JPH07188296A - 組換えインヒビン - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
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-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ヒトおよびウシ等の組換えインヒビンおよびそ
の生合成方法、それを含む薬剤組成物、その合成ペプチ
ド、その他の有用な用途を提供すること。 【構成】インヒビン又は同様な免疫学的又は生物学的活
性を有するポリペプチドの全部、1部、類縁体、相同体
又は前駆体から成る、形質転換宿主の発現生成物、産生
したインヒビンの薬剤組成物、その他の用途に使用する
こと。
の生合成方法、それを含む薬剤組成物、その合成ペプチ
ド、その他の有用な用途を提供すること。 【構成】インヒビン又は同様な免疫学的又は生物学的活
性を有するポリペプチドの全部、1部、類縁体、相同体
又は前駆体から成る、形質転換宿主の発現生成物、産生
したインヒビンの薬剤組成物、その他の用途に使用する
こと。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は特にホルモンインヒビン
の1部又は全部をコードするデオキシリボ核酸(DN
A)配列を含有するクローニングベクターの構築、該ベ
クターを含有する細菌株の様な宿主細胞ならびにインヒ
ビンの1部又は全部又はその前駆体を産生する細菌株の
様な宿主細胞に関するものである。更に本発明は、天然
物も合成物も含めて、該ベクターおよび菌株の発現産物
の産生および用途ならびに該発現産物およびベクターの
断片の産生および用途に関するものである。
の1部又は全部をコードするデオキシリボ核酸(DN
A)配列を含有するクローニングベクターの構築、該ベ
クターを含有する細菌株の様な宿主細胞ならびにインヒ
ビンの1部又は全部又はその前駆体を産生する細菌株の
様な宿主細胞に関するものである。更に本発明は、天然
物も合成物も含めて、該ベクターおよび菌株の発現産物
の産生および用途ならびに該発現産物およびベクターの
断片の産生および用途に関するものである。
【0002】
【従来の技術】生殖腺が下垂体機能のフィードバック調
整に関与するインヒビンと呼ばれる非ステロイド系因子
を生産するものであることが1932年に報告された
(マツクラー,D.R.(1932)サイエンス,7
6,19−20(McCullagh,D.R.(19
32)Science 76,19−20))。この時
以来、下垂体前葉部は、共に生殖腺の発育と機能を調節
する少くとも2種のゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン
すなわちフォリトロピン(FSH)および黄体形成ホル
モンすなわちルトロピン(LH)を生成することが知ら
れている。高感度ラジオイムノアッセイによれば各ホル
モンを正確に個々にモニターすることが可能であり、又
これにより生殖腺によるこれらのホルモンのフィードバ
ック調整の様子を明らかにすることも出来る。LHのフ
ィードバック調整は主としてステロイドを介するもので
あると見られ、又一方、FSHのそれはステロイドの他
にたん白質や糖たん白質因子およびインヒビンを介する
ものである。
整に関与するインヒビンと呼ばれる非ステロイド系因子
を生産するものであることが1932年に報告された
(マツクラー,D.R.(1932)サイエンス,7
6,19−20(McCullagh,D.R.(19
32)Science 76,19−20))。この時
以来、下垂体前葉部は、共に生殖腺の発育と機能を調節
する少くとも2種のゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン
すなわちフォリトロピン(FSH)および黄体形成ホル
モンすなわちルトロピン(LH)を生成することが知ら
れている。高感度ラジオイムノアッセイによれば各ホル
モンを正確に個々にモニターすることが可能であり、又
これにより生殖腺によるこれらのホルモンのフィードバ
ック調整の様子を明らかにすることも出来る。LHのフ
ィードバック調整は主としてステロイドを介するもので
あると見られ、又一方、FSHのそれはステロイドの他
にたん白質や糖たん白質因子およびインヒビンを介する
ものである。
【0003】現在インヒビンは卵巣中の顆粒膜細胞や精
巣中のセルトリ細胞から分泌されるたん白質又は糖たん
白質として定義されている。これはFSHに応答して心
泌され、そしてFSH合成および分泌のフィードバック
抑制剤として下垂体に作用するが、LHの基底合成およ
び分泌にはほとんど関与しない。インヒビン、そのmR
NA又は前駆体が他の細胞や組織中で生成されるかどう
かについては未だ不明である。
巣中のセルトリ細胞から分泌されるたん白質又は糖たん
白質として定義されている。これはFSHに応答して心
泌され、そしてFSH合成および分泌のフィードバック
抑制剤として下垂体に作用するが、LHの基底合成およ
び分泌にはほとんど関与しない。インヒビン、そのmR
NA又は前駆体が他の細胞や組織中で生成されるかどう
かについては未だ不明である。
【0004】1970年代初期以来、精巣および卵巣の
種々の生殖腺からインヒビンを精製する種々の試みが成
されて来たが、当時の種々の生物学的定量法では下垂体
細胞中の生体内および生体外におけるFSHの抑制はイ
ンヒビンが原因であると推定されしかも被検体の非特異
性毒性作用について常にチェックが行なわれていたわけ
ではなく(Baker,H.W.G等(1981年)
〔Intragonadal Regulation
of Reproduction(Franchimo
nt,PおよびChanning,C.P.編),Ac
ademic Press,London,193〜2
28頁;およびBaker,H.W.G.等(1982
年),Ann.New York Acad.Sci.
383,329−342)。この様な方法を使用したこ
とがある程度原因となって矛盾する結果となっていた
(de Jong,F.H.(1979年)Mol.C
ell.Endocrinol,13,1−10)。
種々の生殖腺からインヒビンを精製する種々の試みが成
されて来たが、当時の種々の生物学的定量法では下垂体
細胞中の生体内および生体外におけるFSHの抑制はイ
ンヒビンが原因であると推定されしかも被検体の非特異
性毒性作用について常にチェックが行なわれていたわけ
ではなく(Baker,H.W.G等(1981年)
〔Intragonadal Regulation
of Reproduction(Franchimo
nt,PおよびChanning,C.P.編),Ac
ademic Press,London,193〜2
28頁;およびBaker,H.W.G.等(1982
年),Ann.New York Acad.Sci.
383,329−342)。この様な方法を使用したこ
とがある程度原因となって矛盾する結果となっていた
(de Jong,F.H.(1979年)Mol.C
ell.Endocrinol,13,1−10)。
【0005】近年、ウシ卵胞液(bFF)からのインヒ
ビンを精製して均質物とすることが行なわれた。(国際
特許出願、PCT/AU85/00119;およびRo
bertson,D.M.等(1985年)のBioc
hem,Biophys.Res.Commun.12
6,220−226。)この成功は、被検体の細胞毒作
用を測定する手段(Robertson,D.M.等
(1982年)のMol.Cell,Endocrin
ol,26,119−127)を組み入れた精密培養ラ
ット下垂体細胞分析法(Scott,R.S.等(19
80年)のEndocrinsl,107,1536−
1542)を使用したことによるものであり、これによ
り測定細胞中のFSH含有量を低下させる非特異性毒性
作用がインヒビンの作用とは異なるものであることが同
定された。使用した標準体は、1U/mgの任意の活性
を与える前記ヒツジ精巣リンパ標準体に関して20U/
mlのインヒビン活性を有するウシ卵胞液製剤であった
(Scott,R.S.等(1980年)のEndoc
rinol,107,1536−1542)。
ビンを精製して均質物とすることが行なわれた。(国際
特許出願、PCT/AU85/00119;およびRo
bertson,D.M.等(1985年)のBioc
hem,Biophys.Res.Commun.12
6,220−226。)この成功は、被検体の細胞毒作
用を測定する手段(Robertson,D.M.等
(1982年)のMol.Cell,Endocrin
ol,26,119−127)を組み入れた精密培養ラ
ット下垂体細胞分析法(Scott,R.S.等(19
80年)のEndocrinsl,107,1536−
1542)を使用したことによるものであり、これによ
り測定細胞中のFSH含有量を低下させる非特異性毒性
作用がインヒビンの作用とは異なるものであることが同
定された。使用した標準体は、1U/mgの任意の活性
を与える前記ヒツジ精巣リンパ標準体に関して20U/
mlのインヒビン活性を有するウシ卵胞液製剤であった
(Scott,R.S.等(1980年)のEndoc
rinol,107,1536−1542)。
【0006】bFFからのインヒビンは薬3500回精
製されて200,000単位/mg(たん白質)の特異
活性を有し、そしてこれはドデシルスルホン酸ナトリウ
ムの存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS
−PAGE)により明らかにされたところによると、そ
れぞれ約43kDおよび15kDの2個のジスルフィド
結合サブユニットAおよびBから成る58kDのたん白
質である。各サブユニットのNH2 −末端のアミノ酸配
列は決定されている。この精製物質は先にインヒビンの
生理的性質として定義された、すなわち、ラット下垂体
細胞からの内在FSHの合成および放出を抑制するがL
H、プロラクチンおよび甲状腺刺激ホルモンの合成およ
び放出には関与しないという、生体外生理的性質有して
いる。
製されて200,000単位/mg(たん白質)の特異
活性を有し、そしてこれはドデシルスルホン酸ナトリウ
ムの存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS
−PAGE)により明らかにされたところによると、そ
れぞれ約43kDおよび15kDの2個のジスルフィド
結合サブユニットAおよびBから成る58kDのたん白
質である。各サブユニットのNH2 −末端のアミノ酸配
列は決定されている。この精製物質は先にインヒビンの
生理的性質として定義された、すなわち、ラット下垂体
細胞からの内在FSHの合成および放出を抑制するがL
H、プロラクチンおよび甲状腺刺激ホルモンの合成およ
び放出には関与しないという、生体外生理的性質有して
いる。
【0007】FSHは雌の***および雄の***形成の発
生および率の決定に重要であるので、インヒビン、その
類縁体又は相同体あるいはインヒビンに対する抗体を投
与することは主として人間および家畜動物における生殖
腺を抑制又は刺激することになるであろうし、又生殖腺
機能分析用の診断器材としても使用できるであろう。イ
ンヒビンの生理作用を分析することを目的として、粗製
の又は部分分画した生殖腺抽出物又は分泌物を使用して
の多くの生体内実験が行なわれて来た。これらの実験に
おいて、インヒビン又はインヒビンに対する抗体による
作用として以下のものが明らかとなった。
生および率の決定に重要であるので、インヒビン、その
類縁体又は相同体あるいはインヒビンに対する抗体を投
与することは主として人間および家畜動物における生殖
腺を抑制又は刺激することになるであろうし、又生殖腺
機能分析用の診断器材としても使用できるであろう。イ
ンヒビンの生理作用を分析することを目的として、粗製
の又は部分分画した生殖腺抽出物又は分泌物を使用して
の多くの生体内実験が行なわれて来た。これらの実験に
おいて、インヒビン又はインヒビンに対する抗体による
作用として以下のものが明らかとなった。
【0008】1.生殖腺機能の抑制。(Moudga
l,N.R.等(1985年)のGonadal Pr
oteins and Peptides and t
treir Biological Signifie
ance(Sairam,M.RおよびAtkinso
n,L.E.,編)World Scientrifl
c Publishing Co.,Singapor
e,21−37ページ)。
l,N.R.等(1985年)のGonadal Pr
oteins and Peptides and t
treir Biological Signifie
ance(Sairam,M.RおよびAtkinso
n,L.E.,編)World Scientrifl
c Publishing Co.,Singapor
e,21−37ページ)。
【0009】2.***率の増加。(O′Shea,T.
等(1982年)のProc.Aust,Soc,Re
p,Biol,14,85;O′Shea,T.等(1
983年)のProc.Aust,Soc,Rep,B
iol,15,22;およびHenderson,K.
M.等(1984年)のJ.Endocrinol.1
02,305−309)。
等(1982年)のProc.Aust,Soc,Re
p,Biol,14,85;O′Shea,T.等(1
983年)のProc.Aust,Soc,Rep,B
iol,15,22;およびHenderson,K.
M.等(1984年)のJ.Endocrinol.1
02,305−309)。
【0010】3.思春期の始まりの促進。(Al−Ob
aidi,F.A.R.等(1983年)のProc.
Aust,Soc,Rep,Biol,15,80)。
生体動物におけるこれらの性質やあるいはさらにその他
の生理学的研究を市場規模で開発するためには、天然物
又は合成物の大量の精製インヒビン又はその分画物ある
いはインヒビン作用薬および拮抗薬を必要とする。この
様な大量を得ることは、その物質源が限られている(例
えば、ヒト卵胞液から)ために現在の精製法だけでは不
可能であり、例えば、50mmのbFFからの抽出では
わずか5−10μgの精製物が得られるにすぎない。
aidi,F.A.R.等(1983年)のProc.
Aust,Soc,Rep,Biol,15,80)。
生体動物におけるこれらの性質やあるいはさらにその他
の生理学的研究を市場規模で開発するためには、天然物
又は合成物の大量の精製インヒビン又はその分画物ある
いはインヒビン作用薬および拮抗薬を必要とする。この
様な大量を得ることは、その物質源が限られている(例
えば、ヒト卵胞液から)ために現在の精製法だけでは不
可能であり、例えば、50mmのbFFからの抽出では
わずか5−10μgの精製物が得られるにすぎない。
【0011】本発明は、特に、インヒビンをコードする
遺伝子又は遺伝子の部分の分子クローンを例えば大腸菌
(Escherichia coli)の様な宿主に導
入するためにインヒビンをコードする遺伝子を同定しそ
して特定することにより、そしてそのサブユニットを含
めこのインヒビン分子の全部又は1部又は前駆体を合成
することのできる宿主、例えば細菌株を創製するために
そのクローン化遺伝子又はその部分を操作することによ
り、前記した制限をとり除こうとするものである。
遺伝子又は遺伝子の部分の分子クローンを例えば大腸菌
(Escherichia coli)の様な宿主に導
入するためにインヒビンをコードする遺伝子を同定しそ
して特定することにより、そしてそのサブユニットを含
めこのインヒビン分子の全部又は1部又は前駆体を合成
することのできる宿主、例えば細菌株を創製するために
そのクローン化遺伝子又はその部分を操作することによ
り、前記した制限をとり除こうとするものである。
【0012】
【課題を解決するための手段】本発明の第1の態様は、
インヒビンの全部、1部又は前駆体のアミノ酸配列のコ
ード配列として作用する第1のDNA配列、ならびに該
第1のDNA配列と交雑するDNA配列を提供すること
にあり、該配列は天然の又は合成の又は半合成の原料を
含めていかなる原料物質から得られるせのであっても良
く、又該配列は突然変異関連配列を含み、又単一の又は
複数の塩基置換、除去、導入および変換を含み、かつイ
ンヒビンのポリペプチド又はインヒビンと同様な免疫学
的生物学的活性を有するポリペプチドの全部、1部又は
前駆体あるいは相同体又は類縁体をその発現の際にコー
ドしているDNA配列を含むものである。
インヒビンの全部、1部又は前駆体のアミノ酸配列のコ
ード配列として作用する第1のDNA配列、ならびに該
第1のDNA配列と交雑するDNA配列を提供すること
にあり、該配列は天然の又は合成の又は半合成の原料を
含めていかなる原料物質から得られるせのであっても良
く、又該配列は突然変異関連配列を含み、又単一の又は
複数の塩基置換、除去、導入および変換を含み、かつイ
ンヒビンのポリペプチド又はインヒビンと同様な免疫学
的生物学的活性を有するポリペプチドの全部、1部又は
前駆体あるいは相同体又は類縁体をその発現の際にコー
ドしているDNA配列を含むものである。
【0013】本発明において好ましい配列は、以下本文
において詳述しそして本文添付の図7〜11に示したウ
シおよびヒトインヒビンの43kDおよび15kD(A
およびB)のサブユニットに相当するポリペプチドをコ
ードする配列である。本発明のもう1つの好ましい態様
は、本文後記するインヒビンの20kD(Ac)サブユ
ニットをコードするDNAである。
において詳述しそして本文添付の図7〜11に示したウ
シおよびヒトインヒビンの43kDおよび15kD(A
およびB)のサブユニットに相当するポリペプチドをコ
ードする配列である。本発明のもう1つの好ましい態様
は、本文後記するインヒビンの20kD(Ac)サブユ
ニットをコードするDNAである。
【0014】本発明のDNA配列は、例えば脊椎動物の
細胞から常法によりその全DNAを抽出しそしてその配
列を単離することによって得ることができる。別法とし
てこのDNAは又生体外化学合成又は生合成により例え
ばmRNA鋳型を使用することによって得ることもでき
る。本発明は又、インヒビンのポリペプチド又はインヒ
ビンと同様な免疫学的又は生物学的活性を有するポリペ
プチドの全部又は1部又は前駆体をコードするDNA又
はRNA配列を選択する方法も包含するものであり、そ
して該方法は、1種又はそれ以上のDNA又はRNA配
列を得て、そしてこれら上記した活性を有するポリペプ
チドの1部又は全部又は前駆体をコードすることが知ら
れている公知のDNA又はRNAと交雑する配列を決定
するか、あるいは、インヒビンに対する抗血清又はその
1部を得てそしてインヒビンの1部又は全部と発現する
宿主−ベクター系を同定することから成る。
細胞から常法によりその全DNAを抽出しそしてその配
列を単離することによって得ることができる。別法とし
てこのDNAは又生体外化学合成又は生合成により例え
ばmRNA鋳型を使用することによって得ることもでき
る。本発明は又、インヒビンのポリペプチド又はインヒ
ビンと同様な免疫学的又は生物学的活性を有するポリペ
プチドの全部又は1部又は前駆体をコードするDNA又
はRNA配列を選択する方法も包含するものであり、そ
して該方法は、1種又はそれ以上のDNA又はRNA配
列を得て、そしてこれら上記した活性を有するポリペプ
チドの1部又は全部又は前駆体をコードすることが知ら
れている公知のDNA又はRNAと交雑する配列を決定
するか、あるいは、インヒビンに対する抗血清又はその
1部を得てそしてインヒビンの1部又は全部と発現する
宿主−ベクター系を同定することから成る。
【0015】前記配列は天然物源からのものでも良い
し、又、組換えDNA分子からのRNA配列、合成配列
又はDNA配列あるいはこれら配列の組合わせから成る
ものであっても良い。本発明の1つの好ましい態様とし
て、たん白質インヒビンの少くとも1部分をコードする
DNAを同定しそして特定するために使用する方法は、
インヒビン産生細胞からmRNAを抽出し、これを2本
鎖DNA(相補性DNA、すなわちcDNA)に変換し
そしてこれらをプラスミドの様な自律複製因子中に挿入
することから成る。そして次に該因子で細菌株の様な宿
主細胞を形質転換し、そして他のたん白質をコードする
ことなくインヒビンだけをコードするDNAを含有する
クローンを検出するために、インヒビン様mRNA又は
DNAに相補的な合成DNAプローブの産生するライブ
ラリーをスクリーニングする。
し、又、組換えDNA分子からのRNA配列、合成配列
又はDNA配列あるいはこれら配列の組合わせから成る
ものであっても良い。本発明の1つの好ましい態様とし
て、たん白質インヒビンの少くとも1部分をコードする
DNAを同定しそして特定するために使用する方法は、
インヒビン産生細胞からmRNAを抽出し、これを2本
鎖DNA(相補性DNA、すなわちcDNA)に変換し
そしてこれらをプラスミドの様な自律複製因子中に挿入
することから成る。そして次に該因子で細菌株の様な宿
主細胞を形質転換し、そして他のたん白質をコードする
ことなくインヒビンだけをコードするDNAを含有する
クローンを検出するために、インヒビン様mRNA又は
DNAに相補的な合成DNAプローブの産生するライブ
ラリーをスクリーニングする。
【0016】従って本発明の態様は、インヒビン様mR
NA又はDNAの同定用の合成ポリヌクレオチドプロー
ブを提供するものであり、該プローブはポリヌクレオチ
ドおよび標識物質から成り、そして該ポリヌクレオチド
は下記から選択した配列を有する。
NA又はDNAの同定用の合成ポリヌクレオチドプロー
ブを提供するものであり、該プローブはポリヌクレオチ
ドおよび標識物質から成り、そして該ポリヌクレオチド
は下記から選択した配列を有する。
【0017】
【表1】
【0018】好ましくは標識物質は5′末端に結合した
32PO4 群であるか、あるいは他の標識物質であっても
良い。本発明の更に別の態様は、インヒビンの全部又は
1部又は前駆体のアミノ酸配列をコードする第1のDN
A配列および該第1の配列と交雑するDNA配列とから
成るDNAを挿入したことを特徴とする組換えDNA分
子を提供することであり、該配列は天然の、合成の、生
合成の又は半合成の物質を含むいかなる物質源に由来す
るものでも良く、又該配列は突然変異、単一の又は複数
の塩基置換、除去、挿入および変換による関連体を含有
し、そして更に、インヒビンのポリペプチド又はインヒ
ビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペ
プチドの全部又は1部あるいは前駆体、類縁体又は相同
体をコードする配列を含有するものである。
32PO4 群であるか、あるいは他の標識物質であっても
良い。本発明の更に別の態様は、インヒビンの全部又は
1部又は前駆体のアミノ酸配列をコードする第1のDN
A配列および該第1の配列と交雑するDNA配列とから
成るDNAを挿入したことを特徴とする組換えDNA分
子を提供することであり、該配列は天然の、合成の、生
合成の又は半合成の物質を含むいかなる物質源に由来す
るものでも良く、又該配列は突然変異、単一の又は複数
の塩基置換、除去、挿入および変換による関連体を含有
し、そして更に、インヒビンのポリペプチド又はインヒ
ビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペ
プチドの全部又は1部あるいは前駆体、類縁体又は相同
体をコードする配列を含有するものである。
【0019】本発明の好ましい組換えDNA分子はその
挿入DNAに効果的に結合する発現抑制配列を含有す
る。本発明の1つの好ましい態様においては、該挿入D
NAは大腸菌(E.コリ)のβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子と効果的に結合する。他の好ましい抑制系としては、
トリプトファン(trp)オペロン、バクテリオファー
ジλ(PL )の左側プロモーターおよびtacの様なハ
イブリッドプロモーターあるいは長鎖末端反復モロネイ
(moloney)白血病ビールスのプロモーターの様
なビールスプロモーターから成るものが挙げられる。
挿入DNAに効果的に結合する発現抑制配列を含有す
る。本発明の1つの好ましい態様においては、該挿入D
NAは大腸菌(E.コリ)のβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子と効果的に結合する。他の好ましい抑制系としては、
トリプトファン(trp)オペロン、バクテリオファー
ジλ(PL )の左側プロモーターおよびtacの様なハ
イブリッドプロモーターあるいは長鎖末端反復モロネイ
(moloney)白血病ビールスのプロモーターの様
なビールスプロモーターから成るものが挙げられる。
【0020】本発明の好ましい組換えDNA分子は前記
挿入DNAを含有するプラスミドである。本発明の好ま
しいプラスミドは本文後記において詳述するが、pBT
A22,pBTA23,pBTA28,pBTA29,
pBTA30,pBTA290およびpBTA292−
pBTA305,pBTA306−pBTA310,p
BTA472及びpBTA415−pBTA418が挙
げられる。
挿入DNAを含有するプラスミドである。本発明の好ま
しいプラスミドは本文後記において詳述するが、pBT
A22,pBTA23,pBTA28,pBTA29,
pBTA30,pBTA290およびpBTA292−
pBTA305,pBTA306−pBTA310,p
BTA472及びpBTA415−pBTA418が挙
げられる。
【0021】これとは別に該組換えDNA分子は、バク
テリオファージλの様な適当なバクテリオファージのD
NAあるいは生体外であるいはあらゆる有機体内で真核
細胞中において複製可能なビールスのDNAに結合した
前記挿入DNAから成るものであっても良い。本発明は
又、プロモーター、翻訳開始シグナルおよびインヒビン
のポリペプチドあるいはインヒビンと同様の免疫学的又
は生物学的活性を有するポリペプチドの全部、1部又は
前駆体のアミノ酸配列に相当するかあるいは発現時にこ
れをコードする第1のDNA配列、あるいは該第1の配
列と交雑するDNA配列又は突然変異、単一のあるいは
複数の塩基置換、除去、挿入又は該第1のDNA配列へ
の変換による関連体のDNA配列から成る融合遺伝子を
提供するものである。
テリオファージλの様な適当なバクテリオファージのD
NAあるいは生体外であるいはあらゆる有機体内で真核
細胞中において複製可能なビールスのDNAに結合した
前記挿入DNAから成るものであっても良い。本発明は
又、プロモーター、翻訳開始シグナルおよびインヒビン
のポリペプチドあるいはインヒビンと同様の免疫学的又
は生物学的活性を有するポリペプチドの全部、1部又は
前駆体のアミノ酸配列に相当するかあるいは発現時にこ
れをコードする第1のDNA配列、あるいは該第1の配
列と交雑するDNA配列又は突然変異、単一のあるいは
複数の塩基置換、除去、挿入又は該第1のDNA配列へ
の変換による関連体のDNA配列から成る融合遺伝子を
提供するものである。
【0022】本発明の好ましい組換えDNA分子は、本
発明のDNAから成るDNA配列を挿入したプラスミド
から成るものである。適当なプラスミドとしては、pB
R322,pUR290,pUR291又はpUR29
2又はpBTA286,pUC7,pUC8又はpUC
9又はpUC13又はptrPL1又はpWT111,
pWT121又はpWT131およびそれらの誘導体が
挙げられる。又ビールスベクター、例えばpZIP N
eO SV(X)1、ワクシニアビールス、バクロビー
ルスおよびそれらの誘導体も挙げることができる。
発明のDNAから成るDNA配列を挿入したプラスミド
から成るものである。適当なプラスミドとしては、pB
R322,pUR290,pUR291又はpUR29
2又はpBTA286,pUC7,pUC8又はpUC
9又はpUC13又はptrPL1又はpWT111,
pWT121又はpWT131およびそれらの誘導体が
挙げられる。又ビールスベクター、例えばpZIP N
eO SV(X)1、ワクシニアビールス、バクロビー
ルスおよびそれらの誘導体も挙げることができる。
【0023】又本発明は、インヒビンのポリペプチド又
はインヒビンと同様な免疫学的又は生物学的活性を有す
るポリペプチドの全部、1部又は類縁体、相同体又は前
駆体のアミノ酸配列に相当するかあるいは発現時にこれ
をコードする第1のDNA配列、該第1の配列と交雑す
るDNA配列あるいは突然変異、単一の又は複数の塩基
置換、除去、挿入ならびに該第1のDNA配列あるいは
交雑配列への変換による関連体の配列から成る挿入DN
Aを作り、そしてこの挿入DNAをクローニングベクタ
ーに導入することから成る、組換えDNA分子の製造方
法も包含するものである。
はインヒビンと同様な免疫学的又は生物学的活性を有す
るポリペプチドの全部、1部又は類縁体、相同体又は前
駆体のアミノ酸配列に相当するかあるいは発現時にこれ
をコードする第1のDNA配列、該第1の配列と交雑す
るDNA配列あるいは突然変異、単一の又は複数の塩基
置換、除去、挿入ならびに該第1のDNA配列あるいは
交雑配列への変換による関連体の配列から成る挿入DN
Aを作り、そしてこの挿入DNAをクローニングベクタ
ーに導入することから成る、組換えDNA分子の製造方
法も包含するものである。
【0024】好ましくは該DNA配列ハクローニングベ
クターの正しい位置に導入することであり、そして正し
い読み枠は発現抑制配列を有する。更に他の態様として
本発明は又、少なくとも1個の本発明の組換えDNA分
子で形質転換されそしてポリペプチドインヒビン又はイ
ンヒビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポ
リペプチドの全部、1部又は前駆体を発現可能な宿主を
提供するものである。
クターの正しい位置に導入することであり、そして正し
い読み枠は発現抑制配列を有する。更に他の態様として
本発明は又、少なくとも1個の本発明の組換えDNA分
子で形質転換されそしてポリペプチドインヒビン又はイ
ンヒビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポ
リペプチドの全部、1部又は前駆体を発現可能な宿主を
提供するものである。
【0025】適当な宿主としては、細菌細胞、バクテリ
オファージ、酵母、他の真菌類、脊椎動物細胞、昆虫細
胞、植物細胞ならびにヒト細胞ホ、ヒト組織およびあら
ゆる真核有機体が挙げられる。適当な細菌宿主はE.コ
リおよび他の腸管内微生物、シュードモナス(Pseu
domonas)およびバチルス(Bacillus)
である。好ましい宿主培養体としてはE.コリBTA5
45,BTA634,BTA637,BTA647およ
びBTA652として同定されており、又宿主−ベクタ
ー系としてはATCC67054−ATCC67059
およびBTA1361として同定されている。
オファージ、酵母、他の真菌類、脊椎動物細胞、昆虫細
胞、植物細胞ならびにヒト細胞ホ、ヒト組織およびあら
ゆる真核有機体が挙げられる。適当な細菌宿主はE.コ
リおよび他の腸管内微生物、シュードモナス(Pseu
domonas)およびバチルス(Bacillus)
である。好ましい宿主培養体としてはE.コリBTA5
45,BTA634,BTA637,BTA647およ
びBTA652として同定されており、又宿主−ベクタ
ー系としてはATCC67054−ATCC67059
およびBTA1361として同定されている。
【0026】本発明は又、適当な宿主を作り、そして本
発明の組換えDNA分子を該宿主中の正しい読み枠中に
導入することから成る、宿主の形質転換方法をも包含す
る。更に又本発明は、インヒビンのポリペプチド又はイ
ンヒビンと同様の免疫学的又は生物学的性質を有するポ
リペプチドの全部、1部又は前駆体から成る、本発明の
形質転換宿主の発現生成物を提供する。
発明の組換えDNA分子を該宿主中の正しい読み枠中に
導入することから成る、宿主の形質転換方法をも包含す
る。更に又本発明は、インヒビンのポリペプチド又はイ
ンヒビンと同様の免疫学的又は生物学的性質を有するポ
リペプチドの全部、1部又は前駆体から成る、本発明の
形質転換宿主の発現生成物を提供する。
【0027】本発明の好ましい態様においては、その発
現生成物は、宿主と相同の第1のポリペプチド配列と、
インヒビンのポリペプチド又はインヒビンと同様な免疫
学的又は生物学的性質を有するポリペプチドの全部、1
部又は前駆体、類縁体又は相同体をコードするアミノ酸
配列である第2のポリペプチド配列とから成る。本発明
の好ましい態様においては、該第1のアミノ酸配列はβ
−ガラクトシダーゼの1部又は全部であり、該宿主細胞
はE.コリである。本発明の更に好ましい態様において
は、該第1の配列は発現生成物のNH2 −末端配列であ
る。
現生成物は、宿主と相同の第1のポリペプチド配列と、
インヒビンのポリペプチド又はインヒビンと同様な免疫
学的又は生物学的性質を有するポリペプチドの全部、1
部又は前駆体、類縁体又は相同体をコードするアミノ酸
配列である第2のポリペプチド配列とから成る。本発明
の好ましい態様においては、該第1のアミノ酸配列はβ
−ガラクトシダーゼの1部又は全部であり、該宿主細胞
はE.コリである。本発明の更に好ましい態様において
は、該第1の配列は発現生成物のNH2 −末端配列であ
る。
【0028】更に又本発明は別の態様として本発明は、
適当な宿主を本発明の組換えDNA分子で形質転換して
インヒビンの全部、1部又は前駆体であるポリペプチド
又はインヒビンと同様の生物学的又は免疫学的活性を有
するポリペプチドを含有するたん白質生成物を発現可能
な宿主を作り、該宿主を培養して該発現生成物を得、そ
して該ポリペプチドを採取することから成る、インヒビ
ンの全部、1部又は前駆体から成るポリペプチド又はイ
ンヒビンと同様な免疫学的又は生物学的活性を有するポ
リペプチドを生合成する方法を提供する。
適当な宿主を本発明の組換えDNA分子で形質転換して
インヒビンの全部、1部又は前駆体であるポリペプチド
又はインヒビンと同様の生物学的又は免疫学的活性を有
するポリペプチドを含有するたん白質生成物を発現可能
な宿主を作り、該宿主を培養して該発現生成物を得、そ
して該ポリペプチドを採取することから成る、インヒビ
ンの全部、1部又は前駆体から成るポリペプチド又はイ
ンヒビンと同様な免疫学的又は生物学的活性を有するポ
リペプチドを生合成する方法を提供する。
【0029】好ましい態様として、該発現生成物は不活
性封入体として生成され、そし可溶性細胞たん白質から
の遠心分離によって細胞抽出物から精製される。好まし
い精製方法としては、プロテオリシス抑制剤および膜崩
壊剤を添加しそして密度勾配遠心分離に付することであ
る。必要に応じて、この精製封入体は可溶化されそして
放出されたたん白質は更に選択的分解および(または)
付加的精製等の処理に付することによって不用なたん白
質を除去しても良い。
性封入体として生成され、そし可溶性細胞たん白質から
の遠心分離によって細胞抽出物から精製される。好まし
い精製方法としては、プロテオリシス抑制剤および膜崩
壊剤を添加しそして密度勾配遠心分離に付することであ
る。必要に応じて、この精製封入体は可溶化されそして
放出されたたん白質は更に選択的分解および(または)
付加的精製等の処理に付することによって不用なたん白
質を除去しても良い。
【0030】更に又本発明は、プラスミドpBTA2
8,pBTA29,pBTA292およびpBTA29
6−pBTA310,pBTA472及びpBTA41
5−pBTA418で形質転換された細菌によって発現
されたインヒビン様たん白質を提供しよう。更に又本発
明は、薬学的に許容される形態又はその等価合成体の形
の、1種又はそれ以上の本発明の発現生成物を含む薬剤
組成物を提供する。
8,pBTA29,pBTA292およびpBTA29
6−pBTA310,pBTA472及びpBTA41
5−pBTA418で形質転換された細菌によって発現
されたインヒビン様たん白質を提供しよう。更に又本発
明は、薬学的に許容される形態又はその等価合成体の形
の、1種又はそれ以上の本発明の発現生成物を含む薬剤
組成物を提供する。
【0031】更に又本発明は、インヒビンの部分であ
り、そしてインヒビン作用薬又は拮抗薬となり得るかあ
るいは抗原性応答を誘発することができそしてFSH準
位又は生殖生理を左右するものとして使用することので
きる、合成ペプチドを包含する。組成物は経口投与ある
いは注射剤の形であるのが適当であり、そして好ましく
は薬学的に許容されるアジュバントを含有している。本
発明の薬剤組成物は又、徐放性の形態、特に移植に適当
でありそして脊椎動物中で徐放効果のあるものをも含有
する。この様な形態における組成物は脊椎動物中に移植
し生殖腺機能に作用させそして所望の効果が得られた後
にこれを除去することができる。
り、そしてインヒビン作用薬又は拮抗薬となり得るかあ
るいは抗原性応答を誘発することができそしてFSH準
位又は生殖生理を左右するものとして使用することので
きる、合成ペプチドを包含する。組成物は経口投与ある
いは注射剤の形であるのが適当であり、そして好ましく
は薬学的に許容されるアジュバントを含有している。本
発明の薬剤組成物は又、徐放性の形態、特に移植に適当
でありそして脊椎動物中で徐放効果のあるものをも含有
する。この様な形態における組成物は脊椎動物中に移植
し生殖腺機能に作用させそして所望の効果が得られた後
にこれを除去することができる。
【0032】本発明は又、薬学的に許容される形態にあ
る、1種又はそれ以上の発現たん白質を含有するワクチ
ンを提供する。本発明は又、本発明の薬剤組成物の有効
量を脊椎動物に投与することから成る、脊椎動物の生殖
腺機能を調整する方法を提供する。本発明は又、1種又
はそれ以上の本発明の発現生成物又は本発明の薬剤組成
物を脊椎動物に投与する免疫学的操作の結果得られる抗
体製剤を包含する。該抗体製剤としてはポリクローナル
およびモノクローナル抗体製剤を挙げることができる。
る、1種又はそれ以上の発現たん白質を含有するワクチ
ンを提供する。本発明は又、本発明の薬剤組成物の有効
量を脊椎動物に投与することから成る、脊椎動物の生殖
腺機能を調整する方法を提供する。本発明は又、1種又
はそれ以上の本発明の発現生成物又は本発明の薬剤組成
物を脊椎動物に投与する免疫学的操作の結果得られる抗
体製剤を包含する。該抗体製剤としてはポリクローナル
およびモノクローナル抗体製剤を挙げることができる。
【0033】本文および請求の範囲における語句の「イ
ンヒビン」とは非検特異性なものであり、従ってこれは
ウシ、ヒト、ヒツジ、ブタ、トリおよび魚等のインヒビ
ン関連種、特にヒトおよびウシインヒビンを包含するせ
のである。又該語句は非グリコシル化およびグリコシル
化インヒビン種も包含する。「脊椎動物」なる語句は魚
類、両生類、爬虫類、鳥類およびヒトを含む哺乳類の種
を包含する。 インヒビンのサブユニット構造 本文中に記載の様に、ろ胞液中に分泌されるインヒビン
は、2つのサブユニット、即ち43kDおよび51kD
のサブユニット(それぞれAおよびB)から成る58k
Dのたん白質である。A、すなわち43kD種は、ある
インヒビン種を他の種に投与した時に抗原として作用す
るであろう様に相違している種間における相同たん白質
である。この様に、異種インヒビンは後記する用途の抗
インヒビン抗体を生起せしめる様に使用することができ
ると考えられる。
ンヒビン」とは非検特異性なものであり、従ってこれは
ウシ、ヒト、ヒツジ、ブタ、トリおよび魚等のインヒビ
ン関連種、特にヒトおよびウシインヒビンを包含するせ
のである。又該語句は非グリコシル化およびグリコシル
化インヒビン種も包含する。「脊椎動物」なる語句は魚
類、両生類、爬虫類、鳥類およびヒトを含む哺乳類の種
を包含する。 インヒビンのサブユニット構造 本文中に記載の様に、ろ胞液中に分泌されるインヒビン
は、2つのサブユニット、即ち43kDおよび51kD
のサブユニット(それぞれAおよびB)から成る58k
Dのたん白質である。A、すなわち43kD種は、ある
インヒビン種を他の種に投与した時に抗原として作用す
るであろう様に相違している種間における相同たん白質
である。この様に、異種インヒビンは後記する用途の抗
インヒビン抗体を生起せしめる様に使用することができ
ると考えられる。
【0034】一方、Bサブユニットすなわち15kDサ
ブユニットは多くの種間において、例えばヒトおよびウ
シ種においてアミノ酸配列が実質的に同一である。ある
状況下においては、全たん白質は分子量20kDおよび
15kDの2つのサブユニット(それぞれAcおよび
B)から成る13kD型に切断される場合がある。この
31kD型はインヒビン活性を有しており、そして本発
明の範囲内に包含されるものである。58kD型を31
kD型に切断することによりAN 断片と呼ばれるポリペ
プチド断片が生成するが、これ自身生殖腺機能に重要な
作用をするので、これも又本発明の範囲内に包含され
る。
ブユニットは多くの種間において、例えばヒトおよびウ
シ種においてアミノ酸配列が実質的に同一である。ある
状況下においては、全たん白質は分子量20kDおよび
15kDの2つのサブユニット(それぞれAcおよび
B)から成る13kD型に切断される場合がある。この
31kD型はインヒビン活性を有しており、そして本発
明の範囲内に包含されるものである。58kD型を31
kD型に切断することによりAN 断片と呼ばれるポリペ
プチド断片が生成するが、これ自身生殖腺機能に重要な
作用をするので、これも又本発明の範囲内に包含され
る。
【0035】本文においては下記の略語を使用した。 ATP : アデノシントリフォスフェート bFF : ウシ卵胞液 bp : 塩基材 cDNA : 相補DNA CG : 絨毛ゴナドトロピン Ci : キューリー D : ダルトン dATP : 2′−デオキシアデノシントリフォスフ
ェート dCTP : 2′−デオキシシチジントリフォスフェ
ート dGTP : 2′−デオキシグアノシントリフォスフ
ェート DNA : デオキシリボ核酸 DTT : ジチオスレイトール dTTP : 2′−デオキシチミジントリフォスフェ
ート EDTA : エチレンジアミンテトラ酢酸 ELISA: エライサ(酵素結合免疫吸着分析) FSH : フォリトロピン又はろ泡刺激ホルモン XG : 重さの〜倍の力 g : グラム HPLC : 高速液体クロマトグラフィー k : (接頭語)キロ l : リットル M : モル濃度 m : (接頭語)ミリ mol : モル mRNA : メッセンジャーRNA p : (接頭語)ピコ n : (接頭語)ナノ PAGE : ポリアクリルアミドゲル電気泳動 PCMB : パラクロルメルクリ安息香酸 PMS : ヒト閉経後血清 PMSF : フェニルメチルスルホニルフルオライド PMSG : 妊馬血清ゴナドトロピン RIA : ラジオイムノアッセイ RNA : リボ核酸 RP−HPLC : 逆相 HPLC SDS : ドデシル硫酸ナトリウム SS : 去勢ウシ血清 Trie : トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタ
ン μ : (接頭語)ミクロ 尚本文においては起源又はグリコシル化の状態に関係な
く下記の通り用語を互換可能に定義しこれを使用した。
ェート dCTP : 2′−デオキシシチジントリフォスフェ
ート dGTP : 2′−デオキシグアノシントリフォスフ
ェート DNA : デオキシリボ核酸 DTT : ジチオスレイトール dTTP : 2′−デオキシチミジントリフォスフェ
ート EDTA : エチレンジアミンテトラ酢酸 ELISA: エライサ(酵素結合免疫吸着分析) FSH : フォリトロピン又はろ泡刺激ホルモン XG : 重さの〜倍の力 g : グラム HPLC : 高速液体クロマトグラフィー k : (接頭語)キロ l : リットル M : モル濃度 m : (接頭語)ミリ mol : モル mRNA : メッセンジャーRNA p : (接頭語)ピコ n : (接頭語)ナノ PAGE : ポリアクリルアミドゲル電気泳動 PCMB : パラクロルメルクリ安息香酸 PMS : ヒト閉経後血清 PMSF : フェニルメチルスルホニルフルオライド PMSG : 妊馬血清ゴナドトロピン RIA : ラジオイムノアッセイ RNA : リボ核酸 RP−HPLC : 逆相 HPLC SDS : ドデシル硫酸ナトリウム SS : 去勢ウシ血清 Trie : トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタ
ン μ : (接頭語)ミクロ 尚本文においては起源又はグリコシル化の状態に関係な
く下記の通り用語を互換可能に定義しこれを使用した。
【0036】Aサブユニット=43kDサブユニット=
58kDインヒビンの大サブユニット=アミノ酸His
1からIle300(図5及び図6)=アミノ酸Hi
s1からIle306(図9及び図10)。Acサブユ
ニット=20kDサブユニット−31kDインヒビンの
大サブユニット=アミノ酸Ser167からIle30
0(図5及び図6)=アミノ酸Ser172からIle
306(図9及び図10)。
58kDインヒビンの大サブユニット=アミノ酸His
1からIle300(図5及び図6)=アミノ酸Hi
s1からIle306(図9及び図10)。Acサブユ
ニット=20kDサブユニット−31kDインヒビンの
大サブユニット=アミノ酸Ser167からIle30
0(図5及び図6)=アミノ酸Ser172からIle
306(図9及び図10)。
【0037】An断片=AサブユニットのNH2 −末端
部=アミノ酸His1からArg166(図5)=アミ
ノ酸Hie1からArg171(図9)。Bサブユニッ
ト=15kDサブユニット=58kDおよび31kDイ
ンヒビンの小サブユニット=アミノ酸Gly 1からS
er116(第6および8図)。「同様な免疫学的活性
を有する」とは、インヒビン又はその1部の充分に相同
性のあるたん白質であって、(1)その受容菌の免疫系
が生来のたん白質と同様な反応性を有するか、あるいは
(2) これを投与した場合に内在インヒビンを認識可
能な該たん白質に対する抗体を生成し得る様なたん白質
を含めて意味するものである。
部=アミノ酸His1からArg166(図5)=アミ
ノ酸Hie1からArg171(図9)。Bサブユニッ
ト=15kDサブユニット=58kDおよび31kDイ
ンヒビンの小サブユニット=アミノ酸Gly 1からS
er116(第6および8図)。「同様な免疫学的活性
を有する」とは、インヒビン又はその1部の充分に相同
性のあるたん白質であって、(1)その受容菌の免疫系
が生来のたん白質と同様な反応性を有するか、あるいは
(2) これを投与した場合に内在インヒビンを認識可
能な該たん白質に対する抗体を生成し得る様なたん白質
を含めて意味するものである。
【0038】又、「インヒビンの部分」とはインヒビン
のサブユニットを含めて意味するものであると理解すべ
きである。本発明の方法および産生物を以下に実施例を
挙げて詳述するが、当業者においてはこれらを変更する
ことが可能であり、本発明は当然それらの変法等も良く
包含するものであることは言うまでもない。
のサブユニットを含めて意味するものであると理解すべ
きである。本発明の方法および産生物を以下に実施例を
挙げて詳述するが、当業者においてはこれらを変更する
ことが可能であり、本発明は当然それらの変法等も良く
包含するものであることは言うまでもない。
【0039】
実施例1 ウシ顆粒層細胞からのメッセンジャーRNA(mRN
A)の単離 全精巣および全卵巣または単離したセルトリ細胞および
顆粒層細胞をインヒビンmRNA源として使用すること
ができる。本例の場合単離した顆粒層細胞を使用した。 (a)顆粒層細胞の採取 針および注射器を使用して、地方畜殺場において新鮮な
ウシ卵巣の表面の大卵胞から、顆粒層細胞を含むウシ卵
胞液(bFF)を採取した。この液は採取後すぐに実験
室へ運ぶまでの間氷冷却保存した。70〜100mlの
bFFからの細胞を5分間500×Gで遠心分離して上
ずみ液を除去して生来インヒビンの精製をした。RNA
を下記の様にして細胞から抽出した。 (b) RNAの抽出と精製 採取後すぐに顆粒層細胞に24mlの4.2Mグアニジ
ウムイソチオシアネート/120mMメルカプトエタノ
ール/5%(v/v)サクロシル/10mMトリス−H
Cl(pH7.4)(Chirgwin,J.M.等
(1979年)のBiochemistry 18;5
294−5299)を加えてこれを溶解した。この溶解
産物をソルバール オムニミックス(Sorvall
Omnimix)中で速度4で30秒間ホモジナイズ
し、次に15分間20,000xGで遠心分離して細胞
細片を除去した。上ずみ液に2.5mlにつき1gのC
sClを加えた。この混合物を9mlの5.7M Cs
Cl/10mM EDTA/50mM トリス−HCl
(pH7.8)のクッションの上に置きそして65時間
15℃で122,000Gで遠心分離した。
A)の単離 全精巣および全卵巣または単離したセルトリ細胞および
顆粒層細胞をインヒビンmRNA源として使用すること
ができる。本例の場合単離した顆粒層細胞を使用した。 (a)顆粒層細胞の採取 針および注射器を使用して、地方畜殺場において新鮮な
ウシ卵巣の表面の大卵胞から、顆粒層細胞を含むウシ卵
胞液(bFF)を採取した。この液は採取後すぐに実験
室へ運ぶまでの間氷冷却保存した。70〜100mlの
bFFからの細胞を5分間500×Gで遠心分離して上
ずみ液を除去して生来インヒビンの精製をした。RNA
を下記の様にして細胞から抽出した。 (b) RNAの抽出と精製 採取後すぐに顆粒層細胞に24mlの4.2Mグアニジ
ウムイソチオシアネート/120mMメルカプトエタノ
ール/5%(v/v)サクロシル/10mMトリス−H
Cl(pH7.4)(Chirgwin,J.M.等
(1979年)のBiochemistry 18;5
294−5299)を加えてこれを溶解した。この溶解
産物をソルバール オムニミックス(Sorvall
Omnimix)中で速度4で30秒間ホモジナイズ
し、次に15分間20,000xGで遠心分離して細胞
細片を除去した。上ずみ液に2.5mlにつき1gのC
sClを加えた。この混合物を9mlの5.7M Cs
Cl/10mM EDTA/50mM トリス−HCl
(pH7.8)のクッションの上に置きそして65時間
15℃で122,000Gで遠心分離した。
【0040】RNAペレットを5mlの70%エタノー
ル/30%TE(1mM EDTA/10mM トリス
−HCl、pH7.5)で数回洗浄してCsClを除去
した。これを最後に0.3mlの3M酢酸ナトリウム
(pH7.5)と6mlのエタノールを加えて3mlの
TEから析出させて次に−70℃で凍結させそして10
分間20,000xGで遠心分離した。このRNAペレ
ットを1mlのTE中に再溶解し次で使用するまでの間
−70℃に保存した。 (c) mRNAの単離 オリゴdT セルロースクロマトグラフィーにより全R
NAからmRNAを抽出した。(Aviv,HおよびL
eder,P(1972年)によるProc,Nat
l,Acad,Sci,USA,69;1408−14
12)。まずRNAを1M NaCl/1mM EDT
A/20mMトリス−HCl(pH7.5)の溶液と
し、2分間70℃に加熱し、氷水中に急冷しそしてオリ
ゴdTセルロース(BRL)のカラム(乾燥床重量0.
5g)に供給した。画分からの流体を加熱し、冷却しそ
してこの操作を2回くり返した。カラムを5mlの負荷
緩衝液で次で0.5M NaClを加えた同緩衝液5m
lで順次洗浄した。mRNAが60℃でTE中に溶出し
た。画分(0.25ml)を集め、そのmRNA含有分
を酢酸ナトリウムおよびエタノール(上記参照)を使用
して析出させ、そしてペレットを真空乾燥した。mRN
Aを0.1mlのTE中に再溶解して部分標本(アリク
ウォット(25μl)を−70℃に凍結した。
ル/30%TE(1mM EDTA/10mM トリス
−HCl、pH7.5)で数回洗浄してCsClを除去
した。これを最後に0.3mlの3M酢酸ナトリウム
(pH7.5)と6mlのエタノールを加えて3mlの
TEから析出させて次に−70℃で凍結させそして10
分間20,000xGで遠心分離した。このRNAペレ
ットを1mlのTE中に再溶解し次で使用するまでの間
−70℃に保存した。 (c) mRNAの単離 オリゴdT セルロースクロマトグラフィーにより全R
NAからmRNAを抽出した。(Aviv,HおよびL
eder,P(1972年)によるProc,Nat
l,Acad,Sci,USA,69;1408−14
12)。まずRNAを1M NaCl/1mM EDT
A/20mMトリス−HCl(pH7.5)の溶液と
し、2分間70℃に加熱し、氷水中に急冷しそしてオリ
ゴdTセルロース(BRL)のカラム(乾燥床重量0.
5g)に供給した。画分からの流体を加熱し、冷却しそ
してこの操作を2回くり返した。カラムを5mlの負荷
緩衝液で次で0.5M NaClを加えた同緩衝液5m
lで順次洗浄した。mRNAが60℃でTE中に溶出し
た。画分(0.25ml)を集め、そのmRNA含有分
を酢酸ナトリウムおよびエタノール(上記参照)を使用
して析出させ、そしてペレットを真空乾燥した。mRN
Aを0.1mlのTE中に再溶解して部分標本(アリク
ウォット(25μl)を−70℃に凍結した。
【0041】これらの抽出および精製工程からのRNA
画分の全部をあわせ、その1〜2μg試料をアガロース
−尿素ゲル上の電気泳動により検査した。すなわち、5
M尿素と核0.01%(w/v)のトラッキング色素ブ
ロモフェノールブルーとキシレンシアノールFFとを含
有する10μlのTE中のRNA試料を2分間70℃に
加熱し、そして5.6M尿素/14mMヨード酢酸塩/
1mM EDTA/36mM NaH2 PO4 /40m
Mトリス−NaOH(pH7.4)を含有する1.5%
アガロースゲルの電気泳動に付した。ブロモフェノール
ブルー色素がゲルの底部に到達した時点で電気泳動を完
了し、そして臭化エチジウムの溶液を加えて着色後RN
Aを紫外線下に可視化した。
画分の全部をあわせ、その1〜2μg試料をアガロース
−尿素ゲル上の電気泳動により検査した。すなわち、5
M尿素と核0.01%(w/v)のトラッキング色素ブ
ロモフェノールブルーとキシレンシアノールFFとを含
有する10μlのTE中のRNA試料を2分間70℃に
加熱し、そして5.6M尿素/14mMヨード酢酸塩/
1mM EDTA/36mM NaH2 PO4 /40m
Mトリス−NaOH(pH7.4)を含有する1.5%
アガロースゲルの電気泳動に付した。ブロモフェノール
ブルー色素がゲルの底部に到達した時点で電気泳動を完
了し、そして臭化エチジウムの溶液を加えて着色後RN
Aを紫外線下に可視化した。
【0042】RNA濃度をその260nmにおける吸光
度により測定し、40μg/mlのRNAは1cmの光
路長を使用してのA260 が1.0であった。具体的に
は、60−100mlのbFFからは1−3g湿重量の
ペレット化顆粒層細胞が得られ、そしてこれから600
−900μgの全RNAおよび20−60μgのmRN
Aが抽出された。
度により測定し、40μg/mlのRNAは1cmの光
路長を使用してのA260 が1.0であった。具体的に
は、60−100mlのbFFからは1−3g湿重量の
ペレット化顆粒層細胞が得られ、そしてこれから600
−900μgの全RNAおよび20−60μgのmRN
Aが抽出された。
【0043】このmRNA画分はインヒビン、そのサブ
ユニット又はインヒビン様ポリペプチドに特異性のある
mRNAを含有しているが、このmRNA画分はその大
部分が不用である種々の非常に多くの異なるmRNA種
から成る混合物であることを理解すべきである。次のc
DNA合成および尾部形成の工程中にこれらの各々はイ
ンヒビン、そのサブユニット又はインヒビン様ポリペプ
チドに特異性のあるmRNAと同様に機能し、そしてこ
れらが存在する事が結局大量の不用クローンの生成の原
因となりために所望のクローン、すなわちインヒビンの
全部、1部又はサブユニットをコードするcDNA配列
を含有するクローンを同定するためのスクリーニング工
程が必要となる。
ユニット又はインヒビン様ポリペプチドに特異性のある
mRNAを含有しているが、このmRNA画分はその大
部分が不用である種々の非常に多くの異なるmRNA種
から成る混合物であることを理解すべきである。次のc
DNA合成および尾部形成の工程中にこれらの各々はイ
ンヒビン、そのサブユニット又はインヒビン様ポリペプ
チドに特異性のあるmRNAと同様に機能し、そしてこ
れらが存在する事が結局大量の不用クローンの生成の原
因となりために所望のクローン、すなわちインヒビンの
全部、1部又はサブユニットをコードするcDNA配列
を含有するクローンを同定するためのスクリーニング工
程が必要となる。
【0044】mRNAからのcDNAの生成工程および
これをベクターpBR322に導入する工程を図1に示
しそして実施例2および3に更に詳述したが、これは本
発明の1例の例示にすぎないものである。 実施例2 mRNAからのコピーDNA(cDNA)の合成 (a) 第1cDNA鎖の合成 dATPの不足した反応混合物を用意し、その小部分を
とり出してα−32PdATPを加えることによりcDN
A合成の様子をモニターした。次に過剰のdATPを主
反応混合物に添加し直して第1鎖の完全合成をした。即
ち、mRNA混合物の試料(2μg)を水を加えて27
μlとし2分間70℃に加熱し、そして氷水中に急冷し
た。500ngのオリゴdT10−17プライマー(B
oehringer)、各50nmolのdCTP,d
TTPおよびdGTP、5nmolのdATP、100
nmolのDTT、20単位のAMV逆転写酵素(Li
fe Science)、2μmolのKCl、400
nmolのMgCl2 および2.5molのトリス−H
Cl(pH8.5)から成る混合物23.5μlを加え
て反応を開始した。
これをベクターpBR322に導入する工程を図1に示
しそして実施例2および3に更に詳述したが、これは本
発明の1例の例示にすぎないものである。 実施例2 mRNAからのコピーDNA(cDNA)の合成 (a) 第1cDNA鎖の合成 dATPの不足した反応混合物を用意し、その小部分を
とり出してα−32PdATPを加えることによりcDN
A合成の様子をモニターした。次に過剰のdATPを主
反応混合物に添加し直して第1鎖の完全合成をした。即
ち、mRNA混合物の試料(2μg)を水を加えて27
μlとし2分間70℃に加熱し、そして氷水中に急冷し
た。500ngのオリゴdT10−17プライマー(B
oehringer)、各50nmolのdCTP,d
TTPおよびdGTP、5nmolのdATP、100
nmolのDTT、20単位のAMV逆転写酵素(Li
fe Science)、2μmolのKCl、400
nmolのMgCl2 および2.5molのトリス−H
Cl(pH8.5)から成る混合物23.5μlを加え
て反応を開始した。
【0045】混合後直ちに2μlの試料を0.5μlの
α−32P dATP(1800Ci/nmol;5μC
i/μl)を含有する別のチューブに入れて分析反応を
行い、そして0.5μlの60mM dATPを主反応
系に添加し直してこれを42℃に60分間保った。分析
反応系から0.5μlをとり出しエタノール−ドライア
イス浴中で急激に冷凍しこれを0時間のコントロール試
料とした。
α−32P dATP(1800Ci/nmol;5μC
i/μl)を含有する別のチューブに入れて分析反応を
行い、そして0.5μlの60mM dATPを主反応
系に添加し直してこれを42℃に60分間保った。分析
反応系から0.5μlをとり出しエタノール−ドライア
イス浴中で急激に冷凍しこれを0時間のコントロール試
料とした。
【0046】反応系の残りを42℃に60分間保ち、更
にその0.5μlを分析に供した。各放射性試料を0.
75M KH2 PO4 緩衝液(pH3.5)中ポリエチ
レンイミン(PEI)セルロース(Merck)の薄層
クロマトグラフィーに付した。オートラジオグラフィー
の結果を図2に示した。こうして非結合ヌクレオチドを
出発物中に残っている新たに合成した第1鎖(DNA−
RNAハイブリッド)から除去した。オートラジオグラ
フィー後に各スポットを切り出しそしてその結合放射能
を測定して結合能を評価した。総数の10%の結合(評
価 最大結合33%)又はそれ以上がcDNAの第2鎖
合成に充分な量であった。放射性物の残りを2M酢酸ア
ンモニウム/67%エタノールから2回析出させ、負荷
緩衝液(上記参照)中で2分間沸騰させた後にアガロー
ス−尿素ゲルの電気泳動に付してRNA鎖とDNA鎖を
分離した。このゲルを次にX−線フィルム(富士RX
型)のオートラジオグラフィーに付した。この工程によ
りcDNA生成物のサイズが決定されるが、これによる
と代表的なものは1000塩基以上から200塩基以下
の範囲であった。
にその0.5μlを分析に供した。各放射性試料を0.
75M KH2 PO4 緩衝液(pH3.5)中ポリエチ
レンイミン(PEI)セルロース(Merck)の薄層
クロマトグラフィーに付した。オートラジオグラフィー
の結果を図2に示した。こうして非結合ヌクレオチドを
出発物中に残っている新たに合成した第1鎖(DNA−
RNAハイブリッド)から除去した。オートラジオグラ
フィー後に各スポットを切り出しそしてその結合放射能
を測定して結合能を評価した。総数の10%の結合(評
価 最大結合33%)又はそれ以上がcDNAの第2鎖
合成に充分な量であった。放射性物の残りを2M酢酸ア
ンモニウム/67%エタノールから2回析出させ、負荷
緩衝液(上記参照)中で2分間沸騰させた後にアガロー
ス−尿素ゲルの電気泳動に付してRNA鎖とDNA鎖を
分離した。このゲルを次にX−線フィルム(富士RX
型)のオートラジオグラフィーに付した。この工程によ
りcDNA生成物のサイズが決定されるが、これによる
と代表的なものは1000塩基以上から200塩基以下
の範囲であった。
【0047】第1鎖合成は等業者に公知の他の方法によ
っても行うことができる。本例においてはオリゴdTを
プライマーとして使用してポリ(A)領域を有する全m
RNA種からの第1cDNA鎖を合成した。mRNA種
からcDNAを合成するために任意のプライマーを使用
することもできる。又別法として、インヒビンmRNA
の部分に相補性のある配列を有するプライマーを使用し
てのインヒビンcDNAの特異的合成も可能である。オ
リゴdT又はインヒビンmRNAの部分に相補性のある
配列を有する他のプライマーを第1鎖の合成用のプライ
マーとして使用することも出来る。 (b) 第2鎖の合成 第1cDNA鎖合成と同様にして、dATPの不足した
出発反応混合物から主反応および分析反応を行った。
っても行うことができる。本例においてはオリゴdTを
プライマーとして使用してポリ(A)領域を有する全m
RNA種からの第1cDNA鎖を合成した。mRNA種
からcDNAを合成するために任意のプライマーを使用
することもできる。又別法として、インヒビンmRNA
の部分に相補性のある配列を有するプライマーを使用し
てのインヒビンcDNAの特異的合成も可能である。オ
リゴdT又はインヒビンmRNAの部分に相補性のある
配列を有する他のプライマーを第1鎖の合成用のプライ
マーとして使用することも出来る。 (b) 第2鎖の合成 第1cDNA鎖合成と同様にして、dATPの不足した
出発反応混合物から主反応および分析反応を行った。
【0048】すなわち、第1ストランド主反応系のcD
NA−RNAハイブリッド分子をこれに50μlの3M
酢酸アンモニウム(pH7.5)および200μlのエ
タノールを加えることによって析出させ、−70℃に冷
却しそして15,000xGで5分間遠心分離した。こ
のペレットを50μlのTE中に再けん濁し、再析出さ
せ、これを乾燥しそして最後に50μlのTE中に取っ
た。
NA−RNAハイブリッド分子をこれに50μlの3M
酢酸アンモニウム(pH7.5)および200μlのエ
タノールを加えることによって析出させ、−70℃に冷
却しそして15,000xGで5分間遠心分離した。こ
のペレットを50μlのTE中に再けん濁し、再析出さ
せ、これを乾燥しそして最後に50μlのTE中に取っ
た。
【0049】これに、各16nmolのdCTP,dT
TPおよびdGTP、1nmolのdATP、3.5単
位のRNAアーゼH(BRL)、92単位のDNAポリ
メラーゼI(Boehringer)、40μgのBS
A、6nmolのβ−NAD、400nmolの(NH
4 )SO4 、4μmolのKCl、200nmolのM
gCl2 および800nmolのトリス−HClから成
る溶液(pH7.5)(Gubler,V.およびHo
ffman,B.J.(1983年)のGene 2
5;263−269)の350μlを加えた。
TPおよびdGTP、1nmolのdATP、3.5単
位のRNAアーゼH(BRL)、92単位のDNAポリ
メラーゼI(Boehringer)、40μgのBS
A、6nmolのβ−NAD、400nmolの(NH
4 )SO4 、4μmolのKCl、200nmolのM
gCl2 および800nmolのトリス−HClから成
る溶液(pH7.5)(Gubler,V.およびHo
ffman,B.J.(1983年)のGene 2
5;263−269)の350μlを加えた。
【0050】混合後直ちに2μlの試料を0.5μlの
α32PdATP(1800Ci/nmol;5μCi/
μl)を含有する別のチューブに入れて分析反応を行
い、そして2μlの10mM dATPを主反応系に添
加し直してこれを15℃に60分間次いで22℃に60
分間保った。0時間、1時間および2時間目に分析反応
系から0.5μlの試料をとり出しエタノール−ドライ
アイス浴中で急冷凍しそして第1鎖合成の場合(図2)
と同様にして薄層クロマトグラフィーにより分析した。
この第2鎖合成の結果、総数の少くとも5%の結合(評
価最大結合8%)が得られた。
α32PdATP(1800Ci/nmol;5μCi/
μl)を含有する別のチューブに入れて分析反応を行
い、そして2μlの10mM dATPを主反応系に添
加し直してこれを15℃に60分間次いで22℃に60
分間保った。0時間、1時間および2時間目に分析反応
系から0.5μlの試料をとり出しエタノール−ドライ
アイス浴中で急冷凍しそして第1鎖合成の場合(図2)
と同様にして薄層クロマトグラフィーにより分析した。
この第2鎖合成の結果、総数の少くとも5%の結合(評
価最大結合8%)が得られた。
【0051】第2鎖合成は当業者に公知の他の方法によ
って行うことができる。その例としては例えば次のよう
なものが挙げられる。本例の場合は、DNA/RNAハ
イブリッド中のRNAに特異性のあるRNAアーゼ(例
えばRNAアーゼH)をDNAポリメラーゼと一緒に使
用した。別法として、第1鎖合成の際に生成したDNA
/RNAハイブリッド中のRNAを化学的又は酵素的に
分解しあるいはDNAから単離し、DNAを自己プライ
マーとしても良い。次にDNAポリメラーゼ又は逆転写
酵素を使用して第2鎖合成を行い、残存するヘヤーピン
ループを1本鎖特異性R因子例えばS1ヌクレアーゼに
よって消化する。
って行うことができる。その例としては例えば次のよう
なものが挙げられる。本例の場合は、DNA/RNAハ
イブリッド中のRNAに特異性のあるRNAアーゼ(例
えばRNAアーゼH)をDNAポリメラーゼと一緒に使
用した。別法として、第1鎖合成の際に生成したDNA
/RNAハイブリッド中のRNAを化学的又は酵素的に
分解しあるいはDNAから単離し、DNAを自己プライ
マーとしても良い。次にDNAポリメラーゼ又は逆転写
酵素を使用して第2鎖合成を行い、残存するヘヤーピン
ループを1本鎖特異性R因子例えばS1ヌクレアーゼに
よって消化する。
【0052】第3の方法は、mRNAの除去又は分解の
後にオリゴヌクレオチド(例えばオリゴdC)尾部を第
1鎖DNA生成物の3′末端に付加する方法である。相
補オリゴヌクレオチド(例えばオリゴdG)を尾部にア
ニーリングしそしてこれをDNAポリメラーゼ又は逆転
写酵素による第2鎖反応のプライマーとして使用する。
インヒビンcDNAに相補の又は同一の又は類似の配列
を有する一本鎖又は2本鎖DNAは又クローンの化学合
成によっても作ることができる。 実施例3 E.コリ中におけるウシ顆粒層細胞cDNAライブラリ
ーの構築 (a) テイリングおよびアニーリングcDNA 40μlの3M酢酸ナトリウム(pH7.5)および8
00μlのエタノールを加えることによって第2鎖合成
で得られた2本鎖cDNAを析出させ、これを−70℃
に冷却しそして20,000xGで5分間遠心分離し
た。このペレットを50μlのTE中に再溶解し、等容
量のフェノール(TEで予め平衡化しておいた)で2回
抽出し、100μlのジエチルエーテル(TEで予め平
衡化しておいた)で3回抽出し次で50μlの4M酢酸
アンモニウムと200μlのエタノールを加えて析出さ
せそして−70℃に冷却した。この析出操作とは別に、
冷混合物を室温に戻し、15,000xGで5分間遠心
分離した。この操作は非結合ヌクレオチドを除去するた
めのものである。このペレットを50μlのTE中に溶
かしそして酢酸アンモニウムとエタノールを使用して析
出させた。ペレットを真空乾燥し30μlのTE中に再
けん濁させた。
後にオリゴヌクレオチド(例えばオリゴdC)尾部を第
1鎖DNA生成物の3′末端に付加する方法である。相
補オリゴヌクレオチド(例えばオリゴdG)を尾部にア
ニーリングしそしてこれをDNAポリメラーゼ又は逆転
写酵素による第2鎖反応のプライマーとして使用する。
インヒビンcDNAに相補の又は同一の又は類似の配列
を有する一本鎖又は2本鎖DNAは又クローンの化学合
成によっても作ることができる。 実施例3 E.コリ中におけるウシ顆粒層細胞cDNAライブラリ
ーの構築 (a) テイリングおよびアニーリングcDNA 40μlの3M酢酸ナトリウム(pH7.5)および8
00μlのエタノールを加えることによって第2鎖合成
で得られた2本鎖cDNAを析出させ、これを−70℃
に冷却しそして20,000xGで5分間遠心分離し
た。このペレットを50μlのTE中に再溶解し、等容
量のフェノール(TEで予め平衡化しておいた)で2回
抽出し、100μlのジエチルエーテル(TEで予め平
衡化しておいた)で3回抽出し次で50μlの4M酢酸
アンモニウムと200μlのエタノールを加えて析出さ
せそして−70℃に冷却した。この析出操作とは別に、
冷混合物を室温に戻し、15,000xGで5分間遠心
分離した。この操作は非結合ヌクレオチドを除去するた
めのものである。このペレットを50μlのTE中に溶
かしそして酢酸アンモニウムとエタノールを使用して析
出させた。ペレットを真空乾燥し30μlのTE中に再
けん濁させた。
【0053】15μlのcDNAに30nmolのCo
Cl2 、3nmolのDTT、1.5μmolのカコジ
ル酸カリウム(pH7.2)、5μgのウシ血清アルブ
ミン、30nmolのdCTPおよび17単位の末端ト
ランスフェラーゼ(BRL)を含有する緩衝液の等容量
を加えた。混合物を37℃で3〜5分間培養し、エタノ
ール−ドライアイス浴中で凍結し次で65℃で5分間加
熱した。この尾部形成DNAを次に使用するまで−20
℃で保存した。PstI制限酵素部位(BRLCat,
No.5355 SA)の3′突出末端上に約24個の
dG残基を有する市販のpBR322プラスミド分子
(図1;表2)中へのアニーリングとして公知の方法に
よってcDNA種を結合した。このアニーリング処理に
より、cDNAのdC尾部はプラスミドのdG尾部と安
定なハイブリッドを形成する。PstI部位はpBR3
22B−ラクタマーゼ遺伝子中にあるので、生成したプ
ラスミドはアンピシリン感受性であるが、テトラサイク
リンには尚耐性がある。
Cl2 、3nmolのDTT、1.5μmolのカコジ
ル酸カリウム(pH7.2)、5μgのウシ血清アルブ
ミン、30nmolのdCTPおよび17単位の末端ト
ランスフェラーゼ(BRL)を含有する緩衝液の等容量
を加えた。混合物を37℃で3〜5分間培養し、エタノ
ール−ドライアイス浴中で凍結し次で65℃で5分間加
熱した。この尾部形成DNAを次に使用するまで−20
℃で保存した。PstI制限酵素部位(BRLCat,
No.5355 SA)の3′突出末端上に約24個の
dG残基を有する市販のpBR322プラスミド分子
(図1;表2)中へのアニーリングとして公知の方法に
よってcDNA種を結合した。このアニーリング処理に
より、cDNAのdC尾部はプラスミドのdG尾部と安
定なハイブリッドを形成する。PstI部位はpBR3
22B−ラクタマーゼ遺伝子中にあるので、生成したプ
ラスミドはアンピシリン感受性であるが、テトラサイク
リンには尚耐性がある。
【0054】アニーリング操作において、2.5μlの
dC尾部付cDNAと約0.5μgのdG尾部付pBR
322とを0.1M NaCl含有TEの50μl中で
65℃に5分間加熱し、次で57℃に2時間培養した。
次に溶液を1時間以上かけて徐々に室温に冷却しこれを
次に使用するまでの間氷上に保存するか又は−20℃で
冷凍保存した。
dC尾部付cDNAと約0.5μgのdG尾部付pBR
322とを0.1M NaCl含有TEの50μl中で
65℃に5分間加熱し、次で57℃に2時間培養した。
次に溶液を1時間以上かけて徐々に室温に冷却しこれを
次に使用するまでの間氷上に保存するか又は−20℃で
冷凍保存した。
【0055】cDNA種のベクター分子中への挿入は当
業者に公知の他の方法によっても行うことができる。例
えば、テイリングとして知られている末端トランスフェ
ラーゼ反応を使用してヌクレオチドをDNA分子の3′
末端に付加することができる。これらの分子を次に相補
配列でテイリングしたベクターDNA分子でアニーリン
グすることができる。これとは別にcDNA分子は、制
限酵素で切断した時に、クローニングに好都合な配列を
生成するDNAリガーゼによって付加された合成リンカ
ーを有していても良い。又別に、cDNAは直接制限酵
素又はDNAアーゼで切断して直接クローニングに供し
ても良い。又平滑末端DNA分子はベクター中に直接ク
ローニングしても良く、この様なベクターとしてはプラ
スミド、コスミド、バクテリオファージおよび他のビー
ルス等が挙げられる。 (b) 組換えプラスミドによるE.コリED8654
の形質転換 E.コリED8654(表2)をD.Hanahanの
方法(1983年、J.Mol,Biol,160,5
57−580)により処理して反応能を付与し、この反
応性細胞の0.2mlを10μlのアニーリングしたc
DNA−pBR322ハイブリッドで形質転換した。形
質転換後、細胞を2mlのSOC(5g/lの酵素エキ
ス/20g/lのトリプトン/10mMのNaCl/
2.5mMのKCl/20mMのMgCl2 /20mM
のMgSO4 /20mMのグルコース)中で2時間生長
させ、次で2,000xGで5分間遠心分離し、0.5
mlの0.85% NaCl中に再けん濁し、そして全
けん濁液と、pBR322組換えプラスミドで形質転換
した細胞を選択するために、10μg/mlのテトラサ
イクリン−HClを含有する280mmのLB(1リッ
トルにつき5gの酵素エキス/10gのトリプトン/5
gのNaCl)寒天(1リットルにつき15gの寒天)
板上に載置した。こうして37℃で48時間培養した。
この方法により、代表的な例としてこの形質転換により
組換えプラスミドpBR322 1μgにつき約5×1
03 〜5×104 個のコロニー、あるいはcDNA1μ
gにつき約104 〜105 個のコロニーが生成すること
になる。又14個のテトラサイクリン耐性コロニーから
のプラスミドの任意のスクリーニングにより測定したと
ころ、形質転換体の78%以上が組換えプラスミドを含
有していた。 (c) 形質転換細胞の保存 各培養板からのコロニーを10mlのLB中にかき落し
た。推定2000の独立した形質転換の結果生成した細
胞を集め、1,500xGで5分間遠心分離し、0.5
mlのDMSOを加えた5mlのLB(v/v)中へ再
けん濁した。この一部(0.4ml)を液体窒素中で凍
結し、次に使用するまで−70℃で保存した。こうし
て、この様な5個のプールを作成した。
業者に公知の他の方法によっても行うことができる。例
えば、テイリングとして知られている末端トランスフェ
ラーゼ反応を使用してヌクレオチドをDNA分子の3′
末端に付加することができる。これらの分子を次に相補
配列でテイリングしたベクターDNA分子でアニーリン
グすることができる。これとは別にcDNA分子は、制
限酵素で切断した時に、クローニングに好都合な配列を
生成するDNAリガーゼによって付加された合成リンカ
ーを有していても良い。又別に、cDNAは直接制限酵
素又はDNAアーゼで切断して直接クローニングに供し
ても良い。又平滑末端DNA分子はベクター中に直接ク
ローニングしても良く、この様なベクターとしてはプラ
スミド、コスミド、バクテリオファージおよび他のビー
ルス等が挙げられる。 (b) 組換えプラスミドによるE.コリED8654
の形質転換 E.コリED8654(表2)をD.Hanahanの
方法(1983年、J.Mol,Biol,160,5
57−580)により処理して反応能を付与し、この反
応性細胞の0.2mlを10μlのアニーリングしたc
DNA−pBR322ハイブリッドで形質転換した。形
質転換後、細胞を2mlのSOC(5g/lの酵素エキ
ス/20g/lのトリプトン/10mMのNaCl/
2.5mMのKCl/20mMのMgCl2 /20mM
のMgSO4 /20mMのグルコース)中で2時間生長
させ、次で2,000xGで5分間遠心分離し、0.5
mlの0.85% NaCl中に再けん濁し、そして全
けん濁液と、pBR322組換えプラスミドで形質転換
した細胞を選択するために、10μg/mlのテトラサ
イクリン−HClを含有する280mmのLB(1リッ
トルにつき5gの酵素エキス/10gのトリプトン/5
gのNaCl)寒天(1リットルにつき15gの寒天)
板上に載置した。こうして37℃で48時間培養した。
この方法により、代表的な例としてこの形質転換により
組換えプラスミドpBR322 1μgにつき約5×1
03 〜5×104 個のコロニー、あるいはcDNA1μ
gにつき約104 〜105 個のコロニーが生成すること
になる。又14個のテトラサイクリン耐性コロニーから
のプラスミドの任意のスクリーニングにより測定したと
ころ、形質転換体の78%以上が組換えプラスミドを含
有していた。 (c) 形質転換細胞の保存 各培養板からのコロニーを10mlのLB中にかき落し
た。推定2000の独立した形質転換の結果生成した細
胞を集め、1,500xGで5分間遠心分離し、0.5
mlのDMSOを加えた5mlのLB(v/v)中へ再
けん濁した。この一部(0.4ml)を液体窒素中で凍
結し、次に使用するまで−70℃で保存した。こうし
て、この様な5個のプールを作成した。
【0056】各原形質転換体はmRNA画分中にあるm
RNA種の1個の完全又は部分コピー由来の1個の組換
えDNA種を含有しているので、これら形質転換体の集
合体すなわちプールはライブラリーと呼ばれる。本例の
場合、ウシ顆粒層細胞cDNAのライブラリーがE.コ
リ中に形成されたことになる。真核細胞は約1×104
〜2×104 の別種のたん白質を生成することができる
ので、104 個の独立の形質転換体の集合体はそれ以上
の多数のmRNA種の全部に由来したものを含むことに
なる。事実、これらのライブラリー中の極めて大量の細
胞の大部分は本発明には不用のcDNAを含有してお
り、その内のわずかのものがインヒビンmRNA種の完
全又は部分コピーを含有しているので、これらのコロニ
ーを同定し単離するために次の工程を行う。 実施例4 インヒビンクローンライブラリーのスクリーニング (a) スクリーニング用ライブラリーの調製 冷凍細胞のチューブを解凍し5×105 倍に希釈しその
0.5mlを10μg/mlのテトラサイクリン−HC
lを含有する280mmのLB寒天板の表面上に広げ、
1晩37℃で培養した。こうして1培養板あたり約10
4 個のコロニーが生成し、原ライブラリー中の各形質転
換体は1〜5倍に増加した。転写レプリカをニトロセル
ロースフィルター(Schleicher−Schue
ll)上に置き、墨につけた針をフィルターを通して寒
天中に突き刺すことによって定位マークをつけた。母培
養板を次に使用するまで4℃に保存し、一方レプリカフ
ィルターを10μg/mlのケトラサイクリン−HCl
を含有する新しいLB寒天板の上にかぶせて8時間培養
した。次でこれを50μg/mlのクロラムフェニコー
ルを含有するLB寒天板上に転写し、組換えプラスミド
の細胞1個あたりのコピー数を増加させるために1晩培
養した(Clewell,D.E.(1972年)の
J.Bacteriol,110;667−676;H
anahan,DおよびMeselson,M(198
0年)のGene 10,63−67)。このフィルタ
ーをGrunstein,MおよびHogness,
D.S.らの方法(1975年、Proc,Natl,
Acad,Sci,USA 72,3961−396
5)の変法で処理した。
RNA種の1個の完全又は部分コピー由来の1個の組換
えDNA種を含有しているので、これら形質転換体の集
合体すなわちプールはライブラリーと呼ばれる。本例の
場合、ウシ顆粒層細胞cDNAのライブラリーがE.コ
リ中に形成されたことになる。真核細胞は約1×104
〜2×104 の別種のたん白質を生成することができる
ので、104 個の独立の形質転換体の集合体はそれ以上
の多数のmRNA種の全部に由来したものを含むことに
なる。事実、これらのライブラリー中の極めて大量の細
胞の大部分は本発明には不用のcDNAを含有してお
り、その内のわずかのものがインヒビンmRNA種の完
全又は部分コピーを含有しているので、これらのコロニ
ーを同定し単離するために次の工程を行う。 実施例4 インヒビンクローンライブラリーのスクリーニング (a) スクリーニング用ライブラリーの調製 冷凍細胞のチューブを解凍し5×105 倍に希釈しその
0.5mlを10μg/mlのテトラサイクリン−HC
lを含有する280mmのLB寒天板の表面上に広げ、
1晩37℃で培養した。こうして1培養板あたり約10
4 個のコロニーが生成し、原ライブラリー中の各形質転
換体は1〜5倍に増加した。転写レプリカをニトロセル
ロースフィルター(Schleicher−Schue
ll)上に置き、墨につけた針をフィルターを通して寒
天中に突き刺すことによって定位マークをつけた。母培
養板を次に使用するまで4℃に保存し、一方レプリカフ
ィルターを10μg/mlのケトラサイクリン−HCl
を含有する新しいLB寒天板の上にかぶせて8時間培養
した。次でこれを50μg/mlのクロラムフェニコー
ルを含有するLB寒天板上に転写し、組換えプラスミド
の細胞1個あたりのコピー数を増加させるために1晩培
養した(Clewell,D.E.(1972年)の
J.Bacteriol,110;667−676;H
anahan,DおよびMeselson,M(198
0年)のGene 10,63−67)。このフィルタ
ーをGrunstein,MおよびHogness,
D.S.らの方法(1975年、Proc,Natl,
Acad,Sci,USA 72,3961−396
5)の変法で処理した。
【0057】細胞分解と一本鎖DNAの形成促進のため
に、このフィルターを、0.5MNaOH/1.5M
NaCl中で飽和したワットマン3MM(Whatma
n3MM)紙上に15分間かぶせて置き、次いで1.5
M NaCl/0.5Mトリス−HCl(pH7.5)
中で飽和した紙を2回交換して15分間中和した。これ
らを空気乾燥し、ブワナーろう斗の上に置き、次いで2
0mlのCHCl3 で飽和して吸引した。次いでフィル
ターを80℃で2時間真空オーブン中で焼いた。 (b) 方法 インヒビンcDNA遺伝子又はその1部を含有するクロ
ーンを同定するために、放射能標識したオリゴデオキシ
リボヌクレオチド(オリゴヌクレオチド)プローブを使
用した。これらは、各43kDおよび15kDサブユニ
ットのN末端アミノ酸配列をコードするmRNAの部分
に相補性がある様にしたものである(プローブ1および
5、図3)。43kDおよび15kDサブユニットのN
H2 末端配列は、完全58kDインヒビンおよびその単
離サブユニットの配列のアミノ酸由来のものであり、そ
れぞれの最初の16個のアミノ酸は国際特許出願PCT
/AU 85/00119に記載してある。次いで、完
全58kDインヒビンのミノ酸配列から43kDサブユ
ニットのアミノ酸配列(これはpBTA22およびpB
TA23中の配列のcDNAによって決定されたもので
ある一実施例6A参照)を除去することにより、表2に
示した15kDサブユニット原分析を改良し拡大するこ
とが出来た。この改良によりオリゴヌクレオチドプロー
ブの作成に有用な別の区域、20〜24個を含めてのア
ミノ酸の区域が明らかとなった。図3は作成したオリゴ
ヌクレオチドプローブ(プローブ2)を示す。これは2
4倍変性の14量体であり、pBTA293およびpB
TA294の単離用に使用した。各アミノ酸(メチオニ
ンとトリプトファンを除く)はそれに特異性のある1個
より多くのDNAコドンを有しているので、プローブ中
には可能なすべての組合わせのコドンを入っていること
が好ましい。こうして、インヒビンの大サブユニット用
に選択したアミノ酸配列の大部分をコードする64個の
可能なDNA配列(プローブ1、図3)とインヒビンの
小サブユニット用選択したアミノ酸配列の大部分をコー
ドする24個の可能なDNA配列(プローブ2、図3)
がある。これら配列の各々の代表的な分子を得る可能性
を最大とするために、5′末端から2および6位置にお
いて、dGおよびdA又はdTおよびdA又はdGおよ
びdG又はdTおよびdGのどちらかを有する4個の独
立の合成体から集めた。プローブ2は単一バッチ中で合
成した。 (c) オリゴヌクレオチドの合成および精製 オリゴヌクレオチドプローブはDNA自動合成装置(モ
デル380A、Applied Biosystems
Inc.製)を使用して合成した。この装置は、最初
にMatteucci,M.D.およびCarulhe
re,M.H.により開発された方法(1981年、
J.Amer,Chem,Soc,103,3185−
3191)に従って、N,N′−ジイソプロピルホスホ
ルアミジトデオキシリボヌクレオチド誘導体を派生制御
多孔性ガラス支持体に配列に従って結合する様に入力し
ておいた。
に、このフィルターを、0.5MNaOH/1.5M
NaCl中で飽和したワットマン3MM(Whatma
n3MM)紙上に15分間かぶせて置き、次いで1.5
M NaCl/0.5Mトリス−HCl(pH7.5)
中で飽和した紙を2回交換して15分間中和した。これ
らを空気乾燥し、ブワナーろう斗の上に置き、次いで2
0mlのCHCl3 で飽和して吸引した。次いでフィル
ターを80℃で2時間真空オーブン中で焼いた。 (b) 方法 インヒビンcDNA遺伝子又はその1部を含有するクロ
ーンを同定するために、放射能標識したオリゴデオキシ
リボヌクレオチド(オリゴヌクレオチド)プローブを使
用した。これらは、各43kDおよび15kDサブユニ
ットのN末端アミノ酸配列をコードするmRNAの部分
に相補性がある様にしたものである(プローブ1および
5、図3)。43kDおよび15kDサブユニットのN
H2 末端配列は、完全58kDインヒビンおよびその単
離サブユニットの配列のアミノ酸由来のものであり、そ
れぞれの最初の16個のアミノ酸は国際特許出願PCT
/AU 85/00119に記載してある。次いで、完
全58kDインヒビンのミノ酸配列から43kDサブユ
ニットのアミノ酸配列(これはpBTA22およびpB
TA23中の配列のcDNAによって決定されたもので
ある一実施例6A参照)を除去することにより、表2に
示した15kDサブユニット原分析を改良し拡大するこ
とが出来た。この改良によりオリゴヌクレオチドプロー
ブの作成に有用な別の区域、20〜24個を含めてのア
ミノ酸の区域が明らかとなった。図3は作成したオリゴ
ヌクレオチドプローブ(プローブ2)を示す。これは2
4倍変性の14量体であり、pBTA293およびpB
TA294の単離用に使用した。各アミノ酸(メチオニ
ンとトリプトファンを除く)はそれに特異性のある1個
より多くのDNAコドンを有しているので、プローブ中
には可能なすべての組合わせのコドンを入っていること
が好ましい。こうして、インヒビンの大サブユニット用
に選択したアミノ酸配列の大部分をコードする64個の
可能なDNA配列(プローブ1、図3)とインヒビンの
小サブユニット用選択したアミノ酸配列の大部分をコー
ドする24個の可能なDNA配列(プローブ2、図3)
がある。これら配列の各々の代表的な分子を得る可能性
を最大とするために、5′末端から2および6位置にお
いて、dGおよびdA又はdTおよびdA又はdGおよ
びdG又はdTおよびdGのどちらかを有する4個の独
立の合成体から集めた。プローブ2は単一バッチ中で合
成した。 (c) オリゴヌクレオチドの合成および精製 オリゴヌクレオチドプローブはDNA自動合成装置(モ
デル380A、Applied Biosystems
Inc.製)を使用して合成した。この装置は、最初
にMatteucci,M.D.およびCarulhe
re,M.H.により開発された方法(1981年、
J.Amer,Chem,Soc,103,3185−
3191)に従って、N,N′−ジイソプロピルホスホ
ルアミジトデオキシリボヌクレオチド誘導体を派生制御
多孔性ガラス支持体に配列に従って結合する様に入力し
ておいた。
【0058】Applied Biosystems
Inc.社処方の方法を使用した。ホスホルアミジトデ
オキシリボヌクレオチドを単一派生塩基で置き換えて、
変性オリゴヌクレオチドを生成した。20%(w/v)
アクリルアミド/1.0%(w/v)N,N′−ビスア
クリルアミド/1mM EDTA/50mMトリス−H
Cl(固体ほう酸でpH8.3に調整)を含有するゲル
(20cm×20cm×1.5mm)中の調製用電気泳
動により、早期に停止したオリゴヌクレオチドからこの
オリゴヌクレオチドを精製した。電気泳動は500Vで
1.5時間行い、次でUV光で検出可能な様にこのゲル
をキーゼルゲルF254(Merek)薄層クロマトグ
ラフィー上に置いて可視化した。オリゴヌクレオチドは
暗バンドを示す。これらを切り取り、0.8mlの無菌
水中で1晩ゲルから溶出した。溶出オリゴヌクレオチド
の濃度は260nmの吸光度の測定により推定され、こ
れは1cmの光路長を使用してのA260 が1.0である
ことから、35μg/ml濃度の一本鎖DNAである。 (d) 5′末端標識反応32 P−標識りん酸塩基をその5′末端に付加することに
より、精製オリゴヌクレオチドを放射能活性にした。
Inc.社処方の方法を使用した。ホスホルアミジトデ
オキシリボヌクレオチドを単一派生塩基で置き換えて、
変性オリゴヌクレオチドを生成した。20%(w/v)
アクリルアミド/1.0%(w/v)N,N′−ビスア
クリルアミド/1mM EDTA/50mMトリス−H
Cl(固体ほう酸でpH8.3に調整)を含有するゲル
(20cm×20cm×1.5mm)中の調製用電気泳
動により、早期に停止したオリゴヌクレオチドからこの
オリゴヌクレオチドを精製した。電気泳動は500Vで
1.5時間行い、次でUV光で検出可能な様にこのゲル
をキーゼルゲルF254(Merek)薄層クロマトグ
ラフィー上に置いて可視化した。オリゴヌクレオチドは
暗バンドを示す。これらを切り取り、0.8mlの無菌
水中で1晩ゲルから溶出した。溶出オリゴヌクレオチド
の濃度は260nmの吸光度の測定により推定され、こ
れは1cmの光路長を使用してのA260 が1.0である
ことから、35μg/ml濃度の一本鎖DNAである。 (d) 5′末端標識反応32 P−標識りん酸塩基をその5′末端に付加することに
より、精製オリゴヌクレオチドを放射能活性にした。
【0059】すなわち、40pmolのオリゴヌクレオ
チドと40pmolのγ−32P ATP(2000Ci
/mmol;5μCi/μl)を凍結乾燥し次で溶解し
そして4単位のT4 ポリヌクレオチドキナーゼ/10m
MのMgCl2 /10mMのDTT/1mMのスペルミ
ジン/50mMのトリス−HCl(pH7.5)を含有
する緩衝液の20μl中で90分間37℃で培養した。
チドと40pmolのγ−32P ATP(2000Ci
/mmol;5μCi/μl)を凍結乾燥し次で溶解し
そして4単位のT4 ポリヌクレオチドキナーゼ/10m
MのMgCl2 /10mMのDTT/1mMのスペルミ
ジン/50mMのトリス−HCl(pH7.5)を含有
する緩衝液の20μl中で90分間37℃で培養した。
【0060】放射性オリゴヌクレオチドを上記の様にし
て精製しそして富士RX型X−線フィルム上で5分間オ
ートラジオグラフィーにより可視化した。1.8mlの
無菌水中で1晩溶出した。プローブ1も一緒に含む4個
のオリゴヌクレオチド集合体(実施例1b参照)の各々
をこの段階では別々に処理し次いでこれらを一緒にし
た。
て精製しそして富士RX型X−線フィルム上で5分間オ
ートラジオグラフィーにより可視化した。1.8mlの
無菌水中で1晩溶出した。プローブ1も一緒に含む4個
のオリゴヌクレオチド集合体(実施例1b参照)の各々
をこの段階では別々に処理し次いでこれらを一緒にし
た。
【0061】
【表2】
【0062】58KDインヒビンを還元し、アルキル化
しそして分離したサブユニットをSDS−PAGEゲル
からの電気溶出により単離した。58KDインヒビン
(80pmol)、Aサブユニット(17pmol)お
よびBサブユニット(6pmol)をガス連続相中でエ
ドマン分解した。 (Xaa)=cDNA配列から決定したアミノ酸。
しそして分離したサブユニットをSDS−PAGEゲル
からの電気溶出により単離した。58KDインヒビン
(80pmol)、Aサブユニット(17pmol)お
よびBサブユニット(6pmol)をガス連続相中でエ
ドマン分解した。 (Xaa)=cDNA配列から決定したアミノ酸。
【0063】Xaa* =58KDインヒビンの2重配列
からAサブユニット配列を除去することにより同定した
アミノ酸。 オリゴヌクレオチドプローブ型を作るのに使った領域に
下線を付した。 (e) ライブラリーのスクリーニングのためのプロー
ブの使用 放射性プローブの各組を40mlの5×SSC/10×
デンハルト溶液中にとり、各ライブラリーの代表的な1
つのフィルターを、ゆっくり攪拌しながら1晩この溶液
中に浸した。(尚、20×SSCは3MのNaCl/
0.3Mのクエン酸トリナトリウム(pH7.0)であ
り、50×デンハルト溶液は1%(w/v)フイコール
/1%(w/v)ポリビニルピロリドン/1%(w/
v)ウシ血清アルブミンである。)フィルターを1×S
SC/0.1%SDS(トデシル硫酸ナトリウム)で数
回室温下に洗浄し富士RX型X線フィルムおよびデュポ
ンCronex Hi Plus強化スクリーンを使用
して−70℃で3〜5時間オートラジオグラフィー処理
した。フィルムを現像し、フィルターを再度1×SSC
/0.1%SDSで37℃で洗浄し次いで1晩オートラ
ジオグラフィーに付した。
からAサブユニット配列を除去することにより同定した
アミノ酸。 オリゴヌクレオチドプローブ型を作るのに使った領域に
下線を付した。 (e) ライブラリーのスクリーニングのためのプロー
ブの使用 放射性プローブの各組を40mlの5×SSC/10×
デンハルト溶液中にとり、各ライブラリーの代表的な1
つのフィルターを、ゆっくり攪拌しながら1晩この溶液
中に浸した。(尚、20×SSCは3MのNaCl/
0.3Mのクエン酸トリナトリウム(pH7.0)であ
り、50×デンハルト溶液は1%(w/v)フイコール
/1%(w/v)ポリビニルピロリドン/1%(w/
v)ウシ血清アルブミンである。)フィルターを1×S
SC/0.1%SDS(トデシル硫酸ナトリウム)で数
回室温下に洗浄し富士RX型X線フィルムおよびデュポ
ンCronex Hi Plus強化スクリーンを使用
して−70℃で3〜5時間オートラジオグラフィー処理
した。フィルムを現像し、フィルターを再度1×SSC
/0.1%SDSで37℃で洗浄し次いで1晩オートラ
ジオグラフィーに付した。
【0064】室温における洗浄後に背景部よりも強度が
強いかあるいは37℃における洗浄後に尚可視状態であ
り、かつ母培養板上のコロニーの位置に相当する区域が
潜在インヒビンクローンであるとみなされた。上記実施
例はインヒビン又はインヒビン様DNA配列を含有する
細胞の製造手段および方法のいくつかを例示したもので
あって、その変法を除外するものではない。例えば、出
発DNAとしてゲノムDNAを使用しcDNA合成を必
要としない場合もある(実施例8参照)。又、クローン
化DNA断片を発現させそして抗インヒビン抗血清を使
用し(実施例10参照)あるいはインヒビン又はインヒ
ビン様生物学的活性を直接検出することによりスクリー
ニング操作を行う様なクローニングベクターであっても
良い。この様な方法は当業者に周知である。 実施例5 推定クローンの特定 (a) 潜在インヒビンクローンの精製 オートラジオグラムによる暗色スポットに相当する区域
を拾い出し、10μg/mlのテトラサイクリン−HC
lを含有するLB板上で単一コロニーの筋をつけ37℃
で16時間培養した。これら培養板のレプリカは次に使
用するまで4℃に保存した。フィルターをテトラサイク
リン−HCl含有LB寒天上に3〜6時間置き、50μ
g/mlのクロラムフェニコール含有LB寒天に16時
間転写し、次でコロニーを上記の様にして分解し、再度
放射性オリゴヌクレオチドプローブを使用してスクリー
ニングした。これらのフィルターからオートダイアグラ
ム上の最暗色スポットに相当する単一コロニーを拾い出
しこれに筋付けをして分析した。 (b) プラスミドDNAの制限地図 各推定インヒビンの少くとも1個の単離体のプラスミド
DNA含有量を、制限酵素PstIで抽出および消化す
ることにより分析した。この酵素はプラスミドから挿入
cDNAを放出しそして更に内部PstI部位において
該cDNAを切断する。プラスミドDNA抽出はBir
nboimおよびDolyの方法(1979年,Nuc
l.Acids Res.7;1513−1523)に
従った。3mlのLB中で1晩培養した細胞を遠心分離
し0.2mlの分解緩衝液(50mM グルコース/1
0mM EDTA/0.2%リゾチーム/25mMトリ
ス−HCl、pH8.0)中に再けん濁しそして0℃で
10分間培養した。これに0.4mlのアルカリ性SD
S(0.2M NaOH/1%(w/v)SDS)を加
え、そして0℃で10分間保持後に0.3mlの3M酢
酸ナトリウム(pH4.8)を加えた。0℃で15〜3
0分後に、生成した沈でん物を遠心分離により除去し
た。0.7mlのイソプロパノールを加え、−70℃に
冷却しそして15,000xGで5分間遠心分離するこ
とにより0.8mlの上ずみ液中のプラスミドを析出さ
せた。このペレットを0.4mlのTE中に再溶解し、
次いで40μlの3M酢酸ナトリウム(pH7.5)と
0.8mlのエタノールとを加えそして上記の様にして
冷却し遠心分離することにより沈でんを析出させた。最
終的に得られたペレットを真空乾燥して0.2mlのT
E中に溶解した。10μg/mlのRNAアーゼAを含
有する40μl(最終容量)のTA緩衝液(66mM酢
酸カリウム/10mM酢酸マグネシウム/0.5mMD
TT/0.1mg/mlBSA/33mMトリス・酢酸
塩(pH7.9)中、37℃で60分間試料(20μ
l)を20単位のPstI(Boehringer)で
消化し、次いでTBE緩衝液(2.5mM EDTA/
133mMトリス−HCl/89mMほう酸)中でポリ
アクリルアミドゲル(10%までのアクリルアミド/
0.27%ビスアクリルアミド)上で電気泳動した。A
luI(Boehringer)で消化したpBR32
2の試料を標準体として使用した。最初に同定されたク
ローンを表3に示した。 (c) 配列決定法 適当な制限酵素断片(1個又はそれ以上の酵素Pst
I、PvuII、Seu3AI又はSmaI由来のも
の)を0.5M酢酸アンモニウム/10mM酢酸マグネ
シウム/0.1M EDTA/0.1% SDS中、3
7℃で1晩溶出することによりポリアクリルアミドゲル
から精製し、次いでエタノールで析出させ、TE中に再
溶解し、そしてこれをサブクローニングして、万能プラ
イマー(17量体;#1211又は#1212;New
England Biolabs製)又はcDNA自
身に相補性のあるオリゴヌクレオチドプライマーを使用
するSanger F、等のジデオキシ鎖末端法(19
7年、Proc,Natl,Acad,Sci,USA
74,5463〜5467)により配列決定用のバク
テリオファーズM13mp8およびM13mp9の複製
型分子とした。前記オリゴヌクレオチドプライマーはと
りわけ重複cDNA種の単離や重複cDNA種からの公
知配列の抗張やあるいはdG/dC尾部からcDNAの
中央部への配列決定に有用である。
強いかあるいは37℃における洗浄後に尚可視状態であ
り、かつ母培養板上のコロニーの位置に相当する区域が
潜在インヒビンクローンであるとみなされた。上記実施
例はインヒビン又はインヒビン様DNA配列を含有する
細胞の製造手段および方法のいくつかを例示したもので
あって、その変法を除外するものではない。例えば、出
発DNAとしてゲノムDNAを使用しcDNA合成を必
要としない場合もある(実施例8参照)。又、クローン
化DNA断片を発現させそして抗インヒビン抗血清を使
用し(実施例10参照)あるいはインヒビン又はインヒ
ビン様生物学的活性を直接検出することによりスクリー
ニング操作を行う様なクローニングベクターであっても
良い。この様な方法は当業者に周知である。 実施例5 推定クローンの特定 (a) 潜在インヒビンクローンの精製 オートラジオグラムによる暗色スポットに相当する区域
を拾い出し、10μg/mlのテトラサイクリン−HC
lを含有するLB板上で単一コロニーの筋をつけ37℃
で16時間培養した。これら培養板のレプリカは次に使
用するまで4℃に保存した。フィルターをテトラサイク
リン−HCl含有LB寒天上に3〜6時間置き、50μ
g/mlのクロラムフェニコール含有LB寒天に16時
間転写し、次でコロニーを上記の様にして分解し、再度
放射性オリゴヌクレオチドプローブを使用してスクリー
ニングした。これらのフィルターからオートダイアグラ
ム上の最暗色スポットに相当する単一コロニーを拾い出
しこれに筋付けをして分析した。 (b) プラスミドDNAの制限地図 各推定インヒビンの少くとも1個の単離体のプラスミド
DNA含有量を、制限酵素PstIで抽出および消化す
ることにより分析した。この酵素はプラスミドから挿入
cDNAを放出しそして更に内部PstI部位において
該cDNAを切断する。プラスミドDNA抽出はBir
nboimおよびDolyの方法(1979年,Nuc
l.Acids Res.7;1513−1523)に
従った。3mlのLB中で1晩培養した細胞を遠心分離
し0.2mlの分解緩衝液(50mM グルコース/1
0mM EDTA/0.2%リゾチーム/25mMトリ
ス−HCl、pH8.0)中に再けん濁しそして0℃で
10分間培養した。これに0.4mlのアルカリ性SD
S(0.2M NaOH/1%(w/v)SDS)を加
え、そして0℃で10分間保持後に0.3mlの3M酢
酸ナトリウム(pH4.8)を加えた。0℃で15〜3
0分後に、生成した沈でん物を遠心分離により除去し
た。0.7mlのイソプロパノールを加え、−70℃に
冷却しそして15,000xGで5分間遠心分離するこ
とにより0.8mlの上ずみ液中のプラスミドを析出さ
せた。このペレットを0.4mlのTE中に再溶解し、
次いで40μlの3M酢酸ナトリウム(pH7.5)と
0.8mlのエタノールとを加えそして上記の様にして
冷却し遠心分離することにより沈でんを析出させた。最
終的に得られたペレットを真空乾燥して0.2mlのT
E中に溶解した。10μg/mlのRNAアーゼAを含
有する40μl(最終容量)のTA緩衝液(66mM酢
酸カリウム/10mM酢酸マグネシウム/0.5mMD
TT/0.1mg/mlBSA/33mMトリス・酢酸
塩(pH7.9)中、37℃で60分間試料(20μ
l)を20単位のPstI(Boehringer)で
消化し、次いでTBE緩衝液(2.5mM EDTA/
133mMトリス−HCl/89mMほう酸)中でポリ
アクリルアミドゲル(10%までのアクリルアミド/
0.27%ビスアクリルアミド)上で電気泳動した。A
luI(Boehringer)で消化したpBR32
2の試料を標準体として使用した。最初に同定されたク
ローンを表3に示した。 (c) 配列決定法 適当な制限酵素断片(1個又はそれ以上の酵素Pst
I、PvuII、Seu3AI又はSmaI由来のも
の)を0.5M酢酸アンモニウム/10mM酢酸マグネ
シウム/0.1M EDTA/0.1% SDS中、3
7℃で1晩溶出することによりポリアクリルアミドゲル
から精製し、次いでエタノールで析出させ、TE中に再
溶解し、そしてこれをサブクローニングして、万能プラ
イマー(17量体;#1211又は#1212;New
England Biolabs製)又はcDNA自
身に相補性のあるオリゴヌクレオチドプライマーを使用
するSanger F、等のジデオキシ鎖末端法(19
7年、Proc,Natl,Acad,Sci,USA
74,5463〜5467)により配列決定用のバク
テリオファーズM13mp8およびM13mp9の複製
型分子とした。前記オリゴヌクレオチドプライマーはと
りわけ重複cDNA種の単離や重複cDNA種からの公
知配列の抗張やあるいはdG/dC尾部からcDNAの
中央部への配列決定に有用である。
【0065】配列決定、サブクローニングおよび発現操
作(実施例10参照)のすべてにわたって制限酵素はT
A(実施例5B参照)中で使用し、T4リガーゼはその
メーカー処方に従って使用した。
作(実施例10参照)のすべてにわたって制限酵素はT
A(実施例5B参照)中で使用し、T4リガーゼはその
メーカー処方に従って使用した。
【0066】
【表3】
【0067】(a) Biotechnology A
uetralie Pty,Ltd.Culture
Collectionのコード名。 (b) 「サイズ」(記載がある場合において)とは、
AluIで消化したpBR322標準体に対するポリア
クリルアミドゲル上における電気泳動から推定したbp
値を表わす。この値はDNA配列から得られる実際の大
きさから少し違っている。 (c) Murray,N.K.等(1977年)、M
ol.Gen.Genet.150;53−61。 (d) Bolivar,F等(1977年)のGen
e 2;95−113。 (e) BTA647=E,コリ K12,hed R
K ,sup E44,supF58,lacY1,ga
lT22,galK2,trpR55/F′lac
lq ,Δ(lacZ)M15,lacY+ A+ ,pro
A+ B+ ,tra+ 。 (f) Ruther,UおよびMuller−Hil
l,B,(1983年)のEMBO J,2;1791
−1794。 (g) BTA634=E,コリ K12 Δ(la
c,pro),sup E(glnV),thi,lo
n−1,zaj::Tn5/F′proA+ B+ ,la
cIq ,Δ(lacZ)M15,lacY+ A+ ,tr
aD36。 (h) pBTA286は、2355個の塩基対のHp
aI−AvaI DNA断片がlacZ遺伝子のコード
配列から除去されてそのコード配列が枠内に残るように
したpUR291の誘導体である。 (l) BTA652−E,コリK12 Δ((la
c,pro),thi- ,supE(glnV)44,
hsdPk17 endAl,gyrA96,relA
l/F′,proA+ B+ ,lacIq ,Δ(lac
Z)M15,lacY+ A+ ,traD36。 (j) Viera,J,およびMessing,J,
(1989年)のGene 19,259−268。 (k) BTA545=E,コリK12 tri- ,Δ
(lac,ergF),U169,Δ(lon)10
0,hf1150,zje/zjf::Tn10,rp
sL,hsdPk/F′lacIq ,Δ(lacZ)M
15,lacY+ A+ ,proA+ B+ ,tra+ 。 (l) BTA637=BTA652,lon−1,z
aj;;Tn5,L(m)Cepko et al(1
984)Cell 37,1053−1062。 実施例6 インヒビンクローン (a) A(43kD)サブユニットクローン 43−kDサブユニットの部分をコードする2個のプラ
スミドpBTA22およびpBTA23を、プローブ1
(図3) 使用して最初に作った。これらのcDNAの
配列分析の結果これらは充分な長さではなかったので、
pBTA22(プローブ3)からの5′位およびpBT
A23(プローブ4)からの3′位に伸びるcDNAを
単離するために特異性オリゴヌクレオチドプローブを作
った。pBTA290はプローブ3を使用して単離し、
一方pBTA30とpBTA295はプローブ4を使用
して単離した。
uetralie Pty,Ltd.Culture
Collectionのコード名。 (b) 「サイズ」(記載がある場合において)とは、
AluIで消化したpBR322標準体に対するポリア
クリルアミドゲル上における電気泳動から推定したbp
値を表わす。この値はDNA配列から得られる実際の大
きさから少し違っている。 (c) Murray,N.K.等(1977年)、M
ol.Gen.Genet.150;53−61。 (d) Bolivar,F等(1977年)のGen
e 2;95−113。 (e) BTA647=E,コリ K12,hed R
K ,sup E44,supF58,lacY1,ga
lT22,galK2,trpR55/F′lac
lq ,Δ(lacZ)M15,lacY+ A+ ,pro
A+ B+ ,tra+ 。 (f) Ruther,UおよびMuller−Hil
l,B,(1983年)のEMBO J,2;1791
−1794。 (g) BTA634=E,コリ K12 Δ(la
c,pro),sup E(glnV),thi,lo
n−1,zaj::Tn5/F′proA+ B+ ,la
cIq ,Δ(lacZ)M15,lacY+ A+ ,tr
aD36。 (h) pBTA286は、2355個の塩基対のHp
aI−AvaI DNA断片がlacZ遺伝子のコード
配列から除去されてそのコード配列が枠内に残るように
したpUR291の誘導体である。 (l) BTA652−E,コリK12 Δ((la
c,pro),thi- ,supE(glnV)44,
hsdPk17 endAl,gyrA96,relA
l/F′,proA+ B+ ,lacIq ,Δ(lac
Z)M15,lacY+ A+ ,traD36。 (j) Viera,J,およびMessing,J,
(1989年)のGene 19,259−268。 (k) BTA545=E,コリK12 tri- ,Δ
(lac,ergF),U169,Δ(lon)10
0,hf1150,zje/zjf::Tn10,rp
sL,hsdPk/F′lacIq ,Δ(lacZ)M
15,lacY+ A+ ,proA+ B+ ,tra+ 。 (l) BTA637=BTA652,lon−1,z
aj;;Tn5,L(m)Cepko et al(1
984)Cell 37,1053−1062。 実施例6 インヒビンクローン (a) A(43kD)サブユニットクローン 43−kDサブユニットの部分をコードする2個のプラ
スミドpBTA22およびpBTA23を、プローブ1
(図3) 使用して最初に作った。これらのcDNAの
配列分析の結果これらは充分な長さではなかったので、
pBTA22(プローブ3)からの5′位およびpBT
A23(プローブ4)からの3′位に伸びるcDNAを
単離するために特異性オリゴヌクレオチドプローブを作
った。pBTA290はプローブ3を使用して単離し、
一方pBTA30とpBTA295はプローブ4を使用
して単離した。
【0068】PstI地図およびプラスミドから挿入c
DNAの配列決定の方法を図4に示し、Aサブユニット
をコードする複合ヌクレオチド配列を図5に示した。こ
の配列はプラスミドpBTA290とpBTA295か
らのcDNA中に完全に含まれる。pBTA30の41
0bp断片は停止コドンと、その次の、dG/dC尾部
の前の3′−非翻訳区域の6塩基とを含む。Aサブユニ
ットのHielをコードするCATはpBTA22,p
BTA23およびpBTA290の5′−PstI,c
DNA断片中に存在するが、pBTA30の240又は
300塩基対PstI cDNA断片のどちらかの中に
は存在しない。これら2つの断片は他のクローンと同様
に開放読み枠又は配列を含有しないので、スプライシン
グしていないイントロンの部分中に存在していても良
い。
DNAの配列決定の方法を図4に示し、Aサブユニット
をコードする複合ヌクレオチド配列を図5に示した。こ
の配列はプラスミドpBTA290とpBTA295か
らのcDNA中に完全に含まれる。pBTA30の41
0bp断片は停止コドンと、その次の、dG/dC尾部
の前の3′−非翻訳区域の6塩基とを含む。Aサブユニ
ットのHielをコードするCATはpBTA22,p
BTA23およびpBTA290の5′−PstI,c
DNA断片中に存在するが、pBTA30の240又は
300塩基対PstI cDNA断片のどちらかの中に
は存在しない。これら2つの断片は他のクローンと同様
に開放読み枠又は配列を含有しないので、スプライシン
グしていないイントロンの部分中に存在していても良
い。
【0069】cDNA配列は1〜1140番目の塩基の
開放読み枠を含有している。この読み枠においては、第
1のATGは61番目塩基(Met−60)にありそし
てMet−60に続くアミノ酸配列がシグナルペプチド
を表わすものであるが、多くのシグナルペプチドと異な
って、疎水性ロイシンのストリングの前にはアルギニン
又はリジンはない(Watson,M.E.E.(19
84年)のNucl,Ac.Res.12,5145−
5164)。このシグナルペプチドは、His−1の前
の約40個ほどのアミノ酸のプロペプチドを残してGl
y−44とGly−41の間で終るものと思われる。こ
うして、インヒビンのAサブユニットは最初に、Met
−60からIle−300に伸びる38,810ダルト
ンのプレプロたん白質として合成される。
開放読み枠を含有している。この読み枠においては、第
1のATGは61番目塩基(Met−60)にありそし
てMet−60に続くアミノ酸配列がシグナルペプチド
を表わすものであるが、多くのシグナルペプチドと異な
って、疎水性ロイシンのストリングの前にはアルギニン
又はリジンはない(Watson,M.E.E.(19
84年)のNucl,Ac.Res.12,5145−
5164)。このシグナルペプチドは、His−1の前
の約40個ほどのアミノ酸のプロペプチドを残してGl
y−44とGly−41の間で終るものと思われる。こ
うして、インヒビンのAサブユニットは最初に、Met
−60からIle−300に伸びる38,810ダルト
ンのプレプロたん白質として合成される。
【0070】Aサブユニットは、たん白質前駆体のたん
白質分解用の共通シグナルである、アルギニン残基対
(−2,−1)における切断によってその前駆体から得
られる(Steiner,D.F等(1980年)のA
nn.N.Y.Acad.Sci.343,1−1
6)。このAサブユニットプロたん白質は、−6、−
5、8、9および165、166位に3個の別のアルギ
ニン残基対を含有している。Aサブユニットの165お
よび166残基における切断により、本文中AN および
AC として示す同サイズの2個の切断が生成するであろ
う。AC 断片は31−kDaウシインヒビンの20−k
Daサブユニットから成る(実施例9参照)。Aサブユ
ニットは11個のシステイン残基を含有するものと思わ
れ、その内の4個はHislからArg166までのA
N 断片中にある。これら4個の残基は内部結合してお
り、AC サブユニットからAN 断片を除去することを可
能にしていると思われる。AC サブユニットは7個のシ
ステインを含有しており、その内の少くとも1個はBサ
ブユニットとジスルフイド結合を形成するものと思われ
る。サブユニットAはその認識配列Asn−X−Ser
/Thrに基づきAsn80およびAsn202に2個
の潜在N−グリコシル化部位を有しており(Wogh,
P.V.およびBahl,O.P.(1981年)のC
RC Crit,Rev,Biochem,10,30
7−377)、そしてAsn202がAC サブユニット
中に含まれる。サブユニットAおよびAC のたん白質鎖
の予想分子量は32,298および14,624であ
り、これは天然インヒビンのSDS−PAGEにより推
定されるもの(それぞれ43−kDおよび20−kD)
よりも約25%少ない。これは幾分、その分子重量およ
び分子容量が両方とも変化可能であるものと分子中の炭
水化物含有量に起因するものであると思われる。これら
の違いから、AN およびAC の両部分とも、たぶんAs
n80およびAsn202においてグリコシル化されて
いると思われるが、セリンおよびスレオニン残基のO−
結合グルコシル化があるかどうかについては不明であ
る。糖たん白質ホルモンのウシLH、ヒトCGおよびP
MSGの炭水化物含量はそれぞれ16,29−31およ
び45重量%であるとされている(Pierce,J.
GおよびPorson,T.F.(1981年)のAn
n,Rev,Biochem,50;465−495)
ので、本発明においてはこれが見かけ分子重量の約25
%であることからその範囲の下限になることになる。
白質分解用の共通シグナルである、アルギニン残基対
(−2,−1)における切断によってその前駆体から得
られる(Steiner,D.F等(1980年)のA
nn.N.Y.Acad.Sci.343,1−1
6)。このAサブユニットプロたん白質は、−6、−
5、8、9および165、166位に3個の別のアルギ
ニン残基対を含有している。Aサブユニットの165お
よび166残基における切断により、本文中AN および
AC として示す同サイズの2個の切断が生成するであろ
う。AC 断片は31−kDaウシインヒビンの20−k
Daサブユニットから成る(実施例9参照)。Aサブユ
ニットは11個のシステイン残基を含有するものと思わ
れ、その内の4個はHislからArg166までのA
N 断片中にある。これら4個の残基は内部結合してお
り、AC サブユニットからAN 断片を除去することを可
能にしていると思われる。AC サブユニットは7個のシ
ステインを含有しており、その内の少くとも1個はBサ
ブユニットとジスルフイド結合を形成するものと思われ
る。サブユニットAはその認識配列Asn−X−Ser
/Thrに基づきAsn80およびAsn202に2個
の潜在N−グリコシル化部位を有しており(Wogh,
P.V.およびBahl,O.P.(1981年)のC
RC Crit,Rev,Biochem,10,30
7−377)、そしてAsn202がAC サブユニット
中に含まれる。サブユニットAおよびAC のたん白質鎖
の予想分子量は32,298および14,624であ
り、これは天然インヒビンのSDS−PAGEにより推
定されるもの(それぞれ43−kDおよび20−kD)
よりも約25%少ない。これは幾分、その分子重量およ
び分子容量が両方とも変化可能であるものと分子中の炭
水化物含有量に起因するものであると思われる。これら
の違いから、AN およびAC の両部分とも、たぶんAs
n80およびAsn202においてグリコシル化されて
いると思われるが、セリンおよびスレオニン残基のO−
結合グルコシル化があるかどうかについては不明であ
る。糖たん白質ホルモンのウシLH、ヒトCGおよびP
MSGの炭水化物含量はそれぞれ16,29−31およ
び45重量%であるとされている(Pierce,J.
GおよびPorson,T.F.(1981年)のAn
n,Rev,Biochem,50;465−495)
ので、本発明においてはこれが見かけ分子重量の約25
%であることからその範囲の下限になることになる。
【0071】cDNA配列から42塩基のmRNA中の
3′−非翻訳領域が予測出来る。これはポリ(A)尾部
の前の典型的なポリアデニル化シグナル(AATAA
A)16塩基を含む(Nevins,J.R.(198
3年)のAnn,Rev,Biochem,52,44
1−466)。その3′−非翻訳領域は、コード配列
(66.3%G+C)および5′−非翻訳領域(71.
6%G+C)と異なり、A+Tが多い(40.4%G+
C)。 (b) B(15kD)サブユニットクローン 5個の異なるクローンをプローブ2で検出し、その代表
的な2つ(pBTA293およびpBTA294)から
成熟BサブユニットをコードするcDNAを図4に示し
た。他の3つのクローンは、pBTA293と同様の制
限型を有しているが、但しその5′−PstI断片がよ
り短いものであるcDNAを含有していた。
3′−非翻訳領域が予測出来る。これはポリ(A)尾部
の前の典型的なポリアデニル化シグナル(AATAA
A)16塩基を含む(Nevins,J.R.(198
3年)のAnn,Rev,Biochem,52,44
1−466)。その3′−非翻訳領域は、コード配列
(66.3%G+C)および5′−非翻訳領域(71.
6%G+C)と異なり、A+Tが多い(40.4%G+
C)。 (b) B(15kD)サブユニットクローン 5個の異なるクローンをプローブ2で検出し、その代表
的な2つ(pBTA293およびpBTA294)から
成熟BサブユニットをコードするcDNAを図4に示し
た。他の3つのクローンは、pBTA293と同様の制
限型を有しているが、但しその5′−PstI断片がよ
り短いものであるcDNAを含有していた。
【0072】BサブユニットcDNA(図7〜8)のヌ
クレオチド配列はpBTA293およびpBTA294
配列に原初的に由来するものであり、また、プローブ6
(図3B)を用いてpBTA306pBTA307(図
24)のそれに重ね合うcDNAが得られた。Bサブユ
ニットは、425アミノ酸(図25)からなるプレ−プ
ロ蛋白質として合成されるが、Acサブユニットと同様
に、その各プロ蛋白質のC末端である。これは5個の連
続するアルキニン残基だけその前節から分離される。こ
れはB、14および102、103位に2対のリジン残
基を含有しているが、反応部位はありそうにもない(S
teiner,D.F.等(1980年)の上記文
献)。9個のシステイン残基があり、そして奇数はその
少なくとも1つがAcサブユニットと架橋可能であるこ
とを示している。このcDNA配列から、Bサブユニッ
トのたん白質鎖は12,977ダルトンの分子量を有す
ることが予想され、これは生素のBサブユニットのSD
S−PAGEから予測される見かけ分子量14,900
に近い。成熟Bサブユニット中にははっきりしたN−グ
リコシル化配列はないが、そのプレプロ蛋白質中のAs
n−145はグリコシル化可能である。
クレオチド配列はpBTA293およびpBTA294
配列に原初的に由来するものであり、また、プローブ6
(図3B)を用いてpBTA306pBTA307(図
24)のそれに重ね合うcDNAが得られた。Bサブユ
ニットは、425アミノ酸(図25)からなるプレ−プ
ロ蛋白質として合成されるが、Acサブユニットと同様
に、その各プロ蛋白質のC末端である。これは5個の連
続するアルキニン残基だけその前節から分離される。こ
れはB、14および102、103位に2対のリジン残
基を含有しているが、反応部位はありそうにもない(S
teiner,D.F.等(1980年)の上記文
献)。9個のシステイン残基があり、そして奇数はその
少なくとも1つがAcサブユニットと架橋可能であるこ
とを示している。このcDNA配列から、Bサブユニッ
トのたん白質鎖は12,977ダルトンの分子量を有す
ることが予想され、これは生素のBサブユニットのSD
S−PAGEから予測される見かけ分子量14,900
に近い。成熟Bサブユニット中にははっきりしたN−グ
リコシル化配列はないが、そのプレプロ蛋白質中のAs
n−145はグリコシル化可能である。
【0073】シグナルペプチドの長さは確実には分から
ないが、Gly−282がシグナルペプチドの最後のア
ミノ酸であると考えられる。これらペプチドの生理活性
能力を示すプロー蛋白質には、可能な蛋白質加水分解開
裂部位が幾つかある。Bサブユニットの3′−非翻訳領
域は94ヌクレオチドの長さであり、Aサブユニットを
コードするcDNAの様なAATAAAポリアデニル化
シグナルはない。ポリ(A)尾部の前の3′−非翻訳領
域の最後の12塩基は、同様にAATAAA配列を有し
ていないエリスロポイエチン3′−非翻訳cDNA(A
CTGAAACCACC)の最後の12塩基と良く調和
する(Jacobs,K.等(1985年)のNatu
re,313,806−810)。Bサブユニットの
5′−非翻訳領のG+C含有量は50%であるが、プレ
プロBサブユニットコード領域のG+C含有量は56.
8%でありそして3′−非翻訳領域のそれと同じ位(5
5.3%)であり、これはAサブユニットコード配列お
よび3′−非翻訳領域においてみられた違いとは異なっ
ている。 実施例7 ゲノムDNA中のウシインヒビン様配列の同定 ウシインヒビンの大(43kD)および小(15kD)
サブユニットをコードする遺伝子と同様か又は相同の配
列を、ヒト、ヒツジ、ブタ、魚およびトリゲノムDNA
中で同定した。
ないが、Gly−282がシグナルペプチドの最後のア
ミノ酸であると考えられる。これらペプチドの生理活性
能力を示すプロー蛋白質には、可能な蛋白質加水分解開
裂部位が幾つかある。Bサブユニットの3′−非翻訳領
域は94ヌクレオチドの長さであり、Aサブユニットを
コードするcDNAの様なAATAAAポリアデニル化
シグナルはない。ポリ(A)尾部の前の3′−非翻訳領
域の最後の12塩基は、同様にAATAAA配列を有し
ていないエリスロポイエチン3′−非翻訳cDNA(A
CTGAAACCACC)の最後の12塩基と良く調和
する(Jacobs,K.等(1985年)のNatu
re,313,806−810)。Bサブユニットの
5′−非翻訳領のG+C含有量は50%であるが、プレ
プロBサブユニットコード領域のG+C含有量は56.
8%でありそして3′−非翻訳領域のそれと同じ位(5
5.3%)であり、これはAサブユニットコード配列お
よび3′−非翻訳領域においてみられた違いとは異なっ
ている。 実施例7 ゲノムDNA中のウシインヒビン様配列の同定 ウシインヒビンの大(43kD)および小(15kD)
サブユニットをコードする遺伝子と同様か又は相同の配
列を、ヒト、ヒツジ、ブタ、魚およびトリゲノムDNA
中で同定した。
【0074】これは主としてSouthern Blo
t標準交雑法(ManiatisT.等(1982年)
のMolecular Cloning,Cold S
pring Harbour)に従って行った。なわ
ち、ゲノムDNAを制限酵素で消化し、得られた断片を
アガロースゲルの電気泳動によりその大きさ別に分け
る。DNAをニトロセルロース(又は他のものでも良
い)膜上に転写し、次いでこれを、43kD又は15k
Dウシインヒビンサブユニットの実質的な部分をコード
する〔32P〕−標識 cDNAで調べる。この結果、ヌ
クレオチド配列と類似か又は同一のゲノムDNA段片が
検出される。
t標準交雑法(ManiatisT.等(1982年)
のMolecular Cloning,Cold S
pring Harbour)に従って行った。なわ
ち、ゲノムDNAを制限酵素で消化し、得られた断片を
アガロースゲルの電気泳動によりその大きさ別に分け
る。DNAをニトロセルロース(又は他のものでも良
い)膜上に転写し、次いでこれを、43kD又は15k
Dウシインヒビンサブユニットの実質的な部分をコード
する〔32P〕−標識 cDNAで調べる。この結果、ヌ
クレオチド配列と類似か又は同一のゲノムDNA段片が
検出される。
【0075】具体的には次の様である。ゲノムDNAを
ヒトマイクロファージ細胞系U937(ATCC CR
L 1539)からか、又はヒト血液、ブタ血液および
トリ血液からか、又はウシおよびヒツジ軟組織から作成
した。軟組織およびヒト細胞系からの作成にはmani
atis,T.等の前記文献等に記載の方法を使用し
た。血液からはDNAは次の様にして作成した。10〜
15mlの血液(0.625%のクエン酸塩添加)を1
0mM EDTA/10mMトリス・HCl(pH7.
5)(TE10−10)の***液で40mlに希釈し、
氷上に5分間置いて血液細胞を分解した。4000xG
で5分間遠心分離した後に、ペレットを10mlの冷T
E10−10液中に再けん濁し、TE10−10で40
mlに希釈しそして3000×Gで5分間遠心分離し
た。このペレットを10mMトリス・HCl(pH7.
5)/5mM EDTA(出発血液と同容量)中で解こ
うした。10%SDSを加えて0.5%にし、プロティ
ナーゼKを加えて50μg/mlにし、次いでこの混合
物をゆっくり振とうしながら1晩37℃で培養した。
0.1%8−ヒドロキシキノリンを含有する0.1mM
トリス−HClで飽和したフェノールの10mlを加え
て室温で5〜10分間ゆっくりと混合した。CHC
l3 :イソアシルアルコール(24:1)の10mlを
加えて5〜10分間混合し、次いで室温で10分間80
00×Gで遠心分離した。水相を15mlのCHC
H3 :イソアシルアルコールで更に2回再抽出した。1
/20倍量の5M NaClと2倍量のエタノールとを
室温で加えて混合した。DNAをパスツールピベットで
取り出し、30−60秒間空気乾燥し、そして3時間3
7℃でゆっくり攪拌することによって4mlのTE中に
溶解した。このDNAを上記の様にして再析出させそし
て3mlのTE中に再溶解した。
ヒトマイクロファージ細胞系U937(ATCC CR
L 1539)からか、又はヒト血液、ブタ血液および
トリ血液からか、又はウシおよびヒツジ軟組織から作成
した。軟組織およびヒト細胞系からの作成にはmani
atis,T.等の前記文献等に記載の方法を使用し
た。血液からはDNAは次の様にして作成した。10〜
15mlの血液(0.625%のクエン酸塩添加)を1
0mM EDTA/10mMトリス・HCl(pH7.
5)(TE10−10)の***液で40mlに希釈し、
氷上に5分間置いて血液細胞を分解した。4000xG
で5分間遠心分離した後に、ペレットを10mlの冷T
E10−10液中に再けん濁し、TE10−10で40
mlに希釈しそして3000×Gで5分間遠心分離し
た。このペレットを10mMトリス・HCl(pH7.
5)/5mM EDTA(出発血液と同容量)中で解こ
うした。10%SDSを加えて0.5%にし、プロティ
ナーゼKを加えて50μg/mlにし、次いでこの混合
物をゆっくり振とうしながら1晩37℃で培養した。
0.1%8−ヒドロキシキノリンを含有する0.1mM
トリス−HClで飽和したフェノールの10mlを加え
て室温で5〜10分間ゆっくりと混合した。CHC
l3 :イソアシルアルコール(24:1)の10mlを
加えて5〜10分間混合し、次いで室温で10分間80
00×Gで遠心分離した。水相を15mlのCHC
H3 :イソアシルアルコールで更に2回再抽出した。1
/20倍量の5M NaClと2倍量のエタノールとを
室温で加えて混合した。DNAをパスツールピベットで
取り出し、30−60秒間空気乾燥し、そして3時間3
7℃でゆっくり攪拌することによって4mlのTE中に
溶解した。このDNAを上記の様にして再析出させそし
て3mlのTE中に再溶解した。
【0076】このDNAの試料(普通10μg)を、5
00単位/mlまでの酵素を使用し16時間培養して、
40〜50μg/mlの濃度でそのメーカー指示の処方
に従って、種々の制限酵素で切断した。生成物を、等量
のフェノールで抽出し次いでクロロホルムで3回抽出し
て2.5倍量のエタノール含有0.2M NaCl中で
析出することによってたん白質の除去を行った。DNA
ペレットを水中に溶解しそしてTAE緩衝液中11×1
4cmの1%アガロースゲル上の電気泳動(75ボルト
/4時間)によりサイズ分画した。このゲルを1.5M
NaCl/0.5M NaOHの溶液中に45分間浸
漬し次いで3.0M NaCl/0.5Mトリス・HC
l(pH7)中で2×45分間中和することによってD
NAを変性した。このDNAを毛管作用によりニトロセ
ルロース膜(Schleicher−Schuell)
に転写し、真空中80℃で2時間加熱して固定した。フ
ィルターを50%ホルムアミドと5倍のSSPE(Ma
niatis等の前記文献)と5倍のデンハルト(De
nhardt)と25μg/mlの音波処理したにしん
***DNAとから成る溶液で2−4時間前交雑した。
00単位/mlまでの酵素を使用し16時間培養して、
40〜50μg/mlの濃度でそのメーカー指示の処方
に従って、種々の制限酵素で切断した。生成物を、等量
のフェノールで抽出し次いでクロロホルムで3回抽出し
て2.5倍量のエタノール含有0.2M NaCl中で
析出することによってたん白質の除去を行った。DNA
ペレットを水中に溶解しそしてTAE緩衝液中11×1
4cmの1%アガロースゲル上の電気泳動(75ボルト
/4時間)によりサイズ分画した。このゲルを1.5M
NaCl/0.5M NaOHの溶液中に45分間浸
漬し次いで3.0M NaCl/0.5Mトリス・HC
l(pH7)中で2×45分間中和することによってD
NAを変性した。このDNAを毛管作用によりニトロセ
ルロース膜(Schleicher−Schuell)
に転写し、真空中80℃で2時間加熱して固定した。フ
ィルターを50%ホルムアミドと5倍のSSPE(Ma
niatis等の前記文献)と5倍のデンハルト(De
nhardt)と25μg/mlの音波処理したにしん
***DNAとから成る溶液で2−4時間前交雑した。
【0077】交雑プローブは次の通りである。 (a) pBTA23のAサブユニットcDNA遺伝子
からの790bp Sph I・Sma I断片(図5
〜6)。 (b) ウシBサブユニットクローンpBTA293か
ら得た1109bpのSph I・EcoRI断片(図
4)。これは361〜718位の塩基のBサブユニット
cDNA(図7〜8)ならびにpBR322のPstI
からEcoRI部位の751bpの断片を含有してい
る。
からの790bp Sph I・Sma I断片(図5
〜6)。 (b) ウシBサブユニットクローンpBTA293か
ら得た1109bpのSph I・EcoRI断片(図
4)。これは361〜718位の塩基のBサブユニット
cDNA(図7〜8)ならびにpBR322のPstI
からEcoRI部位の751bpの断片を含有してい
る。
【0078】これらの断片を、電気泳動後に、低ゲル化
温度のアガロースゲルから単離し次いでFeinber
g,A.P.およびVogelstein,Bの方法
(1984年、Anal,Biochem,137,2
66−267)によってα−32PdATPで標識した。
約30ngのDNAを、DNA1μgにつき2×108
〜109 カウント/分(CPM)の特異活性を有する様
に標識し、そして100℃に加熱後、3〜4×106 C
PMのプローブを1倍のデンハルト/50%のホルムア
ミド/5倍のSSPE/1倍のデンハルト/10%の硫
酸デキストラン/25μg/mlの音波処理したにしん
精製DNAから成る溶液と混合した。フィルターの交雑
は42℃で20時間行った。フィルターを室温で2倍の
SSCおよび0.1%のSDSですすぎ、次いで各2倍
のSSC/0.1%のSDS次に1倍のSSC/0.1
%のSDS次に0.2倍のSSC/0.1%のSDSで
順に30分間50℃で洗浄した。交雑は、その交雑配列
の少なくとも70〜75%が全体としてウシcDNA配
列と相同体となる様な条件下で行った。少なくとも24
時間富士RX型X−線フィルムに露光後、交雑断片のサ
イズを、そのサイズがわかっているマーカーDNA断片
を基にして決定することができた。
温度のアガロースゲルから単離し次いでFeinber
g,A.P.およびVogelstein,Bの方法
(1984年、Anal,Biochem,137,2
66−267)によってα−32PdATPで標識した。
約30ngのDNAを、DNA1μgにつき2×108
〜109 カウント/分(CPM)の特異活性を有する様
に標識し、そして100℃に加熱後、3〜4×106 C
PMのプローブを1倍のデンハルト/50%のホルムア
ミド/5倍のSSPE/1倍のデンハルト/10%の硫
酸デキストラン/25μg/mlの音波処理したにしん
精製DNAから成る溶液と混合した。フィルターの交雑
は42℃で20時間行った。フィルターを室温で2倍の
SSCおよび0.1%のSDSですすぎ、次いで各2倍
のSSC/0.1%のSDS次に1倍のSSC/0.1
%のSDS次に0.2倍のSSC/0.1%のSDSで
順に30分間50℃で洗浄した。交雑は、その交雑配列
の少なくとも70〜75%が全体としてウシcDNA配
列と相同体となる様な条件下で行った。少なくとも24
時間富士RX型X−線フィルムに露光後、交雑断片のサ
イズを、そのサイズがわかっているマーカーDNA断片
を基にして決定することができた。
【0079】A又はBサブユニット遺伝子プローブと強
力に交雑した、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタおよびトリゲ
ノムDNAの断片の大体のサイズ(塩基対における)は
次のとおりである。
力に交雑した、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタおよびトリゲ
ノムDNAの断片の大体のサイズ(塩基対における)は
次のとおりである。
【0080】
【表4】
【0081】実験した各種の動物種からのDNAは、大
または小ウシインヒビンサブユニットcDNAプローブ
と交雑する限られた数(通常は1個であって、PstI
での消化により例外的に3個まで)の断片を有してい
る。大サブユニットcDNAで調べた全部の種に共通の
約480bpのPstI断片が特徴的なものであった。
これらの交雑断片は、ウシインヒビン遺伝子と類似した
又は相同的であるウシ以外の種の遺伝子中に存在するこ
とがわかる。本例において選択使用したプローブ中に含
まれないインヒビンcDNA配列も又、表4に示した断
片中のもの以外のゲノムcDNAと交雑可能であること
を除外するものではない。
または小ウシインヒビンサブユニットcDNAプローブ
と交雑する限られた数(通常は1個であって、PstI
での消化により例外的に3個まで)の断片を有してい
る。大サブユニットcDNAで調べた全部の種に共通の
約480bpのPstI断片が特徴的なものであった。
これらの交雑断片は、ウシインヒビン遺伝子と類似した
又は相同的であるウシ以外の種の遺伝子中に存在するこ
とがわかる。本例において選択使用したプローブ中に含
まれないインヒビンcDNA配列も又、表4に示した断
片中のもの以外のゲノムcDNAと交雑可能であること
を除外するものではない。
【0082】別の実験において、ウシサブユニットcD
NAをプローブとして使用して、ラット卵巣からのRN
A中のAおよびBサブユニット前駆体mRNA種を調べ
た。これらmRNA種は、PMSGで処理したラットの
卵巣中に大量にあることがわかり、この結果、インヒビ
ンDNAが診断用プローブとして有用であることがわか
った。
NAをプローブとして使用して、ラット卵巣からのRN
A中のAおよびBサブユニット前駆体mRNA種を調べ
た。これらmRNA種は、PMSGで処理したラットの
卵巣中に大量にあることがわかり、この結果、インヒビ
ンDNAが診断用プローブとして有用であることがわか
った。
【0083】従って、ウシAおよびBインヒビンサブユ
ニットをコードするcDNAは、他の種のゲノムおよび
器官中のインヒビン分子をコードするDNAおよびRN
Aを同定するために使用することができる。この理由か
ら、それらのコードするインヒビン分子はウシインヒビ
ンと相当的なものであり、同様に使用することができ
る。 実施例8 ゲノムDNAからヒトインヒビン様配列の単離 ウシインヒビンのAおよびBサブユニットをコードする
cDNAと類似の又は相同性のあるヒトDNA配列を単
離した。これは、クローン化DNAのヒトゲノムライブ
ラリーをバクテリオファージλ中に構築し、次いでウシ
インヒビンのA又はBサブユニットのどちらかをコード
するcDNAから作った〔32P〕−標識DNA断片でそ
のバクテリオファージプラークを調べることによって行
った。陽性プラークのファージDNAを単離し、制限酵
素で切断し、次にインヒビン様DNA含有断片(これは
実施例7のプローブと方法を使用して、Souther
nBlot交雑法により決定した)をM13中でサブク
ローシングしてヌクレオチド配列を決定した。
ニットをコードするcDNAは、他の種のゲノムおよび
器官中のインヒビン分子をコードするDNAおよびRN
Aを同定するために使用することができる。この理由か
ら、それらのコードするインヒビン分子はウシインヒビ
ンと相当的なものであり、同様に使用することができ
る。 実施例8 ゲノムDNAからヒトインヒビン様配列の単離 ウシインヒビンのAおよびBサブユニットをコードする
cDNAと類似の又は相同性のあるヒトDNA配列を単
離した。これは、クローン化DNAのヒトゲノムライブ
ラリーをバクテリオファージλ中に構築し、次いでウシ
インヒビンのA又はBサブユニットのどちらかをコード
するcDNAから作った〔32P〕−標識DNA断片でそ
のバクテリオファージプラークを調べることによって行
った。陽性プラークのファージDNAを単離し、制限酵
素で切断し、次にインヒビン様DNA含有断片(これは
実施例7のプローブと方法を使用して、Souther
nBlot交雑法により決定した)をM13中でサブク
ローシングしてヌクレオチド配列を決定した。
【0084】具体的には次の通りである。ヒトゲノムラ
イブラリーを、Maniatis等の方法(前記文献)
によりバクテリオファージλEMBL3 中で構築する
か、あるいは同様なヒトゲノムライブラリーをλし、4
7中で構築した( Loenen,W.A.M.および
Brammar,W.J.(1980年)のGene,
20,249−259)。ヒトゲノムDNA(実施例7
の様にして作った)をSau3A Itoで部分消化し
て約5〜30kbpの長さのサイズの範囲にあるDNA
を作った。これは、TEおよび1MのNaClの傾斜液
(Cmix=15%、Cr=31.5,Vm=34.4
5,aK=2.147)を使用して、BeckmanS
W50.1型回転装置中で12.5μgのDNAを5
0,000RPMで2時間遠心分離する、しょ糖傾斜遠
心分離(McCarty,K.S.等(1974年)の
Anal,Biochem,61,165−183)に
よって分画したサイズである。
イブラリーを、Maniatis等の方法(前記文献)
によりバクテリオファージλEMBL3 中で構築する
か、あるいは同様なヒトゲノムライブラリーをλし、4
7中で構築した( Loenen,W.A.M.および
Brammar,W.J.(1980年)のGene,
20,249−259)。ヒトゲノムDNA(実施例7
の様にして作った)をSau3A Itoで部分消化し
て約5〜30kbpの長さのサイズの範囲にあるDNA
を作った。これは、TEおよび1MのNaClの傾斜液
(Cmix=15%、Cr=31.5,Vm=34.4
5,aK=2.147)を使用して、BeckmanS
W50.1型回転装置中で12.5μgのDNAを5
0,000RPMで2時間遠心分離する、しょ糖傾斜遠
心分離(McCarty,K.S.等(1974年)の
Anal,Biochem,61,165−183)に
よって分画したサイズである。
【0085】この傾斜分離によって約15〜25kbp
のDNAを集め、エタノールを担体としてのtRNA
0.5μgで析出させそしてEMBL3λarmsにラ
イゲートした。EMBL3 DNA(Promega B
iotec,MadisonWI,USA)を酵素Ba
mHIおよびEcoRIで消化し、フェノールとクロロ
ホルムで脱たん白質し、そして0.3M酢酸ナトリウム
の存在下に0〜4℃で0.6倍量のイソプロパノールで
析出させた。その2.4μgを、10mMトリス・HC
l(pH7.5)、10mM MgCl2 、1mM A
TP、20mMジチオスレイトールおよび2単位のT4
DNAリガーゼ(BoehringerMannhei
m)から成り全量40μlの溶液中で15−25kbp
のヒトDNAの約1μgと混合しそして15℃で20時
間培養した。95μlのパッカジーン(Package
ne,Promega Biotec)を加え、22℃
で2時間培養した。この混合物を特別の宿主NM539
(Promega Biotec社の処方参照)に与
え、平板直径14cmにつきほぼ50,000個のプラ
ークの濃度とした。この反応混合物から8板の平板を作
った。
のDNAを集め、エタノールを担体としてのtRNA
0.5μgで析出させそしてEMBL3λarmsにラ
イゲートした。EMBL3 DNA(Promega B
iotec,MadisonWI,USA)を酵素Ba
mHIおよびEcoRIで消化し、フェノールとクロロ
ホルムで脱たん白質し、そして0.3M酢酸ナトリウム
の存在下に0〜4℃で0.6倍量のイソプロパノールで
析出させた。その2.4μgを、10mMトリス・HC
l(pH7.5)、10mM MgCl2 、1mM A
TP、20mMジチオスレイトールおよび2単位のT4
DNAリガーゼ(BoehringerMannhei
m)から成り全量40μlの溶液中で15−25kbp
のヒトDNAの約1μgと混合しそして15℃で20時
間培養した。95μlのパッカジーン(Package
ne,Promega Biotec)を加え、22℃
で2時間培養した。この混合物を特別の宿主NM539
(Promega Biotec社の処方参照)に与
え、平板直径14cmにつきほぼ50,000個のプラ
ークの濃度とした。この反応混合物から8板の平板を作
った。
【0086】バクテリオファージL47中のヒトライブ
ラリーも同様にNM539に与えて、同様のプラーク濃
度を得た。インヒビンcDNAプローブで調べるため
に、このプラークをManiatis等の方法(198
2年、前出文献)によりニトロセルロースフィルター
(1枚の平板につき2つのレプリカ)に転写した。標識
プローブは次の通りである。ウシインヒビンのAサブユ
ニットに相当する配列には、790bpのSphI−S
maI断片をλL47ライブラリー用に使用し、Aサブ
ユニットcDNA(表3参照)を含有するpBTA29
7からのBamHI−HindIII断片をEMBL3
ライブラリー用に使用した。小サブユニット用のプロー
ブは実施例7に記載のSphI−EcoRI断片とし
た。調製、標識および交雑の条件は実施例7に記載した
Southern Blot交雑方法と同じである。第
1のプラークのスクリーニングには、1つの交雑溶液中
に両方のプローブを使用した。潜在陽性プラークを溶出
し、再度平板上に載置し、そして純粋クローンが得られ
るまでプローブで調べた。2つのクローンが特に重要で
あり、その1つはL47ライブラリーから得られた大
(A)サブユニットと交雑するλA2 であり、もう1つ
はEMBL3 ライブラリーから得られた小(B)サブユ
ニットと交雑するλB1 である。このλA2 は約11〜
12kbpのヒトDNAが挿入してあった。PstIで
消化するとたくさんの断片が生成し、その内、ウシA遺
伝子の〔32P〕−標識SphI−SmaI断片(前記し
たもの)と交雑した3個がみられた。PvuIIで消化
すると同じプローブと交雑するさらに2つの断片が生成
する(表5)。
ラリーも同様にNM539に与えて、同様のプラーク濃
度を得た。インヒビンcDNAプローブで調べるため
に、このプラークをManiatis等の方法(198
2年、前出文献)によりニトロセルロースフィルター
(1枚の平板につき2つのレプリカ)に転写した。標識
プローブは次の通りである。ウシインヒビンのAサブユ
ニットに相当する配列には、790bpのSphI−S
maI断片をλL47ライブラリー用に使用し、Aサブ
ユニットcDNA(表3参照)を含有するpBTA29
7からのBamHI−HindIII断片をEMBL3
ライブラリー用に使用した。小サブユニット用のプロー
ブは実施例7に記載のSphI−EcoRI断片とし
た。調製、標識および交雑の条件は実施例7に記載した
Southern Blot交雑方法と同じである。第
1のプラークのスクリーニングには、1つの交雑溶液中
に両方のプローブを使用した。潜在陽性プラークを溶出
し、再度平板上に載置し、そして純粋クローンが得られ
るまでプローブで調べた。2つのクローンが特に重要で
あり、その1つはL47ライブラリーから得られた大
(A)サブユニットと交雑するλA2 であり、もう1つ
はEMBL3 ライブラリーから得られた小(B)サブユ
ニットと交雑するλB1 である。このλA2 は約11〜
12kbpのヒトDNAが挿入してあった。PstIで
消化するとたくさんの断片が生成し、その内、ウシA遺
伝子の〔32P〕−標識SphI−SmaI断片(前記し
たもの)と交雑した3個がみられた。PvuIIで消化
すると同じプローブと交雑するさらに2つの断片が生成
する(表5)。
【0087】
【表5】
【0088】1160および480bp断片(PstI
消化による)と800bp断片(PvuII消化によ
る)とはそのサイズにおいて、実施例7に示したヒトゲ
ノムDNAのSouthern Blot分析において
同じプローブと交雑するPstIおよびPvuII断片
にそれぞれ類似している。同じλA2 サザンブロット
(Southern blot)と、pBTA295か
らの〔32P〕−標識した500bpのPstI断片との
交雑によると、λA2 のPstIによる消化の結果の1
160bp断片のみが同定された。この様な交雑パター
ンは、クローン化ヒトDNA断片がウシインヒビンDN
Aと類似か又は相同的である配列を有するという仮説に
一致するものである。λA2 をPstIで消化し、次い
で低ゲル化温度のアガロースゲルから480,1160
および2500bp断片を切り取り、M13中でサブク
ローニングしそしてそのヌクレオチド配列を決定(実施
例5c参照)した結果の配列を図9〜10に示した。2
75と276番目の塩基の間の1.4−1.5kbpの
イントロンのDNA配列は省略してある。誘導アミノ酸
配列とウシインヒビンプレ−プロAサブユニットの配列
が類似していることから、相同たん白質であることがわ
かり、又これはヒトインヒビンAおよびAcサブユニッ
トの前駆体である。ヒトインヒビンのAN断片はHis
lからArg171のアミノ酸であり、Acサブユニッ
トはSer172からIle306のアミノ酸である。
消化による)と800bp断片(PvuII消化によ
る)とはそのサイズにおいて、実施例7に示したヒトゲ
ノムDNAのSouthern Blot分析において
同じプローブと交雑するPstIおよびPvuII断片
にそれぞれ類似している。同じλA2 サザンブロット
(Southern blot)と、pBTA295か
らの〔32P〕−標識した500bpのPstI断片との
交雑によると、λA2 のPstIによる消化の結果の1
160bp断片のみが同定された。この様な交雑パター
ンは、クローン化ヒトDNA断片がウシインヒビンDN
Aと類似か又は相同的である配列を有するという仮説に
一致するものである。λA2 をPstIで消化し、次い
で低ゲル化温度のアガロースゲルから480,1160
および2500bp断片を切り取り、M13中でサブク
ローニングしそしてそのヌクレオチド配列を決定(実施
例5c参照)した結果の配列を図9〜10に示した。2
75と276番目の塩基の間の1.4−1.5kbpの
イントロンのDNA配列は省略してある。誘導アミノ酸
配列とウシインヒビンプレ−プロAサブユニットの配列
が類似していることから、相同たん白質であることがわ
かり、又これはヒトインヒビンAおよびAcサブユニッ
トの前駆体である。ヒトインヒビンのAN断片はHis
lからArg171のアミノ酸であり、Acサブユニッ
トはSer172からIle306のアミノ酸である。
【0089】λB1 クローンは約21〜26kbpの挿
入DNAを有している。このDNAを同様に制限酵素P
stIで切断し、1%アガロースゲル上の電気泳動でサ
イズ分画しそしてニトロセルロースフィルターに転写し
た。pBTA293から精製した136bp又は510
bpのインヒビンPstI断片(〔32P〕−標識した)
での交雑(図4)によると、小さい方のプローブは長さ
が約1300bp(1100−1350bpの範囲)の
DNAの断片に結合し、大きい方のプローブは長さが約
800bp(740−840bpの範囲)の断片に結合
した。800bpの断片の部分のヌクレオチド配列は、
λB1 をPstIで消化し、約800bpのPstI断
片を低ゲル化温度のアガロースゲル上で精製しM13m
p9のPstI部位中にクローニングし、次いでヌクレ
オチド配列を決定することによって決定された。配列決
定のために800bp断片(PstI−Sau3AI;
Sau3AI−Sau3AI)の小さい方の断片とM1
3中にサブクローニングした結果得られたヌクレオチド
配列を図11に示した。DNA配列の翻訳により決定さ
れたアミノ酸配列によれば、このDNAはインヒビンの
B鎖の全部をコードしそしてGlyからSer116の
ヒトB鎖はウシB鎖と同一である。これらλクローンか
ら決定されたヒトプレプロBサブユニットの活性なコー
デング配列を図26に示す。このコーディング配列は3
88塩基間のイントロによって妨害される。
入DNAを有している。このDNAを同様に制限酵素P
stIで切断し、1%アガロースゲル上の電気泳動でサ
イズ分画しそしてニトロセルロースフィルターに転写し
た。pBTA293から精製した136bp又は510
bpのインヒビンPstI断片(〔32P〕−標識した)
での交雑(図4)によると、小さい方のプローブは長さ
が約1300bp(1100−1350bpの範囲)の
DNAの断片に結合し、大きい方のプローブは長さが約
800bp(740−840bpの範囲)の断片に結合
した。800bpの断片の部分のヌクレオチド配列は、
λB1 をPstIで消化し、約800bpのPstI断
片を低ゲル化温度のアガロースゲル上で精製しM13m
p9のPstI部位中にクローニングし、次いでヌクレ
オチド配列を決定することによって決定された。配列決
定のために800bp断片(PstI−Sau3AI;
Sau3AI−Sau3AI)の小さい方の断片とM1
3中にサブクローニングした結果得られたヌクレオチド
配列を図11に示した。DNA配列の翻訳により決定さ
れたアミノ酸配列によれば、このDNAはインヒビンの
B鎖の全部をコードしそしてGlyからSer116の
ヒトB鎖はウシB鎖と同一である。これらλクローンか
ら決定されたヒトプレプロBサブユニットの活性なコー
デング配列を図26に示す。このコーディング配列は3
88塩基間のイントロによって妨害される。
【0090】ヒトインヒビンDNA配列を有するこれら
のλクローンの断片ならびに類似の合成断片は、真核生
物又は原核生物発現系に挿入してヒトインヒビン又はそ
の構造がインヒビンに関連したポリペプチドを生成し得
ることがわかる(実施例10参照)。又、λクローン自
体も適当な真核細胞系にトランスフェクトして発現させ
ることが可能である。
のλクローンの断片ならびに類似の合成断片は、真核生
物又は原核生物発現系に挿入してヒトインヒビン又はそ
の構造がインヒビンに関連したポリペプチドを生成し得
ることがわかる(実施例10参照)。又、λクローン自
体も適当な真核細胞系にトランスフェクトして発現させ
ることが可能である。
【0091】ウシcDNAをプローブとして使用して種
々の脊椎動物種中のインヒビンサブユニット遺伝子を検
出し(実施例7)、次いでアミノ酸配列中の広大な類似
点を明らかにするためにヒトインヒビンサブユニット遺
伝子のクローニングと配列決定を行うことにより、他の
脊椎動物インヒビンが国際特許出願PCT/AU85/
00119および図5〜8中に示したウシインヒビンた
ん白質と相同的であるかまたはそうでなければ同一であ
ることが明らかとなる。
々の脊椎動物種中のインヒビンサブユニット遺伝子を検
出し(実施例7)、次いでアミノ酸配列中の広大な類似
点を明らかにするためにヒトインヒビンサブユニット遺
伝子のクローニングと配列決定を行うことにより、他の
脊椎動物インヒビンが国際特許出願PCT/AU85/
00119および図5〜8中に示したウシインヒビンた
ん白質と相同的であるかまたはそうでなければ同一であ
ることが明らかとなる。
【0092】本発明者らは多くの脊椎動物種(例えば表
6参照)からの卵胞液や卵巣抽出物中のインヒビン活性
を検出し、国際特許出願PCT/AU85/0019お
よび実施例9の方法によりヒトFFおよびヒツジFFか
らの生来のインヒビンを精製し、そして両種ともにウシ
インヒビンと機能的に類似しておりかつウシ型と類似し
たサブユニット構造の58kDおよび31kD型を有し
ている事を発見した。
6参照)からの卵胞液や卵巣抽出物中のインヒビン活性
を検出し、国際特許出願PCT/AU85/0019お
よび実施例9の方法によりヒトFFおよびヒツジFFか
らの生来のインヒビンを精製し、そして両種ともにウシ
インヒビンと機能的に類似しておりかつウシ型と類似し
たサブユニット構造の58kDおよび31kD型を有し
ている事を発見した。
【0093】又、ウサギ、ウシおよびヒトインヒビン
は、国際特許出願PCT/AU85/00119に記載
の、精製58kDウシインヒビンに対するウサギ抗血清
により中和され、かつRIA中で交差反応して再度緊密
な構造相同性を示す(表6)。しかしながら、生来のウ
シインヒビンはウサギ中での免疫応答誘発が可能である
という事実は、ウサギ免疫系によって異質物として認識
されるような、ウサギおよびウシインヒビンとの間の相
違点がある事を意味するものであり、従って、ある種か
らのインヒビンは他の種においては抗原として使用する
ことが可能でありそして内因性インヒビンを認識する抗
体が生成される。
は、国際特許出願PCT/AU85/00119に記載
の、精製58kDウシインヒビンに対するウサギ抗血清
により中和され、かつRIA中で交差反応して再度緊密
な構造相同性を示す(表6)。しかしながら、生来のウ
シインヒビンはウサギ中での免疫応答誘発が可能である
という事実は、ウサギ免疫系によって異質物として認識
されるような、ウサギおよびウシインヒビンとの間の相
違点がある事を意味するものであり、従って、ある種か
らのインヒビンは他の種においては抗原として使用する
ことが可能でありそして内因性インヒビンを認識する抗
体が生成される。
【0094】表6に示した全ての種が、下垂体細胞受容
体と相互作用をする構造相同性を示すラット下垂体細胞
培養物中で活性であるとしても、ウサギの生成した抗体
は、特殊なエピトープ用の抗血清の特異性を示すヒツジ
やラットインヒビンと顕著な交差反応はしいな。Bサブ
ユニットはほとんどの種の中に充分に存在していてかつ
多分同一のものであろうので、内因性インヒビンBサブ
ユニットと交差反応する抗体を誘発するために突然変異
体Bサブユニットたん白質を抗原として使用することは
多くの種において広く可能でありかつ効果的であろうこ
とは、すでに先に述べた記載からも明らかである。この
様な抗体は、DNAの生体外突然変異形成、実施例10
に記載の様な新しい遺伝子の発現又はBサブユニットた
ん白質の化学変性又は図7〜8および図11記載のもの
とは同一ではないが類似しているBサブユニットを有す
る種からのBサブユニット遺伝子の単離、および実施例
10の様にしてのこの遺伝子の発現から成る様な手段に
より生成可能である。
体と相互作用をする構造相同性を示すラット下垂体細胞
培養物中で活性であるとしても、ウサギの生成した抗体
は、特殊なエピトープ用の抗血清の特異性を示すヒツジ
やラットインヒビンと顕著な交差反応はしいな。Bサブ
ユニットはほとんどの種の中に充分に存在していてかつ
多分同一のものであろうので、内因性インヒビンBサブ
ユニットと交差反応する抗体を誘発するために突然変異
体Bサブユニットたん白質を抗原として使用することは
多くの種において広く可能でありかつ効果的であろうこ
とは、すでに先に述べた記載からも明らかである。この
様な抗体は、DNAの生体外突然変異形成、実施例10
に記載の様な新しい遺伝子の発現又はBサブユニットた
ん白質の化学変性又は図7〜8および図11記載のもの
とは同一ではないが類似しているBサブユニットを有す
る種からのBサブユニット遺伝子の単離、および実施例
10の様にしてのこの遺伝子の発現から成る様な手段に
より生成可能である。
【0095】
【表6】
【0096】実施例9 インヒビンの58kD型と31kD型との関係 インヒビンは顆粒層細胞により作られそして卵胞液中に
分泌される。すでに報告されている様に(国際特許出願
PCT/AU/85/00119)、これは最初は58
kD型として存在する。
分泌される。すでに報告されている様に(国際特許出願
PCT/AU/85/00119)、これは最初は58
kD型として存在する。
【0097】ウシ卵胞液からインヒビンを精製する効率
を改良することを目的とした研究から、小さいインヒビ
ンの別の型があることが明らかにされた。Robert
son,D.M.等(1985年、Biochem,B
iophys,Research Commun,12
6,220−226;国際特許出願PCT/AU85/
00119)の精製方法を使用して、pH4.75での
沈殿工程を最初の中性および酸性緩衝液ゲルろ過クロマ
トグラフィー工程の間に行った。この結果、酸性ゲルろ
過工程による最初の生成物から単離された、第2の生物
活性種が生成している事が明らかとなった。この第2の
種を逆相HPLCおよび予備ポリアクリルアミドゲル電
気泳動に付した後、見かけ分子量が20,000と1
5,000の2つのサブユニットから成る、見かけ分子
量が31,000であってかつもとの58kD型と同様
な生物学的活性を有するたん白質が生成していることが
わかった。これら2つのインヒビン種の小さい方のサブ
ユニットの見かけの分子量は非常に似ている(約15k
D)ことから、この2つのインヒビン種の見かけの分子
量の違いは、43kDサブユニットが約20kDに小さ
くなった事に主として起因すると思われる。
を改良することを目的とした研究から、小さいインヒビ
ンの別の型があることが明らかにされた。Robert
son,D.M.等(1985年、Biochem,B
iophys,Research Commun,12
6,220−226;国際特許出願PCT/AU85/
00119)の精製方法を使用して、pH4.75での
沈殿工程を最初の中性および酸性緩衝液ゲルろ過クロマ
トグラフィー工程の間に行った。この結果、酸性ゲルろ
過工程による最初の生成物から単離された、第2の生物
活性種が生成している事が明らかとなった。この第2の
種を逆相HPLCおよび予備ポリアクリルアミドゲル電
気泳動に付した後、見かけ分子量が20,000と1
5,000の2つのサブユニットから成る、見かけ分子
量が31,000であってかつもとの58kD型と同様
な生物学的活性を有するたん白質が生成していることが
わかった。これら2つのインヒビン種の小さい方のサブ
ユニットの見かけの分子量は非常に似ている(約15k
D)ことから、この2つのインヒビン種の見かけの分子
量の違いは、43kDサブユニットが約20kDに小さ
くなった事に主として起因すると思われる。
【0098】又、純粋58kDインヒビンは、去勢ウシ
血清(SS)又はヒト閉経後血清(PMS)中での培養
中に31kD型に変化する。この分解はbFFでの同様
の培養中には起こらない(図12)。従って、インヒビ
ンの小さい方の(31kD)型、特にその大きい方の
(20kD)サブユニットは、国際特許出願PCT/A
U85/00119およびRobertson,D.
M.等(1985年)の“Biochem.Bioph
ys,Res,Commum,126,220−22
6”に記載のインヒビンの58kD型の直接誘導体であ
り、かつ本明細書に記載のサブユニット遺伝子から誘導
可能であると考えられる。
血清(SS)又はヒト閉経後血清(PMS)中での培養
中に31kD型に変化する。この分解はbFFでの同様
の培養中には起こらない(図12)。従って、インヒビ
ンの小さい方の(31kD)型、特にその大きい方の
(20kD)サブユニットは、国際特許出願PCT/A
U85/00119およびRobertson,D.
M.等(1985年)の“Biochem.Bioph
ys,Res,Commum,126,220−22
6”に記載のインヒビンの58kD型の直接誘導体であ
り、かつ本明細書に記載のサブユニット遺伝子から誘導
可能であると考えられる。
【0099】又、天然インヒビンを含有しない血清(S
SおよびPMS)は組換えインヒビン又はそのサブユニ
ットを処理するのに使用することができ、かつ確実な酵
素を血清又はこうの反応を行う細胞型から精製しそして
同様な目的に使用することができるのは明らかである。
この酵素反応はプロテアーゼ抑制剤に関して特徴的であ
る。SS又はPMSの存在下に30℃で17時間血清を
よう素化58kDインヒビンで培養した後で、3mMの
パラクロルメルクリ安息香酸塩又は10mMのEDTA
を加えることによって58kDから31kDインヒビン
への変化は24%から4.5%へ減少した。バシトラシ
ンおよびペプスタチンA(各0.3mM)は効果がなか
った。このプロテアーゼ抑制のパターンは作用酵素の特
徴であり(Lazure,C.等(1983年)のCa
u,J.Biochem,Cell Biol,61,
501−515)であり、本反応で使用されるAサブユ
ニット(図5〜6)中にSer167の前の標準的な反
応部位(Arg−Arg)があるという発見とも合致す
るものである。
SおよびPMS)は組換えインヒビン又はそのサブユニ
ットを処理するのに使用することができ、かつ確実な酵
素を血清又はこうの反応を行う細胞型から精製しそして
同様な目的に使用することができるのは明らかである。
この酵素反応はプロテアーゼ抑制剤に関して特徴的であ
る。SS又はPMSの存在下に30℃で17時間血清を
よう素化58kDインヒビンで培養した後で、3mMの
パラクロルメルクリ安息香酸塩又は10mMのEDTA
を加えることによって58kDから31kDインヒビン
への変化は24%から4.5%へ減少した。バシトラシ
ンおよびペプスタチンA(各0.3mM)は効果がなか
った。このプロテアーゼ抑制のパターンは作用酵素の特
徴であり(Lazure,C.等(1983年)のCa
u,J.Biochem,Cell Biol,61,
501−515)であり、本反応で使用されるAサブユ
ニット(図5〜6)中にSer167の前の標準的な反
応部位(Arg−Arg)があるという発見とも合致す
るものである。
【0100】血清中への放出の際のインヒビン分解によ
り2分子、すなわちインヒビンの31kD型およびAN
断片(大サブユニットのアオノ酸1−166)が生成す
る。この31kD型は下垂体細胞によるFSHの合成お
よび放出を抑制することが知られているが、又一方、1
方の又は両方の分子は生殖腺にもどりそして直接生殖腺
機能を調節することもでき、あるいはインヒビン自体又
はインヒビンの断片やその前駆体分子、例えばAN がF
SHの下垂体調製以外の別の生物学的機能を有している
ことでも良い。これらはウサギ699をペプチド1で免
疫することによりFSH力価が突然0に落ちたという事
実からもうかがえる(実施例15参照)。
り2分子、すなわちインヒビンの31kD型およびAN
断片(大サブユニットのアオノ酸1−166)が生成す
る。この31kD型は下垂体細胞によるFSHの合成お
よび放出を抑制することが知られているが、又一方、1
方の又は両方の分子は生殖腺にもどりそして直接生殖腺
機能を調節することもでき、あるいはインヒビン自体又
はインヒビンの断片やその前駆体分子、例えばAN がF
SHの下垂体調製以外の別の生物学的機能を有している
ことでも良い。これらはウサギ699をペプチド1で免
疫することによりFSH力価が突然0に落ちたという事
実からもうかがえる(実施例15参照)。
【0101】インヒビンの両サブユニットはプレプロ分
子として生成し、そして各サブユニットからのプロペプ
チドは細胞生長および抑制を含めてそれら自身の生物活
性を持つことができる。インヒビン自身の31kD型は
形質転換生長因子−β(Derynck,R.等(19
85年)のNature 316,701−705)と
高い相同性を示し、下垂体細胞によるFSH合成におけ
るすでに知られた作用に加えて、細胞調整における生来
の分子の作用を有することもうかがえる。 例10 インヒビンcDNAの発現 (a) 43kDおよび20kDサブユニット クローンBTA405(表3)はインヒビンの大サブユ
ニットの部分をコードするcDNAを含有しているが、
これがインヒビンの部分を生成する事は期待できない。
なぜならば、そのcDNAはdC尾部を有し(実施例3
a参照)、かつその配列中にリボース結合部位や開始A
TG(f.Met)コドンがないからである。インヒビ
ン遺伝子の部分を発現させるためには、pBTA23中
のcDNAの最大(約480bp)PstI断片をpU
R292のPstI部位中にクローニングすることによ
って融合ペプチドを作った。これを定位におくことによ
って、E.コリたん白質β−ガラクトシダーゼの大部分
とそれに続くインヒビンの43kDサブユニットの27
〜183アオノ酸とから成るたん白質が生成する。プラ
スミド構成はE.コリBTA647(表3)中に形質転
換した。
子として生成し、そして各サブユニットからのプロペプ
チドは細胞生長および抑制を含めてそれら自身の生物活
性を持つことができる。インヒビン自身の31kD型は
形質転換生長因子−β(Derynck,R.等(19
85年)のNature 316,701−705)と
高い相同性を示し、下垂体細胞によるFSH合成におけ
るすでに知られた作用に加えて、細胞調整における生来
の分子の作用を有することもうかがえる。 例10 インヒビンcDNAの発現 (a) 43kDおよび20kDサブユニット クローンBTA405(表3)はインヒビンの大サブユ
ニットの部分をコードするcDNAを含有しているが、
これがインヒビンの部分を生成する事は期待できない。
なぜならば、そのcDNAはdC尾部を有し(実施例3
a参照)、かつその配列中にリボース結合部位や開始A
TG(f.Met)コドンがないからである。インヒビ
ン遺伝子の部分を発現させるためには、pBTA23中
のcDNAの最大(約480bp)PstI断片をpU
R292のPstI部位中にクローニングすることによ
って融合ペプチドを作った。これを定位におくことによ
って、E.コリたん白質β−ガラクトシダーゼの大部分
とそれに続くインヒビンの43kDサブユニットの27
〜183アオノ酸とから成るたん白質が生成する。プラ
スミド構成はE.コリBTA647(表3)中に形質転
換した。
【0102】これらクローンを同定するために、免疫学
的スクリーニング法を使用した。形質転換後、形質転換
体を選択するために、細胞を50μg/mlのアンピシ
リンナトリウム含有LB寒天板上に37℃で16時間置
いた。コロニーをニトロセルロース膜(Schleic
her−Schuell)上に転写し、そして墨にひた
した針を寒天から膜中に突き刺すことによって定位印を
つけた。母培養板は次にこれを使用するまで4℃で保存
し、一方Lプリカフィルターは、50μg/mlのアン
ピシリンナトリウム含有の新しいLB寒天板の上にのせ
て3時間培養した。0.5mMのイソプロピルβ−D−
チオガラクトシド(IPTG)含有LB寒天上に37℃
で2時間で融合たん白質が誘発された。フィルターを
0.2MNaOH/1%(w/v)SDSで飽和したワ
ットマン3MM(Whatman3MM)紙のシート上
に5分間おき、次いで0.5Mトリス・HCl(pH
7.5)で飽和した紙の上で中和した。コロニーから放
出されたたん白質はその場でニトロセルロースに結合す
る。フィルターを、更に0.5%(v/v)のトウィー
ン20(Tween 20,Signa社)を含有する
TST(150mMNaCl/0.05%(v/v)ト
ウィーン20/10mMトリス・HCl(pH8.0)
中に1時間ゆっくり攪拌しながら浸漬することによっ
て、ニトロセルロース上に残っているたん白質結合部位
をブロックした。このフィルターを、ウサギ抗−ウシ5
8kDインヒビン抗血清(国際特許出願PCT/AU8
5/00019)を含有し、TSTで1:50に希釈し
た溶液で室温で1晩処理し、次いで残った抗体を除去す
るためにTST中で数回洗浄した。フィルターを、ブタ
抗ウサギ免疫グロブリン−西洋ワサビペルオキシダーゼ
共役化合物(Dakopatts)をTST中で1:2
00に希釈した溶液で室温で1時間処理し、次いでTS
T中で洗浄した。最後に、これらを20mMのトリス−
HCl(pH7.5)中で洗浄しそして0.5mg/m
lの4−クロルナフトール/0.03%(v/v)のH
2 O2 /20mMのトリス−HCl(pH7.5)を含
有する溶液で着色した。
的スクリーニング法を使用した。形質転換後、形質転換
体を選択するために、細胞を50μg/mlのアンピシ
リンナトリウム含有LB寒天板上に37℃で16時間置
いた。コロニーをニトロセルロース膜(Schleic
her−Schuell)上に転写し、そして墨にひた
した針を寒天から膜中に突き刺すことによって定位印を
つけた。母培養板は次にこれを使用するまで4℃で保存
し、一方Lプリカフィルターは、50μg/mlのアン
ピシリンナトリウム含有の新しいLB寒天板の上にのせ
て3時間培養した。0.5mMのイソプロピルβ−D−
チオガラクトシド(IPTG)含有LB寒天上に37℃
で2時間で融合たん白質が誘発された。フィルターを
0.2MNaOH/1%(w/v)SDSで飽和したワ
ットマン3MM(Whatman3MM)紙のシート上
に5分間おき、次いで0.5Mトリス・HCl(pH
7.5)で飽和した紙の上で中和した。コロニーから放
出されたたん白質はその場でニトロセルロースに結合す
る。フィルターを、更に0.5%(v/v)のトウィー
ン20(Tween 20,Signa社)を含有する
TST(150mMNaCl/0.05%(v/v)ト
ウィーン20/10mMトリス・HCl(pH8.0)
中に1時間ゆっくり攪拌しながら浸漬することによっ
て、ニトロセルロース上に残っているたん白質結合部位
をブロックした。このフィルターを、ウサギ抗−ウシ5
8kDインヒビン抗血清(国際特許出願PCT/AU8
5/00019)を含有し、TSTで1:50に希釈し
た溶液で室温で1晩処理し、次いで残った抗体を除去す
るためにTST中で数回洗浄した。フィルターを、ブタ
抗ウサギ免疫グロブリン−西洋ワサビペルオキシダーゼ
共役化合物(Dakopatts)をTST中で1:2
00に希釈した溶液で室温で1時間処理し、次いでTS
T中で洗浄した。最後に、これらを20mMのトリス−
HCl(pH7.5)中で洗浄しそして0.5mg/m
lの4−クロルナフトール/0.03%(v/v)のH
2 O2 /20mMのトリス−HCl(pH7.5)を含
有する溶液で着色した。
【0103】融合ペプチド含有コロニーは、フィルター
上において、コントロール菌株BTA647(pUR2
92)が生長した区域よりもより強く着色した区域から
同定された。その上で誘発E.コリBTA647(pU
R292)のローンが生長しそして分解したフィルター
で、ウサギ抗インヒビン抗血清の希釈体を前培養するこ
とによって該抗血清の抗E.コリ抗体力価を減少させよ
うとする試みをしたにもかかわらず、別のコロニーが着
色した背景がいくつか見られた。
上において、コントロール菌株BTA647(pUR2
92)が生長した区域よりもより強く着色した区域から
同定された。その上で誘発E.コリBTA647(pU
R292)のローンが生長しそして分解したフィルター
で、ウサギ抗インヒビン抗血清の希釈体を前培養するこ
とによって該抗血清の抗E.コリ抗体力価を減少させよ
うとする試みをしたにもかかわらず、別のコロニーが着
色した背景がいくつか見られた。
【0104】この様なコロニーを3つ精製し、そのプラ
スミド内容物を分析した。全部が定位にある予想された
cDNA断片を有するpUR292を含んでおり、これ
ら菌株の1つをBTA410としそしてそのプラスミド
をpBTA28とした(表3)。融合ペプチドの同定
は、たん白質をドデシル硫酸ナトリウムで変性し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によりサイズごとに分け、
次いで横向きにニトロセルロースシート上に転写すると
いう、Weetern Blot法(Towbin,
H.等(1979年)のProc,Natl,Aca
d,Sci,U.S.A.76,4350−4354)
によって行った。ニトロセルロースは次いで、どのたん
白質バンドがインヒビン抗原決定群を含有しているか決
定するために、前記の様にして処理する。たん白質試料
は次のようにして作った。
スミド内容物を分析した。全部が定位にある予想された
cDNA断片を有するpUR292を含んでおり、これ
ら菌株の1つをBTA410としそしてそのプラスミド
をpBTA28とした(表3)。融合ペプチドの同定
は、たん白質をドデシル硫酸ナトリウムで変性し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によりサイズごとに分け、
次いで横向きにニトロセルロースシート上に転写すると
いう、Weetern Blot法(Towbin,
H.等(1979年)のProc,Natl,Aca
d,Sci,U.S.A.76,4350−4354)
によって行った。ニトロセルロースは次いで、どのたん
白質バンドがインヒビン抗原決定群を含有しているか決
定するために、前記の様にして処理する。たん白質試料
は次のようにして作った。
【0105】LB中で37℃に1晩培養したBTA64
7(pUR292)およびBTA410の培養物を新た
な培地中に1:100に希釈し、濁度がA600 =0.4
になるまで培養し、次いでIPTG中で0.5mMにし
そして更に2時間培養してから採取した。この細胞ペレ
ットを0.1倍量の負荷緩衝液(30%(w/v)しょ
糖/1%(w/v)SDS/0.1Mβ−メルカプトエ
タノール/0.01%ブロモフェノールブルー含有電気
泳動緩衝液)中に直ちに再けん濁し、次いで5分間沸と
う水浴中で加熱した。試料(10−30μl)をポリア
クリルアミドゲル(Laemmli,U.K.(197
0年)のNature,227,680−685;Ma
ttick,J.S.等(1980)年のEur,J.
Biochem,114,643−651)に供給し、
電気泳動を、ブロモフェノールブルー色素がゲルの底部
に到達するまで行った。Hoeffer Transb
lot装置を使用して、156mMのトリス−塩基/1
20mMのグリシン中で1時間、1アンペアで側面転写
を行った。フィルターの抗血清でのブロッキングおよび
処理は前記した通りである。ポリアクリルアミドゲルの
中のたん白質を直接可視化するために、ゲルを脱色液
(10%(v/v)メタノール/5%(v/v)氷酢
酸)中に30分間漬け、次いで同溶液に仕上げた0.5
%(w/v)クーマシーブリリアントブルー(Coom
assie Brilliant Blue)R250
で1時間着色した。ゲルを、数回脱色溶液をとり換えな
がらゆっくり攪拌して脱色し、そしてたん白質バンドを
Western Blotおよび免疫検出により検出し
たものと比較した。株BTA410は少なくとも2個の
たん白質を含有しており、これらは全細胞たん白質の約
5−10%に当り、これらはIPTGにより誘発され、
そして抗インヒビン抗血清(図17、トラック10)に
より検出され、かつこれらは株BTA647(pUR2
92)(図17、トラック11)中には存在しないこと
が明らかとなった。これらは生来のβ−ガラクトシダー
ゼ(116kD)よりも大きく(約130および117
kD)、従って、β−ガラクトシダーゼ−インヒビン融
合たん白質である。この融合たん白質の大きい方はDN
A分析から予想されたもの(約132kD)に匹敵する
ものである。
7(pUR292)およびBTA410の培養物を新た
な培地中に1:100に希釈し、濁度がA600 =0.4
になるまで培養し、次いでIPTG中で0.5mMにし
そして更に2時間培養してから採取した。この細胞ペレ
ットを0.1倍量の負荷緩衝液(30%(w/v)しょ
糖/1%(w/v)SDS/0.1Mβ−メルカプトエ
タノール/0.01%ブロモフェノールブルー含有電気
泳動緩衝液)中に直ちに再けん濁し、次いで5分間沸と
う水浴中で加熱した。試料(10−30μl)をポリア
クリルアミドゲル(Laemmli,U.K.(197
0年)のNature,227,680−685;Ma
ttick,J.S.等(1980)年のEur,J.
Biochem,114,643−651)に供給し、
電気泳動を、ブロモフェノールブルー色素がゲルの底部
に到達するまで行った。Hoeffer Transb
lot装置を使用して、156mMのトリス−塩基/1
20mMのグリシン中で1時間、1アンペアで側面転写
を行った。フィルターの抗血清でのブロッキングおよび
処理は前記した通りである。ポリアクリルアミドゲルの
中のたん白質を直接可視化するために、ゲルを脱色液
(10%(v/v)メタノール/5%(v/v)氷酢
酸)中に30分間漬け、次いで同溶液に仕上げた0.5
%(w/v)クーマシーブリリアントブルー(Coom
assie Brilliant Blue)R250
で1時間着色した。ゲルを、数回脱色溶液をとり換えな
がらゆっくり攪拌して脱色し、そしてたん白質バンドを
Western Blotおよび免疫検出により検出し
たものと比較した。株BTA410は少なくとも2個の
たん白質を含有しており、これらは全細胞たん白質の約
5−10%に当り、これらはIPTGにより誘発され、
そして抗インヒビン抗血清(図17、トラック10)に
より検出され、かつこれらは株BTA647(pUR2
92)(図17、トラック11)中には存在しないこと
が明らかとなった。これらは生来のβ−ガラクトシダー
ゼ(116kD)よりも大きく(約130および117
kD)、従って、β−ガラクトシダーゼ−インヒビン融
合たん白質である。この融合たん白質の大きい方はDN
A分析から予想されたもの(約132kD)に匹敵する
ものである。
【0106】同様の方法で、pBTA30の410bp
PstI断片がpUR291中に発現した。得られたプ
ラスミドをpBTA292(表3)とし、再度、融合た
ん白質が抗インヒビン抗血清(図17、トラック9)を
使用して検出可能であった。完全サブユニットを発現さ
せるために、pBTA290とpBTA30からのcD
NAをスプライシングし、その方法を図13に示した。
これを簡単に説明すると、まず各クローンからSau3
AI断片を精製し、これらを特異のRsaI部位で切断
しそしてライゲートしたものである。ライゲートした生
成物の混合物をSau3AIで切断し、その生成物をp
UR290中にライゲートした。次いでpBTA290
の5′−Sau3AI−RsaI断片とpBTA30の
3′−RsaI−Sau3AI断片の両方を含むクロー
ンを同定するために、クローンとプローブ3と4(図
3)でスクリーニングした。pUR290がAsp−1
0からIle−300の正しい読み枠を与えるので、そ
の挿入が定位である場合にβ−ガラクトシダーゼ−イン
ヒビン融合たん白質の生産が確実となる。480および
410bp PstI部位における正しい発現を、pB
TA28とpBTA292の融合生成物(実施例9参
照)を含有するカラムから単離した特異性抗体を使用す
ることによって別々にチェックすることができる。得ら
れたプラスミドをpBTA296(表3)と命名した。
この完全Aサブユニット遺伝子を又、Sau3AI・S
au3AI断片としてpUC7のBamHI部位中でク
ローニングし、得られたプラスミド(pBTA302;
図16)をBTA652中へ導入してBTA426(A
TCC67057)を得た。Sau3AI部位の配列A
sp−Proは、これがぎ酸中で可変的であるので、融
合たん白質の上流からそのインヒビン部分を切断するの
に使用することができる(Nilsson,B,等(1
985年)のNucl,Ac.Res,13,1151
−1162)。株BTA419からのβ−ガラクトシダ
ーゼに融合した43kDサブユニットの全長(アミノ酸
Asp−10からIle−300)の発現を図17、ト
ラック8に示した。全長β−ガラクトシダーゼ・インヒ
ビンたん白質に加えて更に、生来のβ−ガラクトシダー
ゼの分子量とほぼ同じ分子量であるより小さいサイズの
少くとも3本の別のバンドがあり、これはおそらくその
全長生成物のたん白質分解か又は転写又は翻訳の成熟前
停止によるものであろう。融合たん白質のかたまりは可
溶性である。pBTA296からインヒビンDNAと側
面のβ−ガラクトシダーゼDNAをEcoRI切断断片
として切り出し、pBTA286(表3;図17、トラ
ック4)中に挿入してpBTA297(表3)を生成
し、pBTA286から短縮したβ−ガラクトシダーゼ
たん白質のC−末端においてインヒビンDNAを発現す
るクローンを、前記したコロニー免疫交雑法により選択
した。この様なクローンを位相差顕微鏡によって調べて
みると(例えば、BTA420;表3)、これらが封入
体と呼ばれる不溶性生成物としての融合たん白質を生成
しているのがわかった。この封入体は細胞中のたん白質
分解を防ぐ様な機能を有しかつ抗原生成のための精製を
非常に簡素化するものである(実施例12および1
3)。株BTA420をATCC67054と命名し、
BTA420の精製封入体からのたん白質を図17のト
ラック3に示した。BTA426中のAサブユニットの
発現を図17に示し、そしてこのたん白質は特に封入体
として生成される。BTA420中の融合たん白質と異
なり、BTA426中の最長融合たん白質は、West
ern Blot分析において最も顕著でありかつ最も
反応性が高く、従ってこれはインヒビン様たん白質の産
生用の特にすぐれた宿主−ベクター系であることがわか
る。
PstI断片がpUR291中に発現した。得られたプ
ラスミドをpBTA292(表3)とし、再度、融合た
ん白質が抗インヒビン抗血清(図17、トラック9)を
使用して検出可能であった。完全サブユニットを発現さ
せるために、pBTA290とpBTA30からのcD
NAをスプライシングし、その方法を図13に示した。
これを簡単に説明すると、まず各クローンからSau3
AI断片を精製し、これらを特異のRsaI部位で切断
しそしてライゲートしたものである。ライゲートした生
成物の混合物をSau3AIで切断し、その生成物をp
UR290中にライゲートした。次いでpBTA290
の5′−Sau3AI−RsaI断片とpBTA30の
3′−RsaI−Sau3AI断片の両方を含むクロー
ンを同定するために、クローンとプローブ3と4(図
3)でスクリーニングした。pUR290がAsp−1
0からIle−300の正しい読み枠を与えるので、そ
の挿入が定位である場合にβ−ガラクトシダーゼ−イン
ヒビン融合たん白質の生産が確実となる。480および
410bp PstI部位における正しい発現を、pB
TA28とpBTA292の融合生成物(実施例9参
照)を含有するカラムから単離した特異性抗体を使用す
ることによって別々にチェックすることができる。得ら
れたプラスミドをpBTA296(表3)と命名した。
この完全Aサブユニット遺伝子を又、Sau3AI・S
au3AI断片としてpUC7のBamHI部位中でク
ローニングし、得られたプラスミド(pBTA302;
図16)をBTA652中へ導入してBTA426(A
TCC67057)を得た。Sau3AI部位の配列A
sp−Proは、これがぎ酸中で可変的であるので、融
合たん白質の上流からそのインヒビン部分を切断するの
に使用することができる(Nilsson,B,等(1
985年)のNucl,Ac.Res,13,1151
−1162)。株BTA419からのβ−ガラクトシダ
ーゼに融合した43kDサブユニットの全長(アミノ酸
Asp−10からIle−300)の発現を図17、ト
ラック8に示した。全長β−ガラクトシダーゼ・インヒ
ビンたん白質に加えて更に、生来のβ−ガラクトシダー
ゼの分子量とほぼ同じ分子量であるより小さいサイズの
少くとも3本の別のバンドがあり、これはおそらくその
全長生成物のたん白質分解か又は転写又は翻訳の成熟前
停止によるものであろう。融合たん白質のかたまりは可
溶性である。pBTA296からインヒビンDNAと側
面のβ−ガラクトシダーゼDNAをEcoRI切断断片
として切り出し、pBTA286(表3;図17、トラ
ック4)中に挿入してpBTA297(表3)を生成
し、pBTA286から短縮したβ−ガラクトシダーゼ
たん白質のC−末端においてインヒビンDNAを発現す
るクローンを、前記したコロニー免疫交雑法により選択
した。この様なクローンを位相差顕微鏡によって調べて
みると(例えば、BTA420;表3)、これらが封入
体と呼ばれる不溶性生成物としての融合たん白質を生成
しているのがわかった。この封入体は細胞中のたん白質
分解を防ぐ様な機能を有しかつ抗原生成のための精製を
非常に簡素化するものである(実施例12および1
3)。株BTA420をATCC67054と命名し、
BTA420の精製封入体からのたん白質を図17のト
ラック3に示した。BTA426中のAサブユニットの
発現を図17に示し、そしてこのたん白質は特に封入体
として生成される。BTA420中の融合たん白質と異
なり、BTA426中の最長融合たん白質は、West
ern Blot分析において最も顕著でありかつ最も
反応性が高く、従ってこれはインヒビン様たん白質の産
生用の特にすぐれた宿主−ベクター系であることがわか
る。
【0107】前記したところから、他の制限酵素部位も
又Aサブユニットの発現に有用であることは明らかであ
る。その第1はコドンをHis1につなぐ特異Sph1
部位であり、そして、オリゴヌクレオチド リンカー
を、種々の宿主やベクター中のAサブユニット又はAN
断片を融合生成物として、あるいは新たなf−Metコ
ドンをHis1をコードするCAGの直前に導入するか
又はシグナルペプチドをHis1の前に与えた様な構造
の非融合たん白質として発現させ得るように作ることも
できる。この様な構造は当業者には周知であり、その1
例を図14〜15に示した。
又Aサブユニットの発現に有用であることは明らかであ
る。その第1はコドンをHis1につなぐ特異Sph1
部位であり、そして、オリゴヌクレオチド リンカー
を、種々の宿主やベクター中のAサブユニット又はAN
断片を融合生成物として、あるいは新たなf−Metコ
ドンをHis1をコードするCAGの直前に導入するか
又はシグナルペプチドをHis1の前に与えた様な構造
の非融合たん白質として発現させ得るように作ることも
できる。この様な構造は当業者には周知であり、その1
例を図14〜15に示した。
【0108】この発現リンカーは、Cla1部位を使用
して、trpプロモータープラスミド例えばptrpL
I(Edman,J.C.等(1981年)のNatu
re291,503−506)中への挿入後に新しいN
−末端メチオニンを介して43kD蛋白質またはAN 断
片を発現させるか、あるいは、BamHIを使用してp
UC7、pUC13又はpUR290中への挿入により
β−ガラクトシダーゼ−インヒビン融合たん白質とし
て、又は、pWT121(Talcon,W.等(19
80年)のMolec,Gem,Genet,177,
427−438)中への挿入後のtrpE−インヒビン
融合たん白質として発現が可能であるように作られるも
のである。
して、trpプロモータープラスミド例えばptrpL
I(Edman,J.C.等(1981年)のNatu
re291,503−506)中への挿入後に新しいN
−末端メチオニンを介して43kD蛋白質またはAN 断
片を発現させるか、あるいは、BamHIを使用してp
UC7、pUC13又はpUR290中への挿入により
β−ガラクトシダーゼ−インヒビン融合たん白質とし
て、又は、pWT121(Talcon,W.等(19
80年)のMolec,Gem,Genet,177,
427−438)中への挿入後のtrpE−インヒビン
融合たん白質として発現が可能であるように作られるも
のである。
【0109】AN 断片を発現するクローンの構築方法は
図22に示した。概略的に説明すれば、BamHIおよ
びSphIでpBTA297を消化し、次いで図14A
の1.に記載のリンカーを挿入した。図21に示したよ
うに、完全長Aサブユニット遺伝子をSau3AI断片
として単離し、HaeII部分消化をした。双頭のナン
センスコドンを含むストップリンカーをHdeII部位
に付加した反応生成物をBamHIで切断し、得られた
断片をpUC13に挿入した。
図22に示した。概略的に説明すれば、BamHIおよ
びSphIでpBTA297を消化し、次いで図14A
の1.に記載のリンカーを挿入した。図21に示したよ
うに、完全長Aサブユニット遺伝子をSau3AI断片
として単離し、HaeII部分消化をした。双頭のナン
センスコドンを含むストップリンカーをHdeII部位
に付加した反応生成物をBamHIで切断し、得られた
断片をpUC13に挿入した。
【0110】組換えプラスミドは、アミノ酸128×1
30をコード化するHaeII部位に及ぶオリゴヌクレ
オチドプローブTCCTGGCGCTCCTGCを用い
てスクリーニングし、小HaeII断片が正しい方向に
存在することを確認する。陽性クローンを取り、これを
精製する。次いで、それら挿入部を固定するため配列決
定した。2種の各々のクローンから、一つは正しい挿入
部を含み、他の一つは異なる起源のものを含んでいた。
この正しい挿入部を精製し、pUC13にリクローニン
グし、次いでE.コリに導入され、原初的発現のための
BTA1365を提供する。該分子の両端の3つの制限
部位によって、上記した他のベクターにサブクローニン
グすることができる。
30をコード化するHaeII部位に及ぶオリゴヌクレ
オチドプローブTCCTGGCGCTCCTGCを用い
てスクリーニングし、小HaeII断片が正しい方向に
存在することを確認する。陽性クローンを取り、これを
精製する。次いで、それら挿入部を固定するため配列決
定した。2種の各々のクローンから、一つは正しい挿入
部を含み、他の一つは異なる起源のものを含んでいた。
この正しい挿入部を精製し、pUC13にリクローニン
グし、次いでE.コリに導入され、原初的発現のための
BTA1365を提供する。該分子の両端の3つの制限
部位によって、上記した他のベクターにサブクローニン
グすることができる。
【0111】BTA1365によって製造される組換え
蛋白質は封入体として排出され、明らかにMW23.5
kダルトンを有し、BTA426およびBTA427
(図17)からの融合蛋白質と類似し、予見されるよう
に血清474によるウエスタンブロットで検出される。
全長プレプロAサブユニット遺伝子の構築法を図18〜
19に示した。この方法は基本的には、pBTA295
からPvuII−PvuII断片を単離し次いで図14
(Aii)に示したリンカー(りん酸化されていない)
を付加することから成り、これによりシグナルペプチド
の5′−位の最初の4つのアミノ酸(Met−60から
Gln−57)を最初のPvuII部位に再構築して
5′−末端にBamHI部位を与えることになる。リン
カー結合分子をSphIで切断しBamHIとSphI
とで切断したpBTA297中へライゲートしてpBT
A305を得る。この中間体は融合たん白質としてプレ
プロAサブユニットを発現する。インヒビンDNA断片
をHindIII−HindIII断片として又はEc
oRI−EcoRI断片として切り出し、次の工程で使
用する。特に、このEcoRI−EcoRI断片はpU
C9中でサブクローニングする。そのインヒビンcDN
A配列は、BamHI−BamHI断片として切り出さ
れ、ベクターpZIP NeoSV(X)1(Copk
o,C.L.等(1984年)のCell,37,10
53−1062)にリクローニングし、pBTA417
を提供する。
蛋白質は封入体として排出され、明らかにMW23.5
kダルトンを有し、BTA426およびBTA427
(図17)からの融合蛋白質と類似し、予見されるよう
に血清474によるウエスタンブロットで検出される。
全長プレプロAサブユニット遺伝子の構築法を図18〜
19に示した。この方法は基本的には、pBTA295
からPvuII−PvuII断片を単離し次いで図14
(Aii)に示したリンカー(りん酸化されていない)
を付加することから成り、これによりシグナルペプチド
の5′−位の最初の4つのアミノ酸(Met−60から
Gln−57)を最初のPvuII部位に再構築して
5′−末端にBamHI部位を与えることになる。リン
カー結合分子をSphIで切断しBamHIとSphI
とで切断したpBTA297中へライゲートしてpBT
A305を得る。この中間体は融合たん白質としてプレ
プロAサブユニットを発現する。インヒビンDNA断片
をHindIII−HindIII断片として又はEc
oRI−EcoRI断片として切り出し、次の工程で使
用する。特に、このEcoRI−EcoRI断片はpU
C9中でサブクローニングする。そのインヒビンcDN
A配列は、BamHI−BamHI断片として切り出さ
れ、ベクターpZIP NeoSV(X)1(Copk
o,C.L.等(1984年)のCell,37,10
53−1062)にリクローニングし、pBTA417
を提供する。
【0112】この様に5′PvuII、Sau3AIお
よびSphI部位はすべて43kDたん白質の発現に都
合の良いリンカー部位である。734番塩基から出発す
るHaeII部位は、アルギニン165から出発するA
サブユニットのAc部分の発現に好都合な部位である。
図14(Aiii)に記載のHaeII部位リンカーの
使用により、pUR290、pBTA286およびpU
C13中にβ−ガラクトシダーゼが融合生成物が発現し
ていた。これを達成するためにpBTA30からの所望
のHaeII−Sau3AI断片を精製し、リンカーを
付加した。得られた構築物をSau3AIで切断し、次
いでDNAを、大DNA断片を効率的に析出するが、リ
ンカーの様な小DNA断片を充分に析出しない、イソプ
ロパノールで2回析出させた。析出したDNAをTE中
に再溶解し、pUR290中にライゲートした。このプ
ラスミドをBTA634に形質転換した。得られたクロ
ーンと複写フィルター上に複写し、次いで各対の一方の
フィルターを、〔32P〕−標識HaeIIリンカー(図
14(Aiii)に示したDNA対の先端鎖)を使っ
て、又他方をプローブ4(図3を使って、実施例4のよ
うにしてスクリーニングした。両プローブから検出され
たクローンをとり出しWestern Blot分析に
より発現用の試験をした。この1方のクローンを図1
7、トラック7に示し、これをBTA421(表3)と
命名した。インヒビンAcサブユニットとその側鎖のβ
−ガラクトシダーゼDNA配列をコードするDNA断片
も又EcoRI断片として切り出し、融合たん白質とし
ての発現用のpBTA286中にライゲートした。この
融合たん白質は再度不溶性であり、従って精製および分
解防止に都合が良い。この株をBTA422と命名した
(ATCC67059、表3;図17、トラック2)。
よびSphI部位はすべて43kDたん白質の発現に都
合の良いリンカー部位である。734番塩基から出発す
るHaeII部位は、アルギニン165から出発するA
サブユニットのAc部分の発現に好都合な部位である。
図14(Aiii)に記載のHaeII部位リンカーの
使用により、pUR290、pBTA286およびpU
C13中にβ−ガラクトシダーゼが融合生成物が発現し
ていた。これを達成するためにpBTA30からの所望
のHaeII−Sau3AI断片を精製し、リンカーを
付加した。得られた構築物をSau3AIで切断し、次
いでDNAを、大DNA断片を効率的に析出するが、リ
ンカーの様な小DNA断片を充分に析出しない、イソプ
ロパノールで2回析出させた。析出したDNAをTE中
に再溶解し、pUR290中にライゲートした。このプ
ラスミドをBTA634に形質転換した。得られたクロ
ーンと複写フィルター上に複写し、次いで各対の一方の
フィルターを、〔32P〕−標識HaeIIリンカー(図
14(Aiii)に示したDNA対の先端鎖)を使っ
て、又他方をプローブ4(図3を使って、実施例4のよ
うにしてスクリーニングした。両プローブから検出され
たクローンをとり出しWestern Blot分析に
より発現用の試験をした。この1方のクローンを図1
7、トラック7に示し、これをBTA421(表3)と
命名した。インヒビンAcサブユニットとその側鎖のβ
−ガラクトシダーゼDNA配列をコードするDNA断片
も又EcoRI断片として切り出し、融合たん白質とし
ての発現用のpBTA286中にライゲートした。この
融合たん白質は再度不溶性であり、従って精製および分
解防止に都合が良い。この株をBTA422と命名した
(ATCC67059、表3;図17、トラック2)。
【0113】Acサブユニットをコードする新しいBa
mHI−Sau3AI断片も又pBTA218から切り
出され、短鎖融合たん白質生成のためにpUC13中に
サブクローニングされる。株BTA427(ATCC6
7056;表3)はこのたん白質を封入体として生成
し、これをゲル分析(図17、トラック15)すると、
再度BTA426と一緒になって、その最長融合たん白
質がWeetern Blot分析において再び最も顕
著でありそして最もはっきりと見られることがわかる。
これはBTA427がインヒビン様たん白質の産生のた
めのすぐれた宿主・ベクター結合系であることを示して
いる。pUC13におけるヒトAcサブユニット遺伝子
の発現は、ヒトゲノムDNAの436bpのPvuII
−BamHI断片を単離することによりなされるが、こ
の断片はλA2(セクション8)から誘導されるが、λ
Acサブユニットのコーディング領域を含有するもので
ある。
mHI−Sau3AI断片も又pBTA218から切り
出され、短鎖融合たん白質生成のためにpUC13中に
サブクローニングされる。株BTA427(ATCC6
7056;表3)はこのたん白質を封入体として生成
し、これをゲル分析(図17、トラック15)すると、
再度BTA426と一緒になって、その最長融合たん白
質がWeetern Blot分析において再び最も顕
著でありそして最もはっきりと見られることがわかる。
これはBTA427がインヒビン様たん白質の産生のた
めのすぐれた宿主・ベクター結合系であることを示して
いる。pUC13におけるヒトAcサブユニット遺伝子
の発現は、ヒトゲノムDNAの436bpのPvuII
−BamHI断片を単離することによりなされるが、こ
の断片はλA2(セクション8)から誘導されるが、λ
Acサブユニットのコーディング領域を含有するもので
ある。
【0114】HgaI消化後、
【0115】
【表7】
【0116】を付加し、生成物をBamHIで開裂し、
その後、pUC13のBamHI部位にライゲーション
する。プラスミド調製物はE.コリBTA652を形質
転換し、融合生成物としてhAcサブユニットを発現す
るクローンを単離した。このクローンはBTA1367
(=BTA652<pBTA472>)であり、融合ベ
クターの配列を図27に示す。この融合蛋白質と同等で
あるようなものは、ウエスタンブロットで抗血清474
により検出されるが、最大バンドは最も顕著である。
その後、pUC13のBamHI部位にライゲーション
する。プラスミド調製物はE.コリBTA652を形質
転換し、融合生成物としてhAcサブユニットを発現す
るクローンを単離した。このクローンはBTA1367
(=BTA652<pBTA472>)であり、融合ベ
クターの配列を図27に示す。この融合蛋白質と同等で
あるようなものは、ウエスタンブロットで抗血清474
により検出されるが、最大バンドは最も顕著である。
【0117】第14〜15および上記のリンカー1に示
した各リンカーの顕著な特徴は、DNAがBamHI部
位から正しく発現された時には、そのアミノ酸配列As
p−Proが融合たん白質中に導入されている。前記し
た様に、この配列はギ酸中で易変性であり、Aサブユニ
ットたん白質中にAsp−Pro配列を持たないたん白
質の上流(Nilsson,B.等(1985年)のN
ucl,Ac.Ree,13;1151〜1162)か
らインヒビンたん白質を切断するために使うことができ
る。融合たん白質から所望の配列を切断するその他の方
法も組合わせて使用することができる。例としては、プ
ロテアーゼ認識配列、例えばXa−因子認識配列(Na
gai,KおよびThogerson,H.C.(19
84年)のNature 309,810−812)又
はコラゲナーゼ認識配列(Sermino,J.および
Bastia,D(1984年)のProc.Nat
l.Acad.Sci.USA 81,4692−46
96)を導入する方法である。アルギニン対残基を認識
する酵素の使用可能性については先に述べた(実施例
9)。インヒビン配列の前にその上にメチオニンを導入
することにより、臭化シアンで融合生成物を切断してβ
−ガラクトシダーゼを含有しないインヒビン断片を得る
ことができる。インヒビン配列中のメチオニン残基は、
cDNAの生体外突然変異によって別のアミノ酸に変え
ることができ、従って、全長インヒビン様たん白質は融
合たん白質前駆体を含有しないものであろうから、これ
によりこの臭化シアン切断法の利用法が増大する。内部
メチオニン残基を変えることにより、更には、より好ま
しい抗原性又はインヒビン様作動性又は拮抗性を有する
分子とすることもできる。 (b) 15kDサブユニットの発現 pBTA293(図4)の510bp PstI cD
NA断片をPstI部位にライゲートし、次いでこのプ
ラスミドをE.コリBTA634中に形質転換した。得
られたクローンを、最初にpBTA293およびpBT
A294(プローブ2、図3)の単離に使用した。24
回変性した14−量体オリゴヌクレオチドを使用してス
クリーニングして形質転換プラスミドの存在を確認し
た。次いで数個のプラスミドを、制限酵素HindII
を使用して地図を作り、そして定位に挿入図を有する2
つのプラスミドをポリアクリルアミドゲル上での発現用
に分析した。この1個の株をBTA423(表3)と命
名した。
した各リンカーの顕著な特徴は、DNAがBamHI部
位から正しく発現された時には、そのアミノ酸配列As
p−Proが融合たん白質中に導入されている。前記し
た様に、この配列はギ酸中で易変性であり、Aサブユニ
ットたん白質中にAsp−Pro配列を持たないたん白
質の上流(Nilsson,B.等(1985年)のN
ucl,Ac.Ree,13;1151〜1162)か
らインヒビンたん白質を切断するために使うことができ
る。融合たん白質から所望の配列を切断するその他の方
法も組合わせて使用することができる。例としては、プ
ロテアーゼ認識配列、例えばXa−因子認識配列(Na
gai,KおよびThogerson,H.C.(19
84年)のNature 309,810−812)又
はコラゲナーゼ認識配列(Sermino,J.および
Bastia,D(1984年)のProc.Nat
l.Acad.Sci.USA 81,4692−46
96)を導入する方法である。アルギニン対残基を認識
する酵素の使用可能性については先に述べた(実施例
9)。インヒビン配列の前にその上にメチオニンを導入
することにより、臭化シアンで融合生成物を切断してβ
−ガラクトシダーゼを含有しないインヒビン断片を得る
ことができる。インヒビン配列中のメチオニン残基は、
cDNAの生体外突然変異によって別のアミノ酸に変え
ることができ、従って、全長インヒビン様たん白質は融
合たん白質前駆体を含有しないものであろうから、これ
によりこの臭化シアン切断法の利用法が増大する。内部
メチオニン残基を変えることにより、更には、より好ま
しい抗原性又はインヒビン様作動性又は拮抗性を有する
分子とすることもできる。 (b) 15kDサブユニットの発現 pBTA293(図4)の510bp PstI cD
NA断片をPstI部位にライゲートし、次いでこのプ
ラスミドをE.コリBTA634中に形質転換した。得
られたクローンを、最初にpBTA293およびpBT
A294(プローブ2、図3)の単離に使用した。24
回変性した14−量体オリゴヌクレオチドを使用してス
クリーニングして形質転換プラスミドの存在を確認し
た。次いで数個のプラスミドを、制限酵素HindII
を使用して地図を作り、そして定位に挿入図を有する2
つのプラスミドをポリアクリルアミドゲル上での発現用
に分析した。この1個の株をBTA423(表3)と命
名した。
【0118】pBTA213の510bp PstI
cDNA断片を直接pBTA286のPstI部位中に
クローニングし、融合たん白質発現のためにBTA63
4中へ形質転換した。pBTA286はpUR291由
来であり、従ってそのPstI部位を横切る読み枠の故
にこの直接クローニングが可能である。得られた株をB
TA424(ATCC67058;表3)と命名、これ
は封入体として融合たん白質を生成する。
cDNA断片を直接pBTA286のPstI部位中に
クローニングし、融合たん白質発現のためにBTA63
4中へ形質転換した。pBTA286はpUR291由
来であり、従ってそのPstI部位を横切る読み枠の故
にこの直接クローニングが可能である。得られた株をB
TA424(ATCC67058;表3)と命名、これ
は封入体として融合たん白質を生成する。
【0119】pBTA293の510bp PstI
cDNA断片を同様にpUC8のPstI票位中にクロ
ーニングし、そして不溶性短鎖融合たん白質の発現用に
BTA637中に形質転換して株BTA1360(AT
CC67055;表3)を作った。AおよびAcサブユ
ニットがそれぞれあるにもかかわらず、BTA423、
BTA424およびBTA1360からの融合たん白質
はいずれもウサギ抗インヒビン抗血清によっては検出さ
れなかった(図17、トラック1、6および16)。こ
れにより、15kDたん白質に対する抗体の準位が非常
に低いか又は0であることがわかり、従ってインヒビン
に対する免疫性に関連した生物学的作用はA又はAcサ
ブユニットの使用によってのみ達成可能であろうと思わ
れる(実施例17〜21も参照のこと)。
cDNA断片を同様にpUC8のPstI票位中にクロ
ーニングし、そして不溶性短鎖融合たん白質の発現用に
BTA637中に形質転換して株BTA1360(AT
CC67055;表3)を作った。AおよびAcサブユ
ニットがそれぞれあるにもかかわらず、BTA423、
BTA424およびBTA1360からの融合たん白質
はいずれもウサギ抗インヒビン抗血清によっては検出さ
れなかった(図17、トラック1、6および16)。こ
れにより、15kDたん白質に対する抗体の準位が非常
に低いか又は0であることがわかり、従ってインヒビン
に対する免疫性に関連した生物学的作用はA又はAcサ
ブユニットの使用によってのみ達成可能であろうと思わ
れる(実施例17〜21も参照のこと)。
【0120】又、15kD配列の発現は、15kD配列
の全部およびアルギニン−5から−1に及びHaeII
断片と単離することにより、そして図14(Aiii)
に示したHaeII部位リンカーを付加することにより
達成される。得られた融合コードは、第11(Bi)に
示しそして上記した様に、BamHI部位を使用したp
UR290/pUC7/pUC13中のβ−ガラクトシ
ダーゼ融合の発現に有用であり、かつAsp−Pro配
列における融合をぎ酸で切断し得る機能も有している。
尚、ClaI部位は、ATGが新しい翻訳開始部位とし
て機能しているptrpL1(Edman,J.C.等
(1981年)の上記文献)中における発現用にも使用
可能である。
の全部およびアルギニン−5から−1に及びHaeII
断片と単離することにより、そして図14(Aiii)
に示したHaeII部位リンカーを付加することにより
達成される。得られた融合コードは、第11(Bi)に
示しそして上記した様に、BamHI部位を使用したp
UR290/pUC7/pUC13中のβ−ガラクトシ
ダーゼ融合の発現に有用であり、かつAsp−Pro配
列における融合をぎ酸で切断し得る機能も有している。
尚、ClaI部位は、ATGが新しい翻訳開始部位とし
て機能しているptrpL1(Edman,J.C.等
(1981年)の上記文献)中における発現用にも使用
可能である。
【0121】発現のために可能な第3の手段は、特異H
indII部位を使用し、そして、図15(Bii)に
示すように、所望のリンカーとMet−1配列とを有す
るアミノ酸1〜8をコードするDNA配列を合成するこ
とである。こうして、PsrI、HaeIIおよびHi
ndII部位は全て発現リンカー付加用に好都合な部位
である。又、510bpPstI断片のHaeIIIに
よる部分消化の後で、アミノ酸1および2をつなぐHa
eIII部位(GGCC)を使用することもできる。
尚、発現系を種々変えることは当業者に周知の技術であ
り、AおよびAcサブユニットに関して前記した可能性
はいずれもBサブユニットに適用される。
indII部位を使用し、そして、図15(Bii)に
示すように、所望のリンカーとMet−1配列とを有す
るアミノ酸1〜8をコードするDNA配列を合成するこ
とである。こうして、PsrI、HaeIIおよびHi
ndII部位は全て発現リンカー付加用に好都合な部位
である。又、510bpPstI断片のHaeIIIに
よる部分消化の後で、アミノ酸1および2をつなぐHa
eIII部位(GGCC)を使用することもできる。
尚、発現系を種々変えることは当業者に周知の技術であ
り、AおよびAcサブユニットに関して前記した可能性
はいずれもBサブユニットに適用される。
【0122】プレプロAサブユニットおよびプロBサブ
ユニットcDNAに基ずくプレプロBサブユニットの構
成を図22に示す。インヒビンの該Bサブユニットを5
10bpPstI断片(図4)としてpBTA293か
ら単離した。HaeIIで該PstI断片を消化した
後、分離した365bpHaeII断片をHeaII部
位リンカー(図15B1)に結合させることによりBa
mHI断片に転換する。得られたBamHI断片をpZ
ipZeo SV(X)1のBamHI部位に結合さ
せ、次いで、E.コリを形質転換してBTA1419
(=ED8654 pBTA416)を得た。pZip
Neoの合成プレプロ遺伝子を構築するため、Aサブユ
ニットのシグナル配列をpBTAから160bpBam
HI−Sau3AI断片として単離した。これを下流B
amHI部位が削除されたpBTA416誘導体のBa
mHI部位に結合して、pBTA418である合成プレ
プロBベクターを得た。この構築を図23に示す。アミ
ノ酸−61〜−1の配列はシグナルペプチドにたった1
個のシステイン残基を含有する。従って、真核細胞中で
の発現の間、正しいジスルフィドの形成によって、Bサ
ブユニットの折りたたみが起こることが予想され、かつ
その合成前駆体からのBサブユニットのプロセッシング
は、Gly1前の5個のアルギニン残基に起こることが
なお予想される。
ユニットcDNAに基ずくプレプロBサブユニットの構
成を図22に示す。インヒビンの該Bサブユニットを5
10bpPstI断片(図4)としてpBTA293か
ら単離した。HaeIIで該PstI断片を消化した
後、分離した365bpHaeII断片をHeaII部
位リンカー(図15B1)に結合させることによりBa
mHI断片に転換する。得られたBamHI断片をpZ
ipZeo SV(X)1のBamHI部位に結合さ
せ、次いで、E.コリを形質転換してBTA1419
(=ED8654 pBTA416)を得た。pZip
Neoの合成プレプロ遺伝子を構築するため、Aサブユ
ニットのシグナル配列をpBTAから160bpBam
HI−Sau3AI断片として単離した。これを下流B
amHI部位が削除されたpBTA416誘導体のBa
mHI部位に結合して、pBTA418である合成プレ
プロBベクターを得た。この構築を図23に示す。アミ
ノ酸−61〜−1の配列はシグナルペプチドにたった1
個のシステイン残基を含有する。従って、真核細胞中で
の発現の間、正しいジスルフィドの形成によって、Bサ
ブユニットの折りたたみが起こることが予想され、かつ
その合成前駆体からのBサブユニットのプロセッシング
は、Gly1前の5個のアルギニン残基に起こることが
なお予想される。
【0123】確実かつ完全なプレプロBサブユニット遺
伝子は、真核細胞による発現のためにpBTA306、
pBTA294およびpBTA308からのセグメント
をスプライシングすることにより再構成され、かつサブ
ユニット前駆体の部分はそれら各々の機能を研究するた
めインビビンACおよびBサブユニット配列を独立に前
核細胞又は真核細胞に発現されることは明白である。
伝子は、真核細胞による発現のためにpBTA306、
pBTA294およびpBTA308からのセグメント
をスプライシングすることにより再構成され、かつサブ
ユニット前駆体の部分はそれら各々の機能を研究するた
めインビビンACおよびBサブユニット配列を独立に前
核細胞又は真核細胞に発現されることは明白である。
【0124】牛とヒトのBサブユニットのアミノ酸配列
は同一であるので、ウシBサブユニットをコードするc
DNAを発現させた場合、その生成物はヒトDNA配列
を使って同様に発現させて得た生成物と同一である。従
って、株BTA423、BTA424およびBTA13
60も又ヒトインヒビンのBサブユニットを生成すると
考えるべきである。完全長プレプロBサブユニットmR
NAをコードするDNAは特別なSacI部位(767
〜770塩基、図25)のプラスミドpBTA294お
よびpBTA306からのcDNAをスプライシングす
ることにより作られる。 c.真核細胞における発現 ベクターpBTA417およびpBTA418をNIH
3T3細胞に導入することにより真核細胞におけるイン
ヒビンサブユニットの発現を下記の操作によって独立
に、又は同時に行なった。
は同一であるので、ウシBサブユニットをコードするc
DNAを発現させた場合、その生成物はヒトDNA配列
を使って同様に発現させて得た生成物と同一である。従
って、株BTA423、BTA424およびBTA13
60も又ヒトインヒビンのBサブユニットを生成すると
考えるべきである。完全長プレプロBサブユニットmR
NAをコードするDNAは特別なSacI部位(767
〜770塩基、図25)のプラスミドpBTA294お
よびpBTA306からのcDNAをスプライシングす
ることにより作られる。 c.真核細胞における発現 ベクターpBTA417およびpBTA418をNIH
3T3細胞に導入することにより真核細胞におけるイン
ヒビンサブユニットの発現を下記の操作によって独立
に、又は同時に行なった。
【0125】トランスフェクションの前日、約2×10
5 個のNIH3T3細胞を培地5mlのT25フラスコ
にまいた。DNA(レトロウイルスまたはバクテリオフ
ァージラムダDNA)100ng−1μgをParke
r,B.A.とStark,G.R.(1979,J.
Virol,31,360−369)によって改変され
たGraham,F.L.とVander Eb,A.
J.(1973,Virol,52,456−467)
のリン酸カルシウム法によるトラスフェクションに用い
た。4時間後、グリセロールで刺激し、その後72時間
たって、該細胞をT75フラスコに1/3分取するが、
このフラスコには、1ml当たりG418を200μg
含有する完全培地を入れておく。培地を含むG418で
細胞を3〜4日ごとに洗浄し、集密的生長が完成するま
で14〜21日間***させる。
5 個のNIH3T3細胞を培地5mlのT25フラスコ
にまいた。DNA(レトロウイルスまたはバクテリオフ
ァージラムダDNA)100ng−1μgをParke
r,B.A.とStark,G.R.(1979,J.
Virol,31,360−369)によって改変され
たGraham,F.L.とVander Eb,A.
J.(1973,Virol,52,456−467)
のリン酸カルシウム法によるトラスフェクションに用い
た。4時間後、グリセロールで刺激し、その後72時間
たって、該細胞をT75フラスコに1/3分取するが、
このフラスコには、1ml当たりG418を200μg
含有する完全培地を入れておく。培地を含むG418で
細胞を3〜4日ごとに洗浄し、集密的生長が完成するま
で14〜21日間***させる。
【0126】NIH3T3細胞は牛胎児血清10%(v
/v)、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイ
シンで補充されたDulbecco modified
Eagle培地 (完全培地)に維持された。形質転
換された細胞および上清は、細胞が集密的生長に達した
時、即ち分取後約3日後インヒビンの発現を同定した。
細胞溶解物は、約2×107 細胞をトリプシン処理し、
PBS10mlの洗浄し、5mMリン酸ナトリウム緩衝
液1mlで再懸濁し、−20℃で凍結したものから調製
される。
/v)、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイ
シンで補充されたDulbecco modified
Eagle培地 (完全培地)に維持された。形質転
換された細胞および上清は、細胞が集密的生長に達した
時、即ち分取後約3日後インヒビンの発現を同定した。
細胞溶解物は、約2×107 細胞をトリプシン処理し、
PBS10mlの洗浄し、5mMリン酸ナトリウム緩衝
液1mlで再懸濁し、−20℃で凍結したものから調製
される。
【0127】RNAを調製するため、細胞(2×1
07 )を遠心分離により集め、95℃下で2mlの2×
NETS/フェノール(2×NETS=200mM N
aCl,2mM EDTA,20mM Tris−HC
l,pH7.5,1.0%SDS)にただちに再懸濁し
た。激しく攪拌した後、混合物は相が遠心分離により分
離する前に室温まで冷却された。
07 )を遠心分離により集め、95℃下で2mlの2×
NETS/フェノール(2×NETS=200mM N
aCl,2mM EDTA,20mM Tris−HC
l,pH7.5,1.0%SDS)にただちに再懸濁し
た。激しく攪拌した後、混合物は相が遠心分離により分
離する前に室温まで冷却された。
【0128】水相はフェノールにより再抽出され、RN
Aは最終水相から沈殿されるが、この時1/10容量の
3M酢酸ナトリウムと2容量のエタノールを添加した。
ドライアイス上で10分後、RNAを11,000g、
10分、4℃で遠心分離しペレット化した。RNAを水
に溶解し、DNAとtRNAを全核酸からLiClを
2.5Mまで添加することによって分離した。該水溶液
を4℃一晩静置し、LiCl−沈殿RNAsは、10分
間11,000g、4℃下、等容量3MLiClクッシ
ョンを通して遠心することにより分離した。最終RNA
ペレットを水から再沈殿し、70%エタノールで洗浄
し、乾燥し、滅菌蒸留水に溶解した。260nmの吸光
度で濃度を測定後、RNAを使用に供するまで−80℃
に貯蔵した。
Aは最終水相から沈殿されるが、この時1/10容量の
3M酢酸ナトリウムと2容量のエタノールを添加した。
ドライアイス上で10分後、RNAを11,000g、
10分、4℃で遠心分離しペレット化した。RNAを水
に溶解し、DNAとtRNAを全核酸からLiClを
2.5Mまで添加することによって分離した。該水溶液
を4℃一晩静置し、LiCl−沈殿RNAsは、10分
間11,000g、4℃下、等容量3MLiClクッシ
ョンを通して遠心することにより分離した。最終RNA
ペレットを水から再沈殿し、70%エタノールで洗浄
し、乾燥し、滅菌蒸留水に溶解した。260nmの吸光
度で濃度を測定後、RNAを使用に供するまで−80℃
に貯蔵した。
【0129】ノザーンブロット及びドットブロット分析
をベクターに起因するmRNA転写物の量とサイズを見
積るために用いた。RNA(5μg)をThomas,
P.S.,1980、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 77,5201−5205に記載され
ているようなグリオキシレーション後、1%アガロース
ゲルで分離した。RNAを直接、20×SSC存在下ニ
トロセルロースに移し、室温で1晩置いた。次いで、減
圧下80℃で2時間加熱した。フィルターを42℃で4
時間、50%フォルムアミド、5×SSC、10mM酢
酸ナトリウムpH6.5,250μgml-1DNA0.
02%PVP25,0.02%Ficoll 400中
でプレハイグリダイズし、次いで、ハイブリダイゼイシ
ョンを42℃で1晩行なったが、この時、プレハイブリ
ダイゼーション緩衝液に硫酸デキストラン10%まで、
および1μgDNAプローブ当たり2×109 cpmを
106 〜107 cpm含む緩衝液中で行なった。Acサ
ブユニットのプローブは788〜1149塩基(図5〜
6)を含む365bp cDNA断片であり、Bサブユ
ニットのプローブは504〜872塩基(図7〜8)を
含む369bp cDNA断片である。フィルターを6
5℃、0.1×SSC,0.1%SDSで洗浄し、次い
で−80℃でオートラジオグラフィーを実施した。
をベクターに起因するmRNA転写物の量とサイズを見
積るために用いた。RNA(5μg)をThomas,
P.S.,1980、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 77,5201−5205に記載され
ているようなグリオキシレーション後、1%アガロース
ゲルで分離した。RNAを直接、20×SSC存在下ニ
トロセルロースに移し、室温で1晩置いた。次いで、減
圧下80℃で2時間加熱した。フィルターを42℃で4
時間、50%フォルムアミド、5×SSC、10mM酢
酸ナトリウムpH6.5,250μgml-1DNA0.
02%PVP25,0.02%Ficoll 400中
でプレハイグリダイズし、次いで、ハイブリダイゼイシ
ョンを42℃で1晩行なったが、この時、プレハイブリ
ダイゼーション緩衝液に硫酸デキストラン10%まで、
および1μgDNAプローブ当たり2×109 cpmを
106 〜107 cpm含む緩衝液中で行なった。Acサ
ブユニットのプローブは788〜1149塩基(図5〜
6)を含む365bp cDNA断片であり、Bサブユ
ニットのプローブは504〜872塩基(図7〜8)を
含む369bp cDNA断片である。フィルターを6
5℃、0.1×SSC,0.1%SDSで洗浄し、次い
で−80℃でオートラジオグラフィーを実施した。
【0130】ゲノムDNAの調製のため、集めた細胞
(2×107 )をTNEバッファー(10mM Tri
s HCl,400mM NaCl,2mM EDT
A,pH8.2)および最終濃度0.5%まで添加され
たSDSに再懸濁された。混合後、プロティナーゼKを
20μgml-1添加し、37℃、1晩インキューベート
した。DNAを等容量のフェノールで2度各々15分間
抽出し、次いで1度クロロフォルム:イソアミルアルコ
ール(24:1)で抽出した。
(2×107 )をTNEバッファー(10mM Tri
s HCl,400mM NaCl,2mM EDT
A,pH8.2)および最終濃度0.5%まで添加され
たSDSに再懸濁された。混合後、プロティナーゼKを
20μgml-1添加し、37℃、1晩インキューベート
した。DNAを等容量のフェノールで2度各々15分間
抽出し、次いで1度クロロフォルム:イソアミルアルコ
ール(24:1)で抽出した。
【0131】DNAを最終水相からエタノール沈殿によ
り回収、巻き取り、次いでTE(10mM Tris
HCl,1mM EDTA pH7.5)に再溶解し
た。熱処理されたRNaseを400μgml-1添加
し、37℃、30分間インキュベートした後、SDSを
0.5%まで添加した。プロティナーゼKを20μgm
l-1まで添加し、インキュベーションを更に2時間続行
した。DNAを2度のフェノール処理と1度のクロロフ
ォルム:イソアミルアルコール処理の後、エタノール沈
殿により分離した。巻き取ったDNAを利用に供するま
でTEに溶解し、4℃に保存した。
り回収、巻き取り、次いでTE(10mM Tris
HCl,1mM EDTA pH7.5)に再溶解し
た。熱処理されたRNaseを400μgml-1添加
し、37℃、30分間インキュベートした後、SDSを
0.5%まで添加した。プロティナーゼKを20μgm
l-1まで添加し、インキュベーションを更に2時間続行
した。DNAを2度のフェノール処理と1度のクロロフ
ォルム:イソアミルアルコール処理の後、エタノール沈
殿により分離した。巻き取ったDNAを利用に供するま
でTEに溶解し、4℃に保存した。
【0132】サザーンブロット分析はベクターをゲノム
内への組込みを検知するため用いられたが、それは、組
込まれたコピーの数を見積る能力もある。DNA(10
μg)をDNA1μg当たり8〜10単位の酵素で消化
するが、この時、通常、提供者の推奨する条件下で37
℃、1晩実施される。試料をフェノール抽出し、エタノ
ールで沈殿さ、40mM Tris アセテート、1m
MEDTA,pH8.2を含有する0.7%アガロース
ゲルで電気泳動される。UV下、可視化の後、変成およ
び中和し、DNAはサザーン(1975)によって述べ
られているように通常20×SSC存在下のニトロセル
ロースへゲルから移される。一晩移行の後、フィルター
を5×SSCで軽く洗浄し、80℃、2時間、減圧下加
熱する。
内への組込みを検知するため用いられたが、それは、組
込まれたコピーの数を見積る能力もある。DNA(10
μg)をDNA1μg当たり8〜10単位の酵素で消化
するが、この時、通常、提供者の推奨する条件下で37
℃、1晩実施される。試料をフェノール抽出し、エタノ
ールで沈殿さ、40mM Tris アセテート、1m
MEDTA,pH8.2を含有する0.7%アガロース
ゲルで電気泳動される。UV下、可視化の後、変成およ
び中和し、DNAはサザーン(1975)によって述べ
られているように通常20×SSC存在下のニトロセル
ロースへゲルから移される。一晩移行の後、フィルター
を5×SSCで軽く洗浄し、80℃、2時間、減圧下加
熱する。
【0133】プレハイブリダイゼーションを最低4時
間、50%フォルムアミド、1×Denhardts,
25μgml-1,DNA,5×SSPE(SSPE:1
80mM NaCl,10mM NaH2 PO4 ,1m
M EDTA)中で実施し、ハイブリダイゼーションを
42℃、1晩、10%硫酸デキストリンおよび106 〜
107 cpmプローブ(1μg DNA当たりの比活性
2×109 cpm)を含有するプレハイブリダイゼーシ
ョンバッファ中で実施する。プローブは上述したもので
ある。フィルターを65℃、0.1×SSC、0.1%
SDSで洗浄し、−80℃でオートラジオグラフィーを
行なった。
間、50%フォルムアミド、1×Denhardts,
25μgml-1,DNA,5×SSPE(SSPE:1
80mM NaCl,10mM NaH2 PO4 ,1m
M EDTA)中で実施し、ハイブリダイゼーションを
42℃、1晩、10%硫酸デキストリンおよび106 〜
107 cpmプローブ(1μg DNA当たりの比活性
2×109 cpm)を含有するプレハイブリダイゼーシ
ョンバッファ中で実施する。プローブは上述したもので
ある。フィルターを65℃、0.1×SSC、0.1%
SDSで洗浄し、−80℃でオートラジオグラフィーを
行なった。
【0134】RIAはほとんどMcLachlan,
R.I.et al(1986;Mol.Cell.E
ndocrinol,46,175−185)に記載さ
れているが、トレーサーとしてI125 −ラベル化31K
D牛インヒビンを使用するものである。この検定法は、
変成サブユニットよりむしろ形態的に正確なインヒビン
あるいはサブユニットを検知する。使用される標準は、
HPLC精製31KDインヒビンで、0.4のB/I比
を有し、1.0のB/I比を有するbFFと対比され
る。
R.I.et al(1986;Mol.Cell.E
ndocrinol,46,175−185)に記載さ
れているが、トレーサーとしてI125 −ラベル化31K
D牛インヒビンを使用するものである。この検定法は、
変成サブユニットよりむしろ形態的に正確なインヒビン
あるいはサブユニットを検知する。使用される標準は、
HPLC精製31KDインヒビンで、0.4のB/I比
を有し、1.0のB/I比を有するbFFと対比され
る。
【0135】分取されたラットの脳下垂体細胞培養は、
国際特許公開WO86/00078に記載されているよ
うに、羊の網状組織液がスタンダードに用いられた。全
ての場合、正しいDNAがゲノム中に観察され、形質転
換させるベクターの組込みを示していた。またmRNA
はこれらの細胞中で生成されていた。しかしながら、組
込みコピー数、mRNAレベルおよび発現蛋白質間の明
確な関係はなかった。
国際特許公開WO86/00078に記載されているよ
うに、羊の網状組織液がスタンダードに用いられた。全
ての場合、正しいDNAがゲノム中に観察され、形質転
換させるベクターの組込みを示していた。またmRNA
はこれらの細胞中で生成されていた。しかしながら、組
込みコピー数、mRNAレベルおよび発現蛋白質間の明
確な関係はなかった。
【0136】一方、新しい細胞培養培地はバイオアッセ
イおよびRIAにおいてインヒビンを検知するのは不可
能であった、ベクターpBTA419により形質転換さ
れた細胞からの経過培地はバイオアッセイにおいて、F
SH抑制を低レベルに与えるが、これは、非特異的抑制
効果(図7〜8)と思われる。対照的に、pBTA41
7のAサブユニット遺伝子は、発現し、バイオアッセイ
およびRIA両者に検知可能な物質を与えるように分泌
される。この事はプレプロAサブユニット遺伝子単独か
らの1種又は複数の蛋白質はインヒビン様生物活性を有
していると思われるが、以前は単にABまたはAcBの
サブユニットの組合せをインヒビンとして分類していた
のもである。
イおよびRIAにおいてインヒビンを検知するのは不可
能であった、ベクターpBTA419により形質転換さ
れた細胞からの経過培地はバイオアッセイにおいて、F
SH抑制を低レベルに与えるが、これは、非特異的抑制
効果(図7〜8)と思われる。対照的に、pBTA41
7のAサブユニット遺伝子は、発現し、バイオアッセイ
およびRIA両者に検知可能な物質を与えるように分泌
される。この事はプレプロAサブユニット遺伝子単独か
らの1種又は複数の蛋白質はインヒビン様生物活性を有
していると思われるが、以前は単にABまたはAcBの
サブユニットの組合せをインヒビンとして分類していた
のもである。
【0137】生産された免疫活性物質の量は、培養培地
の細胞数に比例する〔Bサブユニットブロット〕。しか
しながら、宿主細胞自体が低レベルのBサブユニットを
作っているということを今だ除外することはできない。
トランスフェクション3からの試料のB/I比は天然の
インヒビンと接近しているので、この組換え物質は生物
活性が要請されているところ、例えば避妊剤の開発な
ど、どこへでも、天然のインヒビンと代替可能であるこ
とを示している。生物活性物質はまた、pBTA417
と418によるコトランスフェクションされた細胞から
の上清または各々のベクターを別々にトランスフェクシ
ョンした後混合された集合体からの上清に見られるがイ
ンヒビンの再構成を表わしている。
の細胞数に比例する〔Bサブユニットブロット〕。しか
しながら、宿主細胞自体が低レベルのBサブユニットを
作っているということを今だ除外することはできない。
トランスフェクション3からの試料のB/I比は天然の
インヒビンと接近しているので、この組換え物質は生物
活性が要請されているところ、例えば避妊剤の開発な
ど、どこへでも、天然のインヒビンと代替可能であるこ
とを示している。生物活性物質はまた、pBTA417
と418によるコトランスフェクションされた細胞から
の上清または各々のベクターを別々にトランスフェクシ
ョンした後混合された集合体からの上清に見られるがイ
ンヒビンの再構成を表わしている。
【0138】
【表8】
【0139】データはバイオアッセイ(B)またはRI
A(I)において決定されたが、単位/ml(培養上
清)として与えている。 ND:検知以下のレベルをふす。 * :純化細胞コロニーから得られたデータを示す。残
りのものは、細胞を混合した集合体を含有する形質転換
上清から得られたものである。
A(I)において決定されたが、単位/ml(培養上
清)として与えている。 ND:検知以下のレベルをふす。 * :純化細胞コロニーから得られたデータを示す。残
りのものは、細胞を混合した集合体を含有する形質転換
上清から得られたものである。
【0140】+ :各々のベクターを独立に形質転換
し、その後それらを混合した培養細胞を示す。 / :各々のベクターを同時にコトランスフェクション
した細胞を示す。 ヒト、牛および他の動物種(実施例7)間の類似性か
ら、上述と類似の構成はヒトを含む任意の種から生物活
性のある分子を発現するために用いられることができ
る。しかしながら、インヒビン蛋白質またはインヒビン
様蛋白質またはペプチドの発現は上述の実施例に限定さ
れない。
し、その後それらを混合した培養細胞を示す。 / :各々のベクターを同時にコトランスフェクション
した細胞を示す。 ヒト、牛および他の動物種(実施例7)間の類似性か
ら、上述と類似の構成はヒトを含む任意の種から生物活
性のある分子を発現するために用いられることができ
る。しかしながら、インヒビン蛋白質またはインヒビン
様蛋白質またはペプチドの発現は上述の実施例に限定さ
れない。
【0141】本発明における配列の発現は、従来公知の
前核細胞および真核細胞に用いられている多くの異なる
発現に対しても適用できるものである。 実施例11 抗インヒビン抗体の単離 BTA410およびBTA415からのβ−ガラクトシ
ダーゼ−インヒビン融合たん白質を含有するたん白質画
分を、カルボニルジイミダゾール法(Bethell,
G.S.等(1979)年のJ.Biol,Chem,
254;2572−2574)を使用してセファロース
CL−6Bに結合し、各融合たん白質に対する抗体をア
フイニテイ精製により1mlのウサギ抗インヒビン抗血
清から単離した。吸着した抗体を3MのMgCl2 でカ
ラムから溶出し、10mMのトリス−HCl/150m
MのNaCl(pH7.5)に対して透析した。
前核細胞および真核細胞に用いられている多くの異なる
発現に対しても適用できるものである。 実施例11 抗インヒビン抗体の単離 BTA410およびBTA415からのβ−ガラクトシ
ダーゼ−インヒビン融合たん白質を含有するたん白質画
分を、カルボニルジイミダゾール法(Bethell,
G.S.等(1979)年のJ.Biol,Chem,
254;2572−2574)を使用してセファロース
CL−6Bに結合し、各融合たん白質に対する抗体をア
フイニテイ精製により1mlのウサギ抗インヒビン抗血
清から単離した。吸着した抗体を3MのMgCl2 でカ
ラムから溶出し、10mMのトリス−HCl/150m
MのNaCl(pH7.5)に対して透析した。
【0142】溶出された抗体を各融合たん白質のWes
tern Blot分析に使用したところ、これらは、
それが単離された融合たん白質をのみ結合することが明
らかとなった。すなわち、交差結合性はなく、かつ抗イ
ンヒビン抗体に比べて抗β−ガラクトシダーゼ抗体の量
は無視し得る程度であった。株BTA425,420,
422および424からの融合たん白質についても同様
の実験を行った。
tern Blot分析に使用したところ、これらは、
それが単離された融合たん白質をのみ結合することが明
らかとなった。すなわち、交差結合性はなく、かつ抗イ
ンヒビン抗体に比べて抗β−ガラクトシダーゼ抗体の量
は無視し得る程度であった。株BTA425,420,
422および424からの融合たん白質についても同様
の実験を行った。
【0143】これらの実験の結果、組換えインヒビン又
はインヒビン様たん白質は、抗インヒビン抗体の精製や
抗インヒビン抗体用のモノクローナル又はポリクローナ
ル抗体製剤のスクリーニングならびにインヒビン分析
系、例えばELISAやRIA等における標準体として
使用することができる。 実施例12 合成ペプチドの合成 真核細胞および原核細胞中でのインヒビン様たん白質の
産生の代替法は、インヒビンの1部又は全部を化学的に
合成することである。この様な合成ペプチドは、インヒ
ビンの類縁体、作用剤および拮抗剤として使用すること
ができ、実施例10および11に記載の様な用途を有し
ている。
はインヒビン様たん白質は、抗インヒビン抗体の精製や
抗インヒビン抗体用のモノクローナル又はポリクローナ
ル抗体製剤のスクリーニングならびにインヒビン分析
系、例えばELISAやRIA等における標準体として
使用することができる。 実施例12 合成ペプチドの合成 真核細胞および原核細胞中でのインヒビン様たん白質の
産生の代替法は、インヒビンの1部又は全部を化学的に
合成することである。この様な合成ペプチドは、インヒ
ビンの類縁体、作用剤および拮抗剤として使用すること
ができ、実施例10および11に記載の様な用途を有し
ている。
【0144】合成ペプチドの合成、精製および特性決定
は次の様な方法で行った。430A型ペプチド合成装置
(Applied Biosyeteme Inc.)
を使用した。1.00版ソフトウエアを変更することな
くメーカーの処方通りに使用した。すべての使用薬剤
は、Applied Biosyeteme社供給のも
のを使用した。PAM樹脂と共有結合して供給されたC
末端アミノ酸(0.5mmol)を反応容器に装填し
た。合成の様子は、各樹脂のカップリング後のニンヒド
リン反応でモニターした。ペプチドに結合した樹脂の総
収量は約75%であった。
は次の様な方法で行った。430A型ペプチド合成装置
(Applied Biosyeteme Inc.)
を使用した。1.00版ソフトウエアを変更することな
くメーカーの処方通りに使用した。すべての使用薬剤
は、Applied Biosyeteme社供給のも
のを使用した。PAM樹脂と共有結合して供給されたC
末端アミノ酸(0.5mmol)を反応容器に装填し
た。合成の様子は、各樹脂のカップリング後のニンヒド
リン反応でモニターした。ペプチドに結合した樹脂の総
収量は約75%であった。
【0145】ペプチド結合樹脂を、スカベンジャークレ
ゾール(0.5ml)とチオクレゾール(0.5ml)
の存在下に0℃で1時間ふっ化水素酸(10ml)で処
理することによって樹脂からのペプチドの切断と脱保護
を行った。この切断と脱保護は、テフロンHF−型反応
装置(Protein Research Found
ation,大阪)中で行った。反応生成物をエーテル
(3×50ml)中ですりつぶし、ろ過し、次いで、こ
のペプチドを酢酸(10%)中に溶解し、ろ過し、そし
てろ液を凍結乾燥した。
ゾール(0.5ml)とチオクレゾール(0.5ml)
の存在下に0℃で1時間ふっ化水素酸(10ml)で処
理することによって樹脂からのペプチドの切断と脱保護
を行った。この切断と脱保護は、テフロンHF−型反応
装置(Protein Research Found
ation,大阪)中で行った。反応生成物をエーテル
(3×50ml)中ですりつぶし、ろ過し、次いで、こ
のペプチドを酢酸(10%)中に溶解し、ろ過し、そし
てろ液を凍結乾燥した。
【0146】残留物をアセトニトリル(10%)を含有
するトリフルオル酢酸(0.1%)中に溶解した。ペプ
チドを逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製し
て均質物とした。トリフルオル酢酸(0.1%)と10
〜80%に直線的に増加するアセトニトリルとを使用し
て傾斜溶出した。アルテックス(Altex)C8カラ
ムを分析クロマトグラフィーに使い、溶出液を連続的に
1ml/分の流速で220nmでモニターした。予備R
P−HPLCを、Vydac ProteinおよびP
eptides C18カラム(Cat,No.218T
P1010)を使って2〜4ml/分で操作して行っ
た。溶離液傾斜は各ペプチドの最適精製となる様に調節
した。アセトニトリルを蒸発させて精製ペプチドを回収
し次いで水相を凍結乾燥した。
するトリフルオル酢酸(0.1%)中に溶解した。ペプ
チドを逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製し
て均質物とした。トリフルオル酢酸(0.1%)と10
〜80%に直線的に増加するアセトニトリルとを使用し
て傾斜溶出した。アルテックス(Altex)C8カラ
ムを分析クロマトグラフィーに使い、溶出液を連続的に
1ml/分の流速で220nmでモニターした。予備R
P−HPLCを、Vydac ProteinおよびP
eptides C18カラム(Cat,No.218T
P1010)を使って2〜4ml/分で操作して行っ
た。溶離液傾斜は各ペプチドの最適精製となる様に調節
した。アセトニトリルを蒸発させて精製ペプチドを回収
し次いで水相を凍結乾燥した。
【0147】Waters Pico−tag Sys
temを使用して合成ペプチドのアミノ酸分析をした。
メーカー処方に従って行い、系をPTCアミノ酸で目盛
った。各ペプチドのアミノ酸組成は各アミノ酸の予想割
合と一致した。cDNA配列由来のAサブユニットアミ
ノ酸配列の2つの領域を最初に合成ペプチドの生成に使
用した。第1はHisIからAla26までであり、第
2はSer167からAsp195までであり、これは
インヒビンの43kD(A)および20kD(Ac)サ
ブユニットのN末端を含むものである。ペプチド1の全
配列を以下に示した。ここで各数字は図5〜6のアミノ
酸配列に従って表示した。ペプチド1
temを使用して合成ペプチドのアミノ酸分析をした。
メーカー処方に従って行い、系をPTCアミノ酸で目盛
った。各ペプチドのアミノ酸組成は各アミノ酸の予想割
合と一致した。cDNA配列由来のAサブユニットアミ
ノ酸配列の2つの領域を最初に合成ペプチドの生成に使
用した。第1はHisIからAla26までであり、第
2はSer167からAsp195までであり、これは
インヒビンの43kD(A)および20kD(Ac)サ
ブユニットのN末端を含むものである。ペプチド1の全
配列を以下に示した。ここで各数字は図5〜6のアミノ
酸配列に従って表示した。ペプチド1
【0148】
【表9】
【0149】この配列は最後の1個のアミノ酸コードを
使用して(H1 −A26)Kと省略することができ、ここ
にかつこ中のアミノ酸は図5〜6に挙げたインヒビン配
列を示す。ペプチド2はY(H1 −A26)Kである。こ
れはペプチド1にNH2 末端チロシンを付加して得られ
る。合成法としてはリジンから出発して行った。樹脂の
部分(75%)を除去し(ペプチド1)、次いでペプチ
ド2を生成するために、チロシン残基を残りの25%の
ペプチドに加えた。リジン残基はハブテンの製造を容易
にするために加えたものであり、チロシンは放射性よう
素化の部位を作るために加えたものである。実施例13 封入体の製造と精製 株BTA420とBTA422とBTA424は融合生
成物としてインヒビン様たん白質を生成する。これら3
種の株からたん白質はいずれも封入体と呼ばれる不溶性
塊状物として生体内に見られ、これは次の工程により生
成しそして精製される。
使用して(H1 −A26)Kと省略することができ、ここ
にかつこ中のアミノ酸は図5〜6に挙げたインヒビン配
列を示す。ペプチド2はY(H1 −A26)Kである。こ
れはペプチド1にNH2 末端チロシンを付加して得られ
る。合成法としてはリジンから出発して行った。樹脂の
部分(75%)を除去し(ペプチド1)、次いでペプチ
ド2を生成するために、チロシン残基を残りの25%の
ペプチドに加えた。リジン残基はハブテンの製造を容易
にするために加えたものであり、チロシンは放射性よう
素化の部位を作るために加えたものである。実施例13 封入体の製造と精製 株BTA420とBTA422とBTA424は融合生
成物としてインヒビン様たん白質を生成する。これら3
種の株からたん白質はいずれも封入体と呼ばれる不溶性
塊状物として生体内に見られ、これは次の工程により生
成しそして精製される。
【0150】1晩培養した培養物を2リットルのじやま
板付フラスコ中で2×1リットルの新鮮なLB(10g
のトリプトン/5gの酵母エキス/5gのNaCl;1
リットルにつき)中に1:50に希釈し、これを、培養
物濃度がOD=0.3−0.4になるまで37℃で振と
うした。イソプロヒル−B−D−チオガラクトシダーゼ
(IPTG:最終濃度0.1mM)を加えて2〜7時間
培養を続けた。封入体は最初2時間後に明相顆粒状に可
視となり次いで7時間後に実験的に最大のサイズおよび
量になった。
板付フラスコ中で2×1リットルの新鮮なLB(10g
のトリプトン/5gの酵母エキス/5gのNaCl;1
リットルにつき)中に1:50に希釈し、これを、培養
物濃度がOD=0.3−0.4になるまで37℃で振と
うした。イソプロヒル−B−D−チオガラクトシダーゼ
(IPTG:最終濃度0.1mM)を加えて2〜7時間
培養を続けた。封入体は最初2時間後に明相顆粒状に可
視となり次いで7時間後に実験的に最大のサイズおよび
量になった。
【0151】細胞を集め、便利のためにこのペレットを
1晩−80℃に冷凍した。細胞をもとの培養物1リット
ルにつき20mlのH2 O中に再けん濁し、フレンチプ
レス(French Press)を使用して破砕し
た。けん濁液を臭化フェニルメチルスルホニル(PMS
F)と5%のトリトンX−100中で0.1mMにし、
次いで1,200×Gで10分間遠心分離した。
1晩−80℃に冷凍した。細胞をもとの培養物1リット
ルにつき20mlのH2 O中に再けん濁し、フレンチプ
レス(French Press)を使用して破砕し
た。けん濁液を臭化フェニルメチルスルホニル(PMS
F)と5%のトリトンX−100中で0.1mMにし、
次いで1,200×Gで10分間遠心分離した。
【0152】上ずみ液を捨て、ペレットを超音波処理に
より、50mlの1M NaCl/5%トリトンX−1
00中に再けん濁し次いで遠心分離した。この洗浄工程
をくり返し、ペレットを最終的に超音波処理により、も
との培養物1リットルにつき2.5mlの1M NaC
l/5%トリトンλ−100中に再けん濁した。このけ
ん濁液をベックマン(Beckman)SW28回転器
中、60%(w/v)のしょ糖密度勾配上に層を作り、
32,000×Gで60分間遠心分離した。封入体はし
ょ糖クッションを通してペレットとなり、細胞枠片から
単離した。これらをH2 Oで洗い、少なくとも3か月
間、ポリアクリルアミドゲル上に見られるたん白質物質
として何の変化もなく−80℃で冷凍保存できる。 実施例14 抗原の製造 精製した封入体を2mg/mlの濃度に8M尿素/0.
1M DTT/0.1Mトリス−HCl(pH8.0)
中に、N2 雰囲気下37℃で2時間溶解した。溶液を1
2,000rpmで15分間遠心分離し、上ずみ液を1
晩4℃で少くとも2×5リットル交換して50mM N
aH2 PO4 /150mM NaCl(pH7.5)
(PBS)に対して透析した。透析バッグ中のたん白質
は白色のフロックとなり、これは更に精製することなく
使用した。その1mgをマウスに腹腔内注射したとこ
ろ,この物質は発熱物質やリポ多糖類を含まないことが
わかった。このフロックけん濁液を、同量の油性アジュ
バント、すなわちMarcol52;Montanid
e888(9:1)で乳化し、最終的に1mlにつき抗
原100−250μgの濃度にした。2種又はそれ以上
の出発物からの抗原がある場合には、各抗原の濃度を1
00−250μg/mlとした。
より、50mlの1M NaCl/5%トリトンX−1
00中に再けん濁し次いで遠心分離した。この洗浄工程
をくり返し、ペレットを最終的に超音波処理により、も
との培養物1リットルにつき2.5mlの1M NaC
l/5%トリトンλ−100中に再けん濁した。このけ
ん濁液をベックマン(Beckman)SW28回転器
中、60%(w/v)のしょ糖密度勾配上に層を作り、
32,000×Gで60分間遠心分離した。封入体はし
ょ糖クッションを通してペレットとなり、細胞枠片から
単離した。これらをH2 Oで洗い、少なくとも3か月
間、ポリアクリルアミドゲル上に見られるたん白質物質
として何の変化もなく−80℃で冷凍保存できる。 実施例14 抗原の製造 精製した封入体を2mg/mlの濃度に8M尿素/0.
1M DTT/0.1Mトリス−HCl(pH8.0)
中に、N2 雰囲気下37℃で2時間溶解した。溶液を1
2,000rpmで15分間遠心分離し、上ずみ液を1
晩4℃で少くとも2×5リットル交換して50mM N
aH2 PO4 /150mM NaCl(pH7.5)
(PBS)に対して透析した。透析バッグ中のたん白質
は白色のフロックとなり、これは更に精製することなく
使用した。その1mgをマウスに腹腔内注射したとこ
ろ,この物質は発熱物質やリポ多糖類を含まないことが
わかった。このフロックけん濁液を、同量の油性アジュ
バント、すなわちMarcol52;Montanid
e888(9:1)で乳化し、最終的に1mlにつき抗
原100−250μgの濃度にした。2種又はそれ以上
の出発物からの抗原がある場合には、各抗原の濃度を1
00−250μg/mlとした。
【0153】合成ペプチドをグルタルアルデヒド法に従
ってキーホールリンペットヘモシアニン(Keyhol
e limpet haemocyanine,KL
H)と結合させ(Briad,J.P.等(1985
年)のJ.Immunol,Methods,78,5
6−59)、そしてこの共役物を前記した様に乳化し
た。抗原を製造するのにたくさんの他の手段があり、又
免疫性付与についても他のたくさんの方法ややり方があ
ることに留意すべきである。抗原製造の別法としては、
例えば、フロイントの完全又は不完全アジュバント中へ
の乳化、アンヒドロゲル又はサポニン中への乳化又は抗
原含有ポリアクリルアミドゲル切片の温浸等がある。又
これとは別に、抗原はアジバントを使用することなく投
与しても良い。投与形態としては、経口投与、粘膜を通
しての投与、筋肉内投与、腹腔内投与あるいは皮下投与
等がある。又、ペプチド又はたん白質の抗原性増強にも
たくさんの方法があり、例えば自分自身との架橋、他の
たん白質との架橋あるいは残基の変性や配列の変更等が
挙げられる。 実施例15 免疫付与方法 下記の動物についてまず図1の注射をし(0週目)、次
に4週間後に促進剤を注射した。各フロック抗原の投与
量は下記の通りである。
ってキーホールリンペットヘモシアニン(Keyhol
e limpet haemocyanine,KL
H)と結合させ(Briad,J.P.等(1985
年)のJ.Immunol,Methods,78,5
6−59)、そしてこの共役物を前記した様に乳化し
た。抗原を製造するのにたくさんの他の手段があり、又
免疫性付与についても他のたくさんの方法ややり方があ
ることに留意すべきである。抗原製造の別法としては、
例えば、フロイントの完全又は不完全アジュバント中へ
の乳化、アンヒドロゲル又はサポニン中への乳化又は抗
原含有ポリアクリルアミドゲル切片の温浸等がある。又
これとは別に、抗原はアジバントを使用することなく投
与しても良い。投与形態としては、経口投与、粘膜を通
しての投与、筋肉内投与、腹腔内投与あるいは皮下投与
等がある。又、ペプチド又はたん白質の抗原性増強にも
たくさんの方法があり、例えば自分自身との架橋、他の
たん白質との架橋あるいは残基の変性や配列の変更等が
挙げられる。 実施例15 免疫付与方法 下記の動物についてまず図1の注射をし(0週目)、次
に4週間後に促進剤を注射した。各フロック抗原の投与
量は下記の通りである。
【0154】 ウサギ 100 μg/回 ヒツジ 250 〃 ブ タ 200−250 〃 ラット 100 〃 尚、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結
合した合成ペプチド(ペプチド1,実施例10)は、1
回につき100μgの接合体をウサギに投与して使っ
た。 実施例16 抗血清の分析 血液試料を規則的に採取する。代表的な放血法は次の通
りである。第1回目の注射の前に1回放血し、ブースタ
ー投与前に1回またはそれ以上放血し、更にブースター
投与時および投与後に毎週放血する。この血液を一晩4
℃で凝血させ、そして遠心分離後に血清を除く。血清を
整除数個に分けて、抗体およびFSH力価の分析中に−
20℃に冷凍して保存した。
合した合成ペプチド(ペプチド1,実施例10)は、1
回につき100μgの接合体をウサギに投与して使っ
た。 実施例16 抗血清の分析 血液試料を規則的に採取する。代表的な放血法は次の通
りである。第1回目の注射の前に1回放血し、ブースタ
ー投与前に1回またはそれ以上放血し、更にブースター
投与時および投与後に毎週放血する。この血液を一晩4
℃で凝血させ、そして遠心分離後に血清を除く。血清を
整除数個に分けて、抗体およびFSH力価の分析中に−
20℃に冷凍して保存した。
【0155】血清は3種の違った実験条件下で試験し
た。 (a) トレーサー結合 よう素化した58kDおよび31kDインヒビンとの抗
体結合性を測定し、これにより抗体が在来のウシインヒ
ビンを認識可能かどうかを調べた。トレーサー抗体錯化
合物を第2抗体を使用して沈でんさせ、ペレット中の放
射性を、反応系中の全カウント数のパーセントで表わし
た。
た。 (a) トレーサー結合 よう素化した58kDおよび31kDインヒビンとの抗
体結合性を測定し、これにより抗体が在来のウシインヒ
ビンを認識可能かどうかを調べた。トレーサー抗体錯化
合物を第2抗体を使用して沈でんさせ、ペレット中の放
射性を、反応系中の全カウント数のパーセントで表わし
た。
【0156】よう素化工程は次の通りである。精製した
58kD又は31kDインヒビン(25μlの電気溶出
緩衝液中に1〜2μg)(国際特許出願PCT/AU8
5/00119)を25μlの0.5Mりん酸緩衝液
(pH7.2)に加えた。Na125 I(0.5mCi,
5μl,Amersham,Bucks,UK)を加え
た。クロラミンT(40μl)をクロラミンT:ホルモ
ン=8:1の割合で加えた。反応を攪拌下に室温で60
秒間行い、20μlのメタ重亜硫酸ナトリウム(3mg
/ml)を加えて反応を停止した。反応混合物を20m
Mりん酸緩衝液/0.1%BSA又は0.5%Poly
pep(pH6.0)で500μlとし、セファデック
スG25カラム(PD10,Pharmacia,Up
pealapSweden)上でゲルろ過して遊離の
125Iを除いた。不活性画分を集め20mlにし、20
0μlのMatrex Red A(Amicon,D
envers,Mass.,USA)に供給し、次いで
400mM KClを含有するりん酸緩衝液で洗浄し、
溶出物を除去した。 125I−インヒビンをりん酸緩衝液
中の1M KCl/4M尿素で溶出した。このよう素化
インヒビンを更に適当なRIA緩衝液(下記参照)を有
するセファデックスG25カラム上でゲルろ過し、KC
l/尿素を除去した。
58kD又は31kDインヒビン(25μlの電気溶出
緩衝液中に1〜2μg)(国際特許出願PCT/AU8
5/00119)を25μlの0.5Mりん酸緩衝液
(pH7.2)に加えた。Na125 I(0.5mCi,
5μl,Amersham,Bucks,UK)を加え
た。クロラミンT(40μl)をクロラミンT:ホルモ
ン=8:1の割合で加えた。反応を攪拌下に室温で60
秒間行い、20μlのメタ重亜硫酸ナトリウム(3mg
/ml)を加えて反応を停止した。反応混合物を20m
Mりん酸緩衝液/0.1%BSA又は0.5%Poly
pep(pH6.0)で500μlとし、セファデック
スG25カラム(PD10,Pharmacia,Up
pealapSweden)上でゲルろ過して遊離の
125Iを除いた。不活性画分を集め20mlにし、20
0μlのMatrex Red A(Amicon,D
envers,Mass.,USA)に供給し、次いで
400mM KClを含有するりん酸緩衝液で洗浄し、
溶出物を除去した。 125I−インヒビンをりん酸緩衝液
中の1M KCl/4M尿素で溶出した。このよう素化
インヒビンを更に適当なRIA緩衝液(下記参照)を有
するセファデックスG25カラム上でゲルろ過し、KC
l/尿素を除去した。
【0157】58kDおよび31kDインヒビンのよう
素化に続き、セファデックスG25上でのゲルクロマト
グラフィー後の不活性体積画分中のそれぞれ60μCi
および25μCiを回収した。約30%が1M KCl
/4M尿素緩衝液で溶出された。SDS−PAGEにお
ける分子量から決定した 125I−インヒビンはこの画分
中に見出された。
素化に続き、セファデックスG25上でのゲルクロマト
グラフィー後の不活性体積画分中のそれぞれ60μCi
および25μCiを回収した。約30%が1M KCl
/4M尿素緩衝液で溶出された。SDS−PAGEにお
ける分子量から決定した 125I−インヒビンはこの画分
中に見出された。
【0158】よう素化製剤の特異活性は、基準体のよう
素化に使ったホルモンを使用する自己置換法(Mara
na等(1979年)のActa Endocrino
l(Kbh.)92,585−598)によるラジオイ
ムノアッセイ(RIA)により決定された。 125I−5
8kDインヒビンの特異活性は50−60μCi/μg
で、 125I−31kDインヒビンのそれは24μCi/
μgであり、それぞれの回収率は5−25%であった。
素化に使ったホルモンを使用する自己置換法(Mara
na等(1979年)のActa Endocrino
l(Kbh.)92,585−598)によるラジオイ
ムノアッセイ(RIA)により決定された。 125I−5
8kDインヒビンの特異活性は50−60μCi/μg
で、 125I−31kDインヒビンのそれは24μCi/
μgであり、それぞれの回収率は5−25%であった。
【0159】在来58kDインヒビンで免疫したウサギ
474からの抗インヒビン抗血清は生来のインヒビンの
生物活性を失っており、よう素化58および31kDイ
ンヒビンと強力に結合するが、各インヒビンの分離した
サブユニットとはほとんど結合しない。この事は、よう
素化はその分子にそれほど重大変化を与えていないこと
がわかる。従って被検抗血清のよう素化インヒビンとの
結合能は、該抗血清の在来インヒビンを認識する能力で
あるとみなされる。 (b) 生体外生物学的定量(バイオアッセイ) 前記したバイオアッセイ(国際特許出願PCT/AU8
5/00119)において、抗血清は在来インヒビンの
生物活性を抑制する能力を有するのであるから、中和抗
体が存在するものと認められる。 (c) FSH。
474からの抗インヒビン抗血清は生来のインヒビンの
生物活性を失っており、よう素化58および31kDイ
ンヒビンと強力に結合するが、各インヒビンの分離した
サブユニットとはほとんど結合しない。この事は、よう
素化はその分子にそれほど重大変化を与えていないこと
がわかる。従って被検抗血清のよう素化インヒビンとの
結合能は、該抗血清の在来インヒビンを認識する能力で
あるとみなされる。 (b) 生体外生物学的定量(バイオアッセイ) 前記したバイオアッセイ(国際特許出願PCT/AU8
5/00119)において、抗血清は在来インヒビンの
生物活性を抑制する能力を有するのであるから、中和抗
体が存在するものと認められる。 (c) FSH。
【0160】ヒツジFSHの血清準位を、ウサギ抗ヒツ
ジFSH血清とトレーサーとしてのよう素化ヒツジFS
Hとを使用するラジオイムノアッセイ法により決定し
た。又ウサギFSHの血清準位をモルモット抗ウサギF
SH血清とトレーサーとしてのよう素化ウサギFSHと
を使用するラジオイムノアッセイ法により決定した。F
SH力価における増加は、組換え体に対して生起した抗
体循環からの内因性インヒビンの除去の際に認められる
と思われる。 実施例17 ヒツジ実験 9匹の動物のグループ(白めん羊、実験中発情期にない
ものを選んだ)を、表5に示した1つの又は1対のフロ
ック抗体で免疫し、その血清を実施例16の様にして分
析した。 (a) トレーサー結合実験。
ジFSH血清とトレーサーとしてのよう素化ヒツジFS
Hとを使用するラジオイムノアッセイ法により決定し
た。又ウサギFSHの血清準位をモルモット抗ウサギF
SH血清とトレーサーとしてのよう素化ウサギFSHと
を使用するラジオイムノアッセイ法により決定した。F
SH力価における増加は、組換え体に対して生起した抗
体循環からの内因性インヒビンの除去の際に認められる
と思われる。 実施例17 ヒツジ実験 9匹の動物のグループ(白めん羊、実験中発情期にない
ものを選んだ)を、表5に示した1つの又は1対のフロ
ック抗体で免疫し、その血清を実施例16の様にして分
析した。 (a) トレーサー結合実験。
【0161】19匹から顕著なトレーサー結合能(表1
0)を有する血清(ブースター投与後2週間目)が採取
された。これらの動物はすべて、プラシーボコントロー
ル群(A群)およびpBTA301からの15kDサブ
ユニット融合たん白質で免疫した群(C群)以外の群の
ものであった。最高の応答は673番の動物(D群)に
みられ、これは1、1000の希釈条件下で31kDト
レーサーとの10%結合能および58kDトレーサーと
の3.1%結合能を示した。
0)を有する血清(ブースター投与後2週間目)が採取
された。これらの動物はすべて、プラシーボコントロー
ル群(A群)およびpBTA301からの15kDサブ
ユニット融合たん白質で免疫した群(C群)以外の群の
ものであった。最高の応答は673番の動物(D群)に
みられ、これは1、1000の希釈条件下で31kDト
レーサーとの10%結合能および58kDトレーサーと
の3.1%結合能を示した。
【0162】
【表10】
【0163】表中に記載のない動物はすべて1%より少
ない結合度であった。この様に、組換えインヒビンサブ
ユニットは、これを抗原として使用した時に、生来のイ
ンヒビンを認識し得る抗血清をヒツジ中に生起せしめる
能力を有する。尚、(i)これらの実験により血清中の
遊離の抗体が検出され、かつヒツジインヒビンに対して
最高の親和性を有する抗体は実際にヒツジインヒビンと
結合しておりこの実験の分析では検出されなく、そして
(ii)スクリーニングは、弱陽性血清の希釈力価を多
分超えた1:1000の希釈度で行った点に留意すべき
である。 (b) 生体外バイオアッセイによるデータ 本実験条件(2Vインヒビンにつき1μlの抗血清)下
においては、いずれの血清も、下垂体細胞培養バイオア
ッセイでの生体外インヒビン活性中和を示さなかった。 (c) FSH力価 各動物群の血清FSH準位を表11に示した。コントロ
ール群(A)とは顕著な違いが見られなかったが、1時
的ではあっても顕著な増加が被検群全部(1群を除き)
に見られた。
ない結合度であった。この様に、組換えインヒビンサブ
ユニットは、これを抗原として使用した時に、生来のイ
ンヒビンを認識し得る抗血清をヒツジ中に生起せしめる
能力を有する。尚、(i)これらの実験により血清中の
遊離の抗体が検出され、かつヒツジインヒビンに対して
最高の親和性を有する抗体は実際にヒツジインヒビンと
結合しておりこの実験の分析では検出されなく、そして
(ii)スクリーニングは、弱陽性血清の希釈力価を多
分超えた1:1000の希釈度で行った点に留意すべき
である。 (b) 生体外バイオアッセイによるデータ 本実験条件(2Vインヒビンにつき1μlの抗血清)下
においては、いずれの血清も、下垂体細胞培養バイオア
ッセイでの生体外インヒビン活性中和を示さなかった。 (c) FSH力価 各動物群の血清FSH準位を表11に示した。コントロ
ール群(A)とは顕著な違いが見られなかったが、1時
的ではあっても顕著な増加が被検群全部(1群を除き)
に見られた。
【0164】この様に、組換えインヒビンは家畜動物に
おけるFSH力価を増加する抗原として使用することが
できる。FSHは***率を増加することが知られている
ので、従って組換えインヒビンに対する免疫は***率を
増加するものであると期待出来、かつこれは生殖改善の
ための生殖能増強剤としての使用が期待される。更に
又、FSHは雄における***生成および雌における卵子
生成を調節する作用を有しているので、生物化成組換え
インヒビンの投与によってFSH準位を低下させ、従っ
て雄および雌の両方用の避妊薬としてこれを使用するこ
とも出来る。
おけるFSH力価を増加する抗原として使用することが
できる。FSHは***率を増加することが知られている
ので、従って組換えインヒビンに対する免疫は***率を
増加するものであると期待出来、かつこれは生殖改善の
ための生殖能増強剤としての使用が期待される。更に
又、FSHは雄における***生成および雌における卵子
生成を調節する作用を有しているので、生物化成組換え
インヒビンの投与によってFSH準位を低下させ、従っ
て雄および雌の両方用の避妊薬としてこれを使用するこ
とも出来る。
【0165】
【表11】
【0166】上記データは、群平均±標準偏差である。
被検群は表5と同じである。第4週目のデータとその後
の週のデータとの間の統計的な比較を、同じ群の動物間
の1対のt−試験において行った。 (*) P<0.05 (**) P<0.01実施例18 ウサギ実験 在来58kD又は31kDインヒビンで、又はプラスミ
ドpBTA297,299又は301を有する細胞から
の融合たん白質で、又は合成ペプチド1(実施例10)
を含有する接合たん白質で免疫した、去勢していない雄
ウサギからの抗血清を、トレーサー結合系で分析した。
結果を表12に示した。
被検群は表5と同じである。第4週目のデータとその後
の週のデータとの間の統計的な比較を、同じ群の動物間
の1対のt−試験において行った。 (*) P<0.05 (**) P<0.01実施例18 ウサギ実験 在来58kD又は31kDインヒビンで、又はプラスミ
ドpBTA297,299又は301を有する細胞から
の融合たん白質で、又は合成ペプチド1(実施例10)
を含有する接合たん白質で免疫した、去勢していない雄
ウサギからの抗血清を、トレーサー結合系で分析した。
結果を表12に示した。
【0167】
【表12】
【0168】動物番号474の血清は1:2000に希
釈したものを使用し、他は全部1:1000に希釈して
使用した。これらのデータから又、組換えインヒビンサ
ブユニットおよび合成ペプチドは、在来インヒビンを認
識しかつこれを結合し得る抗体を含めての抗体応答を誘
発し得ることがわかる。応答は動物によって変るが、組
変え15kD抗原(BTA424由来)はすべての被検
ウサギにおいて顕著な応答を誘発しない事から、474
番ウサギからの血清中のすべての抗体(これは在来58
kDインヒビンに対して生起されたものである)は本実
験に関する限り43kDインヒビンに対する抗体である
と思われ、従って15kDサブユニットはウサギにおい
てはほとんど抗原性を有しないと認められる。しかしこ
の事実は、このサブユニットが他の種において有用でな
いだろう事を意味するものではない。これらの結果から
又、15kDサブユニットに対する充分な抗原性応答を
達成するためには、その構造、配列又は構成に何らかの
変更を与える事が必要であろうと思われる。又同様に、
20kDサブユニットもウサギにおいては貧抗原であ
る。
釈したものを使用し、他は全部1:1000に希釈して
使用した。これらのデータから又、組換えインヒビンサ
ブユニットおよび合成ペプチドは、在来インヒビンを認
識しかつこれを結合し得る抗体を含めての抗体応答を誘
発し得ることがわかる。応答は動物によって変るが、組
変え15kD抗原(BTA424由来)はすべての被検
ウサギにおいて顕著な応答を誘発しない事から、474
番ウサギからの血清中のすべての抗体(これは在来58
kDインヒビンに対して生起されたものである)は本実
験に関する限り43kDインヒビンに対する抗体である
と思われ、従って15kDサブユニットはウサギにおい
てはほとんど抗原性を有しないと認められる。しかしこ
の事実は、このサブユニットが他の種において有用でな
いだろう事を意味するものではない。これらの結果から
又、15kDサブユニットに対する充分な抗原性応答を
達成するためには、その構造、配列又は構成に何らかの
変更を与える事が必要であろうと思われる。又同様に、
20kDサブユニットもウサギにおいては貧抗原であ
る。
【0169】699番ウサギの毛清準位は、ペプチド1
・KLH接合抗原(図20)での強化免疫後に突然減少
して0になり、又698番ウサギでは徐々に減少するこ
とがわかる。各動物の応答は、58kDトレーサーに対
するその抗血清力価と相互関係がある。又、合成ペプチ
ド自体又はそれに対する抗血清は生体外ラット下垂体細
胞バイオアッセイにおいて作用せず、これらはインヒビ
ン受容体に対して直接作用をしない。従って、FSHは
***形成および卵子形成に関与する(実施例19参照)
ので、このペプチドおよびその誘導体は、雄および雌の
両方に対して避妊薬として使用可能なものである。更に
又、これはAN 断片のNH2 −末端部であるので、AN
断片自身又はウシ、ヒト又はその他の脊椎動物種のAN
断片由来のその他の合成ペプチドも又、ここに観察され
た応答が抗体を介するものであるとするならば、同様な
用達を有するものと認められる。又、生物活性AN 断片
又はその部分を抗原としてではなく投与する場合にはF
SH準位が増加することが予想され、従って、これらは
生殖能改善のための生殖増強剤として作用することが予
想される(実施例19も参照)。 実施例19 ブタ実験 本実験の方法は前記の例の場合とは異なる。
・KLH接合抗原(図20)での強化免疫後に突然減少
して0になり、又698番ウサギでは徐々に減少するこ
とがわかる。各動物の応答は、58kDトレーサーに対
するその抗血清力価と相互関係がある。又、合成ペプチ
ド自体又はそれに対する抗血清は生体外ラット下垂体細
胞バイオアッセイにおいて作用せず、これらはインヒビ
ン受容体に対して直接作用をしない。従って、FSHは
***形成および卵子形成に関与する(実施例19参照)
ので、このペプチドおよびその誘導体は、雄および雌の
両方に対して避妊薬として使用可能なものである。更に
又、これはAN 断片のNH2 −末端部であるので、AN
断片自身又はウシ、ヒト又はその他の脊椎動物種のAN
断片由来のその他の合成ペプチドも又、ここに観察され
た応答が抗体を介するものであるとするならば、同様な
用達を有するものと認められる。又、生物活性AN 断片
又はその部分を抗原としてではなく投与する場合にはF
SH準位が増加することが予想され、従って、これらは
生殖能改善のための生殖増強剤として作用することが予
想される(実施例19も参照)。 実施例19 ブタ実験 本実験の方法は前記の例の場合とは異なる。
【0170】末経産の雌ブタ(22−23週令)を、B
TA425由来β−ガラクトシダーゼフロック抗原75
0μgで(16匹、コントロール群)、又はBTA42
2、BTA424およびBTA426由来の各サブユニ
ットフロック抗原の各250μgを含有する混合物で
(16匹、テスト群)それぞれ免疫した。初回免疫後2
5日目と更に47日目に同様のブースターを投与した。
初回免疫後60日目に血清を採取し、トレーサー結合法
により抗インヒビン抗体を分析した。これらの雌ブタは
発情を示し、60日後の第1回発情期に交尾させた。
TA425由来β−ガラクトシダーゼフロック抗原75
0μgで(16匹、コントロール群)、又はBTA42
2、BTA424およびBTA426由来の各サブユニ
ットフロック抗原の各250μgを含有する混合物で
(16匹、テスト群)それぞれ免疫した。初回免疫後2
5日目と更に47日目に同様のブースターを投与した。
初回免疫後60日目に血清を採取し、トレーサー結合法
により抗インヒビン抗体を分析した。これらの雌ブタは
発情を示し、60日後の第1回発情期に交尾させた。
【0171】15匹の被検動物からの血清を、1:10
0の希釈条件下にトレーサー結合能を分析したところ、
これらの内の10匹の血清は1.7〜9.0%(X=
4.9±2.5)の範囲の 125I−58kDインヒビン
との結合能を示した。更に、125I−58kDインヒビ
ンに対して2.0%の結合能を有する1例は 125I−3
1kDインヒビンに対しても6.4%の結合能を示し
た。コントロール血清の6例はいずれも両トレーサーに
対してはっきりした結合性を示さず、これより組換えイ
ンヒビンサブユニットはブタの抗原性応答誘発が可能で
あり、従って在来インヒビンを認識する抗体となり得る
ことが明らかとなった。
0の希釈条件下にトレーサー結合能を分析したところ、
これらの内の10匹の血清は1.7〜9.0%(X=
4.9±2.5)の範囲の 125I−58kDインヒビン
との結合能を示した。更に、125I−58kDインヒビ
ンに対して2.0%の結合能を有する1例は 125I−3
1kDインヒビンに対しても6.4%の結合能を示し
た。コントロール血清の6例はいずれも両トレーサーに
対してはっきりした結合性を示さず、これより組換えイ
ンヒビンサブユニットはブタの抗原性応答誘発が可能で
あり、従って在来インヒビンを認識する抗体となり得る
ことが明らかとなった。
【0172】ブタの発情期は、60日目の採血の後に2
1〜27日周期であり、本実験の被検動物は全て発性を
示し従って交尾するものと予測された。表13はコント
ロール群およびテスト群の交尾データを示す。しかし、
下記分析の結果から、この実験処理により多くのテスト
群の動物は交尾しなかったことがわかる。
1〜27日周期であり、本実験の被検動物は全て発性を
示し従って交尾するものと予測された。表13はコント
ロール群およびテスト群の交尾データを示す。しかし、
下記分析の結果から、この実験処理により多くのテスト
群の動物は交尾しなかったことがわかる。
【0173】
【表13】
【0174】抗58kDインヒビン抗体を有する10例
の血清の内9例は1:100の希釈条件下において31
kDインヒビンを検出しなかったので、上記のデータは
58kDインヒビンのAN 断片に対する抗体作用を示す
ものであり、この抗体の大部分はAN 特異性であると考
えられる。この仮説はウサギ実験において、すなわち、
ペプチド1を抗原として投与した場合に、FSH準位が
低下し(実施例18)そしてその1つの結果として、雌
の脊椎動物において発情期周期と卵胞形成が停止するこ
とになることによって裏付けられている。58kDイン
ヒビンよりも31kDインヒビンに対してより高い抗体
力価を持つ血清を生成した1例は本実験の期間中に正常
に交尾した。又次の様に説明することもできる。例え
ば、43kD抗原はプレプロAサブユニットのアミノ酸
−10から−1を持っており、この配列が前記作用をも
たらすものである。しかしこの逆説的な結果が生体内で
達成されたといういかなる作用機能によっても、そのデ
ータはFSHと従って生殖機能およびその過程の調整剤
としてのインヒビンの作用を強調するものであり、かつ
これは雄および雌の避妊薬としてそして雌の発情期を抑
制する分子としての組換えインヒビンの作用を実証する
ものである。 実施例20 ラット実験 ラットの被検群をヒツジの場合と同様にして免疫した。
その血清をよう素化トレーサー結合分析により1:50
0の希釈条件下に分析し、各群の結合データ(%)を平
均値±標準偏差の値で表14に示した。群(A−F)で
使用した抗原は表10と同じものである。
の血清の内9例は1:100の希釈条件下において31
kDインヒビンを検出しなかったので、上記のデータは
58kDインヒビンのAN 断片に対する抗体作用を示す
ものであり、この抗体の大部分はAN 特異性であると考
えられる。この仮説はウサギ実験において、すなわち、
ペプチド1を抗原として投与した場合に、FSH準位が
低下し(実施例18)そしてその1つの結果として、雌
の脊椎動物において発情期周期と卵胞形成が停止するこ
とになることによって裏付けられている。58kDイン
ヒビンよりも31kDインヒビンに対してより高い抗体
力価を持つ血清を生成した1例は本実験の期間中に正常
に交尾した。又次の様に説明することもできる。例え
ば、43kD抗原はプレプロAサブユニットのアミノ酸
−10から−1を持っており、この配列が前記作用をも
たらすものである。しかしこの逆説的な結果が生体内で
達成されたといういかなる作用機能によっても、そのデ
ータはFSHと従って生殖機能およびその過程の調整剤
としてのインヒビンの作用を強調するものであり、かつ
これは雄および雌の避妊薬としてそして雌の発情期を抑
制する分子としての組換えインヒビンの作用を実証する
ものである。 実施例20 ラット実験 ラットの被検群をヒツジの場合と同様にして免疫した。
その血清をよう素化トレーサー結合分析により1:50
0の希釈条件下に分析し、各群の結合データ(%)を平
均値±標準偏差の値で表14に示した。群(A−F)で
使用した抗原は表10と同じものである。
【0175】
【表14】
【0176】これらのデータにおいて、(A)群と
(B)および(E)又は(D)群のトレーサー結合能を
比較すると、A(43kD)サブユニットの方がAc
(20kD)サブユニットよりもすぐれた抗原であるこ
とがわかる。トレーサー結合試験の結果からみると、B
サブユニットは抗原としての作用は有していなかった。
これらの結果は、58kD在来インヒビンは474番ウ
サギにおいてすぐれた抗体応答性と中和抗体を生成し、
一方461番ウサギと31kD在来インヒビンで免疫し
た他の2匹においては中和抗体は生成されず又抗原応答
性もほとんどなかったという観察結果をうら付け強調す
るものである。
(B)および(E)又は(D)群のトレーサー結合能を
比較すると、A(43kD)サブユニットの方がAc
(20kD)サブユニットよりもすぐれた抗原であるこ
とがわかる。トレーサー結合試験の結果からみると、B
サブユニットは抗原としての作用は有していなかった。
これらの結果は、58kD在来インヒビンは474番ウ
サギにおいてすぐれた抗体応答性と中和抗体を生成し、
一方461番ウサギと31kD在来インヒビンで免疫し
た他の2匹においては中和抗体は生成されず又抗原応答
性もほとんどなかったという観察結果をうら付け強調す
るものである。
【0177】他の種(ヒツジ、ウサギ、ブタ)に関して
は、組み換えインヒビンサブユニットで免疫した動物の
どれにも中和抗体は検出されなかった。又、ほとんどの
種において、抗原のβ−ガラクトシダーゼ部分に対する
顕著な免疫応答が見られた。これらの観察結果から、立
体配座エピトープが重要であり、かつBTA426,B
TA427およびBTA1360由来の又はtrpベク
ター(実施例10)由来の抗原の様な抗原が高価値であ
ることがうかがわれる。なぜならば、融合部のβ−ガラ
クトシダーゼ部分は実質的に減少している(図16)か
あるいは欠失しており、そして実験は立体配座エピトー
プを生成するためにかつ抗原生成を改善するために行う
ことができるからである。
は、組み換えインヒビンサブユニットで免疫した動物の
どれにも中和抗体は検出されなかった。又、ほとんどの
種において、抗原のβ−ガラクトシダーゼ部分に対する
顕著な免疫応答が見られた。これらの観察結果から、立
体配座エピトープが重要であり、かつBTA426,B
TA427およびBTA1360由来の又はtrpベク
ター(実施例10)由来の抗原の様な抗原が高価値であ
ることがうかがわれる。なぜならば、融合部のβ−ガラ
クトシダーゼ部分は実質的に減少している(図16)か
あるいは欠失しており、そして実験は立体配座エピトー
プを生成するためにかつ抗原生成を改善するために行う
ことができるからである。
【0178】しかしながら、本発明における動物実験に
よれば、組換えインヒビン、サブユニット、断片および
その合成類似体又は相同体は次のように使用することが
できることが明らかにされた。 (a) 在来インヒビンを認識する抗体の産生。 (b) FSH準位の変更。 (c) 生殖増強剤又は避妊薬としての用途。 実施例21 免疫原としてのpUC−由来融合蛋白質の生産と利用 pBTA303,pBTA308,pBTA309およ
びpBTA472からのpUC−由来短鎖融合蛋白質の
優れた免疫原性がBTA427様由来の封入体からの牛
Ac生成物で免疫された羊の抗体を中和することにより
得られるものによって例示される。
よれば、組換えインヒビン、サブユニット、断片および
その合成類似体又は相同体は次のように使用することが
できることが明らかにされた。 (a) 在来インヒビンを認識する抗体の産生。 (b) FSH準位の変更。 (c) 生殖増強剤又は避妊薬としての用途。 実施例21 免疫原としてのpUC−由来融合蛋白質の生産と利用 pBTA303,pBTA308,pBTA309およ
びpBTA472からのpUC−由来短鎖融合蛋白質の
優れた免疫原性がBTA427様由来の封入体からの牛
Ac生成物で免疫された羊の抗体を中和することにより
得られるものによって例示される。
【0179】この蛋白質は封入体をTris−HCl pH
8.0(8M尿素および0.1MDTT含有)、37
℃、2時間溶解することにより調製される。この溶液は
氷酢酸を添加してpH3にし、次いで、遠心し、その後
濃縮し、0.1M酢酸でセファデックス×G50または
G75カラムでクロマトグラフィーを実施した。組換え
蛋白を含む画分はSDS−pAGEにより固定され、プ
ールされ、逆相クロマトグラフィーカラム(Vydac
C4またはDY name×C18)で実施した。各
々の場合、蛋白質は0.1%TFA含有アセトニトリル
勾配を用いてカラムから溶出した。溶出された蛋白質
は、再びSDS−pAGEで固定され、必要な画分をプ
ール、濃縮し、1〜10mg/mlとし、PBSで透析
した。蛋白質の固定はNH2 −末端配列決定法により確
認された。
8.0(8M尿素および0.1MDTT含有)、37
℃、2時間溶解することにより調製される。この溶液は
氷酢酸を添加してpH3にし、次いで、遠心し、その後
濃縮し、0.1M酢酸でセファデックス×G50または
G75カラムでクロマトグラフィーを実施した。組換え
蛋白を含む画分はSDS−pAGEにより固定され、プ
ールされ、逆相クロマトグラフィーカラム(Vydac
C4またはDY name×C18)で実施した。各
々の場合、蛋白質は0.1%TFA含有アセトニトリル
勾配を用いてカラムから溶出した。溶出された蛋白質
は、再びSDS−pAGEで固定され、必要な画分をプ
ール、濃縮し、1〜10mg/mlとし、PBSで透析
した。蛋白質の固定はNH2 −末端配列決定法により確
認された。
【0180】4頭の羊は300μgKLHで免疫され、
等数の羊はAc融合蛋白質30μg、および300μg
KLH結合Acを含む混成体(107:1モル比)をグ
ルタルアルデヒド法(Briand et al.,1
985 idid)により各々免疫された。第1次免疫
感体は0日ではフロインドの完全アジュバントで、ブー
スターは21日と50日にマルコール(Marcol)
52:モンタニド(Montanide)888(9:
1)で実施した。26日の血清は、RIAにより天然の
牛31KDトレーサーを認識する能力をテストし、その
結果を%(カウント)で表15に示した。
等数の羊はAc融合蛋白質30μg、および300μg
KLH結合Acを含む混成体(107:1モル比)をグ
ルタルアルデヒド法(Briand et al.,1
985 idid)により各々免疫された。第1次免疫
感体は0日ではフロインドの完全アジュバントで、ブー
スターは21日と50日にマルコール(Marcol)
52:モンタニド(Montanide)888(9:
1)で実施した。26日の血清は、RIAにより天然の
牛31KDトレーサーを認識する能力をテストし、その
結果を%(カウント)で表15に示した。
【0181】
【表15】
【0182】天然31KDインヒビンへの意味ある結合
は、形態的に正しいインヒビンを認識する抗体が作られ
たことを示している。更に、羊6,7,8および10か
らの抗体を主体内バイオアッセイでテストしたが、それ
らはインヒビン生物活性を中和した。羊5〜12は混成
されない免疫原(モンタニド888:マルコール52中
に100μg)で93日に再免疫し、次いで***応答を
調べるため、プロゲストーゲン発情周期同時施療を実施
した。組換えインヒビンを受容しているこれらのグルー
プはKLH−免疫コントロールまたは非処理コントロー
ル(C1〜C5:表16)より顕著に高い***率を有
し、単独で、またはキャリア分子との混成されたものを
使いる時、免疫原としての短鎖融合蛋白質の優れた特性
が確認され、インヒビンの単独サブユニットに対する抗
体が生体内および生体外でインヒビンの生物活性を中和
することが可能なことが証明された。1頭(9)は腹腔
鏡で、オバレクトマイズド(ovarectmist
d)していることが分かった。
は、形態的に正しいインヒビンを認識する抗体が作られ
たことを示している。更に、羊6,7,8および10か
らの抗体を主体内バイオアッセイでテストしたが、それ
らはインヒビン生物活性を中和した。羊5〜12は混成
されない免疫原(モンタニド888:マルコール52中
に100μg)で93日に再免疫し、次いで***応答を
調べるため、プロゲストーゲン発情周期同時施療を実施
した。組換えインヒビンを受容しているこれらのグルー
プはKLH−免疫コントロールまたは非処理コントロー
ル(C1〜C5:表16)より顕著に高い***率を有
し、単独で、またはキャリア分子との混成されたものを
使いる時、免疫原としての短鎖融合蛋白質の優れた特性
が確認され、インヒビンの単独サブユニットに対する抗
体が生体内および生体外でインヒビンの生物活性を中和
することが可能なことが証明された。1頭(9)は腹腔
鏡で、オバレクトマイズド(ovarectmist
d)していることが分かった。
【0183】
【表16】
【0184】これらの方法がヒトおよび家畜、例えば、
ブタ、犬、馬、牛、羊やヤギなどに、pBTA303,
pBTA308,pBTA309およびpBTA472
からの蛋白質を単独あるいは混合して用いることができ
ることは明白である。 実施例22 インヒビンの製造方法 インヒビン産生の遺伝情報を有する組み換えプラスミド
を持つ宿主細胞を産生培養集合体中で凍結乾燥したバイ
アルとして保存する。保存バイアルからの細胞を再生
し、特定の培地上に植え、そしてこの培地からの細胞を
使用して発酵様接種材料を調整する。この接種材料は適
当な成長培地を含有する発酵材料を作るのに使用し、発
酵はインヒビンたん白質産生に適当な条件下で行う。発
酵終了後に、細胞を採取し、産生物を細胞から単離しそ
して精製する。生成物を分析し品質調整し、そしてその
安定性のために充分な保存条件下に保存する。きびしい
衛生条件下で生成物を他の成分と組合わせて用途に応じ
て組成する。
ブタ、犬、馬、牛、羊やヤギなどに、pBTA303,
pBTA308,pBTA309およびpBTA472
からの蛋白質を単独あるいは混合して用いることができ
ることは明白である。 実施例22 インヒビンの製造方法 インヒビン産生の遺伝情報を有する組み換えプラスミド
を持つ宿主細胞を産生培養集合体中で凍結乾燥したバイ
アルとして保存する。保存バイアルからの細胞を再生
し、特定の培地上に植え、そしてこの培地からの細胞を
使用して発酵様接種材料を調整する。この接種材料は適
当な成長培地を含有する発酵材料を作るのに使用し、発
酵はインヒビンたん白質産生に適当な条件下で行う。発
酵終了後に、細胞を採取し、産生物を細胞から単離しそ
して精製する。生成物を分析し品質調整し、そしてその
安定性のために充分な保存条件下に保存する。きびしい
衛生条件下で生成物を他の成分と組合わせて用途に応じ
て組成する。
【0185】
インヒビンの用途 本発明により生成されるインヒビン又はその部分は抗原
としてあるいは生理活性物質として使用することができ
る。ある1つの使用法による効果は他の使用方法による
効果と逆である場合がある。
としてあるいは生理活性物質として使用することができ
る。ある1つの使用法による効果は他の使用方法による
効果と逆である場合がある。
【0186】1つの形態として、本発明により生成さ
れ、そして(または)ひきつづき変性処理されたインヒ
ビン又はその部分は抗原として使用することができ、従
って生殖能力を調節するために使用することができる。
ヒトを含めての脊椎動物における***率の上昇は生殖能
力を改善し従って繁殖性を増大し、すなわち生殖効率を
改善する。本発明の生成物は、***率の増加のために使
用することができ、従って例えば家畜ろヒト用の生体内
での受精のプログラミングに利用することができる。
又、家畜以外の動物にも、例えば動物園において交配を
容易にするためにも使用することができる。又本発明の
生成物は、生殖可能期を長くするために性的成熟および
思春期の到来を早めたり、および(または)交尾と分べ
んの間の期間を短かくするために畜産動物における発情
期を長くしたり、および(または)季節的な又は分べん
後の非発情期を短かくするために使用することができ
る。雄の場合には、本発明の化合物は***形成刺激のた
めに使用することができる。
れ、そして(または)ひきつづき変性処理されたインヒ
ビン又はその部分は抗原として使用することができ、従
って生殖能力を調節するために使用することができる。
ヒトを含めての脊椎動物における***率の上昇は生殖能
力を改善し従って繁殖性を増大し、すなわち生殖効率を
改善する。本発明の生成物は、***率の増加のために使
用することができ、従って例えば家畜ろヒト用の生体内
での受精のプログラミングに利用することができる。
又、家畜以外の動物にも、例えば動物園において交配を
容易にするためにも使用することができる。又本発明の
生成物は、生殖可能期を長くするために性的成熟および
思春期の到来を早めたり、および(または)交尾と分べ
んの間の期間を短かくするために畜産動物における発情
期を長くしたり、および(または)季節的な又は分べん
後の非発情期を短かくするために使用することができ
る。雄の場合には、本発明の化合物は***形成刺激のた
めに使用することができる。
【0187】従って畜産業種例えばウシ、ヒツジ、ブ
タ、ヤギ、シカ、ウマ、サカナおよびトリ等の飼育にお
いて、インヒビンの投与は益のあるものである。又イン
ヒビンは活性物質として雌における***を抑制し又は雄
における***形成能を低下させる手段として使用するこ
とができ、従って避妊薬としてや***の同時性を持たせ
るための手段として使用することができる。
タ、ヤギ、シカ、ウマ、サカナおよびトリ等の飼育にお
いて、インヒビンの投与は益のあるものである。又イン
ヒビンは活性物質として雌における***を抑制し又は雄
における***形成能を低下させる手段として使用するこ
とができ、従って避妊薬としてや***の同時性を持たせ
るための手段として使用することができる。
【0188】インヒビンの部分、例えば合成ペプチド又
はAN 断片はFSH準位を下げるための抗原として使用
することができ、そして避妊薬として又は発情期を抑制
するための薬剤として作用する。本発明の生成物は抗体
産生用に使用することができ、この抗体も又本発明の一
部に包含されるものである。又抗インヒビン抗体は診断
剤として使用することが出来る。例えばこの様な用途と
しては、ヒトを含めての脊椎動物における生殖周期の状
態をモニターする手段等がある。この様にして、***の
時期や***した卵の数を予測することが可能であり、従
って生殖周期の調整に使う治療法を決定することも出来
る。
はAN 断片はFSH準位を下げるための抗原として使用
することができ、そして避妊薬として又は発情期を抑制
するための薬剤として作用する。本発明の生成物は抗体
産生用に使用することができ、この抗体も又本発明の一
部に包含されるものである。又抗インヒビン抗体は診断
剤として使用することが出来る。例えばこの様な用途と
しては、ヒトを含めての脊椎動物における生殖周期の状
態をモニターする手段等がある。この様にして、***の
時期や***した卵の数を予測することが可能であり、従
って生殖周期の調整に使う治療法を決定することも出来
る。
【0189】この抗体は雌の顆粒層細胞機能を検知し、
あるいは雄のセルトリ細胞機能のマーカーとして、ある
いはおそらく繁殖能の高い家畜の遺伝的選択用のマーカ
ーとして使用することができる。この様に、先に記載し
た組み換えたん白質やその誘導体、相同体および類似体
は多くの種々の例えば次の様な用途を有している。 (a)生体内において、在来インヒビン又はその前駆体
に起因する生理的作用の1部又は全部を抑制しあるいは
禁止するための抗原又はインヒビン拮抗薬としての用
途。 (b)モノクローナル又はポリクローナル抗体生成用の
抗原としての用途。 (c)生体内又は生体外における生理的活性組換えイン
ヒビンの生成のための前駆体としての用途。 (d)インヒビンラジオイムノアッセイ(RIA)およ
び酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)や
あるいは他の検出系例えば化学発光体や蛍光発光体を使
用する分析法における標準体としての用途。 (e)モノクローナル又はポリクローナル抗体製剤のス
クリーニングにおける用途。 (f)インヒビン又はインヒビン様アミノ酸配列(実施
例9参照)を認識する抗体の精製における用途。 (g)生成内における在来インヒビン又はその前駆体に
起因する生理的作用の1部又は全部を可能にするための
インヒビン作用薬としての用途。生物活性組換えインヒ
ビンは同一細胞内で両サブユニット又はその前駆体を同
時に発現させるか、又は個々のサブユニット又はその前
駆体、類似体、相同体又は誘導体を生体外で正しく再構
築することにより生成することができる。
あるいは雄のセルトリ細胞機能のマーカーとして、ある
いはおそらく繁殖能の高い家畜の遺伝的選択用のマーカ
ーとして使用することができる。この様に、先に記載し
た組み換えたん白質やその誘導体、相同体および類似体
は多くの種々の例えば次の様な用途を有している。 (a)生体内において、在来インヒビン又はその前駆体
に起因する生理的作用の1部又は全部を抑制しあるいは
禁止するための抗原又はインヒビン拮抗薬としての用
途。 (b)モノクローナル又はポリクローナル抗体生成用の
抗原としての用途。 (c)生体内又は生体外における生理的活性組換えイン
ヒビンの生成のための前駆体としての用途。 (d)インヒビンラジオイムノアッセイ(RIA)およ
び酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)や
あるいは他の検出系例えば化学発光体や蛍光発光体を使
用する分析法における標準体としての用途。 (e)モノクローナル又はポリクローナル抗体製剤のス
クリーニングにおける用途。 (f)インヒビン又はインヒビン様アミノ酸配列(実施
例9参照)を認識する抗体の精製における用途。 (g)生成内における在来インヒビン又はその前駆体に
起因する生理的作用の1部又は全部を可能にするための
インヒビン作用薬としての用途。生物活性組換えインヒ
ビンは同一細胞内で両サブユニット又はその前駆体を同
時に発現させるか、又は個々のサブユニット又はその前
駆体、類似体、相同体又は誘導体を生体外で正しく再構
築することにより生成することができる。
【0190】インヒビンcDNA配列は種々の用途を有
しているが、その例を次に挙げる。 (1)原核又は真核細胞中でのたん白質合成のcDNA
鋳型としての用途(実施例8参照)。 (2)放射性標識インヒビンcDNAプローブの製造用
のDNA鋳型としての用途。これらのプローブは色々な
種のゲノムDNA中やあるいはインヒビン又はインヒビ
ン様ペプチドを作る細胞のmRNA中のインヒビン又は
インヒビン様配列を検出し単離するために使用すること
ができる(実施例7および8参照)。従ってこれらは、
ヒトおよび家畜動物におけるインヒビン合成および調節
を診断的に検出する能力、あるいはインヒビン遺伝子の
クローニングおよび処理における使用可能性を有してい
る。 (3)前記(2)と同様な用途の放射性標識RNAプロ
ーブの製造のためのDNA鋳型としての用途。 (4)放射性標識インヒビンの製造のためのDNA鋳型
としての用途。
しているが、その例を次に挙げる。 (1)原核又は真核細胞中でのたん白質合成のcDNA
鋳型としての用途(実施例8参照)。 (2)放射性標識インヒビンcDNAプローブの製造用
のDNA鋳型としての用途。これらのプローブは色々な
種のゲノムDNA中やあるいはインヒビン又はインヒビ
ン様ペプチドを作る細胞のmRNA中のインヒビン又は
インヒビン様配列を検出し単離するために使用すること
ができる(実施例7および8参照)。従ってこれらは、
ヒトおよび家畜動物におけるインヒビン合成および調節
を診断的に検出する能力、あるいはインヒビン遺伝子の
クローニングおよび処理における使用可能性を有してい
る。 (3)前記(2)と同様な用途の放射性標識RNAプロ
ーブの製造のためのDNA鋳型としての用途。 (4)放射性標識インヒビンの製造のためのDNA鋳型
としての用途。
【図1】ウシ顆粒層細胞cDNAを含有する組換えプラ
スミドの合成法を示す。
スミドの合成法を示す。
【図2】ウシ顆粒層細胞のメンセンジャーRNAからの
合成cDNAの産物のポリエチレンイミンセルロース上
の薄層クロマトグラムである。
合成cDNAの産物のポリエチレンイミンセルロース上
の薄層クロマトグラムである。
【図3】43kD(A)サブユニットおよび15kD
(B)サブユニットプローブの配列を示す。
(B)サブユニットプローブの配列を示す。
【図4】制限酵素(PstI)地図および7個のインヒ
ビンcDNAの配列方法を示す。
ビンcDNAの配列方法を示す。
【図5】ウシインヒビンAサブユニットcDNAのヌク
レオチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。これに選択した制限酵素部位はそのDNA配列の上
に示した。ず
レオチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。これに選択した制限酵素部位はそのDNA配列の上
に示した。ず
【図6】図5の続きである。
【図7】ウシインヒビンBサブユニットcDNAのヌク
レオチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。
レオチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。
【図8】図6の続きである。
【図9】ヒトインヒビンAサブユニットDNAのヌクレ
オチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。
オチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。
【図10】図9の続きである。
【図11】ヒトインヒビンBサブユニットDNAのヌク
レオチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。
レオチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。
【図12】SDS−PAGEゲル上の分子量標準(Sは
kDで示した大きさ)としての58kDインヒビン
(I)と31kDインヒビン(II)の構造(A);お
よび非還元SDS−PAGEゲルからの切片中での放射
能測定により測定した、去勢ウシ血清(SS)およびヒ
ト閉経後血清(PMS)中で1晩培養した後の58kD
の在来ウシインヒビンの31kD型への変換の結果
(B)を示す。尚、PBSは、ウシ血清アルブミンを、
CAは炭酸デヒドラターゼを示す。
kDで示した大きさ)としての58kDインヒビン
(I)と31kDインヒビン(II)の構造(A);お
よび非還元SDS−PAGEゲルからの切片中での放射
能測定により測定した、去勢ウシ血清(SS)およびヒ
ト閉経後血清(PMS)中で1晩培養した後の58kD
の在来ウシインヒビンの31kD型への変換の結果
(B)を示す。尚、PBSは、ウシ血清アルブミンを、
CAは炭酸デヒドラターゼを示す。
【図13】全長AサブユニットcDNAを得る方法を示
す。
す。
【図14】AおよびBサブユニットcDNAの発現のた
めに使用するリンカーを示す。
めに使用するリンカーを示す。
【図15】図14の続きである。
【図16】プラスミドpBTA302,pBTA303
およびpBTA304の地図を示す。
およびpBTA304の地図を示す。
【図17】E.コリ株中におけるインヒビンサブユニッ
ト融合たん白質およびβ−ガラクトシダーゼの発現を示
す。
ト融合たん白質およびβ−ガラクトシダーゼの発現を示
す。
【図18】全長プレプロAサブユニットcDNAの構築
法を示す。
法を示す。
【図19】図18の続きである。
【図20】合成ペプチドで免疫化したウサギの血清FS
H位を示す。矢印はワクチン注射の時期を示す。
H位を示す。矢印はワクチン注射の時期を示す。
【図21】牛AN断片発現のためのベクターの構成を示
す。
す。
【図22】プレプロBサブユニット遺伝子の構成を示
す。
す。
【図23】pBTA418のプレプロBサブユニット遺
伝子の構造を示す。
伝子の構造を示す。
【図24】pBTA306およびpBTA307の制限
酵素(PstI)地図および塩基配列法を示す。
酵素(PstI)地図および塩基配列法を示す。
【図25】完全長牛イニヒビンプレプロBサブユニット
cDNAのヌクレオチド配列とその予見されるアミノ酸
配列を示す。
cDNAのヌクレオチド配列とその予見されるアミノ酸
配列を示す。
【図26】完全長ヒトインヒビンプレプロBサブユニッ
トコーディングDNA配列とその予見されるアミノ酸配
列を示す。
トコーディングDNA配列とその予見されるアミノ酸配
列を示す。
【図27】プラスミドpBTA303、pBTA30
8、pBTA309およびpBTA472によってコー
ドされるインヒビン融合蛋白質の配列を示す。合成リン
カーにより製造された塩基は各配列の小文字で示されて
いる。
8、pBTA309およびpBTA472によってコー
ドされるインヒビン融合蛋白質の配列を示す。合成リン
カーにより製造された塩基は各配列の小文字で示されて
いる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 A61K 39/00 H 39/395 AEF C07H 21/00 C07K 1/06 8318−4H C12P 21/02 C 9282−4B G01N 33/53 B // C12N 15/09 ZNA (C12P 21/02 C12R 1:19) 9281−4B C12N 15/00 ZNA A (31)優先権主張番号 PH3960 (32)優先日 1985年12月19日 (33)優先権主張国 オーストラリア(AU) (31)優先権主張番号 PH3961 (32)優先日 1985年12月20日 (33)優先権主張国 オーストラリア(AU) (71)出願人 594051585 モナッシュ・メディカル・センター オーストラリア国 ヴイクトリア 3004、 メルボルン、セント・キルダ・ロード(番 地なし) (71)出願人 594051596 セント・ヴインセンツ・インステイチユー ト・オブ・メデイカル・リサーチ オーストラリア国 ヴイクトリア 3065、 フイツツロイ、ヴイクトリア・パーク 41 (72)発明者 フオレイジ,ロバート・グレゴリー オーストラリア国 ニユー・サウス・ウエ ールズ 2088、モスマン、アワバ・ストリ ート 80 (72)発明者 スチワート,アンドリユー・ジヨージ オーストラリア国 ニユー・サウス・ウエ ールズ 2073、ピンブル、ロビン・ヘッ ド・ロード 26 (72)発明者 ロバートソン,デイヴイツト・マーク オーストラリア国 ヴイクトリア 3150、 グレン・ウエイヴアーリー、フロリート・ コート 6 (72)発明者 デ・クレツツアー,デイヴイツト・モリツ ツ オーストラリア国 ヴイクトリア 3127、 サリー・ヒリズ、リユーラ・ストリート 1 (72)発明者 フィンドレイ,ジョン・ケール オーストラリア国 ヴイクトリア 3127、 マウント・アルバート、バロア・ロード 3
Claims (33)
- 【請求項1】 インヒビン又は同様な免疫学的又は生物
学的活性を有するポリペプチドの全部、1部、類縁体、
相同体又は前駆体から成る、形質転換宿主の発現生成
物。 - 【請求項2】 実質的に純粋な形の請求項1に記載の発
現生成物。 - 【請求項3】 宿主と相同的な第一のポリペプチド配列
と、インヒビン又は同様な免疫学的又は生物学的活性を
有するポリペプチドの全部、1部、類縁体、相同体又は
前駆体のアミノ酸配列である第2のポリペプチド配列と
から成る、請求項2または3の発現生成物。 - 【請求項4】 該第1のアミノ酸配列がβ−ガラクトシ
ダーゼの1部又は全部でありそして宿主細胞がた、コリ
である請求項3の発現生成物。 - 【請求項5】 インヒビンの43kD,20kD又は1
5KDサブユニット、インヒビンの43kDおよび15
kDサブユニットの組合わせ、インヒビンの20kDお
よび15kDサブユニットの組合わせあるいはその生物
学的等価体を含有する、請求項2,3又は4の発現生成
物。 - 【請求項6】 該インヒビンの43kD,20kD又は
15kDサブユニットが配列においてウシ又はヒトイン
ヒビンのそれに相当するものである、請求項5の発現生
成物。 - 【請求項7】 第5図の−60から166のアミノ酸配
列、第5図の−10から166のアミノ酸配列、第5図
の1から166のアミノ酸配列、図9及び図10の−6
1から171のアミノ酸配列、図9及び図10の−10
から171のアミノ酸配列、図9及び図10の1から1
71のアミノ酸配列又はその生物学的等価体を含有す
る、請求項1の発現生成物。 - 【請求項8】 インヒビン又は同様の免疫学的又は生物
学的活性を有するポリペプチドの全部、1部、類似体、
相同体又は前駆体から成るポリペプチドを生合成する方
法であって、 インヒビンの全部、1部、類似体、相同体又は前駆体の
アミノ酸配列に相当するかあるいは発現の際にこれとコ
ードする第1のDNA配列、該第1の配列と交雑するD
NA配列、単一の又は複数の塩基置換、転換、除去およ
び挿入を含めての前記第1の配列又は交雑配列への変異
関連のDNA配列、又はインヒビン又は同様の免疫学的
又は生物学的活性を有するポリペプチドの全部、1部、
類似体、相同体又は前駆体を発現の際にコードするDN
A配列から成る挿入DNAを有することを特徴とする組
換えDNA分子を用意し、 該組換えDNA分子で宿主を形質転換して、該宿主がイ
ンヒビン又はインヒビンに類似の生物学的又は免疫学的
活性を有するポリペプチドの全部、1部又は前駆体から
成るポリペプチドを含有するたん白質生成物を発現可能
である様にし、 該宿主を培養して発現生成物を生成させ、そして該たん
白質生成物を採取することからなる、該方法。 - 【請求項9】 該たん白質生成物が封入体として生成さ
れる、請求項8の方法。 - 【請求項10】 該たん白質生成物がウシ又はヒトイン
ヒビンの43kD,20kD又は15kDサブユニット
又はその実質的な部分から成るものである、請求項8又
は9の方法。 - 【請求項11】 該たん白質生成物が第5図の−60か
ら166ノアミノ酸配列、第5図の−10から166の
アミノ酸配列、図9の1から166のアミノ酸配列、図
9及び図10の−10から171のアミノ酸配列、図9
及び図10の1から171のアミノ酸配列又はその生物
学的等価体から成るものである、請求項8又は9の方
法。 - 【請求項12】 インヒビンの全部、1部、類縁体、相
同体間は前駆体から成るポリペプチド又は同様の免疫学
的又は生物学的活性を有するポリペプチドである、請求
項8〜11項のいずれかの方法による生成物。 - 【請求項13】 インヒビン又は同様の免疫学的又は生
物学的活性を有するポリペプチドの全部、1部、類縁
体、相同体又は前駆体から成るポリペプチドである、組
換えDNA技術により生成されたポリペプチド。 - 【請求項14】 ウシ又はヒトインヒビンの43kD,
20kD又は15kDサブユニット又はその実質的な部
分から成る、請求項13のポリペプチド。 - 【請求項15】 請求項1〜7のいずれかの発現生成物
又は請求項13〜14のいずれかのポリペプチドを、薬
学的に許容される希釈剤又は担体との混合物の形で含有
してなる、薬剤組成物。 - 【請求項16】 経口投与型、注射剤型又は徐放性製剤
型である、請求項15の薬剤組成物。 - 【請求項17】 インヒビンの少なくとも1部のミノ酸
配列を有しかつインヒビン分子又はその一部に帰する免
疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドから成る
合成ペプチド。 - 【請求項18】 実質的に純粋な形の、請求項17の合
成ペプチド。 - 【請求項19】 下記の式の配列および所望によっては
これにカルボキシル−又はアミノ−末端チロシン残基を
付加して成る、請求17又は18の合成ペプチド。 His−Ala−Val−Gly−Gly−Phe−Met−Arg−Arg− 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Gly−Ser−Glu−Pro−Glu−Asp−Gln−Asp−Val− 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Ser−Gln−Ala−Ila−Leu−Phe−Pro−Ala−Lys− 19 20 21 22 23 24 25 26 - 【請求項20】 本文添付の第5,6,7又は8図に記
載の配列の全部又は1部に相当するアミノ酸配列を有す
る、請求項17又は18の合成ペプチド。 - 【請求項21】 インヒビン作用薬又は拮抗薬としての
用途又は生殖腺機能又は生殖生理機能を調節する抗原応
答を誘発すまための用途に使用する、請求項17〜20
のいずれかの合成ペプチド。 - 【請求項22】 請求項17のいずれかに記載の発現生
成物又は請求項13〜14のいずれかに記載のポリペプ
チド、又は請求項17〜20のいずれかに記載の合成ペ
プチドを、脊椎動物に投与することから成る、生殖腺機
能又は生殖生理機能を調節する方法。 - 【請求項23】 請求項1〜7のいずれかの発現生成
物、又は請求項13〜14のいずれかのポリペプチド、
又は請求項17〜20のいずれかの合成ペプチドの用途
であって、該生成物、ポリペプチド又は合成ペプチドに
対する抗体を生起させるように脊椎動物を免疫学的に挑
発することから成る前記用途。 - 【請求項24】 請求項23に従った脊椎動物の免疫学
的挑発の結果として生成された抗体調製物。 - 【請求項25】 請求項1〜7又は13〜14のいずれ
かの組換えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又
は前駆体、あるいは請求項17〜20のいずれかの合成
ペプチドの、診断剤又は医薬としての用途。 - 【請求項26】 請求項1〜7又は13〜14のいずれ
かの組換えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又
は前駆体、あるいは請求項17〜20のいずれかの合成
ペプチドの、脊椎動物における避妊薬としての用途。 - 【請求項27】 請求項24の抗体調製物を脊椎動物に
投与することによって脊椎動物における生殖能力を増強
せしめることである、該抗体調製物の用途。 - 【請求項28】 脊椎動物をその内因性インヒビンに対
して免疫してその生殖能力を増強させることである、請
求項1〜7又は13および14項のいずれかの組換えイ
ンヒビン又はその部分、類似体、相同体又は前駆体又は
請求項13および20のいずれかの合成ペプチドの用
途。 - 【請求項29】 脊椎動物において、その性的成熟まで
の期間を短縮しあるいは非発情期の時期を短縮するか又
は全くなくするためのものである、請求項1〜7又は1
3および14のいずれかの組換えインヒビン又はその部
分、類縁体、相同体又は前駆体、又は請求項13および
20のいずれかの合成ペプチドの用途。 - 【請求項30】 脊椎動物において、その繁殖能抑制が
望ましい場合にその非発情期を誘発させるためのもので
ある、請求項1〜7又は13および14のいずれかの組
換えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又は前駆
体、又は請求項13および20のいずれかの合成ペプチ
ドの用途。 - 【請求項31】 脊椎動物において、FSH準位を低下
させ又は完全に0にして繁殖能抑制、ヒトの避妊又は有
害生物の撲滅の手段としての避妊効果を達成するための
ものである、請求項1〜7又は13および14のいずれ
かの組換えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又
は前駆体、又は請求項13および20項のいずれかの合
成ペプチドの用途。 - 【請求項32】 ヒト特に男性における避妊薬とてし
の、請求項1〜7又は13および14のいずれかの組換
えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又は前駆
体、又は請求項13および20のいずれかの合成ペプチ
ドの用途。 - 【請求項33】 脊椎動物におけるインヒビン又はその
誘導体の準位の診断的測定においてそしてその様な診断
的測定系用の標準体として有用である、モノクローナル
およびポリクローナルの両抗体を生成するための反応剤
としてのものである、請求項1〜7又は13および14
のいずれかの組換えインヒビン又はその部分、類縁体、
相同体又は前駆体、又は請求項13および20のいずれ
かの合同ペプチドの用途。
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