからのIFN−γ活性を含有するフラクショ
ンを集め、PM−10膜(Amicon)上での限外濾
過により塩を除去する。保持フラクションを数容量の2
mMリン酸ナトリウム(pH7.4)で洗浄し、元の培
養物容量の約0.5%まで濃縮する。不溶性タンパク質
を遠心分離により除去し、清明な上澄液を使用時まで+
4℃で保存する。限外濾過により得られた生成するイン
ターフェロン濃縮物は9×105単位/mgの比活性を
示し、回収率は約60〜100%である。
るCPGからの溶出により得られた、生成する精製イン
ターフェロンは約2×105単位/mgの比活性を示
し、回収率は約50〜100%である。CPG−クロマ
トグラフィからのIFN−γ活性を含有するフラクショ
ンを集め、PM−10膜(Amicon)上での限外濾
過により塩を除去する。保持フラクションを数容量の2
mMリン酸ナトリウム(pH7.4)で洗浄し、元の培
養物容量の約0.5%まで濃縮する。不溶性タンパク質
を遠心分離により除去し、清明な上澄液を使用時まで+
4℃で保存する。限外濾過により得られた生成するイン
ターフェロン濃縮物は9×105単位/mgの比活性を
示し、回収率は約60〜100%である。
【0013】限外濾過により生成されたインターフェロ
ン濃縮物をさらに精製するために、このインターフェロ
ンを高分割能を有するカチオン交換高圧液クロマトグラ
フィ(HPLC)工程に1回または2回通す。この液ク
ロマトグラフィ工程では、スルホアルキル基が結合して
いる単分散有機重合体系マトリックスを含有するカラム
を使用する。これらのカラムは順次的に、およびpH勾
配およびイオン強度勾配の変化する条件下におよびエチ
レングリコールのような種々の安定化剤の存在下に使用
できるものであって、ヒト免疫インターフェロンをナト
リウム−硫酸ドデシル(SDS)ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動における単一吸収帯、および活性およびタ
ンパク質レベルについてスーパーインポーズできるHP
LCでの一定の比活性および単一ピークを得ることによ
り測定して、均質に精製できる。
ン濃縮物をさらに精製するために、このインターフェロ
ンを高分割能を有するカチオン交換高圧液クロマトグラ
フィ(HPLC)工程に1回または2回通す。この液ク
ロマトグラフィ工程では、スルホアルキル基が結合して
いる単分散有機重合体系マトリックスを含有するカラム
を使用する。これらのカラムは順次的に、およびpH勾
配およびイオン強度勾配の変化する条件下におよびエチ
レングリコールのような種々の安定化剤の存在下に使用
できるものであって、ヒト免疫インターフェロンをナト
リウム−硫酸ドデシル(SDS)ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動における単一吸収帯、および活性およびタ
ンパク質レベルについてスーパーインポーズできるHP
LCでの一定の比活性および単一ピークを得ることによ
り測定して、均質に精製できる。
【0014】本発明を実施する際に使用する有機マトリ
ックス カチオン−交換HPLCカラムは市販物品であ
る。適当なカラムはPharmacia Fina C
hemicals(Uppsala,Sweden)に
より生産され、市販されているMono−Sである。前
記カラムを使用する高圧液クロマトグラフィ系はPha
rmacia,Varian,Beckman,Wat
ers PerkinElmars等のような多くの製
造業者から入手できる。
ックス カチオン−交換HPLCカラムは市販物品であ
る。適当なカラムはPharmacia Fina C
hemicals(Uppsala,Sweden)に
より生産され、市販されているMono−Sである。前
記カラムを使用する高圧液クロマトグラフィ系はPha
rmacia,Varian,Beckman,Wat
ers PerkinElmars等のような多くの製
造業者から入手できる。
【0015】本発明において、HPLCカラムからのイ
ンターフェロン−γの溶出に好適な緩衝系はpH7.0
の10mMリン酸ナトリウム−20%(容量/容量)エ
チレングリコールである。処理は約10〜約1000P
SIの中圧で行なう。標準5×50mmカラムに使用す
る流速は0.1〜1.0ml/分であり、処理は−10
℃〜+30℃の温度範囲で実施できる。インターフェロ
ン−γ(0.1mg〜10mgタンパク質)はこのカラ
ムに吸着させ、次いで増大する塩濃度勾配を使用して選
択的様式で順次溶出する。この目的に適する塩として
は、NaCl,KCl,MgCl2,MgSO4,テト
ラメチルアンモニウム クロリド等を包含する。分離は
約pH5〜約pH8.5で変化するpH値範囲のいづれ
かで達成できる。別法として、塩濃度を一定に保持し、
pHをpH5〜pH10の間で増加勾配にして変えるこ
ともできる。同じカラムにおいて前記で概述した中で同
じ条件または異なる条件のどちらかで2回または3回以
上連続分別することによりさらに精製することができ
る。
ンターフェロン−γの溶出に好適な緩衝系はpH7.0
の10mMリン酸ナトリウム−20%(容量/容量)エ
チレングリコールである。処理は約10〜約1000P
SIの中圧で行なう。標準5×50mmカラムに使用す
る流速は0.1〜1.0ml/分であり、処理は−10
℃〜+30℃の温度範囲で実施できる。インターフェロ
ン−γ(0.1mg〜10mgタンパク質)はこのカラ
ムに吸着させ、次いで増大する塩濃度勾配を使用して選
択的様式で順次溶出する。この目的に適する塩として
は、NaCl,KCl,MgCl2,MgSO4,テト
ラメチルアンモニウム クロリド等を包含する。分離は
約pH5〜約pH8.5で変化するpH値範囲のいづれ
かで達成できる。別法として、塩濃度を一定に保持し、
pHをpH5〜pH10の間で増加勾配にして変えるこ
ともできる。同じカラムにおいて前記で概述した中で同
じ条件または異なる条件のどちらかで2回または3回以
上連続分別することによりさらに精製することができ
る。
【0016】溶出液の分別は210〜280nmの範
囲、好ましくは210nmまたは280nmの波長で作
動する紫外線検知器のようなタンパク質監視器により、
分別中のタンパク質含有量を付随監視するそれ自体既知
の方法でフラクション採集器を使用して行なう。
囲、好ましくは210nmまたは280nmの波長で作
動する紫外線検知器のようなタンパク質監視器により、
分別中のタンパク質含有量を付随監視するそれ自体既知
の方法でフラクション採集器を使用して行なう。
【0017】シリカおよびガラスに対する吸着によるI
FN−γの損失が可能であるので、本発明で使用する全
ての管、容器および試験管はテフロン、ポリプロピレン
またはポリエチレンのいづれかから作る。
FN−γの損失が可能であるので、本発明で使用する全
ての管、容器および試験管はテフロン、ポリプロピレン
またはポリエチレンのいづれかから作る。
【0018】高度に精製された生成物はポリプロピレン
試験管で20%(容量/容量)エチレングリコールの存
在下に+4℃で保存した場合に最も安定である。生物学
的活性の有意の損失が反復凍結−解凍サイクルで検出さ
れる。
試験管で20%(容量/容量)エチレングリコールの存
在下に+4℃で保存した場合に最も安定である。生物学
的活性の有意の損失が反復凍結−解凍サイクルで検出さ
れる。
【0019】0.15,0.20,0.25および0.
26モルのNaCl濃度で溶出して(pH7.0)、生
物学的活性の4つの主要ピークが20〜40%の総回収
率で得られる。この分離は非変性条件下に行なわれるの
で、各ピークはHu IFN−γの異なるサブタイプを
示している。β−メルカプトエタノールの存在または不
存在のどちらかでNa Dod SO4−ポリアクリル
アミド ゲル電気泳動により分析すると、0.25Mお
よび0.26M NaClで溶出するピークは26,0
00(26K)および21,000(21K)の見掛分
子質量をそれぞれ有する単一タンパク質吸収帯を含有す
ることが判り、他方、0.15Mおよび0.20Mのピ
ークは純度が低い。26Kおよび21Kの両サブタイプ
の比活性は7×106単位/mgであった。粗製または
いづれかの精製IFN−γサブタイプを非変性条件下に
Ultrogel AcA 54カラムでゲル濾過によ
り分析すると、45,000ダルトンの分子質量に相当
する比活性のピークが得られる。サブタイプ26Kおよ
び21Kのアミノ酸分析はGray等により開示されて
いる(前記文献4)cDNAクローンの順序から計算し
た理論値と一般的類似を示した。しかしながら、プロリ
ン、グリシンおよびパニルアラニンのレベルにおける有
意の差違が見られた。サブタイプ26Kおよび21Kは
ほとんど同一のアミノ酸組成およびヘプチドマップを示
した。
26モルのNaCl濃度で溶出して(pH7.0)、生
物学的活性の4つの主要ピークが20〜40%の総回収
率で得られる。この分離は非変性条件下に行なわれるの
で、各ピークはHu IFN−γの異なるサブタイプを
示している。β−メルカプトエタノールの存在または不
存在のどちらかでNa Dod SO4−ポリアクリル
アミド ゲル電気泳動により分析すると、0.25Mお
よび0.26M NaClで溶出するピークは26,0
00(26K)および21,000(21K)の見掛分
子質量をそれぞれ有する単一タンパク質吸収帯を含有す
ることが判り、他方、0.15Mおよび0.20Mのピ
ークは純度が低い。26Kおよび21Kの両サブタイプ
の比活性は7×106単位/mgであった。粗製または
いづれかの精製IFN−γサブタイプを非変性条件下に
Ultrogel AcA 54カラムでゲル濾過によ
り分析すると、45,000ダルトンの分子質量に相当
する比活性のピークが得られる。サブタイプ26Kおよ
び21Kのアミノ酸分析はGray等により開示されて
いる(前記文献4)cDNAクローンの順序から計算し
た理論値と一般的類似を示した。しかしながら、プロリ
ン、グリシンおよびパニルアラニンのレベルにおける有
意の差違が見られた。サブタイプ26Kおよび21Kは
ほとんど同一のアミノ酸組成およびヘプチドマップを示
した。
【0020】インターフェロン−γは抗ウイルス活性、
抗細胞活性、天然および抗体依存キラー細胞(kill
er cell)活性に対抗する能力、或る種のHLA
表面マーカー抗原を誘発させる能力を示した。これらの
活性は多くの生物学的活性リンホカインを含有する比較
的粗製の製剤によっても得られている。本発明の精製さ
れた均質ヒト免疫インターフェロンはIFN−γ固有に
属するこれらの活性の同定に使用できる。本発明の精製
IFN−γを含有する製剤は種々のウイルス性および腫
瘍性病気におけるそれらの有用性を評価するための臨床
研究に使用できる。
抗細胞活性、天然および抗体依存キラー細胞(kill
er cell)活性に対抗する能力、或る種のHLA
表面マーカー抗原を誘発させる能力を示した。これらの
活性は多くの生物学的活性リンホカインを含有する比較
的粗製の製剤によっても得られている。本発明の精製さ
れた均質ヒト免疫インターフェロンはIFN−γ固有に
属するこれらの活性の同定に使用できる。本発明の精製
IFN−γを含有する製剤は種々のウイルス性および腫
瘍性病気におけるそれらの有用性を評価するための臨床
研究に使用できる。
【0021】本発明の方法および生成物を次例によりさ
らに説明する。 例1ヒトIFN−γの生産 単核細胞をFicool−Hypaque勾配(gra
dient)上での遠心分離(400×g;30分)に
より野牛革(buffy coats)から単離する。
血清を含有しないRPMl−1640メジュウム中の単
核細胞の培養物(5×106/ml)に12−O−テト
ラデカノイル ホルボール−13−アセテート(5μg
/ml)および精製フイトヘムアグルチニン(5μg/
ml)を添加することによりIFN−γを産生させる。
37℃および5%CO2雰囲気で24時間インキュベー
ションした後に、細胞を遠心分離により除去し、培養物
上澄液を採取し、+4℃で保存する。
らに説明する。 例1ヒトIFN−γの生産 単核細胞をFicool−Hypaque勾配(gra
dient)上での遠心分離(400×g;30分)に
より野牛革(buffy coats)から単離する。
血清を含有しないRPMl−1640メジュウム中の単
核細胞の培養物(5×106/ml)に12−O−テト
ラデカノイル ホルボール−13−アセテート(5μg
/ml)および精製フイトヘムアグルチニン(5μg/
ml)を添加することによりIFN−γを産生させる。
37℃および5%CO2雰囲気で24時間インキュベー
ションした後に、細胞を遠心分離により除去し、培養物
上澄液を採取し、+4℃で保存する。
【0022】例2制御された細孔を有するガラス上におけるクロマトグラ
フィおよび限外濾過 CPGビーズをポリプロピレン遠心用管中のIFN−γ
含有培養物上澄液(3,000〜16,000単位.m
l;8〜20×104単位/ml)に1:100(容量
/容量)の比率で加える。混合物を4℃で3時間保持
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、ビーズを
シリコン化ガラス カラムに詰める。このカラムを先ず
数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類溶液で洗浄し、次いで
IFN−γを0.5Mテトラメチル アンモニウム ク
ロリド(pH7)により溶出する。CPG−クロマトグ
ラフィからIFN−γ活性を含有するフラクションを集
め、塩をPM−10膜(Amicon)上での限外濾過
により除去する。保持フラクションを数容量の2mMリ
ン酸ナトリウム(pH7.4)で洗浄し、次いで元の培
養物容量の約0.5%に濃縮する。不溶性タンパク質を
遠心分離により除去し、清明な上澄液を使用時まで+4
℃で保存する。
フィおよび限外濾過 CPGビーズをポリプロピレン遠心用管中のIFN−γ
含有培養物上澄液(3,000〜16,000単位.m
l;8〜20×104単位/ml)に1:100(容量
/容量)の比率で加える。混合物を4℃で3時間保持
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、ビーズを
シリコン化ガラス カラムに詰める。このカラムを先ず
数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類溶液で洗浄し、次いで
IFN−γを0.5Mテトラメチル アンモニウム ク
ロリド(pH7)により溶出する。CPG−クロマトグ
ラフィからIFN−γ活性を含有するフラクションを集
め、塩をPM−10膜(Amicon)上での限外濾過
により除去する。保持フラクションを数容量の2mMリ
ン酸ナトリウム(pH7.4)で洗浄し、次いで元の培
養物容量の約0.5%に濃縮する。不溶性タンパク質を
遠心分離により除去し、清明な上澄液を使用時まで+4
℃で保存する。
【0023】例3高速液体クロマトグラフィ(HPLC) HPLCはAltex Model 330液クロマト
グラフ(Beckman Instruments)上
で行なう。Mono−S HPLC カチオン−交換カ
ラム(5×50mm)を10mMリン酸ナトリウム(p
H7.0)−20%(容量/容量)エチレン−グリコー
ル(緩衝剤A)で平衡にする。前記工程からのIFN−
γ生成物を0.5ml/分の流速で加える。カラムを次
いで緩衝剤Aで30分間、次いで緩衝剤A中にNaCl
を直線勾配(0〜400mM)で含有する液で60分間
洗浄する。各フラクション(1ml)を次いでタンパク
質標準として仔牛血清アルブミンを使用して、IFN−
γ活性およびタンパク質含有量について分析する。エチ
レン グレコールが溶出緩衝剤中に含まれている場合に
だけ高度の分割が達成された。0.15M,0.20
M,0.25Mおよび0.26MのNaCl濃度で溶出
する生物学的活性の数ピークが連続的に得られる。通
常、0.25Mにおけるピークが最も支配的である。
0.25Mおよび0.26Mにおける生物学的活性のピ
ークは2種の異なるタンパク質ピークを付随し、種々の
生成物におけるそれらの比活性は7×106単位/mg
であった。低い方のNaCl濃度(0.15Mおよび
0.20M)における生物学的活性のピークは比活性が
さらに低く、分離したタンパク質ピークを付随しない。
生物学的活性の総回収率は最後の工程で主として損失が
生じて、20〜40%であった。
グラフ(Beckman Instruments)上
で行なう。Mono−S HPLC カチオン−交換カ
ラム(5×50mm)を10mMリン酸ナトリウム(p
H7.0)−20%(容量/容量)エチレン−グリコー
ル(緩衝剤A)で平衡にする。前記工程からのIFN−
γ生成物を0.5ml/分の流速で加える。カラムを次
いで緩衝剤Aで30分間、次いで緩衝剤A中にNaCl
を直線勾配(0〜400mM)で含有する液で60分間
洗浄する。各フラクション(1ml)を次いでタンパク
質標準として仔牛血清アルブミンを使用して、IFN−
γ活性およびタンパク質含有量について分析する。エチ
レン グレコールが溶出緩衝剤中に含まれている場合に
だけ高度の分割が達成された。0.15M,0.20
M,0.25Mおよび0.26MのNaCl濃度で溶出
する生物学的活性の数ピークが連続的に得られる。通
常、0.25Mにおけるピークが最も支配的である。
0.25Mおよび0.26Mにおける生物学的活性のピ
ークは2種の異なるタンパク質ピークを付随し、種々の
生成物におけるそれらの比活性は7×106単位/mg
であった。低い方のNaCl濃度(0.15Mおよび
0.20M)における生物学的活性のピークは比活性が
さらに低く、分離したタンパク質ピークを付随しない。
生物学的活性の総回収率は最後の工程で主として損失が
生じて、20〜40%であった。
【0024】例4Na Dod SO4−ポリアクリルアミド ゲル電気
泳動およびアミノ酸分析 タンパク質資料を先ず2mMリン酸ナトリウム(pH
7.4)に対して透析し、Speedvac Conc
entrator(Savant)中で乾燥させ、2%
β−メルカプトエタノールを含有する新たに製造した試
料緩衝液に溶解し、100℃で5分間加熱する。15%
ポリアクリルアミドのスラブ ゲルを使用する。電気泳
動の後に、タンパク質吸収帯がCoomassie b
lueまたは銀染色のどちらかにより目に見える。0.
26M塩で溶出するフラクションは21,000ダルト
ンの見掛分子質量を有する単一タンパク質吸収帯を示し
た(サブタイプ21K)。0.25M塩で溶出するフラ
クションは26,000の見掛分子質量を有する主要タ
ンパク質吸収帯を示すが、非常に低い分子質量の若干の
少量吸収帯が場合により見られる(サブタイプ26
K)。このフラクションを同じHPLCカラム上で再ク
ロマトグラフィ処理すると、これらの汚染物を除去でき
る。低い塩濃度(0.15〜0.20M)で溶出する生
物学的活性のピークはMr26000に相当する吸収帯
を含む数個の主要タンパク質吸収帯を示した。ピーク2
1Kおよび26Kの見掛分子質量はゲル電気泳動前のβ
−メルカプトエタノールによる処理により影響されな
い。
泳動およびアミノ酸分析 タンパク質資料を先ず2mMリン酸ナトリウム(pH
7.4)に対して透析し、Speedvac Conc
entrator(Savant)中で乾燥させ、2%
β−メルカプトエタノールを含有する新たに製造した試
料緩衝液に溶解し、100℃で5分間加熱する。15%
ポリアクリルアミドのスラブ ゲルを使用する。電気泳
動の後に、タンパク質吸収帯がCoomassie b
lueまたは銀染色のどちらかにより目に見える。0.
26M塩で溶出するフラクションは21,000ダルト
ンの見掛分子質量を有する単一タンパク質吸収帯を示し
た(サブタイプ21K)。0.25M塩で溶出するフラ
クションは26,000の見掛分子質量を有する主要タ
ンパク質吸収帯を示すが、非常に低い分子質量の若干の
少量吸収帯が場合により見られる(サブタイプ26
K)。このフラクションを同じHPLCカラム上で再ク
ロマトグラフィ処理すると、これらの汚染物を除去でき
る。低い塩濃度(0.15〜0.20M)で溶出する生
物学的活性のピークはMr26000に相当する吸収帯
を含む数個の主要タンパク質吸収帯を示した。ピーク2
1Kおよび26Kの見掛分子質量はゲル電気泳動前のβ
−メルカプトエタノールによる処理により影響されな
い。
【0025】アミノ酸分析:Mono−S カラムから
のIFN−γ含有(10〜30μg)試料にアセトン
(4〜5容量)を加える。混合物を−20℃で3〜16
時間放置し、回転処理し(13,000×g;5分
間)、沈殿を減圧で乾燥させる。アミノ酸分析は加水分
解(6NHCl;110℃;24時間)の後にDurr
um500分析機で行なった。セリンまたはセレオニン
についての補正は行なわない。サブタイプ21Kおよび
26Kの両サブタイプのアミノ酸分析は遺伝子の配列か
ら計算されたものと全く類似の結果を与えた。グリシン
の高い含有量は多分、汚染物質および加水分解中のその
他のアミノ酸の分解によるものである。
のIFN−γ含有(10〜30μg)試料にアセトン
(4〜5容量)を加える。混合物を−20℃で3〜16
時間放置し、回転処理し(13,000×g;5分
間)、沈殿を減圧で乾燥させる。アミノ酸分析は加水分
解(6NHCl;110℃;24時間)の後にDurr
um500分析機で行なった。セリンまたはセレオニン
についての補正は行なわない。サブタイプ21Kおよび
26Kの両サブタイプのアミノ酸分析は遺伝子の配列か
ら計算されたものと全く類似の結果を与えた。グリシン
の高い含有量は多分、汚染物質および加水分解中のその
他のアミノ酸の分解によるものである。
【0026】
【表1】
【0027】例5均質ヒト免疫インターフェロン サブタイプ26Kを含
有する非経口投与形剤 7×106単位/mgの比活性を有する均質ヒト免疫イ
ンターフェロン サブタイブ26K総量10mgを正常
血清アルブミン(ヒト)USP35mlに溶解する。溶
液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して2〜3変化させて透
析して低分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フィ
ルターに通す。濾過した溶液を140のバイアル中に吸
引により分配する。各バイアルは非経口投与に適する純
粋インターフェロン5×105単位を含有する。これら
のバイアルは使用前は冷所(−20℃〜−70℃)で保
存すると好ましい。
有する非経口投与形剤 7×106単位/mgの比活性を有する均質ヒト免疫イ
ンターフェロン サブタイブ26K総量10mgを正常
血清アルブミン(ヒト)USP35mlに溶解する。溶
液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して2〜3変化させて透
析して低分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フィ
ルターに通す。濾過した溶液を140のバイアル中に吸
引により分配する。各バイアルは非経口投与に適する純
粋インターフェロン5×105単位を含有する。これら
のバイアルは使用前は冷所(−20℃〜−70℃)で保
存すると好ましい。
【0028】例6均質ヒト免疫インターフェロン サブタイプ21Kを含
有する非経口投与形剤 7×106単位/mgの比活性を有する均質ヒト免疫イ
ンターフェロン サブタイプ21K総量10mgを正常
血清アルブミン(ヒト)USP35mlに溶解する。溶
液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して2〜3変化させて透
析し、低分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フィ
ルターに通す。濾過した溶液を140のバイアルに吸引
により分配する。各バイアルは非経口投与に適する純粋
インターフェロン5×105単位を含有する。これらの
バイアルは使用前は、冷所(−20℃〜−70℃)で保
存すると好ましい。
有する非経口投与形剤 7×106単位/mgの比活性を有する均質ヒト免疫イ
ンターフェロン サブタイプ21K総量10mgを正常
血清アルブミン(ヒト)USP35mlに溶解する。溶
液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して2〜3変化させて透
析し、低分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フィ
ルターに通す。濾過した溶液を140のバイアルに吸引
により分配する。各バイアルは非経口投与に適する純粋
インターフェロン5×105単位を含有する。これらの
バイアルは使用前は、冷所(−20℃〜−70℃)で保
存すると好ましい。
【0029】例7均質ヒト免疫インターフェロン サブタイプ26Kおよ
び21Kを含有する非経口投与形剤 両方共に7×106単位/mgの比活性を有する均質ヒ
ト免疫インターフェロン サブタイプ21K5mgおよ
び均質ヒト免疫インターフェロン サブタイプ26K5
mgの組合せを正常血清アルブミン(ヒト)USP35
mlに溶解する。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して
2〜3変化させて透析して、低分子量汚染物質を除去
し、次いで細菌学的フィルターに通す。濾過した溶液を
140のバイアルに吸引により分配する。各バイアルは
非経口投与に適する純粋インターフェロン5×105単
位を含有する。これらのバイアルは使用前は冷所(−2
0℃〜−70℃)で保存すると好ましい。
び21Kを含有する非経口投与形剤 両方共に7×106単位/mgの比活性を有する均質ヒ
ト免疫インターフェロン サブタイプ21K5mgおよ
び均質ヒト免疫インターフェロン サブタイプ26K5
mgの組合せを正常血清アルブミン(ヒト)USP35
mlに溶解する。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して
2〜3変化させて透析して、低分子量汚染物質を除去
し、次いで細菌学的フィルターに通す。濾過した溶液を
140のバイアルに吸引により分配する。各バイアルは
非経口投与に適する純粋インターフェロン5×105単
位を含有する。これらのバイアルは使用前は冷所(−2
0℃〜−70℃)で保存すると好ましい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12P 21/00 C12R 1:91) (72)発明者 デイナ フイツシヤー イスラエル国ラマツト ガン,アーロンソ ン ストリート 8
Claims (10)
- 【請求項1】 7×106単位/mgの比活性、26,
000ダルトンの見掛分子質量及び下記のアミノ酸組成
を有する、生物学的に活性な形態にある、サブタイプ2
6Kのヒトインターフェロンガンマ。 【表1】 - 【請求項2】 7×106単位/mgの比活性、26,
000ダルトンの見掛分子質量及び下記のアミノ酸組成
を有する、生物学的に活性な形態にある、サブタイプ2
6Kのヒトインターフェロンガンマの製造法であって、 【表2】 (a) 不純な状態のサブタイプ26Kを含むインター
フェロンガンマの水溶液を制御された細孔を有するガラ
ス吸着剤と混合して、その後、この吸着剤からインター
フェロンを溶出し、この溶出液の選ばれたフラクション
中に増大した純度の状態でインターフェロンを採取し; (b) 工程(a)で得られた選ばれたフラクションを
膜上での限外濾過により濃縮し、この膜に保持されてい
るフラクション中におけるさらに高い濃度および増大し
た純度の状態でのインターフェロンを採取し; (c) 工程(b)で得られたフラクションをカチオン
交換マトリックスに少なくとも1回通し、その後、この
カラムから増加する塩濃度勾配あるいは増加するpH勾
配を用いて適当な圧力下に生物学的に活性なヒトインタ
ーフェロンガンマのタンパク質を含む少なくとも1つの
フラクションを溶出し、この溶出液の選ばれたフラクシ
ョン中の数種の異なるピークとして、ヒトインターフェ
ロンガンマのサブタイプ26Kを均質で生物学的に活性
なタンパク質状態で得る;工程の組合せからなる方法。 - 【請求項3】 工程(c)をHPLC条件下に実施する
請求項2の方法。 - 【請求項4】 カチオン交換カラムがスルホアルキル基
を有する有機ポリマーからなる、請求項2の方法。 - 【請求項5】 工程(c)において増加する塩濃度勾配
によりインターフェロンを溶出する、請求項2の方法。 - 【請求項6】 工程(c)において増加するpH濃度勾
配によりインターフェロンを溶出する、請求項2の方
法。 - 【請求項7】 工程(c)においてエチレングリコール
の存在下にインターフェロンを溶出する、請求項2の方
法。 - 【請求項8】 カラムがスルホアルキル基を有する有機
ポリマーからなるカチオン交換カラムであり、緩衝剤が
20%(容量/容量)エチレングリコールを含有する1
0mMリン酸ナトリウム(pH7.0)であり、そして
勾配が0〜400mMの直線状に増加させたNaCl濃
度の60分である請求項2から7のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項9】 工程(c)の少なくとも1つのフラクシ
ョンにおいて均質なサブタイプ26Kを含むようにサブ
タイプ26Kを溶出してサブタイプ26Kを製造する請
求項2から8のいずれかに記載の方法。 - 【請求項10】 工程(b)の膜が約10,000ダル
トンの分子量カット−オフ値を有する、請求項2の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IL67896A IL67896A (en) | 1983-02-13 | 1983-02-13 | Two biologically active human gama interferon subtypes,purification thereof and pharmaceutical compositions containing them |
IL67896 | 1983-02-13 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59024943A Division JPS59231097A (ja) | 1983-02-13 | 1984-02-13 | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ21kおよびその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0725898A true JPH0725898A (ja) | 1995-01-27 |
JPH0751599B2 JPH0751599B2 (ja) | 1995-06-05 |
Family
ID=11054073
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59024943A Granted JPS59231097A (ja) | 1983-02-13 | 1984-02-13 | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ21kおよびその製造法 |
JP3216712A Expired - Lifetime JPH0751599B2 (ja) | 1983-02-13 | 1991-03-04 | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ26k及びその製造法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59024943A Granted JPS59231097A (ja) | 1983-02-13 | 1984-02-13 | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ21kおよびその製造法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP0117470B1 (ja) |
JP (2) | JPS59231097A (ja) |
AU (1) | AU566137B2 (ja) |
CA (1) | CA1248448A (ja) |
DE (2) | DE3465881D1 (ja) |
IL (1) | IL67896A (ja) |
ZA (1) | ZA84497B (ja) |
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---|---|---|---|---|
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US4946674A (en) * | 1984-10-05 | 1990-08-07 | Bioferon Biochemische Substanzen Gmbh & Co. | Process for treatment of rheumatic diseases |
IL76591A0 (en) * | 1984-10-05 | 1986-02-28 | Bioferon Biochem Substanz | Pharmaceutical compositions containing ifn-ypsilon and processes for the preparation thereof |
IL78444A (en) * | 1986-04-08 | 1992-05-25 | Yeda Res & Dev | Human gamma interferon-specific receptor protein,antibody against said protein,and compositions containing said protein and antibody |
US4894330A (en) * | 1986-12-23 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC |
US4908432A (en) * | 1987-01-09 | 1990-03-13 | New York University | Novel polypeptide having gamma-interferon activity |
IT1222427B (it) * | 1987-07-31 | 1990-09-05 | Sclavo Spa | Procedimento per la purificazione di interferone |
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