DK173446B1 - Polynucleotidsekvens, som koder for inhibin - Google Patents
Polynucleotidsekvens, som koder for inhibin Download PDFInfo
- Publication number
- DK173446B1 DK173446B1 DK198606113A DK611386A DK173446B1 DK 173446 B1 DK173446 B1 DK 173446B1 DK 198606113 A DK198606113 A DK 198606113A DK 611386 A DK611386 A DK 611386A DK 173446 B1 DK173446 B1 DK 173446B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- inhibin
- subunit
- cdna
- dna
- see
- Prior art date
Links
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 title claims description 156
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 title claims description 155
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 37
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 147
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 147
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 70
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 60
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 47
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 241000894007 species Species 0.000 description 38
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 35
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 26
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 23
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 22
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 20
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 20
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 13
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 12
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 12
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 7
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 7
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 7
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 5
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000009123 feedback regulation Effects 0.000 description 4
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- -1 beef Chemical compound 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101100285688 Caenorhabditis elegans hrg-7 gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 101800000684 Ribonuclease H Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 241000030538 Thecla Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;ethanol Chemical compound CCO.O=C=O OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 2
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- AWNXKZVIZARMME-UHFFFAOYSA-N 1-[[5-[2-[(2-chloropyridin-4-yl)amino]pyrimidin-4-yl]-4-(cyclopropylmethyl)pyrimidin-2-yl]amino]-2-methylpropan-2-ol Chemical compound N=1C(NCC(C)(O)C)=NC=C(C=2N=C(NC=3C=C(Cl)N=CC=3)N=CC=2)C=1CC1CC1 AWNXKZVIZARMME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N Ala-Glu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229930091051 Arenine Natural products 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N Arg-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(O)=O IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QEYJFBMTSMLPKZ-ZKWXMUAHSA-N Asn-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QEYJFBMTSMLPKZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- MQLZLIYPFDIDMZ-HAFWLYHUSA-N Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O MQLZLIYPFDIDMZ-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- SEMWSADZTMJELF-BYULHYEWSA-N Asp-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O SEMWSADZTMJELF-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 101100511466 Caenorhabditis elegans lon-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- VAIWPXWHWAPYDF-FXQIFTODSA-N Glu-Asp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VAIWPXWHWAPYDF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N Gly-Gly-Phe Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229920006063 Lamide® Polymers 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001466105 Melanotaenia splendida Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101000931108 Mus musculus DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- CBENHWCORLVGEQ-HJOGWXRNSA-N Phe-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CBENHWCORLVGEQ-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 241000269435 Rana <genus> Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- UFKPDBLKLOBMRH-XHNCKOQMSA-N Ser-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O UFKPDBLKLOBMRH-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 244000247617 Teramnus labialis var. labialis Species 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N Tyr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 241000736772 Uria Species 0.000 description 1
- QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N Val-Asp-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- XLDYBRXERHITNH-QSFUFRPTSA-N Val-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C XLDYBRXERHITNH-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 1
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 1
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229940124558 contraceptive agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010060943 human inhibin-like peptide (1-31) Proteins 0.000 description 1
- 102000008292 human inhibin-like peptide (1-31) Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 108010067471 inhibin A Proteins 0.000 description 1
- 108010067479 inhibin B Proteins 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical class [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanol Chemical compound CNCO IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M p-chloromercuribenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([Hg]Cl)C=C1 YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 108010065135 phenylalanyl-phenylalanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000004071 soot Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
i DK 173446 B1 5 10 15 Den foreliggende opfindelse angår en polynucleotidse- kvens, som koder for inhibin.
I 1932 blev det opdaget, at kønskirtler producerer en nonsteroidal faktor, der blev benævnt inhibin, som er involveret i feed-back-reguleringen af hypofysefunktionen, se 20 McCullagh, D.R. (1932), Science 76, 19-20. Efter den tid har det vist sig, at hypofyseforlappen producerer mindst to gona-dotropiher, follikelstimulerende hormon eller follitropin (PSH) og luteiniserende hormon eller lutropin (LH), som tilsammen regulerer udviklingen og funktionen af kønskirtlerne.
25 Følsomme radioimmunoanalyser har muliggjort nøjagtig og uafhængig overvågning af hvert hormon og har vist feedbackregulering af disse hormoner ved hjælp af kønskirtlerne. Feedbackreguleringen af LH synes at være fremherskende via steroider, medens feedbackreguleringen af FSH ud over steroider .30 sker via protein eller glycoproteinfaktoren inhibin.
Inhibin kan nu defineres som et protein eller glycoprote-inhormon, der sekreteres fra granulosaceller i ovarierne eller Sertoli-celler i testiklerne. Det sekreteres som svar på FSH og virker på hypofysen som feedbackinhibitor af FSH- 35 syntesen og sekretion, men efterlader den grundlæggende syntese og sekretion af LH stort set intakt. Hvorvidt inhibin, dets triRNA eller forstadier dannes i andre celler eller væv, er endnu ikke kendt.
2 DK 173446 B1
Siden først i 1970'erne er der gjort et antal forsøg på at rense inhibin fra· flere forskellige kønkiktelki Ider, både fra testikler og ovarier, og med modstridende resultater, se de Jong, F.H. )1979) Mol. Cell. Endocrinol. 13, 1-10, hvilket delvist skyldes anvendelsen af flere forskellige bi oanalyse systemer, hvor enhver undertrykkelse af FSH i hypofysens celler in vitro eller in vivo antoges at skyldes inhibin, og der foretoges ikke altid kontrol for ikke-speci-fikke toxiske effekter p§'testsubstanserne, se Baker, H.W.G. et al. (19815 i Intragonadal Regulations of Reproduction (Franchimont, P. og Channing, C.P. Eds.), Academic Press, London pp 193-228; Baker H.W.G. et al., (1982) Ann. New York Acad. Sci. 383, 329-342).
Fornylig er inhibin fra oksefollikel væske (bFF) renset til homogenitet. Se international patentansøgning PCT/AU85/00119, Robertson, D.M. et al., (1985) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 126, 220-226. Dette resultat understøttedes af brugen af en rigorøst dyrket rottehypofysece l leanalyse, se Scott, R.S. et al., (1980) Endocrinol. 107, 1536-1542, som indbefatter et middel til at vurdere de cytotoxiske effekter af substanserne under test, se Robertson, D.M. et al., (1982)
Mol.Cel l .Endocrinol. 26, 119-127, således at ikke specifikke toxiske effekter, som sænkede FSH-indholdet af cellerne under måling, kunne i dent i ficeres som værende distinkt fra i n-hibins virkninger. Den anvendte standard var et oksefol LikeL-væsk.epræpa rat med en inhibinaktivitet på 20 U/ml udtrykt i en tidligere beskrevet fåretestikel lymfestandard med en vilkårlig aktivitet på 1 U/mg, se Scott, R.S. et al., (1980) Endocrinol. 197, 1536-1542.
INhibinet fra bFF rensedes omtrent 3500 gange til en specifik aktivitet på 200.000 enheder pr. mg protein og er et protein af 58 kD sammensat af to disulphid-bundne underenheder A og B på ca. 43 kD henholdsvis 15 kD som det fremgår af elektrophorese i polyacrylamidgeler i nærvær af natriumdode-cylsulfat (SDS-PAGE). Aminosyresekvenserne for Nl^-terminus 3 DK 173446 B1 af hver underenhed er bestemt. Denne rensede substans har de tidligere definerede in vitro-fysiologiske egenskaber som hos inhibin, nemlig at de inhiberer syntesen og frigivelsen af endogen FSH fra rottehypofyseceller, idet de efterlader syntesen og frigivelsen af LH prolactin og thyro-id-stimulerende hormon intakt.
Eftersom FSH er vigtig for bestemmelsen af forekomsten og hasti gheden af ovulation i hunner og spermatogenese i hanner, følger det, at de vigtigste anvendelser af inhibin, analoger eller homologer af inhibin eller antistoffer mod inhibin vil vare at inhibere eller at stimulere kønskirtelfunktionen i mennesker og husdyr og som diagnostisk værktøj til analyse af kønskirtelfunktionen. Mange eksperimenter er udført in vivo under anvendelse af rå eller delvist fraktionerede kønskirtelekstrakter eller sekretioner i forsøg på at analysere inhibins fysiologiske effekter. Effekter, der blev tilskrevet inhibin eller antistof.fer mod inhibin i disse eksperimenter, omfatter: 1. inhibering af kønskirtelfunktionen, se Moudgal, N.R. et al., (1985) i Gonadal Proteins and Peptides and their biological significance (Sairam, M.R. and Atkinson, L.E., Eds.) World Scientific Publishing Co., Singapore, pp 21-37).
2. en stigning Ί ovulationshastighed, se O'Shea, T. et al., (1982) Pr oc . Aust. Soc . Rep . Bi ol. 1_4, 85; O'Shea, T. et al., (1983) Proc.Aust.Soc.Rep.Biol. 15, 22; Henderson, K.M. et al., (1984) J. Endocrinol. 102, 305-309.
3. en fremrykning af tidspunktet for pubertetens indtråden, se Al-0baidi, F.A.R. et al., (1983) Proc.Aust.Soc.Rep.
B i o l. 15, 80).
Den kommercielle udnyttelse af disse egenskaber og yderligere fysiologiske studier i levende dyr kraver store mængder af ren inhibin eller fragmenter heraf eller inhibinagonister eller antagonister, hvadenten disse er af naturlig eller syntetisk oprindelse. Sådanne mængder kan ikke udelukkende 4 DK 173446 B1 opnås ved de foreliggende metoder til rensning, eftersom kildematerialet kan vare begranset, f.eks. human follikelvaske og entypisk ekstraktion, der begynder med 50 ml bFF, giver kun 5-10renset materiale.
Den foreliggende opfindelses formål er bl.a. at eliminere disse begransninger ved identifikation og karakterisering af generne, som koder inhibin, for at tillade en molekylår kloning af gener eller dele af gener, der koder for inhibin i en vart, såsom Escherichia coli og ved manipulering af de klonede gener eller dele deraf til fremstilling af varter, såsom bakteriestammer, som kan syntetisere hele, en del af eller forstadier til inhibinmolekylet, indbefattende underenheder deraf.
Der angives ved opfindelsen en polynucleotidsekvens, som koder for inhibin, hvilken sekvens har den aminosyre-sekvens, som er illustreret i fig. 5 og 6, eller derivater af inhibin med samme biologiske egenskaber.
Fordelagtige udførelser er angivet i underkravene e 5 DK 173446 B1 I hete denne beskrivelse og kravene er brugen af vendingen inhibin ikke artsspecifik og omfatter følgeligt relaterede arter af inhibin, såsom okse-, menneske-, fåre-, svine-, høhse- og fiske- og især menneske- og okseinhibin. Vendingen omfatter også ikke-glycosylerede og glycosylerede inhibin-a rter.
Vendingen hvirveldyr omfatter arter af fisk, amfibier, reptiler, fugle og pattedyr indbefattende mennesker.
Underenhedsstruktur af inhibin
Som antydet i hele denne beskrivelse er det inhibin, der udskilles’i follikelvæske, et 58 kD-protein omfattende to underenheder; en 43 kD og en 15 kD underenhed henholdsvis A og B. A- eller 43 kD-arten er et homolog protein mellem arter med visse forskelle, således at det sandsynligvis vil opføre sig som et antigen, når en inhibinart blev indgivet en anden art. På denne måde er det fundet, at forskellige arter af inhibiner kan anvendes til frembringelse af anti-inhi binanti stoffer med de herefter beskrevne anvendelser.
I sammenligning er B underenheden eller 15 kD underenheden faktisk identisk i aminosyresekvens blandt et antal arter, såsom humane og bovine arter.
Under visse omstændigheder kløves hele proteinet til en 31 kD-form omfattende to underenheder af molekylvægten 20 kD og 15 kD,henholdsvis Ac og B. 31 kD-formen udviser inhibin-aktivitet og udgør en del af den foreliggende opfindelse. Deling af 58 kD-formen til 31 kD-formen frigiver et poly-peptidfragment, der betegnes som A^-fragmentet, som i sig selv kunne spille en væsentlig rolle i regulering af kønski rteLfunktionen, og som således også udgør en del af den foreliggende opfindelse.
Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere beskrevet i for- 6 DK 173446 B1 bindelse med nogle eksempler og under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser fremgangsmåden til syntese af rekombinant plas-mider indeholdende oksegranulosacelle cDNA, fig. 2 tyndtlagschromatografi på polyethylenimincellulose af produkterne af cDNA syntese fra messenger RNA af bovine granulosace 11 er, fig. 3 sekvenserne af 43 kD (A) underenheden og 15 kD (B) underenhedsundersøgelser, fig. 4 et restriktionsenzym (Pst I) kortægnings- og sekven-teringsstrategi af syv inhibin cDNA'er, fig. 5 nucleotidsekvensen af bovin inhibin A underenheds cDNA samt dens forudsagte aminosyresekvens. Udvalgte restriktionsenzymbindinger er vist over DNA-sekvensen, fig. 6 nucleotidsekvensen af bovin inhibin B underenhed cDNA samt dets forudsagte aminosyresekvens. Udvalgte restriktionsenzymbindinger er vist over DNA-sekvensen, ( f i 9. 7 udgAET) (fig. 8 UDGÅET) fig. 9 strukturen af 58 kD inhibin (I) og 31 kD inhibin (II) sammenlignet med molekylvægtstandarder (S; størrelser vist i kD) på SDS-PAGE geler (A) og konvertering af 58 kD naturligt bovin inhibin til 31 kD-formen efter inkubering natten over i studeserum (SS) og human post-menopausaIt serum (PMS) som bestemt ved radioaktivitetsmålinger i vævsskiver af ikke-reduce-ret SDS-PAGE geler (B), fig. 10 fremgangsmåde til opnåelse af en fuld længde A under-enhed cDNA, fig. 11 koblingselementer anvendt til opnåelse at ekspression af A og B underenheds cDNA, fig. 12 viser kortlægning af plasmiderne pBTA302, pBTA303 og pBTA304, f DK 173446 B1 i 7 fig. 13 ekspressionen af inhibinunderenhedsfusionsproteiner og -gaLactosidase i E. c o L i stammer, OG fig. 14 fremgangsmåde til konstruktion af fuld længde præ pro A underenhed cDNA, I teksten anvendes følgende forkortelser: ATP s adenosintriphosphat bFF s bov i nfo11ikeIvæske bp = basepar
cDNA s complementært DNA
CG s korionisk gonidotropin
Ci = C u r i e D - Dalton dATP s 21deoxyadenosintriphosphat dCTP s 21-deoxycyti dintriphosphat dGTP s 2'-deoxyguanosintriphosphat DNA = deoxyribonucleinsyre DTT = dithi ot re i tol dTTP = 2'-deoxythymidintriphosphat EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre ELISA = enzymbundet immunosorbentanalyse FSH s follitropin eller foilikelstimulerende hormon X G = gange tyngdekraften g = gram HPLC = højydelses flydende chromatografi k =* (præf i x) kilo I = liter M s molær koncentration m = (præf i x) mi 11 i - mol = mol
mRNA = messenger RNA
P = (prefix) pico- n = (prefix) nano- 8 DK 173446 B1 PAGE - polyacrylamidgelelektrophorese PCMB = parachloromercuribenzoesyre PMS = humant post-menopausalt serum PMSF 55 phenylmethylsulfonylfluorid PMSG = serumgonadotropin fra gravid hoppe RI A » radioimmunoana lyse RNA = ribonucleinsyre
RP-HPLC = reverseret fase HPLC
SDS = natriumdodecyLsupfat SS = studeserum
Tris = tri s(hydroxymethyl)aminomethan A = (præfix) mikro-
Endvidere er følgende vendinger defineret og anvendt synonymt i teksten uanset oprindelse eller glycosyleringsstatus: A underenhed = 43 kD underenhed = stor underenhed af 58 kO inhibin = aminosyrerne His 1 til Ile 300, se fig. 5 = aminosyrerne His 1 til Ile 306, se fig. 7.
Ας underenhed = 20 kD underenhed » stor underenhed af 31 kD inhibin - aminosyrer Ser 167 til Ile 300 (fig. 5) = aminosyrer Ser 172 til Ile 306, fig. 7.
Α^ fragment = NHg-termina Ide l af A underenhed = aminosyre HIS 1 til ARG 166, fig. 5 = aminosyrer His 1 til Arg 171, fig. 7.
B underenhed = 15 kD underenhed = lille underenhed af 58 kD og 31 kD inhibin = aminosyrer Gly 1 til Ser 116, fig. 6 og 8.
Ved anvendelsen af vendingen "med lignende immunologisk aktivitet" er det meningen at inkludere et protein, som er tilstrækkeligt homologt med inhibin eller dele deraf, således at (1) recipientens immunsystem reagerer på samme måde som på det naturlige protein, eller (2) indgift vil frembringe antistoffer til proteinet, som er i stand til at genkende endogent inhibin.
9 DK 173446 B1
Det skal ogs§ forstis, at vendingen ’’dele af inhibin" omfatter underenheder af inhibin.
Fremgangsmåderne og produkterne ifølge opfindelsen er beskrevet mere detaljeret nedenfor, og det skal forstås, at der er alternative metoder til rådighed for en fagmand, som falder inden for denne opfindelses brede rammer.
Eksempel 1 ISOLERING AF MESSENGER RNA(mRNA) FRA BOVINE 6RANUL0SACELLER Hele testikler og ovarier eller isolerede Sertoli og granu-losaceller kan anvendes som kilde for inhibin mRNA. I dette tilfælde anvendtes isolerede granulosaceller.
a. Indsamling af granulosaceller. Bovin follikelvæske (bFF) indehlldende granulosaceller indsamledes fra store follikler på overfladen af friske okseovarier på et lokalt slagteri ved hjælp af en nål og en sprøjte. Væsken oplagredes iskoldt fra umiddelbart efter indsamlingen og indtil ankomsten til laboratoriet. Cellerne fra 70-100 ml bFF centrifugeredes ved 500 x G i 5 minutter og supernatanten fjernedes til rensning af naturligt inhibin. RNA ekstraheredes fra cellerne som herefter beskrevet.
b. Ekstrahering og rensning af RNA. Umiddelbart efter høst lyseredes granulosacellerne ved tilsætning af 24 ml 4,2 M guanidinium i sot hiocyanat/120 mM mercaptoethanol/5 procent (v/v) sacrosyl/10 mM Tris-HCl pH 7,4, se Chirgwin, J.M. et al (1979) biochemistry 1_8; 5294-5299. Lysatet homogeniseredes i en Sorvall Omnimix på hastighed 4 i 30 sekunder og centrifugeredes derefter ved 20.000 x G i 15 minutter til fjernelse af celleaffald. Til supernatanten tilsattes 1 g CsCl pr. 2,5 ml. Denne blanding overlejredes på en 9 ml 5,7 M CsCl/10 mM EDTA / 50 mM Tris-HCl pH 7,8 stødpude og centrifugeredes ved 122.000 x G i 65 timer ved 15°C.
RNA-pellett en vaskedes adskillige gange i 5 ml 70 procent ethanol/30 procent TE (1mM EDTA/. 10 mM Tris-HCl pH 7,5) til fjernelse af CsCl. Den præcipi te redes endelig fra 3 ml 10 DK 173446 B1 TE ved tilsætning af 0,3 ml 3 M Na acetat pH 7,5 og 6 ml ethanol efterfulgt af frysning til -70°C og centrifugering ved 20.000 x G i 10 minutter. RNA pelletten genopløstes i 1 ml TE og holdtes ved -70°C til den behøvedes.
c. Isolation af mRNA. mRNA ekstraheredes fra det totale RNA ved chromatografi pi oli go dT cellulose, se Aviv. H. og Leder, P (1972) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 69; 1408-1412. RNA-opløsningen foretoges i 1M i NaCl/1 mM i IDTA/20 mM i Tris-HCL pH 7,5 opvarmet til 70°C i 2 minutter, afkøledes hurtigt i isvand og påførtes en søjle (0,5 g tør vegt) af oligo dT cellulose (BRL). Strømmen gennem fraktionerne opvarmedes, afkøledes og genpiførtes 2 gange. Søjlen vaskedes med 5 ml belastningsbuffer og derefter med 5 ml af samme buffer, men indeholdende 0,5 M NaCl. mRNA elueredes ved 60°C i TE. Fraktioner pi 0,25 ml indsamledes og deres mRNA indhold præcipiteredes under anvendelse af natriumacetat og ethanol, se ovenfor, og pellets tørredes in vacuo. mRNA genopløstes i 0,1 ml TE og al i q uotter pS 25 jtX. blev ned frosset ved -70°C.
Integriteten af RNA fraktionerne fra disse ekstraktioner og rensningstrin undersøgtes ved elekt rophorese af 1-2^icg prøver pi agaroseureageler, se Locker, J. (1979) Anal. Biochem. 98, 353-367). Specifikt indeholdt RNA-prøven i 10 jtX TE 5 PI urinstof og 0,01 procent (w/v), hvor hver af sporfarverne bromphenolblit og xylencyanol FF opvarmedes til 70°C i
2 minutter og udsattes derefter for elektrophorese i en gel pi 1,5 procent agaroseindehoIdende 5,6 M urinstof/14 mM
iodoacetat/1 mM EDTA/ 36 mM NaH2P04/40 mM Tris-NaOH pH 7,4. Elektrophoresen afsluttedes, når den bromophenolblå farve nåede bunden af gelen og RNA visualiseredes under ultraviolet lys efter farvning med en opløsning af et hidiumbromid.
Koncentrationen af RNA måltes ved sin absorption ved 260 nm, en A260 udlæsning af 1,0 under anvendelse af en 1 cm lys bane taget som 40y,g RNA pr. ml. Typisk giver 60-100 ml 11 DK 173446 B1 bFF 1-3 g vid vagt pelleterede granulosace l ler , fra hvilke 600-900ju,q totalt RNA og 20-60^itg mRNA kunne ekstraheres.
Denne mRNA fraktion indeholder mRNA, der er specifik for inhibin, dets underenheder eller inhibin-lignende poly-peptider, men det mi forstis, at mRNA fraktionen er en blanding af et stort antal forskellige mRNA arter i forskellige koncentrationer i blandingen, af hvilke de fleste er uønskede.
Under de naste trin af cDNA syntesen og fjernelsen opfører hver sig i lighed med mRNA arterne, der er specifikke for inhibin, dets underenheder eller inhibinlignende polypepti-der og deres tilstedeværelse vil til sidst resultere i dannelsen af et stort antal uønskede kloner og nødvendiggør en frasorteringsprocedure for at identificere korrekte kloner, d.v.s. kloner, der indeholder cDNA-sekvenser, der koder for en del af eller underenheder af eller hele inhibinet.
Strategien for dannelse af cDNA fra mRNA og dets indsættelse i vektoren pBR322 er vist i fig. 1 og er beskrevet mere detaljeret i eksemplerne 2 og 3, men kun som eksempel.
Eksempel 2
SYNTESE AFKOPI-DNA (cDNA) fra mRNA
a. Syntese af den første c&NA streng. En reaktionsblanding begrænset i dATP tilvejebragtes, og en lille del af det fjernedes for at overvåge omfanget af cDNA syntesen ved ind-32 sætning af P dATP. Overskydende dATP tilsattes derefter tilbage til hovedreaktionsblandingen for at tillade fuldstændig førstestrengssyntese. Specifikt fyldtes en prøve p9 2 mRNA-præparatet op til et rumfang pi 27yuX med vand og opvarmedes ved 70°C i 2 minutter og hurtig-afkøledes derefter i isvand. Reaktionen påbegyndtes ved tilsætning af 23,5 l blanding indeholdende 500 ng oligo dT^g^^ grundsubstans (Boehringer), 50 nmol af hver af dCTP, dTTP og .*· 12 DK 173446 B1 og dGTP, 5 nmol af dATP, 100 nmol DTT, 20 enheder AMV revers transcriptase (Life Sciences), 2 jt. mol KCl, 400 nmol MgC^ og 2,5^ttmol Tris-HCl pH 8,5.
Umiddelbart efter blandingen tilvejebragtes den analytiske reaktion ved at udtage en 2y/λ prøve i et separat rør, der indeholdt 0,5^Μ·1 Λ -^p dATP (1800 Ci/nmol; 5 j&Z i / l) og 0,5jjlX 60 mM dATP tilsattes tilbage til hovedreaktionen, som var henstillet ved 42°C i 60 minutter. Fra den analytiske reaktion fjernedes 0,5juX og blev hurtig-frosset i et ethanoltørisbad for at tjene som nultidskontrol. Resten af reaktionen anbragtes ved 42°C i 60 minutter, hvorefter yderligere 0,5ytU udtoges for analyse.
Hver af de radioaktive prøver underkastedes tyndtlagschroma-tografi på po lyethylen i mi η (PEI) cellulose (Merck) i 0,75 M KH^PO^ buffer pH 3,5. Resultaterne efter autoradiografi er vist i fig. 2. Ved hjælp af disse foranstaltninger fjernes ikke optagne nucleotider fra de nyligt syntetiserede førstestrenge (DNA-RNA hybrider), som forbliver tilbage i det oprindelige stof. De individuelle pletter blev skåret ud efterfulgt af aut orad i ografi, og den påførte radioaktivitet blev bestemt for at give et skøn over optagelsens effektivitet. En optagelse på 10 procent (skønnet maksimal optagelse 33 procent) af det totale antal eller mere antoges at være tilfredsstillende til fortsættelse med den anden binding af cDNA-syntesen. Resten af det radioaktive materiale præci piteredes to gange fra 2M ammoniumacetat/67 procent ethanol og underkastedes elektrophorese på agarose-urinstofgeler efter kogning i 2 minutter i en ladningsbuffer, se ovenfor, for at adskille RNA og DNA-strengene. Gelen underkastedes derefter autoradiografi på Fuji RX røntgenfilm. Denne fremgangsmåde giver et skøn over størrelsen af cDNA-produkter og gav typisk et område på fra over 1000 baser til mindre end 200 baser.
13 DK 173446 B1 Førstestrengssyntese kan opnås via andre fremgangsmåder, der er kendte af fagfolk. I dette eksempel anven-tes otigo dT som grundsubstans til opnåelse af førstestrengs cDNA syntese fra alle mRNA arter med poly(A)regioner. Tilfældige grundsubstanser kan også anvendes til opnåelse af cDNA syntese fra mRNA arter. Alternativt kan anvendes grundsubstanser med en sekvens, der er komplementær til en del af inhibin mRNA til opnåelse af specifik syntese af inhibin cDNA.
Oligo dT eller andre grundsubstanser, der har en sekvens, der er komplementær til en del af inhibin mRNA, kan anvendes som grundsubstanser for førstestrengssyntesen, b. Syntese af den anden streng. I en strategi i lighed med den for førstestrengs cDNA syntesen udledtes både større reaktioner og analytiske reaktioner fra en indledende reaktionsblanding, som var ufuldstændig i henseende til dATP.
Specifikt præcipiteredes cDNA-RNA hybridmolekylerne fra den første strengs hovedreaktion ved tilsætning af 50^£t,l 3 M ammoniumacetat pH 7,5 og 200y6U ethanol efterfulgt af nedkøling til -70°C og centrifugering i 5 minutter ved 15.000 x G. Pellet'en resuspenderedes i 50jjA. TE, repræcipiteredes derefter og tørredes og optoges endelig o 50yU*l TE.
Dertil tilsattes 350 l opløsning indeholdende 16 nmol af hver af dCTP, dTTP og dGTP, 1 nmol dATP, 3,5 enheder RNAase H (BRL) 92 enheder DNA polymerase I fra Boehringer, 40 g BSA, 6 nmol -NAD, 400 nmol (NH^JjSO^, 4 mol KCl, 200 nmol MgC^ og 800 nmol Tris-HCl pH 7,5 (Gubier, U. og Hoffman, B.J. (1983) Gene 25; 263-269.
Umiddelbart efter blanding tilvejebragtes den analytiske reaktion ved udtagning af en 2 l prøve i et separat rør indeholdende 0,5^1 o4-^P dATP (1800 Ci/nmol; 5^u.Ci/,x*l) og 2 ^u.1 10 mM dATP tilsattes tilbage til hovedreaktionen, som anbragtes ved 15°C i 60 minutter og derefter ved 22°C i 60 minutter. Fra de anaLytiske reaktioner udtoges 0,5 L
14 DK 173446 B1 prøver, som hurtigt blev nedfrosset i et ethanoltørisbad ved nul tid, 1 time og 2 timer og analyseredes ved tyndtlags-chromatografi som beskrevet i forbindelse med førstestrengssyntesen, fig. 2. En optagelse af mindst 5 procent (skønnet maksimum 8 procent) af det totale antal antoges som bevis for god andenstrengssyntese.
Andenstrengssyntese kan opnås via andre fremgangsmåder, der er kendte for fagfolk. Eksempler er angivet nedenfor.
I denne sag anvendtes en RNAase specifik for RNA i DNA/RNA-krydsninger, eksempelvis RNAase H, sammen med en DNA polymerase. Alternativt kan RNA'et i DNA/RNA krydsningerne, der er et resultat af førstestrengssyntese, ødelægges kemisk eller enzymatisk eller fjernes fra DNA og DNA'et kan tillades selvigangsætning. Andenstrengssyntese udføres derefter under anvendelse af en DNA-polymerase eller en revers trans-kriptase, og den tiloversblevne hårnå Iskrø l le fordøjes ved hjælp af en enke11strengsspec ifik frigivelse, såsom S1-nuclease.
En tredie fremgangsmåde involverer fjernelsen eller degraderingen af mRNA efterfulgt af tilsætning af oligonucleotid, f.eks. oligo dC slutkæder til 3'-enden af de første streng-DNA-produkter. Et komplentært oligonucLeotid, f.eks. oligo dG er fæstnet til (eng.: annealed) til endeafsnittet og tjener som en grundsubstans for den anden streng-reaktion ved en DNA polymerase eller revers transcriptase. Enkelteller dobbeltbindings DNA med sekvenser, der er komplementære eller identiske eller ligner inhibin cDNA, kan også fremstilles ved kemisk syntese til kloning.
Eksempel 3 KONSTRUKTION AF BOVIN GRANULOSACELLE cDNA SAMLINGER I E. COLI a. Endeafsnitsdannelse og fæstning cDNA. Det dobbeItstren-gede cDNA fra den anden strengsyntese præcipiteredes ved tilsætning af 40jjX 3 M NA acetat pH 7,5 og 800yttl ethanol 75 DK 173446 B1 efterfulgt af nedkøling til -70°C og centrifugering ved 20.000 x G i 5 minutter. Pellet’en genopløstes i 50 jjX TE, ekstrahe redes to gange med en lige så stor mængde phenol, der var præækvilibreret med TE, ekstraheredes tre gange med 100yitl diethy lether, der var præækvi li breret i TE, præcipiteredes derefter ved tilsætning af 50 4 M ammo niumacetat og 200^i*.l ethanol efterfulgt af nedkøling til -70°C. I modsætning til de foregående præcipiteringer til-lodes den kolde blanding at stige til stuetemperatur før centrifugering ved 15.000 x G i 5 minutter. Denne fremgangsmåde bistår ved fjernelse af uoptagne nucleotider. Pellet'en opløstes i 50yt*.L TE og repræcipiteredes under anvendelse af ammoniumacetat og ethanol. Pellet’en tørredes in vacuo og resuspenderedes i 30^tcl TE.
Til 15 jaX cDNA tilsattes en lige så stor mængde buffer inde holdende 30 nmol CoC^s 3nmol DTT, 1,5^11101 kaliumcacodylat pH 7,2, 5yttg bovin serumalbumin, 30 nmol dCTP og 17 enheder terminal transferase (BRL). Blandingen inkuberedes ved 37°C i 3-5 minutter før frysning i et ethanoltørisbad og opvarmedes derefter til 65°C i 5 minutter. Det endeafsnit-dannede DNA lagredes ved -20°C indtil det krævedes til anvendelse. cDNA-arterne optoges ved en fremgangsmåde, der er kendt som fæstning i kommercielt tilgængelige pBR322 plas-midmoleky ler, se fig. 1, tabel 2, som indeholdt tilnærmelsesvis 24 dG rester på 3' udhængende ender af Pst I restrik-tionsendonucleasebindingssted (BRL Cat.No. 5355 SA). I fæstningsprocessen danner dC enderne af cDNA stabile hybrider med dG enderne af plasmidet. Fordi Pst I bindingsstederne ligger inden for pBR322 B-lactamasegenet, er de resulterende plasmider følsomme overfor ampicillin, men stadig resistente overfor tetracyclin.
Til fæstning opvarmedes 2,5^icl dC-endedannet cDNA og tilnærmelsesvis 0,5^9 dG endeaf sni tsdannet pBR322 ved 65°C i 5 minutter i 50^o>l TE indeholdende 0,1 M NaCl og inkuberedes DK 173446 B1 " 16 derefter ved 57°C i 2 timer. Opløsningen nedkøledes derpå gradvist til stuetemperatur over en periode på en time og holdtes på is eller frosset ved -20°C indtil yderligere brug.
Indsætningen af cDNA arter i vektormolekyler kan opnås ved andre fremgangsmåder, der er kendte af fagfolk. F.eks. kan alle nucleotider tilsattes til 3'-enderne af DNA-molekyLer ved anvendelse af terminal transferasereaktionen, der er kendt som endedannelse. Disse molekyler kan derefter fæst-nes med vektor DNA molekyler, der er endedannet med komplementære sekvenser. Alternativt kan cDNA molekylerne have syntetiske bindinger, der er tilsat ved DNA ligaser, som, når de bortskæres med restriktionsenzymer, tilvejebringer passende sekvenser til kloning. Alternativt kan cDNA kløves direkte ved restriktionsenzymer eller DNAaser til direkte kloning. Stump-endede DNA molekyler kan også klones direkte i vektorer, idet sådanne vektorer omfatter plasmider, cosmider, bakteriofager og andre vira.
b. Transformation af E. coli ED8654 med rekorobinant plasmider.
E. coli ED8654, tabel 2, blev gjort egnet ved hjælp af proceduren ifølge D. Hanahan <1983; J.Mol.Biol. 160, 557-580) og 0,2 ml egnede celler transformeredes med 10 l af de fæstnede cDNA-pBR322 hybrider. Efter transformation dyrkedes cellerne i 2 timer i 2 ml SOC (5 g/l gærekstrakt/20 g/l irypton/10 mM NaCl/2,5 mM KCl /20 mM MgCl2/20 mM MgS04/20 mM glucose) og centrifugeredes derefter ved 2.000 x G i 5 minutter, resuspenderedes i 0,5 ml 0,85 procent NaCl og hele suspensionen udbredtes på en 280 mm LB <5 g gærekstrakt/ 10 g trypton/5 g NaCl pr. liter) agar <15 g agar pr. 1) plade indeholdende lO^g/ml tetracycI in-KCl for at udvælge de celler, der var transformeret med pBR322 eller rekombi-nant plasmider. Inkubationen foretoges ved 37°C i 48 timer. Herved ville en typisk transformation give ca. 5 x 10^ til 5 x 10^ kolonier pr. g rekombinant pBR322 eller tilnærmet- 17 DK 173446 B1 4 5 sesvis 10 - 10 pr.^g cDNA. Typisk indeholdt mere end 78 procent af transformanterne rekombinant plasmider som det fandtes ved tilfældig sortering af plasmider fra 14 tetra-cyc li nresistente kolonier.
c. Lagring af transformerede celler. Kolonierne fra hver plade skrabedes af i 10 ml LB. De celler, der var resultatet af · anslået 2.000 uafhængige transformationsforløb samledes sammen, centrifugeredes ved 1.500 x G i 5 minutter og resuspenderedes i 5 ml LB (v/v>, hvortil der tilsattes 0,5 ml DMSO. Portioner på 0,4 ml blev nedfrosset i flydende nitrogen og holdtes ved -70°C indtil de krævedes. Fem sådanne indsamlinger konstrueredes ved hjælp heraf.
Fordi hver original transformant indeholder en rekombinant DNA art, som stammer fra en komplet eller delvis kopi af en af mRNA arterne, der forefindes i mRNA fraktionen, kaldes kollektioner eller pools af sådanne transformanter for samlinger. I dette eksempel er samlinger af bovin granulosa- celle cDNA konstrueret i E. coli. En eukaryotisk celle kan 4 4 fremstille 1 x 10 til 2 x 10 forskellige proteiner, så en 4 kollektion af 10 uafhængige transformanter bør indeholde elementer fra alle de mere talrige mRNA-arter, Tilsyneladende indeholder langt størstedelen af cellerne i disse samlinger cDNA, som ikke er af umiddelbar interesse, men få indeholder hele eller delvise kopier af en inhibin mRNA-art,og de følgende fremgangsmåder tager sigte på at identificere og isolere sådanne kolonier.
Eksempel 4 SORTERING AF SAMLINGERNE I HENSEENDE TIL INHIBINKLONER: a. Forberedelse af samlingerne til sortering. r^r
frosne celler blev optøet og fortyndedes 5 x 10^ gange, hvorefter 0,5 ml udspredtes på overfladen af en 280 mm LB
agarplade indeholdende 10 g/ml tetracyc l in-HCl og inkube- o 4 redes ved 37 C natten over. Dette gav ca. 10 kolonier 18 DK 173446 B1 pr. plade, således at hver transformant i den originale samling skulle være repræsenteret 1-5 gange. Duplikatkopier blev taget på nitrocellulosefiltre fra Schleicher og Schnell og der fremstilledes orienteringsmærker ved med en nål dyppet i tusch at bore gennem filtrene og ned i agaren. Master-pladerne lagredes ved 4°C indtil de krævedes, og de inkuberede kopifiltre blev lagt på friske LB agarplader indeholdende lO^itg/ml tetracyclin-HCl i 8 timer. De overførtes derefter til LB agarplader indeholdende 50yO.g/ml chloramphenicol og inkuberedes natten over til forøgelse af kopiantallet pr. celle af rekombinant plasmiderne, se Clewell, D.B.
(1972) J. Bacteriol. 110; 667-676; Hanahan, D. og Meselson, M. (1980), Gene 10, 63-67). Filtrene behandledes ved en modifikation af fremgangsmåderne ifølge Grundstein, M og Hogness, D.S. (1975; Proc.Natl.Acad .Sci. USA 72, 3961-3965). Filtrene blev lagt med forsiden opad på et ark Whatman 3MM papir, der var mættet i 0,5 M NaOH/1,5 M MaCl i 15 minutter til fremskyndelse af lysering af cellerne og dannelse af enkeLtstrenget DNA, derefter neutraliseredes i 15 minutter på 2 papirsskift, der var mættet i 1,5 M NaCl/0,5 M Tris-HCl pH 7,5. De lufttørredes og lagdes på en Buchner-tragt og mættedes med 20 ml CHCl^ før aspiration. Filtrene bagtes derefter i 2 timer ved 80°C i en vacuumovn.
c. Strategi . For at identificere de kloner, der indeholder et inhibin cDNA gen eller en del deraf, anvendte radioaktivt mærkede oligodeoxyribonucleotid (oligonucleotid) prøver. De var indrettet til at være komplementære til en del af mRNA, der koder for NHg-terminalaminosyresekvenser af hver af de 43 kD og 15 kD underenheder, prøve 1 og 5, fig, 3. NHg-terminalsekvenserne af 43 kD og 15 kD underenhederne udledtes af aminosyresekvensering af intakt 58 kD inhibin, og dets fraseparerede underenheder og de første 16 aminosyrer af hver anførtes i international patentansøgning PCT/AU85/00119. Derefter var det ved at subtrahere amino-syresekvensen af 43 kD underenheden som fundet ved cDNA
19 DK 173446 B1 sekventering i pBTA22 og pBTA23, se eksempel 6A fra amino-syresekvensen af intakt 58 kD inhibin at rense og udstrække den originale analyse af 15 kO underenheden som vist i tabel 1. Denne rensning antydede et andet område, der var anvendeligt til udførelse af oligonucleotidprøver indbefattende dem for aminosyrer 20 til 24, begge incl. Fig. 3 viser den foretagne oligonuc leotidprøve, prøve 2. Det er en 24 gange degenereret 14mer og anvendtes til at isolere pBTA293 og pBTA294. Fordi hver aminosyre med undtagelse af methionin og tryptofan har mere end en DNA codon, som specificerer den, er det ønskeligt at optage alle mulige kombinationer af codons i prøverne. Således er der 64 mulige DNA sekvenser, som koder for det meste af aminosyresekvensen, der valges til inhibins store underenhed, undersøgelse 1, fig. 3, og 24 mulige DNA-sekvenser, som koder for det meste af den aminosyresekvens, der valges til inhibins lille underenhed, undersøgelse 2, fig. 3. For at maksimere muligheden for at opnå repræsentative molekyler for hver af disse sekvenser indsamles undersøgelse 1 fra fire uafhængige synteser, som ved positionerne 2 og 6 fra 5'-enden havde enten dG og dA eller dT og dA eller dG og dG eller dT og dG. Undersøgelse 2 syntetiseredes i en enkelt portion.
c. Oli gonucleoti dsyntese og rensning.Oligonucleotidprøverne syntetiseredes ved hjælp af en automatisk DNA syntetiseringsindretning (Applied Biosystems Incl, Model 380A). Maskinen programmeredes til sekventielt at sammenkoble N,N’-di isopro-pylphosphoramidit deoxyribonucleotidderivater til en deri-vatiseret kontrolleret poreglasunderstøtning ifølge den metodologi, der oprindeligt udvikledes af Matteucci, M.D. og Caruthers, M.H. (1981), J.Amer.Chem.Soc . 103, 3185-3191 .
Den protokol, der anbefales af Applied Biosystems Inc. anvendtes. Degenererede oligonucleotider dannedes ved substituering af.en blanding af phosphoramiditdeoxyribonucleo-tider til en enkelt deri vat i seret base. 0 l igonucleoti derne rensedes fra for tidligt terminerede oligonucleotider ved 20 DK 173446 B1 præparativ elektrophorese i en gel 20 cm x 20 cm x 1,5 mm indeholdende 20 procent w/v acrylamid/1,0 procent (w/v) N,N’~ bisac ry lamid/1 mM EDTA/50 mM Tris justeret til pH 8,3 med fast borsyre. Elektrophorese foretoges med 500 V i 1,5 time og derefter visualiseredes oligonucleotiderne ved placering af gelen på en Kieselgel F254 fra Merck tyndt-lagschromatografi til undersøgelse under ultraviolet lys. Oligonucleotiderne kommer til syne som mørke bånd. De blev udskåret og elueredes fra gelen natten over i 0,8 ml sterilt vand. Koncentrationen af eluerede oligonucleoti der anloges ved bestemmelse af adsorbansen ved 260 nm, en *260 a^*-ssnin9 1*0 under anvendelse af 1 cm lys bane taget som 35^«,g enke It st r engs DNA pr. ml.
d. 51 endemærket reaktion. De rensede oligonucleotider 32 blev gjort radioaktive ved tilsætning af en P-mærket phosphatgruppe til deres 5'-ender.
Specifikt lyopholi seredes 40 pmol oligonucleotid og 40 pmol r32 P ATP C2.000 Ci/mmol; 5 jj&\!j*X.} og opløstes og inkuberedes ved 37°C i 90 minutter i 20 jud. buffer indeholdende 4 enheder T^ polynucleotidkinase/10 mM MgClj/IO mM DTT/ 1 mM spermidin/50 mM Tris-HCl pH 7,5.
De radioaktive oligonucleotider rensedes som beskrevet ovenfor og visualisering foretoges ved autoradiografi i 5 minutter på Fuji RX røntgenfilm. Eluering foretoges i 0,8 ml sterilt vand natten over. Hver af de fire oligonu-c leotidsamlinger, som tilsammen dannede prøve 1, se eksempel 1b, behandledes separat op til dette trin og kombineredes derefter.
21 DK 173446 B1 TABEL 1 NH-.-TERMINAL SEKVENSANALYSE 06 PRflVEDESIGN Rest inhibin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Ala GLu Gly Gly Phe Met Val Arg Gly Ser Glu Pro
Leu Val Asp Gly Lys Asn Ile Lys A under- enhed Asn Ala Val Gly Gly Phe Met Arg Arg Gly Ser Glu Pro B underenhed Tyr Leu Glu Asp Gly Lys Val Asp Ile Lys*
Rest inhibin 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Glu Asp Gin Asp Val Ser Gin Ala Ile Leu Phe Pro Ala
Lys Gin Phe Phe Phe Lys Asp Ile Gly Asn A under- enhed Glu Asp Gln(Asp)Val(SerXGln)(Ala) Ile Leu (Phe) (Pro) (Ala) B underenhed Lys*Gln*Phe*Phe* Phe*Lya*Asp* Ile* Gly* Asn* 58 kD inhibin reduceredes, alkyleredes og de fraskilte under enheder isoleredes ved elektroe luering fra SDS-PAGE geler.
58 kD inhibin (80 praot) A underenhed 17 pmol og B underenhed 6 pmol udsattes for Edman degradering i en gasfasesekvenator. (Xaa) - aminosyrer fundet fra cDNA sekvens.
Xaa* = aminosyrer identificeret ved subtraktion af A underenhedssekvensen fra den dobbelte sekvens af 58 kD inhibin. De regioner, der anvendtes til at betegne oligonucleotidprøverne,er understreget.
e. Anvendelse af prøverne til sortering af samlingerne. Hvert sæt af de radioaktive prøver blev optaget i en 40 ml 5 x SCC/ 10 x Denhardt's opløsning, 20 x SCC er 3 M NaCl/0,3 M trinet ri umci trat pH 7,0 og 50 x Denhardt's opløsning er 1 procent (w/v) Ficoll/1 procent (w/v) polyvinylpyrrolidon/ 1 procent (w/v) bovinserumaIbumin og et filter, der var representativt for hver af samlingerne, nedsænkedes i opløsningerne under forsigtig omrøring natten over. Filtrene vaskedes i adskillige skift af 1 x SCC/0,1 procent SDS (natri-umdodecyIsulfat) ved stuetemperatur og underkastedes autoradiografi i 3-5 timer ved -70°C under anvendelse af Fuji 22 DK 173446 B1 RX røntgenfilm og en Dupont Crones Hi Plus intensiveringsplade. Filmen fremkaldtes og filtrene vaskedes igen i 1 x SCC/0,1 procent SDS ved 37°C og underkastedes derefter autoradiografi natten over.
De omrader, der var mere intense end baggrunden efter vask-ningen ved stuetemperatur eller som stadig var synlige efter vaskning ved 37°C, og som svarede til positionen af kolonier p§ masterpladerne, ansås for at være potentielle inhi-binkloner.
De foregående eksempler beskriver nogle midler og en strategi, ved hjalp af hvilken celler, der indeholder inhibin eller i nhi binlignende DNA-sekvenser, kan opnås, men hensigten er ikke at udelukke alternative midler eller strategier. F.eks. er det muligt at anvende genomisk DNA som ud-gangs-DNA og således udelukke behovet for cDNA syntese, se eksempel 8. Endvidere kan kloningsvektoren vare en sådan, i hvilken ekspression af klonede DNA-fragmenter er opnået og sorteringsproceduren er baseret på anvendelsen af anti-inhibinanti serum, se eksempel 10 eller den direkte detektering af inhibin eller inhibin-lignende biologisk aktivitet. Sådanne metoder er velkendte for fagfolk.
Eksempel 5
KARAKTERISERING AF FORMODEDE KLONER
a. Rensning af potentielle inhibinkloner. Områderne, der svarer til de mørke pletter på autoradiogrammerne, udvalgtes og blev bestrøget for enkeltkolonier på LB plader indeholdende 10 g/ml tetracyclin-HCl og inkuberedes i 16 timer ved 37°C. Kopier af disse plader lagredes ved A°C indtil de kravedes. Filtrene anbragtes i 3-6 timer på en LB agar med tetracyclin-HCl og overførtes derpå til en LB agar indeholdende 50^cg/ml chloramphenicol i 16 timer, hvorefter kolonierne lyseredes som beskrevet tidligere og sorteredes igen under anvendelse af de radioaktive oligo- 23 DK 173446 B1 nucleotidprøver. Enkeltkolonier svarende til de mørkeste pletter på autoradiogrammerne fra disse filtre udvalgtes, blev bestrøget igen og analyseret.
b. Restrikti onskortlagning af plasmid DNA. Plasmid DNA-indholdet af i det mindste et isolat af hver formodet inhibinklon analyseredes ved ekstraktion og digestion med restriktionsendonuclease Pst I. Dette enzym frigiver cDNA-inserten fra plasmidet og kløver også cDNA ved ethvert internt Pst I bindingssted. Plasmid DNA ekstraktion var baseret pi Birnboim og Doly's métode (1979; Nucl.Acids Res. Ti 1513-1523). En cellekultur, der var dyrket natten overii 3 ml LB, centf i fugeredes og resuspenderedes i 0,2 ml lysebuffer, 50 mM glucose/10 mM EDTA/0,2 procent lysozym/ 25 mM Tris-HCl pH 8,0 og inkuberedes ved 0°C i 10 minutter. Dertil tilsattes 0,4 ml alkalin SDS, 0,2 M Na0H/1 procent w/v SDS og efter 10 minutter ved 0°C tilsattes 0,3 ml 3 M Na acetat pH 4,8. Efter 15-30 minutter ved 0°C fjernedes det resulterende hvide pracipitat ved centrifugering. Plas-midindholdet af 0,8 ml af supernatanten pracipi te redes ved tilsætning af 0,7 ml isopropanol, nedkøledes til -70°C og cent rifugeredes ved 15.000 x g i 5 minutter. Pellet’en genopløstes i 0,4 ml TE og præcipiteredes ved tilsatning af 40 f/λ. 3 M Na acetat pH 7,5 og 0,8 ml ethanol, nedkøling og centrifugering som ovenfor. Den endelige pellet tørredes in vacuo og opløstes i 0,2 ml TE. En prøve p§ 20^u,l diges-teredes med 20 enheder Pst I fra Boehringer i et endeligt volumen på 40 jjJl TA buffer, 66 mM ka li umacet at/10 mM magnesiumacetat/0,5 mM DTT/ 0,1 mg/ml BSA/33 mM Tris-ace-tat pH 7,9 indeholdende ΙΟ^μ^/ml RNAse A ved 37°C i 60 minutter og udsattes derefter for elektrophorese på polyacryl-amidgeler, op til 10 procent acry lamid/0,27 procent bis acrylamid i TBE buffer, 2,5 mM EDTA/133 mM Tris/89 mM Bor-syre. Prøver af pBR322 digesteret med Alu I fra Boehringer anvendtes som størrelsesstandarder. Klonerne, der indledningsvis identificeredes, er opført i tabel 2.
24 DK 173446 B1 S. Sekvenseringsstrategier. Egnede restriktionsenxymfragmenter, der var dannet med et eller flere af enzymerne Pst I, Pvu II, Sau 3AI eller Sma I rensedes fra polyacryl-amidgeler ved eluering i 0,5 M ammoniumacetat/10 mM magne-siumacetat/0,1 M EDTA/0,1 procent SDS ved 37°C natten over og præci pite redes derefter med ethanol, genopløstes i TE og underklonedes til kopiformerne af bakteriofager M13 mp8 og M13 mp9 til sekvensering ved dideoxykædeterminerings- · metoden ifølge Sanger F*. et al. (1977; Proc.Natl.Acad.
Sci. USA 74, 5463-5467) under anvendelse af en universel grundsubstans (17 mers; Nr. 1211 eller nr. 1212; New England Biolabs) eller oli gonucleotidgrundsubstanser, der er komplementære til cDNA i sig selv. Sidstnævnte er i særdeleshed anvendelig til isolerende overlapning af cDNA-ar-ter og til udstrækning af kendte sekvenser fra overlappende cDNA-arter eller til sekvensering fra dG/dC ender mod midten af cDNA'et.
Til al sekvensering, subkloning og ekspressionsarbejde, se eksempel 10, anvendtes restriktionsenzymer i TA, eksempel 5B og T4 ligase fra Boehringer ifølge fabrikantens instruktioner.
Tabel 2 - PLASMIDER OG BAKTERIESTAMMER.
BAKTERIE- PLASMID FORÆLDR E UNDER- RESTRIKTION Kodea STAMME INDHOLD PLASMID ENHEDS- STØRRELSE*» _ _ _ _ FRAGMENT _ BTA123 ED8654C - ED8654 pBR322d BTA404 ED86S4 pBTA22 pBR322 Λ; Pst I;215/17$ BTA40S ED8654 pBTA23 pBR322 A; Pst I;480/295/150 25 DK 173446 B1
Tabel 2 - fortsat
Kodea BAKTERIE- PLASMID- FORÆLDRE- UNDER- RESTRIKTION
STAMME INDHOLD PLASMID ENHED, STØRRELSE*» _ _ _ _ FRAGMENTER _ B7A647® pUR292* B7A410 BTA647 pB7A28 pOR292 A; pBTA23 Pst I;480 BTA411 B7A647 pBTA29 pDC9 A; pBTA23 Pst I;480 BTA412 ED8654 pBTA30 pBR322 A; Pst I;300/240/480/410 BTA413 ED8654 pBTA290 PBR322 A; Pst I;480/360 BTA415 BTA647 pBTA292 pUR291 A; pBTA30 Pst I;410 BTA416 ED86S4 pBTA293 pBR322 B; 13S/S10 BTA417 ED86S4 pBTA294 pBR322 B; 165/320/530 BTA418 ED8654 pBTA29S pBR322 A; 300/500
BTA419 BTA6348 pBTA296 pUR290 A; Sau 3A I-Ssu 3A I
BTA420 BTA634 pBTA297 pB7A286b A; pB7A296;EeoRI-EeoRI
(BTA420 « ATCC67054) BTA421 BTA634 pBTA298 pUR290 Ac; Ha· II-San 3A I plus adapter
BTA422 BTA634 pBTA299 pBTA286 Ac; pBIA298 EcoRI-EeoRI
(BTA422 « ATCC67059)
BTA423 BTA634 pBIA300 pOR291 B; pBTA293 Pst I; SIO
BTA424 BTA634 pBTA301 pBTA286 B; pBTA300 EeoRI-EcoRI
(BTA424 - ATCC67058) BTA42S BTA634 pBTA286 pOR291
BTA426 BTA6S2^ pBTA302 pUC7J Λ; pBTA296 Sau 3A Ι-Sau 3A I
(BTA426 « ATCC670S7) BTA427 B7AS4S* pBTA3.03 pUC13 Ac; Hae II-Sau 3A I plus adapter*.
(BTA427 » ATCC67056)
BTA1360 BTA6371 pB7A304 pUG8 B; pB7A293 Pst I; SIO
tm»60 - ATCC6705S) 26 DK 173446 B1 (a) kodenummer for Biotechnology Australia Pty. Ltd.
Culture Collection, (b) størrelser, når disse er opgivet, er bp anslået ud fra e lektrophorese på polyacrylamidgeler mod standarder af pBR322 digesteret med Alu I. Disse værdier afviger lidt fra de virkelige størrelser, der er afledt ved DNA-se-kvense ri ng.
(c) Murray, N.K. et al, )1977), Mol.Gen.Genet. 150; 53-61.
(d) Botivar, F. et al, C1977) Gene 2; 95-113.
(e) BTA647 - E. coli K12, hsdR^, supE44, supF58, lac Y1, gaIT22, galK2, trpR55/F·lacIq, Δ(lacZ)Ml5, lacY+A+, proA+B+, tra+.
(f) Ruther, U. og Muller-Hill, B. >1983) EMBO J. 2; 1791-1794.
(g) BTA634 = E. coli K12 AClac,pro), supECglnV), thi,lon-l, za j :: Tn5/F1 proA+B+, laclq, Δ(lacZ)M15, lacY+A+, traD36.
(h) pBTA286 er et derivat af pUR291, hvori en Hpa I - Ava I DNA fragment af 2355 basepar er slettet fra kodningssekvensen af lacZ genet, siledes at kodningssekvensen forbliver i rammen.
<i) BTA 652 = E. coli K12 AClac, pro), thi , supE(glnV)44, hsdRK17 endAl, gyrA96, relAl/F’ proA+B·*·, laclq, ClacZ)Ml5, lacY+A+ traD36.
(j) Viera, J. og Messing, J. C1982) Gene 19, 259-268.
(k) BTA545 = E. coli K12 thi , AClac, arg F), U169 (lon)100, j f115 0, zje/zjf::Tn10, rpsL, hsdRK /F' laclq, A(lacZ)M15, lacY+A+, proA+B+, tra+.
Cl) BTA637 = BTA652, lon-1, zaj::Tn5.
Eksempel 6 INHIBINKLONER
a. A C43 kD) UNDERENHEDSKLONER. To plasmider pBTA22 og pBTS 23, der indholder dele af 43 kD underenheden, opnåedes oprindeligt ved anvendelse af prøve 1, fig. 3. Sekvensanalyse af deres cDNA’er indicerede, at de ikke havde fuld længde, så der foretoges specifikke oligonucleotidprøver for at isolere cDNA, der forløb 5'- fra pBTA22, prøve 3, og 27 DK 173446 B1 3’- fra pBTA23, prøve 4. pBTA290 isoleredes under anvendelse af prøve 3 medens pBTA30 og pBTA295 isoleredes under anvendelse af prøve 4.
Pst I kortet og strategien for sekvensering af cDNA insert-erne fra plasmiderne er opgivet i fig. 4 og en komposit-nucleotidsekvens, der indkoder A underenheden, er vist i fig. 5. Denne sekvens er i sin helhed indeholdt i cDNA fra plasmiderne pBTA290 og pBTA295. 410 bp fragmenter af pBTA 30 indeholder stop-codon og de naste 6 baser fra 3'-utransla-teret region før dG/dC enderne. CAG, der indkoder His 1 af A underenheden er til stede i 5'-Pst I cDNA fragmenter af pBTA22, pBTA23, pBTA290 men ikke i hverken 240 eller 300 basepar Pst I cDNA fragmenter af pBTA30. Disse to fragmenter har ingen Sbne udlæsningsrammer eller sekvenser til fælles med de andre kloner og kan derfor repræsentere en del af en usplejset intron.
cDNA sekvensen indeholder en Sben udlæsningsramme fra base 1 til 1140. I denne udlæsningsramme er det første ATG ved base 61 (Met-60) og aminosyresekvensen, der efterfølge Met-60 er indikativ for et signalpeptid, men modsat de fleste signalpeptider er der ingen arginin eller lysin før rækken af hydrofobe leuciner, se Watson, M.E.E. (1984) Nucl.Ac.Res. JK2, 5145-5164. Dette signalpeptid er forventet at ende mellem Gly-44 og Gly-41, der efterlader et propeptid pi omkring 40 aminosyrer, der går forud for His-1. Således syntetiseres A-underenheden af inhibin til at begynde med som et præ-proprotein af 38,310 Dalton, der forløber fra Met-60 til Ile-300.
A-underenheden er afledt fra dets forstadium ved kløvning ved parvise argininrester (-2, -1), et fælles signal for proteolytisk behandling af forstadieproteiner, se Steiner, D.F. et al (1980) Ann.N.Y. Acad.Sci. 343, 1-16. A under-enhedsproproteinet indeholder tre andre par argininrester 28 DK 173446 B1 ved lokaliteterne -6, -5, 8, 9 og 165, 166. Kløvning af A underenheden ved resterne 165, 166 ville danne to frag-menter af lignende størrelse, der her benævnes og A^..
A^ fragmentet danner 20-kD underenheden af 31-k Da bovi n-inhib in, se eksempel 9. A underenheden beregnes at indeholde 11 cysteinrester, af hvilke fire er i A^ fragmentet fra His 1 til Arg 166. Disse fire rester forventes at vare internt bundet, hvilket tillader fjernelse af fragmentet fra Ac underenheden. A^. underenheden indeholder syv cysteiner og i det mindste en af disse forventes at danne en disulfidkade til B underenheden. A underenheden har to potentielle N-glycosyleringsbindingssteder ved Asn 80 o Asn 202 baseret på genkendelsessekvensen Asn-X-Ser/Thr, se Wagh, P.V. og Bahl, O.P. (1981) CRC Crit. Rev .Biochem. 10, 307-377, og Asn 202 er indeholdt i A^ underenheden. De beregnede molekylvægte af proteinkæderne af underenhederne A og Ac er 32,298 og 14,624, hvilket er ca. 25 procent mindre end de, der er anslået ved SDS-PAGE for naturligt in-hibin, henholdsvis 43 kD og 20 kD. Dette kan delvist skyldes carbohydratindholdet i de naturligt forekommende molekyler, som kan ændre både deres molekylvægt og molære omfang.
Ud fra disse forskelle forventes både A., og A- delene at være glycosyleret, formentlig med Asn 80 og Asn 202, men hvorvidt 0-bundet glycosylering af serin og threoninrester er involveret, vides ikke. Carbohydratindholdet af glyco-prote i nhormonerne bovin IH, human CG og PMSC er skønnet at være 16 vægtprocent, 29-31 vægtprocent og 45 vægtprocent, se Pierce, J.G. og Parsons, T.F., (1981) Ann.Rev. Biochem.
50; 465-495, så vort tal på ca. 25 procent baseret på den forekommende molekylvægt kan repræsentere den lavere del af dette område.
cDNA sekvensen forudsiger en 3'-ut rans lateret region i mRNA af 42 baser. Dette indbefatter et typisk polyadenylerings-signal (AATAAA) 16 baser før enden af poly(A), se Nevins, J.R. (1983) Ann.Rev.Biochem. 52, 441-466). Den 3'-utransla- 29 DK 173446 B1 terede region er A+T rig, 40,4 procent G+C i modsætning tiL kodningssekvensen 66,3 procent G+C og den 5'-utransla-terede region 71,6 procent G+C.
b. B (15 kD) UNDERENHEDSKLONER. Fem uafhængige kloner detek-teredes med prøve 2 og det cDNA, der indholder den modne B underenhed fra to repræsentanter er vist i fig. 4. De andre tre kloner indeholdt cDNA med et restriktionsmønster magen til pBTA293, men med kortere 3*-Pst I fragmenter.
Nucleotidsekvensen af B underenheds cDNA opnåedes ved sekvensering af pBTA293 og pBTA294, se fig. 6. B underenheden syntetiseres i det mindste som et proprotein og i lighed med Ac underenheden er den C-terminus af dens respektive proprotein. Den separeres fra pro-sektionen ved hjalp af 5 konsekutive argininrester. Den indeholder to par lysinres-ter ved positionerne 13, 14 og 102, 103, men det er usandsynligt, at disse er behandLingsbindingssteder, se Steiner, D.F. et al. (1980) se ovenfor. Der er ni cysteinrester og dette mærkelige antal antyder, at i det mindste en er til rådighed for krydsbinding til A^ underenheden. Fra cDNA sekvensen beregnes det, at proteinkæden af B underenheden har en molekylmasse på 12,977 Dalton, hvilket er tat på den aktuelle molekylvægt på 14,900, der anslås ved SDS-PAGE af den oprindelige B underenhed. Der er ingen forekommende N-glycosyleringssekvenser i den modne B underenhed, men Asn-145 i proproteinet kan være glycosyleret.
Den 3'-utranslaterede region af B underenheden er 94 nucleo-tider lang, og der er intet AATAAA polyadenyleringssignal, som i cDNA kodningen for A underenheden. De sidste tolv baser af den 31-ut rans late rede region før poly(A)enderne passer nøje sammen med de sidste 12 baser af erythropoietin 3*-utranslateret cDNA (ACTGAAACCACC), som heller ikke har nogen AATAAA sekvens, se Jacobs, K. et al (1985) Nature 313, 806-810. G+C indholdet af B underenhedskodningsregionen, baserne 157 til 504, er 54,2 procent og indeholdet af 30 DK 173446 B1 den 3'-utransLaterede region er tilsvarende 55,3 procent i modsætning til de fo-skelle, der observeredes for A underenhedskodningssekvensen og 3*-ut rans lakeret region.
Eksempel 7 IDENTIFIKATION AF BOVIN INHIBINLICNENDE SEKVENSER I GENOMISK DNA.
Sekvenser i lighed med eller homologe med de gener, der koder for de store 43 kD og små 15 kD underenheder af bovin inhibin identificeredes i human, ovin, porcin, fishe- og hønse genomisk DNA.
Dette opnåedes i det væsentlige ved standard Southern Blot hybridiseringsteknikker, se Maniatis T. et al (1982), "Molecular Cloning", Cold Spring Harbour). I det væsentlige opløses genomisk DNA med et restriktionsenzym og de resultrende fragmenter frasepareres efter størrelse ved elektro-phorese på agarosegeler. DNA overføres til en nitrocellulose eller anden membran, som derefter undersøges med £«p] mærket cDNA, der koder for væsentlige dele af 43 kD eller 15 kD bovininhibinunderenheder. Dette resulterer i detekteringen af genomiske DNA fragmenter, som ligner eller er identiske i henseende til nucleotid sekvens.
Specifikt frembringes genomisk DNA enten fra en human makro-fag cellestamme U937 CATCC CRL 1539) eller fra menneskeblod, svineblod og hønseblod eller fra blødt væv fra okser eller får. Fra de bløde væv og den humane cellestamme var den anvendte fremgangsmåde i det væsentlige som beskrevet i Maniatis, T. et al, se ovenfor. Fra blod frembragtes DNA som følger: 10-15 ml blod (+ 0,625 procent citrat) fortyndedes til 40 ml med kold 10 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, pH 7,5, TE 10-10) og anbragtes på is i 5 minutter til lysering af blodcellerne. Efter centrifugering i 5 minutter ved 4.000 x g resuspenderedes pellet'en i 10 ml kold TE 10-10, fortyndedes til 40 ml med TE 10-10 og centrifugeredes i 5 31 DK 173446 B1 minutter ved 3.000 x g. Pellet'en disaggregeredes i 10 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, samme volumen som udgangsblodvolumenet. 10 procent SDS tilsattes til 0,5 procent, proteinase K tilsattes til 50 g/ml og blandingen inkuberedes ved 37° natten over under svag rystning. 10 ml phenol mættet med 0,1 mM Tris HCl pH 8,0 og indeholdende 0,1 procent ^-hydroxyquinoLin tilsattes og blandedes forsigtigt i 5-10 minutter ved stuetemperatur. 10 ml CHCl^: isoamylal-kohol (24:1) tilsattes og blandedes i 5-10 minutter efterfulgt af centrifugering ved 8.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Den vandige fase reekstraheredes to gange mere med 15 ml CHCl^: isoamylalkoholl 1/20 rumfang af 5 M NaCl og 2 rumfang ethanol tilsattes ved stuetemperatur og blandedes. DNA fjernedes med en pasteur-pipette, lufttørredes 30-60 sekunder og opløstes i 4 ml TE ved svag rystning ved 37° i 3 timer. DNA'et repræcipite redes som beskrevet ovenfor og genopløstes i 3 ml TE.
Prøver p9 generelt 10 g af dette DNA blev udskåret med forskellige restriktionsendonucleaser ifølge fabrikantens instruktioner ved en koncentration p§ 40-50 ^tg/ml under anvendelse af op til 500 enheder/ml enzym og inkuberedes i 16 timer. Produkterne deproteiniseredes ved ekstraktion med et lignende rumfang phenol efterfulgt af tre ekstraktioner med chloroform og præcipitering i 0,2 M NaCl med 2,5 rumfang ethanol. Den pelleterede DNA opløstes i vand og størelsesopdeLtes ved elektrophorese, 75 volt/4 timer på en 11 x 14 cm 1 procent agarosegel i TAE buffer.
DNA denatureredes ved nedsænkning af gelen i en opløsning på 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH i 45 minutter efterfulgt af neutralisering i 2 x 45 minutter i 3,0 M NaCl/0,5 M Tris-HCl pH 7. DNA'ét overførtes ved kapillærvirkning til en nitrocellulosemembran, Schleicher og SchnelL, og fikseredes ved bagning under vacuum ved 80°C i 2 timer. Filtrene præhybri-diseredes med en opløsning indeholdende 50 procent formamid, 5 x SSPE, se Maniatis et al, se ovenfor, 5 x Denhardts og 25 g/ml lydbehandlet sildesperma DNA i 2-4 timer.
32 DK 173446 B1
Hybri di seringsprøverne var som følger: a) 790 bp Sph I - Sma I fragment fra A underenheds cDNA genet af pBTA23, se fig. 5.
b) et 1109 bp Sph I - Eco RI fragment opnået fra bovin δ underenhedsklonen pBTS293, se fig. 4. Denne indeholdt B underenheds cDNA fra basepositionen 361 til 718, se fig. 6, samt et 751 bp fragment fra Pst I til Eco RI bindingsstederne af pBR322. Disse fragmenter isoleredes fra lav geldannelsestemperaturagarosegeler efter elek- - 32 trophorese og markedes mede*- p dATP ved metoden ifølge Feinberg A.P. og Vogelstein, B. (1984) Anal.Biochem.
137, 266-267.
Ca. 30 ng af DNA mærkedes til en specifik aktivitet af 8 9 2 x 10 til 10 tællinger pr. minut (CPM)/ g af DNA og mellem 3 og 4 x 10^ CPM af prøven blandedes efter opvarmning til 100°C med en opløsning indeholdende 1 x Denhardt/ 50 procent formamid/ 5 x SSPE/1X Denhardts/10 procent dex-transuIphat/25 /JLgtml lydbehandlet sildesperma DNA. Hybri-disering af filtrene foretoges i 20 timer ved 42°C. Filteret rensedes ved stuetemperatur i 2 x SCC 0,1 procent S DS og vaskedes derefter ved 50°C i 30 minutter hver i 2 x SCC/ 0,1 procent SDS og derefter 1 x SSC/0,1 procent SDS og derefter 0,1 x SSC/0,1 procent SDS. Betingelserne for hybri-disering er s3danne, at hybrid i seringssekvenser skal være mindst 70-75 procent generelt homologe til bovin cDNA-sek-venserne. Efter eksponering på Fuji RX røntgenfilm i mindst 24 timer kunne størrelserne af hybridiseringsfragmenterne bestemmes på baggrund af markerings DNA fragmenter af kendte større Iser.
Den omtrentlige størrelse i basepar af fragmenterne af human, bovin, ovin, portin og hønse genomiske DNA'er somhybridi-seredes kraftigt til A eller B bovin underenhedsgenprøverne, er som følger: 33 DK 173446 B1
Tabel 3
A UNDERENHEDSPRØVE
GENOM ENZYM FRAGMENTER ENZYM FRAGMENTER ENZYM FRAGMENTER
Bovin Pst I 3400/2700,960,480 PvuII 1700 BamHI 13000
Human ” 2450,1200,480 " 700 " 18000
Ovin " 2650,980,480 " ND " 11000
Porcin " 2200,2000,480 " ND " 2150 Høns " (nogen hybridise ring) " . ND " 6600
Bovin EcoRI 5-6000 Hindlll 5000
Human " 150000 " 20000
B UNDERENHEDSPROVE
GENOM ENZYM FRAGMENTER ENZYM FRAGMENTER ENZYM FRAGMENTER
Bovin EcoRI 7000 Hindlll 3300 PstI ND
Human " 9000 " 11000 " 650
Ovin " 7000 " 3900 " 680
Porcin " . 7000 " 6000 " 1100,680 Høns " 14000 " 4350 " 1310
Fisk (Melanotaenia splendida) ND ND " 3600 (ND = ikke bestemt) DNA fra hver art, der blev testet, besidder et begrænset antal (generelt et og i særlige tilfælde helt op til tre efter digestion med Pst I) af fragmenter, der hybridiserer til de store eller små bovininhibinunderenheds cDNA prøver. Karakteristisk var et ca. 480 bp Pst I fragment, der var fælles for alle arterne, der undersøgtes, med den store underenhed cDNA. Disse hybridiseringsfragmenter påviser tilstedevære Isen af andre arter end kvæg af gener, der ligner eller er homologe med bovininhibingener. Det er ikke udelukket, at inhibin cDNA sekvenser, der ikke er omfattet af det foreliggende valg af prøver, kan hybridisere til genomisk DNA i andre fragmenter end de i tabel 3 viste.
I en separat serie eksperimenter detekteredes A og B underenhedsforstadie mRNA arter i RNA fra rotteovarier under anvendelse af bovinunderenheds cDNA som prøver. Disse mRNA arter fandtes at være mere rigelige i rotteovarier, som var 34 DK 173446 B1 behandlet med PMSG og påviste således anvendeligheden af inhibin DNA som diagnostisk prøve.
cDNA generne, der koder for bovin A og B inhibinunderenhe-de r, kan derfor anvendes til identifikation af DNA og RNA , der koder for inhibinmolekyler i andre arters genomer og organer. På grund heraf er de inhibinmolekyler, som de indkoder, homologer af bovininhibin og kan anvendes pi lignende måde.
35 DK 173446 B1
Eksempel 8 og tabel 4 udgår.
Detekteringen af inhibinunderenhedsgener i forskellige hvirveldyrsarter tnder anvendelse af bovin cDNA
som prøve efterfulgt af kloningen og sekvenseringen af human inhibinunderenhedsgener for at vise omfattende ligheder i aminosyresekvens afslører, at andre hvirveldyrs inhibiner er homologe, om ikke identiske, med det bovininhibinprotein, der defineredes internationalt i patentansøgning PCT/AU85/ 00119 og i fig. 5 og 6.
Vi har detekteret inhibinaktivitet i follikelvaske eller ovarieekstrakter fra mange hvirveIdyrsarter, f.eks. se tabel 5, og har renset oprindeligt inhibin fra human FF og ovin FF ved hjalp af fremgangsmåderne ifølge international patentansøgning PCT/AU85/00119 og eksempel 9 og fundet, at begge arter funktionelt ligner bovin inhibin og har 58 kD og 31 kD former med underenhedsstrukturer, der: ligner bovi nf orme rn.e.
Kanin-, bovin- og humane.inhibiner neutraliseres også med kaninåntiserum beskrevet i international patentansøgning PCT/AU85/00119, som blev fremhævet overfor renset 58 kD bovin inhibin og også krydsreager et i en RIA, hvilket igen indicerer tat strukturmass i g homo logi, se tabel 5.
Det faktum, at naturlig bovininhibin er i stand til at fremkalde en immun respons i kaninen, indicerer ikke desto mindre, at der er forskelle mellem kanin og bovininhibiner, som genkendes af kaninens immunsystem som fremmede og på denne måde kan inhibin fra en art anvendes som antigen i en anden til dannelse af antistoffer, der er i stand til at genkende et endogent inhibin.
De antistoffer, der produceres af kaninen, kryds reagerer ikke navnevardigt med bovin eller rotteinhibiner, hvilket indicerer specificitet for antiserum for særlige epitoper, selvom DK 173446 Bl 36 alle de i tabel 5 viste arter er aktive i rottehypofysecelle-kulturen, hvilket vise r en konform homologi for interaktion med hypofysecellereceptoren .
Det fremgår også af den foregående diskussion, at eftersom B underenheden er godt bevaret og måske identisk i de fleste arter, vil anvendelsen af et mutant B underenheds protein som et antigen til frembringelse af antistoffer, som krydsreagerer med B underenheden af endogent inhibin, finde stor anvendelse i og virkningsfuldhed i mange arter. Sådan et antigen kan frembringes ved teknikker, såsom in vitro muta-genese af DNA efterfulgt af ekspression af det nye gen som beskrevet i eksempel 10, eller ved kemisk modifikation af B underenhedsproteinet eller ved isolering af et B underenhedsgen fra en art med en B underenhed, der ligner, men ikke er identisk med den i figur 6 beskrevne, efter fulgt af ekspression af dette gen som beskrevet i eksempel 10.
Tabel 5 INTERAKTION AF INHIB1NER FRA FOLLIKELVÆSKER HED KANIN 474 ANTIBOVIN 58 kD INHIBIN ANTISERUM.
Art_ Neutralisering Procent krydsreakt i vitet i RIA* 58 kD sporstof 31 kD sporstof
Bovin + 100 100
Human + 27 28
Ovin - 8,0 0,3
Rotte - 6,0 ND
Kanin + ND ND
* se eksempel 16a ND = ikke bestemt
Eksempel 9 FORHOLDET HELLEN 58 kD og 31 kD FORMER AF INHIBIN.
Inhibin er fremstillet af granulosacel lerne og sekreteret i fol likelvæsken. Der eksisterer de primart som en 58 kD form som tidligere vist, se international patentansøgning PCT/AU85/00119.
37 DK 173446 B1
Bevis på en mindre form for inhibin opnåedes ved studier, der tog sigte på at forbedre effektiviteten af rensningen af inhibin fra bovin follikeIvæske. Ved anvendelse af rensningsproceduren ifølge Robertson, D.M. et al C1985, Biochem. Biophys .Research Commun. 126, 220-226; International patentansøgning No. PCT/AU85/00119> indsattes et pH 4,75 præcipite-ringstrin mellem det indledende neutrale og det sure buffer getfiLtreringschroma tografitrin. Dette resulterede i dannelsen af en sekundær genomisk aktiv art, som separeredes fra den første under anvendelse af det sure gelf iItreringstrin. Efter følgende omvendt fase HPLC og præparativ polyacrylami ri-gele lektrophorese på denne sekundære art fandtes den at være et protein med en sand molekylvægt pS 31.000 sammensat af to underenheder af sand molekylvægt på 20.000 og 15.000 med lignende biologisk aktivitet som det originale 58 kD materiale. De sande mokekyIvægte af de mindre underenheder af de to inhibinarter er meget ens, ca. 15 kD, hvilket antyder, at forskellen i sand ' molekylvægt af de to inhibinarter hovedsagelig skyldes ændringer i 43 kD underenheden, som er forkortet til ca. 20 kD.
Endvidere konverteres ren 58 kD inhibin til 31 kD formen under inkubering med studeserum eller (SS) human post-meno-pausalt serum (PMS) . Denne opdeling finder ikke sted under lignende inkubation med bFF, se fig. 9. Derfor må den mindre 31 kD form af inhibin og specielt dens større 20 kD underenhed betragtes som direkte derivater af 58 kD formen af inhibin beskrevet i international patentansøgning PCT/AU85/ 00119 og hos Robertson, D.M. et al (1985), Biochem.Biophys. Res.Commun. 126, 220-226 og kan afledes direkte af underenhedsgenerne beskrevet her.
Det er også klart, at serum, der er frit for naturligt inhibin (SS og PMS) kan anvendes til behandling af rekombi-nant inhibin eller dets underenheder inwitro, og at det enzym, der er ansvarligt herfor, kan renses fra serum eller 38 DK 173446 B1 fra celletyper, der udfører denne reaktion og anvendes til et lignende formål. Denne enzymaktivitet er karakteriseret i henseende til proteaseinhibitorer. Efter inkubering af serum med i odineret 58 kD inhibin ved 30°C i 17 timer i nærvær af SS eller PMS reduceredes konvertionen af 58 kD til 31 kD inhibin fra 24 procent til 4,5 procent ved indeslutning af 3 mM parachloromercuribenzoat eller 10 mM EDTA. Bacitracin og Pepstatin A på hver 0,3 mM var uden virkning. Dette proteaseinhibitionsmønster er karakteristisk for behandlingsenzymer, se Lazure, C. et al (1983) Can.J.Biochem. Cell Biol. 61, 501-515, og i overensstemmelse med disse opdagelser findes et anerkendt behandlingsbindingssted (Arg-Arg) foran Ser 167 i A underenheden, se fig. 5, som anvendes i denne reaktion.
Opdeling af inhibin efter frigivelse til serum resulterer i to molekyler, 31 kD formen af inhibin og A^ fragmentet (aminosyrer 1-166 af den store underenhed). Medens 31 kD formen vides at undertrykke syntesen og frigivelsen af FSH af hypofyseceller, er det også muligt, at et eller flere molekyler vender tilbage til kønskirtlerne og regulerer kønskir-telfunktionen direkte, eller at inhibin i sig selv, fragmenter af inhibin eller dets forstadiemolekyler, såsom A„, har
N
andre biologiske funktioner end hypofyseregulering af FSH.
En indikation herpå er tilvejebragt af det faktum, at immuniseringen af kanin 699 med peptid 1 tilvejebragte et dramatisk fald til nul i FSH titrering, se eksempel 15.
Begge underenheder af inhibin er formet som præ pro molekyler, og propeptiderne fra hver underenhed har egne biologiske aktiviteter, hvilket igen omfatter cellevækst og regulering. 31 kD formen af inhibin i sig selv har betydelig homo-logi med transformationsvækstf aktor^3, se Derynck, R et al (1985) Nature 316, 701-705, og foreslår en rolle for det oprindelige molekyle i celleregulering ud over dets kendte effekter på FSH syntese af hypofysece l ler.
39 DK 173446 B1
Eksempel 10
EKSPRESSION AF INHIBIN cDNA
a. 43 kD og 20 kD underenheder. Selvom klon BTA405, se tabel 2, indeholder cDNA, der ioder for en del af den store underenhed af inhibin, forventes den ikke at udgøre nogen del af inhibinet, fordi cDNA er dC afsluttet, se eksempel 3a, og der er intet ribosom-bindingssted eller initierende ATG <f-Met) codon i sekvensen. For at opnå ekspression af en del af inhibingenet fremstilledes et fusionspeptid ved kloning af det største <ca. 480 bp) Pst I fragment af cDNA i pBTA23 til Pst I bindingsstedet på pUR292. I den korrekte orientering frembringer dette et protein, der består af det meste af E. coli proteinet ^5-galactosidase efterfulgt af aminosyrerne 27 til 183 af 43 kD underenheden af inhibin. Plasmidkonstruktionerne transformeredes til E. coli BTA647, se tabel 2.
For at identificere sådanne kloner anvendtes en immunologisk sorteringsmetode. Efter transformation udbredtes cellerne på LB agar indeholdende SO^g/ml natriumampici llin i 16 timer ved 37°C for at udvælge transformanter. Kolonierne kbpieredes på nitrocelLulosemembraner fra Schleicher og Schuell og orienteringsmærker påførtes ved gennemstikning af membranerne ned i agaren med en nål dyppet i tusch. Masterpladerne oplagredes ved 4°C indtil de skulle bruges, og kopifiltrene inkuberedes med forsiden opad på friske LB agarplader indeholdende 50 g/ml natriumampic i 11in i 3 timer. Fusionsproteinerne tilførtes på LB agar indeholdende 0,5 mM isopropyl B-D-thio-galactosid (IPTG) ved 37°C i 2 timer. Filtrene blev lagt på et ark Whatman 3MM papir mættet med 0,2 M Na0H/1 procent (w/v) SDS i 5 minutter og derpå neutraliseret på papir mættet med 0,5 M Tris-HCl pH 7,5. Proteiner frigjort fra kolonierne bindes til nitrocellulosen i situ. Alle proteinbindingsstederne, der blev tilbage på nitrocellulosen, blokeredes ved nedsænkning af filtrene under Let omrøring i TST (150 mM NaCl/0,05 procent (v/v) Tween 20 fra Sigma/10 mM Tris-HCl 40 DK 173446 B1 pH 8,0) indeholdende yderligere <0,5 procent (v/v)) Tween 20 i 1 time. Filtrene behandledes ved stuetemperatur natten over med en opløsning indeholdende kanin antibovin 58 kD inhibinantiserum, se international patentansøgning PCT/AU85/001 19, opløst i forholdet 1:50 i TST og derpå vasket adskillige gange i TST til fjernelse af overskydende antistof. Filtrene behandledes i 1 time ved stuetemperatur med en 1:200 opløsning i TST af svineantikaninimmunbglobulin-peberrodperoxidasekonjugat fra Cakopatts og vaskedes derpå i TST. Endelig vaskedes de i 20 mM Tris HCl pH 7,5 og farvedes med en opløsning indeholdende 0,5 mg/ml 4-chloronaph-thol/0,03 procent <v/v) HgOg^O mM Tris-HCl pH 7,5.
Kolonier i ndehoIdende fusionspeptidet identificeredes fra områder på filtrene, som var mere intenst farvede end områder, på hvilke kontrolstammen BTA647 (pUR292) var dyrket. Nogen baggrundsfarvning af andre kolonier var synlig til trods for forsøg på at reducere anti-E. coli anti stoftitre-ring af kam* nant i inhi bi nant i serum ved prsinkuber ing af det fortyndede antiserum med filtre, på hvilke der var dyrket og lyseret et område af t*i Iført E. coli BTA647 (pUR292) .
Tre sådanne kolonier rensedes, og deres plasmidindhold analyseredes. Alle indeholdt pUR292 med det ventede cDNA fragment i korrekt orientering, og en af disse stammer betegnedes BTA410 og dens plasmid pBTA28, se tabel 2. Identiteten af fusionspeptidet kontrolleredes ved Western plet-proceduren, se Towbin, H., et al (1979) Proc.Natl. Acad.Sci. USA 76, 4350-4354, hvori proteinerne denatureres med natrium-dodecylsulfat og deles op efter størrelse ved polyacrylamid-gelelektrophorese og overføres derefter sideværts til et ark med nitrocellulose. Nitrocellulosen behandledes derefter som beskrevet ovenfor til bestemmelse af, hvilket protein-bånd, der indeholder inhi binanti geni ske determinanter. Proteinprøverne frembragtes som følger: 41 DK 173446 B1
Kulturer af BTA647 (pUR292) og BTA410 dyrket natten over ved 37°C i LB opløstes i forholdet 1:100 i et frisk medium og inkuberedes indtil en uklarhed pS A^gg 0,4 opnåedes og gjordes derefter 0,5 mM i IPTG og inkuberedes i yderligere 2 timer før høst. Ce 11 epellet1 erne resuspenderedes direkte i 0,1 volumendele ladningsbuffer Celektrophoresebuffer indeholdende 30 procent (w/v) sucrose/1 procent (w/v) SDS/0,1 M B-mercaptoethanol/0,01 procent bromophenolblåt) og opvarmedes i et kogende vandbad i 5 minutter. Prøver på 10-30 yuX tilførtes polyacrylamidgeler, se Laemmli, U.K. <1970) Nature, 227, 680-685, Mattick, J.S. et al, C1980) Eur. J. Biochem. 114, 643-651, og elektrophoresen gennemførtes, indtil den bromo-phenolblå farve nåede gelens bund. Den sideværts overførsel udførtes under anvendelse af et Hoeffer Transblot apparat ved 1 ampere i 1 time i 15,6 mM Tris base/120 mM glycin. Blokering og behandling af filtrene med antisera var som beskrevet ovenfor. Til direkte visualisering af proteinerne i polyacrylamidgelerne neddyppedes gelerne i en affarvningsopløsning på 10 procent v/v methanol/5 procent v/v iskold eddikesyre i 30 minutter og farvedes med 0,5 procent w/v Coomassie Brilliant Blue R250 frambragt i den samme opløsning i 1 time. Gelerne affarvedes ved let omrøring i adskillige affarvningsop løsningssk ift, og proteinbåndene sammenlignedes med de, der blev fundet ved Western plet og im-munodetektering. Stammen BTA410 viste sig at indeholde i det mindste to proteiner, som sammen kan repræsentere hen imod 5-10 procent af det totale celleprotein, som tilføres ved IPTG og detekteres af antiinhibinantiserum, se fig. 13, spalte 10, og som ikke forefindes i stammen BTA647 <pUR292), se fig. 13, spalte 11. De er større, ca. 130 og 117 kD, end oprindelig ^»-galactosidase, 116 kD, og repræsenterer derfor galactosidaseinhibinfusionsproteiner. De største af fusions-proteinerne er kompatible med det, der ansloges ud fra DNA-analysen, ca. 132 kD.
Under anvendelse af en Lignende fremgangsmåde ekspresseredes 42 DK 173446 B1 410 bp Pst I fragmentet af pBTA30 i pUR291. Det resulterende plasmid betegnes pBTA292, se tabel 2, og igen kunne fusions-proteinet detekteres under anvendelse af antiinhibinantiserum, se fig. 13, spalte 9.
For at opnå ekspression af hele underenheden splejsedes cDNA fra pBTA290 og pBTA30, og den anvendte strategi er vist i fig. 10. I korthed involverede denne rensning af Sau 3A I fragmenter fra hver af klonerne, spaltning af dem på det unikke Rsa I bindingssted og nedrykning. Blandingen af ligationsprodukter spaltedes med Sau 3A I og produkterne ligeredes til pUR290. Klonerne frasorteredes derefter med prøverne 3 og 4/ se fig. 3, for at identificere kloner, der indeholdt både 5'-Sau 3A I-Rsa I fragment af pBTA290 og 3'-Rsa I-Sau 3A I fragment af pBTA30. Produktionen af et -ga lactosi-daseinhibinfusionsprotein sikres, når inserten er i den'korrekte orientering, fordi pUR290 giver den korrekte udlæsningsramme fra Asp -10 til Ile 300. Korrekt ekspression af 480 og 410 bp Pst I sektionerné kan kontrolleres uafhængigt ved hjælp af de specifikke antistoffer isoleret fra søjler indeholdende fusionsprodukterne af pBTA28 og pBTA292, se eksempel 9. Det resulterende plasmid er blevet benævnt ΡΒΤΑ296, se tabel 2. Dette komplette A under enhedsgen er altså klonet til Barn HI bindingsstedet af pUC7 som et Sau 3A I- Sau 3A I fragment og det reulterende plasmid pBTA302, se fig. 12, er overført til BTA652 til frembringelse af BTA426 (ATCC67Q57). Sekvensen Asp-Pro ved Sau 3A 1 bindingsstedet kan anvendes til at spalte inhibindelen af fusionsproteinet fra proteinet opstrøms, fordi denne sekvens er labil i myresyre, se Nilsson, B. et al, (1985), Nucl.Ac.Res.
13, 1151-1162.
Ekspressionen af en fuld længde 43 kD underenhed smeltet sammen med ^-galactosidase, aminosyrerne Asp -10 til Ile 300 fra stammen BTA419 er vist i fig. 13, spalte 8. Ud over φ-galactos idaseinhi binproteinet af fuld længde er der mindst 43 DK 173446 B1 tre andre bånd af mindre størrelse ned til en molekylvagt på ca. den samme som den oprindelige ~gala ctos i dase, der måske repræsenterer proteolytisk degradation af produktet af fuld længde eller præmatur termination af transkription eller translation. Størstedelen af fusionsproteinet er opløseligt. Inhibin DNA og flankerende (i-galactosidase ONA fjernedes fra pBTA296 som et Eco RI restriktionsfragment og indsattes i pBTA286, se tabel 2, fig. 13, spalte 4, til dannelse af pBTA297, se tabel 2, kloner, der ekspresserede inhibin DNA ved C-terminus af det af kortede β-galactosidase-protein fra pBTA286 udvalgtes ved koloniimmunohybridisering som beskrevet ovenfor. Undersøtelse af sådanne kloner under fasekontrastmi kroskopi, f.eks. BTA420, se tabel 2, afslørede, at de producerede fusionsproteiner som et uopløseligt produkt benævnt et inklusionslegeme, som yder nogen beskyttelse mod proteolytisk degradation i cellen og i høj grad forenkler rensningen til antigendannelse, se eksempel 12 og 13. Stammen BTA420 er benævnt ATCC67054 og proteinet fra rensede inklusionslegemer af BTA420 er vist i fig. 13, spalte 3. Ekspresssionen af A underenheden i BTA426 er vist i fig. 13, spalte 14 og igen er dette protein fortrinsvis dannet som et inklusi ons legeme. I modsætning til fusionsproteinet i BTA420 er det Længste fusionsprotein i BTA426 også det mest rigelige og det mest reaktive i Western plet analyse, hvilket indicerer, at det er en god værtsvektorkombination til produktion af inhibinlignende protein.
Det vil fremgå af det foregående, at andre restriktions-enzymbipdingssteder kan anvendes i ekspressionen af A underenheden. Først og fremmest er det unikke Sph I bindingssted som spænder codon for His 1 og oligonucleotidbindere kan udformes til tilladelse af ekspression af A underenheden eller Atø fragmentet i flere forskellige værter og vektorer, enten som fusionsprodukter eller som et fusionsuafhængigt protein, hvor et nyt f-Met codon introduceres.umiddeIbart før CA6, der indkoder His 1 eller hvor et signalpeptid er 44 DK 173446 B1 tilvejebragt forud for His 1. Sådanne konstruktioner er velkendte for fagfolk, og et eksempel herpå er givet i fig. 11.
Denne ekspresssionsbinder er udformet med henblik på at yde ekspression af 43 kD proteinet via et nyt N-terminalt methionin efter indsættelse i et trp promoter plasmid, såsom ptrpLI, se Edman, J.C. et al. (1981) Nature 291, 503-506, under anvendelse af Cla I bindingsstedet og som et {3-galactosidaseinhibinfusionsprotein efter indsættelse i pUC7, pUC13 eller pl)R290 under anvendelse af Bam HI bindingsstedet og som et trp E-inhibinfusionsprotein efter indsætning i pWH21, se Tacon W. et al (1980) Molec.Gen.
Genet. 177, 427-438.
Den metode, er anvendes til rekonstruktion af et fuld længde præ pro A underenheds forstadium er angivet i fig. 12. Grundlæggende omfatter det isolering af Pvu II-Pvu II fragmentet fra pBTA295 og tilsættelse af en binder, der er ikke phospha-taseret, vist i fig. 11 A i i som rekonstruerer de første fire aminosyrer af signalpeptidet (Met -60 til Gin -57), 5' til det første Pvu II bindingssted og tilvejebringer et Bam HI bindingssted ved 5' enden. Det bundne molekyle overskæres med Sph I og ligeres ind i pBTA297, overskæres med Bam HI og Sph I, hvilket giver pBTA305. Denne mellemoperation ekspresserer præ pro A underenhed som et fusionsprotein. Inhibin DNA sekvenserne kan fjernes som et Hind III-Hind III fragment eller som et Eco RI - Eco RI fragment til efterfølgende manipulering. Navnlig kan dette Eco RI - Eco RI fragment underklones til pUC8 eller pUC9. Inhibin cDNA sekvenserne fjernes som et Bam Hi - Bam HI fragment og genklones i vektoren pZIP Neo SVCX51. Se Cepko, C.L. et al (1984) Cell 37, 1053-1062.
Dette ekspressionssystemrtil brug i eukaryotiske celler og forventes at yde sekreterede og glycosylerede former for 43 kD proteinet i modsætning til det tidligere beskrevene prokaryot i ske system.
45 DK 173446 B1 Således tilvejebringer 5' Pvu II, Sai 3A I og Sph I bindingsstederne alle passende bindingssteder til ekspression af 43 kD proteinet. Hai II bindingsstedet, der starter ved base 734, tilvejebringer et egnet punkt til ekspression af A^ delen af A underenheden, der begynder med arginin 165.
Det er blevet ekspresseret som ^-ga lactosidasefusi onsprodukter i pUR290, pBTA286 og pUCl3 ved hjælp af Hae II bindingsstedsbinderne beskrevet i fig. 11A iii. Til opnåelse heraf rensedes den krævede Hae II-Sau 3A I fragment fra pBTA30 og bindere tilsattes. De resulterende konstruktioner blev udskåret med Sau 3A I og derefter præcipiterede DNA to gange med isopropanol, som er effektivt tilat præcipitere store DNA fragmenter, men som præcipiterer små DNA fragmenter, såsom bindere, ueffektivt. Det præcipiterede DNA genopløstes i TE og ligeredes til pUR290. Plasmiderne transformeredes til BTA634. De resulterende kloner kopieredes på duplikatfiltre og derefter frasorteredes et filter af hvert par som beskrevet i eksempel 4 med E^pjmærket Hae II binder, den øverste række af DNA parret vist i fig. 11A iii og den anden med prøve 4, se fig. 3. Kloner, som detekteredes ved begge prøver, udvalgtes og blev testet for ekspression ved Western plet analyse. Kun en klone er vist i fig. 13, spalte 7, og er betegnet 3TA421, se tabel 2. DNA fragmentet der indkoder inhibin Ac underenheden og dens flankerende ^-galactosidase DNA sekvenser er også fjernet som et Eco RI fragment og ligeret til pBTA286 for ekspression som et fusionsprotein, som igen er uopløseligt og yder således fordele i form af rensning og beskyttelse mod degradation. Denne stamme er betegnet BTA422 (ATCC67059, se tabel 2, fig. 13, spalte 2.
Det nye Barn HI-Sau 3A I fragment, der indkoder Ac underenheden, er også udskåret fra pBTA 298 og underklonet til pUC13 for at frembringe et kort fusionsprotein. Stammen BTA427, ATCC67056, tabel 2, producerer dette protein som et inklusionslegeme og gelanalyse viser, se fig. 13, spalte 15, at 46 DK 173446 B1 igen, som det er tilfældet med BTA426, er det længeste fusionsprotein også det mest rigelige og det mest synlige ved Western plet analysen, hvilket indicerer, at BTA427 er en god værtsvektorkombination til produktion af inhibin-lignende protein.
En detalje, der bør bemærkes ved hver af binderne vist i fig. 11 er, at når DNA er korrekt ekspresseret fra Bam HI-bindingsstedet, optages aminosyresekvensen Asp.Pro i fusionsproteinet. Som nævnte ovenfor er denne sekvens labil i myresyre Og kan anvendes til at fraspalte inhibinproteinet fra proteinet opstrøms, se Nilsson, B. et al, (1985) Nucl.Ac.
Res. 13; 1151-1162, hvorunder er ikke er nogen Asp-Pro sekvens i A underenhedsproteinet. Det er ogs§ muligt at optage andre 'spaltningsmidler i en given sekvens fra fusionsproteinet. Eksempler inlkuderer optagelsen af protease-recognitionssekvenser, f.eks. faktor X recognitionssekven-
O
ser, se Nagai, K. og Thogerson, H.C. (1984) Nature 309, 810-812, eller collagenoaserecognitionssekvenser, se Sermino, J og Bastia, D. (1984) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81, 4692-4696, og muligheden af at anvende enzymer, som genkender parrede argini nrester, er nylig blevet diskuteret i eksempel 9.
Ved optagelse af et methionin før inhibinsekvensen ovenfor er det muligt at fraspalte fusionsproduktet med cyanogen-bromid til opnåelse af inhi binfragmenter, der er frie for (3-galactosidase. Met hi oninrester inde i inhibinsekvensen kan konverteres til alternative aminosyrer ved in vitro mutage-nese af cDNA og således forøge anvendelse af cyanogenbromid-spaltningsteknikken, fordi et inhibinlignende protein af fuld længde vil være frigjort fra f usionsproteinfors'tadiet. Konvertering af de interne methi on inrester kan også resultere i. et molekyle med mere ønskelige antigenegenskaber eller inhibinlignende agonist* eller antagonistegenskaber.
b. Ekspression af 15 kD underenheden. 510 bp Pst I cDNA fragmentet af pBTA293, se fig. 4, li geredes i Pst I bindingsstedet af pUR291 og derpå transformeredes plasmiderne 47 DK 173446 B1 i E. coli BTA634. De resulterende kloner frasorteredes for tilstedeværelse af rekombinant plasmider under anvendelse af de 24 gange degenererede 14 mer oligonucleotider, som indledningsvis var anvendt til at isolere pBTA293 og PBTA294 , prøve 2, fig. 3. Adskillige rekombinant plasmider kortlagdes derefter under anvende.se af restri<tionsen2ymet Hind II, og to plasmider, soa indeholdt inserten i den korrekte orientering, analyseredes for ekspression på polyacryl-amidgeler. En sådan stamme er blévet benævnt ΘΤΑ423, se tabel 2.
510 bp Pst I cDNA fragmentet af pBTA293 klonedes direkte i Pst I bindingsstedet af pBTA286 og transformeredes til bTA634 til ekspression som et fusionsprodukt. pBTA286 var afledt af pUR291, så udlæsningsrammen tværs over Pst I bindingsstedet tillader denne direkte kloning. Den resulterende stamme er betegnet BTA424 (ATCC67058, se tabel 2) og producerer fusionsproduktet som et inklusions legeme.
510 bp Pst I cDNA fragmentet af pBTA293 klonedes også i Pst I bindingsstedet af pUC8 og transformeredes til pBTA 637 for ekspression som et uopløseligt kort fusionsprotein, der frembragte stammen BTA1360 CATCC67055, se tabel 2).
Ingen af fusionsproteinerne fra BTA423 eller BTA424 eller BTA1360 detekteredes ved kaninantiinhibinanti se rum, se fig.
13, spalte 1, 6 og 16, selvom hver af A og A. underenheds- v fusionerne blev. Dette indicerer, at niveauet af antistoffer til 15 kD proteinet er ekstremt lav eller nul, og det synes derfor sandsynligt, at de biologiske effekter, der associeres med immunisering mod inhibin, kan opnås under anvendelse af A eller A^ underenheder alene, se også eksemplerne 17-20.
Ekspression af 15 kD sekvensen kan også opnås ved isolering af Hae II fragmentet, som spænder over hele 15 kD sekvensen plus argininer -5 til -1 og ved tilsætning af Hae II bindings- 48 DK 173446 B1 stedsbindere beskrevet i fig. 11A iii. Den resulterende fusion koder som vist i fig. 11B i,og som beskrevet ovenfor er den anvendelig til ekspression af en^-galactosidasefusion i Pur290/pUC7/pUC13 under anvendelse af Barn HI bindingsstedet med potentialet for myresyrespaLtning af fusionen ved Asp-Pro sekvensen. Endvidere er Cla I bindingsstedet anvendeligt til ekspression i ptrpLl, se Edman, J.C. et al C1981c)> se ovenfor, hvor ATG fungerer som et nyt trans lat i one It initiationsbindingssted.
En tredie mulighed for ekspression er at anvende det unikke Hind II bindingssted og at syntetisere DNA sekvensen og indkode aminosyrerne 1-8 med de ønskede bindere og Met -1 sekvensen som vist i fig. 11B iii.
Således er Pst I, Hae II og Hind II bindingsstederne alle egnede bindingssteder for tilsætning af ekspressionsbindere.
Det er også muligt at anvende Hae III bindingsstedet (GGCC), der spænder over aminosyrerne 1 og 2 efter en delvis Hae III opløsning af 510 bp Pst I fragmentet. Igen er variationer i ekspressionssystemet velkendt for fagfolk, og de muligheder, der er beskrevet for A og A^ underenhederne ovenfor, gælder også for B underenheden.
Det er også klart, at dele af underenhedsforstadierne kan ekspresseres uafhængigt af inhibin Ac og B underenhedssek-venserne med henblik på studium af deres funktion. F.eks. kan fragmentet DNA isoleres som et Sph I-Hae II (delvist) fragment og ekspresseres i pUC7 eller pUC13 under anvendelse af bindere vist i fig. 11A i og 11A iii for at konvertere begge ender til Barn HI bindingssteder.
Endvidere er det klart, at ekspression af i nhi bi nproteiner eller inhibinlignende proteiner eller peptider ikke behøver at begrænses til de ovenfor angivne eksempler. Der er mange forskellige ekspressionssystemer, der er anvendelige i pro- 49 DK 173446 B1 karyotiske og eukaryotiske celler, som er velkendte for fagfolk, hvilke systemer er egnede til ekspression af de her givne sekvenser.
Eftersom aminosyresekvenserne af bovin og human B underenheder er identiske, er det klart, at idet produktet har ekspresseret cDNA, der indkoder bovin B underenheden, er det identisk med det, som kunne opnås ved en Lignende ekspression af den humane DNA sekvens. Således kan også stammerne BTA423, BTA424 og BTA1360 antages at producere B underenheden af human inhibin.
INDUSTRIEL BRUG Anvendelser af inhibin
Inhibin eller dele deraf fremstillet ved hjalp af den foreliggende opfindelse kan anvendes enten som antigener eller som bioaktive forbindelser; de effekter, der skyldes den ene brugsmetode, forventes at vare modsat de, der er fremstillet ved den anden brugsmetode.
50 DK 173446 B1 I en form kan inhibin eller dele deraf produceret ifølge den foreliggende opfindelse og/eller modificeret bagefter anvendes som et antigen og således anvendes til fremkaldelse af frugtbarhed. Forøgelse af ovulationshyppigheden hos hvirveldyr incl. mennesker kan forbedre forplantningen og således forøge frugtbarheden eller forbedre den reproduktive effektivitet. Produkter ifølge opfindelsen kan anvendes til forøgelse af ovulationshyppigheden og kan således finde anvende Ise i in vitro frugtbarhedsprogrammer, såsom for husdyr eller for mennesker. Det kan også anvendes i vilde dyr, f.eks. til lettelse af opdrætsprogrammer i zoologiske haver. Endvidere kan produkterne ifølge denne opfindelse anvendes til fremskyndelse af seksuel modenhed eller pubertet til forøgelse af den reproduktive levetid og/ eller til fremskyndelse af brunst hos produktionsdyr for at mindske perioden mellem fødsel og parring og/eller for at reducere sæsonbetonet eller post partum anaøstral periode.
Hos hanner kan produkterne ifølge opfindelsen anvendes til at stimulere spermatogenesen.
Produktionen af tamdyr, såsom køer, får, svin, geder, hjorte, heste, fisk og høns kan således nyde godt af disse anvendelser af inhibin.
Inhibin som et aktivt middel kan anvendes som et middel til at kontrollere ovulation hos hunner eller undertrykke spermatogenesen i hanner og således anvendes som kontracep-tivt middel eller middel til at synkronisere ovulationen.
Dele af inhibin, f.eks. syntetiske peptider eller fragment, kan anvendes som antigener til undertrykkelse af FSH niveauer og således fungere som kontraceptive midler eller molekyler til undertrykkelse af brunst.
Eftersom produkterne ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes til at aktivere antistoffer og disse også udgør en del af den foreliggende opfindelse, kan antiinhibinantistof - 51 DK 173446 B1 fer anvendes som diagnostiske midler. F.eks. omfatter sådanne anvendelser midler til overvågning af status af den reproduktive cyklus hos hvirveldyr indbefattende mennesker. På denne måde kan tidspunktet for ovulationen og antallet af afgivne ag forudsiges og således tillade fastsættelse af terapeutiske procedurer til indgreb i den reproduktive cyklus. Antistofferne kan anvendes til bestemmelse af granulosacellefunktionen hos hunnen,som en markering af Sertolicellefunktionen i hanner og muligvis som en markering for genetisk selektion af gode avlsdyr.
Således kan rekombinant inhibinerne, der tidligere er beskrevet, og derivater eller homologer eller analoger deraf, finde mange anvendelser, hvilke omfatter: a) anvendelse som antigener eller inhibinantagonister for at regulere eller fjerne nogle eller alle de fysiologiske virkninger, der skyldes det originale inhibin eller dets forstadier in vivo, b) anvendelse som antigener for at producere monoclonale eller polyclonale antistoffer, c) anvendelse som forstadier for produktion af biologisk aktiv rekombinant inhibin in vivo eller in vitro, d) anvendelse som standarder i en i nhibinradioimmunoanalyse (RIA) og enzymbundne immunosorbent (ELISA) analyser eller analyser, der anvender andre detekteringssystemer, såsom kemilluminescens eller fluorescens, e) anvendelse i sortering af monoclonale og polyclonale antistofpræparater, f) anvendelse i rensning af antistoffer som genkender inhibin eller inhibinlignende aminosyresekvenser, se eksempel 9, g) anvendelse som inhibinagonister til muliggørelse af nogle eller alle de fysiologiske virkninger, der skyldes originalt inhibin eller dets forstadier in vivo. Bioaktivt rekombinant inhibin kan fremstilles ved koekspression af begge underenheder eller forstadier dertil i den samme celle eller ved korrekt refolding af individuelle underenheder 52 DK 173446 B1 eller forstadier/ analoger, homologer eller derivater deraf in vitro.
Inhibin cDNA sekvenserne finder forskellig anvendelse/ som f.eks. omfatter: 1) anvendelse som cDNA skabeloner for proteinsyntese i pro-karyotiske eller eukaryotiske celler/ · 2) anvendelse som DNA skabeloner for fremstilling af radio mærkede inhibin cONA prøver. Disse prøver kan anvendes til detektering og isolering af inhibin eller inhibi ni ignende sekvenser i det genomiske DNA af forskellige arter eller i mRNA af celler/ der fremstiller inhibin ellerinhibinlignende peptider/ se eksempel 7,
De har således et potentiale i henseende til diagnosticering af defekter i inhibinsyntesen og regulering hos mennesker og husdyr og til kloning og manipulering af i nhibingener/ 3) anvendelse som DNA skabeloner til fremstilling af radiomærkede RNA prøver til anvendelser som angivet under 2)/ og 4) anvendelse som DNA skabeloner til fremstilling af radio-market inhibin.
Claims (6)
1. En polynucleotidsekvens, som koder for inhibin, hvilken sekvens har den aminosyresekvens, som er illustreret i 5 fig. 5 og 6, eller derivater af inhibin med samme biologiske egenskaber.
2. En polynucleotidsekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er i det væsentlige i ren form. 10
3. Polynucleotidsekvens ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den koder for 43 kD underenheden af inhibin.
4. Polynucleotidsekvens ifølge krav 1 eller 2, kendeteg- 15 net ved, at den koder for 20 kD underenheden af inhibin.
5. Polynucleotidsekvens ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den koder for 15 kD underenheden af inhihin.
6. Polynucleotidsekvens ifølge krav 1 eller 2, kendeteg net ved, at den koder for -60 til 166 aminosyresekvensen ifølge fig. 5, -10, til 166 aminosyresekvensen ifølge fig. 5, eller biologiske ækvivalenter dertil.
Applications Claiming Priority (12)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AUPH019485 | 1985-04-18 | ||
AUPH019485 | 1985-04-18 | ||
AUPH232085 | 1985-09-06 | ||
AUPH232085 | 1985-09-06 | ||
AUPH315785 | 1985-10-29 | ||
AUPH315785 | 1985-10-29 | ||
AUPH396085 | 1985-12-19 | ||
AUPH396085 | 1985-12-19 | ||
AUPH396185 | 1985-12-20 | ||
AUPH396185 | 1985-12-20 | ||
AU8600097 | 1986-04-14 | ||
PCT/AU1986/000097 WO1986006076A1 (en) | 1985-04-18 | 1986-04-14 | Recombinant inhibin |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK611386D0 DK611386D0 (da) | 1986-12-18 |
DK611386A DK611386A (da) | 1987-02-18 |
DK173446B1 true DK173446B1 (da) | 2000-11-06 |
Family
ID=27507359
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK198606113A DK173446B1 (da) | 1985-04-18 | 1986-12-18 | Polynucleotidsekvens, som koder for inhibin |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6613891B1 (da) |
EP (1) | EP0218717B1 (da) |
JP (1) | JP3213470B2 (da) |
KR (1) | KR940004077B1 (da) |
CA (1) | CA1341619C (da) |
DE (1) | DE3650689T2 (da) |
DK (1) | DK173446B1 (da) |
IL (1) | IL78519A (da) |
IN (1) | IN165453B (da) |
NZ (1) | NZ215829A (da) |
WO (1) | WO1986006076A1 (da) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1341617C (en) * | 1984-06-08 | 2011-06-28 | Henry George Burger | Inhibin isolated from ovarian follicular fluid |
JPH0637520B2 (ja) * | 1985-07-03 | 1994-05-18 | 味の素株式会社 | ポリペプチド |
US5215893A (en) * | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US5089396A (en) * | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
NZ217727A (en) * | 1985-10-03 | 1990-05-28 | Genentech Inc | Nucleic acid encoding alpha or b chain of inhibin, its production and compositions containing it |
JPS63503086A (ja) * | 1986-03-13 | 1988-11-10 | バイオテクノロジ− オ−ストラリア プロプライエタリ− リミテッド | インヒビンの分析法 |
EP0272309A4 (en) * | 1986-06-24 | 1989-12-19 | Salk Inst For Biological Studi | POULTRY INHIBINE. |
WO1989011862A1 (en) * | 1988-05-31 | 1989-12-14 | Biotechnology Australia Pty. Ltd. | Actions of hormones |
US5071834A (en) * | 1988-09-16 | 1991-12-10 | Genentech, Inc. | Purified activin B composition |
US5942220A (en) * | 1990-03-16 | 1999-08-24 | Chiron Corporation | Inhibitor of cytokine activity and applications thereof |
US6043212A (en) | 1993-07-26 | 2000-03-28 | Cor Therapeutics, Inc. | Recombinant C140 receptor, its agonists and antagonists, and nucleic acids encoding the receptor |
AUPO638897A0 (en) * | 1997-04-23 | 1997-05-22 | Monash University | Modulation of cell growth and methods relating thereto |
AU8579298A (en) * | 1997-07-31 | 1999-02-22 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Growth differentiation factor-16 |
EP1163365A4 (en) | 1999-02-25 | 2002-11-20 | Auckland Uniservices Ltd | DIAGNOSIS AND THERAPY OF EARLY OVARY FAILURE |
BR0208880A (pt) * | 2001-04-13 | 2004-12-07 | Thompson Boyce Plant Res | Métodos para produzir um homogeneizado seco estável de uma planta transgênica que expressa uma proteìna heteróloga, para prevenir uma doença patogênica em um animal, para liberar uma proteìna transgênica a um animal, de contracepção e para induzir uma resposta imune mucosal, homogeneizado seco estável, composição farmacêutica, planta transgênica, célula de planta, vetor plasmìdico para transformar uma célula de planta, composição de alimento, e, alimento |
CN102409065B (zh) * | 2011-06-28 | 2014-05-21 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种提高动物繁育力的新型shRNA及其应用 |
BR102014005376A2 (pt) * | 2014-03-07 | 2016-02-10 | Ouro Fino Saúde Animal Ltda | antígeno de inibina alfa, gene codificante de inibina alfa, gene codificante de proteína de fusão, processo de obtenção do antígeno de inibina alfa, composição antigênica, uso do antígeno de inibina alfa e uso da composição antigênica |
CN105296493B (zh) * | 2015-11-13 | 2020-09-11 | 北京农学院 | 一种牛抑制素α亚基成熟肽基因及重组表达蛋白质的方法 |
CN108588100B (zh) * | 2018-05-09 | 2021-07-16 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种抑制素b双基因片段联合表达载体及其应用 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US4717666A (en) | 1984-03-05 | 1988-01-05 | Smithkline Beckman Corporation | Cloned streptomycete lividans excretable β-galactosidase gene |
EP0147445B1 (en) | 1983-06-20 | 1987-11-19 | Battelle Development Corporation | High-velocity multisolid fluidized bed process |
US4643969A (en) | 1983-07-25 | 1987-02-17 | The Research Foundation Of State University Of New York | Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts |
DE3587022T2 (de) * | 1984-02-17 | 1993-06-17 | Genentech Inc | Menschlicher transformationswachstumsfaktor und vorlaeufer oder fragment hiervon, zellen, dna, vektoren und verfahren zu ihrer herstellung, zusammensetzungen und produkte, die diese enthalten, sowie davon abgeleitete antikoerper und diagnostizierverfahren. |
US4636463A (en) * | 1984-04-05 | 1987-01-13 | Scripps Clinic And Research Foundation | Antibodies to human interleukin-2 induced by synthetic polypeptides |
CA1341617C (en) | 1984-06-08 | 2011-06-28 | Henry George Burger | Inhibin isolated from ovarian follicular fluid |
JPH0730114B2 (ja) * | 1985-04-03 | 1995-04-05 | 正雄 五十嵐 | インヒビン |
US4624944A (en) | 1985-06-14 | 1986-11-25 | The Regents Of The University Of California | Human seminal alpha-inhibins |
US4740587A (en) | 1985-07-18 | 1988-04-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Inhibin and method of purifying same |
US4798885A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-17 | Genentech, Inc. | Compositions of hormonally active human and porcine inhibin containing an α chain and 62 chain |
NZ217727A (en) * | 1985-10-03 | 1990-05-28 | Genentech Inc | Nucleic acid encoding alpha or b chain of inhibin, its production and compositions containing it |
US4864019A (en) * | 1985-11-08 | 1989-09-05 | The Salk Institute For Biological Studies | Antibodies to inhibin and conjugates produced therefrom |
US4737578A (en) | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
US5011691A (en) | 1988-08-15 | 1991-04-30 | Stryker Corporation | Osteogenic devices |
-
1986
- 1986-04-14 KR KR1019860700911A patent/KR940004077B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-04-14 EP EP86903112A patent/EP0218717B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-14 DE DE3650689T patent/DE3650689T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-14 WO PCT/AU1986/000097 patent/WO1986006076A1/en active IP Right Grant
- 1986-04-15 NZ NZ215829A patent/NZ215829A/xx unknown
- 1986-04-16 CA CA506791A patent/CA1341619C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-04-16 IL IL78519A patent/IL78519A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-04-17 IN IN302/CAL/86A patent/IN165453B/en unknown
- 1986-12-18 DK DK198606113A patent/DK173446B1/da not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-02-28 JP JP05450094A patent/JP3213470B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/478,696 patent/US6613891B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0218717A1 (en) | 1987-04-22 |
IL78519A (en) | 1992-01-15 |
DK611386D0 (da) | 1986-12-18 |
US6613891B1 (en) | 2003-09-02 |
DE3650689D1 (de) | 1998-08-20 |
DK611386A (da) | 1987-02-18 |
JPH07188296A (ja) | 1995-07-25 |
KR870700633A (ko) | 1987-12-30 |
IL78519A0 (en) | 1986-08-31 |
KR940004077B1 (ko) | 1994-05-11 |
CA1341619C (en) | 2011-08-02 |
DE3650689T2 (de) | 1999-04-08 |
JP3213470B2 (ja) | 2001-10-02 |
IN165453B (da) | 1989-10-21 |
WO1986006076A1 (en) | 1986-10-23 |
EP0218717A4 (en) | 1990-04-10 |
EP0218717B1 (en) | 1998-07-15 |
NZ215829A (en) | 1991-11-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK173446B1 (da) | Polynucleotidsekvens, som koder for inhibin | |
Mayo et al. | Inhibin A-subunit cDNAs from porcine ovary and human placenta. | |
US20100203060A1 (en) | Inhibitors for growth hormone and related hormones, and methods of use thereof | |
JP2004073205A (ja) | 精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチド | |
JPS59156284A (ja) | ヒト−レラキシンh2遺伝子 | |
JP2525048B2 (ja) | 部位特異的変異形成で修飾された糖蛋白質ホルモンおよびその使用 | |
Garczynski et al. | Molecular characterization of a ribonucleic acid transcript that is highly up-regulated at the time of ovulation in the brook trout (Salvelinus fontinalis) ovary | |
Inoue et al. | Isolation of estrogen receptor-binding sites in human genomic DNA | |
Angerer et al. | Expression of a collagen gene in mesenchyme lineages of the Strongylocentrotus purpuratus embryo. | |
Evans et al. | Characterization of two relaxin genes in the chimpanzee | |
LEE et al. | Secretion of proliferin | |
JPH025871A (ja) | コクシジウム症ワクチンとして有用な組換え及び天然a、c、f及びh群アイメリア・テネラ免疫原 | |
JPH04505103A (ja) | 糖タンパク質ホルモン受容体分子 | |
JPH05501952A (ja) | Tsh受容体 | |
JPH04503960A (ja) | 高発現宿主細胞系からの生物活性血小板由来成長因子の産生 | |
DK173162B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinante polypeptider med svinevæksthormonaktivitet, rekombinant plasmidekspressionsv | |
JP2652534B2 (ja) | 組換えインヒビン | |
EP0222526A2 (en) | Self-incompatibility gene | |
EP1195382A2 (en) | Testis-specific gene | |
AU5903986A (en) | Recombinant inhibin | |
JP2770926B2 (ja) | 毛管内皮細胞プロテアーゼ合成、dna合成および遊走を促進することの出来るヒト胎盤血管形成誘導因子 | |
JPS58201797A (ja) | 豚レラキシンをコード化する遺伝子配列の分子クローニングおよび特性化 | |
JP2004525628A (ja) | 新規な天然の抗菌性ペプチド、該ペプチドをコードするヌクレオチド配列及びそれらの使用 | |
CN100384481C (zh) | 胚泡着床相关因子及其用途 | |
US5612220A (en) | Isolated DNA molecule encoding SPRM-1 protein |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ATS | Application withdrawn | ||
ATS | Application withdrawn | ||
AHB | Application shelved due to non-payment | ||
B1 | Patent granted (law 1993) | ||
PUP | Patent expired |