JPH07227279A - 細胞質雑種カルスの作出方法 - Google Patents
細胞質雑種カルスの作出方法Info
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- JPH07227279A JPH07227279A JP6039258A JP3925894A JPH07227279A JP H07227279 A JPH07227279 A JP H07227279A JP 6039258 A JP6039258 A JP 6039258A JP 3925894 A JP3925894 A JP 3925894A JP H07227279 A JPH07227279 A JP H07227279A
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- protoplast
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 細胞質に有用な遺伝形質が存在する種の細胞
核を放射線照射により選択的に破壊し、一方、細胞核に
有用な遺伝形質が存在する種の細胞質を薬剤により不活
化する。該２種のプロトプラストを融合させる非対称融
合法を用い、アルファルファの細胞質雑種カルスおよび
細胞質の置換体を作出する方法。 【効果】 非対称融合法により、アルファルファの雑種
カルスおよび細胞質の置換体を効率良く得ることができ
る。
核を放射線照射により選択的に破壊し、一方、細胞核に
有用な遺伝形質が存在する種の細胞質を薬剤により不活
化する。該２種のプロトプラストを融合させる非対称融
合法を用い、アルファルファの細胞質雑種カルスおよび
細胞質の置換体を作出する方法。 【効果】 非対称融合法により、アルファルファの雑種
カルスおよび細胞質の置換体を効率良く得ることができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞融合法による、ア
ルファルファの雑種カルスおよび細胞質の置換体の作出
に関するものである。本発明は、アルファルファの育種
に利用される。
ルファルファの雑種カルスおよび細胞質の置換体の作出
に関するものである。本発明は、アルファルファの育種
に利用される。
【０００２】
【従来の技術】従来、植物の育種には交配が行われてい
る。しかし、アルファルファは、自家受粉および他家受
粉を行う上、４倍体性であるため、選抜方法が複雑にな
り、交配による雑種を得ることが困難な植物の一つであ
る。
る。しかし、アルファルファは、自家受粉および他家受
粉を行う上、４倍体性であるため、選抜方法が複雑にな
り、交配による雑種を得ることが困難な植物の一つであ
る。
【０００３】このような問題を解決する手段の１つとし
て、例えば、２種のアルファルファの体細胞融合によ
り、体細胞雑種を得る方法が知られている（特開昭６０
−９１９２７号公報）。この手法を用いることにより、
上記の問題は回避されるが、今まで行われてきた対称融
合では、雑種細胞に２種の核が存在してしまい、核に存
在する不要な遺伝形質が排除できない。これまで、例え
ば、ブラシカ属などで体細胞融合によって得られた体細
胞雑種植物は、戻し交配により核の置換を行い、この問
題を解決してきた。しかし、戻し交配による核置換は、
数年〜十年といった長い年月を要し、また、上記理由の
ため、アルファルファの場合は、交配そのものに難点が
ある。なお、最近Ｌｉらにより、アルファルファのプロ
トプラストとガンマ線を照射して核を損傷させたイガマ
メ（ｓａｉｎｆｏｉｎ，Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ ｖｉｃ
ｉｉｆｏｌｉａ Ｓｃｏｐ）のプロトプラストとを融合
させる文献が報告された（Ｔｈｅｏｒｉｔｉｃａｌ ａ
ｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８７ ４５
５−４６３（１９９３）。この文献の技術は、アルファ
ルファと交配不能であるイガマメの核の遺伝情報のう
ち、タンニンの生合成に関する必要な形質のみをアルフ
ァルファに導入することを目的としたものである。しか
しながら、この方法で目的とする形質のみを選択的に導
入することは極めて難しく、目的としない不必要な形質
も同時に導入されることになると考えられる。したがっ
て、上記の対称融合の場合と同様に、戻し交配等の方法
により、この問題を解決する必要が生ずると考えられ
る。
て、例えば、２種のアルファルファの体細胞融合によ
り、体細胞雑種を得る方法が知られている（特開昭６０
−９１９２７号公報）。この手法を用いることにより、
上記の問題は回避されるが、今まで行われてきた対称融
合では、雑種細胞に２種の核が存在してしまい、核に存
在する不要な遺伝形質が排除できない。これまで、例え
ば、ブラシカ属などで体細胞融合によって得られた体細
胞雑種植物は、戻し交配により核の置換を行い、この問
題を解決してきた。しかし、戻し交配による核置換は、
数年〜十年といった長い年月を要し、また、上記理由の
ため、アルファルファの場合は、交配そのものに難点が
ある。なお、最近Ｌｉらにより、アルファルファのプロ
トプラストとガンマ線を照射して核を損傷させたイガマ
メ（ｓａｉｎｆｏｉｎ，Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ ｖｉｃ
ｉｉｆｏｌｉａ Ｓｃｏｐ）のプロトプラストとを融合
させる文献が報告された（Ｔｈｅｏｒｉｔｉｃａｌ ａ
ｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８７ ４５
５−４６３（１９９３）。この文献の技術は、アルファ
ルファと交配不能であるイガマメの核の遺伝情報のう
ち、タンニンの生合成に関する必要な形質のみをアルフ
ァルファに導入することを目的としたものである。しか
しながら、この方法で目的とする形質のみを選択的に導
入することは極めて難しく、目的としない不必要な形質
も同時に導入されることになると考えられる。したがっ
て、上記の対称融合の場合と同様に、戻し交配等の方法
により、この問題を解決する必要が生ずると考えられ
る。
【０００４】一方、片方の親の核のみを持つ、非対称体
細胞雑種植物を作出する際の戻し交配に要する長期の年
月を短縮するための方法として、超遠心による脱核（例
えば、特開平２−３０３４２６号公報）や、放射線照射
による核の破壊（例えば、特開平１−１９６２３９号公
報、特開昭６４−２００４１号公報、特開昭６３−３６
７７６号公報）を行ったプロトプラストを用いた非対称
融合法による細胞質雑種作成などが行われている。しか
しながら、現時点では、この非対称融合による細胞質雑
種は、タバコ、イネ、ニンジン、ジャガイモ、キャベツ
などの限られた植物のみで得られているにすぎない。以
上のように、アルファルファについては、先に述べたよ
うな交配による育種の困難さにも係わらず、細胞質の遺
伝情報のみを導入するための非対称融合の技術は確立さ
れていない。
細胞雑種植物を作出する際の戻し交配に要する長期の年
月を短縮するための方法として、超遠心による脱核（例
えば、特開平２−３０３４２６号公報）や、放射線照射
による核の破壊（例えば、特開平１−１９６２３９号公
報、特開昭６４−２００４１号公報、特開昭６３−３６
７７６号公報）を行ったプロトプラストを用いた非対称
融合法による細胞質雑種作成などが行われている。しか
しながら、現時点では、この非対称融合による細胞質雑
種は、タバコ、イネ、ニンジン、ジャガイモ、キャベツ
などの限られた植物のみで得られているにすぎない。以
上のように、アルファルファについては、先に述べたよ
うな交配による育種の困難さにも係わらず、細胞質の遺
伝情報のみを導入するための非対称融合の技術は確立さ
れていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、細胞質雄性
不稔等といった有用な細胞質遺伝形質をアルファルファ
栽培種に効率よく導入し、細胞質雑種カルスを得る方法
を提供するものである。
不稔等といった有用な細胞質遺伝形質をアルファルファ
栽培種に効率よく導入し、細胞質雑種カルスを得る方法
を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、有用な遺伝形
質が細胞質に存在するアルファルファ細胞のプロトプラ
ストのうち細胞核のみを選択的に破壊したものを一方の
親とし、有用な遺伝形質が核に存在するアルファルファ
のプロトプラストのうち細胞質のみを不活性化したもの
を片方の親とし、これら二種類のプロトプラストを融合
させることにより、有用な遺伝形質を含む核を持ち、同
時に、有用な遺伝形質を細胞質に有するアルファルファ
雑種細胞を形成させる方法である。
質が細胞質に存在するアルファルファ細胞のプロトプラ
ストのうち細胞核のみを選択的に破壊したものを一方の
親とし、有用な遺伝形質が核に存在するアルファルファ
のプロトプラストのうち細胞質のみを不活性化したもの
を片方の親とし、これら二種類のプロトプラストを融合
させることにより、有用な遺伝形質を含む核を持ち、同
時に、有用な遺伝形質を細胞質に有するアルファルファ
雑種細胞を形成させる方法である。
【０００７】以下、本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明で使用できる、細胞質に有用な遺伝形質が存在す
るアルファルファとしては、例えば、細胞質雄性不稔系
統等があり、一方、核に有用な遺伝形質を持つアルファ
ルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ（Ｌ．））とし
ては、例えば、栽培品種である、ＳｐｒｅｄｏｒＩＩ、
Ｖａｎｃｏｒ、Ｒａｎｇｅｌａｎｄｅｒ等が挙げられ
る。
本発明で使用できる、細胞質に有用な遺伝形質が存在す
るアルファルファとしては、例えば、細胞質雄性不稔系
統等があり、一方、核に有用な遺伝形質を持つアルファ
ルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ（Ｌ．））とし
ては、例えば、栽培品種である、ＳｐｒｅｄｏｒＩＩ、
Ｖａｎｃｏｒ、Ｒａｎｇｅｌａｎｄｅｒ等が挙げられ
る。
【０００８】以下、細胞質雄性不稔系統およびＭ．ｓａ
ｔｉｖａ（Ｌ．）を用いた場合のカルス作出方法を述べ
る。 １．プロトプラストの単離 プロトプラストは、常法に従い、細胞質雄性不稔系統の
懸濁培養細胞から、また、Ｍ．ｓａｔｉｖａ（Ｌ．）に
ついては、植物体またはその部分を細分し、セルラーゼ
やペクチナーゼ等の細胞壁分解酵素を含む酵素液中、２
７〜３２℃、約６０ｓｐｍ（ｓｔｒｏｋｅ ｐｅｒ ｍ
ｉｎｕｔｅ）の条件で、２〜４時間程度処理することに
よって得ることができる。
ｔｉｖａ（Ｌ．）を用いた場合のカルス作出方法を述べ
る。 １．プロトプラストの単離 プロトプラストは、常法に従い、細胞質雄性不稔系統の
懸濁培養細胞から、また、Ｍ．ｓａｔｉｖａ（Ｌ．）に
ついては、植物体またはその部分を細分し、セルラーゼ
やペクチナーゼ等の細胞壁分解酵素を含む酵素液中、２
７〜３２℃、約６０ｓｐｍ（ｓｔｒｏｋｅ ｐｅｒ ｍ
ｉｎｕｔｅ）の条件で、２〜４時間程度処理することに
よって得ることができる。
【０００９】２．核の破壊 細胞質雄性不稔系統由来のプロトプラストは、Ｘ線を照
射し細胞核のみを選択的に破壊する。例えば、好ましい
方法として、次が挙げられる。すなわち、前記の方法で
調製したプロトプラストを０．５Ｍマンニトール溶液に
懸濁してプラスチックシャーレに入れ、軟Ｘ線を照射す
る。照射後プロトプラストを洗浄し、培養および融合に
供する。Ｘ線照射の条件については、線量を１００〜３
００ｋｒａｄの範囲に設定することで、生理活性はある
期間維持しているが、***および増殖が阻害されたプロ
トプラストを得ることができる。アルファルファの核の
不活化に必要な線量の範囲は、今までに他の植物につい
て知られたＸ線照射量に比べ高い値をとる。
射し細胞核のみを選択的に破壊する。例えば、好ましい
方法として、次が挙げられる。すなわち、前記の方法で
調製したプロトプラストを０．５Ｍマンニトール溶液に
懸濁してプラスチックシャーレに入れ、軟Ｘ線を照射す
る。照射後プロトプラストを洗浄し、培養および融合に
供する。Ｘ線照射の条件については、線量を１００〜３
００ｋｒａｄの範囲に設定することで、生理活性はある
期間維持しているが、***および増殖が阻害されたプロ
トプラストを得ることができる。アルファルファの核の
不活化に必要な線量の範囲は、今までに他の植物につい
て知られたＸ線照射量に比べ高い値をとる。
【００１０】３．細胞質の不活化 Ｍ．ｓａｔｉｖａ（Ｌ．）のプロトプラストは、ヨード
アセトアミド（以下、ＩＯＡという）で処理して細胞質
の不活性化を行う。例えば、好ましい方法として、上記
の方法で調製したプロトプラストを０．５〜２．０×１
０４ 個／ミリリットルの密度で、ＩＯＡを最終濃度で
３〜２０ｍＭ含むように調製した０．５Ｍマンニトール
溶液に懸濁する。このプロトプラストを室温または２〜
４℃で１０分間処理した後、０．５Ｍマンニトール溶液
で洗浄し、培養および融合に供する。ＩＯＡ処理したプ
ロトプラストの培養法として液体培地での培養法を用い
ると、室温で処理する場合にはＩＯＡ１０ｍＭ以上で、
低温においた場合にはＩＯＡ１５ｍＭ以上の濃度で処理
することにより、プロトプラストの***は完全に阻害さ
れる。しかし、プロトプラストをアガロース包埋する培
養法（Ｊ．Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１５ ５０１（１９８９））を
用いた場合には、室温では３ｍＭ、低温では６ｍＭでも
プロトプラストの***は阻害される。これらのどの条件
で処理したプロトプラストも融合に用いることができ
る。
アセトアミド（以下、ＩＯＡという）で処理して細胞質
の不活性化を行う。例えば、好ましい方法として、上記
の方法で調製したプロトプラストを０．５〜２．０×１
０４ 個／ミリリットルの密度で、ＩＯＡを最終濃度で
３〜２０ｍＭ含むように調製した０．５Ｍマンニトール
溶液に懸濁する。このプロトプラストを室温または２〜
４℃で１０分間処理した後、０．５Ｍマンニトール溶液
で洗浄し、培養および融合に供する。ＩＯＡ処理したプ
ロトプラストの培養法として液体培地での培養法を用い
ると、室温で処理する場合にはＩＯＡ１０ｍＭ以上で、
低温においた場合にはＩＯＡ１５ｍＭ以上の濃度で処理
することにより、プロトプラストの***は完全に阻害さ
れる。しかし、プロトプラストをアガロース包埋する培
養法（Ｊ．Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１５ ５０１（１９８９））を
用いた場合には、室温では３ｍＭ、低温では６ｍＭでも
プロトプラストの***は阻害される。これらのどの条件
で処理したプロトプラストも融合に用いることができ
る。
【００１１】４．細胞の融合条件 上記２．で得られる細胞質に有用な遺伝形質が存在し細
胞核のみが破壊されたプロトプラストと、上記３．の方
法で得られる細胞質が不活性化されたプロトプラストを
細胞融合させる。細胞融合は、電気融合法により行うこ
とができる。その方法としては、双方のプロトプラスト
を、０．５Ｍマンニトールまたは０．１％塩化カルシウ
ムを含む０．５Ｍマンニトールに、最終密度が１〜５×
１０４ 個／ミリリットルになるように、ＩＯＡ処理プ
ロトプラスト：Ｘ線処理プロトプラスト＝１：１〜４の
割合で混合する。このプロトプラスト懸濁液を細胞融合
用の平行電極の間に入れ、以下に示すような電圧を電極
間に印加し、電気刺激をプロトプラストに与える。 ・交流電圧 １５０〜２００Ｖ／ｃｍ ３
〜１０秒 ・直流パルス幅 １０〜３０μｓｅｃ ・直流パルス電圧 １．０〜１．５ｋＶ／ｃｍ ・直流パルス印加回数 １回 上述のような電圧を電極間に印加後、５〜１０分間静置
し洗浄する。二種類のプロトプラストの色調の違いをも
とに融合率を評価すると、上述の方法での異種融合細胞
の形成率は、ＩＯＡ処理プロトプラストの約５０％に達
する。
胞核のみが破壊されたプロトプラストと、上記３．の方
法で得られる細胞質が不活性化されたプロトプラストを
細胞融合させる。細胞融合は、電気融合法により行うこ
とができる。その方法としては、双方のプロトプラスト
を、０．５Ｍマンニトールまたは０．１％塩化カルシウ
ムを含む０．５Ｍマンニトールに、最終密度が１〜５×
１０４ 個／ミリリットルになるように、ＩＯＡ処理プ
ロトプラスト：Ｘ線処理プロトプラスト＝１：１〜４の
割合で混合する。このプロトプラスト懸濁液を細胞融合
用の平行電極の間に入れ、以下に示すような電圧を電極
間に印加し、電気刺激をプロトプラストに与える。 ・交流電圧 １５０〜２００Ｖ／ｃｍ ３
〜１０秒 ・直流パルス幅 １０〜３０μｓｅｃ ・直流パルス電圧 １．０〜１．５ｋＶ／ｃｍ ・直流パルス印加回数 １回 上述のような電圧を電極間に印加後、５〜１０分間静置
し洗浄する。二種類のプロトプラストの色調の違いをも
とに融合率を評価すると、上述の方法での異種融合細胞
の形成率は、ＩＯＡ処理プロトプラストの約５０％に達
する。
【００１２】５．細胞の培養 上記４．で得られた融合細胞は、遠心分離により沈澱画
分を集め培養する。例えば、好ましい方法として、融合
細胞をＫＡＯプロトプラスト培養培地（Ｋ．Ｎ．Ｋａ
ｏ， Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１５０ ２２５
（１９７７））をアガロースで固めたものに、異種融合
細胞の密度が１〜３×１０３ 個／ミリリットルとなる
ように包埋した後、（１）周囲にナース細胞として、細
胞質雄性不稔系統の懸濁培養細胞を流し、または（２）
一般に用いられる、懸濁培養細胞培養培地、プロトプラ
スト培養培地、プロトプラスト由来コロニー培養用培地
のいずれかのみを流して、２３〜２７℃、約３０ｒｐ
ｍ、暗所で培養する。ナース細胞を添加した場合も、し
ない場合も３〜５週間で、直径０．５〜１．０ｍｍ程度
のコロニーが形成される。その後、この前述で得られた
コロニーをゲランガムで固めたＵＭ固体培地（Ｈ．Ｕｃ
ｈｉｍｉｙａａｎｄ Ｔ．Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｐｌａ
ｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４ ９３６（１９７４））上
に移し、生育を促しカルス化させる。
分を集め培養する。例えば、好ましい方法として、融合
細胞をＫＡＯプロトプラスト培養培地（Ｋ．Ｎ．Ｋａ
ｏ， Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１５０ ２２５
（１９７７））をアガロースで固めたものに、異種融合
細胞の密度が１〜３×１０３ 個／ミリリットルとなる
ように包埋した後、（１）周囲にナース細胞として、細
胞質雄性不稔系統の懸濁培養細胞を流し、または（２）
一般に用いられる、懸濁培養細胞培養培地、プロトプラ
スト培養培地、プロトプラスト由来コロニー培養用培地
のいずれかのみを流して、２３〜２７℃、約３０ｒｐ
ｍ、暗所で培養する。ナース細胞を添加した場合も、し
ない場合も３〜５週間で、直径０．５〜１．０ｍｍ程度
のコロニーが形成される。その後、この前述で得られた
コロニーをゲランガムで固めたＵＭ固体培地（Ｈ．Ｕｃ
ｈｉｍｉｙａａｎｄ Ｔ．Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｐｌａ
ｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４ ９３６（１９７４））上
に移し、生育を促しカルス化させる。
【００１３】６．細胞質雑種カルスのミトコンドリアＤ
ＮＡ解析 カルスの細胞質が雑種になっているか否かを調べるに
は、カルスを構成する細胞のミトコンドリアのＤＮＡを
分析することにより行うことができる。ミトコンドリア
が雑種になっているか否かは、サザンハイブリダイゼー
ション法を用いて調べることができる。例えば、好まし
い方法として、カルスから全ＤＮＡを抽出し、例えば、
ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ等の制限酵素で全Ｄ
ＮＡを消化し、電気泳動で分離し、例えばイネのミトコ
ンドリアＤＮＡ遺伝子、例えば、ａｔｐ Ａ、ａｔｐ
６、ａｔｐ ９、ｃｏｂ、ｎａｄ３−ｒｐｓ１２などを
プローブとして、両親のバンドパターンと比較する。上
記４．で得られた細胞由来のカルスについて、ミトコン
ドリアＤＮＡを解析した結果、細胞質の雑種性を確認す
ることができる。
ＮＡ解析 カルスの細胞質が雑種になっているか否かを調べるに
は、カルスを構成する細胞のミトコンドリアのＤＮＡを
分析することにより行うことができる。ミトコンドリア
が雑種になっているか否かは、サザンハイブリダイゼー
ション法を用いて調べることができる。例えば、好まし
い方法として、カルスから全ＤＮＡを抽出し、例えば、
ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ等の制限酵素で全Ｄ
ＮＡを消化し、電気泳動で分離し、例えばイネのミトコ
ンドリアＤＮＡ遺伝子、例えば、ａｔｐ Ａ、ａｔｐ
６、ａｔｐ ９、ｃｏｂ、ｎａｄ３−ｒｐｓ１２などを
プローブとして、両親のバンドパターンと比較する。上
記４．で得られた細胞由来のカルスについて、ミトコン
ドリアＤＮＡを解析した結果、細胞質の雑種性を確認す
ることができる。
【００１４】７．細胞質雑種カルスの核ＤＮＡの解析 細胞質雑種であることが確認できたカルスについて、さ
らにＣＭＳの核が除去されていることを調べるために
は、カルスを構成する細胞の核のＤＮＡを分析すること
により行うことができる。例えば、好ましい方法とし
て、カルスから全ＤＮＡを抽出し、これをテンプレート
として１０塩基対程度の適当な核酸をプライマーとして
用い、適当な条件下でＰＣＲ（ポリメリゼーション チ
ェイン リアクション）反応を行い、その反応液を電気
泳動で分離し、得られるバンドパターンを両親のものと
比較する。上記６．で得られた細胞質雑種のカルスにつ
いて、その核ＤＮＡを解析した結果、細胞質提供親であ
るＣＭＳに特徴的にみられるバンドが消失したものは、
ＣＭＳの核が除去されていることが確認できる。以上の
方法により、栽培種の核をもち細胞質は雑種であるカル
スを作出することができる。
らにＣＭＳの核が除去されていることを調べるために
は、カルスを構成する細胞の核のＤＮＡを分析すること
により行うことができる。例えば、好ましい方法とし
て、カルスから全ＤＮＡを抽出し、これをテンプレート
として１０塩基対程度の適当な核酸をプライマーとして
用い、適当な条件下でＰＣＲ（ポリメリゼーション チ
ェイン リアクション）反応を行い、その反応液を電気
泳動で分離し、得られるバンドパターンを両親のものと
比較する。上記６．で得られた細胞質雑種のカルスにつ
いて、その核ＤＮＡを解析した結果、細胞質提供親であ
るＣＭＳに特徴的にみられるバンドが消失したものは、
ＣＭＳの核が除去されていることが確認できる。以上の
方法により、栽培種の核をもち細胞質は雑種であるカル
スを作出することができる。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明する。 （実施例１） （１）本葉からの培養細胞の調製 細胞質親としては、北海道農試で育種された雄性不稔系
統Ｌ−２０９５（以下、ＣＭＳ）のアルファルファを使
用した。ＣＭＳは、人工気象室内で育成した個体の本葉
を、ＵＭカルス培養培地の２，４−ジクロロフェノキシ
酢酸濃度を０．５ｐｐｍに改変し（以下、ＵＭ改変培
地）、０．２％のゲランガムで固めた固体培地に置床
し、約２５℃で培養した。培養後約１ヶ月でカルスを形
成し、このカルスをＵＭ改変培地５０ミリリットルに懸
濁し、２５℃の温度で振盪培養して懸濁培養細胞株を樹
立し、この懸濁培養細胞をプロトプラストの材料とし
た。
統Ｌ−２０９５（以下、ＣＭＳ）のアルファルファを使
用した。ＣＭＳは、人工気象室内で育成した個体の本葉
を、ＵＭカルス培養培地の２，４−ジクロロフェノキシ
酢酸濃度を０．５ｐｐｍに改変し（以下、ＵＭ改変培
地）、０．２％のゲランガムで固めた固体培地に置床
し、約２５℃で培養した。培養後約１ヶ月でカルスを形
成し、このカルスをＵＭ改変培地５０ミリリットルに懸
濁し、２５℃の温度で振盪培養して懸濁培養細胞株を樹
立し、この懸濁培養細胞をプロトプラストの材料とし
た。
【００１６】（２）ＣＭＳ系統からのプロトプラストの
調製 対数増殖期にあるＣＭＳの懸濁培養細胞を、０．５Ｍマ
ンニトールで洗浄した後、０．５Ｍマンニトールに溶か
した酵素液（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ”ＯＮＯＺＵＫＡ”Ｒ
Ｓ ３％、Ｍｅｉｃｅｌｌａｓｅ ３％、Ｍａｓｅｒｏ
ｚｙｍｅ Ｒ−１０ ０．５％、Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ
Ｙ−２３ ０．２％ ｐＨ５．５）で３０℃、６０ｓ
ｐｍ、４時間処理した。この酵素液を濾過して未消化物
を除去し、７００ｒｐｍで２分間遠心して沈澱物を集
め、それを１７％サッカロース液で懸濁し、７００ｒｐ
ｍで２分間遠心し、プロトプラストのバンドを回収し
た。
調製 対数増殖期にあるＣＭＳの懸濁培養細胞を、０．５Ｍマ
ンニトールで洗浄した後、０．５Ｍマンニトールに溶か
した酵素液（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ”ＯＮＯＺＵＫＡ”Ｒ
Ｓ ３％、Ｍｅｉｃｅｌｌａｓｅ ３％、Ｍａｓｅｒｏ
ｚｙｍｅ Ｒ−１０ ０．５％、Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ
Ｙ−２３ ０．２％ ｐＨ５．５）で３０℃、６０ｓ
ｐｍ、４時間処理した。この酵素液を濾過して未消化物
を除去し、７００ｒｐｍで２分間遠心して沈澱物を集
め、それを１７％サッカロース液で懸濁し、７００ｒｐ
ｍで２分間遠心し、プロトプラストのバンドを回収し
た。
【００１７】（３）Ｘ線照射による核の破壊 （２）で得られたプロトプラストを０．５Ｍマンニトー
ルに懸濁し、７×１０５ 個／ミリリットルの濃度に調
製し、直径６０ｍｍのプラスチックシャーレに入れて、
１３５ｋｒａｄのＸ線を照射し（オーミック社 軟Ｘ線
照射装置、Ｍｏｄｅｌ ＯＭ−１００Ｒ）、核を破壊し
た。
ルに懸濁し、７×１０５ 個／ミリリットルの濃度に調
製し、直径６０ｍｍのプラスチックシャーレに入れて、
１３５ｋｒａｄのＸ線を照射し（オーミック社 軟Ｘ線
照射装置、Ｍｏｄｅｌ ＯＭ−１００Ｒ）、核を破壊し
た。
【００１８】（４）Ｓｐｒｅｄｏｒ ＩＩからのプロト
プラストの調製 核親としては、栽培種であるＭ．ｓａｔｉｖａ（Ｌ．）
Ｓｐｒｅｄｏｒ ＩＩ（以下、Ｓｐｒｅｄｏｒ）を無菌
的に播種し、２５℃、明所（約５０００ｌｕｘ）で発芽
させ、播種後５日目の子葉をプロトプラストの材料とし
た。子葉は約１ｍｍ幅に細断し、０．６Ｍマンニトール
に溶かした酵素液（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ”ＯＮＯＺＵＫ
Ａ”ＲＳ ４％、Ｍａｓｅｒｏｚｙｍｅ Ｒ−１００．
５％、Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ−２３ ０．２％ ｐ
Ｈ５．５）で３０℃、約６０ｓｐｍ、２時間処理した。
この酵素液を濾過して未消化物を除去し、７００ｒｐｍ
で２分間遠心して沈澱物を集め、それを２０％ サッカ
ロース液で懸濁し、７００ｒｐｍで２分間遠心し、プロ
トプラストのバンドを回収した。
プラストの調製 核親としては、栽培種であるＭ．ｓａｔｉｖａ（Ｌ．）
Ｓｐｒｅｄｏｒ ＩＩ（以下、Ｓｐｒｅｄｏｒ）を無菌
的に播種し、２５℃、明所（約５０００ｌｕｘ）で発芽
させ、播種後５日目の子葉をプロトプラストの材料とし
た。子葉は約１ｍｍ幅に細断し、０．６Ｍマンニトール
に溶かした酵素液（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ”ＯＮＯＺＵＫ
Ａ”ＲＳ ４％、Ｍａｓｅｒｏｚｙｍｅ Ｒ−１００．
５％、Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ−２３ ０．２％ ｐ
Ｈ５．５）で３０℃、約６０ｓｐｍ、２時間処理した。
この酵素液を濾過して未消化物を除去し、７００ｒｐｍ
で２分間遠心して沈澱物を集め、それを２０％ サッカ
ロース液で懸濁し、７００ｒｐｍで２分間遠心し、プロ
トプラストのバンドを回収した。
【００１９】（５）ＩＯＡ処理による細胞質の不活化 （５）で得られたプロトプラストを０．５Ｍマンニトー
ルにＩＯＡ濃度が３ｍＭ、プロトプラスト密度が１×１
０４ 個／ミリリットルになるよう懸濁して氷冷下で１
０分間浸漬し、単独での***能を失わせた。
ルにＩＯＡ濃度が３ｍＭ、プロトプラスト密度が１×１
０４ 個／ミリリットルになるよう懸濁して氷冷下で１
０分間浸漬し、単独での***能を失わせた。
【００２０】（６）細胞融合 Ｘ線照射したＣＭＳプロトプラストと、ＩＯＡ処理した
Ｓｐｒｅｄｏｒプロトプラストは、０．１％塩化カルシ
ウムを含む０．５Ｍマンニトールに４：１の割合で、最
終密度が５×１０４ 個／ミリリットルになるように混
合した。このプロトプラスト懸濁液を融合用電極（島津
融合チャンバー、ＦＴＣ−２３Ｗ）の間に入れ、島津細
胞融合装置、ＳＳＨ−２を用いて以下の電気刺激を与え
融合を行った。すなわち、交流電圧２００Ｖ／ｃｍ ５
秒間、直流パルス電圧１．０ｋＶ／ｃｍ 、直流パルス
幅２０μｓｅｃ １回の電圧を印加した。融合処理後、
室温で５分間静置しＫＡＯプロトプラスト培養培地で１
回洗浄し、培養に供した。
Ｓｐｒｅｄｏｒプロトプラストは、０．１％塩化カルシ
ウムを含む０．５Ｍマンニトールに４：１の割合で、最
終密度が５×１０４ 個／ミリリットルになるように混
合した。このプロトプラスト懸濁液を融合用電極（島津
融合チャンバー、ＦＴＣ−２３Ｗ）の間に入れ、島津細
胞融合装置、ＳＳＨ−２を用いて以下の電気刺激を与え
融合を行った。すなわち、交流電圧２００Ｖ／ｃｍ ５
秒間、直流パルス電圧１．０ｋＶ／ｃｍ 、直流パルス
幅２０μｓｅｃ １回の電圧を印加した。融合処理後、
室温で５分間静置しＫＡＯプロトプラスト培養培地で１
回洗浄し、培養に供した。
【００２１】（７）融合細胞の培養 ＫＡＯプロトプラスト培養培地に懸濁した融合細胞は、
異種融合細胞の培養密度が３×１０３ 個／ミリリット
ルとなるように調製し、０．５％アガロースに包埋し、
周囲にＫＡＯプロトプラスト培養培地を流して、室温、
暗黒条件下、約３０ｒｐｍで回旋しながら培養すること
により、４〜５週間後に直径０．５〜１．０ｍｍのコロ
ニーが形成された。得られたコロニーは、ゲランガム
０．２％を含むＵＭ改変固体培地に置床し、生育を促し
た。
異種融合細胞の培養密度が３×１０３ 個／ミリリット
ルとなるように調製し、０．５％アガロースに包埋し、
周囲にＫＡＯプロトプラスト培養培地を流して、室温、
暗黒条件下、約３０ｒｐｍで回旋しながら培養すること
により、４〜５週間後に直径０．５〜１．０ｍｍのコロ
ニーが形成された。得られたコロニーは、ゲランガム
０．２％を含むＵＭ改変固体培地に置床し、生育を促し
た。
【００２２】（８）雑種検定 上記（７）で得られたカルスをミトコンドリアＤＮＡの
解析に用いた。ミトコンドリアＤＮＡの解析にはサザン
ハイブリダイゼーション法を用い、カルスからの全ＤＮ
Ａの抽出法はＨｏｎｄａらの方法（Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂ
ｒｅｅｄ．，４０ ３３９ （１９９０））によった。
解析に用いた。ミトコンドリアＤＮＡの解析にはサザン
ハイブリダイゼーション法を用い、カルスからの全ＤＮ
Ａの抽出法はＨｏｎｄａらの方法（Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂ
ｒｅｅｄ．，４０ ３３９ （１９９０））によった。
【００２３】この全ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造
（株））で消化し、サザンハイブリダイゼーションのプ
ローブとしてベーリンガー社製のラベリングキットによ
りディゴシキゲニンでラベルした、ａｔｐ Ａ（イネ
Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ α ｓｕｂｕｎｉｔ）を用いて、
ベーリンガー社のディテクションキットのプロトコール
記載の手順に従ってシグナルを検出し、両親のバンドパ
ターンと比較した。得られたカルスのバンドパターン
は、両親のそれと異なり、細胞質が混合した状態、すな
わち、細胞質雑種であることが確認された。
（株））で消化し、サザンハイブリダイゼーションのプ
ローブとしてベーリンガー社製のラベリングキットによ
りディゴシキゲニンでラベルした、ａｔｐ Ａ（イネ
Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ α ｓｕｂｕｎｉｔ）を用いて、
ベーリンガー社のディテクションキットのプロトコール
記載の手順に従ってシグナルを検出し、両親のバンドパ
ターンと比較した。得られたカルスのバンドパターン
は、両親のそれと異なり、細胞質が混合した状態、すな
わち、細胞質雑種であることが確認された。
【００２４】また、上記全ＤＮＡをテンプレートとし、
ＯＰＥＲＯＮ社製ＲＡＰＤプライマー １０ｍｅｒキッ
トＣのＯＰＣ−０１（塩基配列：ＴＴＣＧＡＧＣＣＡ
Ｇ）をプライマーとして、以下の条件でＰＣＲ反応を行
った。すなわち、２倍濃度のＰＣＲ用リアクションバッ
ファー（宝酒造（株））、２００μＭのｄＮＴＰ、０．
２μＭのプライマーを含む溶液に、上記全ＤＮＡを５０
ｎｇとＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡ ｐｏｙｍｅｒａｓｅ
（宝酒造（株））約１．５ｕｎｉｔを加え、全容量を２
５マイクロリットルとしたものを反応液とし、これをＤ
ＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ社製）を用いて、次のステップで増幅した。 ９４℃ ３分 ９４℃ １分、３８℃ ２分、７２℃ ３分、この
ステップを４０回繰り返す。 ７２℃ ５分 ＰＣＲ反応後、反応液を２％のアガロースゲルで電気泳
動し、バンドバターンを調べた結果、約８００塩基対の
ところにみられるＣＭＳの核特有のバンドは確認され
ず、ＣＭＳの核が除去されていることが確認された。
ＯＰＥＲＯＮ社製ＲＡＰＤプライマー １０ｍｅｒキッ
トＣのＯＰＣ−０１（塩基配列：ＴＴＣＧＡＧＣＣＡ
Ｇ）をプライマーとして、以下の条件でＰＣＲ反応を行
った。すなわち、２倍濃度のＰＣＲ用リアクションバッ
ファー（宝酒造（株））、２００μＭのｄＮＴＰ、０．
２μＭのプライマーを含む溶液に、上記全ＤＮＡを５０
ｎｇとＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡ ｐｏｙｍｅｒａｓｅ
（宝酒造（株））約１．５ｕｎｉｔを加え、全容量を２
５マイクロリットルとしたものを反応液とし、これをＤ
ＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ社製）を用いて、次のステップで増幅した。 ９４℃ ３分 ９４℃ １分、３８℃ ２分、７２℃ ３分、この
ステップを４０回繰り返す。 ７２℃ ５分 ＰＣＲ反応後、反応液を２％のアガロースゲルで電気泳
動し、バンドバターンを調べた結果、約８００塩基対の
ところにみられるＣＭＳの核特有のバンドは確認され
ず、ＣＭＳの核が除去されていることが確認された。
【００２５】（実施例２）（３）Ｘ線照射による核の破
壊および（５）ＩＯＡ処理による細胞質の不活化条件、
（７）融合細胞の培養方法以外の操作は実施例１と同じ
である。以下、条件を変更した部分について述べる。 （３）Ｘ線照射による核の破壊 実施例１と同様に、回収したＣＭＳ系統のプロトプラス
トは１×１０７ 個／ミリリットルの濃度に調製し、２
２５ｋｒａｄのＸ線を照射し、選択的に核を破壊した。 （５）ＩＯＡ処理による核の不活化 同じく実施例１と同様に回収したＳｐｒｅｄｏｒのプロ
トプラストは、最終ＩＯＡ濃度が６ｍＭになるようにＩ
ＯＡを添加することを除き、実施例１と同様に処理し、
融合に供した。 （７）融合細胞の培養
壊および（５）ＩＯＡ処理による細胞質の不活化条件、
（７）融合細胞の培養方法以外の操作は実施例１と同じ
である。以下、条件を変更した部分について述べる。 （３）Ｘ線照射による核の破壊 実施例１と同様に、回収したＣＭＳ系統のプロトプラス
トは１×１０７ 個／ミリリットルの濃度に調製し、２
２５ｋｒａｄのＸ線を照射し、選択的に核を破壊した。 （５）ＩＯＡ処理による核の不活化 同じく実施例１と同様に回収したＳｐｒｅｄｏｒのプロ
トプラストは、最終ＩＯＡ濃度が６ｍＭになるようにＩ
ＯＡを添加することを除き、実施例１と同様に処理し、
融合に供した。 （７）融合細胞の培養
【００２６】融合後の細胞の取扱、細胞を懸濁する培
地、包埋の方法は、実施例１と同じであるが、細胞を包
埋したアガロースの周りに、ＫＡＯ細胞培養培地（Ｋ．
Ｎ．Ｋａｏ， Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１５０
２２５（１９７７））を流して実施例１と同様の条件
下で培養する。この培養方法を用いた場合にも、４〜５
週間後に０．５〜１ｍｍ程度のコロニーが得られ、カル
スを誘導できた。上記条件で各プロトプラストを処理
し、融合を行った場合に得られたカルスについても、そ
れらのミトコンドリアＤＮＡの解析により、細胞質雑種
であることが確認された。
地、包埋の方法は、実施例１と同じであるが、細胞を包
埋したアガロースの周りに、ＫＡＯ細胞培養培地（Ｋ．
Ｎ．Ｋａｏ， Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１５０
２２５（１９７７））を流して実施例１と同様の条件
下で培養する。この培養方法を用いた場合にも、４〜５
週間後に０．５〜１ｍｍ程度のコロニーが得られ、カル
スを誘導できた。上記条件で各プロトプラストを処理
し、融合を行った場合に得られたカルスについても、そ
れらのミトコンドリアＤＮＡの解析により、細胞質雑種
であることが確認された。
【００２７】
【発明の効果】本発明に従い、アルファルファのプロト
プラストを原料とし、細胞質提供親とするプロトプラス
トをＸ線処理し、また、核提供親とするプロトプラスト
をヨードアセトアミドで処理し、これらを融合させるこ
とによって、効率的にアルファルファの細胞質雑種細胞
を得ることができ、アルファルファの品種改良に有効で
ある。
プラストを原料とし、細胞質提供親とするプロトプラス
トをＸ線処理し、また、核提供親とするプロトプラスト
をヨードアセトアミドで処理し、これらを融合させるこ
とによって、効率的にアルファルファの細胞質雑種細胞
を得ることができ、アルファルファの品種改良に有効で
ある。
Claims (1)
- 【請求項１】 有用な遺伝形質が細胞質に存在するアル
ファルファ細胞のプロトプラストのうち細胞核のみを選
択的に破壊したものを一方の親とし、有用な遺伝形質が
核に存在するアルファルファのプロトプラストのうち細
胞質のみを不活性化したものを片方の親とし、これら二
種類のプロトプラストを融合させることにより、有用な
遺伝形質を含む核を持ち、同時に、有用な遺伝形質を細
胞質に有するアルファルファ雑種細胞を形成させる方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6039258A JPH07227279A (ja) | 1994-02-15 | 1994-02-15 | 細胞質雑種カルスの作出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6039258A JPH07227279A (ja) | 1994-02-15 | 1994-02-15 | 細胞質雑種カルスの作出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07227279A true JPH07227279A (ja) | 1995-08-29 |
Family
ID=12548125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6039258A Pending JPH07227279A (ja) | 1994-02-15 | 1994-02-15 | 細胞質雑種カルスの作出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07227279A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104542260A (zh) * | 2015-01-16 | 2015-04-29 | 上海科技馆 | 紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质及其选育和繁殖方法 |
| CN113215172A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-08-06 | 吉林农业大学 | 雄性不育基因MsJMT及其应用 |
-
1994
- 1994-02-15 JP JP6039258A patent/JPH07227279A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104542260A (zh) * | 2015-01-16 | 2015-04-29 | 上海科技馆 | 紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质及其选育和繁殖方法 |
| CN113215172A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-08-06 | 吉林农业大学 | 雄性不育基因MsJMT及其应用 |
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