JPH0725692B2 - ニユーモシステイス・カリニの抑制方法 - Google Patents
ニユーモシステイス・カリニの抑制方法Info
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- JPH0725692B2 JPH0725692B2 JP1236802A JP23680289A JPH0725692B2 JP H0725692 B2 JPH0725692 B2 JP H0725692B2 JP 1236802 A JP1236802 A JP 1236802A JP 23680289 A JP23680289 A JP 23680289A JP H0725692 B2 JPH0725692 B2 JP H0725692B2
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- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【発明の詳細な説明】 ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)
は日和見性微生物であり、広く蔓延(prevalent)する
が一般には休暇状態にあり、宿主の体防御が低下したと
きに宿主中で増殖して発病させる。一般には肺内に存在
するが、肺外感染も報告されている。免疫が低下した固
体中でのこの微生物の肺感染は一般に肺炎をひきおこ
し、治療を怠った場合は通常致命的となる。免疫が低下
した固体においては患者から患者への伝染も起こり得る
といわれている。固体の免疫低下状態は通常、遺伝的欠
陥,リンパ増殖性(lymphoproliferative)の病気、ガ
ン治療や免疫抑制薬を用いた治療に由来する症状、ある
いはAIDSによる症状に関連する。ほとんどのAIDS患者は
最終的にはニューモシスティス・カリニ肺炎(PCP)を
患い、この病気の最近の例の多くを占めるに至った。治
療を怠れば、PCPはほとんどまちがいなく致命的とな
る。
は日和見性微生物であり、広く蔓延(prevalent)する
が一般には休暇状態にあり、宿主の体防御が低下したと
きに宿主中で増殖して発病させる。一般には肺内に存在
するが、肺外感染も報告されている。免疫が低下した固
体中でのこの微生物の肺感染は一般に肺炎をひきおこ
し、治療を怠った場合は通常致命的となる。免疫が低下
した固体においては患者から患者への伝染も起こり得る
といわれている。固体の免疫低下状態は通常、遺伝的欠
陥,リンパ増殖性(lymphoproliferative)の病気、ガ
ン治療や免疫抑制薬を用いた治療に由来する症状、ある
いはAIDSによる症状に関連する。ほとんどのAIDS患者は
最終的にはニューモシスティス・カリニ肺炎(PCP)を
患い、この病気の最近の例の多くを占めるに至った。治
療を怠れば、PCPはほとんどまちがいなく致命的とな
る。
P.カリニ肺炎の最近の治療方法はトリメトプリム/スル
ファメトキサゾール又はペンタミジンである。トリメト
プリム/スルファメトキサゾール(TMP/SMZ)による治
療は、発疹、肝機能上昇、悪心および嘔吐、貧血、アレ
アチン上昇、ならびに極端な場合にはスティーブンス・
ジョンソン(Stevens−Johnson)症候群といった毒性の
副作用を高い水準でひき起こす。TMP/SMZによる副作用
はAIDS患者に極めて多く蔓延している。ペンタミジンに
よる治療もまた、腎障害、肝毒、低血糖、血液学的異
常、および注射部位の痛みもしくは膿瘍といった毒性の
副作用を高い水準でひき起こす。治療に由来する死亡率
は20乃至30パーセントにも達し得る。免疫が低下した患
者のP.カリニ肺炎の治療のための改良された方法が強く
所望されている。
ファメトキサゾール又はペンタミジンである。トリメト
プリム/スルファメトキサゾール(TMP/SMZ)による治
療は、発疹、肝機能上昇、悪心および嘔吐、貧血、アレ
アチン上昇、ならびに極端な場合にはスティーブンス・
ジョンソン(Stevens−Johnson)症候群といった毒性の
副作用を高い水準でひき起こす。TMP/SMZによる副作用
はAIDS患者に極めて多く蔓延している。ペンタミジンに
よる治療もまた、腎障害、肝毒、低血糖、血液学的異
常、および注射部位の痛みもしくは膿瘍といった毒性の
副作用を高い水準でひき起こす。治療に由来する死亡率
は20乃至30パーセントにも達し得る。免疫が低下した患
者のP.カリニ肺炎の治療のための改良された方法が強く
所望されている。
本発明は、哺乳動物のニューモシスティス・カリニ感染
の治療に有用な組成物に関し、後述のシクロヘキサペプ
チド化合物(I)ならびに製薬上許容し得る担体からな
る。
の治療に有用な組成物に関し、後述のシクロヘキサペプ
チド化合物(I)ならびに製薬上許容し得る担体からな
る。
本発明の範囲内の化合物には、後記に詳述する新規な真
菌代謝産物、脂肪酸側鎖を有する親油性シクロヘキサペ
プチドである既知のエキノカンジン型抗生物質、側鎖ジ
ヒドロもしくはテトラヒドロ還元生成物、環状エーテル
およびエステル誘導体などのエキノカンジン型抗生物質
の簡単な誘導体、あるいはシクロヘキサペプチド環は維
持されているが脂肪酸側鎖が入れ代わっている半合成生
成物が含まれる。文献中のほとんどのこうした化合物は
抗真菌剤として教示されている。
菌代謝産物、脂肪酸側鎖を有する親油性シクロヘキサペ
プチドである既知のエキノカンジン型抗生物質、側鎖ジ
ヒドロもしくはテトラヒドロ還元生成物、環状エーテル
およびエステル誘導体などのエキノカンジン型抗生物質
の簡単な誘導体、あるいはシクロヘキサペプチド環は維
持されているが脂肪酸側鎖が入れ代わっている半合成生
成物が含まれる。文献中のほとんどのこうした化合物は
抗真菌剤として教示されている。
本発明の組成物に用いられる化合物は、天然の抗生物質
のみならず、天然の抗生物質の簡単な誘導体や後記に詳
説する半合成化合物をも含み、次の式(I)により表わ
すことができる。
のみならず、天然の抗生物質の簡単な誘導体や後記に詳
説する半合成化合物をも含み、次の式(I)により表わ
すことができる。
上記の式および下記の式において、 R′はH又はOH; R″はH又はOH; RはH,OH.−O−アルキル(C1−C6),−0−ベンジ
ル、又は ただし、R1はH,C1−C12アルキル,C1−C7シクロアルキ
ル,ヒドロキシエチル,低級アルコキシエチル,フリル
メチル,テトラヒドロフリルメチル,フェニル,フェニ
ルアルキル(フェニルはハロ,ヒドロキシ,低級アルキ
ルおよび低級アルコキシで置換されていてもよい);R2
は水素又は低級アルコキシ;又はR1とR2とで−(CH2)2
Q(CH2)2-(Qは−CH2−,−NH−あるいは−N−低級
アルキルのような結合基)を形成;mは0乃至4; R′はH又はOH; R″はH,CH3又はH2CONH2; RはH又はCH3;そして Rは、 (C)R′,R″,R及びR′がOH、R″がCH3のと
きは、 (Aは2価の酸素,イオウ,スルフィニル又はスルホニ
ル;A1は2価の酸素,イオウ,スルフィニル,スルホニ
ル又は−NH−;Xは水素,クロロ,ブロモ,ヨード,ニト
ロ,C1−C3アルキル,ヒドロキシ,C1−C3アルコキシ,メ
ルカプト,C1−C3アルキルチオ,カルバミル又はC1−C3
アルキルカルバミル;X1はクロロ,ブロモ又はヨード:R1
は水素,C1−C18アルキル又はC2−C18アルケニル;WはC1
−C10アルキレン又はC2−C10アルケニレン;m,nおよびp
は0又は1であるが、mが0のときは、nは0でなけれ
ばならない;ただし、基R1おびW中の炭素原子数の和は
4より大きくなければならず21を越えてはならない;Xが
メルカプトのときは、AおよびA1はスルフィニル又はス
ルホニルであってはならない;AおよびA1がスルフィニル
又はスルホニルのときは、それらは等しい酸化状態にな
ければならない); (D)R′がOH、R″がHのときは、 (Yは以下に示すアミノアシル基 (ZはC1−C10アルキレン又はC5−C6シクロアルキレ
ン); (R3はヒドロキシメチル,ヒドロキシエチル,メルカプ
トメチル,メルカプトエチル,メチルチオエチル,2−チ
エニル,3−インドロメチル,フェニル,ベンジル,ハロ
フェニル,ハロベンジル,C1−C3アルキルフェニル,C1−
C3アルキルベンジル,C1−C3アルキルチオフェニル,C1−
C3アキルチオベンジル,カルバミルフェニル,カルバミ
ルベンジル,C1−C3アルキルカルバミルフェニル又はC1
−C3アルキルカルバミルベンジル); (X2は水素又はハロ)) を意味する。
ル、又は ただし、R1はH,C1−C12アルキル,C1−C7シクロアルキ
ル,ヒドロキシエチル,低級アルコキシエチル,フリル
メチル,テトラヒドロフリルメチル,フェニル,フェニ
ルアルキル(フェニルはハロ,ヒドロキシ,低級アルキ
ルおよび低級アルコキシで置換されていてもよい);R2
は水素又は低級アルコキシ;又はR1とR2とで−(CH2)2
Q(CH2)2-(Qは−CH2−,−NH−あるいは−N−低級
アルキルのような結合基)を形成;mは0乃至4; R′はH又はOH; R″はH,CH3又はH2CONH2; RはH又はCH3;そして Rは、 (C)R′,R″,R及びR′がOH、R″がCH3のと
きは、 (Aは2価の酸素,イオウ,スルフィニル又はスルホニ
ル;A1は2価の酸素,イオウ,スルフィニル,スルホニ
ル又は−NH−;Xは水素,クロロ,ブロモ,ヨード,ニト
ロ,C1−C3アルキル,ヒドロキシ,C1−C3アルコキシ,メ
ルカプト,C1−C3アルキルチオ,カルバミル又はC1−C3
アルキルカルバミル;X1はクロロ,ブロモ又はヨード:R1
は水素,C1−C18アルキル又はC2−C18アルケニル;WはC1
−C10アルキレン又はC2−C10アルケニレン;m,nおよびp
は0又は1であるが、mが0のときは、nは0でなけれ
ばならない;ただし、基R1おびW中の炭素原子数の和は
4より大きくなければならず21を越えてはならない;Xが
メルカプトのときは、AおよびA1はスルフィニル又はス
ルホニルであってはならない;AおよびA1がスルフィニル
又はスルホニルのときは、それらは等しい酸化状態にな
ければならない); (D)R′がOH、R″がHのときは、 (Yは以下に示すアミノアシル基 (ZはC1−C10アルキレン又はC5−C6シクロアルキレ
ン); (R3はヒドロキシメチル,ヒドロキシエチル,メルカプ
トメチル,メルカプトエチル,メチルチオエチル,2−チ
エニル,3−インドロメチル,フェニル,ベンジル,ハロ
フェニル,ハロベンジル,C1−C3アルキルフェニル,C1−
C3アルキルベンジル,C1−C3アルキルチオフェニル,C1−
C3アキルチオベンジル,カルバミルフェニル,カルバミ
ルベンジル,C1−C3アルキルカルバミルフェニル又はC1
−C3アルキルカルバミルベンジル); (X2は水素又はハロ)) を意味する。
“アルキル”という用語は、1価の飽和直鎖もしくは有
枝鎖炭化水素基を意味する。“アルケニル”という用語
は1価の不飽和直鎖もしくは直枝鎖炭化水素基であって
3以下の二重結合を有するものを意味する。“低級”と
は炭素原子数6以下を意味する。“ハロ”という用語は
クロロ、ブロモ、フルオロおよびヨードを意味する。
枝鎖炭化水素基を意味する。“アルケニル”という用語
は1価の不飽和直鎖もしくは直枝鎖炭化水素基であって
3以下の二重結合を有するものを意味する。“低級”と
は炭素原子数6以下を意味する。“ハロ”という用語は
クロロ、ブロモ、フルオロおよびヨードを意味する。
本発明の哺乳類におけるニューモシスティス・カリニ感
染の治療に有用な組成物に用いられる化合物は一般に白
色結晶又は粉状物質である。それらは一般にアルコー
ル、例えばメタノール及びエタノールに良く溶解し、水
及び炭化水素、例えばヘキサンに良く溶解せずそして多
くの通常の溶媒に中程度に溶解する。天然のシクロヘキ
サペプチド類の溶解性及び他の多くの性質がCRC Handbo
ok of Antibiotic Compounds,Vol IV,Part I,355〜367
ページ,CRC Press,Inc.Boca Raton,Florida,1980にまと
められている。
染の治療に有用な組成物に用いられる化合物は一般に白
色結晶又は粉状物質である。それらは一般にアルコー
ル、例えばメタノール及びエタノールに良く溶解し、水
及び炭化水素、例えばヘキサンに良く溶解せずそして多
くの通常の溶媒に中程度に溶解する。天然のシクロヘキ
サペプチド類の溶解性及び他の多くの性質がCRC Handbo
ok of Antibiotic Compounds,Vol IV,Part I,355〜367
ページ,CRC Press,Inc.Boca Raton,Florida,1980にまと
められている。
本質的に好ましい化合物は新規な真菌代謝産物であり、
これはR′,R″,R及びR′がOHであり、R″が−
CH2CONH2であり、RがCH3でありそしてRが であるもの、すなわち式IA によって表わされる化合物である。
これはR′,R″,R及びR′がOHであり、R″が−
CH2CONH2であり、RがCH3でありそしてRが であるもの、すなわち式IA によって表わされる化合物である。
この化合物は1−[4,5−ジヒドロキシ−N2−(10,12−
ジメチル−1−オキソテトラデシル)−L−オルニチン
−5−(トレオ−3−ヒドロキシ−1−グルタミン)エ
キノカンジンBと名付けることができるが、便宜上以下
化合物IAという。1[(4R,5R)−4,5−ジヒドロキシ−
N2−(10,12−ジメチル−1−オキソ−テトラデシル)
−L−オルニチン−5−(トレオ−3−ヒドロキシ−1
−グルミン)エキノカンジンBと名付けられる異性体が
特に好ましい。以下に化合物IAの製造及び性質が説明さ
れるが、それらは共に断続中の1987年8月7日出願の米
国特許出願第105,795号及び第105,797号の主題でもあ
り、それらにさらに詳述されている。
ジメチル−1−オキソテトラデシル)−L−オルニチン
−5−(トレオ−3−ヒドロキシ−1−グルタミン)エ
キノカンジンBと名付けることができるが、便宜上以下
化合物IAという。1[(4R,5R)−4,5−ジヒドロキシ−
N2−(10,12−ジメチル−1−オキソ−テトラデシル)
−L−オルニチン−5−(トレオ−3−ヒドロキシ−1
−グルミン)エキノカンジンBと名付けられる異性体が
特に好ましい。以下に化合物IAの製造及び性質が説明さ
れるが、それらは共に断続中の1987年8月7日出願の米
国特許出願第105,795号及び第105,797号の主題でもあ
り、それらにさらに詳述されている。
好ましい化合物、化合物IA、は次の物理的性質によって
特徴付けることができる白色固体である。
特徴付けることができる白色固体である。
分解温度 206〜214℃ 実験式 C51H82N8O17 〔高分解能FAB(Fast Atom Bombardment質量分光測定,
計算値C51H82N8O17+Li=1085.5958,実測値 1085,614
6)〕; アミノ酸組成(スレオニン,ヒドロキシプロリン,メチ
ルヒドロキシプロリン及びヒドロキシグルタミン酸の各
1当量の全酸加水分解物のトリメチルシリル誘導体のカ
ズクロマトグラム/質量スペクトルによって測定)図1
に示したように400MHzでCD3ODにおける1H NMRスペクト
ル及び100MHzでCD3ODにおいて次のような13C NMR化学シ
フトが得られた。
計算値C51H82N8O17+Li=1085.5958,実測値 1085,614
6)〕; アミノ酸組成(スレオニン,ヒドロキシプロリン,メチ
ルヒドロキシプロリン及びヒドロキシグルタミン酸の各
1当量の全酸加水分解物のトリメチルシリル誘導体のカ
ズクロマトグラム/質量スペクトルによって測定)図1
に示したように400MHzでCD3ODにおける1H NMRスペクト
ル及び100MHzでCD3ODにおいて次のような13C NMR化学シ
フトが得られた。
11.20,11.64,19.75,20.25,20.78,27.00,28.07,30.33,3
0.37,30.61,30.76,31.19,31.29,32.94,34.83,36.69,38,
10,38.54,39.07,39.53,45.93,51.39,53.01,55.59,56.3
1,57.11,58.35,62.43,68.18,70.08,70.55,70.61,71.26,
73.94,75.72,75.84,76.86,116.06(x2),129.43(x2),
132.86,158.22,168.80,172.16,172.35,172.40,173.12,1
74.24,175.47,176.88ppm. この化合物は種々な有機溶媒、例えばメタノール、エタ
ノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
等に可溶である。
0.37,30.61,30.76,31.19,31.29,32.94,34.83,36.69,38,
10,38.54,39.07,39.53,45.93,51.39,53.01,55.59,56.3
1,57.11,58.35,62.43,68.18,70.08,70.55,70.61,71.26,
73.94,75.72,75.84,76.86,116.06(x2),129.43(x2),
132.86,158.22,168.80,172.16,172.35,172.40,173.12,1
74.24,175.47,176.88ppm. この化合物は種々な有機溶媒、例えばメタノール、エタ
ノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
等に可溶である。
新規化合物、化合物IA、の製造を以下に詳細に説明す
る。本発明の他の有用な化合物は、適当な微生物を代わ
りに使用することによって又は次いで説明されるような
他の手順によって同様な方法で製造され得る。
る。本発明の他の有用な化合物は、適当な微生物を代わ
りに使用することによって又は次いで説明されるような
他の手順によって同様な方法で製造され得る。
化合物IAはMerck & Co.,Rahway,N.J.のカチャー コレ
クションにおいてMF5171と命名され、ツァレリオン ア
ルボリコラ(Zalerion arboricola)として同定される
微生物の菌株を培養し、培地から該薬剤を回収すること
によって製造され得る。化合物IAを製造することができ
る培養株のサンプルは12301 Parklawn Drive,Rockvill
e,MD 20852のアメリカン タイプ カルチャー コレク
ション(American Type Culture Collection)のカルチ
ャー コレクションにブタペスト条約(Budapest Treat
y)の下に寄託されている。このサンプルは入手番号(a
ccession number)ATCC 20868を与えられている。
クションにおいてMF5171と命名され、ツァレリオン ア
ルボリコラ(Zalerion arboricola)として同定される
微生物の菌株を培養し、培地から該薬剤を回収すること
によって製造され得る。化合物IAを製造することができ
る培養株のサンプルは12301 Parklawn Drive,Rockvill
e,MD 20852のアメリカン タイプ カルチャー コレク
ション(American Type Culture Collection)のカルチ
ャー コレクションにブタペスト条約(Budapest Treat
y)の下に寄託されている。このサンプルは入手番号(a
ccession number)ATCC 20868を与えられている。
ATCC 20868のコロニー及び形態の説明を以下に述べる。
A.形態の説明 球状の、直径約6.0ミクロンの、厚い壁のある、暗色の
厚幕胞子に類似する構造が菌糸体に沿って発生し、しば
しば節間であるように見える。これらの構造は分割する
ように見え、容易には解体しない4〜8個の多細胞群を
形成している。ある培地では、菌糸体のクラスターのス
トランドが一緒になってロープ状の構造になり、多細胞
群が粘液質の物質によって一緒にされたような大きなク
ラスターを形成している。
厚幕胞子に類似する構造が菌糸体に沿って発生し、しば
しば節間であるように見える。これらの構造は分割する
ように見え、容易には解体しない4〜8個の多細胞群を
形成している。ある培地では、菌糸体のクラスターのス
トランドが一緒になってロープ状の構造になり、多細胞
群が粘液質の物質によって一緒にされたような大きなク
ラスターを形成している。
B.コロニーの説明 1.ツァペック−ドックス(Czapek−Dox)寒天 コロニーはゆっくりと成長し、成長は広範囲にわたら
ず、不規則な端部を有していて平坦である。菌糸体は黒
く光っていて;表面は、コロニーが時間を経るに従っ
て、鈍い粒状の、黒色から緑色を帯びた褐色になる。
ず、不規則な端部を有していて平坦である。菌糸体は黒
く光っていて;表面は、コロニーが時間を経るに従っ
て、鈍い粒状の、黒色から緑色を帯びた褐色になる。
2.コーン寒天 コロニーはゆっくりと成長する。成長は広範囲にわたら
ない。菌糸体は黒色であり、光っている表面は、コロニ
ーが時間を経るに従って、粉状の鈍い黒色になる。
ない。菌糸体は黒色であり、光っている表面は、コロニ
ーが時間を経るに従って、粉状の鈍い黒色になる。
3.ポテト−デキストロース寒天、サブロー (Sabouraud)マルトール寒天及び酵母抽出物−モルト
抽出物−デキストロース寒天 コロニーはゆっくりと成長する。生成は広範囲にわたら
ず、中央でわずかに盛り上り、端部がガラス状で規則的
であるサブロー−マルトース寒天以外、放射状にしわの
ある不規則な端部である。菌糸体は黒く光っており;コ
ロニーが時間を経るに従って、鈍い粉状の黒になる。
抽出物−デキストロース寒天 コロニーはゆっくりと成長する。生成は広範囲にわたら
ず、中央でわずかに盛り上り、端部がガラス状で規則的
であるサブロー−マルトース寒天以外、放射状にしわの
ある不規則な端部である。菌糸体は黒く光っており;コ
ロニーが時間を経るに従って、鈍い粉状の黒になる。
本発明は以下主として特定の菌株に関して説明される
が、微生物の性質が天然に又は人工的に変化され得るこ
とはこの技術分野において周知である。従って、天然の
選択によって得られるか、イオン化放射又は紫外線照射
のような突然変異を起させるものの作用によって産生さ
れるか、又はニトロソグアニジンのような化学的な突然
変異誘発要因によって産生されるかにかかわらず変種及
び突然変異体を含む属ATCC 20868は本発明の範囲内であ
ると考えられる。
が、微生物の性質が天然に又は人工的に変化され得るこ
とはこの技術分野において周知である。従って、天然の
選択によって得られるか、イオン化放射又は紫外線照射
のような突然変異を起させるものの作用によって産生さ
れるか、又はニトロソグアニジンのような化学的な突然
変異誘発要因によって産生されるかにかかわらず変種及
び突然変異体を含む属ATCC 20868は本発明の範囲内であ
ると考えられる。
実質的な量の抗生物質活性が培地中、一般にその菌糸体
に検出されるまで栄養培地においてツァレリオン アル
ボリコラの菌株ATCC 20868を培養し、その後発酵菌糸体
から活性成分を適当な溶媒中に回収し、活性成分の溶液
を濃縮し、次に濃縮物質をクロマトグラフ分離にかける
ことによって薬剤としての用途に適用できる形で化合物
IAを製造することができる。
に検出されるまで栄養培地においてツァレリオン アル
ボリコラの菌株ATCC 20868を培養し、その後発酵菌糸体
から活性成分を適当な溶媒中に回収し、活性成分の溶液
を濃縮し、次に濃縮物質をクロマトグラフ分離にかける
ことによって薬剤としての用途に適用できる形で化合物
IAを製造することができる。
発酵は微生物によって同化可能な炭素及び窒素源及び一
般的に低水準の無機塩類を含む培地中で行なわれる。さ
らに、炭素及び窒素の複合源を使用するならば金属は普
通その複合源に存在するけれども、培地に痕跡の金属を
加えることができる。
般的に低水準の無機塩類を含む培地中で行なわれる。さ
らに、炭素及び窒素の複合源を使用するならば金属は普
通その複合源に存在するけれども、培地に痕跡の金属を
加えることができる。
炭素源にはグリセロール、シュガー、スターチ、及び他
の炭水化物又は炭水化物誘導体、例えばデキストラン、
セレロース(cerelose)、及び複合栄養、例えばオート
麦粉、コーン粉、きび、コーン等がある。培地に使用さ
れる炭素源の正確な量は部分的には培地中の他の成分に
依存するであろう。しかし、通常培地の0.5重量%と5
重量%との間の量の炭化水物が適切であることが分って
いる。これらの炭素源を個別に使用することができ、ま
たいくつかのそのような炭素源を同じ培地中で組合せる
ことができる。
の炭水化物又は炭水化物誘導体、例えばデキストラン、
セレロース(cerelose)、及び複合栄養、例えばオート
麦粉、コーン粉、きび、コーン等がある。培地に使用さ
れる炭素源の正確な量は部分的には培地中の他の成分に
依存するであろう。しかし、通常培地の0.5重量%と5
重量%との間の量の炭化水物が適切であることが分って
いる。これらの炭素源を個別に使用することができ、ま
たいくつかのそのような炭素源を同じ培地中で組合せる
ことができる。
窒素源にはアミノ酸、例えばグリシン、アルギニンスレ
オニン、メチオニン等及び複合源、例えば酵母加水分解
物、酵母自己分解物質、酵母細胞、トマトペースト、大
豆粉、カゼイン加水分解物、酵母エキス、コーン・ステ
ィープ・リカー(corn steep requors)、ジスチラース
・ソリューブルス(distillers solubles)、綿実ミー
ル、肉エキス等がある。種々の窒素源を単独又は組合せ
て培地の0.2〜90重量%の範囲の量で使用することがで
きる。
オニン、メチオニン等及び複合源、例えば酵母加水分解
物、酵母自己分解物質、酵母細胞、トマトペースト、大
豆粉、カゼイン加水分解物、酵母エキス、コーン・ステ
ィープ・リカー(corn steep requors)、ジスチラース
・ソリューブルス(distillers solubles)、綿実ミー
ル、肉エキス等がある。種々の窒素源を単独又は組合せ
て培地の0.2〜90重量%の範囲の量で使用することがで
きる。
培地中に入れることができる栄養無機塩には、ナトリウ
ム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウ
ム、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、炭酸塩等のイオンを生
じることが慣用の塩がある。痕跡の金属、例えばコバル
ト、マンガン、鉄、モリブデン、亜鉛、カドミウム等も
含むことができる。
ム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウ
ム、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、炭酸塩等のイオンを生
じることが慣用の塩がある。痕跡の金属、例えばコバル
ト、マンガン、鉄、モリブデン、亜鉛、カドミウム等も
含むことができる。
発酵を行うために適当な培地は固体又は液体であること
ができる。
ができる。
固体培地はきび、コーン、オート麦、大豆又は小麦ベー
スを有することができる。きびベースを有する1つの培
地が実施例Aの培地2である。他の代表的な固体培地に
は次のものがある。
スを有することができる。きびベースを有する1つの培
地が実施例Aの培地2である。他の代表的な固体培地に
は次のものがある。
培 地 250mlフラスコ中の重量又は体積 培地A トウモロコシ(破砕品) 10.0g イースト抽出物 0.5g 酒石酸ナトリウム 0.1g グルタミン酸モノナトリウム 0.1g コーン油 0.1ml 硫酸鉄(II)・7H2O 0.01g 水 15−20ml 培地B 雑殻 15g イースト抽出物 0.5g 酒石酸ナトリウム 0.1g 硫酸鉄(III)・7H2O 0.01g スクロース 0.5g アルファルファ 0.5g コーン油 0.1ml 水 15ml 培地C 雑殻 15g イースト抽出物 0.5g 酒石酸ナトリウム 0.1g 硫酸鉄(III)・7H2O 0.01g シリカゲル 0.5g アルファルファ 0.5g グルタミン酸モノナトリウム 0.1g コーン油 0.1ml 水 15ml 培地D 雑殻 15g イースト抽出物 0.5g 酒石酸ナトリウム 0.1g 硫酸鉄(III)・7H2O 0.01g さらに、培地は、小麦、大麦、オートムギ若しくは大豆
を上述の雑殻やトウモロコシの代わりにすることで調製
してもよい。
を上述の雑殻やトウモロコシの代わりにすることで調製
してもよい。
液体培地もまた用いることが出来る。
より大きい規模での醗酵は、通常、より好都合には液体
培地を用いて行われる。従来の液体培地は化合物IAを得
るのに使用され得るが、そのような培地は、希望する抗
生物質の良好な収率を得るのに好適であるとは見出され
ていない。しかしながら、グリセロールを約6乃至9重
量パーセント混ぜることによって、希望する抗生物質化
合物の良好な収率が得られることが見出された。好適な
液体培地が含むのは: 培地E グリセロール 85g ペクチン 10g ピーナッツミール 4g ペプトン化ミルク 4g トマトペースト 4g コーンスティーブ(Corn Steep) 4g ラード水(Lard Water) 4g グリシン 2g KH2PO4 2g 蒸溜水で全体を1000mlにする……pH7.0 培地F デキストロース 10g グリセロール 10ml ソイフラワー(Soy Flour) 4g ペプトン化ミルク 4g トマトペースト 4g ラード水(Lard Water) 4g リン酸二水素カリウム 2g 塩化コバルト六水和物 0.01g 蒸溜水で全体を1000mlにする……pH7.0 化合物IAを製造するために、抗生物質産生生物の胞子若
しくは菌糸体を好適な培地に接種し好気性条件下で培養
することによって、ATCC 20868を含有する醗酵培地を調
製する。
培地を用いて行われる。従来の液体培地は化合物IAを得
るのに使用され得るが、そのような培地は、希望する抗
生物質の良好な収率を得るのに好適であるとは見出され
ていない。しかしながら、グリセロールを約6乃至9重
量パーセント混ぜることによって、希望する抗生物質化
合物の良好な収率が得られることが見出された。好適な
液体培地が含むのは: 培地E グリセロール 85g ペクチン 10g ピーナッツミール 4g ペプトン化ミルク 4g トマトペースト 4g コーンスティーブ(Corn Steep) 4g ラード水(Lard Water) 4g グリシン 2g KH2PO4 2g 蒸溜水で全体を1000mlにする……pH7.0 培地F デキストロース 10g グリセロール 10ml ソイフラワー(Soy Flour) 4g ペプトン化ミルク 4g トマトペースト 4g ラード水(Lard Water) 4g リン酸二水素カリウム 2g 塩化コバルト六水和物 0.01g 蒸溜水で全体を1000mlにする……pH7.0 化合物IAを製造するために、抗生物質産生生物の胞子若
しくは菌糸体を好適な培地に接種し好気性条件下で培養
することによって、ATCC 20868を含有する醗酵培地を調
製する。
概してその方法は初めに、栄養培地を含有する寒天傾斜
から貯蔵源の培養物を栄養分供給製造培地(nutrient s
eed−producing medium)に接種し、好ましくは2段階
の手順を経て、抗ニューモシスティス剤(antipneumocy
stis agent)の製造に於ける種として都合が良いその生
物の生長を得る。
から貯蔵源の培養物を栄養分供給製造培地(nutrient s
eed−producing medium)に接種し、好ましくは2段階
の手順を経て、抗ニューモシスティス剤(antipneumocy
stis agent)の製造に於ける種として都合が良いその生
物の生長を得る。
この工程において、ATCC20868の貯蔵培養物源の斜面部
分を、pH範囲5乃至8.1、最善には6乃至7.5の適当な液
体栄養分供給培地中へ接種する。そして、約15℃乃至約
30℃、好適には20℃乃至28℃の温度範囲で、撹拌しなが
らまたは撹拌することなしにフラスコを培養する。撹拌
する場合は、400rpmまでは構わないが、好ましくは約20
0乃至220rpmである。
分を、pH範囲5乃至8.1、最善には6乃至7.5の適当な液
体栄養分供給培地中へ接種する。そして、約15℃乃至約
30℃、好適には20℃乃至28℃の温度範囲で、撹拌しなが
らまたは撹拌することなしにフラスコを培養する。撹拌
する場合は、400rpmまでは構わないが、好ましくは約20
0乃至220rpmである。
培養は、2乃至30日間、好適には2乃至14日間にわたり
行われる。培養生長物は、生長に富んだ時に、普通は2
乃至5日のあいだだが、生成物培地に抗ニューモシステ
ィス剤の生産ために接種されるを常としてよい。しかし
ながら好適には、第二段階の醗酵が行われ、培養生長物
の部分を接種しそれから類似の条件を、但し通常は短く
した約1乃至3日の培養期間で、用いる。
行われる。培養生長物は、生長に富んだ時に、普通は2
乃至5日のあいだだが、生成物培地に抗ニューモシステ
ィス剤の生産ために接種されるを常としてよい。しかし
ながら好適には、第二段階の醗酵が行われ、培養生長物
の部分を接種しそれから類似の条件を、但し通常は短く
した約1乃至3日の培養期間で、用いる。
培養生長物を接種した醗酵製造培地は3乃至30日間、通
常は7乃至14日間撹拌しながらまたは撹拌することなし
に培養する。醗酵は約20℃乃至約40℃の温度範囲で好気
的に行われてもよい。最善の結果のために、約24℃乃至
約30℃の温度範囲でこれらの醗酵を行なうのが最も都合
がよい。約24−28℃の温度が最も好ましい。本化合物の
製造に好ましい栄養培地のpHは、好適な範囲を約6.0乃
至7.5として、約5.0乃至8.5の範囲に及ぶことが出来
る。希望する化合物の製造にとって適当な期間の後、そ
の終わりごろのものは、以下により十分に述べるよう
に、醗酵培地から回収される。
常は7乃至14日間撹拌しながらまたは撹拌することなし
に培養する。醗酵は約20℃乃至約40℃の温度範囲で好気
的に行われてもよい。最善の結果のために、約24℃乃至
約30℃の温度範囲でこれらの醗酵を行なうのが最も都合
がよい。約24−28℃の温度が最も好ましい。本化合物の
製造に好ましい栄養培地のpHは、好適な範囲を約6.0乃
至7.5として、約5.0乃至8.5の範囲に及ぶことが出来
る。希望する化合物の製造にとって適当な期間の後、そ
の終わりごろのものは、以下により十分に述べるよう
に、醗酵培地から回収される。
活性材料は次から成る段階によって醗酵培地から回収し
てもよい。
てもよい。
(1) 該培地にアルコールを添加し、撹拌し濾過し
て、得られたアルコール水溶液中に活性成分を回収す
る。
て、得られたアルコール水溶液中に活性成分を回収す
る。
(2) 濃縮したアルコール水溶液を初めに水溶液の小
さい体積にまで濃縮し、 (3) 得られた濃縮アルコール水溶液を水−非混合性
有機溶媒に密接に接触させて、その中に活性成分を抽出
若しくは分配し、そして濃縮し、又はその濃縮された溶
液をHP−20吸着及び溶離に処する。それから、 (4) 段階(3)で回収された材料を少なくとも一つ
のクロマトグラフ分離に処して、各々のクロマトグラフ
分離においてCandida albicansに対して活性を示す溶出
分からの活性成分を合わせて濃縮し、化合物IAを回収す
る。
さい体積にまで濃縮し、 (3) 得られた濃縮アルコール水溶液を水−非混合性
有機溶媒に密接に接触させて、その中に活性成分を抽出
若しくは分配し、そして濃縮し、又はその濃縮された溶
液をHP−20吸着及び溶離に処する。それから、 (4) 段階(3)で回収された材料を少なくとも一つ
のクロマトグラフ分離に処して、各々のクロマトグラフ
分離においてCandida albicansに対して活性を示す溶出
分からの活性成分を合わせて濃縮し、化合物IAを回収す
る。
的確な段階は、醗酵が液体培地内で行われたのか或いは
固体培地内なのかどうか、どんな溶媒が用いられたか、
そしてどんな吸着剤及びその組み合わせが用いられたか
で幾分か異なってよい。
固体培地内なのかどうか、どんな溶媒が用いられたか、
そしてどんな吸着剤及びその組み合わせが用いられたか
で幾分か異なってよい。
醗酵が固体培地で行われる場合、最初の段階はアルコー
ル溶液を醗酵培地に加えることによって行われ、完全に
混合し、そして濾過し回収してアルコール水溶液濾液を
濃縮する。好ましくは、濃縮された濾液を最初にヘキサ
ン或いは他のアルカンのような低級脂肪族炭化水素溶媒
で逆抽出若しくは洗浄しアルカン可溶性不純物を除去す
る。アルカン洗浄した濾液は水−非混合性の酸化された
有機溶媒で抽出し若しくは分配し、得た溶液は濃縮して
から、カラムに配置し、少なくとも一つ、通常は幾つか
のクロマトグラフ分離段階に処す。好適なカラムは、シ
リカゲル、逆相そしてSEPHADEXLH−20である。
ル溶液を醗酵培地に加えることによって行われ、完全に
混合し、そして濾過し回収してアルコール水溶液濾液を
濃縮する。好ましくは、濃縮された濾液を最初にヘキサ
ン或いは他のアルカンのような低級脂肪族炭化水素溶媒
で逆抽出若しくは洗浄しアルカン可溶性不純物を除去す
る。アルカン洗浄した濾液は水−非混合性の酸化された
有機溶媒で抽出し若しくは分配し、得た溶液は濃縮して
から、カラムに配置し、少なくとも一つ、通常は幾つか
のクロマトグラフ分離段階に処す。好適なカラムは、シ
リカゲル、逆相そしてSEPHADEXLH−20である。
醗酵が液体培地で行われる場合は、一つの方法では、菌
糸体固体が濾過されて醗酵培地から回収される。アルコ
ールを菌糸体ケーキに加え、その菌糸体固体をアルコー
ルと完全に混合し、濾過して、濾液は集められて濃縮さ
れる。もう一つの方法では、全ての肉汁は一体積のアル
コール、好ましくはメタノールを加えることで抽出する
ことができ、濾過して固体不純物を除去する。それから
アルコール抽出物をDIAION SP−207または他の市販され
ているスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーに吸着さ
せる。第二希釈溶液/HP−20吸着/溶出 段階は、クロ
マトグラフ分離の用意にサンプルを濃縮するために利用
される。時々、第三希釈溶液/HP−20吸着/溶出 段階
が体積縮小のためには望ましい。
糸体固体が濾過されて醗酵培地から回収される。アルコ
ールを菌糸体ケーキに加え、その菌糸体固体をアルコー
ルと完全に混合し、濾過して、濾液は集められて濃縮さ
れる。もう一つの方法では、全ての肉汁は一体積のアル
コール、好ましくはメタノールを加えることで抽出する
ことができ、濾過して固体不純物を除去する。それから
アルコール抽出物をDIAION SP−207または他の市販され
ているスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーに吸着さ
せる。第二希釈溶液/HP−20吸着/溶出 段階は、クロ
マトグラフ分離の用意にサンプルを濃縮するために利用
される。時々、第三希釈溶液/HP−20吸着/溶出 段階
が体積縮小のためには望ましい。
固体栄養培地からの若しくは菌糸体パッドからの活性剤
の初期抽出に用いられるアルコール溶媒は、メタノー
ル、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコー
ルのいずれであってもよい。メタノールが好適である。
の初期抽出に用いられるアルコール溶媒は、メタノー
ル、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコー
ルのいずれであってもよい。メタノールが好適である。
アルカノールまたはメタノール溶液からの活性剤の抽出
若しくは分配に有用な水−非混合性非極性有機溶媒は、
酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチルなどのエス
テルか、メチルエチルケトンのようなケトンである。低
級脂肪酸エステルが好適である。
若しくは分配に有用な水−非混合性非極性有機溶媒は、
酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチルなどのエス
テルか、メチルエチルケトンのようなケトンである。低
級脂肪酸エステルが好適である。
クロマトグラフィーによる分離は、非イオン性樹脂を有
する慣用のカラムクロマトグラフィーを用いることによ
って、または逆相樹脂を利用した高性能液体クロマトグ
ラフィーによって行うことができる。抗生化合物IAを含
む画分はカンディダアルビカンス(Candida albicans)
を用いてバイオオートグラフィーにより検出することが
できる。一般にクロマトグラフィーによる2段階以上の
分離工程が用いられる。最も好ましい操作にあっては、
1工程以上の分離をカラムクロマトグラフィーを用いて
行い、最終分離工程をC18逆相樹脂を有する高性能液体
クロマトグラフィー(HPLC)を用いて行う。
する慣用のカラムクロマトグラフィーを用いることによ
って、または逆相樹脂を利用した高性能液体クロマトグ
ラフィーによって行うことができる。抗生化合物IAを含
む画分はカンディダアルビカンス(Candida albicans)
を用いてバイオオートグラフィーにより検出することが
できる。一般にクロマトグラフィーによる2段階以上の
分離工程が用いられる。最も好ましい操作にあっては、
1工程以上の分離をカラムクロマトグラフィーを用いて
行い、最終分離工程をC18逆相樹脂を有する高性能液体
クロマトグラフィー(HPLC)を用いて行う。
クロマトグラフィーによる分離に、慣用のカラムクロマ
トグラフィーを用いる場合は、シリカゲルが好ましい吸
着剤である。通常、クロマトグラフィーによる2段階以
上の分離が必要となる。シリカゲルは、異なる溶離剤を
用いる場合でも、全分離工程で使用することができる。
しかし他の吸着剤、例えばSEPHADEX LH−20(Pharmacia
社製)の商品名で販売されているデキストランゲルの使
用と有利に組み合わせることができる。他の吸着剤とし
て、アルミナやDIAION HP−20,HP−30,HP−40,SP−207
(三菱化成工業製)やAMBERLITE XAD−2,XAD−4,XAD−1
6[ロームアンドハース(Rohm and Haas社製]として商
業的に入手し得るスチレン−ジビニルベンゼン共重合体
もまた使用することができる。
トグラフィーを用いる場合は、シリカゲルが好ましい吸
着剤である。通常、クロマトグラフィーによる2段階以
上の分離が必要となる。シリカゲルは、異なる溶離剤を
用いる場合でも、全分離工程で使用することができる。
しかし他の吸着剤、例えばSEPHADEX LH−20(Pharmacia
社製)の商品名で販売されているデキストランゲルの使
用と有利に組み合わせることができる。他の吸着剤とし
て、アルミナやDIAION HP−20,HP−30,HP−40,SP−207
(三菱化成工業製)やAMBERLITE XAD−2,XAD−4,XAD−1
6[ロームアンドハース(Rohm and Haas社製]として商
業的に入手し得るスチレン−ジビニルベンゼン共重合体
もまた使用することができる。
シリカゲル上クロマトグラフィーによる活性成分の分別
並びに回収にあっては、アルコールの濃度を増大させた
エステル/アルコール混合物が良好な分離を与える。酢
酸エチルとメタノールとの混合物が特に有効であること
が判った。これら混合物は均等(isocratic)、段階勾
配または連続勾配の各系に置いて用いることができる。
SEPHADEXLH−20のようなデキストラン吸着剤を使用する
場合は、塩化炭化水素/炭化水素/アルコール溶剤系を
用いることができる。塩化メチレン/ヘキサン/メタノ
ールの混合物が特に有効であるこのが分かった。
並びに回収にあっては、アルコールの濃度を増大させた
エステル/アルコール混合物が良好な分離を与える。酢
酸エチルとメタノールとの混合物が特に有効であること
が判った。これら混合物は均等(isocratic)、段階勾
配または連続勾配の各系に置いて用いることができる。
SEPHADEXLH−20のようなデキストラン吸着剤を使用する
場合は、塩化炭化水素/炭化水素/アルコール溶剤系を
用いることができる。塩化メチレン/ヘキサン/メタノ
ールの混合物が特に有効であるこのが分かった。
HPLCによる分離を行うには、慣用のクロマトグラフィー
から回収された物質を含むアルコール溶液を濃縮し、残
さをメタノールに溶解して市販の逆相樹脂を詰めたカラ
ム上または文献に詳細に報告されているようにして製造
したシリカゲル/C18逆相樹脂を充填したカラム上に置く
ようにする。或いは、上記アルコール溶液を水で50%に
希釈し、ポンプでカラム上に載せることもできる。カラ
ムをメタン/水(1:1または所望により他の比)を用い
て800−2000psiで操作し、約20ml/分の流量を得る。分
離を210nmにおいてモニターする。
から回収された物質を含むアルコール溶液を濃縮し、残
さをメタノールに溶解して市販の逆相樹脂を詰めたカラ
ム上または文献に詳細に報告されているようにして製造
したシリカゲル/C18逆相樹脂を充填したカラム上に置く
ようにする。或いは、上記アルコール溶液を水で50%に
希釈し、ポンプでカラム上に載せることもできる。カラ
ムをメタン/水(1:1または所望により他の比)を用い
て800−2000psiで操作し、約20ml/分の流量を得る。分
離を210nmにおいてモニターする。
得られた画分の活性をカンディダアルビカンス(Candid
a albicans)を用いて検定する。活性画分を合せ、減圧
下で濃縮することによりクロマトグラフィー操作から生
成物を回収する。生成物は次いで慣用のクロマトグラフ
ィーあるいは調整用HPLCによって精製することができ
る。
a albicans)を用いて検定する。活性画分を合せ、減圧
下で濃縮することによりクロマトグラフィー操作から生
成物を回収する。生成物は次いで慣用のクロマトグラフ
ィーあるいは調整用HPLCによって精製することができ
る。
本発明に包含される他の天然生成物としては、エキノカ
ンディン類(echinocandins),アクレアシン類(acule
acins),ムルンドカンディン類(mulundocandins),
アスレスタイン[(athlestain),エキノカンディンT
(echinocandin T)とも呼ばれる],スポリノフンギン
(sporinofungin)として、または番号による指定によ
って文献中に記述されるものを挙げることができる。幾
つかのものについては構造は完全には特定されていない
が、これら化合物は脂肪酸側鎖を有する中性シクロヘキ
サペプチドとして知られている。
ンディン類(echinocandins),アクレアシン類(acule
acins),ムルンドカンディン類(mulundocandins),
アスレスタイン[(athlestain),エキノカンディンT
(echinocandin T)とも呼ばれる],スポリノフンギン
(sporinofungin)として、または番号による指定によ
って文献中に記述されるものを挙げることができる。幾
つかのものについては構造は完全には特定されていない
が、これら化合物は脂肪酸側鎖を有する中性シクロヘキ
サペプチドとして知られている。
エキノカンディンスとしては、Aspergillus nidulans−
echinulatus(スイス特許第568,386号)により製造され
るエキノカンディン−A[(echinocandin−A),A−32
204−Aとしても知られる];Asp.nidulans(スイス特許
第568,386号)及びAsp.rugulosus(Helv.Chim.Acta 62
11252(1979);ドイツ特許第2,549,127号;ベルギー特
許第834,289号)により製造されるエキノカンディン−
B[(echinocandin−B),A−32204−B並びにSF−781
0−Fとしても知られる];Asp.rugulosus(ドイツ特許
第2,549,127号;ベルギー特許第834,289号)により製造
されるエキノカンディン−C[(echinocandin−C),S
L−7810−FIIとしても知られる];Asp.rugulosus(ドイ
ツ特許第2,549,127号;ベルギー特許第834,289号)によ
り製造されるエキノカンディン−D[(echinocandin−
D),SL−7810−FIIIとしても知られる]が挙げられ
る。
echinulatus(スイス特許第568,386号)により製造され
るエキノカンディン−A[(echinocandin−A),A−32
204−Aとしても知られる];Asp.nidulans(スイス特許
第568,386号)及びAsp.rugulosus(Helv.Chim.Acta 62
11252(1979);ドイツ特許第2,549,127号;ベルギー特
許第834,289号)により製造されるエキノカンディン−
B[(echinocandin−B),A−32204−B並びにSF−781
0−Fとしても知られる];Asp.rugulosus(ドイツ特許
第2,549,127号;ベルギー特許第834,289号)により製造
されるエキノカンディン−C[(echinocandin−C),S
L−7810−FIIとしても知られる];Asp.rugulosus(ドイ
ツ特許第2,549,127号;ベルギー特許第834,289号)によ
り製造されるエキノカンディン−D[(echinocandin−
D),SL−7810−FIIIとしても知られる]が挙げられ
る。
エキノカンディン類B、CおよびDはAspergillus rugu
losus株の発酵によって一緒に得ることができる。Asper
gillus rugulosusの発酵における主な代謝産生はエキノ
カンディンBでC52H81N7O16の分子式を有する。エキノ
カンディンCおよびDは従たる代謝産物であり、環式ペ
プチド環を構成するアミノ酸の幾つかが異なる。すなわ
ち、エキノカンディンCでC52H81N7O15の分子式を有
し、エキノカンディンB中に存在する3、4−ジヒドロ
キシホモチロシンに代えて3−ヒドロキシホモチロシン
を有する。エキノカンディンDはC52H81N7O13の分子式
を有し、3、4−ジヒドロキシホモチロシン並びに4、
5−ジヒドロキシオルニチンに代えて3−ヒドロキシホ
モチロシンおよびオルニチンを有するものである。
losus株の発酵によって一緒に得ることができる。Asper
gillus rugulosusの発酵における主な代謝産生はエキノ
カンディンBでC52H81N7O16の分子式を有する。エキノ
カンディンCおよびDは従たる代謝産物であり、環式ペ
プチド環を構成するアミノ酸の幾つかが異なる。すなわ
ち、エキノカンディンCでC52H81N7O15の分子式を有
し、エキノカンディンB中に存在する3、4−ジヒドロ
キシホモチロシンに代えて3−ヒドロキシホモチロシン
を有する。エキノカンディンDはC52H81N7O13の分子式
を有し、3、4−ジヒドロキシホモチロシン並びに4、
5−ジヒドロキシオルニチンに代えて3−ヒドロキシホ
モチロシンおよびオルニチンを有するものである。
エキノカンディンBは実施例中に記載されているよう
に、Emericella nidulansの培養によっても製造するこ
とができる。
に、Emericella nidulansの培養によっても製造するこ
とができる。
アクレアシン類にはアクレアシン−A、アクレアシン−
B、アクレアシン−C、アクレアシン−D、アクレアシ
ン−E、アクレアシン−F、アクレアシン−G、アクレ
アシン−AA″、アクレアシン−DA″、アクレアシン−A
G″、アクレアシン−Aα、アクレアシン−Aγ、並び
にアクレアシン−DαおよびDγが含まれる。アクレア
シン類は米国特許第3,978,210号および第4,212,858号、
ドイツ特許第2,509,820号並びにベルギー特許第826,393
に記載されているように、Aspergillus aculeatus(液
体または固体培養菌のいずれか)(好ましくはM4214FER
M−P2324)を発酵させ、次いでの菌糸を水混和性有機溶
媒で抽出し、濃縮し、さらにクロマトグラフィーによる
精製することにより製造することができる。
B、アクレアシン−C、アクレアシン−D、アクレアシ
ン−E、アクレアシン−F、アクレアシン−G、アクレ
アシン−AA″、アクレアシン−DA″、アクレアシン−A
G″、アクレアシン−Aα、アクレアシン−Aγ、並び
にアクレアシン−DαおよびDγが含まれる。アクレア
シン類は米国特許第3,978,210号および第4,212,858号、
ドイツ特許第2,509,820号並びにベルギー特許第826,393
に記載されているように、Aspergillus aculeatus(液
体または固体培養菌のいずれか)(好ましくはM4214FER
M−P2324)を発酵させ、次いでの菌糸を水混和性有機溶
媒で抽出し、濃縮し、さらにクロマトグラフィーによる
精製することにより製造することができる。
文献中に見出だされる他のシクロヘキサペプチド抗生物
質はAsp.sydowic No.Y−30462(J.Antibiotics 40,275
および40,281(1987))により製造されるムルンドカン
ディン(mulundocandin)(R′,R″,R,R′はOHで
あり、R″はHであり、Rは−CO(CH2)10−CH3CH−
CH2CH3である)である。この抗生物質は培養菌の濾液と
菌糸の双方に存在し、Roy et al,J.Antibiotics 4,275
−280(1987)に、より詳細に記載されているように、
培養濾液の酢酸エチル抽出物から、シリカゲルカラムク
ロマトグラフィーおよび微粒液滴向流クロマトグラフィ
ーにより単離することができる。
質はAsp.sydowic No.Y−30462(J.Antibiotics 40,275
および40,281(1987))により製造されるムルンドカン
ディン(mulundocandin)(R′,R″,R,R′はOHで
あり、R″はHであり、Rは−CO(CH2)10−CH3CH−
CH2CH3である)である。この抗生物質は培養菌の濾液と
菌糸の双方に存在し、Roy et al,J.Antibiotics 4,275
−280(1987)に、より詳細に記載されているように、
培養濾液の酢酸エチル抽出物から、シリカゲルカラムク
ロマトグラフィーおよび微粒液滴向流クロマトグラフィ
ーにより単離することができる。
文献中に報告されているもう一つのエキノカンディン型
環式ペプチドはスポリオフンギン(sporiofungin)
(R′、R′およびR′はOHであり、R″はHであ
り、R′はCH2CONH2であり、RはHであり、Rは
分枝鎖C16脂肪酸基である)であり、この物質はCryptos
poriopsis(WIPO公開、WO 82/00587)菌株ATCC20594ま
たはNRRL 12192を好気的表面培養または浸漬培養として
種々の慣用の栄養培地上で培養することにより得ること
ができ、菌糸を培養肉汁より分離し、慣用的な方法、例
えばWO 82/00587に、より詳細に記載されているよう
に、菌糸をメタノールで均質化し、酢酸エチルのような
水混和性有機溶媒でメタノールから抽出し、溶媒を除去
し、クロマトグラフィーにより精製することにより回収
される。
環式ペプチドはスポリオフンギン(sporiofungin)
(R′、R′およびR′はOHであり、R″はHであ
り、R′はCH2CONH2であり、RはHであり、Rは
分枝鎖C16脂肪酸基である)であり、この物質はCryptos
poriopsis(WIPO公開、WO 82/00587)菌株ATCC20594ま
たはNRRL 12192を好気的表面培養または浸漬培養として
種々の慣用の栄養培地上で培養することにより得ること
ができ、菌糸を培養肉汁より分離し、慣用的な方法、例
えばWO 82/00587に、より詳細に記載されているよう
に、菌糸をメタノールで均質化し、酢酸エチルのような
水混和性有機溶媒でメタノールから抽出し、溶媒を除去
し、クロマトグラフィーにより精製することにより回収
される。
他のエキノカンディン型シクロヘキサペプチドとして
は、Aspergillus rugulosus(Ind.J.B.Biochem.7,81(1
970))により製造されるX−73,Aspergillus niger(J
ap.J.Ant.,17 268(1964),特公昭41−12688;カナダ特
許第65,19274号;同70,27607号)により製造されるathl
estain,Acrophialophora limonispora(米国特許第4,17
3,629号;ドイツ特許第2,628,965)により製造されるS
−3179−F−1,Asp.nidulansおよびAsp.rugulosus(米
国特許第4,074,246号;4,074,245号:4,288,549号;ドイ
ツ特許第2,643,485号;カナダ特許第87,20612号)によ
り製造されるA−30912−AまたはA−22082、Asp.rugu
losus(米国特許第4,024,245号)により製造されるA−
30912−B,,A−30912−CおよびA−30912−Dが挙げら
れる。
は、Aspergillus rugulosus(Ind.J.B.Biochem.7,81(1
970))により製造されるX−73,Aspergillus niger(J
ap.J.Ant.,17 268(1964),特公昭41−12688;カナダ特
許第65,19274号;同70,27607号)により製造されるathl
estain,Acrophialophora limonispora(米国特許第4,17
3,629号;ドイツ特許第2,628,965)により製造されるS
−3179−F−1,Asp.nidulansおよびAsp.rugulosus(米
国特許第4,074,246号;4,074,245号:4,288,549号;ドイ
ツ特許第2,643,485号;カナダ特許第87,20612号)によ
り製造されるA−30912−AまたはA−22082、Asp.rugu
losus(米国特許第4,024,245号)により製造されるA−
30912−B,,A−30912−CおよびA−30912−Dが挙げら
れる。
天然生成物の変形物質である化合物としては、側鎖すな
わちRが不飽和脂肪酸である場合に、これが還元によっ
て変形されたものが挙げられる。これは大気圧下におい
て炭素上Pdを用いて触媒的に行うことができる。
わちRが不飽和脂肪酸である場合に、これが還元によっ
て変形されたものが挙げられる。これは大気圧下におい
て炭素上Pdを用いて触媒的に行うことができる。
Rが−O−アルキル(C1−C6)または−O−ベンジル
である化合物類は、RがOHである対応する化合物を、
適当なアルカノールと共に、酸性条件下、室温において
数時間ないし一晩中撹拌して混合物中にエーテルを得、
さらに好ましくは反応物を希炭酸水素塩で急冷し、慣用
操作で反応物を回収することにより得ることができる。
下記実施例中に記載の製法に加え、イギリス特許公開第
2,050,385Aにはこれら化合物の多くの製造について詳細
に記載されている。
である化合物類は、RがOHである対応する化合物を、
適当なアルカノールと共に、酸性条件下、室温において
数時間ないし一晩中撹拌して混合物中にエーテルを得、
さらに好ましくは反応物を希炭酸水素塩で急冷し、慣用
操作で反応物を回収することにより得ることができる。
下記実施例中に記載の製法に加え、イギリス特許公開第
2,050,385Aにはこれら化合物の多くの製造について詳細
に記載されている。
Rが (式中R1は水素、アルキルまたは上に定義した置換アル
キルであり、R2は水素またはC1−C4アルキルであり、あ
るいはR1とR2とは一緒になって−(CH2)2−Q−(C
H2)2−(式中Qは−CH2、−NH−または−N(低級ア
ルキル)−のような連結基である)を形成する)である
化合物は、RがOHである化合物を式 の化合物と、p−トルエンスルホン酸、メタンスルホン
酸のような有機酸または鉱酸の存在下、ジメチルホルム
アミドのような非プロトン溶媒中で反応させることによ
り製造することができ、この方法はベルギー特許第851,
310号に詳細に記載されている。
キルであり、R2は水素またはC1−C4アルキルであり、あ
るいはR1とR2とは一緒になって−(CH2)2−Q−(C
H2)2−(式中Qは−CH2、−NH−または−N(低級ア
ルキル)−のような連結基である)を形成する)である
化合物は、RがOHである化合物を式 の化合物と、p−トルエンスルホン酸、メタンスルホン
酸のような有機酸または鉱酸の存在下、ジメチルホルム
アミドのような非プロトン溶媒中で反応させることによ
り製造することができ、この方法はベルギー特許第851,
310号に詳細に記載されている。
アシル側鎖すなわち式中のRが天然発生脂肪酸から構造
的に特徴のあるアシル基に変形された半合成化合物は、
最初に脂肪酸側鎖を除去した後、特徴的なアシル基を導
入することにより製造することができる。脂肪酸側鎖は
好ましくは酵素的に除去する。シクロヘキサペプチド類
を脱アシル化して環式ペプチド核を得るために有用な酵
素は、Actinoplanaceae族のある種の微生物、特にノー
ザンリージョナルリサーチセンター(Northern Regiona
l Research Center),USDA,アグリカルチャルリサーチ
サービス(Agricultural Research Service,ペオリア
(Peoria)I11 61604から入手できるかまたはアメリカ
合衆国、メリーランド20852,ロックビル、パークローン
ドライヴ12301のアメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョンから得られるA.utahensis ATCC 14539として入手し
得る微生物A ctinoplanes utahensis NRRL 12052によっ
て製造されるものである。
的に特徴のあるアシル基に変形された半合成化合物は、
最初に脂肪酸側鎖を除去した後、特徴的なアシル基を導
入することにより製造することができる。脂肪酸側鎖は
好ましくは酵素的に除去する。シクロヘキサペプチド類
を脱アシル化して環式ペプチド核を得るために有用な酵
素は、Actinoplanaceae族のある種の微生物、特にノー
ザンリージョナルリサーチセンター(Northern Regiona
l Research Center),USDA,アグリカルチャルリサーチ
サービス(Agricultural Research Service,ペオリア
(Peoria)I11 61604から入手できるかまたはアメリカ
合衆国、メリーランド20852,ロックビル、パークローン
ドライヴ12301のアメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョンから得られるA.utahensis ATCC 14539として入手し
得る微生物A ctinoplanes utahensis NRRL 12052によっ
て製造されるものである。
酵素はアクチノプラナセアエ(Actinoplanaceae)を、
温度約25℃ないし30℃、pHを約5.0ないし8.0、好ましく
は6.0ないし7.0にて、培地中で約40ないし約60時間、か
くはんおよび通気しながら培養することによって調製す
ることができる。この培地は以下のものを含有する。
(a)同化性の炭素源、たとえばスクロース、グルコー
スまたはグリセロール;(b)窒素源、たとえばペプト
ン、尿素または硫酸アンモニウム;(c)りん酸塩源、
たとえば可溶性りん酸塩および(d)成長促進無機塩。
温度約25℃ないし30℃、pHを約5.0ないし8.0、好ましく
は6.0ないし7.0にて、培地中で約40ないし約60時間、か
くはんおよび通気しながら培養することによって調製す
ることができる。この培地は以下のものを含有する。
(a)同化性の炭素源、たとえばスクロース、グルコー
スまたはグリセロール;(b)窒素源、たとえばペプト
ン、尿素または硫酸アンモニウム;(c)りん酸塩源、
たとえば可溶性りん酸塩および(d)成長促進無機塩。
脱アシル化において、シクロヘキサペプチド化合物また
はシクロヘキサペプチド含有基質を、少なくとも48時間
インキュベートしたアクチノプラナセアエの培養物に添
加する。基質添加後、温度を約25℃ないし約30℃の範囲
で、培養物のインキュベーションを約24時間以上にわた
って続ける。
はシクロヘキサペプチド含有基質を、少なくとも48時間
インキュベートしたアクチノプラナセアエの培養物に添
加する。基質添加後、温度を約25℃ないし約30℃の範囲
で、培養物のインキュベーションを約24時間以上にわた
って続ける。
反応はカンジダ アルビカンス(Candida albicans)検
定によってモニターすることができる。最初のシクロヘ
キサペプチド化合物は、カンジダ アルビカンスに対し
て活性であるが、脱アシル化された核化合物(nucleus
compound)は微生物学的に不活性である。
定によってモニターすることができる。最初のシクロヘ
キサペプチド化合物は、カンジダ アルビカンスに対し
て活性であるが、脱アシル化された核化合物(nucleus
compound)は微生物学的に不活性である。
その後脱アシル化された核化合物を、半合成化合物の調
製に使用することができる。従来のアシル化法を使用す
ることができる。一つの好ましい方法においては、所望
の酸の2,4,5−トリクロロフェニルエステルを、脱アシ
ル化核化合物と不活性溶媒中、たとえばジメチルホルム
アミド中室温で約15ないし18時間反応させる。これを以
下の例により説明する。
製に使用することができる。従来のアシル化法を使用す
ることができる。一つの好ましい方法においては、所望
の酸の2,4,5−トリクロロフェニルエステルを、脱アシ
ル化核化合物と不活性溶媒中、たとえばジメチルホルム
アミド中室温で約15ないし18時間反応させる。これを以
下の例により説明する。
下記構造式の脱アシル化核化合物 〔式中、EはH(化合物IBi)を表わす〕を、まず斜面
にアクチノプラネス ウタヘンシス(Actinoplanes uta
hensis)NRRL 12052を接種し、該斜面を30℃で約8ない
し10日間インキュベートした後、その斜面培養物を使用
して増殖培地50mlに接種し、震動させながら30℃で72時
間インキュベートしてアクチノプラネス ウタヘンシス
を発酵させることにより、まず脱アシル化酵素を調製す
ることにより調整することができる。そのインキュベー
トした増殖培地を使用して、第一段階の培地と同じ組成
を有する第二段階の培地400mlに接種し、震動させなが
ら30℃で約48時間インキュベートする。その後、該培地
800mlを使用して、生産培地100に接種し、かくはんと
通気を行ない大気圧における空気飽和の30%以上の溶解
酸素レベルを維持しつつ、約30℃で42時間発酵させ、所
望の脱アシル化酵素を得る。
にアクチノプラネス ウタヘンシス(Actinoplanes uta
hensis)NRRL 12052を接種し、該斜面を30℃で約8ない
し10日間インキュベートした後、その斜面培養物を使用
して増殖培地50mlに接種し、震動させながら30℃で72時
間インキュベートしてアクチノプラネス ウタヘンシス
を発酵させることにより、まず脱アシル化酵素を調製す
ることにより調整することができる。そのインキュベー
トした増殖培地を使用して、第一段階の培地と同じ組成
を有する第二段階の培地400mlに接種し、震動させなが
ら30℃で約48時間インキュベートする。その後、該培地
800mlを使用して、生産培地100に接種し、かくはんと
通気を行ない大気圧における空気飽和の30%以上の溶解
酸素レベルを維持しつつ、約30℃で42時間発酵させ、所
望の脱アシル化酵素を得る。
斜面を調製するための培地は、以下の組成を有すること
ができる:ベビーオートミール60.0g;イースト2.5g;K2H
PO41.0g;クゼペク(Czepek)ミネラル ストック5.0ml;
寒天25.0g;脱イオン水で1とする。クゼペクミネラル
ストックは以下の組成を有する:FeSO4・7H2O(2ml中
濃塩酸)2g;KCl 100g;MgSO4・7H2O 100g;脱イオン水で
最終pHを6.7に調整した1とする。
ができる:ベビーオートミール60.0g;イースト2.5g;K2H
PO41.0g;クゼペク(Czepek)ミネラル ストック5.0ml;
寒天25.0g;脱イオン水で1とする。クゼペクミネラル
ストックは以下の組成を有する:FeSO4・7H2O(2ml中
濃塩酸)2g;KCl 100g;MgSO4・7H2O 100g;脱イオン水で
最終pHを6.7に調整した1とする。
第一段階と第二段階の増殖培地両者に適する培地は、以
下の組成を有することができる:ベビーオートミール2
0.0g;スクロース20.0g;イースト2.5g;乾燥殻物5.0g;K2H
PO41.0g;クゼペク ミネラル ストック5.0mlおよび脱
イオン水で1とし最終pH6.8とする。
下の組成を有することができる:ベビーオートミール2
0.0g;スクロース20.0g;イースト2.5g;乾燥殻物5.0g;K2H
PO41.0g;クゼペク ミネラル ストック5.0mlおよび脱
イオン水で1とし最終pH6.8とする。
生産培地は以下の組成とすることができる:ピーナッツ
ミール10.0g;可溶性ミート ペプトン5.0g;スクロー
ス20.0g;KH2PO4 0.5g;K2HPO4 1.2g;MgSO4・7H2O 0.25g;
水道水で1とする。
ミール10.0g;可溶性ミート ペプトン5.0g;スクロー
ス20.0g;KH2PO4 0.5g;K2HPO4 1.2g;MgSO4・7H2O 0.25g;
水道水で1とする。
シクロヘキサペプチド(IB)のアルコール溶液〔Eはス
テアロイル(テトラヒドロエキノカンジン(tetrahydro
echinocandin)B)またはパルミトイル(アクレアシン
(aculeacin)A)〕を、上記生産発酵培地に加え、脱
アシル化をカンジダアルビカンスに対する検定によりモ
ニターする。
テアロイル(テトラヒドロエキノカンジン(tetrahydro
echinocandin)B)またはパルミトイル(アクレアシン
(aculeacin)A)〕を、上記生産発酵培地に加え、脱
アシル化をカンジダアルビカンスに対する検定によりモ
ニターする。
脱アシル化の終了と同時に、核化合物を含有する発酵肉
汁培地を濾過し、HP−20樹脂に通して核化合物をカラム
上に置き、該化合物を200−300ml/分の速度で水/メタ
ノール(7/3)で溶離した。溶出液を、酸塩化物で処理
することにより核化合物についてモニターし、カンジダ
アルビカンスに対する活性について検定を行なう。活
性を示す溶出液の画分を濃縮して核化合物(IBi)を得
る。
汁培地を濾過し、HP−20樹脂に通して核化合物をカラム
上に置き、該化合物を200−300ml/分の速度で水/メタ
ノール(7/3)で溶離した。溶出液を、酸塩化物で処理
することにより核化合物についてモニターし、カンジダ
アルビカンスに対する活性について検定を行なう。活
性を示す溶出液の画分を濃縮して核化合物(IBi)を得
る。
このようにして得られた脱アシル化シクロペプチド化合
物を、水/アセトニトリル/酢酸/ピリジン(96/2/1/
1)中に溶解して精製し、流速約60ml/分で逆層液体クロ
マトグラフィー(LICHROPREP RP−18)により精製し、U
Vモニターを使用して280nmにて分離をモニターする。28
0nmにおける吸収に基づいて、所望の化合物を含有する
画分を結合させ、減圧下で濃縮してアシル化に使用する
かまたは以後の使用に供するため凍結乾燥する。エキノ
カシジンタイプの天然生成物と同じ核を有する脱アシル
化シクロヘキサペプチド化合物は、米国特許第4,293,48
2号に更に詳しく記載されている。同じような核を有す
る他の脱アシル化シクロヘキサペプチド化合物の同様な
調製は、米国特許第4,173,629号;4,293,490号;4,299,76
3号;4,299,762号および4,304,716号に記載されている。
物を、水/アセトニトリル/酢酸/ピリジン(96/2/1/
1)中に溶解して精製し、流速約60ml/分で逆層液体クロ
マトグラフィー(LICHROPREP RP−18)により精製し、U
Vモニターを使用して280nmにて分離をモニターする。28
0nmにおける吸収に基づいて、所望の化合物を含有する
画分を結合させ、減圧下で濃縮してアシル化に使用する
かまたは以後の使用に供するため凍結乾燥する。エキノ
カシジンタイプの天然生成物と同じ核を有する脱アシル
化シクロヘキサペプチド化合物は、米国特許第4,293,48
2号に更に詳しく記載されている。同じような核を有す
る他の脱アシル化シクロヘキサペプチド化合物の同様な
調製は、米国特許第4,173,629号;4,293,490号;4,299,76
3号;4,299,762号および4,304,716号に記載されている。
その後、該脱アシル化化合物を使用し、新規なおよび/
または特異なアシル化化合物を製造することができる。
または特異なアシル化化合物を製造することができる。
特異なアシル誘導体を製造するための脱アシル化核化合
物のアシル化は、式(IB)中のEが下記式: で表わされる化合物の調製により説明される。そのよう
な化合物は、Rが(c)(i)のもとで定義された基で
ある式Iの化合物によっても説明される。
物のアシル化は、式(IB)中のEが下記式: で表わされる化合物の調製により説明される。そのよう
な化合物は、Rが(c)(i)のもとで定義された基で
ある式Iの化合物によっても説明される。
アシル化において、アシル基は好ましくはトリクロロフ
ェニルエステルによって導入される。まず、トリクロロ
フェニルエステルを、カップリング剤、たとえばN,N′
−ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下、不活性溶
媒中たとえば塩化メチレン中、側鎖酸を2,4,5−トリク
ロロフェノールで処理することにより調製することがで
きる。2,4,5−トリクロロフェノール約1.1モルおよびカ
ップリング剤1.0モルを、アルコキシ安息香酸1モルに
対して使用する。混合物を室温で15ないし18時間かくは
んしてエステルを得る。このエステルは、固型物を濾過
し、濾液を減圧下で蒸発して残渣を再結晶することによ
り回収することができる。
ェニルエステルによって導入される。まず、トリクロロ
フェニルエステルを、カップリング剤、たとえばN,N′
−ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下、不活性溶
媒中たとえば塩化メチレン中、側鎖酸を2,4,5−トリク
ロロフェノールで処理することにより調製することがで
きる。2,4,5−トリクロロフェノール約1.1モルおよびカ
ップリング剤1.0モルを、アルコキシ安息香酸1モルに
対して使用する。混合物を室温で15ないし18時間かくは
んしてエステルを得る。このエステルは、固型物を濾過
し、濾液を減圧下で蒸発して残渣を再結晶することによ
り回収することができる。
こうして調製されたエステルを、ジメチルホルムアミド
中核化合物の溶液に加え、約18時間かくはんした後、溶
媒を蒸発して除去する。残渣を洗浄した後、溶離剤とし
て酢酸エチル−メタノール(3/2)を使用してシリカゲ
ル上でクロマトグラフを行ない、所望のオクチルオキシ
ベンゾイル誘導体を得る。これはEとしてオクチルオキ
シベンゾイル基を有する式IB中に表わされている。その
ような化合物は、1−[(4R,5R)−4,5−ジヒドロキシ
−N2−[4−(オクチルオキシ)ベンゾイル]−L−オ
ルニチン]エキノカンジンBと命名される(化合物IB i
i)。
中核化合物の溶液に加え、約18時間かくはんした後、溶
媒を蒸発して除去する。残渣を洗浄した後、溶離剤とし
て酢酸エチル−メタノール(3/2)を使用してシリカゲ
ル上でクロマトグラフを行ない、所望のオクチルオキシ
ベンゾイル誘導体を得る。これはEとしてオクチルオキ
シベンゾイル基を有する式IB中に表わされている。その
ような化合物は、1−[(4R,5R)−4,5−ジヒドロキシ
−N2−[4−(オクチルオキシ)ベンゾイル]−L−オ
ルニチン]エキノカンジンBと命名される(化合物IB i
i)。
化合物IAに加え他の好ましい化合物には、化合物IB ii;
エキノカンジンB(R′,R″,R,R′はOH;R′およ
びRはCH3;Rは テトラヒドロエキノカンジンB(R′,R″,R,R′は
OH;R″およびRは O−メチルテトラヒドロエキノカンジンB(R′,R″お
よびR′はOH;Rは−OCH3;R″およびRはCH3;
Rは およびO−ベンジルテトラヒドロエキノカンジンB
(R′,R″およびR′はOH,Rは−OCH2C6H5,R″お
よびRは が挙げられる。
エキノカンジンB(R′,R″,R,R′はOH;R′およ
びRはCH3;Rは テトラヒドロエキノカンジンB(R′,R″,R,R′は
OH;R″およびRは O−メチルテトラヒドロエキノカンジンB(R′,R″お
よびR′はOH;Rは−OCH3;R″およびRはCH3;
Rは およびO−ベンジルテトラヒドロエキノカンジンB
(R′,R″およびR′はOH,Rは−OCH2C6H5,R″お
よびRは が挙げられる。
哺乳類に於けるニューモシスチスカリニイ感染症の治療
又は予防のために本発明の方法は、式Iで表わされるシ
クロヘキサペプチド化合物の治療上有効な量又は抗感染
量をニューモシスチスカリニイに感染した患者に又は感
染を受けやすい免疫妥協(compromised)患者に投与す
ることを包含している。
又は予防のために本発明の方法は、式Iで表わされるシ
クロヘキサペプチド化合物の治療上有効な量又は抗感染
量をニューモシスチスカリニイに感染した患者に又は感
染を受けやすい免疫妥協(compromised)患者に投与す
ることを包含している。
免疫妥協患者の治療及び抗感染目的に対するシクロヘキ
サペプチドの効能はまず免疫抑制ラット及び免疫制御マ
ウスによる研究で定量することができる。
サペプチドの効能はまず免疫抑制ラット及び免疫制御マ
ウスによる研究で定量することができる。
ラットに化合物IAを使用する代表的な研究では、体重が
各々約200gの9匹の雄のスプラグ−ダウレーラットを飲
料水にデキサメタゾンを添加(2.0mg/)することによ
って免疫制御してP.カリニイ感染症の発生を誘発させ
た。感染を促進するためにラットを低タンパク食で維持
した。7週目の始めにラットを各々3匹ずつの3グルー
プに分けた。3つのグループは全て残りの研究の間飲料
水中のデキサメタゾンと低タンパク食を受けることを続
けた。グループIのラットは未処理の感染対照として維
持し、グループIIには化合物IA2mgを含む滅菌dH2O 0.5m
lを1日2回2週間腹腔内に注射し、グループIIIにはP.
カリニイ感染症の公知の治療法である飲料水中のトリメ
トプリムースルファメトキサゾール(TMP−SMZ)(TMP2
08mg及びSMZ/1.040g)で2週間処理した。2匹のラッ
トが実験の始めに死んだ。1匹はグループIIからのもの
であり(ラット72A)、他の1匹はグループIIIからのも
のであった(ラット75A)。これらがニューモシスチス
肺炎で死んだから決められなかった。
各々約200gの9匹の雄のスプラグ−ダウレーラットを飲
料水にデキサメタゾンを添加(2.0mg/)することによ
って免疫制御してP.カリニイ感染症の発生を誘発させ
た。感染を促進するためにラットを低タンパク食で維持
した。7週目の始めにラットを各々3匹ずつの3グルー
プに分けた。3つのグループは全て残りの研究の間飲料
水中のデキサメタゾンと低タンパク食を受けることを続
けた。グループIのラットは未処理の感染対照として維
持し、グループIIには化合物IA2mgを含む滅菌dH2O 0.5m
lを1日2回2週間腹腔内に注射し、グループIIIにはP.
カリニイ感染症の公知の治療法である飲料水中のトリメ
トプリムースルファメトキサゾール(TMP−SMZ)(TMP2
08mg及びSMZ/1.040g)で2週間処理した。2匹のラッ
トが実験の始めに死んだ。1匹はグループIIからのもの
であり(ラット72A)、他の1匹はグループIIIからのも
のであった(ラット75A)。これらがニューモシスチス
肺炎で死んだから決められなかった。
2週間処理した後ラットを犠牲にし、肺組織を取り除い
た。各ラットからの肺の重量をはかり、次に各々のラッ
トに対して嚢胞と寄生体核の数を測定するために処理し
た。この実験の結果は表Iに示される。
た。各ラットからの肺の重量をはかり、次に各々のラッ
トに対して嚢胞と寄生体核の数を測定するために処理し
た。この実験の結果は表Iに示される。
これらの結果は、化合物IAがP.カリニイ感染症に対して
効能があることを証明している。嚢胞は対照ラットの32
×108〜1.5×109の範囲のレベルと比較した場合、化合
物IAで処理したいずれのラットの肺にも見られなかっ
た。また対照(5.8×109〜1.4×1010)と比較した場
合、これらのラットの寄生体核の数(1.0〜2.1×109)
にも減少があった。これらの結果は、TMP−SMZラットが
P.カリニイ嚢胞の検出可能なレベルを有することから、
P.カリニイ感染症に対して公知の療法であるTMP−SMZで
処理した動物に見られるものより優れている。
効能があることを証明している。嚢胞は対照ラットの32
×108〜1.5×109の範囲のレベルと比較した場合、化合
物IAで処理したいずれのラットの肺にも見られなかっ
た。また対照(5.8×109〜1.4×1010)と比較した場
合、これらのラットの寄生体核の数(1.0〜2.1×109)
にも減少があった。これらの結果は、TMP−SMZラットが
P.カリニイ嚢胞の検出可能なレベルを有することから、
P.カリニイ感染症に対して公知の療法であるTMP−SMZで
処理した動物に見られるものより優れている。
同様のラットの研究が1−[(4R,5R)−4,5−ジヒドロ
キシ−N2−[4−(オクチルオキシ)ベンゾイル]−L
−iiオルニチン]エキノカンジンB(化合物IB ii)の
抗ニューモシスチス活性を測定するために行なわれた。
免疫を抑制した6週間後ラットにベヒクルのみ、化合物
IB ii(2mg/kg)又は化合物IA(2mg/kg)を1日2回7
日間注射しこの間免疫抑制が続けられた。この処理後ラ
ットを犠牲にし、肺1個当りの嚢胞の数を測定した。化
合物IAは>99%嚢胞数が減少し化合物IB iiは約84%嚢
胞数が減少した(ベヒクル対照10%DMSOに比べて)。研
究はまたマウス及び式I範囲内の別の化合物で行なわれ
る。マウス及び別の化合物で行なわれる研究で用いられ
る代表的な方法は次の通りである。
キシ−N2−[4−(オクチルオキシ)ベンゾイル]−L
−iiオルニチン]エキノカンジンB(化合物IB ii)の
抗ニューモシスチス活性を測定するために行なわれた。
免疫を抑制した6週間後ラットにベヒクルのみ、化合物
IB ii(2mg/kg)又は化合物IA(2mg/kg)を1日2回7
日間注射しこの間免疫抑制が続けられた。この処理後ラ
ットを犠牲にし、肺1個当りの嚢胞の数を測定した。化
合物IAは>99%嚢胞数が減少し化合物IB iiは約84%嚢
胞数が減少した(ベヒクル対照10%DMSOに比べて)。研
究はまたマウス及び式I範囲内の別の化合物で行なわれ
る。マウス及び別の化合物で行なわれる研究で用いられ
る代表的な方法は次の通りである。
体重が各々22〜24gの雄のCH3/HeWマウスを飲料水にデキ
サメタゾンを添加することによってP.カリニイ感染症の
発生を誘発させた。感染を促進するためにマウスを低タ
ンパク食で維持した。7週目の始めにマウスを6つのグ
ループに無作為に分けた。グループは全て残りの研究の
間飲料水中のデキサメタゾン及び低タンパク食を受ける
ことを続けた。各グループのマウスにベヒクル対照とし
て10%DMSO溶液0.5ml又は服用量2mg/kgを得るように薬
剤を含む同じカクテールを1日2回腹腔内に注射した。
この操作を1週間続けた。
サメタゾンを添加することによってP.カリニイ感染症の
発生を誘発させた。感染を促進するためにマウスを低タ
ンパク食で維持した。7週目の始めにマウスを6つのグ
ループに無作為に分けた。グループは全て残りの研究の
間飲料水中のデキサメタゾン及び低タンパク食を受ける
ことを続けた。各グループのマウスにベヒクル対照とし
て10%DMSO溶液0.5ml又は服用量2mg/kgを得るように薬
剤を含む同じカクテールを1日2回腹腔内に注射した。
この操作を1週間続けた。
この処理の跡(合計7週間の免疫抑制)、マウスを犠牲
にし肺組織を取り除いた。次いでこの組織を各マウスに
対して嚢胞の数を測定するために処理した。
にし肺組織を取り除いた。次いでこの組織を各マウスに
対して嚢胞の数を測定するために処理した。
種々の化合物に対する結果は表IIに示される。
前述の試験結果及び人に適用したTMP−SMZに対する公知
の投薬量範囲から一般にシクロヘキサペプチド抗ニュー
モシスト剤(化合物I)約0.5〜20.0mg/体重kgが患者の
健康状態、体重、年齢及び薬剤に対する応答に影響する
他の因子並びにヒト患者又は動物に適用されるかを考慮
しながら使用することができる。人間に適した服用量と
して表わされる場合これらの量は好ましくは非経口投与
により1日約35〜1500mgの範囲にある。
の投薬量範囲から一般にシクロヘキサペプチド抗ニュー
モシスト剤(化合物I)約0.5〜20.0mg/体重kgが患者の
健康状態、体重、年齢及び薬剤に対する応答に影響する
他の因子並びにヒト患者又は動物に適用されるかを考慮
しながら使用することができる。人間に適した服用量と
して表わされる場合これらの量は好ましくは非経口投与
により1日約35〜1500mgの範囲にある。
化合物が通常の医薬配合手法に従って医薬的に使用し得
る担体と供に新規な医薬組成物に処方される場合に顕著
な特性が最も有効に利用される。
る担体と供に新規な医薬組成物に処方される場合に顕著
な特性が最も有効に利用される。
新規な組成物は有効化合物を少なくとも1重量%含有す
る。この組成物の製造に於て、化合物Iは通常の医薬的
に使用し得る担体のいずれとも密接に混和される。
る。この組成物の製造に於て、化合物Iは通常の医薬的
に使用し得る担体のいずれとも密接に混和される。
組成物は経口、直腸、局所、非経口(皮下、筋肉内、静
脈内を含む)肺(鼻腔又は口腔吸入)、鼻腔投与又は通
気法に適した組成物を包含する。
脈内を含む)肺(鼻腔又は口腔吸入)、鼻腔投与又は通
気法に適した組成物を包含する。
シクロヘキサペプチド抗ニューモシスチス剤の化合物I
は注射用組成物に処方されることが好ましく、必要なら
ば防腐剤を添加してアンプル又は多回投与容器に単位投
薬形態で存在させることができる。組成物はまたは油中
又は20/80エタノール/プロピレングリコール又は20〜3
5%ポリエチレングリコール300のようなベヒクル中懸濁
液剤、液剤又は乳剤のような形態を取ることができ、沈
殿防止剤、安定化剤及び/又は分散剤を含有することが
できる。他方有効成分は投与前に適当なベヒクルと再構
成するために又は通気法で用いるために粉末形態にある
ことができる。
は注射用組成物に処方されることが好ましく、必要なら
ば防腐剤を添加してアンプル又は多回投与容器に単位投
薬形態で存在させることができる。組成物はまたは油中
又は20/80エタノール/プロピレングリコール又は20〜3
5%ポリエチレングリコール300のようなベヒクル中懸濁
液剤、液剤又は乳剤のような形態を取ることができ、沈
殿防止剤、安定化剤及び/又は分散剤を含有することが
できる。他方有効成分は投与前に適当なベヒクルと再構
成するために又は通気法で用いるために粉末形態にある
ことができる。
明細書で使用される単位投薬形態という言葉は、物理的
に分離している単位を意味し各単位は、医薬担体と共に
所望の治療効果を生じるように計算された所定量の有効
成分を含んでいる。かかる単位用量形態の具体例は、ア
ンプル又は多回投与容器等の単位と判断される。本発明
の単位投薬量は一般にシクロヘキサペプチド抗ニューモ
シスチス剤100〜1000mgを含有する。
に分離している単位を意味し各単位は、医薬担体と共に
所望の治療効果を生じるように計算された所定量の有効
成分を含んでいる。かかる単位用量形態の具体例は、ア
ンプル又は多回投与容器等の単位と判断される。本発明
の単位投薬量は一般にシクロヘキサペプチド抗ニューモ
シスチス剤100〜1000mgを含有する。
式Iの化合物の有効な投薬量で患者に投与するためにい
かなる適切な投与経路も使用することができる。例えば
経口、直腸、局所、非経口、眼、肺、鼻腔等を使用する
ことができる。投薬形態は錠剤、トローチ剤、分散剤、
懸濁液剤、液剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏、エー
ロゾル剤、通気用散剤等を包含する。
かなる適切な投与経路も使用することができる。例えば
経口、直腸、局所、非経口、眼、肺、鼻腔等を使用する
ことができる。投薬形態は錠剤、トローチ剤、分散剤、
懸濁液剤、液剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏、エー
ロゾル剤、通気用散剤等を包含する。
組成物は経口、直腸、局所、非経口(皮下、筋肉内静脈
内を含む)、肺(鼻腔又は口腔吸入)鼻腔投与又は通気
法に適当な組成物を包含する。
内を含む)、肺(鼻腔又は口腔吸入)鼻腔投与又は通気
法に適当な組成物を包含する。
吸入による投与に対して本発明の化合物は、圧力容器又
は噴霧器からエーロゾル噴霧の形態で供給することが便
利である。化合物はまた処方することができる粉末とし
て供給することもできこの粉末組成物は通気粉末吸入装
置によって吸入させることができる。吸入に好ましい供
給系は計量された服用量吸入(MDI)エーロゾルであ
り,これは適当な推進薬例えばフルオロカーボン又はヒ
ドロカーボン中化合物Iの懸濁液又は溶液として処方す
ることができる。
は噴霧器からエーロゾル噴霧の形態で供給することが便
利である。化合物はまた処方することができる粉末とし
て供給することもできこの粉末組成物は通気粉末吸入装
置によって吸入させることができる。吸入に好ましい供
給系は計量された服用量吸入(MDI)エーロゾルであ
り,これは適当な推進薬例えばフルオロカーボン又はヒ
ドロカーボン中化合物Iの懸濁液又は溶液として処方す
ることができる。
化合物が医薬的に使用し得る液体担体に難溶性であり、
肺及び気管支に直接治療することが望ましいため、エー
ロゾル投与が好ましい投与方法である。通気法もまた特
に感染が耳や他の体腔に広がってしまう場合に望ましい
方法である。
肺及び気管支に直接治療することが望ましいため、エー
ロゾル投与が好ましい投与方法である。通気法もまた特
に感染が耳や他の体腔に広がってしまう場合に望ましい
方法である。
他方、非経口投与は静脈内滴注投与を用いて使用するこ
とができる。かかる方法では薬剤をアルコール/プロピ
レングリコール又はポリエチレングリコール組成物中に
溶解させることができる。腹腔内注射も使用することが
できる。
とができる。かかる方法では薬剤をアルコール/プロピ
レングリコール又はポリエチレングリコール組成物中に
溶解させることができる。腹腔内注射も使用することが
できる。
次の実施例は、化合物IA及び式Iの他の親油性シクロヘ
キサペプチド化合物の製造方法及びニューモシストカリ
ニイを制御する本発明に有用な組成物を具体的に説明す
るものであるが限定するものとして解釈されるべきでは
ない。
キサペプチド化合物の製造方法及びニューモシストカリ
ニイを制御する本発明に有用な組成物を具体的に説明す
るものであるが限定するものとして解釈されるべきでは
ない。
化合物IAの製造方法 実施例A 発酵 ザレリオン アルボリコラ(Zalerion Arboricola)、A
TCC 20868として同定されメルクカルチュアコレクショ
ンに保存されている最初に水から分離された培養菌8525
−307Pの単離物2のグリセロール中の凍結培養液を発酵
に使用した。
TCC 20868として同定されメルクカルチュアコレクショ
ンに保存されている最初に水から分離された培養菌8525
−307Pの単離物2のグリセロール中の凍結培養液を発酵
に使用した。
凍結培養液2ml分を解凍し、培地154mlを含む250mlのバ
ッフルの付いていないエルレンマイヤーフラスコに無菌
的に移植した。接種跡培地1を回転撹拌(220rpm、2″
スロウシェーカー)しながら28℃で3日間温置した。こ
の後増殖培地2.0mlを、培地1を含むいくつかのバッフ
ル付きでない250mlエルレンマイヤーフラスコの各々に
無菌的に移植した。接種フラスコを28℃で2日間温置し
た。
ッフルの付いていないエルレンマイヤーフラスコに無菌
的に移植した。接種跡培地1を回転撹拌(220rpm、2″
スロウシェーカー)しながら28℃で3日間温置した。こ
の後増殖培地2.0mlを、培地1を含むいくつかのバッフ
ル付きでない250mlエルレンマイヤーフラスコの各々に
無菌的に移植した。接種フラスコを28℃で2日間温置し
た。
成熟種子ブイヨン12.5mlを培地2を含有する5本の生産
フラスコに接種し、静止条件下25℃で7日間温置して発
酵培地中の抗生物質を得た。
フラスコに接種し、静止条件下25℃で7日間温置して発
酵培地中の抗生物質を得た。
前述の発酵に使用した培地は次の通りである。
培地1(KF種子培地) コーン浸漬液 5g トマトペースト 40g オート麦粉 10g グルコース 10g 痕跡性元素混合物 10ml 蒸留水 全量1000ml pH6.8 痕跡性元素混合物 FeSO4・7H2O 1g MnSO4・4H2O 1g CuCl2・2H2O 25mg CaCl2 100mg H3BO3 65mg (NH4)6MoO2・4H2O 19mg ZnSO4・7H2O 200mg 蒸留水 全量1000ml 培地2(F204固形培地) 用量/フラスコ アワベース 15g 酵母エキス .5g 酒石酸ナトリウム .1g 硫酸第一鉄 .01g ダルタミン酸モノナトリウム .1g とうもろこし油 .1ml 単離 固相発酵の5本の2フラスコの各々に500mlのメタノ
ールを添加した。次いでフラスコの内容物を合わせ、メ
タノール可溶性物質を抽出するために撹拌し、次に混合
物を濾過した。更にメタノール可溶性物質を抽出するた
めに廃ケークを追加のメタノール2500mlと撹拌した後混
合液を濾過した。
ールを添加した。次いでフラスコの内容物を合わせ、メ
タノール可溶性物質を抽出するために撹拌し、次に混合
物を濾過した。更にメタノール可溶性物質を抽出するた
めに廃ケークを追加のメタノール2500mlと撹拌した後混
合液を濾過した。
濾液と洗液を合わせ500mlに濃縮した。
こうして得られた水性メタノール濃縮液を次に酢酸エチ
ル500mlずつで2回抽出した。廃水溶液をDIAION HP−20
カラムに装填し、活性物質を吸着させ次にこれをメタノ
ールで溶離した。この溶出液を前に得られた酢酸抽出液
と合わせ、合わせた酢酸エチル溶液を濃縮乾固した。残
留物を溶離液として5:5:2の塩化メチレン/ヘキサン/
メタノールを用いてSEPHDEX LH−20 200mlによりクロマ
トグラフィ処理した。
ル500mlずつで2回抽出した。廃水溶液をDIAION HP−20
カラムに装填し、活性物質を吸着させ次にこれをメタノ
ールで溶離した。この溶出液を前に得られた酢酸抽出液
と合わせ、合わせた酢酸エチル溶液を濃縮乾固した。残
留物を溶離液として5:5:2の塩化メチレン/ヘキサン/
メタノールを用いてSEPHDEX LH−20 200mlによりクロマ
トグラフィ処理した。
カンジダ アルビカンス(Candida albicans)によって
定量された有効な画分を合わせ、酢酸エチル/メタノー
ルで段階勾配溶離を用いてシリカゲル(EMサイエンス、
KEISELGEL 60,230〜400メッシュ)200mlによりクロマト
グラフィ処理した。このクロマトグラフィからの活性画
分を合わせ濃縮し、75:25の酢酸エチル/メタノールイ
ソクラチック系を用いてシリカゲルによりクロマトグラ
フィ処理した。
定量された有効な画分を合わせ、酢酸エチル/メタノー
ルで段階勾配溶離を用いてシリカゲル(EMサイエンス、
KEISELGEL 60,230〜400メッシュ)200mlによりクロマト
グラフィ処理した。このクロマトグラフィからの活性画
分を合わせ濃縮し、75:25の酢酸エチル/メタノールイ
ソクラチック系を用いてシリカゲルによりクロマトグラ
フィ処理した。
次にこのクロマトグラフィからの活性部分を合わせ溶離
溶媒としてメタノールを用いてSEPHADEXLH−20 100mlに
装填した。溶媒を蒸発させた後溶出液は精製化合物95mg
を生成した。化合物は第1図に示される1H NMRスペクト
ルを有する白色固体であった。
溶媒としてメタノールを用いてSEPHADEXLH−20 100mlに
装填した。溶媒を蒸発させた後溶出液は精製化合物95mg
を生成した。化合物は第1図に示される1H NMRスペクト
ルを有する白色固体であった。
実施例B 発酵 実施例Aに記載したと同様の方法でメルクカルチュアコ
レクションからのATCC 20868の1本の凍結ヴァイアルの
内容物を解凍し、0.4%寒天を含むKF培地(培地1)54m
lを含有する250mlのバッフル付きでないフラスコに無菌
的に移植した。接種後修飾された培地1を220rpmで撹拌
しながら28℃で48時間温置した。この後増殖培地10ml
を、0.4%寒天を含むKF培地500mlを含有する2のバッ
フル付きでないフラスコに移植した。接種後得られた培
地を220rpmで撹拌しながら28℃で24時間温置した。
レクションからのATCC 20868の1本の凍結ヴァイアルの
内容物を解凍し、0.4%寒天を含むKF培地(培地1)54m
lを含有する250mlのバッフル付きでないフラスコに無菌
的に移植した。接種後修飾された培地1を220rpmで撹拌
しながら28℃で48時間温置した。この後増殖培地10ml
を、0.4%寒天を含むKF培地500mlを含有する2のバッ
フル付きでないフラスコに移植した。接種後得られた培
地を220rpmで撹拌しながら28℃で24時間温置した。
培地2 120g及び 酵母エキス 5重量部 酒石酸ナトリウム 1重量部 硫酸第一鉄 0.1重量部 グルタミン酸モノナトリウム 1重量部 とうもろこし油 1重量部 からなる保存溶液120mlを各々含有する20本の2フラ
スコを122℃で20分間オートクレーブにかけ次に水80ml
と更に122℃で20分間再びオートクレーブにかけた。フ
ラスコを冷却しておき、次いで上述した通り調製された
種子培地20mlを接種し、接種したフラスコを静止条件下
25℃で14日間温置した。
スコを122℃で20分間オートクレーブにかけ次に水80ml
と更に122℃で20分間再びオートクレーブにかけた。フ
ラスコを冷却しておき、次いで上述した通り調製された
種子培地20mlを接種し、接種したフラスコを静止条件下
25℃で14日間温置した。
単離 18本の2固形発酵フラスコの各々にメタノール1を
添加し、内容物を合わせ、撹拌し、濾過した。廃ケーク
をメタノール6で2回抽出した。次いで水性メタノー
ル濾液を濃縮し濃縮物を酢酸エチル2で2回抽出し
た。酢酸エチル抽出液を合わせ、乾燥し、約100mlに濃
縮した。
添加し、内容物を合わせ、撹拌し、濾過した。廃ケーク
をメタノール6で2回抽出した。次いで水性メタノー
ル濾液を濃縮し濃縮物を酢酸エチル2で2回抽出し
た。酢酸エチル抽出液を合わせ、乾燥し、約100mlに濃
縮した。
次いで濃縮物にメタノール100ml及びシリカゲル100mlを
添加し、この成分を密接に接触させ、次に回転蒸発器で
溶媒を除去することによって濃縮物をシリカゲルに被覆
した。次いで乾燥シリカゲルをシリカゲル500mlのカラ
ムに適用し、カラムを酢酸エチルで洗浄して不純物を除
去し、9:1の酢酸エチル/メタノールで溶離した。カン
ジダ アルビカンスに対して陽性の抗生物質を含有する
溶出液を回収し合わせた。
添加し、この成分を密接に接触させ、次に回転蒸発器で
溶媒を除去することによって濃縮物をシリカゲルに被覆
した。次いで乾燥シリカゲルをシリカゲル500mlのカラ
ムに適用し、カラムを酢酸エチルで洗浄して不純物を除
去し、9:1の酢酸エチル/メタノールで溶離した。カン
ジダ アルビカンスに対して陽性の抗生物質を含有する
溶出液を回収し合わせた。
シリカゲルクロマトグラフィから抗生物質に富む留分を
10:10:1の塩化メチレン/ヘキサン/メタノール200mlに
溶解し、得られた溶液をSEPHADEX LH−20(予めメタノ
ールに一晩浸漬し、次に塩化メチレン/ヘキサン/メタ
ノール200mlで2回洗浄することによって調製されてい
る)40mlと混合した。数分後上澄みを濾過によって除去
し、SEPHADEX LH−20を塩化メチレン/ヘキサン/メタ
ノール200mlで洗浄し次に濾過した。濾液は活性成分を
含まないことがわかり捨てた。デキストランSEPHADEX L
H−20ビーズに分配した活性成分をメタノール200mlで2
回洗浄して抽出し、これらのメタノール洗液を合わせ、
濃縮した。
10:10:1の塩化メチレン/ヘキサン/メタノール200mlに
溶解し、得られた溶液をSEPHADEX LH−20(予めメタノ
ールに一晩浸漬し、次に塩化メチレン/ヘキサン/メタ
ノール200mlで2回洗浄することによって調製されてい
る)40mlと混合した。数分後上澄みを濾過によって除去
し、SEPHADEX LH−20を塩化メチレン/ヘキサン/メタ
ノール200mlで洗浄し次に濾過した。濾液は活性成分を
含まないことがわかり捨てた。デキストランSEPHADEX L
H−20ビーズに分配した活性成分をメタノール200mlで2
回洗浄して抽出し、これらのメタノール洗液を合わせ、
濃縮した。
次にメタノール濃縮液をシリカゲル200mlに注ぎ75:25の
酢酸エチル/メタノールで溶離し、溶出液を合わせ溶媒
を蒸発させて化合物IAを得た。化合物IAは分解点206〜2
14℃を有する白色粉末である。エキノカンジンB誘導体
の製造方法 実施例C エキノカンジンBの製造 A.発酵 メルク カルチュア コレクションからの培養菌MF5100
エメリセラ ニジュランス(Emericella nidulans)ATC
C 20956を次の通り種子養成発生に使用した。MF5100の
凍結ヴァイアル(約2.5ml)1本を使用してKF培地54ml
に接種し、250mlのバッフル付きでないエルレンマイヤ
ーフラスコ中で28℃及び220rpmで72時間培養して“B"期
培養液を得た。“B"期培養液5mlを使用して2のバッ
フル付きでないエルレンマイヤーフラスコ中のKF培地50
0mlに接種し、28℃220rpmで48時間温置して“C"期培養
液を得た。4本の“C"期フラスコを用いて“D"期(300
撹拌発酵槽)に於ける痕跡性元素混合物#2を含むKF
培地160に接種した。
酢酸エチル/メタノールで溶離し、溶出液を合わせ溶媒
を蒸発させて化合物IAを得た。化合物IAは分解点206〜2
14℃を有する白色粉末である。エキノカンジンB誘導体
の製造方法 実施例C エキノカンジンBの製造 A.発酵 メルク カルチュア コレクションからの培養菌MF5100
エメリセラ ニジュランス(Emericella nidulans)ATC
C 20956を次の通り種子養成発生に使用した。MF5100の
凍結ヴァイアル(約2.5ml)1本を使用してKF培地54ml
に接種し、250mlのバッフル付きでないエルレンマイヤ
ーフラスコ中で28℃及び220rpmで72時間培養して“B"期
培養液を得た。“B"期培養液5mlを使用して2のバッ
フル付きでないエルレンマイヤーフラスコ中のKF培地50
0mlに接種し、28℃220rpmで48時間温置して“C"期培養
液を得た。4本の“C"期フラスコを用いて“D"期(300
撹拌発酵槽)に於ける痕跡性元素混合物#2を含むKF
培地160に接種した。
この3期の種子養成を800の発酵槽中の“E"規模発酵
に使用した。発酵は、28℃背圧0.7kg/cm2、通気0.300m
(1分当り53)及び撹拌100rpmで23時間行なった。
に使用した。発酵は、28℃背圧0.7kg/cm2、通気0.300m
(1分当り53)及び撹拌100rpmで23時間行なった。
“E"期の生産物に次の組成を有する生産培地5700中で
“D"期からの5%種子を接種した。
“D"期からの5%種子を接種した。
グリセロール 85g/L ペクチン 10g/L 落花生ミール 4g/L ペプトン化ミール 4g/L 乳餅 4g/L トルトペースト 4g/L コーン浸漬液 4g/L 豚脂水 4g/L グリシン 2g/L 一塩基性リン酸カリウム 2g/L ポリグリコールP−2000 1mL/L この培地を123℃で25分間滅菌し、次いで発酵を温度28
℃、陽圧約0.8kg/cm2、通気6000/分、撹拌速度120rp
m、pH5.5〜6.5に於て溶存酸素を30%以上に維持して約3
6時間行なった。
℃、陽圧約0.8kg/cm2、通気6000/分、撹拌速度120rp
m、pH5.5〜6.5に於て溶存酸素を30%以上に維持して約3
6時間行なった。
B.単離 HPLC検定(比較標準エキノカンジンBに対して)による
エキノカンジンB355gを含む上記発酵からの全ブイヨン
を同量のメタノールで一晩抽出した。希釈したブイヨン
を遠心してブイヨン固形分を除去し、遠心分離液を50:5
0のメタノール/水で平衡にした450のSP207カラムに
吸着させた。100の水で洗浄し、1000の50:50のメタ
ノール/水で洗浄した後、カラムをメタノールで溶離
し、溶出液を189に濃縮し、塩化メチレンで分配し
た。水性メタノール層を水の添加により50:50のメタノ
ール/水に調節し、メタノールで予め洗浄し50:50のメ
タノール/水で予め平衡にした100のHP−20カラムに
吸着させた。50:50のメタノール/水で洗浄した後カラ
ムを80:20のメタノール/水で溶離した。80:20の溶出液
を水で50:50に調節し、次に前の通り予め平衡にした27
のSP207カラムに吸着させた。次いでこのカラムをメ
タノールで溶離した。
エキノカンジンB355gを含む上記発酵からの全ブイヨン
を同量のメタノールで一晩抽出した。希釈したブイヨン
を遠心してブイヨン固形分を除去し、遠心分離液を50:5
0のメタノール/水で平衡にした450のSP207カラムに
吸着させた。100の水で洗浄し、1000の50:50のメタ
ノール/水で洗浄した後、カラムをメタノールで溶離
し、溶出液を189に濃縮し、塩化メチレンで分配し
た。水性メタノール層を水の添加により50:50のメタノ
ール/水に調節し、メタノールで予め洗浄し50:50のメ
タノール/水で予め平衡にした100のHP−20カラムに
吸着させた。50:50のメタノール/水で洗浄した後カラ
ムを80:20のメタノール/水で溶離した。80:20の溶出液
を水で50:50に調節し、次に前の通り予め平衡にした27
のSP207カラムに吸着させた。次いでこのカラムをメ
タノールで溶離した。
SP207溶出液の19gアリコートを水で50:50のメタノール
/水に希釈し、3.9のアミコン分取用C−18カラムに
吸着させた。アセトニトリル/水(25:75)から100%ア
セトニトリルまでの勾配を75分間にわたって使用して化
合物を溶離した。アセトニトリル/水から濃縮及び凍結
乾燥した後選択された留分は、純度87〜91%のエキノカ
ンジンB16gを生成した。
/水に希釈し、3.9のアミコン分取用C−18カラムに
吸着させた。アセトニトリル/水(25:75)から100%ア
セトニトリルまでの勾配を75分間にわたって使用して化
合物を溶離した。アセトニトリル/水から濃縮及び凍結
乾燥した後選択された留分は、純度87〜91%のエキノカ
ンジンB16gを生成した。
前述のエキノカンジンBの同定及び純度は以前に製造さ
れ精製された以下の性質を有するエキノカンジンBの試
料とHPLC及びスペクトルを比較して決定し、その同定は
エキノカンジンBの発表された構造と比較して確かめ
た。
れ精製された以下の性質を有するエキノカンジンBの試
料とHPLC及びスペクトルを比較して決定し、その同定は
エキノカンジンBの発表された構造と比較して確かめ
た。
実施例D テトラヒドロエキノカンジンBの製造 純度約87パーセント(HPLC)のエキノカンジンB(EB)
5.0グラムを無水エタノール150ミリリットルに溶解し、
1気圧の水素下で20分間予め減圧したエタノール80ミリ
リットル中10%Pd−Cに加えた。添加後、その混合物を
1気圧の水素下で4時間すばやく撹拌した。C8ゾルバッ
クス(ZORBAX)カラム上で、流速1ml/min、30℃で、CH3
CN/H2O(81/19)を用いたHPLCよる分析によれば、反応
はこの時殆ど完了していた。
5.0グラムを無水エタノール150ミリリットルに溶解し、
1気圧の水素下で20分間予め減圧したエタノール80ミリ
リットル中10%Pd−Cに加えた。添加後、その混合物を
1気圧の水素下で4時間すばやく撹拌した。C8ゾルバッ
クス(ZORBAX)カラム上で、流速1ml/min、30℃で、CH3
CN/H2O(81/19)を用いたHPLCよる分析によれば、反応
はこの時殆ど完了していた。
反応混合物をセライトパッドを用いて濾過し、そのパッ
ドをエタノールで洗い、その混合物を真空中で濃縮して
固形物を得た。CH3CN/H2O(81/19)の5ミリリットルに
溶解した0.5グラムのバッチ10個でその固形物を精製し
た。HPLCをC8ゾルバックス1インチのカラムで行い、80
%メタノール/20%水を用いて15ml/minの流速で溶出し
た。テトラヒドロエキノカンジンBを3.15グラム(79
%)の全収量で得た。
ドをエタノールで洗い、その混合物を真空中で濃縮して
固形物を得た。CH3CN/H2O(81/19)の5ミリリットルに
溶解した0.5グラムのバッチ10個でその固形物を精製し
た。HPLCをC8ゾルバックス1インチのカラムで行い、80
%メタノール/20%水を用いて15ml/minの流速で溶出し
た。テトラヒドロエキノカンジンBを3.15グラム(79
%)の全収量で得た。
実施例E O−メチルテトラヒドロエキノカンジンBの製造 テトラヒドロエキノカンジンBの55ミリグラムをメタノ
ール4ミリリットルに溶解した。この溶液にp−トルエ
ンスルホン酸4.0ミリグラムを加え、その混合物を室温
で3時間撹拌した。HPLC分析によれば、この時反応が完
了していた。
ール4ミリリットルに溶解した。この溶液にp−トルエ
ンスルホン酸4.0ミリグラムを加え、その混合物を室温
で3時間撹拌した。HPLC分析によれば、この時反応が完
了していた。
反応混合物を1N重炭酸ナトリウム溶液で冷却し、飽和塩
化ナトリウム溶液で2回洗い、200ミリリットルのイソ
プロパノール/クロロホルム(2/7)で希釈した。
化ナトリウム溶液で2回洗い、200ミリリットルのイソ
プロパノール/クロロホルム(2/7)で希釈した。
有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸
発させて残留物として殆ど白色の固形物を得た。後者を
最初メタノールで精製し、ついでH2O/CH3CN(2:3)で精
製し、4ミリリットルのフランクションでC8ロバー(LO
BAR)サイズAカラム上を用いて、H2O/CH3CN(2:3)中
で、MPLCによりクロマトグラフした。42.4mg(76%)の
収量でその化合物を得た。
発させて残留物として殆ど白色の固形物を得た。後者を
最初メタノールで精製し、ついでH2O/CH3CN(2:3)で精
製し、4ミリリットルのフランクションでC8ロバー(LO
BAR)サイズAカラム上を用いて、H2O/CH3CN(2:3)中
で、MPLCによりクロマトグラフした。42.4mg(76%)の
収量でその化合物を得た。
実施例F O−ベンジルテトラヒドロエキノカンジンBの製造 テトラヒドロエキノカンジンBの50ミリグラムをテトラ
ヒドロフラン1ミリリットル中に懸濁した。それに無水
ベンジルアルコール97ミリリットルを加え、生成した混
合物をすべてが完全な溶液になるまで撹拌した。生成し
た溶液にp−トルエンスルホン酸一水和物1mgを加え、
混合物を室温で3時間撹拌した。HPLC分析によれば、そ
の反応は完了したことが示された。反応混合物は1N重炭
酸ナトリウム溶液で、次ぎにイソプロピルアルコール/
クロロホルム(3:7)で希釈した。有機溶液を水で2回
洗い、乾燥させ、蒸発させ、その生成物を残留物として
回収した。
ヒドロフラン1ミリリットル中に懸濁した。それに無水
ベンジルアルコール97ミリリットルを加え、生成した混
合物をすべてが完全な溶液になるまで撹拌した。生成し
た溶液にp−トルエンスルホン酸一水和物1mgを加え、
混合物を室温で3時間撹拌した。HPLC分析によれば、そ
の反応は完了したことが示された。反応混合物は1N重炭
酸ナトリウム溶液で、次ぎにイソプロピルアルコール/
クロロホルム(3:7)で希釈した。有機溶液を水で2回
洗い、乾燥させ、蒸発させ、その生成物を残留物として
回収した。
次の実施例は本発明を実施するのに有用な新規な組成物
を示すもので、本発明を限定するものと解釈すべきでは
ない。
を示すもので、本発明を限定するものと解釈すべきでは
ない。
次に組成を有するエアロゾル組成物を製造することがで
きる。
きる。
実施例I 缶あたり 化合物Ia 24mg レシチン、NF液体濃縮物 1.2mg トリクロロフルオロメタン 4.025g ジクロロジフルオロメタン 12.15g 実施例II 缶あたり エキノカンジンB 24mg オレイン酸 1.2mg トリクロロフルオロメタン 4.025g ジクロロジフルオロメタン 12.15g 実施例III 缶あたり O−メチルテトラヒドロエキノカルボンB 24mg ソルビタントリオレエート 1.2mg トリクロロフルオロメタン 4.025g ジクロロジフルオロメタン 12.15g 注射可能な懸濁液(1M)を次のように調製することがで
きる。
きる。
実施例IV mg/ml 化合物Ia 10 メチルセルロース 5.0 ツイーン(Tween)80 0.5 ベンジルアルコール 9.0 ベンザルコニウムクロライド 1.0 1mlとする水 一般的情報 エキノカンジンBについて エメリセラ・ニデュランス(Emericella nidulans)
(アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidula
ns)の後期成長段階、エキノカンジンBについての製造
微生物として確立されている)、そしてメルク・カルチ
ャー・コレクションでMF5100として維持されているもの
を発酵に用いた。培養菌はブタベスト条約のもとでアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され
ており、ATCC番号20956が付されている。
(アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidula
ns)の後期成長段階、エキノカンジンBについての製造
微生物として確立されている)、そしてメルク・カルチ
ャー・コレクションでMF5100として維持されているもの
を発酵に用いた。培養菌はブタベスト条約のもとでアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され
ており、ATCC番号20956が付されている。
実施例Cで記載したようにして製造したエキノカンジン
Bを、次のMSおよびNMRスペクトルを有するあらかじめ
製造したエキノカンジンBとパーセント純度について比
較し、エキノカンジンBについての発行された構造と比
較することによって同定した。
Bを、次のMSおよびNMRスペクトルを有するあらかじめ
製造したエキノカンジンBとパーセント純度について比
較し、エキノカンジンBについての発行された構造と比
較することによって同定した。
質量スペクトルデータ:FAB質量スペクトルをVG20−253
質量分析計に記録した。ジチオトレイトール(dithioth
reitol)−ジチオエリトリトール(dithiocrxthritol)
−LiIのマトリックスを用いた。そして、M+Liを分子
量1059に相当するm/z1066で観察した。1 H NMRスペクトル:スペクトル、第2図がCD3ODを用い
て300MHzでヴァリアン(Varian)XL−300NMR分析計に記
録された。化学シフトが、内部対象として3.30ppmで溶
媒ピークを用いて零ppmでのテトラメチルシラン(TMS)
に対してppmで示されている。13 C NMRデータ:スペクトルが24℃でCD3ODを用いて100M
HzでヴァリアンXL−400NMR分光計上に記録された。化学
シフトが、内部対象として49.0ppmでの溶媒ピークを用
いて零ppmでのテトラメチルシランに対してppmで与えら
れている。13 C化学シフト(CD3OD,100MHz):11.28,14.43,19.66,2
0.04,23.62,26.54,27.05,28.15,28.20,30.27(x2),30.
42,30.46,30.78,32.65,35.08,36.82,38.60,39.06,51.6
7,52.94,56.32,56.84,57.19,58.61,62.46,68.33,69.59,
69.70,70.87,71.29,74.60,75.52,75.77,76.94,116.21
(x2),129.06(x2),129.60(x2),130.94,130.96,13
3.09,158.46,169.97,172.48,172.51,172.79,173.53,17
4.35,176.19.
質量分析計に記録した。ジチオトレイトール(dithioth
reitol)−ジチオエリトリトール(dithiocrxthritol)
−LiIのマトリックスを用いた。そして、M+Liを分子
量1059に相当するm/z1066で観察した。1 H NMRスペクトル:スペクトル、第2図がCD3ODを用い
て300MHzでヴァリアン(Varian)XL−300NMR分析計に記
録された。化学シフトが、内部対象として3.30ppmで溶
媒ピークを用いて零ppmでのテトラメチルシラン(TMS)
に対してppmで示されている。13 C NMRデータ:スペクトルが24℃でCD3ODを用いて100M
HzでヴァリアンXL−400NMR分光計上に記録された。化学
シフトが、内部対象として49.0ppmでの溶媒ピークを用
いて零ppmでのテトラメチルシランに対してppmで与えら
れている。13 C化学シフト(CD3OD,100MHz):11.28,14.43,19.66,2
0.04,23.62,26.54,27.05,28.15,28.20,30.27(x2),30.
42,30.46,30.78,32.65,35.08,36.82,38.60,39.06,51.6
7,52.94,56.32,56.84,57.19,58.61,62.46,68.33,69.59,
69.70,70.87,71.29,74.60,75.52,75.77,76.94,116.21
(x2),129.06(x2),129.60(x2),130.94,130.96,13
3.09,158.46,169.97,172.48,172.51,172.79,173.53,17
4.35,176.19.
【図面の簡単な説明】 第1図は、本発明の実施に好適な化合物IAの、CD3OD中4
00MHzにおける1H NMRスペクトルを示す。 第2図は、エキノカンジンBの、CD3OD中300MHzにおけ
る1H NMRスペクトルを示す。
00MHzにおける1H NMRスペクトルを示す。 第2図は、エキノカンジンBの、CD3OD中300MHzにおけ
る1H NMRスペクトルを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:645)
Claims (4)
- 【請求項1】式 [式中、 R′はH又はOH: R″はH又はOH: RはH,OH.−O−アルキル(C1−C6),−O−ベンジ
ル、又は ただし、R1はH.C1−C12アルキル,C3−C7シクロアルキ
ル,ヒドロキシエチル,低級アルコシキエチル,フリル
メチル,テトラヒドロフリルメチル,フェニル,フェニ
ルアルキル(フェニルはハロ,ヒドロキシ,低級アルキ
ル及び低級アルコキシで置換されていてもよい);R2は
水素又は低級アルコキシ;又はR1とR2とで−(CH2)2Q
(CH2)2−(Qは−CH2−,−NH−あるいは−N−低級
アルキルのような結合基)を形成;mは0乃至4; R′はH又はOH; R″はH,CH3又はH2CONH2; RはH又はCH3;そして Rは、 (C)R′,R″,R及びR′がOH、R″がCH3のと
きは、 (Aは2価の酸素,イオウ,スルフィニル又はスルホニ
ル;A1は2価の酸素,イオウ,スルフィニル,スルホニ
ル又は−NH−;Xは水素,クロロ,ブロモ,ヨード,ニト
ロ,C1−C3アルキル,ヒドロキシ,C1−C3アルコキシ,メ
ルカプト,C1−C3アルキルチオ,カルバミル又はC1−C3
アルキルカルバミル;X1はクロロ,ブロモ又はヨード:R1
は水素,C1−C18アルキル又はC2−C18アルケニル;WはC1
−C10アルキレン又はC2−C10アルケニレン;m,nおよびp
は0又は1であるが、mが0のときは、nは0でなけれ
ばならない;ただし、基R1およびW中の炭素原子数の和
は4より大きくなければならず21を越えてはならない;X
がメルカプトのときは、AおよびA1はスルフィニル又は
スルホニルであってはならない;AおよびA1がスルフィニ
ル又はスルホニルのときは、それらは等しい酸化状態に
なければならない): (D)R′がOH、R″がHのときは、 (Yは以下に示すアミノアシル基 (ZはC1−C10アルキレン又はC5−C6シクロアルキレ
ン); (R3はヒドロキシメチル,ヒドロキシエチル,メルカプ
トメチル,メルカプトエチル,メチルチオエチル,2−チ
エニル,3−インドロメチル,フェニル,ベンジル,ハロ
フェニル,ハロベンジル,C1−C3アルキルフェニル,C1−
C3アルキルベンジル,C1−C3アルキルチオフェニル,C1−
C3アキルチオベンジル,カルバミルフェニル,カルバミ
ルベンジル,C1−C3アルキルカルバミルフェニル又はC1
−C3アルキルカルバミルベンジル); (X2は水素又はハロ))を意味する。]で表わされるシ
クロヘキサペプチド化合物、ならびに製薬上許容し得る
担体から成ることを特徴とする哺乳動物のニューモシス
ティス・カリニ感染の治療に有用な組成物。 - 【請求項2】吸入法による投与に適していることを特徴
とする請求項1記載の組成物。 - 【請求項3】非経口投与に適していることを特徴とする
請求項1記載の組成物。 - 【請求項4】単位投与形態であることを特徴とする請求
項1記載の組成物。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US24276788A | 1988-09-12 | 1988-09-12 | |
US242,767 | 1988-09-12 | ||
US24604288A | 1988-09-16 | 1988-09-16 | |
US246,042 | 1988-09-16 | ||
US39888989A | 1989-08-30 | 1989-08-30 | |
US398,889 | 1989-08-30 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02288837A JPH02288837A (ja) | 1990-11-28 |
JPH0725692B2 true JPH0725692B2 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=27399603
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1236802A Expired - Lifetime JPH0725692B2 (ja) | 1988-09-12 | 1989-09-12 | ニユーモシステイス・カリニの抑制方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0359529B1 (ja) |
JP (1) | JPH0725692B2 (ja) |
CA (1) | CA1333150C (ja) |
DE (1) | DE68905119T2 (ja) |
DK (1) | DK173802B1 (ja) |
ES (1) | ES2054017T3 (ja) |
IE (1) | IE892924L (ja) |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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