CN111733098A - 一种芽孢杆菌在低温降解石油烃中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境微生物学、生物修复技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌PL‑10在低温降解石油烃中的应用。本发明所述的具有石油烃类低温降解能力的菌株PL‑10的用途为以微生物强化的方式降解石油烃类污染物，可用于石油烃污染土壤、水体的生物修复；使用本发明菌株PL‑10及其对应营养液，能在5～20℃条件下有效去除石油烃类污染物，且具有成本低、环境友好等优点。

Description

一种芽孢杆菌在低温降解石油烃中的应用

技术领域

本发明属于环境微生物学、生物修复技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌PL-10在低温降解石油烃中的应用。

背景技术

石油是非常重要的能源与化工原料。随着人类社会工业的迅猛发展，全球对石油的消耗量与日俱增。在油田勘探、石油开采、石油运输等过程中均存在一定的原油泄漏风险。全球范围内有关石油泄漏及污染的事件频发，导致石油进入土壤、水体环境中，产生严重污染。石油主要由约200种烃类化合物组成，含有多种具有致癌、致畸性的化合物组分，对生态环境质量和安全产生严重威胁。

利用微生物或植物降解石油烃类污染物(简称生物法)是清除土壤、水体污染的重要方法。生物法主要利用石油烃降解菌将污染物最终转变为无害的无机物质(CO₂和H₂O)。同物理、化学方法相比，微生物降解石油烃污染物具有经济可行、环境友好等显著优势。获取具有高效降解能力的微生物菌种资源，发挥微生物在自然条件下的降解活性是生物法的核心与关键。近几十年来，围绕高效石油烃降解菌的筛选、石油烃降解机理以及降解工艺的优化等内容，国内外的多个研发机构和企业单位开展了大量的积极探索。例如：CN104031870A公开了一种微生物复合菌剂及由其制备的土壤联合修复剂及二者的应用。此复合菌剂中由铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、热带假丝酵母菌等多种石油烃降解菌按照特定比例复配而成，在修复石油污染土壤、降解多种石油烃污染物的应用中具有较好的效果。CN106734181A公开了一种石油污染土壤的微生物修复方法。该方法将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobacter sp.与生物表面活性剂粗品联合使用，能够将土壤中含有的浓度为20000mg/kg-130000mg/kg的石油烃降解，其降解效率达到75-91％。另有专利CN108034626A、CN108102977A、CN108048376A、CN108048374A、CN108102979A、CN108034625A、CN108102978A、CN108048375A公开了多种具有降解油泥中石油烃能力的菌株，包括不动杆菌属Acinetobacter sp.JN1、莱茵海默氏菌属Rheinheimerasp.JN2、假单胞菌属(Pseudomonas sp.JN3,JN4,JN5,JN7,JN8)、丛毛单胞菌属Comamonassp.JN6。单独使用这些菌株，30天内含油污泥中总石油烃的降解率可达到44-94％。以上菌种/株均为中温微生物，即仅在30-35℃的条件下降解石油烃性能较好。然而，在真实的石油烃污染土壤或水体环境中，其温度绝大多数低于20℃，因此，这些中温降解菌很难很好地发挥作用。

CN105907675A公开了一株具有低温降解石油功能的红球菌QY-2及其应用。在实验室规模试验中，该菌株可在0-15℃的条件下于60天内将锥形瓶内53％的原油降解。CN107815430A公开了一株具有低温耐盐高效芘降解功能的菌株BWO2及其用途。在实验室规模试验中，该菌株在15℃、盐浓度为3％条件下表现出最高的芘降解能力。

CN102277312A公开了一株在10-20℃条件下可以降解多环芳烃的新鞘氨醇杆菌。CN105907676A公开了一株在0-15℃条件下降解石油烃的交替假单胞菌DC-2。上述专利菌株降解石油烃类污染物的评价均采用摇瓶试验完成，即将功能菌株接种到添加一定量石油烃污染物的培养基中完成降解性能评价，未采用真实的污染土壤或水体介质进行评价，菌株在真实污染环境中的效能存在一定程度的不确定性。

同时，本领域可知因温度对于绝大多数微生物的生理代谢具有决定性影响，即中温条件下菌株能够降解石油烃类化合物，并不意味着菌株在低温条件下也能够发挥类似的降解能力。因而必须从微生物菌种自身及其培养条件再行评价确定。

总体而言，现有石油烃降解菌菌种资源大多仅在中温条件下(35℃左右)发挥降解石油烃的能力，而在诸如0-25℃的低温条件下降解石油烃的微生物菌种资源依然极为缺乏；另一方面，上述在低温条件下降解石油烃的菌株大多不能产芽孢，当真实污染环境条件发生变化时这些微生物的存活能力偏弱。这些不足会大大限制了微生物处理技术在低温条件下石油烃污染修复中的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是针对当前石油烃污染生物处理技术中低温降解菌菌种资源不足的现状，提供了提供一种芽孢杆菌PL-10在低温降解石油烃中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种芽孢杆菌在低温降解石油烃中的应用。

所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(PL-10)在5-20℃的低温下降解石油烃中的应用。

所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(PL-10),其已于2019年3月04日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株的保藏号为CGMCCNo.17302。

进一步的说，将菌株经活化好的PL-10的种子液按1-15％接种量接种至待处理的石油烃污染土壤样品中，再通过无机盐培养基调节污染土壤样品的含水量至22-35％，并调节pH值为6.5-8.5，然后在温度为5-20℃下培养30-150d。

再进一步的说，

(1)按照1-15％的接种量向待处理的石油污染土壤中接入OD₆₀₀＝0.8-2.0的Bacillus subtilis(PL-10)菌液，并用无机盐培养基调节土壤的含水量为22-35％；

(2)将上述调节含水量的体系置于5-20℃恒温培养箱中恒温静置培养30-150天，即可实现对污染土壤中总石油烃的降解。

所述菌株活化种子液为将培养的Bacillus subtilis(PL-10)单菌落接种于含灭菌种子液培养基中，在150-180rpm、30℃恒温振荡培养48-72h即可。

所述无机盐培养基成分为：(KH₄)₂SO₄ 2.0-18.0g、KCl 0.5-2.5g、NaCl 0.5-5.0g、KH₂PO₄ 1.0-6.4g、K₂HPO₄ 1.0-8.0g、MgSO₄ 0.5-2.0g、酵母膏0.2-2.0g、微量元素液0.1-3.0mL、维生素液1.0-10.0mL、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5-8.5；

所述的种子液培养基的成分为：葡萄糖5.0-15.0g、(KH₄)₂SO₄ 10-15.0g、KCl 1.0-3.0g、NaCl 0.5-5.0g、KH₂PO₄ 2.0-5.0g、K₂HPO₄ 2.0-8.0g、MgSO₄ 0.2-1.0g、酵母膏0.2-3.0g、微量元素液0.1-2.0mL、维生素液1.0-10.0mL、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5-8.5；

微量元素液成分为：ZnSO₄ 0.1-0.6g、CaCl₂ 0.2-1.5g、CuSO₄ 0.5-3.0g、MnSO₄0.1-2.0g、去离子水1000mL，微量元素液经115℃高温灭菌30min后，待用。

维生素液成分为：生物素2.0mg、叶酸3.0mg、硫胺素6.0mg、泛酸钙6.0mg、维生素B12 0.2mg、维生素B2 6.0mg、蒸馏水1000mL，经0.22μm滤膜过滤除菌后，待用。

一种降解土壤中石油烃的方法：

(1)按照1-15％的接种量向土壤中接入OD₆₀₀＝0.8-2.0的Bacillus subtilis(PL-10)菌液，并用无机盐培养基调节土壤含水量为22-35％；

(3)将上述调节含水量的体系置于5-20℃恒温培养箱中恒温静置培养30-150天，即可实现低温条件下土壤中石油烃的降解。

本发明的有益效果：

(1)本发明所述石油烃降解菌菌株Bacillus subtilis(PL-10)能够很好地适应高浓度石油烃污染胁迫及复杂多变的自然环境条件(温度、盐度)，菌株在石油污染土壤中生长及定殖能力强，适用于真实的石油污染土壤或水体环境条件下石油烃的降解去除；

(2)本发明菌株在土壤或水体环境中具有能在5-20℃的低温条件下降解石油烃的特点，可用于我国北方年均温较低的区域土壤石油烃污染的生物修复；

(3)本发明菌株具有降解多种石油烃类化合物的能力，包括但不限于芳香烃、碳链长度为C25以下的直/支链烷烃等有机污染物，菌株具有更广泛的石油烃类污染场地修复潜力；

(4)本发明菌株在中低温条件下生长繁殖能力均较好，菌株扩培及种子液制备相对较容易，有利于工业化生产及后续应用。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的Bacillus subtilis(PL-10)的菌落形态图。

图2为本发明实施例1提供的Bacillus subtilis(PL-10)环境扫面电镜下菌体形态。

图3为本发明实施例2提供的接种Bacillus subtilis(PL-10)在20℃对土壤中石油烃类去除结果图。

图4为本发明实施例3提供的Bacillus subtilis(PL-10)在10℃对土壤中石油烃类的去除结果图。

图5为本发明实施例4提供的Bacillus subtilis(PL-10)在5℃对土壤中柴油的去除结果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明内容不仅局限于以下实施例。

本发明菌株分离筛选自新疆某油田含油污泥池，经初步鉴定为枯草芽孢杆菌，其在低温条件下对土壤中总石油烃类化合物具有明显降解去除作用。通过配施营养剂，菌株PL-10可以实现石油烃的有效降解，150天内含油量去除40％以上。为石油烃污染土壤修复提供了新的菌种资源及生物处理途径。

下述实施例中所需材料：

1)油泥：从新疆某油田长期(大于15年)储藏油泥的油泥池终取适量油泥样品，经过风干、磨碎、过2mm筛后用作石油烃降解菌株筛选。

2)培养基：

种子液培养基的成分为：葡萄糖9g、(KH₄)₂SO₄ 10.0g、KCl 1.1g、NaCl 1.1g、KH₂PO₄3.4g、K₂HPO₄ 4.4g、MgSO₄ 0.5g、酵母膏0.4g、微量元素液0.5mL、维生素液1.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7。

无机盐培养基成分为：(KH₄)₂SO₄ 9.0g、KCl 1.0g、NaCl 1.2g、KH₂PO₄ 3.3g、K₂HPO₄4.0g、MgSO₄ 0.2g、酵母膏0.5g、微量元素液0.5mL、维生素液1.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7。

微量元素液成分为：ZnSO₄ 0.25g、CaCl₂ 0.22g、CuSO₄ 0.20、MnSO₄ 0.15、去离子水1000mL。

维生素液成分为：生物素2.0mg、叶酸3.0mg、硫胺素6.0mg、泛酸钙6.0mg、维生素B12 0.2mg、维生素B2 6.0mg、蒸馏水1000mL，经0.22μm滤膜过滤除菌后，待用。

筛选培养基：种子液培养基组分中的葡萄糖替换为1.0g/L的原油。

3)实验仪器：

恒温培养箱、恒温震荡培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、超净工作台、立式压力蒸汽灭菌器、凝胶成像***、微型紫外分光光度计、PCR仪、电泳仪、涡旋振荡器。

实施例1

(一)菌株PL-10筛选

取含油污泥15g，放入预装有100mL种子液培养基的250mL锥形瓶中，然后在30℃、180rpm的恒温摇床上震荡培养72h；

72h后，取静置后的上层菌液并经10倍梯度稀释后涂布于筛选培养基平板中。筛选培养基中原油的含量为1.0g/L；

种子液培养基的成分为：葡萄糖9g、(KH₄)₂SO₄ 10.0g、KCl 1.1g、NaCl 1.1g、KH₂PO₄3.4g、K₂HPO₄ 4.4g、MgSO₄ 0.5g、酵母膏0.4g、微量元素液0.5mL、维生素液1.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7。

无机盐培养基成分为：(KH₄)₂SO₄ 9.0g、KCl 1.0g、NaCl 1.2g、KH₂PO₄ 3.3g、K₂HPO₄4.0g、MgSO₄ 0.2g、酵母膏0.5g、微量元素液0.5mL、维生素液1.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7。

微量元素液成分为：ZnSO₄ 0.25g、CaCl₂ 0.22g、CuSO₄ 0.20、MnSO₄ 0.15、去离子水1000mL。

维生素液成分为：生物素2.0mg、叶酸3.0mg、硫胺素6.0mg、泛酸钙6.0mg、维生素B12 0.2mg、维生素B2 6.0mg、蒸馏水1000mL，经0.22μm滤膜过滤除菌后，待用。

筛选培养基：种子液培养基组分中的葡萄糖替换为1.0g/L的原油。

待筛选培养基上菌落生长后，用无菌接种环挑取噬油斑直径大于1cm的菌落，采用平板划线分离法接种于种子液固体培养基上，并置于30℃恒温培养箱中培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，重复上述划线分离过程直至菌落形态单一，经石油烃降解效率测定，取降解率最大的菌株，编号为PL-10。

石油烃降解菌PL-10的鉴定与保藏：

菌株编号为PL-10，其菌落形态如图1所示。PL-10菌体呈短杆状，细胞形态见图2所示。菌株PL-10的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的数列信息进行同源性分析，判断该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。经DNA测序，PL-10菌株16S rRNA基因序列为：GTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCATGTA

菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，菌株保藏号为CGMCC No.17302。

实施例2

取上述获得PL-10菌种，接种至装有100mL种子液培养基的250mL锥形瓶中，在30℃、180rpm的恒温摇床上培养48h。48h后取PL-10菌液，按照2％接种比例接种至筛选培养基中，然后分别在20℃、10℃、5℃恒温培养150天，每隔50天转接至新配制的筛选培养基中；重复3轮次恒温培养过程，获得菌株低温驯化种子液，待用。

使用PL-10在20℃条件下降解土壤中石油烃类污染物试验

将上述20℃培养获得的驯化菌液按照5％接种比例接种到石油烃污染土壤中；另设不接种PL-10菌液的处理。用无机盐培养基调节混合样的含水量为30％，并调节pH为7.5。用透气封口膜封口后，将塑料烧杯置于20℃恒温培养箱中恒温静置培养。每30d取样采用索氏提取法-重量法测定油泥中总石油烃含量(参见图3)。

所述石油烃污染土壤，其初始总石油烃含量为1.5％。

由图3测定结果可见，第30天、60天、90天、120天添加PL-10菌株处理组的总石油烃降解率分别为5.3％、32.9％、42.1％、70.4％；第150天,添加菌株PL-10的处理组土壤中总石油烃的去除率达到80.3％，其石油烃去除效果明显好于不接菌的处理。

实施例3

使用PL-10在10℃条件下降解土壤中石油烃类污染物试验

将上述10℃培养获得的驯化菌液按照5％接种比例接种到石油烃污染土壤中；另设不接种PL-10菌液的处理。用无机盐培养基调节混合样的含水量为30％，并调节pH为7.5。用透气封口膜封口后，将塑料烧杯置于10℃恒温培养箱中恒温静置培养。每30d取样采用索氏提取法-重量法测定油泥中总石油烃含量(参见图4)。其中，石油烃污染土壤，其初始含油量为2.0％。

由图4记载测定结果可见，第30天、60天、90天、120天添加PL-10菌株处理组的总石油烃降解率分别为10.0％、17.5％、40.0％、42.5％；第150天,添加菌株PL-10的处理组土壤中总石油烃的去除率达到47.0％，其石油烃去除效果明显好于不接菌的处理(见附图4)。

实施例4

使用PL-10在5℃条件下降解土壤中柴油试验

将上述5℃培养获得的驯化菌液按照5％接种比例接种到柴油污染土壤中；另设不接种PL-10菌液的处理。用无机盐培养基调节混合样的含水量为30％，并调节pH为7.5。用透气封口膜封口后，将塑料烧杯置于5℃恒温培养箱中恒温静置培养。每30d取样采用索氏提取法-重量法测定油泥中柴油含量(参见图5)。其中，柴油污染土壤，其初始含量为2.5％。

由图5可见测定结果可见，第30天、60天、90天、120天添加PL-10菌株处理组的柴油降解率分别为16.0％、22.0％、32.8％、39.2％；第150天,添加菌株PL-10的处理组土壤中柴油的去除率达到45.6％，其柴油去除效果明显好于不接菌的处理。

序列表

<110> 中国科学院沈阳应用生态研究所

<120> 一种芽孢杆菌在低温降解石油烃中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1403

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag 60

gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt ccagcttcac 120

gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact gagaacagat ttgtgggatt ggcttaacct 180

cgcggtttcg ctgccctttg ttctgtccat tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg 240

ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag 300

agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc 360

caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac ctgtcactct gcccccgaag 420

gggacgtcct atctctagga ttgtcagagg atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt 480

gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt 540

tcagtcttgc gaccgtactc cccaggcgga gtgcttaatg cgttagctgc agcactaagg 600

ggcggaaacc ccctaacact tagcactcat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta 660

atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct cagcgtcagt tacagaccag agagtcgcct 720

tcgccactgg tgttcctcca catctctacg catttcaccg ctacacgtgg aattccactc 780

tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc caatgaccct ccccggttga gccgggggct 840

ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcga gccctttacg cccaataatt ccggacaacg 900

cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct ttctggttag 960

gtaccgtcaa ggtaccgccc tattcgaacg gtacttgttc ttccctaaca acagagcttt 1020

acgatccgaa aaccttcatc actcacgcgg cgttgctccg tcagactttc gtccattgcg 1080

gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc 1140

cgatcaccct ctcaggtcgg ctacgcatcg ttgccttggt gagccgttac ctcaccaact 1200

agctaatgcg ccgcgggtcc atctgtaagt ggtagccgaa gccacctttt atgtttgaac 1260

catgcggttc aaacaaccat ccggtattag ccccggtttc ccggagttat cccagtctta 1320

caggcaggtt acccacgtgt tactcacccg tccgccgcta acatcaggga gcaagctccc 1380

atctgtccgc tcgactgcat gta 1403

Claims (7)

1.一种芽孢杆菌在低温降解石油烃中的应用。

2.按权利要求1所述的应用，其特征在于：所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis(PL-10)在5-20℃的低温下降解石油烃中的应用。

3.按权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis(PL-10),其已于2019年3月04日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株的保藏号为CGMCC No.17302。

4.按权利要求3所述的应用，其特征在于，将活化好的PL-10的种子液按1-15％接种量接种至待处理的石油烃污染土壤样品中，再通过无机盐培养基调节污染土壤样品的含水量至22-35％，并调节pH值为6.5-8.5，然后在温度为5-20℃下培养30-150d。

5.按权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌株活化种子液为将Bacillussubtilis(PL-10)单菌落接种于含灭菌种子液培养基中，在150-180rpm、30℃恒温振荡培养48-72h即可。

6.按权利要求4所述的应用，其特征在于，所述无机盐培养基成分为：(KH₄)₂SO₄ 2.0-18.0g、KCl 0.5-2.5g、NaCl 0.5-5.0g、KH₂PO₄1.0-6.4g、K₂HPO₄ 1.0-8.0g、MgSO₄ 0.5-2.0g、酵母膏0.2-2.0g、微量元素液0.1-3.0mL、维生素液1.0-10.0mL、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5-8.5；

所述的种子液培养基的成分为：葡萄糖5.0-15.0g、(KH₄)₂SO₄ 10-15.0g、KCl 1.0-3.0g、NaCl 0.5-5.0g、KH₂PO₄ 2.0-5.0g、K₂HPO₄ 2.0-8.0g、MgSO₄ 0.2-1.0g、酵母膏0.2-3.0g、微量元素液0.1-2.0mL、维生素液1.0-10.0mL、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5-8.5；

微量元素液成分为：ZnSO₄ 0.1-0.6g、CaCl₂ 0.2-1.5g、CuSO₄ 0.5-3.0g、MnSO₄ 0.1-2.0g、去离子水1000mL，微量元素液经115℃高温灭菌30min后，待用；

维生素液成分为：生物素2.0mg、叶酸3.0mg、硫胺素6.0mg、泛酸钙6.0mg、维生素B120.2mg、维生素B2 6.0mg、蒸馏水1000mL，经0.22μm滤膜过滤除菌后，待用。

7.一种降解土壤中石油烃的方法，其特征在于：

(1)按照1-15％的接种量向土壤中接入OD₆₀₀＝0.8-2.0的Bacillus subtilis(PL-10)菌液，并用无机盐培养基调节土壤含水量为22-35％；

(2)将上述调节含水量的体系置于5-20℃恒温培养箱中恒温静置培养30-150天，即可实现低温条件下土壤中石油烃的降解。

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