JPH07206888A - 胎盤抽出物およびその製造方法 - Google Patents
胎盤抽出物およびその製造方法Info
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- JPH07206888A JPH07206888A JP6001273A JP127394A JPH07206888A JP H07206888 A JPH07206888 A JP H07206888A JP 6001273 A JP6001273 A JP 6001273A JP 127394 A JP127394 A JP 127394A JP H07206888 A JPH07206888 A JP H07206888A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】生物学的活性及び／または治療活性を有し、製
剤及び／または化粧品に使用できる抽出物及びその製造
方法を提供することを目的とする。 【構成】生物学的活性及び／または治療活性を有し、製
剤及び／または化粧品に使用でき、以下のステップによ
り得られる抽出物：ヒトまたは動物由来の胎盤から、不
要な組織を取り除き；脱血し、乾燥し、少なくとも−１
０℃で凍結させ；凍結状態のまま小片としどろどろにつ
ぶし、食塩を含んでもよい冷水と混合して懸濁液とし；
攪拌し静置後に食塩を添加して生理的濃度とし；＋１５
℃以下で適当な時間攪拌後に静置し、ｐＨを酸性に調整
し；適当な時間約４℃で保存し；遠心し、上清を集め；
この上清を濾過し、濾液を酸性に調整し、濾過し；約６
０℃で少なくとも１４時間滅菌し；遠心し、上清を集め
る。
剤及び／または化粧品に使用できる抽出物及びその製造
方法を提供することを目的とする。 【構成】生物学的活性及び／または治療活性を有し、製
剤及び／または化粧品に使用でき、以下のステップによ
り得られる抽出物：ヒトまたは動物由来の胎盤から、不
要な組織を取り除き；脱血し、乾燥し、少なくとも−１
０℃で凍結させ；凍結状態のまま小片としどろどろにつ
ぶし、食塩を含んでもよい冷水と混合して懸濁液とし；
攪拌し静置後に食塩を添加して生理的濃度とし；＋１５
℃以下で適当な時間攪拌後に静置し、ｐＨを酸性に調整
し；適当な時間約４℃で保存し；遠心し、上清を集め；
この上清を濾過し、濾液を酸性に調整し、濾過し；約６
０℃で少なくとも１４時間滅菌し；遠心し、上清を集め
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抽出物およびその抽出
物の製造方法に関する。
物の製造方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】従来、胎盤は非常に多様な方法で抽出さ
れてきた。こうした抽出物に基づき、いくつかの産物が
知られている。最も近い先行技術は、ヒト新鮮胎盤の氷
酢酸抽出物を、筋肉内投与によって雑犬に投与し、血糖
値、非エステル化脂肪酸、インスリン様活性、血中コレ
ステロール値等を測定したバート Ｒ．Ｌ．等（Ａｍ．
Ｊ．Ｏｂｓｔ．ａｎｄ Ｇｙｓ．、９５巻、５７９〜５
８５頁（１９６６年） セントルイス）の報告と、酵
素、ホルモンおよびムコポリサッカライドを含むヒト胎
盤抽出物が、低濃度で強い呼吸刺激作用を有することを
見出したローチ Ｓ．（ＪＡＭＡ、１６２巻、９１５頁
（１９５６年））の報告と、マイコバクテリウム ブチ
リカムを含むフロイントのアジュバントで関節炎及び浮
腫を起こさせたラットに市販の胎盤抽出物を腹腔内投与
して奏効したというゴールド−ユーバート Ｐ．等（Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅａｃ．ＩＩＩ、１５５〜１６
５頁（１９８１年））の報告及び、ヒト胎盤抽出物を妊
娠ドンリュウラット及びｄｄＮ系マウスに皮下投与投与
し、妊娠後期における催奇形性を観察し、催奇形性は臨
床使用で問題とならないとしたナカジマ Ｓ．（Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｓｔｏｙ Ｔｏｈｏ Ｕｎｉｖ．、１８巻、３６
８−３７２頁（１９７１年）「英訳」）の報告である。
れてきた。こうした抽出物に基づき、いくつかの産物が
知られている。最も近い先行技術は、ヒト新鮮胎盤の氷
酢酸抽出物を、筋肉内投与によって雑犬に投与し、血糖
値、非エステル化脂肪酸、インスリン様活性、血中コレ
ステロール値等を測定したバート Ｒ．Ｌ．等（Ａｍ．
Ｊ．Ｏｂｓｔ．ａｎｄ Ｇｙｓ．、９５巻、５７９〜５
８５頁（１９６６年） セントルイス）の報告と、酵
素、ホルモンおよびムコポリサッカライドを含むヒト胎
盤抽出物が、低濃度で強い呼吸刺激作用を有することを
見出したローチ Ｓ．（ＪＡＭＡ、１６２巻、９１５頁
（１９５６年））の報告と、マイコバクテリウム ブチ
リカムを含むフロイントのアジュバントで関節炎及び浮
腫を起こさせたラットに市販の胎盤抽出物を腹腔内投与
して奏効したというゴールド−ユーバート Ｐ．等（Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅａｃ．ＩＩＩ、１５５〜１６
５頁（１９８１年））の報告及び、ヒト胎盤抽出物を妊
娠ドンリュウラット及びｄｄＮ系マウスに皮下投与投与
し、妊娠後期における催奇形性を観察し、催奇形性は臨
床使用で問題とならないとしたナカジマ Ｓ．（Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｓｔｏｙ Ｔｏｈｏ Ｕｎｉｖ．、１８巻、３６
８−３７２頁（１９７１年）「英訳」）の報告である。
【０００３】
【本発明の説明】最近、驚くべきことに、ある抽出物が
治療活性および／または生物学的活性を有していること
が発見された。その抽出物組成は現在のところ知られて
いない。この抽出物は、本発明の製造過程によって得る
ことが可能であるが、これらの工程に限定されるもので
はなく、これらの工程によって得ることができるものと
同様の活性を有するものであれば良い。また、一または
複数の過程、例えば、Ａ、ＢおよびＣは、本発明物質の
治療活性および／または生物学的活性を損なうことな
く、省略することが可能である。本発明は、上皮再形成
または神経障害治療活性などの生物学的活性及び／また
は治療活性を有し、製剤及び／または化粧品に使用でき
る胎盤抽出物及びその製造方法を提供することを目的と
する。すなわち、本発明の特徴は独立請求項によって定
義される。また、本発明の好適な実施態様は従属請求項
によって定義される。
治療活性および／または生物学的活性を有していること
が発見された。その抽出物組成は現在のところ知られて
いない。この抽出物は、本発明の製造過程によって得る
ことが可能であるが、これらの工程に限定されるもので
はなく、これらの工程によって得ることができるものと
同様の活性を有するものであれば良い。また、一または
複数の過程、例えば、Ａ、ＢおよびＣは、本発明物質の
治療活性および／または生物学的活性を損なうことな
く、省略することが可能である。本発明は、上皮再形成
または神経障害治療活性などの生物学的活性及び／また
は治療活性を有し、製剤及び／または化粧品に使用でき
る胎盤抽出物及びその製造方法を提供することを目的と
する。すなわち、本発明の特徴は独立請求項によって定
義される。また、本発明の好適な実施態様は従属請求項
によって定義される。
【０００４】本発明の第一の態様は、生物学的活性及び
／または治療活性を有し、製剤及び／または化粧品に使
用でき、以下のステップにより得ることができる抽出物
である： （Ａ）ヒトまたは動物由来の胎盤から絨毛膜、腱、血液
凝集塊および壊死した組織を除去し； （Ｂ）上記のようにして得られた胎盤組織から、加圧
下、特に手による加圧によって血液を除去し； （Ｃ）上記のようにして得られた胎盤の水気を切り、拭
き取りで乾燥し、少なくとも−１０℃で凍結させ； （Ｄ）上記のように凍結した胎盤を凍結状態のまま小片
とし、直径５mmを越える粒子が残存しないように、好ま
しくは直径３mmを越える粒子が残存しないように、どろ
どろにつぶし; （Ｅ）上記のようにどろどろにつぶした塊を必要により
食塩を含んでもよい冷水と混合して懸濁液とし； （Ｆ）上記の懸濁液を少なくとも１５分攪拌し、次いで
約＋４℃で、例えば約１時間静置し； （Ｇ）生理的濃度を得るために、固形の食塩を、例えば
８．５ｇ〜９．０ｇ／kg水で添加し； （Ｈ）上記のようにして得られた懸濁液を、＋１５℃以
下、特に＋１０℃以下で、適当な時間、好ましくは約３
０分間攪拌し、次いで約＋４℃で適当な時間、好ましく
は約４時間静置し； （Ｉ）上記の懸濁液のｐＨ値を測定し、そのｐＨを酸
性、特に約５．３に、好ましくは乳酸を添加して調整
し； （Ｊ）上記のように酸性にした懸濁液を、適当な時間、
例えば１５時間、約４℃で保存し； （Ｋ）上記の保存した懸濁液を遠心し、上清を集め； （Ｌ）上記のように集められた上清を濾過し、得られた
透明な濾液を酸性、特にｐＨ５．４に、好ましくは乳酸
を添加して調整し、前記酸性に調整した濾液を濾過し； （Ｍ）上記のようにして得られた濾液を、好ましくは約
６０℃で少なくとも１４時間滅菌し；及び （Ｎ）上記の滅菌された透明でない濾液を遠心し、上清
を集める。
／または治療活性を有し、製剤及び／または化粧品に使
用でき、以下のステップにより得ることができる抽出物
である： （Ａ）ヒトまたは動物由来の胎盤から絨毛膜、腱、血液
凝集塊および壊死した組織を除去し； （Ｂ）上記のようにして得られた胎盤組織から、加圧
下、特に手による加圧によって血液を除去し； （Ｃ）上記のようにして得られた胎盤の水気を切り、拭
き取りで乾燥し、少なくとも−１０℃で凍結させ； （Ｄ）上記のように凍結した胎盤を凍結状態のまま小片
とし、直径５mmを越える粒子が残存しないように、好ま
しくは直径３mmを越える粒子が残存しないように、どろ
どろにつぶし; （Ｅ）上記のようにどろどろにつぶした塊を必要により
食塩を含んでもよい冷水と混合して懸濁液とし； （Ｆ）上記の懸濁液を少なくとも１５分攪拌し、次いで
約＋４℃で、例えば約１時間静置し； （Ｇ）生理的濃度を得るために、固形の食塩を、例えば
８．５ｇ〜９．０ｇ／kg水で添加し； （Ｈ）上記のようにして得られた懸濁液を、＋１５℃以
下、特に＋１０℃以下で、適当な時間、好ましくは約３
０分間攪拌し、次いで約＋４℃で適当な時間、好ましく
は約４時間静置し； （Ｉ）上記の懸濁液のｐＨ値を測定し、そのｐＨを酸
性、特に約５．３に、好ましくは乳酸を添加して調整
し； （Ｊ）上記のように酸性にした懸濁液を、適当な時間、
例えば１５時間、約４℃で保存し； （Ｋ）上記の保存した懸濁液を遠心し、上清を集め； （Ｌ）上記のように集められた上清を濾過し、得られた
透明な濾液を酸性、特にｐＨ５．４に、好ましくは乳酸
を添加して調整し、前記酸性に調整した濾液を濾過し； （Ｍ）上記のようにして得られた濾液を、好ましくは約
６０℃で少なくとも１４時間滅菌し；及び （Ｎ）上記の滅菌された透明でない濾液を遠心し、上清
を集める。
【０００５】また、本発明の抽出物は、上記ステップ
（Ｎ）の終わりで得られた滅菌濾液を、所望の分子量を
有する化合物を除去するため、あるいは得るために、少
なくとも１回、限外濾過又はゲル濾過して得ることがで
きることを特徴とする。さらに、本発明の抽出物は、以
下のステップをいずれかの順序で行うことによって得る
ことができることを特徴とする： （Ｏ）前記滅菌濾液を、３０，０００未満の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップと； （Ｐ）前記滅菌濾液を、３００，０００超の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップ。
（Ｎ）の終わりで得られた滅菌濾液を、所望の分子量を
有する化合物を除去するため、あるいは得るために、少
なくとも１回、限外濾過又はゲル濾過して得ることがで
きることを特徴とする。さらに、本発明の抽出物は、以
下のステップをいずれかの順序で行うことによって得る
ことができることを特徴とする： （Ｏ）前記滅菌濾液を、３０，０００未満の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップと； （Ｐ）前記滅菌濾液を、３００，０００超の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップ。
【０００６】さらに本発明の抽出物は、上記ステップ
（Ｌ）、（Ｎ）、（Ｏ）及び（Ｐ）の１つまたは複数を
行った後、さらに濾過によって各濾液を滅菌することに
より得ることができることを特徴とする。また、本発明
の抽出物は、上記ステップ（Ｇ）の後、上記ステップ
（Ｈ）の前に、有機金属の水溶液、例えば酢酸銅（Ｉ
Ｉ）（Cu( OAc)2)水溶液を添加して得ることが好まし
い。上記酢酸銅水溶液の濃度は、好ましくは０．１％溶
液であり、水１kgにつきCu(OAc)2 １．５２ｇとなる量
を添加することが好ましい。本発明の抽出物は、前記ス
テップ（Ｌ）の後濾過により前記水溶液を濾過滅菌し、
上記ステップ（Ｍ）の前に、前記得られた滅菌濾液を、
適当な温度で適当な期間インキュベートすることにより
得ることができることを特徴とする。約＋３５℃〜＋４
５℃でインキュベートすることが好ましく、特に、＋３
９℃で４〜６日間インュベートすることが好ましい。
（Ｌ）、（Ｎ）、（Ｏ）及び（Ｐ）の１つまたは複数を
行った後、さらに濾過によって各濾液を滅菌することに
より得ることができることを特徴とする。また、本発明
の抽出物は、上記ステップ（Ｇ）の後、上記ステップ
（Ｈ）の前に、有機金属の水溶液、例えば酢酸銅（Ｉ
Ｉ）（Cu( OAc)2)水溶液を添加して得ることが好まし
い。上記酢酸銅水溶液の濃度は、好ましくは０．１％溶
液であり、水１kgにつきCu(OAc)2 １．５２ｇとなる量
を添加することが好ましい。本発明の抽出物は、前記ス
テップ（Ｌ）の後濾過により前記水溶液を濾過滅菌し、
上記ステップ（Ｍ）の前に、前記得られた滅菌濾液を、
適当な温度で適当な期間インキュベートすることにより
得ることができることを特徴とする。約＋３５℃〜＋４
５℃でインキュベートすることが好ましく、特に、＋３
９℃で４〜６日間インュベートすることが好ましい。
【０００７】本発明の抽出物は、上記ステップ（Ｎ）の
後得られた溶液を酸性にし、前記酸性溶液を適当な時間
インキュベートし、その後、前記インキュベートした酸
性溶液のｐＨを測定し、その後ｐＨを５．０〜８．０に
調整して得ることを特徴とする。ここで、上記ステップ
（Ｎ）の後得られた溶液を酸性にするには、塩酸を用い
ることが好ましく、特に好ましくは塩酸水溶液であり、
上記溶液のｐＨを、好ましくは１．０に調整し、１５〜
２４時間インキュベートすることが好ましい。上記のイ
ンキュベートした酸性溶液のｐＨは、７．０に調整する
ことが好ましい。
後得られた溶液を酸性にし、前記酸性溶液を適当な時間
インキュベートし、その後、前記インキュベートした酸
性溶液のｐＨを測定し、その後ｐＨを５．０〜８．０に
調整して得ることを特徴とする。ここで、上記ステップ
（Ｎ）の後得られた溶液を酸性にするには、塩酸を用い
ることが好ましく、特に好ましくは塩酸水溶液であり、
上記溶液のｐＨを、好ましくは１．０に調整し、１５〜
２４時間インキュベートすることが好ましい。上記のイ
ンキュベートした酸性溶液のｐＨは、７．０に調整する
ことが好ましい。
【０００８】本発明の第二の態様は、生物学的活性及び
／または治療活性を有し、製剤及び／または化粧品に使
用でき、上記のステップ（Ａ）〜（Ｎ）を行う本発明第
一の態様の抽出物の製造方法である。本発明の製造方法
は、上記ステップ（Ｎ）の終わりで得られた滅菌濾液
を、所望の分子量を有する化合物を除去するまたは得る
ために、少なくとも１回、限外濾過又はゲル濾過するこ
とを特徴とする。
／または治療活性を有し、製剤及び／または化粧品に使
用でき、上記のステップ（Ａ）〜（Ｎ）を行う本発明第
一の態様の抽出物の製造方法である。本発明の製造方法
は、上記ステップ（Ｎ）の終わりで得られた滅菌濾液
を、所望の分子量を有する化合物を除去するまたは得る
ために、少なくとも１回、限外濾過又はゲル濾過するこ
とを特徴とする。
【０００９】また、本発明の製造方法は、以下のステッ
プをいずれかの順序で行うことを特徴とする： （Ｏ）前記滅菌濾液を、３０，０００未満の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップと； （Ｐ）前記滅菌濾液を、３００，０００超の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップ。
プをいずれかの順序で行うことを特徴とする： （Ｏ）前記滅菌濾液を、３０，０００未満の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップと； （Ｐ）前記滅菌濾液を、３００，０００超の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップ。
【００１０】さらに、本発明の製造方法は、上記各ステ
ップ（Ｌ）、（Ｎ）、（Ｏ）及び（Ｐ）の１つまたは複
数を行った後、さらに濾過よって各濾液の滅菌を行うこ
とを特徴とする。本発明の製造方法は、上記ステップ
（Ｇ）の後、上記ステップ（Ｈ）の前に、有機金属の水
溶液を添加することが好ましい。有機金属の水溶液とし
ては、酢酸銅（ＩＩ）（Cu( OAc)2)水溶液が好ましく、
０．１％水溶液であることがさらに好ましい。好ましい
添加量は、水１kgにつきCu(OAc)2 １．５２ｇとなる量
である。
ップ（Ｌ）、（Ｎ）、（Ｏ）及び（Ｐ）の１つまたは複
数を行った後、さらに濾過よって各濾液の滅菌を行うこ
とを特徴とする。本発明の製造方法は、上記ステップ
（Ｇ）の後、上記ステップ（Ｈ）の前に、有機金属の水
溶液を添加することが好ましい。有機金属の水溶液とし
ては、酢酸銅（ＩＩ）（Cu( OAc)2)水溶液が好ましく、
０．１％水溶液であることがさらに好ましい。好ましい
添加量は、水１kgにつきCu(OAc)2 １．５２ｇとなる量
である。
【００１１】本発明の製造方法は、上記ステップ（Ｌ）
の後濾過滅菌を行い、上記ステップ（Ｍ）の前に上記滅
菌濾液を、適当な温度で適当な時間インキュベートする
ことが好ましい。インキュベート温度は、約＋３５℃〜
＋４５℃が好ましく、特に好ましくは＋３９℃であり、
インキュベート時間は４〜６日間であることが好まし
い。本発明の製造方法は、上記ステップ（Ｎ）の後得ら
れた溶液を酸性にし、適当な時間インキュベートした
後、このインキュベートした酸性溶液のｐＨを測定し、
ｐＨを５．０〜８．０に調整することを特徴とする。上
記ステップ（Ｎ）の後得られた溶液を酸性にするには、
塩酸を用いることが好ましく、塩酸水溶液を用いること
が特に好ましく、ｐＨを１．０に調整し、１５〜２４時
間インキュベートすることが好ましい。その後、前記イ
ンキュベートした酸性溶液のｐＨを測定し、ｐＨを好ま
しくは７．０に調整する。
の後濾過滅菌を行い、上記ステップ（Ｍ）の前に上記滅
菌濾液を、適当な温度で適当な時間インキュベートする
ことが好ましい。インキュベート温度は、約＋３５℃〜
＋４５℃が好ましく、特に好ましくは＋３９℃であり、
インキュベート時間は４〜６日間であることが好まし
い。本発明の製造方法は、上記ステップ（Ｎ）の後得ら
れた溶液を酸性にし、適当な時間インキュベートした
後、このインキュベートした酸性溶液のｐＨを測定し、
ｐＨを５．０〜８．０に調整することを特徴とする。上
記ステップ（Ｎ）の後得られた溶液を酸性にするには、
塩酸を用いることが好ましく、塩酸水溶液を用いること
が特に好ましく、ｐＨを１．０に調整し、１５〜２４時
間インキュベートすることが好ましい。その後、前記イ
ンキュベートした酸性溶液のｐＨを測定し、ｐＨを好ま
しくは７．０に調整する。
【００１２】本発明の第三の態様は、上記のようにして
得られた抽出物を、少なくとも１つの活性成分として含
む、上皮再形成及び／または神経障害の治療のための医
薬組成物である。本発明の医薬組成物は、注射剤、滅菌
溶液、または、溶液、軟膏、クリーム、ジェル、膣坐剤
及び坐剤等の局所投与用の剤形すべてを含み、特に点眼
用溶液であることが好ましい。
得られた抽出物を、少なくとも１つの活性成分として含
む、上皮再形成及び／または神経障害の治療のための医
薬組成物である。本発明の医薬組成物は、注射剤、滅菌
溶液、または、溶液、軟膏、クリーム、ジェル、膣坐剤
及び坐剤等の局所投与用の剤形すべてを含み、特に点眼
用溶液であることが好ましい。
【００１３】本発明の第四の態様は、上皮再形成用医薬
組成物の製造のための本発明第一の態様の抽出物の使用
である。本発明の第五の態様は、神経障害治療用医薬組
成物の製造のための本発明第一の態様の抽出物の使用で
ある。
組成物の製造のための本発明第一の態様の抽出物の使用
である。本発明の第五の態様は、神経障害治療用医薬組
成物の製造のための本発明第一の態様の抽出物の使用で
ある。
【００１４】本発明の第六の態様は、上皮再形成または
神経障害活性治療活性を有する胎盤抽出物である。本発
明の第七の態様は、上記抽出物の分子量が３０，０００
〜３００，０００である本発明の第六の態様の抽出物で
ある。
神経障害活性治療活性を有する胎盤抽出物である。本発
明の第七の態様は、上記抽出物の分子量が３０，０００
〜３００，０００である本発明の第六の態様の抽出物で
ある。
【００１５】
【好適な実施態様の説明】以下の部分において、本発明
を詳細に説明する。抽出用の胎盤は、ヒト由来のもので
あっても動物由来のものであってもよい。原則的とし
て、胎盤は、分娩あるいは胎盤が中絶等の時に切り離さ
れた後、速やかに処理する。しかし、胎盤は輸送経路が
限られているために、限定された方法においてのみこう
した処理が可能である。
を詳細に説明する。抽出用の胎盤は、ヒト由来のもので
あっても動物由来のものであってもよい。原則的とし
て、胎盤は、分娩あるいは胎盤が中絶等の時に切り離さ
れた後、速やかに処理する。しかし、胎盤は輸送経路が
限られているために、限定された方法においてのみこう
した処理が可能である。
【００１６】実用的な理由から、ヒト胎盤は、病院では
低温冷凍庫（ディープフリーザー）のボックス中で保存
し、ディープフリーザーの温度は−１０℃超にならない
ように注意する。使用されるディープフリーザーにより
異なるが、保存温度は、通常−１８〜−２５℃である。
より低温で保存することも可能であるが、経済的でな
い。材料として、危険因子（リスクファクタ−ズ）のな
いヒト胎盤が好ましい。上記胎盤は、摘出より３−４ヵ
月が経過する前に処理することが好ましい。
低温冷凍庫（ディープフリーザー）のボックス中で保存
し、ディープフリーザーの温度は−１０℃超にならない
ように注意する。使用されるディープフリーザーにより
異なるが、保存温度は、通常−１８〜−２５℃である。
より低温で保存することも可能であるが、経済的でな
い。材料として、危険因子（リスクファクタ−ズ）のな
いヒト胎盤が好ましい。上記胎盤は、摘出より３−４ヵ
月が経過する前に処理することが好ましい。
【００１７】本発明の抽出物の調製のために、上記に示
す温度で凍結した胎盤を、無菌的（ＵＶ照射下）に雰囲
気温度に戻す。凍結された胎盤の量によって、解凍時間
は異なるが、解凍は２日間までが限界である。解凍は、
好ましくは、胎盤は戸棚中にてプラスチックバット中で
行う。衛生条件をコントロールして行うことが好まし
い。こうして、汚染されていない（コンタミしてない）
材料を使用することができ、作業空間は清潔に保たなけ
ればならない。上記の胎盤は、加熱あるいはマイクロ波
によって解凍してもよい。解凍した複数の胎盤から、絨
毛膜、腱、血液の凝集塊および壊死した組織を除去す
る。好ましくは、こうした部分は、小刀または外科用メ
スを用いて手で取り除く。上記のようにして得られた胎
盤組織から、圧力をかけて血液を除去する。血液の除去
は、手による加圧あるいは遠心分離によって行うことが
好ましい。
す温度で凍結した胎盤を、無菌的（ＵＶ照射下）に雰囲
気温度に戻す。凍結された胎盤の量によって、解凍時間
は異なるが、解凍は２日間までが限界である。解凍は、
好ましくは、胎盤は戸棚中にてプラスチックバット中で
行う。衛生条件をコントロールして行うことが好まし
い。こうして、汚染されていない（コンタミしてない）
材料を使用することができ、作業空間は清潔に保たなけ
ればならない。上記の胎盤は、加熱あるいはマイクロ波
によって解凍してもよい。解凍した複数の胎盤から、絨
毛膜、腱、血液の凝集塊および壊死した組織を除去す
る。好ましくは、こうした部分は、小刀または外科用メ
スを用いて手で取り除く。上記のようにして得られた胎
盤組織から、圧力をかけて血液を除去する。血液の除去
は、手による加圧あるいは遠心分離によって行うことが
好ましい。
【００１８】このようにして得られた胎盤組織は、排液
し必要により乾燥する。乾燥は、例えば、スポンジ、布
あるいは紙を用いて行い、時にはまだ残留している水分
及び血液を除去する。上記のように排液し乾燥した胎盤
組織を、ディープフリーザーの温度が−１０℃超になら
ないように注意して、再度凍結する。使用するディープ
フリーザーにより保存温度は異なるが、約−１８〜約−
２５℃である。さらに低温で保存することも可能である
が、経済的でない。また、液体窒素を用いたショック凍
結も可能である。この時点において、処理を数日間ない
し数カ月間、例えば、３−４ヵ月間中断してもよい。
し必要により乾燥する。乾燥は、例えば、スポンジ、布
あるいは紙を用いて行い、時にはまだ残留している水分
及び血液を除去する。上記のように排液し乾燥した胎盤
組織を、ディープフリーザーの温度が−１０℃超になら
ないように注意して、再度凍結する。使用するディープ
フリーザーにより保存温度は異なるが、約−１８〜約−
２５℃である。さらに低温で保存することも可能である
が、経済的でない。また、液体窒素を用いたショック凍
結も可能である。この時点において、処理を数日間ない
し数カ月間、例えば、３−４ヵ月間中断してもよい。
【００１９】凍結した胎盤は、凍結状態のまま、次の工
程において小片とした。これらの小片をどろどろのピュ
ーレ状になるまでそれぞれ破砕した。ここで、５ｍｍ超
の径を有する粒子が残存しないことが好ましく、３ｍｍ
超の径の粒子がないことがより好ましい。凍結しない状
態で小片とすることも可能である。このどろどろの状態
のものを冷水と混合し、懸濁液とした。上記冷水の温度
は、通常、約＋１〜約＋１０℃であることが好ましく、
約＋４〜約＋１０℃であることが特に好ましい。蒸留
水、または脱イオン水を使用することが好ましい。上記
のようにして得られた懸濁液を、少なくとも１５分間機
械的に攪拌する。マイクロ波を用いて、追加処理を行う
ことも可能である。
程において小片とした。これらの小片をどろどろのピュ
ーレ状になるまでそれぞれ破砕した。ここで、５ｍｍ超
の径を有する粒子が残存しないことが好ましく、３ｍｍ
超の径の粒子がないことがより好ましい。凍結しない状
態で小片とすることも可能である。このどろどろの状態
のものを冷水と混合し、懸濁液とした。上記冷水の温度
は、通常、約＋１〜約＋１０℃であることが好ましく、
約＋４〜約＋１０℃であることが特に好ましい。蒸留
水、または脱イオン水を使用することが好ましい。上記
のようにして得られた懸濁液を、少なくとも１５分間機
械的に攪拌する。マイクロ波を用いて、追加処理を行う
ことも可能である。
【００２０】次いで、冷蔵庫中またはクーリングチャン
バー内にて約４℃で、例えば１時間静置する。使用する
冷蔵庫またはクーリングチャンバーによって、上記静置
温度は幾分上下してもよいが、例えば４±１〜２℃であ
る。冷却した懸濁液をクーリングチャンバーから移動
し、室温で固形塩化ナトリウムを生理的濃度、すなわち
８．５〜９．０ｇ／kg水となるように、機械的に攪拌し
つつ添加する。有機金属の水溶液、例えば、酢酸銅（Ｉ
Ｉ）（Cu(OAc)2）の０．１％水溶液を添加してもよい。
添加量は、水１kgにつき酢酸銅（ＩＩ）が１．５２ｇと
なるようにすることが好ましい。塩化ナトリウム、およ
び必要により酢酸銅（ＩＩ）水溶液と混合した後、冷却
懸濁液を室温で数分から数時間の間機械的に攪拌する。
攪拌時間は、例えば、３０分である。マイクロ波を用い
て追加処理を行ってもよい。攪拌中は、上記懸濁液の温
度が＋１５℃、特に＋１０℃を越えないように注意す
る。温度をこの範囲内とするために、必要により懸濁液
を冷却しなければならない。
バー内にて約４℃で、例えば１時間静置する。使用する
冷蔵庫またはクーリングチャンバーによって、上記静置
温度は幾分上下してもよいが、例えば４±１〜２℃であ
る。冷却した懸濁液をクーリングチャンバーから移動
し、室温で固形塩化ナトリウムを生理的濃度、すなわち
８．５〜９．０ｇ／kg水となるように、機械的に攪拌し
つつ添加する。有機金属の水溶液、例えば、酢酸銅（Ｉ
Ｉ）（Cu(OAc)2）の０．１％水溶液を添加してもよい。
添加量は、水１kgにつき酢酸銅（ＩＩ）が１．５２ｇと
なるようにすることが好ましい。塩化ナトリウム、およ
び必要により酢酸銅（ＩＩ）水溶液と混合した後、冷却
懸濁液を室温で数分から数時間の間機械的に攪拌する。
攪拌時間は、例えば、３０分である。マイクロ波を用い
て追加処理を行ってもよい。攪拌中は、上記懸濁液の温
度が＋１５℃、特に＋１０℃を越えないように注意す
る。温度をこの範囲内とするために、必要により懸濁液
を冷却しなければならない。
【００２１】次に、上記懸濁液を、再度冷蔵庫あるいは
クーリングチャンバー内にて、数時間、例えば約４℃で
約４時間静置する。使用する冷蔵庫またはクーリングチ
ャンバーにより上記静置温度は幾分上下してもよいが、
例えば４±１〜２℃である。その後、冷却した懸濁液を
クーリングチャンバーから出し、室温にて機械的に攪拌
しながらｐＨを測定した。一般的には、上記懸濁液のｐ
Ｈは約６．６〜６．９の範囲内にある。この懸濁液をそ
の後酸を用いて酸性にするが、ｐＨは約５．３とするこ
とが好ましい。酸性にするには、乳酸を用いることが好
ましい。
クーリングチャンバー内にて、数時間、例えば約４℃で
約４時間静置する。使用する冷蔵庫またはクーリングチ
ャンバーにより上記静置温度は幾分上下してもよいが、
例えば４±１〜２℃である。その後、冷却した懸濁液を
クーリングチャンバーから出し、室温にて機械的に攪拌
しながらｐＨを測定した。一般的には、上記懸濁液のｐ
Ｈは約６．６〜６．９の範囲内にある。この懸濁液をそ
の後酸を用いて酸性にするが、ｐＨは約５．３とするこ
とが好ましい。酸性にするには、乳酸を用いることが好
ましい。
【００２２】酸性にした上記懸濁液を、冷蔵庫あるいは
クーリングチャンバー内にて、所望の時間、例えば約４
℃で約１５時間静置する。上記静置温度の許容範囲は、
上述の通りである。この時点で、再度抽出処理を数日間
中断してもよい。その後、上記懸濁液を遠心処理し、上
清を集める。この上清を清澄にするために、濾過を行
う。濾過は、同一あるいは異なる多孔度を有する一また
は複数のフィルタを用いて行う。この濾過はまた、加圧
下あるいは減圧下で行ってもよい。上記のようにして得
られた濾液のｐＨは、通常、約５．７〜約６．１であ
る。この濾液は酸を用いて酸性にするが、そのｐＨは、
約５．４であることが好ましい。この濾液を酸性にする
には、乳酸を添加することが好ましい。この濾液を酸性
にする間に、通常沈殿が生じるため、この沈殿を同一あ
るいは異なる多孔度を有する一または複数のフィルタを
用いて濾過する。この濾過はまた、加圧下あるいは減圧
下で行ってもよい。
クーリングチャンバー内にて、所望の時間、例えば約４
℃で約１５時間静置する。上記静置温度の許容範囲は、
上述の通りである。この時点で、再度抽出処理を数日間
中断してもよい。その後、上記懸濁液を遠心処理し、上
清を集める。この上清を清澄にするために、濾過を行
う。濾過は、同一あるいは異なる多孔度を有する一また
は複数のフィルタを用いて行う。この濾過はまた、加圧
下あるいは減圧下で行ってもよい。上記のようにして得
られた濾液のｐＨは、通常、約５．７〜約６．１であ
る。この濾液は酸を用いて酸性にするが、そのｐＨは、
約５．４であることが好ましい。この濾液を酸性にする
には、乳酸を添加することが好ましい。この濾液を酸性
にする間に、通常沈殿が生じるため、この沈殿を同一あ
るいは異なる多孔度を有する一または複数のフィルタを
用いて濾過する。この濾過はまた、加圧下あるいは減圧
下で行ってもよい。
【００２３】上記の様にして得られた濾液を、濾過滅菌
した。この滅菌に使用されるすべてのものは、予め滅菌
することが必要であり、滅菌は、例えば１２７℃で３０
分間蒸気滅菌器中で行う。また、上記濾過滅菌は、無菌
室内において許容される条件の下で行わなければならな
い。上記のようにして得られた滅菌濾液を、適当な容器
に入れ、保温（インキュベーション）した。上記インキ
ュベーションは、約＋３５℃〜約＋４５℃の温度で４〜
６日間行うことが好ましく、特に＋３９℃で行うことが
好ましい。試料を適宜採取して、例えばチオグリコール
培地等を用いて、無菌試験を行ってもよい。インキュベ
ートした溶液を、必要により低温滅菌する。滅菌は、約
＋６０℃の温度で、少なくとも１４時間行うことが好ま
しい。この滅菌操作により、清澄でない溶液が得られ
る。ここで生じた沈殿を上記の遠心および必要により濾
過滅菌によって除去する。
した。この滅菌に使用されるすべてのものは、予め滅菌
することが必要であり、滅菌は、例えば１２７℃で３０
分間蒸気滅菌器中で行う。また、上記濾過滅菌は、無菌
室内において許容される条件の下で行わなければならな
い。上記のようにして得られた滅菌濾液を、適当な容器
に入れ、保温（インキュベーション）した。上記インキ
ュベーションは、約＋３５℃〜約＋４５℃の温度で４〜
６日間行うことが好ましく、特に＋３９℃で行うことが
好ましい。試料を適宜採取して、例えばチオグリコール
培地等を用いて、無菌試験を行ってもよい。インキュベ
ートした溶液を、必要により低温滅菌する。滅菌は、約
＋６０℃の温度で、少なくとも１４時間行うことが好ま
しい。この滅菌操作により、清澄でない溶液が得られ
る。ここで生じた沈殿を上記の遠心および必要により濾
過滅菌によって除去する。
【００２４】この濾液を適当な濃度に調製し、少なくと
も１回、通常の限外濾過を行って、所望の分子量の化合
物を除去し、あるいは得る。この上記濾液を、分子量３
０，０００未満の分子量の化合物を除去するために限外
濾過する。以下の記載では、これを限外濾過Ｉとした。
これら除去された化合物は別々に集められる。
も１回、通常の限外濾過を行って、所望の分子量の化合
物を除去し、あるいは得る。この上記濾液を、分子量３
０，０００未満の分子量の化合物を除去するために限外
濾過する。以下の記載では、これを限外濾過Ｉとした。
これら除去された化合物は別々に集められる。
【００２５】上記のようにして得られた溶液を、塩酸、
特に塩酸水溶液を用いて酸性にする。ｐＨは、例えば
１．０以下とすることが好ましい。酸性にした上記溶液
を、所望の時間、例えば１５〜２４時間程度インキュベ
ートする。次いで、上記のようにして得られた溶液のｐ
Ｈを、５．０〜８．０の範囲、好ましくは７．０に調整
する。この混合液を、分子量３００，０００超の分子量
の化合物を除去する目的で、適当な濃度に調製し、さら
に通常の限外濾過を行う。以下の記載では、これを限外
濾過ＩＩという。これら除去された化合物は別々に集め
られる。最初に限外濾過ＩＩを行い、次に限外濾過Ｉを
行うことも可能である。ｐＨ値を特定の値に調整するこ
とばかりでなく限外濾過Ｉ及びＩＩを行う順序は、最終
産物には影響しない。
特に塩酸水溶液を用いて酸性にする。ｐＨは、例えば
１．０以下とすることが好ましい。酸性にした上記溶液
を、所望の時間、例えば１５〜２４時間程度インキュベ
ートする。次いで、上記のようにして得られた溶液のｐ
Ｈを、５．０〜８．０の範囲、好ましくは７．０に調整
する。この混合液を、分子量３００，０００超の分子量
の化合物を除去する目的で、適当な濃度に調製し、さら
に通常の限外濾過を行う。以下の記載では、これを限外
濾過ＩＩという。これら除去された化合物は別々に集め
られる。最初に限外濾過ＩＩを行い、次に限外濾過Ｉを
行うことも可能である。ｐＨ値を特定の値に調整するこ
とばかりでなく限外濾過Ｉ及びＩＩを行う順序は、最終
産物には影響しない。
【００２６】通常の限外濾過を行って、分子量３００，
０００超の化合物を除去し、これらの化合物を別々に集
めることもできる。こうして得られる濾液を、第２回目
の通常の限外濾過（１００−Ｋメンブラン）処理するこ
とができる。メンブラン上には、分子量１００，０００
〜３００，０００の化合物の濃縮溶液が残留する。上記
のようにして得られる濾液を、分子量５，０００〜１０
０，０００の化合物を除去し、これらを別々に集めるた
めに、第３回目の限外濾過（５−Ｋメンブラン）を行
う。最後の操作として、最後に得られる濾液（分子量０
〜５，０００）を、特定の産物を得るために第２回目の
限外濾過の残留液（分子量１００，０００〜３００，０
００）と所望の比率で混合する。限外濾過によって除去
されたすべての化合物は別々に集め、さらに他の目的に
使用し得る。上記限外濾過の代わりに、ゲル濾過を行っ
てもよい。また、ｐＨ調整は、塩酸等の酸、あるいはＮ
ａＯＨ等の塩基を用いて行ってもよい。
０００超の化合物を除去し、これらの化合物を別々に集
めることもできる。こうして得られる濾液を、第２回目
の通常の限外濾過（１００−Ｋメンブラン）処理するこ
とができる。メンブラン上には、分子量１００，０００
〜３００，０００の化合物の濃縮溶液が残留する。上記
のようにして得られる濾液を、分子量５，０００〜１０
０，０００の化合物を除去し、これらを別々に集めるた
めに、第３回目の限外濾過（５−Ｋメンブラン）を行
う。最後の操作として、最後に得られる濾液（分子量０
〜５，０００）を、特定の産物を得るために第２回目の
限外濾過の残留液（分子量１００，０００〜３００，０
００）と所望の比率で混合する。限外濾過によって除去
されたすべての化合物は別々に集め、さらに他の目的に
使用し得る。上記限外濾過の代わりに、ゲル濾過を行っ
てもよい。また、ｐＨ調整は、塩酸等の酸、あるいはＮ
ａＯＨ等の塩基を用いて行ってもよい。
【００２７】極めて驚くべきことに、この方法のみを用
いて、生物学的活性及び／または治療活性を有する本発
明の抽出物を得た。所望により、これらの抽出物は、凍
結乾燥してもよい。これらの本発明の抽出物は、生物学
的活性及び／または治療活性を有する薬剤を調製するた
めに使用してもよい。上記のようにして得られた抽出物
は薬剤の活性成分の一つとして使用でき、特に、上皮再
形成、あるいは神経障害の治療のために使用することが
できる。
いて、生物学的活性及び／または治療活性を有する本発
明の抽出物を得た。所望により、これらの抽出物は、凍
結乾燥してもよい。これらの本発明の抽出物は、生物学
的活性及び／または治療活性を有する薬剤を調製するた
めに使用してもよい。上記のようにして得られた抽出物
は薬剤の活性成分の一つとして使用でき、特に、上皮再
形成、あるいは神経障害の治療のために使用することが
できる。
【００２８】
【実施例】以下の実施例により、本発明を説明するが、
これらによって本発明が限定されるものではない。 （実施例１）凍結ヒト胎盤から、絨毛膜、腱、血液凝集
塊および壊死した組織をナイフで除去した。このように
して得られた胎盤組織を手でもんで、血液を除去した。
上記のようにして脱血した胎盤は、水気を切り、次に紙
を用いて乾燥させた。上記胎盤組織を−１８℃でディー
プフリーザー中で凍結した。以下の部分では、各々明ら
かに別個に行った２バッチの操作を記載した。（）内の
数字は、第２バッチの場合を示した。
これらによって本発明が限定されるものではない。 （実施例１）凍結ヒト胎盤から、絨毛膜、腱、血液凝集
塊および壊死した組織をナイフで除去した。このように
して得られた胎盤組織を手でもんで、血液を除去した。
上記のようにして脱血した胎盤は、水気を切り、次に紙
を用いて乾燥させた。上記胎盤組織を−１８℃でディー
プフリーザー中で凍結した。以下の部分では、各々明ら
かに別個に行った２バッチの操作を記載した。（）内の
数字は、第２バッチの場合を示した。
【００２９】３２．２kg（３３．６kg）の胎盤を、凍結
状態で破砕器中にてどろどろの状態にした。このピュー
レ状のものに、＋４℃の水１９３kg（１９３kg）を加
え、懸濁液とした。この懸濁液を、速やかに、室温で３
０分間、機械的に攪拌した。攪拌には、ポリトロン キ
ネマチック 高周波攪拌機（POLYTRON kinematic high
frequencystirrer ）を使用した。回転速度は、通常
の、毎分２，７００〜３，０００で使用した。この混合
液をクーリングチャンバー中にて、４℃で１時間静置し
た。次いで、室温で攪拌しながら１．６４０kg（１．６
４０kg）の塩化ナトリウムと２９２ml（２９２ml）の
０．１％Ｃｕ（ＯＡｃ）2 水溶液を添加した。塩化ナト
リウム及び酢酸銅（ＩＩ）を含むこの懸濁液をその後３
０分間攪拌した。懸濁液の温度が１０℃を越えないよう
に注意した。次に、この懸濁液を、４℃のクーリングチ
ャンバー中にて、４時間静置した。この後、測定したｐ
Ｈ値は、６．８０（６．８５）であった。この懸濁液
に、２２０ml（１７３ml）の乳酸（純度８８−９２％）
を添加し、ｐＨを５．３（５．３）に調整した。酸性に
した懸濁液をクーリングチャンバー内にて４℃で一夜保
存した。翌日、この懸濁液を遠心し、上清を集め濾過し
た。
状態で破砕器中にてどろどろの状態にした。このピュー
レ状のものに、＋４℃の水１９３kg（１９３kg）を加
え、懸濁液とした。この懸濁液を、速やかに、室温で３
０分間、機械的に攪拌した。攪拌には、ポリトロン キ
ネマチック 高周波攪拌機（POLYTRON kinematic high
frequencystirrer ）を使用した。回転速度は、通常
の、毎分２，７００〜３，０００で使用した。この混合
液をクーリングチャンバー中にて、４℃で１時間静置し
た。次いで、室温で攪拌しながら１．６４０kg（１．６
４０kg）の塩化ナトリウムと２９２ml（２９２ml）の
０．１％Ｃｕ（ＯＡｃ）2 水溶液を添加した。塩化ナト
リウム及び酢酸銅（ＩＩ）を含むこの懸濁液をその後３
０分間攪拌した。懸濁液の温度が１０℃を越えないよう
に注意した。次に、この懸濁液を、４℃のクーリングチ
ャンバー中にて、４時間静置した。この後、測定したｐ
Ｈ値は、６．８０（６．８５）であった。この懸濁液
に、２２０ml（１７３ml）の乳酸（純度８８−９２％）
を添加し、ｐＨを５．３（５．３）に調整した。酸性に
した懸濁液をクーリングチャンバー内にて４℃で一夜保
存した。翌日、この懸濁液を遠心し、上清を集め濾過し
た。
【００３０】１８３kg（１８８kg）のｐＨ５．７０
（５．７０）の清澄濾液を得た。さらに２０ml（２８m
l）の乳酸（純度８８−９２％）を添加し、ｐＨを５．
４（５．４）に調整した。この酸性化処理の間に再度沈
殿が生じるため、さらに濾過を行ってこの沈殿を除去し
た。この濾液をその後、濾過によって滅菌した（「フィ
ブラ フィックス」−フィルタ（"Fibra Fix"-filter）
ＡＦ １３０及びＡＦ １４０、フィルトロン−ベルク
（Filtron-werk AG ）社製、サンガレン、スイス国、と
フィルターカプセルスーパーＤＦＣ（filter capsule S
UPOR DFC）０．２μm 、ゲルマン サイエンス オブ
スキャン（Gelman Science of Skan AG ）社製、バーゼ
ル、スイス国とを使用した。）この滅菌濾液を１０L の
フラスコに満たし、＋３９℃で１４２時間２０分（１４
４時間１５分）インキュベートした。
（５．７０）の清澄濾液を得た。さらに２０ml（２８m
l）の乳酸（純度８８−９２％）を添加し、ｐＨを５．
４（５．４）に調整した。この酸性化処理の間に再度沈
殿が生じるため、さらに濾過を行ってこの沈殿を除去し
た。この濾液をその後、濾過によって滅菌した（「フィ
ブラ フィックス」−フィルタ（"Fibra Fix"-filter）
ＡＦ １３０及びＡＦ １４０、フィルトロン−ベルク
（Filtron-werk AG ）社製、サンガレン、スイス国、と
フィルターカプセルスーパーＤＦＣ（filter capsule S
UPOR DFC）０．２μm 、ゲルマン サイエンス オブ
スキャン（Gelman Science of Skan AG ）社製、バーゼ
ル、スイス国とを使用した。）この滅菌濾液を１０L の
フラスコに満たし、＋３９℃で１４２時間２０分（１４
４時間１５分）インキュベートした。
【００３１】その後、＋６０℃で２７時間（２７時間）
低温滅菌を行った。この低温滅菌は、この濾液の温度が
フラスコ中で少なくとも１４時間、＋６０℃であるよう
に注意した。低温滅菌後、この濾液をクーリングチャン
バー中にて＋４℃で６日間（５日間）保存した。低温滅
菌され、透明でなくなった溶液を遠心し、２バッチの上
清を集めて、一緒にした。この溶液を濾過滅菌し、合計
３６０kgの濾液を得た（ステップ（Ｎ）終了）。
低温滅菌を行った。この低温滅菌は、この濾液の温度が
フラスコ中で少なくとも１４時間、＋６０℃であるよう
に注意した。低温滅菌後、この濾液をクーリングチャン
バー中にて＋４℃で６日間（５日間）保存した。低温滅
菌され、透明でなくなった溶液を遠心し、２バッチの上
清を集めて、一緒にした。この溶液を濾過滅菌し、合計
３６０kgの濾液を得た（ステップ（Ｎ）終了）。
【００３２】（実施例２）実施例１によって得られた濾
液の治療活性は、創傷治癒の促進を示した。雄のニュー
ジーランド家兎を、シングルケージを用いて一定の明暗
サイクル及び２１℃にて馴化飼育した。家兎の両目の角
膜をガラス管（直径３mm）で切開し、角膜の潰瘍を形成
した。間質を除いた角膜の視覚領域（optic area of th
e cornea）の表面を切開した。最初の試験は、同一の大
きさおよび深さの角膜潰瘍を有する動物のみを使用し、
スリットランプを用いて行った。
液の治療活性は、創傷治癒の促進を示した。雄のニュー
ジーランド家兎を、シングルケージを用いて一定の明暗
サイクル及び２１℃にて馴化飼育した。家兎の両目の角
膜をガラス管（直径３mm）で切開し、角膜の潰瘍を形成
した。間質を除いた角膜の視覚領域（optic area of th
e cornea）の表面を切開した。最初の試験は、同一の大
きさおよび深さの角膜潰瘍を有する動物のみを使用し、
スリットランプを用いて行った。
【００３３】治療前及び治療の期間中連続して、１２時
間毎にすべての動物に対してスリットランプを用いた角
膜の眼科学的試験を行った。各試験に先立って、１％ナ
トリウムフルオレセンを用いた。これらの試験のため
に、コバルトブルー光が使用された。角膜潰瘍の総合的
な治癒を記録した。６匹の家兎を治療群とし、実施例１
で得られた濾液を用いて治療した。６時間ごとに２滴を
点眼した。この治療は、ガラス管を用いた外科的処理を
行った後速やかに開始し、スリットランプを用いた上記
第一の試験を行った。８匹の家兎を対照群とし、プラセ
ボ（生理食塩水溶液）を用いて同様に処理した。治療効
果を、上記２群の角膜潰瘍の総治癒時間の比較より評価
した。結果を表１に示す。
間毎にすべての動物に対してスリットランプを用いた角
膜の眼科学的試験を行った。各試験に先立って、１％ナ
トリウムフルオレセンを用いた。これらの試験のため
に、コバルトブルー光が使用された。角膜潰瘍の総合的
な治癒を記録した。６匹の家兎を治療群とし、実施例１
で得られた濾液を用いて治療した。６時間ごとに２滴を
点眼した。この治療は、ガラス管を用いた外科的処理を
行った後速やかに開始し、スリットランプを用いた上記
第一の試験を行った。８匹の家兎を対照群とし、プラセ
ボ（生理食塩水溶液）を用いて同様に処理した。治療効
果を、上記２群の角膜潰瘍の総治癒時間の比較より評価
した。結果を表１に示す。
【００３４】 表 １ ─────────────────────────────────── 試験後の時間 治癒率（％） （時間） プラセボ投与群 胎盤抽出物投与群 ──────────────────────────────────── ０ ０ ０ １２ ０ １７ ２４ ０ １７ ３６ １３ ６７ ４８ ２５ ８３ ６０ ５０ ８３ ７２ ６３ １００ ８４ ８８ １００ ９６ １００ １００ ────────────────────────────────────
【００３５】上記の数字は、胎盤抽出物を用いた治療で
早期に治癒が始まること、及び治癒も速やかに進行し、
短期間で終了することを示した。
早期に治癒が始まること、及び治癒も速やかに進行し、
短期間で終了することを示した。
【００３６】（実施例３）実施例１で得られた濾液（３
６０kg）を、分子量３０，０００未満の化合物を除去す
るために、限外濾過（３０Ｋ−メンブラン、タイプ「オ
メガ」、エヌエムダブリューエル オブ フィルトロン
テクノロジー社(NMWL of Filtron Technology Co. 、
アメリカ合衆国、を用いた) ）した。約９５重量％の上
記濾液を３０Ｋ−メンブランを通し、濾液と残渣とを別
々に集めた。３０Ｋ−メンブラン上の残渣を１回あたり
１０L の生理食塩水で１２回洗った。洗浄後の残渣は、
最適収量とするために（限外濾過装置を洗って）、約２
０Lの生理食塩水で希釈した。
６０kg）を、分子量３０，０００未満の化合物を除去す
るために、限外濾過（３０Ｋ−メンブラン、タイプ「オ
メガ」、エヌエムダブリューエル オブ フィルトロン
テクノロジー社(NMWL of Filtron Technology Co. 、
アメリカ合衆国、を用いた) ）した。約９５重量％の上
記濾液を３０Ｋ−メンブランを通し、濾液と残渣とを別
々に集めた。３０Ｋ−メンブラン上の残渣を１回あたり
１０L の生理食塩水で１２回洗った。洗浄後の残渣は、
最適収量とするために（限外濾過装置を洗って）、約２
０Lの生理食塩水で希釈した。
【００３７】得られた水溶液（約３６kg）を、７２kgの
滅菌蒸留水で希釈した。この水溶液を、分子量３００，
０００超の化合物を除去するために、限外濾過（３００
Ｋ−メンブラン、タイプ「オープン チャネル」、エヌ
エムダブリューエル オブ フィルトロン テクノロジ
ー社、アメリカ合衆国、を用いた）した。この水溶液の
約９８〜９９重量％を３００Ｋ−メンブランを通し、濾
液と残渣とを別々に集めた。３００Ｋ−メンブラン上の
残渣を、最適収量を得るために、１回あたり１０L の生
理食塩水で４回洗った。
滅菌蒸留水で希釈した。この水溶液を、分子量３００，
０００超の化合物を除去するために、限外濾過（３００
Ｋ−メンブラン、タイプ「オープン チャネル」、エヌ
エムダブリューエル オブ フィルトロン テクノロジ
ー社、アメリカ合衆国、を用いた）した。この水溶液の
約９８〜９９重量％を３００Ｋ−メンブランを通し、濾
液と残渣とを別々に集めた。３００Ｋ−メンブラン上の
残渣を、最適収量を得るために、１回あたり１０L の生
理食塩水で４回洗った。
【００３８】上記のようにして得られた濾液（約１４４
kg）を、濾過滅菌した（「フィブラフィックス」−フィ
ルタ、ＡＦ １３０及びＡＦ １４０、とフィルターカ
プセル スーパーＤＦＣ ０．２μm とを使用し
た。）。滅菌濾液は、２５％塩酸水溶液を添加して、ｐ
Ｈ１．０に調整した。酸性にした水溶液を１５時間、＋
４℃で保存した。その後、５ＮのＮａＯＨを添加してｐ
Ｈを７．０５に調整した。この中和水溶液を上記の方法
の濾過によって滅菌した（ステップ（Ｐ）終了）。
kg）を、濾過滅菌した（「フィブラフィックス」−フィ
ルタ、ＡＦ １３０及びＡＦ １４０、とフィルターカ
プセル スーパーＤＦＣ ０．２μm とを使用し
た。）。滅菌濾液は、２５％塩酸水溶液を添加して、ｐ
Ｈ１．０に調整した。酸性にした水溶液を１５時間、＋
４℃で保存した。その後、５ＮのＮａＯＨを添加してｐ
Ｈを７．０５に調整した。この中和水溶液を上記の方法
の濾過によって滅菌した（ステップ（Ｐ）終了）。
【００３９】この滅菌濾液（画分３０，０００〜３０
０，０００）中のタンパク量、塩化ナトリウムおよび滅
菌蒸留水添加による塩化ナトリウム濃度は表２に示す通
りであった。 表 ２ ────────────────────────────── タンパク量 ： １mg タンパク（総）／１ml 水溶液 塩化ナトリウム濃度： ８．５mg ＮａＣｌ／１ml 水溶液 収量 ：２６０〜３００kg 最終水溶液 ──────────────────────────────
０，０００）中のタンパク量、塩化ナトリウムおよび滅
菌蒸留水添加による塩化ナトリウム濃度は表２に示す通
りであった。 表 ２ ────────────────────────────── タンパク量 ： １mg タンパク（総）／１ml 水溶液 塩化ナトリウム濃度： ８．５mg ＮａＣｌ／１ml 水溶液 収量 ：２６０〜３００kg 最終水溶液 ──────────────────────────────
【００４０】（実施例４）実施例３で得られた濾液の治
療活性は、実施例２に記載した方法と同様の方法で試験
した。表３に示す結果が得られた。
療活性は、実施例２に記載した方法と同様の方法で試験
した。表３に示す結果が得られた。
【００４１】 表 ３ ──────────────────────────────────── 試験後の時間 治癒率（％） （時間） プラセボ投与群 胎盤抽出物投与群 ──────────────────────────────────── ０ ０ ０ ４ ０ ０ ８ ０ ０ １２ ０ １０ １６ １０ ２０ ２０ ４０ ４０ ２４ ５０ ８０ ２８ ５０ ９０ ３２ ６０ １００ ３６ ７０ ４４ ８０ ５２ ９０ ────────────────────────────────────
【００４２】上記の数字は、胎盤抽出物を用いた治療で
早期に治癒が始まること、治癒も速やかに進行し、短期
間で終了したことを示した。
早期に治癒が始まること、治癒も速やかに進行し、短期
間で終了したことを示した。
【００４３】（実施例５）実施例３で得られた上記濾液
（画分３０，０００〜３００，０００）を用いて、末梢
神経の成長を試験した。この目的のために、１群１０匹
のスプラーグ−ダウリーラット（ＳＤラット、１８０〜
２００ｇ）を４群にして通常の条件下（１２時間昼、１
２時間夜）で維持した。水及び餌は、随時十分量与え
た。
（画分３０，０００〜３００，０００）を用いて、末梢
神経の成長を試験した。この目的のために、１群１０匹
のスプラーグ−ダウリーラット（ＳＤラット、１８０〜
２００ｇ）を４群にして通常の条件下（１２時間昼、１
２時間夜）で維持した。水及び餌は、随時十分量与え
た。
【００４４】第１群及び第２群の動物に、ストレプトゾ
トシン（１００mg／体重１kg）を１回静脈内投与した。
１週間後、血中グルコースレベルを毎日測定した。グル
コースレベルが３日間続けて１５０mg／mlを越えたとき
に、ラットが糖尿病になったと判定した。
トシン（１００mg／体重１kg）を１回静脈内投与した。
１週間後、血中グルコースレベルを毎日測定した。グル
コースレベルが３日間続けて１５０mg／mlを越えたとき
に、ラットが糖尿病になったと判定した。
【００４５】第３群及び第４群の動物は、以下のように
処置した：エーテル麻酔下で、右後肢を切開し、右座骨
神経を筋肉から剥がして露出させ、座骨神経節の末端側
から６mm離れた部位を、止血鉗子で３０秒間圧迫した。
その後、切開部を縫合した。第１群及び第３群の動物
に、実施例３で得られた抽出物（画分３０，０００〜３
００，０００）を、０．５mgタンパク／体重１kg／日の
投与量で、３週間皮下投与した。第２群及び第４群の動
物は、第１群及び第３群の動物に投与した抽出物と同体
積の生理食塩水で、同様に処理した。
処置した：エーテル麻酔下で、右後肢を切開し、右座骨
神経を筋肉から剥がして露出させ、座骨神経節の末端側
から６mm離れた部位を、止血鉗子で３０秒間圧迫した。
その後、切開部を縫合した。第１群及び第３群の動物
に、実施例３で得られた抽出物（画分３０，０００〜３
００，０００）を、０．５mgタンパク／体重１kg／日の
投与量で、３週間皮下投与した。第２群及び第４群の動
物は、第１群及び第３群の動物に投与した抽出物と同体
積の生理食塩水で、同様に処理した。
【００４６】治療の間を通して、感覚の回復をヒートペ
イン試験（a heat pain test）への応答として「フット
−フリック−試験」（“Foot-Flick-test"）で試験し
た。ラットを手で固定し、一定温度の加熱空気（４７
℃）流を吹き出す吹き出し口の正面に、後肢を２mmの距
離に近づけた。このとき、後肢を引っ込めるまでに要し
た時間を治療群、対照群の各ラットで測定し、比較し
た。対照群の動物が後肢を引っ込めるまでの時間は、
１．５秒未満であった。試験した動物が後肢を引っ込め
るまでの時間は３秒未満であったとき、感覚の回復は良
好であるとした。試験動物が３秒後でも後肢を引っ込め
ない場合には、感覚の回復はなかったものとした。感覚
運動機能が回復した初日をそれぞれのラットについて決
定した。表４に各群の平均値を示した。
イン試験（a heat pain test）への応答として「フット
−フリック−試験」（“Foot-Flick-test"）で試験し
た。ラットを手で固定し、一定温度の加熱空気（４７
℃）流を吹き出す吹き出し口の正面に、後肢を２mmの距
離に近づけた。このとき、後肢を引っ込めるまでに要し
た時間を治療群、対照群の各ラットで測定し、比較し
た。対照群の動物が後肢を引っ込めるまでの時間は、
１．５秒未満であった。試験した動物が後肢を引っ込め
るまでの時間は３秒未満であったとき、感覚の回復は良
好であるとした。試験動物が３秒後でも後肢を引っ込め
ない場合には、感覚の回復はなかったものとした。感覚
運動機能が回復した初日をそれぞれのラットについて決
定した。表４に各群の平均値を示した。
【００４７】 表 ４ ─────────────────────────────────── 実験群 治療薬物 感覚の回復（日） ─────────────────────────────────── １ 糖尿病 抽出物 ９．５±０．３ ２ 糖尿病 生理食塩水 １６．５±０．８ ３ 神経障害 抽出物 １１．３±０．４ ４ 神経障害 生理食塩水 １８．９±０．３ ───────────────────────────────────
【００４８】表４に示すように、胎盤抽出物の分子量３
０，０００〜３００，０００の画分で治療された動物
は、感覚の回復が非常に早いことが示唆された。従って
この抽出物は（３０，０００〜３００，０００の画分）
は治療活性を有することが示された。
０，０００〜３００，０００の画分で治療された動物
は、感覚の回復が非常に早いことが示唆された。従って
この抽出物は（３０，０００〜３００，０００の画分）
は治療活性を有することが示された。
【００４９】
【発明の効果】以上から、本発明の抽出方法により胎盤
より抽出された本発明の抽出物は、生物学的活性及び治
療活性を有しており、本発明の抽出物を用いると、上皮
の再形成が促進され、また、神経障害の感覚の回復も促
進された。さらに、本発明の抽出物は、点眼剤、注射剤
等の医薬組成物の有効成分として使用することができ
る。さらにまた、本発明の抽出物は、凍結保存した胎盤
を用いて、安定的に供給することが可能である。
より抽出された本発明の抽出物は、生物学的活性及び治
療活性を有しており、本発明の抽出物を用いると、上皮
の再形成が促進され、また、神経障害の感覚の回復も促
進された。さらに、本発明の抽出物は、点眼剤、注射剤
等の医薬組成物の有効成分として使用することができ
る。さらにまた、本発明の抽出物は、凍結保存した胎盤
を用いて、安定的に供給することが可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 9/08 Ｆ Ｍ Ｖ 35/50 ＡＡＢ 7431−4Ｃ ＡＡＱ 7431−4Ｃ ＡＤＡ 7431−4Ｃ
Claims (20)
- 【請求項１】生物学的活性及び／または治療活性を有
し、製剤及び／または化粧品に使用でき、以下のステッ
プにより得ることができる抽出物： （Ａ）ヒトまたは動物由来の胎盤から絨毛膜、腱、血液
凝集塊および壊死した組織を除去し； （Ｂ）前記のようにして得られた胎盤組織から、加圧
下、特に手による加圧によって血液を除去し； （Ｃ）前記のようにして得られた胎盤の水気を切り、拭
き取りによって乾燥し、少なくとも−１０℃で凍結さ
せ； （Ｄ）前記凍結した胎盤を凍結状態のまま小片とし、直
径５mm超の粒子が残存しないように、好ましくは直径３
mm超の粒子が残存しないように、どろどろにつぶし; （Ｅ）前記どろどろにつぶした塊を必要により食塩を含
んでもよい冷水と混合して懸濁液とし； （Ｆ）前記懸濁液を少なくとも１５分攪拌し、次いで約
＋４℃で、例えば約１時間静置し； （Ｇ）生理的濃度を得るために、固形の食塩を、例えば
８．５ｇ〜９．０ｇ／kg水で添加し； （Ｈ）前記得られた懸濁液を、＋１５℃以下、特に＋１
０℃以下で、適当な時間、好ましくは約３０分間攪拌
し、次いで約＋４℃で適当な時間、好ましくは約４時間
静置し； （Ｉ）前記懸濁液のｐＨ値を測定し、そのｐＨを酸性、
特に約５．３に、好ましくは乳酸を添加して調整し； （Ｊ）前記酸性にした懸濁液を、適当な時間、例えば１
５時間、約４℃で保存し； （Ｋ）前記保存した懸濁液を遠心し、上清を集め； （Ｌ）前記集められた上清を濾過し、得られた透明な濾
液を酸性、特にｐＨ５．４に、好ましくは乳酸を添加し
て調整し、前記酸性に調整した濾液を濾過し； （Ｍ）前記のようにして得られた濾液を、好ましくは約
６０℃で少なくとも１４時間滅菌し；及び （Ｎ）前記滅菌された透明でない濾液を遠心し、上清を
集める。 - 【請求項２】前記ステップ（Ｎ）の終わりで得られた滅
菌濾液を、所望の分子量を有する化合物を除去するある
いは得るために、少なくとも１回、限外濾過又はゲル濾
過して得ることができる請求項１に記載の抽出物。 - 【請求項３】以下のステップをいずれかの順序で行うこ
とによって得ることができる請求項１または２に記載の
抽出物： （Ｏ）前記滅菌濾液を、３０，０００未満の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップと； （Ｐ）前記滅菌濾液を、３００，０００超の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップ。 - 【請求項４】前記各ステップ（Ｌ）、（Ｎ）、（Ｏ）及
び（Ｐ）の１つまたは複数を行った後、さらに濾過によ
って各濾液を滅菌することにより得ることができる請求
項１ないし３のいずれかに記載の抽出物。 - 【請求項５】前記ステップ（Ｇ）の後、前記ステップ
（Ｈ）の前に、有機金属の水溶液、例えば酢酸銅（Ｉ
Ｉ）（Cu(OAc)2）水溶液、好ましくは０．１％溶液を、
水１kgにつきCu(OAc)2 １．５２ｇとなる量添加するこ
とにより得ることができる請求項１ないし４のいずれか
に記載の抽出物。 - 【請求項６】前記ステップ（Ｌ）の後濾過により前記水
溶液を濾過滅菌し、前記ステップ（Ｍ）の前に、前記得
られた滅菌濾液を、約＋３５℃〜＋４５℃で、特に好ま
しくは＋３９℃で４〜６日間インキュベートすることに
より得ることができる請求項１ないし５のいずれかに記
載の抽出物。 - 【請求項７】前記ステップ（Ｎ）の後得られた溶液を酸
性、好ましくは塩酸、特に好ましくは塩酸水溶液を用い
て、例えばｐＨ１．０に調整し、前記酸性溶液を、適当
な時間、例えば１５〜２４時間インキュベートし、その
後、前記インキュベートした酸性溶液のｐＨを測定し、
そのｐＨを５．０〜８．０、好ましくは７．０に調整す
ることにより得ることができる請求項１ないし６のいず
れかに記載の抽出物。 - 【請求項８】生物学的活性及び／または治療活性を有
し、製剤及び／または化粧品に使用でき、請求項１に記
載のステップ（Ａ）〜（Ｎ）を行う抽出物の製造方法。 - 【請求項９】前記ステップ（Ｎ）の終わりで得られた滅
菌濾液を、所望の分子量を有する化合物を除去するまた
は得るために、少なくとも１回、限外濾過又はゲル濾過
する請求項８に記載の抽出物の製造方法。 - 【請求項１０】以下のステップを、いずれかの順序で行
う請求項８または９に記載の抽出物の製造方法： （Ｏ）前記滅菌濾液を、３０，０００未満の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップと； （Ｐ）前記滅菌濾液を、３００，０００超の分子量を有
する化合物を除去し、分離して集めるために、限外濾過
するステップ。 - 【請求項１１】前記ステップ（Ｌ）、（Ｎ）、（Ｏ）及
び（Ｐ）の１つまたは複数を行った後、さらに濾過よっ
て各濾液の滅菌を行う請求項８ないし１０のいずれかに
記載の抽出物の製造方法。 - 【請求項１２】前記ステップ（Ｇ）の後、前記ステップ
（Ｈ）の前に、有機金属の水溶液、例えば酢酸銅（Ｉ
Ｉ）（Cu( OAc)2)水溶液、好ましくは０．１％溶液を、
水１kgにつきCu(OAc)2 １．５２ｇとなる量添加する請
求項８ないし１１のいずれかに記載の抽出物の製造方
法。 - 【請求項１３】前記ステップ（Ｌ）の後濾過により濾過
滅菌し、前記ステップ（Ｍ）の前に、前記滅菌濾液を、
約＋３５℃〜＋４５℃で、特に好ましくは＋３９℃で４
〜６日間インュベートする請求項８ないし１２のいずれ
かに記載の抽出物の製造方法。 - 【請求項１４】前記ステップ（Ｎ）の後得られた溶液を
酸性、好ましくは塩酸、特に好ましくは塩酸水溶液を用
いて、例えばｐＨ１．０に調整し、前記得られた酸性水
溶液を、適当な時間、例えば１５〜２４時間インキュベ
ートし、その後、前記インキュベートした酸性溶液のｐ
Ｈを測定し、ｐＨを５．０〜８．０、好ましくは７．０
に調整する請求項８ないし１３のいずれかに記載の抽出
物の製造方法。 - 【請求項１５】請求項１〜７のいずれかに記載の抽出物
を、少なくとも１つの活性成分として含む、上皮再形成
または神経障害の治療のための医薬組成物。 - 【請求項１６】注射剤、滅菌溶液、または、溶液、軟
膏、クリーム、ジェル、膣坐剤及び坐剤等の局所投与用
のすべての剤形、特に点眼用溶液である、請求項１５に
記載の医薬組成物。 - 【請求項１７】上皮再形成用医薬組成物の製造のための
請求項１ないし７のいずれかに記載の抽出物の使用。 - 【請求項１８】神経障害治療用医薬組成物の製造のため
の請求項１ないし７のいずれかに記載の抽出物の使用。 - 【請求項１９】上皮再形成及び／または神経障害治療活
性を有する胎盤抽出物。 - 【請求項２０】前記抽出物の分子量が３０，０００〜３
００，０００である請求項１９に記載の抽出物。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH1855/92A CH684741A5 (de) | 1992-06-11 | 1992-06-11 | Verfahren zur Herstellung eines Extraktes. |
| DE59304087T DE59304087D1 (de) | 1992-06-11 | 1993-06-11 | Placentaextrakt und Verfahren zu seiner Herstellung |
| EP93109388A EP0577996B1 (de) | 1992-06-11 | 1993-06-11 | Placentaextrakt und Verfahren zu seiner Herstellung |
| AT93109388T ATE143809T1 (de) | 1992-06-11 | 1993-06-11 | Placentaextrakt und verfahren zu seiner herstellung |
| CA002113143A CA2113143A1 (en) | 1992-06-11 | 1994-01-10 | Extract and process for the preparation of this extract |
| JP6001273A JPH07206888A (ja) | 1992-06-11 | 1994-01-11 | 胎盤抽出物およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH1855/92A CH684741A5 (de) | 1992-06-11 | 1992-06-11 | Verfahren zur Herstellung eines Extraktes. |
| CA002113143A CA2113143A1 (en) | 1992-06-11 | 1994-01-10 | Extract and process for the preparation of this extract |
| JP6001273A JPH07206888A (ja) | 1992-06-11 | 1994-01-11 | 胎盤抽出物およびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07206888A true JPH07206888A (ja) | 1995-08-08 |
Family
ID=32329376
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6001273A Pending JPH07206888A (ja) | 1992-06-11 | 1994-01-11 | 胎盤抽出物およびその製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0577996B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07206888A (ja) |
| AT (1) | ATE143809T1 (ja) |
| CA (1) | CA2113143A1 (ja) |
| CH (1) | CH684741A5 (ja) |
| DE (1) | DE59304087D1 (ja) |
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- 1992-06-11 CH CH1855/92A patent/CH684741A5/de not_active IP Right Cessation
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1993
- 1993-06-11 EP EP93109388A patent/EP0577996B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-11 AT AT93109388T patent/ATE143809T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-06-11 DE DE59304087T patent/DE59304087D1/de not_active Expired - Fee Related
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