CN104542260A - 紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质及其选育和繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质，该种质是采用下述方法获得：⑴以穴播种植3年的紫花苜蓿栽培品种甘农3号、天水、牧歌Graze401+Z、金皇后、公农1号、庆阳、河西、甘农1号、西部巨人、陇中、金达莱、甘农2号、巨人、阿尔冈金、苜蓿王、定西、陇东和中兰1号作为自然雄性不育突变体筛选种质资源库；⑵每个紫花苜蓿品种于花期进行花粉量分级测定；⑶配制Alexander染色液；⑷对单株花粉可育率进行测定；⑸判断是否为雄性可育、雄性不育；⑹对所述步骤⑴中自然雄性不育突变体筛选种质资源库进行筛选，获得紫花苜蓿品种牧歌Graze401+Z的雄性不育株cms4-10。本发明还公开了该种质的选育和繁殖方法。本发明性状稳定，且育种目标明确、程序简单。

Description

紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质及其选育和繁殖方法

技术领域

本发明涉及豆科牧草和饲料作物遗传育种技术领域，尤其涉及紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质及其选育和繁殖方法。

背景技术

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是多年生同源四倍体和异花授粉植物，种质资源丰富，种类多且分布广，丰富的紫花苜蓿种质之间常发生基因交流和种质渐渗，使其遗传基础表现出相当大的异质性（王晓娟等. 基于RAPD的群体标记法分析苜蓿种质资源多样性. 植物研究. 2010. 30: 87-91.）。同时，由于紫花苜蓿异花授粉且互交可孕，从而产生了大量的遗传变异，这为紫花苜蓿育种工作中自然雄性不育突变体材料的筛选提供了有利条件（李晓霞等. 几个紫花苜蓿亚（变）种花粉和胚珠遗传变异分析. 中国农业科学. 2009. 42: 1911-1917.）。国内外学者对紫花苜蓿雄性不育系的研究已经历时40余年，已经获得了一些苜蓿雄性不育系，但因获得的不育系雌蕊育性低，杂交制种结实率低，在生产上很难大面积推广应用，因此选育优良的紫花苜蓿雄性不育系已经成为育种学家的一项重要工作。

目前，国内外紫花苜蓿杂种优势利用的花粉控制***主要包括以下几种类型：细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）、细胞核雄性不育（genetic male sterility，GMS）、核质互作雄性不育（cytoplasmic genetic male sterility，CGMS）、自交不亲和性（self-incompatibility，SI）和转基因雄性不育（transgenic male sterility），其中，细胞质雄性不育是紫花苜蓿杂种优势利用的重要途径（冯光辉等. 紫花苜蓿雄性不育机制及其杂交制种研究进展. 种子. 2011. 30: 55-59.）。细胞质雄性不育因其母性遗传的特性，不育性状可以通过母本细胞质基因的稳定遗传传给子代，能够找到保持系，为生产上雄性不育杂种优势的利用提供了依据。

1967年，Davis & Greenblatt（Davis WH, Greenblatt IM. Cytoplasmic male sterility in alfalfa. Journal of Heredity. 1967. 58: 301-305.）从多个苜蓿品种中筛选出完全雄性不育植株，经过和可育植株杂交后并多次回交，子代均表现出雄性不育，具有母系遗传特征，属于细胞质遗传，这也是首次在紫花苜蓿上报导细胞质雄性不育现象。随后Bradner & Childers（Bradner NR, Childers WR. Cytoplasmic male sterility in alfalfa. Canadian Journal of Plant Science. 1968. 48: 111-112.）在苜蓿品种Ontario中发现花粉败育率高达95%的不育植株，并命名为Oms-5，遗传试验证实该不育株属于细胞质雄性不育类型。Stucker & Pedersen（Pedersen MW, Stucker RE. Evidence of cytoplasmic male sterility in alfalfa. Crop Science. 1969. 9: 767-770.）也相继在苜蓿品种DuPuits中发现和报导了细胞质雄性不育突变体。Goldberg（Goldberg RB. Plants: novel developmental processes. Science. 1988. 240: 1460-1467.）进行了紫花苜蓿雄性不育的遗传转化，将带有绒毡层启动子pTA29的核糖核酸酶（Barnase）基因转入苜蓿并获得了转基因植株。Rosellini等（Rosellini D, Ferranti F, Barone P, Veronesiet F. Characterization of transgenic male sterility in alfalfa. Euphytica. 2001. 118: 313-319.）进一步对该转基因雄性不育株的遗传特性进行分析时发现，与正常苜蓿植株相比较，转pTA29-barnase的雄性不育株减数***阶段花粉较小，出现绒毡层变薄和细胞真空化现象，而且细胞质会出现不同程度的降解，这直接导致了小花过早弹开和花粉萌发率的降低。但是，这些研究成果仅仅限于资源研究阶段，离实际应用还相差甚远。

苜蓿育种工作者的首要育种目标是获得具有杂种优势的杂交种以提高牧草的产量和品质，其中紫花苜蓿杂交种生产体系主要集中在利用细胞质雄性不育系进行杂交制种。迄今为止，美国、加拿大、前苏联等许多国家开展了紫花苜蓿细胞质雄性不育系的选育，杂交实验数据表明利用紫花苜蓿细胞质雄性不育杂交获取的杂交种，增产10%~50%不等，具有明显的杂种优势和非常可观的生产应用价值，而这些紫花苜蓿细胞质雄性不育杂交种的不育胞质均来源于紫花苜蓿栽培品种。2001~2006年间，美国Dairyland种子公司经过二十几年的努力，实现了紫花苜蓿雄性不育杂交种的商业化生产，选育出的紫花苜蓿杂交种除了增产之外，还具有耐刈割、生长快等特性（孙寰等. 木豆、苜蓿和大豆 3 种豆科作物杂种优势利用概述. 中国农业科学. 2009. 42(5): 1528-1539.）。目前，国内还没有关于紫花苜蓿细胞质雄性不育系种质及其选育和繁殖的专利技术，只涉及通过远缘杂交来选育苜蓿雄性不育系的方法，如专利号为CN201010624142.7的“苜蓿雄性不育系的选育方法”，该方法以内蒙古锡林郭勒草原的野生黄花苜蓿为母本，以内蒙古准格尔紫花苜蓿为父本进行种间远缘杂交，从其后代中获得雄性不育系Ms-4，该不育系与9个紫花苜蓿品种进行测交试验，发现F₁代群体中雄性不育植株占2~10%，属细胞核基因控制的雄性不育类型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供目标明确、程序简单的该紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质的选育和繁殖方法。

为解决上述问题，本发明所述的紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质，其特征在于：该种质是采用下述方法获得：

⑴以穴播种植3年的紫花苜蓿栽培品种甘农3号、天水、牧歌Graze401+Z、金皇后、公农1号、庆阳、河西、甘农1号、西部巨人、陇中、金达莱、甘农2号、巨人、阿尔冈金、苜蓿王、定西、陇东和中兰1号作为自然雄性不育突变体筛选种质资源库；

⑵每个紫花苜蓿品种于花期随机选择10株，每株不同分枝级别上随机选取5朵小花，弹小花花粉于干净整洁的黑色塑料板上，按常规方法采用花粉量分级测定法根据无花粉、少量花粉、适量花粉、大量花粉的四级分类，目测花粉量级别并记录；

⑶配制Alexander染色液：

ⅰ配制1%的孔雀石绿：将1g的孔雀石用100 ml的质量浓度为95%的酒精溶解，并搅拌10 min，然后静置3 h即得；

ⅱ配制1%酸性品红：将1 g的酸性品红用100 ml蒸馏水溶解，即得；

ⅲ配制1%橙红G：将1 g的橙红用蒸馏水溶解，即得；

ⅴ依次将10 ml 质量浓度为95%的乙醇，1 ml 1%的孔雀石绿，50 ml蒸馏水，25 ml甘油，5 g苯酚，5 ml 1%的酸性品红，0.5 ml 1%的橙红G混合均匀后，即得Alexander染色液；

⑷对单株花粉可育率进行测定：

吸取150 μl Alexander染色液置于干净的载玻片上，再从每个单株上随机选取3个花序，每个花序取2朵小花，分别弹出花粉至Alexander染液中，染色30 min，在显微镜下观察花粉染色情况，若花粉能被染液染成红色，则表示花粉可育；若花粉被染成青蓝色，则表示花粉不育；选取5个视野，统计视野内可育花粉和不育花粉的总个数，并按下式计算花粉可育率：

FPR=（可育花粉总数/观察花粉总数）×100%；

⑸根据花粉量分级和花粉染色率结果，如果单株花粉量为大量或适量，且FPR≥10%，表示为雄性可育；单株花粉量为少量、无花粉，或FPR<10%，则表示为雄性不育；

⑹对所述步骤⑴中自然雄性不育突变体筛选种质资源库进行筛选，获得紫花苜蓿品种牧歌Graze401+Z的雄性不育株4-10。

如上所述的紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质的选育和繁殖方法，包括以下步骤：

①将紫花苜蓿品种牧歌Graze401+Z的雄性不育株4-10作为母本，以可育紫花苜蓿西部巨人10-10为父本，在温室种植条件下按照常规方法进行杂交，获得杂种一代F₁种子；

②播种所述F₁种子，于花期鉴定其花粉数量和花粉活力，全部F₁植株均为完全雄性不育，并以其中的雄性不育单株4-10-2、4-10-4、4-10-5、4-10-6和4-10-12作为母本，与可育亲本紫花苜蓿西部巨人10-10回交，获得回交BCF₁种子；

③播种所述回交BCF₁种子，于花期鉴定其花粉数量和花粉活力，全部BCF₁植株均为完全雄性不育，并命名获得的雄性不育株4-10为cms4-10，其F₁雄性不育株4-10-2、4-10-4、4-10-5、4-10-6和4-10-12作为cms4-10衍生系，命名为cms4-10-2、cms4-10-4、cms4-10-5、cms4-10-6和cms4-10-12；

④于秋季紫花苜蓿收获前，按照亲本标准选留不育系cms4-10作为母本植株，紫花苜蓿西部巨人10-10母株作为父本植株，按常规方法对所述母本植株和所述父本植株进行扦插克隆繁殖，安全越冬，于翌年春季3月初定植在40~60目网室隔离区内，所述母本植株与所述父本植株按4~5：1的比例定植，定植密度为行距60 cm，株距40 cm，于花期在网室内人工放蜂，将父本植株花粉授予母本植株，花谢后拔除父本植株，种子于褐荚期采收即可。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明克服现有紫花苜蓿制种技术的缺陷，以同源四倍体紫花苜蓿优良栽培品种为种质资源库，从紫花苜蓿品种牧歌分离筛选出自然雄性不育突变株4-10，通过种间杂交和回交获得F₁代和BCF₁代种子，经花粉育性和农艺性状检测筛选获得不育性100%稳定遗传和农艺性状优良的紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10及其衍生系cms4-10-2、cms4-10-4、cms4-10-5、cms4-10-6和cms4-10-12，为豆科牧草紫花苜蓿的杂种优势利用和杂交种生产提供细胞质雄性不育新种质。

2、本发明所得的紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10的花器官特征为：紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10的花序特征与保持系相似，每花序小花数8-15朵，二体雄蕊10枚（9+1），花药干瘪呈淡黄色，雄蕊和花药长度正常，在显微镜下观察，该细胞质雄性不育系无花粉或花粉无活力（参见图1），即紫花苜蓿细胞质雄性不育系为无花粉型，对环境反应不敏感，不育性状100%稳定遗传；雌蕊单生，柱头表面多乳突，子房外观形态大小与可育系相同，结构和功能正常；蜜腺数量与保持系相同，发育状况良好，能吸引蜜蜂等昆虫正常采蜜传粉；综合农艺性状优良，叶色深绿，茎红色，生长整齐，综合抗病性强，抗旱耐盐碱。

经在中国甘肃省兰州市、张掖市临泽县以及武威市黄羊镇连续5年5世代种植，其不育性状稳定，均表现为完全雄性不育。

3、本发明的育种目标明确（参见图2），育种程序简单，育种研究和利用方便。

4、本发明的紫花苜蓿细胞质雄性不育系农艺性状优良，杂交结实率高，有利于繁殖不育系种子和生产杂交种（参见图3）。

5、与紫花苜蓿细胞核雄性不育系相比，该细胞质雄性不育株的不育性状能通过细胞质基因完全遗传给子代，人工控制授粉表明cms4-10和保持系10-10杂交获得的F₁代植株均表现为完全雄性不育性状，且F₁代植株结实正常，是优良的紫花苜蓿细胞质雄性不育系（参见表1），适合于商品化杂交种的生产应用。

表1 细胞质雄性不育系cms4-10及其衍生系和保持系10-10杂交F₁和BC₁ F₁的结实率

基于此，本发明提出紫花苜蓿细胞质雄性不育系（cms4-10及其衍生系cms4-10-2、cms4-10-4、cms4-10-5、cms4-10-6和cms4-10-12）杂交制种体系（参见图4），即直接利用不育系和具有杂种优势的强优父本杂交获得杂交种子，由于紫花苜蓿属于多年生茎叶收获的牧草和饲料作物，直接利用不育系和保持系杂交获得杂种优势，不需要恢复系，与细胞核雄性不育系杂交制种体系相比，可省去F₁代种子生产过程，大大缩短了育种年限，具有更高的经济价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明的cms4-10和保持系10-10的花粉育性比较。其中A为保持系10-10植株花药染色；B为保持系10-10植株花药开裂后花粉染色；C为保持系10-10花粉粒形态；D为cms4-10植株花药染色；E为cms4-10植株花药开裂后花粉染色；F为cms4-10植株花粉形态。

图2为本发明的紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10的选育流程。

图3为本发明的紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10及其保持系生长性状比较。其中A为保持系10-10植株形态；B为cms4-10植株形态；C为保持系10-10植株花序；D为cms4-10植株柱头中性红染色；E为cms4-10植株花序；F为cms4-10植株小花形成的荚果。

图4为本发明紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10杂种优势利用途径。

具体实施方式

实施例1    紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质，该种质是采用下述方法获得：

⑴以穴播种植3年的紫花苜蓿栽培品种甘农3号、天水、牧歌Graze401+Z、金皇后、公农1号、庆阳、河西、甘农1号、西部巨人、陇中、金达莱、甘农2号、巨人、阿尔冈金、苜蓿王、定西、陇东和中兰1号作为自然雄性不育突变体筛选种质资源库；

⑵每个紫花苜蓿品种于花期随机选择10株，每株不同分枝级别上随机选取5朵小花，弹小花花粉于干净整洁的黑色塑料板上，按常规方法采用花粉量分级测定法根据无花粉、少量花粉、适量花粉、大量花粉的四级分类，目测花粉量级别并记录；

⑶配制Alexander染色液：

ⅰ配制1%的孔雀石绿：将1g的孔雀石用100 ml的质量浓度为95%的酒精溶解，并搅拌10 min，然后静置3 h即得；

ⅱ配制1%酸性品红：将1 g的酸性品红用100 ml蒸馏水溶解，即得；

ⅲ配制1%橙红G：将1 g的橙红用蒸馏水溶解，即得；

ⅴ依次将10 ml 质量浓度为95%的乙醇，1 ml 1%的孔雀石绿，50 ml蒸馏水，25 ml甘油，5 g苯酚，5 ml 1%的酸性品红，0.5 ml 1%的橙红G混合均匀后，即得Alexander染色液；

⑷对单株花粉可育率进行测定：

吸取150 μl Alexander染色液置于干净的载玻片上，再从每个单株上随机选取3个花序，每个花序取2朵小花，分别弹出花粉至Alexander染液中，染色30 min，在显微镜下观察花粉染色情况，若花粉能被染液染成红色，则表示花粉可育；若花粉被染成青蓝色，则表示花粉不育；选取5个视野，统计视野内可育花粉和不育花粉的总个数，并按下式计算花粉可育率：

FPR=（可育花粉总数/观察花粉总数）×100%；

⑸根据花粉量分级和花粉染色率结果，如果单株花粉量为大量或适量，且FPR≥10%，表示为雄性可育；单株花粉量为少量、无花粉，或FPR<10%，则表示为雄性不育；

⑹对步骤⑴中自然雄性不育突变体筛选种质资源库进行筛选，获得紫花苜蓿品种牧歌Graze401+Z的雄性不育株4-10。

实施例2    紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质的选育和繁殖方法，包括以下步骤：

①将紫花苜蓿品种牧歌Graze401+Z的雄性不育株4-10作为母本，以可育紫花苜蓿西部巨人10-10为父本，在温室种植条件下按照常规方法进行杂交，获得杂种一代F₁种子；

②播种F₁种子，于花期鉴定其花粉数量和花粉活力，全部F₁植株均为完全雄性不育，并以其中的雄性不育单株4-10-2、4-10-4、4-10-5、4-10-6和4-10-12作为母本，与可育亲本紫花苜蓿西部巨人10-10回交，获得回交BCF₁种子；

③播种回交BCF₁种子，于花期鉴定其花粉数量和花粉活力，全部BCF₁植株均为完全雄性不育，并命名获得的雄性不育株4-10为cms4-10，其F₁雄性不育株4-10-2、4-10-4、4-10-5、4-10-6和4-10-12作为cms4-10衍生系，命名为cms4-10-2、cms4-10-4、cms4-10-5、cms4-10-6和cms4-10-12；

④于秋季紫花苜蓿收获前，按照亲本标准选留不育系cms4-10作为母本植株，紫花苜蓿西部巨人10-10母株作为父本植株，按常规方法对母本植株和父本植株进行扦插克隆繁殖，安全越冬，于翌年春季3月初定植在40~60目网室隔离区内，母本植株与父本植株按4~5：1的比例定植，定植密度为行距60 cm，株距40 cm，于花期在网室内人工放蜂，将父本植株花粉授予母本植株，花谢后拔除父本植株，种子于褐荚期采收即可。

Claims (2)

1. 紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质，其特征在于：该种质是采用下述方法获得：

⑴以穴播种植3年的紫花苜蓿栽培品种甘农3号、天水、牧歌Graze401+Z、金皇后、公农1号、庆阳、河西、甘农1号、西部巨人、陇中、金达莱、甘农2号、巨人、阿尔冈金、苜蓿王、定西、陇东和中兰1号作为自然雄性不育突变体筛选种质资源库；

⑵每个紫花苜蓿品种于花期随机选择10株，每株不同分枝级别上随机选取5朵小花，弹小花花粉于干净整洁的黑色塑料板上，按常规方法采用花粉量分级测定法根据无花粉、少量花粉、适量花粉、大量花粉的四级分类，目测花粉量级别并记录；

⑶配制Alexander染色液：

ⅰ配制1%的孔雀石绿：将1g的孔雀石用100 ml的质量浓度为95%的酒精溶解，并搅拌10 min，然后静置3 h即得；

ⅱ配制1%酸性品红：将1 g的酸性品红用100 ml蒸馏水溶解，即得；

ⅲ配制1%橙红G：将1 g的橙红用蒸馏水溶解，即得；

ⅴ依次将10 ml 质量浓度为95%的乙醇，1 ml 1%的孔雀石绿，50 ml蒸馏水，25 ml甘油，5 g苯酚，5 ml 1%的酸性品红，0.5 ml 1%的橙红G混合均匀后，即得Alexander染色液；

⑷对单株花粉可育率进行测定：

吸取150 μl Alexander染色液置于干净的载玻片上，再从每个单株上随机选取3个花序，每个花序取2朵小花，分别弹出花粉至Alexander染液中，染色30 min，在显微镜下观察花粉染色情况，若花粉能被染液染成红色，则表示花粉可育；若花粉被染成青蓝色，则表示花粉不育；选取5个视野，统计视野内可育花粉和不育花粉的总个数，并按下式计算花粉可育率：

FPR=（可育花粉总数/观察花粉总数）×100%；

⑸根据花粉量分级和花粉染色率结果，如果单株花粉量为大量或适量，且FPR≥10%，表示为雄性可育；单株花粉量为少量、无花粉，或FPR<10%，则表示为雄性不育；

⑹对所述步骤⑴中自然雄性不育突变体筛选种质资源库进行筛选，获得紫花苜蓿品种牧歌Graze401+Z的雄性不育株4-10。

2.如权利要求1所述的紫花苜蓿细胞质雄性不育系cms4-10种质的选育和繁殖方法，包括以下步骤：

①将紫花苜蓿品种牧歌Graze401+Z的雄性不育株4-10作为母本，以可育紫花苜蓿西部巨人10-10为父本，在温室种植条件下按照常规方法进行杂交，获得杂种一代F₁种子；

②播种所述F₁种子，于花期鉴定其花粉数量和花粉活力，全部F₁植株均为完全雄性不育，并以其中的雄性不育单株4-10-2、4-10-4、4-10-5、4-10-6和4-10-12作为母本，与可育亲本紫花苜蓿西部巨人10-10回交，获得回交BCF₁种子；

③播种所述回交BCF₁种子，于花期鉴定其花粉数量和花粉活力，全部BCF₁植株均为完全雄性不育，并命名获得的雄性不育株4-10为cms4-10，其F₁雄性不育株4-10-2、4-10-4、4-10-5、4-10-6和4-10-12作为cms4-10衍生系，命名为cms4-10-2、cms4-10-4、cms4-10-5、cms4-10-6和cms4-10-12；

④于秋季紫花苜蓿收获前，按照亲本标准选留不育系cms4-10作为母本植株，紫花苜蓿西部巨人10-10母株作为父本植株，按常规方法对所述母本植株和所述父本植株进行扦插克隆繁殖，安全越冬，于翌年春季3月初定植在40~60目网室隔离区内，所述母本植株与所述父本植株按4~5：1的比例定植，定植密度为行距60 cm，株距40 cm，于花期在网室内人工放蜂，将父本植株花粉授予母本植株，花谢后拔除父本植株，种子于褐荚期采收即可。