DK173446B1 - Polynucleotidsekvens, som koder for inhibin - Google Patents

Description

i DK 173446 B1 5 10 15 Den foreliggende opfindelse angår en polynucleotidse- kvens, som koder for inhibin.

I 1932 blev det opdaget, at kønskirtler producerer en nonsteroidal faktor, der blev benævnt inhibin, som er involveret i feed-back-reguleringen af hypofysefunktionen, se 20 McCullagh, D.R. (1932), Science 76, 19-20. Efter den tid har det vist sig, at hypofyseforlappen producerer mindst to gona-dotropiher, follikelstimulerende hormon eller follitropin (PSH) og luteiniserende hormon eller lutropin (LH), som tilsammen regulerer udviklingen og funktionen af kønskirtlerne.

25 Følsomme radioimmunoanalyser har muliggjort nøjagtig og uafhængig overvågning af hvert hormon og har vist feedbackregulering af disse hormoner ved hjælp af kønskirtlerne. Feedbackreguleringen af LH synes at være fremherskende via steroider, medens feedbackreguleringen af FSH ud over steroider .30 sker via protein eller glycoproteinfaktoren inhibin.

Inhibin kan nu defineres som et protein eller glycoprote-inhormon, der sekreteres fra granulosaceller i ovarierne eller Sertoli-celler i testiklerne. Det sekreteres som svar på FSH og virker på hypofysen som feedbackinhibitor af FSH- 35 syntesen og sekretion, men efterlader den grundlæggende syntese og sekretion af LH stort set intakt. Hvorvidt inhibin, dets triRNA eller forstadier dannes i andre celler eller væv, er endnu ikke kendt.

2 DK 173446 B1

Siden først i 1970'erne er der gjort et antal forsøg på at rense inhibin fra· flere forskellige kønkiktelki Ider, både fra testikler og ovarier, og med modstridende resultater, se de Jong, F.H. )1979) Mol. Cell. Endocrinol. 13, 1-10, hvilket delvist skyldes anvendelsen af flere forskellige bi oanalyse systemer, hvor enhver undertrykkelse af FSH i hypofysens celler in vitro eller in vivo antoges at skyldes inhibin, og der foretoges ikke altid kontrol for ikke-speci-fikke toxiske effekter p§'testsubstanserne, se Baker, H.W.G. et al. (19815 i Intragonadal Regulations of Reproduction (Franchimont, P. og Channing, C.P. Eds.), Academic Press, London pp 193-228; Baker H.W.G. et al., (1982) Ann. New York Acad. Sci. 383, 329-342).

Fornylig er inhibin fra oksefollikel væske (bFF) renset til homogenitet. Se international patentansøgning PCT/AU85/00119, Robertson, D.M. et al., (1985) Biochem. Biophys. Res.

Commun. 126, 220-226. Dette resultat understøttedes af brugen af en rigorøst dyrket rottehypofysece l leanalyse, se Scott, R.S. et al., (1980) Endocrinol. 107, 1536-1542, som indbefatter et middel til at vurdere de cytotoxiske effekter af substanserne under test, se Robertson, D.M. et al., (1982)

Mol.Cel l .Endocrinol. 26, 119-127, således at ikke specifikke toxiske effekter, som sænkede FSH-indholdet af cellerne under måling, kunne i dent i ficeres som værende distinkt fra i n-hibins virkninger. Den anvendte standard var et oksefol LikeL-væsk.epræpa rat med en inhibinaktivitet på 20 U/ml udtrykt i en tidligere beskrevet fåretestikel lymfestandard med en vilkårlig aktivitet på 1 U/mg, se Scott, R.S. et al., (1980) Endocrinol. 197, 1536-1542.

INhibinet fra bFF rensedes omtrent 3500 gange til en specifik aktivitet på 200.000 enheder pr. mg protein og er et protein af 58 kD sammensat af to disulphid-bundne underenheder A og B på ca. 43 kD henholdsvis 15 kD som det fremgår af elektrophorese i polyacrylamidgeler i nærvær af natriumdode-cylsulfat (SDS-PAGE). Aminosyresekvenserne for Nl^-terminus 3 DK 173446 B1 af hver underenhed er bestemt. Denne rensede substans har de tidligere definerede in vitro-fysiologiske egenskaber som hos inhibin, nemlig at de inhiberer syntesen og frigivelsen af endogen FSH fra rottehypofyseceller, idet de efterlader syntesen og frigivelsen af LH prolactin og thyro-id-stimulerende hormon intakt.

Eftersom FSH er vigtig for bestemmelsen af forekomsten og hasti gheden af ovulation i hunner og spermatogenese i hanner, følger det, at de vigtigste anvendelser af inhibin, analoger eller homologer af inhibin eller antistoffer mod inhibin vil vare at inhibere eller at stimulere kønskirtelfunktionen i mennesker og husdyr og som diagnostisk værktøj til analyse af kønskirtelfunktionen. Mange eksperimenter er udført in vivo under anvendelse af rå eller delvist fraktionerede kønskirtelekstrakter eller sekretioner i forsøg på at analysere inhibins fysiologiske effekter. Effekter, der blev tilskrevet inhibin eller antistof.fer mod inhibin i disse eksperimenter, omfatter: 1. inhibering af kønskirtelfunktionen, se Moudgal, N.R. et al., (1985) i Gonadal Proteins and Peptides and their biological significance (Sairam, M.R. and Atkinson, L.E., Eds.) World Scientific Publishing Co., Singapore, pp 21-37).

2. en stigning Ί ovulationshastighed, se O'Shea, T. et al., (1982) Pr oc . Aust. Soc . Rep . Bi ol. 1_4, 85; O'Shea, T. et al., (1983) Proc.Aust.Soc.Rep.Biol. 15, 22; Henderson, K.M. et al., (1984) J. Endocrinol. 102, 305-309.

3. en fremrykning af tidspunktet for pubertetens indtråden, se Al-0baidi, F.A.R. et al., (1983) Proc.Aust.Soc.Rep.

B i o l. 15, 80).

Den kommercielle udnyttelse af disse egenskaber og yderligere fysiologiske studier i levende dyr kraver store mængder af ren inhibin eller fragmenter heraf eller inhibinagonister eller antagonister, hvadenten disse er af naturlig eller syntetisk oprindelse. Sådanne mængder kan ikke udelukkende 4 DK 173446 B1 opnås ved de foreliggende metoder til rensning, eftersom kildematerialet kan vare begranset, f.eks. human follikelvaske og entypisk ekstraktion, der begynder med 50 ml bFF, giver kun 5-10renset materiale.

Den foreliggende opfindelses formål er bl.a. at eliminere disse begransninger ved identifikation og karakterisering af generne, som koder inhibin, for at tillade en molekylår kloning af gener eller dele af gener, der koder for inhibin i en vart, såsom Escherichia coli og ved manipulering af de klonede gener eller dele deraf til fremstilling af varter, såsom bakteriestammer, som kan syntetisere hele, en del af eller forstadier til inhibinmolekylet, indbefattende underenheder deraf.

Der angives ved opfindelsen en polynucleotidsekvens, som koder for inhibin, hvilken sekvens har den aminosyre-sekvens, som er illustreret i fig. 5 og 6, eller derivater af inhibin med samme biologiske egenskaber.

Fordelagtige udførelser er angivet i underkravene e 5 DK 173446 B1 I hete denne beskrivelse og kravene er brugen af vendingen inhibin ikke artsspecifik og omfatter følgeligt relaterede arter af inhibin, såsom okse-, menneske-, fåre-, svine-, høhse- og fiske- og især menneske- og okseinhibin. Vendingen omfatter også ikke-glycosylerede og glycosylerede inhibin-a rter.

Vendingen hvirveldyr omfatter arter af fisk, amfibier, reptiler, fugle og pattedyr indbefattende mennesker.

Underenhedsstruktur af inhibin

Som antydet i hele denne beskrivelse er det inhibin, der udskilles’i follikelvæske, et 58 kD-protein omfattende to underenheder; en 43 kD og en 15 kD underenhed henholdsvis A og B. A- eller 43 kD-arten er et homolog protein mellem arter med visse forskelle, således at det sandsynligvis vil opføre sig som et antigen, når en inhibinart blev indgivet en anden art. På denne måde er det fundet, at forskellige arter af inhibiner kan anvendes til frembringelse af anti-inhi binanti stoffer med de herefter beskrevne anvendelser.

I sammenligning er B underenheden eller 15 kD underenheden faktisk identisk i aminosyresekvens blandt et antal arter, såsom humane og bovine arter.

Under visse omstændigheder kløves hele proteinet til en 31 kD-form omfattende to underenheder af molekylvægten 20 kD og 15 kD,henholdsvis Ac og B. 31 kD-formen udviser inhibin-aktivitet og udgør en del af den foreliggende opfindelse. Deling af 58 kD-formen til 31 kD-formen frigiver et poly-peptidfragment, der betegnes som A^-fragmentet, som i sig selv kunne spille en væsentlig rolle i regulering af kønski rteLfunktionen, og som således også udgør en del af den foreliggende opfindelse.

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere beskrevet i for- 6 DK 173446 B1 bindelse med nogle eksempler og under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser fremgangsmåden til syntese af rekombinant plas-mider indeholdende oksegranulosacelle cDNA, fig. 2 tyndtlagschromatografi på polyethylenimincellulose af produkterne af cDNA syntese fra messenger RNA af bovine granulosace 11 er, fig. 3 sekvenserne af 43 kD (A) underenheden og 15 kD (B) underenhedsundersøgelser, fig. 4 et restriktionsenzym (Pst I) kortægnings- og sekven-teringsstrategi af syv inhibin cDNA'er, fig. 5 nucleotidsekvensen af bovin inhibin A underenheds cDNA samt dens forudsagte aminosyresekvens. Udvalgte restriktionsenzymbindinger er vist over DNA-sekvensen, fig. 6 nucleotidsekvensen af bovin inhibin B underenhed cDNA samt dets forudsagte aminosyresekvens. Udvalgte restriktionsenzymbindinger er vist over DNA-sekvensen, ( f i 9. 7 udgAET) (fig. 8 UDGÅET) fig. 9 strukturen af 58 kD inhibin (I) og 31 kD inhibin (II) sammenlignet med molekylvægtstandarder (S; størrelser vist i kD) på SDS-PAGE geler (A) og konvertering af 58 kD naturligt bovin inhibin til 31 kD-formen efter inkubering natten over i studeserum (SS) og human post-menopausaIt serum (PMS) som bestemt ved radioaktivitetsmålinger i vævsskiver af ikke-reduce-ret SDS-PAGE geler (B), fig. 10 fremgangsmåde til opnåelse af en fuld længde A under-enhed cDNA, fig. 11 koblingselementer anvendt til opnåelse at ekspression af A og B underenheds cDNA, fig. 12 viser kortlægning af plasmiderne pBTA302, pBTA303 og pBTA304, f DK 173446 B1 i 7 fig. 13 ekspressionen af inhibinunderenhedsfusionsproteiner og -gaLactosidase i E. c o L i stammer, OG fig. 14 fremgangsmåde til konstruktion af fuld længde præ pro A underenhed cDNA, I teksten anvendes følgende forkortelser: ATP s adenosintriphosphat bFF s bov i nfo11ikeIvæske bp = basepar

cDNA s complementært DNA

CG s korionisk gonidotropin

Ci = C u r i e D - Dalton dATP s 21deoxyadenosintriphosphat dCTP s 21-deoxycyti dintriphosphat dGTP s 2'-deoxyguanosintriphosphat DNA = deoxyribonucleinsyre DTT = dithi ot re i tol dTTP = 2'-deoxythymidintriphosphat EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre ELISA = enzymbundet immunosorbentanalyse FSH s follitropin eller foilikelstimulerende hormon X G = gange tyngdekraften g = gram HPLC = højydelses flydende chromatografi k =* (præf i x) kilo I = liter M s molær koncentration m = (præf i x) mi 11 i - mol = mol

mRNA = messenger RNA

P = (prefix) pico- n = (prefix) nano- 8 DK 173446 B1 PAGE - polyacrylamidgelelektrophorese PCMB = parachloromercuribenzoesyre PMS = humant post-menopausalt serum PMSF 55 phenylmethylsulfonylfluorid PMSG = serumgonadotropin fra gravid hoppe RI A » radioimmunoana lyse RNA = ribonucleinsyre

RP-HPLC = reverseret fase HPLC

SDS = natriumdodecyLsupfat SS = studeserum

Tris = tri s(hydroxymethyl)aminomethan A = (præfix) mikro-

Endvidere er følgende vendinger defineret og anvendt synonymt i teksten uanset oprindelse eller glycosyleringsstatus: A underenhed = 43 kD underenhed = stor underenhed af 58 kO inhibin = aminosyrerne His 1 til Ile 300, se fig. 5 = aminosyrerne His 1 til Ile 306, se fig. 7.

Ας underenhed = 20 kD underenhed » stor underenhed af 31 kD inhibin - aminosyrer Ser 167 til Ile 300 (fig. 5) = aminosyrer Ser 172 til Ile 306, fig. 7.

Α^ fragment = NHg-termina Ide l af A underenhed = aminosyre HIS 1 til ARG 166, fig. 5 = aminosyrer His 1 til Arg 171, fig. 7.

B underenhed = 15 kD underenhed = lille underenhed af 58 kD og 31 kD inhibin = aminosyrer Gly 1 til Ser 116, fig. 6 og 8.

Ved anvendelsen af vendingen "med lignende immunologisk aktivitet" er det meningen at inkludere et protein, som er tilstrækkeligt homologt med inhibin eller dele deraf, således at (1) recipientens immunsystem reagerer på samme måde som på det naturlige protein, eller (2) indgift vil frembringe antistoffer til proteinet, som er i stand til at genkende endogent inhibin.

9 DK 173446 B1

Det skal ogs§ forstis, at vendingen ’’dele af inhibin" omfatter underenheder af inhibin.

Fremgangsmåderne og produkterne ifølge opfindelsen er beskrevet mere detaljeret nedenfor, og det skal forstås, at der er alternative metoder til rådighed for en fagmand, som falder inden for denne opfindelses brede rammer.

Eksempel 1 ISOLERING AF MESSENGER RNA(mRNA) FRA BOVINE 6RANUL0SACELLER Hele testikler og ovarier eller isolerede Sertoli og granu-losaceller kan anvendes som kilde for inhibin mRNA. I dette tilfælde anvendtes isolerede granulosaceller.

a. Indsamling af granulosaceller. Bovin follikelvæske (bFF) indehlldende granulosaceller indsamledes fra store follikler på overfladen af friske okseovarier på et lokalt slagteri ved hjælp af en nål og en sprøjte. Væsken oplagredes iskoldt fra umiddelbart efter indsamlingen og indtil ankomsten til laboratoriet. Cellerne fra 70-100 ml bFF centrifugeredes ved 500 x G i 5 minutter og supernatanten fjernedes til rensning af naturligt inhibin. RNA ekstraheredes fra cellerne som herefter beskrevet.

b. Ekstrahering og rensning af RNA. Umiddelbart efter høst lyseredes granulosacellerne ved tilsætning af 24 ml 4,2 M guanidinium i sot hiocyanat/120 mM mercaptoethanol/5 procent (v/v) sacrosyl/10 mM Tris-HCl pH 7,4, se Chirgwin, J.M. et al (1979) biochemistry 1_8; 5294-5299. Lysatet homogeniseredes i en Sorvall Omnimix på hastighed 4 i 30 sekunder og centrifugeredes derefter ved 20.000 x G i 15 minutter til fjernelse af celleaffald. Til supernatanten tilsattes 1 g CsCl pr. 2,5 ml. Denne blanding overlejredes på en 9 ml 5,7 M CsCl/10 mM EDTA / 50 mM Tris-HCl pH 7,8 stødpude og centrifugeredes ved 122.000 x G i 65 timer ved 15°C.

RNA-pellett en vaskedes adskillige gange i 5 ml 70 procent ethanol/30 procent TE (1mM EDTA/. 10 mM Tris-HCl pH 7,5) til fjernelse af CsCl. Den præcipi te redes endelig fra 3 ml 10 DK 173446 B1 TE ved tilsætning af 0,3 ml 3 M Na acetat pH 7,5 og 6 ml ethanol efterfulgt af frysning til -70°C og centrifugering ved 20.000 x G i 10 minutter. RNA pelletten genopløstes i 1 ml TE og holdtes ved -70°C til den behøvedes.

c. Isolation af mRNA. mRNA ekstraheredes fra det totale RNA ved chromatografi pi oli go dT cellulose, se Aviv. H. og Leder, P (1972) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 69; 1408-1412. RNA-opløsningen foretoges i 1M i NaCl/1 mM i IDTA/20 mM i Tris-HCL pH 7,5 opvarmet til 70°C i 2 minutter, afkøledes hurtigt i isvand og påførtes en søjle (0,5 g tør vegt) af oligo dT cellulose (BRL). Strømmen gennem fraktionerne opvarmedes, afkøledes og genpiførtes 2 gange. Søjlen vaskedes med 5 ml belastningsbuffer og derefter med 5 ml af samme buffer, men indeholdende 0,5 M NaCl. mRNA elueredes ved 60°C i TE. Fraktioner pi 0,25 ml indsamledes og deres mRNA indhold præcipiteredes under anvendelse af natriumacetat og ethanol, se ovenfor, og pellets tørredes in vacuo. mRNA genopløstes i 0,1 ml TE og al i q uotter pS 25 jtX. blev ned frosset ved -70°C.

Integriteten af RNA fraktionerne fra disse ekstraktioner og rensningstrin undersøgtes ved elekt rophorese af 1-2^icg prøver pi agaroseureageler, se Locker, J. (1979) Anal. Biochem. 98, 353-367). Specifikt indeholdt RNA-prøven i 10 jtX TE 5 PI urinstof og 0,01 procent (w/v), hvor hver af sporfarverne bromphenolblit og xylencyanol FF opvarmedes til 70°C i

2 minutter og udsattes derefter for elektrophorese i en gel pi 1,5 procent agaroseindehoIdende 5,6 M urinstof/14 mM

iodoacetat/1 mM EDTA/ 36 mM NaH2P04/40 mM Tris-NaOH pH 7,4. Elektrophoresen afsluttedes, når den bromophenolblå farve nåede bunden af gelen og RNA visualiseredes under ultraviolet lys efter farvning med en opløsning af et hidiumbromid.

Koncentrationen af RNA måltes ved sin absorption ved 260 nm, en A260 udlæsning af 1,0 under anvendelse af en 1 cm lys bane taget som 40y,g RNA pr. ml. Typisk giver 60-100 ml 11 DK 173446 B1 bFF 1-3 g vid vagt pelleterede granulosace l ler , fra hvilke 600-900ju,q totalt RNA og 20-60^itg mRNA kunne ekstraheres.

Denne mRNA fraktion indeholder mRNA, der er specifik for inhibin, dets underenheder eller inhibin-lignende poly-peptider, men det mi forstis, at mRNA fraktionen er en blanding af et stort antal forskellige mRNA arter i forskellige koncentrationer i blandingen, af hvilke de fleste er uønskede.

Under de naste trin af cDNA syntesen og fjernelsen opfører hver sig i lighed med mRNA arterne, der er specifikke for inhibin, dets underenheder eller inhibinlignende polypepti-der og deres tilstedeværelse vil til sidst resultere i dannelsen af et stort antal uønskede kloner og nødvendiggør en frasorteringsprocedure for at identificere korrekte kloner, d.v.s. kloner, der indeholder cDNA-sekvenser, der koder for en del af eller underenheder af eller hele inhibinet.

Strategien for dannelse af cDNA fra mRNA og dets indsættelse i vektoren pBR322 er vist i fig. 1 og er beskrevet mere detaljeret i eksemplerne 2 og 3, men kun som eksempel.

Eksempel 2

SYNTESE AFKOPI-DNA (cDNA) fra mRNA

a. Syntese af den første c&NA streng. En reaktionsblanding begrænset i dATP tilvejebragtes, og en lille del af det fjernedes for at overvåge omfanget af cDNA syntesen ved ind-32 sætning af P dATP. Overskydende dATP tilsattes derefter tilbage til hovedreaktionsblandingen for at tillade fuldstændig førstestrengssyntese. Specifikt fyldtes en prøve p9 2 mRNA-præparatet op til et rumfang pi 27yuX med vand og opvarmedes ved 70°C i 2 minutter og hurtig-afkøledes derefter i isvand. Reaktionen påbegyndtes ved tilsætning af 23,5 l blanding indeholdende 500 ng oligo dT^g^^ grundsubstans (Boehringer), 50 nmol af hver af dCTP, dTTP og .*· 12 DK 173446 B1 og dGTP, 5 nmol af dATP, 100 nmol DTT, 20 enheder AMV revers transcriptase (Life Sciences), 2 jt. mol KCl, 400 nmol MgC^ og 2,5^ttmol Tris-HCl pH 8,5.

Umiddelbart efter blandingen tilvejebragtes den analytiske reaktion ved at udtage en 2y/λ prøve i et separat rør, der indeholdt 0,5^Μ·1 Λ -^p dATP (1800 Ci/nmol; 5 j&Z i / l) og 0,5jjlX 60 mM dATP tilsattes tilbage til hovedreaktionen, som var henstillet ved 42°C i 60 minutter. Fra den analytiske reaktion fjernedes 0,5juX og blev hurtig-frosset i et ethanoltørisbad for at tjene som nultidskontrol. Resten af reaktionen anbragtes ved 42°C i 60 minutter, hvorefter yderligere 0,5ytU udtoges for analyse.

Hver af de radioaktive prøver underkastedes tyndtlagschroma-tografi på po lyethylen i mi η (PEI) cellulose (Merck) i 0,75 M KH^PO^ buffer pH 3,5. Resultaterne efter autoradiografi er vist i fig. 2. Ved hjælp af disse foranstaltninger fjernes ikke optagne nucleotider fra de nyligt syntetiserede førstestrenge (DNA-RNA hybrider), som forbliver tilbage i det oprindelige stof. De individuelle pletter blev skåret ud efterfulgt af aut orad i ografi, og den påførte radioaktivitet blev bestemt for at give et skøn over optagelsens effektivitet. En optagelse på 10 procent (skønnet maksimal optagelse 33 procent) af det totale antal eller mere antoges at være tilfredsstillende til fortsættelse med den anden binding af cDNA-syntesen. Resten af det radioaktive materiale præci piteredes to gange fra 2M ammoniumacetat/67 procent ethanol og underkastedes elektrophorese på agarose-urinstofgeler efter kogning i 2 minutter i en ladningsbuffer, se ovenfor, for at adskille RNA og DNA-strengene. Gelen underkastedes derefter autoradiografi på Fuji RX røntgenfilm. Denne fremgangsmåde giver et skøn over størrelsen af cDNA-produkter og gav typisk et område på fra over 1000 baser til mindre end 200 baser.

13 DK 173446 B1 Førstestrengssyntese kan opnås via andre fremgangsmåder, der er kendte af fagfolk. I dette eksempel anven-tes otigo dT som grundsubstans til opnåelse af førstestrengs cDNA syntese fra alle mRNA arter med poly(A)regioner. Tilfældige grundsubstanser kan også anvendes til opnåelse af cDNA syntese fra mRNA arter. Alternativt kan anvendes grundsubstanser med en sekvens, der er komplementær til en del af inhibin mRNA til opnåelse af specifik syntese af inhibin cDNA.

Oligo dT eller andre grundsubstanser, der har en sekvens, der er komplementær til en del af inhibin mRNA, kan anvendes som grundsubstanser for førstestrengssyntesen, b. Syntese af den anden streng. I en strategi i lighed med den for førstestrengs cDNA syntesen udledtes både større reaktioner og analytiske reaktioner fra en indledende reaktionsblanding, som var ufuldstændig i henseende til dATP.

Specifikt præcipiteredes cDNA-RNA hybridmolekylerne fra den første strengs hovedreaktion ved tilsætning af 50^£t,l 3 M ammoniumacetat pH 7,5 og 200y6U ethanol efterfulgt af nedkøling til -70°C og centrifugering i 5 minutter ved 15.000 x G. Pellet'en resuspenderedes i 50jjA. TE, repræcipiteredes derefter og tørredes og optoges endelig o 50yU*l TE.

Dertil tilsattes 350 l opløsning indeholdende 16 nmol af hver af dCTP, dTTP og dGTP, 1 nmol dATP, 3,5 enheder RNAase H (BRL) 92 enheder DNA polymerase I fra Boehringer, 40 g BSA, 6 nmol -NAD, 400 nmol (NH^JjSO^, 4 mol KCl, 200 nmol MgC^ og 800 nmol Tris-HCl pH 7,5 (Gubier, U. og Hoffman, B.J. (1983) Gene 25; 263-269.

Umiddelbart efter blanding tilvejebragtes den analytiske reaktion ved udtagning af en 2 l prøve i et separat rør indeholdende 0,5^1 o4-^P dATP (1800 Ci/nmol; 5^u.Ci/,x*l) og 2 ^u.1 10 mM dATP tilsattes tilbage til hovedreaktionen, som anbragtes ved 15°C i 60 minutter og derefter ved 22°C i 60 minutter. Fra de anaLytiske reaktioner udtoges 0,5 L

14 DK 173446 B1 prøver, som hurtigt blev nedfrosset i et ethanoltørisbad ved nul tid, 1 time og 2 timer og analyseredes ved tyndtlags-chromatografi som beskrevet i forbindelse med førstestrengssyntesen, fig. 2. En optagelse af mindst 5 procent (skønnet maksimum 8 procent) af det totale antal antoges som bevis for god andenstrengssyntese.

Andenstrengssyntese kan opnås via andre fremgangsmåder, der er kendte for fagfolk. Eksempler er angivet nedenfor.

I denne sag anvendtes en RNAase specifik for RNA i DNA/RNA-krydsninger, eksempelvis RNAase H, sammen med en DNA polymerase. Alternativt kan RNA'et i DNA/RNA krydsningerne, der er et resultat af førstestrengssyntese, ødelægges kemisk eller enzymatisk eller fjernes fra DNA og DNA'et kan tillades selvigangsætning. Andenstrengssyntese udføres derefter under anvendelse af en DNA-polymerase eller en revers trans-kriptase, og den tiloversblevne hårnå Iskrø l le fordøjes ved hjælp af en enke11strengsspec ifik frigivelse, såsom S1-nuclease.

En tredie fremgangsmåde involverer fjernelsen eller degraderingen af mRNA efterfulgt af tilsætning af oligonucleotid, f.eks. oligo dC slutkæder til 3'-enden af de første streng-DNA-produkter. Et komplentært oligonucLeotid, f.eks. oligo dG er fæstnet til (eng.: annealed) til endeafsnittet og tjener som en grundsubstans for den anden streng-reaktion ved en DNA polymerase eller revers transcriptase. Enkelteller dobbeltbindings DNA med sekvenser, der er komplementære eller identiske eller ligner inhibin cDNA, kan også fremstilles ved kemisk syntese til kloning.

Eksempel 3 KONSTRUKTION AF BOVIN GRANULOSACELLE cDNA SAMLINGER I E. COLI a. Endeafsnitsdannelse og fæstning cDNA. Det dobbeItstren-gede cDNA fra den anden strengsyntese præcipiteredes ved tilsætning af 40jjX 3 M NA acetat pH 7,5 og 800yttl ethanol 75 DK 173446 B1 efterfulgt af nedkøling til -70°C og centrifugering ved 20.000 x G i 5 minutter. Pellet’en genopløstes i 50 jjX TE, ekstrahe redes to gange med en lige så stor mængde phenol, der var præækvilibreret med TE, ekstraheredes tre gange med 100yitl diethy lether, der var præækvi li breret i TE, præcipiteredes derefter ved tilsætning af 50 4 M ammo niumacetat og 200^i*.l ethanol efterfulgt af nedkøling til -70°C. I modsætning til de foregående præcipiteringer til-lodes den kolde blanding at stige til stuetemperatur før centrifugering ved 15.000 x G i 5 minutter. Denne fremgangsmåde bistår ved fjernelse af uoptagne nucleotider. Pellet'en opløstes i 50yt*.L TE og repræcipiteredes under anvendelse af ammoniumacetat og ethanol. Pellet’en tørredes in vacuo og resuspenderedes i 30^tcl TE.

Til 15 jaX cDNA tilsattes en lige så stor mængde buffer inde holdende 30 nmol CoC^s 3nmol DTT, 1,5^11101 kaliumcacodylat pH 7,2, 5yttg bovin serumalbumin, 30 nmol dCTP og 17 enheder terminal transferase (BRL). Blandingen inkuberedes ved 37°C i 3-5 minutter før frysning i et ethanoltørisbad og opvarmedes derefter til 65°C i 5 minutter. Det endeafsnit-dannede DNA lagredes ved -20°C indtil det krævedes til anvendelse. cDNA-arterne optoges ved en fremgangsmåde, der er kendt som fæstning i kommercielt tilgængelige pBR322 plas-midmoleky ler, se fig. 1, tabel 2, som indeholdt tilnærmelsesvis 24 dG rester på 3' udhængende ender af Pst I restrik-tionsendonucleasebindingssted (BRL Cat.No. 5355 SA). I fæstningsprocessen danner dC enderne af cDNA stabile hybrider med dG enderne af plasmidet. Fordi Pst I bindingsstederne ligger inden for pBR322 B-lactamasegenet, er de resulterende plasmider følsomme overfor ampicillin, men stadig resistente overfor tetracyclin.

Til fæstning opvarmedes 2,5^icl dC-endedannet cDNA og tilnærmelsesvis 0,5^9 dG endeaf sni tsdannet pBR322 ved 65°C i 5 minutter i 50^o>l TE indeholdende 0,1 M NaCl og inkuberedes DK 173446 B1 " 16 derefter ved 57°C i 2 timer. Opløsningen nedkøledes derpå gradvist til stuetemperatur over en periode på en time og holdtes på is eller frosset ved -20°C indtil yderligere brug.

Indsætningen af cDNA arter i vektormolekyler kan opnås ved andre fremgangsmåder, der er kendte af fagfolk. F.eks. kan alle nucleotider tilsattes til 3'-enderne af DNA-molekyLer ved anvendelse af terminal transferasereaktionen, der er kendt som endedannelse. Disse molekyler kan derefter fæst-nes med vektor DNA molekyler, der er endedannet med komplementære sekvenser. Alternativt kan cDNA molekylerne have syntetiske bindinger, der er tilsat ved DNA ligaser, som, når de bortskæres med restriktionsenzymer, tilvejebringer passende sekvenser til kloning. Alternativt kan cDNA kløves direkte ved restriktionsenzymer eller DNAaser til direkte kloning. Stump-endede DNA molekyler kan også klones direkte i vektorer, idet sådanne vektorer omfatter plasmider, cosmider, bakteriofager og andre vira.

b. Transformation af E. coli ED8654 med rekorobinant plasmider.

E. coli ED8654, tabel 2, blev gjort egnet ved hjælp af proceduren ifølge D. Hanahan <1983; J.Mol.Biol. 160, 557-580) og 0,2 ml egnede celler transformeredes med 10 l af de fæstnede cDNA-pBR322 hybrider. Efter transformation dyrkedes cellerne i 2 timer i 2 ml SOC (5 g/l gærekstrakt/20 g/l irypton/10 mM NaCl/2,5 mM KCl /20 mM MgCl2/20 mM MgS04/20 mM glucose) og centrifugeredes derefter ved 2.000 x G i 5 minutter, resuspenderedes i 0,5 ml 0,85 procent NaCl og hele suspensionen udbredtes på en 280 mm LB <5 g gærekstrakt/ 10 g trypton/5 g NaCl pr. liter) agar <15 g agar pr. 1) plade indeholdende lO^g/ml tetracycI in-KCl for at udvælge de celler, der var transformeret med pBR322 eller rekombi-nant plasmider. Inkubationen foretoges ved 37°C i 48 timer. Herved ville en typisk transformation give ca. 5 x 10^ til 5 x 10^ kolonier pr. g rekombinant pBR322 eller tilnærmet- 17 DK 173446 B1 4 5 sesvis 10 - 10 pr.^g cDNA. Typisk indeholdt mere end 78 procent af transformanterne rekombinant plasmider som det fandtes ved tilfældig sortering af plasmider fra 14 tetra-cyc li nresistente kolonier.

c. Lagring af transformerede celler. Kolonierne fra hver plade skrabedes af i 10 ml LB. De celler, der var resultatet af · anslået 2.000 uafhængige transformationsforløb samledes sammen, centrifugeredes ved 1.500 x G i 5 minutter og resuspenderedes i 5 ml LB (v/v>, hvortil der tilsattes 0,5 ml DMSO. Portioner på 0,4 ml blev nedfrosset i flydende nitrogen og holdtes ved -70°C indtil de krævedes. Fem sådanne indsamlinger konstrueredes ved hjælp heraf.

Fordi hver original transformant indeholder en rekombinant DNA art, som stammer fra en komplet eller delvis kopi af en af mRNA arterne, der forefindes i mRNA fraktionen, kaldes kollektioner eller pools af sådanne transformanter for samlinger. I dette eksempel er samlinger af bovin granulosa- celle cDNA konstrueret i E. coli. En eukaryotisk celle kan 4 4 fremstille 1 x 10 til 2 x 10 forskellige proteiner, så en 4 kollektion af 10 uafhængige transformanter bør indeholde elementer fra alle de mere talrige mRNA-arter, Tilsyneladende indeholder langt størstedelen af cellerne i disse samlinger cDNA, som ikke er af umiddelbar interesse, men få indeholder hele eller delvise kopier af en inhibin mRNA-art,og de følgende fremgangsmåder tager sigte på at identificere og isolere sådanne kolonier.

Eksempel 4 SORTERING AF SAMLINGERNE I HENSEENDE TIL INHIBINKLONER: a. Forberedelse af samlingerne til sortering. r^r

frosne celler blev optøet og fortyndedes 5 x 10^ gange, hvorefter 0,5 ml udspredtes på overfladen af en 280 mm LB

agarplade indeholdende 10 g/ml tetracyc l in-HCl og inkube- o 4 redes ved 37 C natten over. Dette gav ca. 10 kolonier 18 DK 173446 B1 pr. plade, således at hver transformant i den originale samling skulle være repræsenteret 1-5 gange. Duplikatkopier blev taget på nitrocellulosefiltre fra Schleicher og Schnell og der fremstilledes orienteringsmærker ved med en nål dyppet i tusch at bore gennem filtrene og ned i agaren. Master-pladerne lagredes ved 4°C indtil de krævedes, og de inkuberede kopifiltre blev lagt på friske LB agarplader indeholdende lO^itg/ml tetracyclin-HCl i 8 timer. De overførtes derefter til LB agarplader indeholdende 50yO.g/ml chloramphenicol og inkuberedes natten over til forøgelse af kopiantallet pr. celle af rekombinant plasmiderne, se Clewell, D.B.

(1972) J. Bacteriol. 110; 667-676; Hanahan, D. og Meselson, M. (1980), Gene 10, 63-67). Filtrene behandledes ved en modifikation af fremgangsmåderne ifølge Grundstein, M og Hogness, D.S. (1975; Proc.Natl.Acad .Sci. USA 72, 3961-3965). Filtrene blev lagt med forsiden opad på et ark Whatman 3MM papir, der var mættet i 0,5 M NaOH/1,5 M MaCl i 15 minutter til fremskyndelse af lysering af cellerne og dannelse af enkeLtstrenget DNA, derefter neutraliseredes i 15 minutter på 2 papirsskift, der var mættet i 1,5 M NaCl/0,5 M Tris-HCl pH 7,5. De lufttørredes og lagdes på en Buchner-tragt og mættedes med 20 ml CHCl^ før aspiration. Filtrene bagtes derefter i 2 timer ved 80°C i en vacuumovn.

c. Strategi . For at identificere de kloner, der indeholder et inhibin cDNA gen eller en del deraf, anvendte radioaktivt mærkede oligodeoxyribonucleotid (oligonucleotid) prøver. De var indrettet til at være komplementære til en del af mRNA, der koder for NHg-terminalaminosyresekvenser af hver af de 43 kD og 15 kD underenheder, prøve 1 og 5, fig, 3. NHg-terminalsekvenserne af 43 kD og 15 kD underenhederne udledtes af aminosyresekvensering af intakt 58 kD inhibin, og dets fraseparerede underenheder og de første 16 aminosyrer af hver anførtes i international patentansøgning PCT/AU85/00119. Derefter var det ved at subtrahere amino-syresekvensen af 43 kD underenheden som fundet ved cDNA

19 DK 173446 B1 sekventering i pBTA22 og pBTA23, se eksempel 6A fra amino-syresekvensen af intakt 58 kD inhibin at rense og udstrække den originale analyse af 15 kO underenheden som vist i tabel 1. Denne rensning antydede et andet område, der var anvendeligt til udførelse af oligonucleotidprøver indbefattende dem for aminosyrer 20 til 24, begge incl. Fig. 3 viser den foretagne oligonuc leotidprøve, prøve 2. Det er en 24 gange degenereret 14mer og anvendtes til at isolere pBTA293 og pBTA294. Fordi hver aminosyre med undtagelse af methionin og tryptofan har mere end en DNA codon, som specificerer den, er det ønskeligt at optage alle mulige kombinationer af codons i prøverne. Således er der 64 mulige DNA sekvenser, som koder for det meste af aminosyresekvensen, der valges til inhibins store underenhed, undersøgelse 1, fig. 3, og 24 mulige DNA-sekvenser, som koder for det meste af den aminosyresekvens, der valges til inhibins lille underenhed, undersøgelse 2, fig. 3. For at maksimere muligheden for at opnå repræsentative molekyler for hver af disse sekvenser indsamles undersøgelse 1 fra fire uafhængige synteser, som ved positionerne 2 og 6 fra 5'-enden havde enten dG og dA eller dT og dA eller dG og dG eller dT og dG. Undersøgelse 2 syntetiseredes i en enkelt portion.

c. Oli gonucleoti dsyntese og rensning.Oligonucleotidprøverne syntetiseredes ved hjælp af en automatisk DNA syntetiseringsindretning (Applied Biosystems Incl, Model 380A). Maskinen programmeredes til sekventielt at sammenkoble N,N’-di isopro-pylphosphoramidit deoxyribonucleotidderivater til en deri-vatiseret kontrolleret poreglasunderstøtning ifølge den metodologi, der oprindeligt udvikledes af Matteucci, M.D. og Caruthers, M.H. (1981), J.Amer.Chem.Soc . 103, 3185-3191 .

Den protokol, der anbefales af Applied Biosystems Inc. anvendtes. Degenererede oligonucleotider dannedes ved substituering af.en blanding af phosphoramiditdeoxyribonucleo-tider til en enkelt deri vat i seret base. 0 l igonucleoti derne rensedes fra for tidligt terminerede oligonucleotider ved 20 DK 173446 B1 præparativ elektrophorese i en gel 20 cm x 20 cm x 1,5 mm indeholdende 20 procent w/v acrylamid/1,0 procent (w/v) N,N’~ bisac ry lamid/1 mM EDTA/50 mM Tris justeret til pH 8,3 med fast borsyre. Elektrophorese foretoges med 500 V i 1,5 time og derefter visualiseredes oligonucleotiderne ved placering af gelen på en Kieselgel F254 fra Merck tyndt-lagschromatografi til undersøgelse under ultraviolet lys. Oligonucleotiderne kommer til syne som mørke bånd. De blev udskåret og elueredes fra gelen natten over i 0,8 ml sterilt vand. Koncentrationen af eluerede oligonucleoti der anloges ved bestemmelse af adsorbansen ved 260 nm, en *260 a^*-ssnin9 1*0 under anvendelse af 1 cm lys bane taget som 35^«,g enke It st r engs DNA pr. ml.

d. 51 endemærket reaktion. De rensede oligonucleotider 32 blev gjort radioaktive ved tilsætning af en P-mærket phosphatgruppe til deres 5'-ender.

Specifikt lyopholi seredes 40 pmol oligonucleotid og 40 pmol r32 P ATP C2.000 Ci/mmol; 5 jj&\!j*X.} og opløstes og inkuberedes ved 37°C i 90 minutter i 20 jud. buffer indeholdende 4 enheder T^ polynucleotidkinase/10 mM MgClj/IO mM DTT/ 1 mM spermidin/50 mM Tris-HCl pH 7,5.

De radioaktive oligonucleotider rensedes som beskrevet ovenfor og visualisering foretoges ved autoradiografi i 5 minutter på Fuji RX røntgenfilm. Eluering foretoges i 0,8 ml sterilt vand natten over. Hver af de fire oligonu-c leotidsamlinger, som tilsammen dannede prøve 1, se eksempel 1b, behandledes separat op til dette trin og kombineredes derefter.

21 DK 173446 B1 TABEL 1 NH-.-TERMINAL SEKVENSANALYSE 06 PRflVEDESIGN Rest inhibin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Ala GLu Gly Gly Phe Met Val Arg Gly Ser Glu Pro

Leu Val Asp Gly Lys Asn Ile Lys A under- enhed Asn Ala Val Gly Gly Phe Met Arg Arg Gly Ser Glu Pro B underenhed Tyr Leu Glu Asp Gly Lys Val Asp Ile Lys*

Rest inhibin 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Glu Asp Gin Asp Val Ser Gin Ala Ile Leu Phe Pro Ala

Lys Gin Phe Phe Phe Lys Asp Ile Gly Asn A under- enhed Glu Asp Gln(Asp)Val(SerXGln)(Ala) Ile Leu (Phe) (Pro) (Ala) B underenhed Lys*Gln*Phe*Phe* Phe*Lya*Asp* Ile* Gly* Asn* 58 kD inhibin reduceredes, alkyleredes og de fraskilte under enheder isoleredes ved elektroe luering fra SDS-PAGE geler.

58 kD inhibin (80 praot) A underenhed 17 pmol og B underenhed 6 pmol udsattes for Edman degradering i en gasfasesekvenator. (Xaa) - aminosyrer fundet fra cDNA sekvens.

Xaa* = aminosyrer identificeret ved subtraktion af A underenhedssekvensen fra den dobbelte sekvens af 58 kD inhibin. De regioner, der anvendtes til at betegne oligonucleotidprøverne,er understreget.

e. Anvendelse af prøverne til sortering af samlingerne. Hvert sæt af de radioaktive prøver blev optaget i en 40 ml 5 x SCC/ 10 x Denhardt's opløsning, 20 x SCC er 3 M NaCl/0,3 M trinet ri umci trat pH 7,0 og 50 x Denhardt's opløsning er 1 procent (w/v) Ficoll/1 procent (w/v) polyvinylpyrrolidon/ 1 procent (w/v) bovinserumaIbumin og et filter, der var representativt for hver af samlingerne, nedsænkedes i opløsningerne under forsigtig omrøring natten over. Filtrene vaskedes i adskillige skift af 1 x SCC/0,1 procent SDS (natri-umdodecyIsulfat) ved stuetemperatur og underkastedes autoradiografi i 3-5 timer ved -70°C under anvendelse af Fuji 22 DK 173446 B1 RX røntgenfilm og en Dupont Crones Hi Plus intensiveringsplade. Filmen fremkaldtes og filtrene vaskedes igen i 1 x SCC/0,1 procent SDS ved 37°C og underkastedes derefter autoradiografi natten over.

De omrader, der var mere intense end baggrunden efter vask-ningen ved stuetemperatur eller som stadig var synlige efter vaskning ved 37°C, og som svarede til positionen af kolonier p§ masterpladerne, ansås for at være potentielle inhi-binkloner.

De foregående eksempler beskriver nogle midler og en strategi, ved hjalp af hvilken celler, der indeholder inhibin eller i nhi binlignende DNA-sekvenser, kan opnås, men hensigten er ikke at udelukke alternative midler eller strategier. F.eks. er det muligt at anvende genomisk DNA som ud-gangs-DNA og således udelukke behovet for cDNA syntese, se eksempel 8. Endvidere kan kloningsvektoren vare en sådan, i hvilken ekspression af klonede DNA-fragmenter er opnået og sorteringsproceduren er baseret på anvendelsen af anti-inhibinanti serum, se eksempel 10 eller den direkte detektering af inhibin eller inhibin-lignende biologisk aktivitet. Sådanne metoder er velkendte for fagfolk.

Eksempel 5

KARAKTERISERING AF FORMODEDE KLONER

a. Rensning af potentielle inhibinkloner. Områderne, der svarer til de mørke pletter på autoradiogrammerne, udvalgtes og blev bestrøget for enkeltkolonier på LB plader indeholdende 10 g/ml tetracyclin-HCl og inkuberedes i 16 timer ved 37°C. Kopier af disse plader lagredes ved A°C indtil de kravedes. Filtrene anbragtes i 3-6 timer på en LB agar med tetracyclin-HCl og overførtes derpå til en LB agar indeholdende 50^cg/ml chloramphenicol i 16 timer, hvorefter kolonierne lyseredes som beskrevet tidligere og sorteredes igen under anvendelse af de radioaktive oligo- 23 DK 173446 B1 nucleotidprøver. Enkeltkolonier svarende til de mørkeste pletter på autoradiogrammerne fra disse filtre udvalgtes, blev bestrøget igen og analyseret.

b. Restrikti onskortlagning af plasmid DNA. Plasmid DNA-indholdet af i det mindste et isolat af hver formodet inhibinklon analyseredes ved ekstraktion og digestion med restriktionsendonuclease Pst I. Dette enzym frigiver cDNA-inserten fra plasmidet og kløver også cDNA ved ethvert internt Pst I bindingssted. Plasmid DNA ekstraktion var baseret pi Birnboim og Doly's métode (1979; Nucl.Acids Res. Ti 1513-1523). En cellekultur, der var dyrket natten overii 3 ml LB, centf i fugeredes og resuspenderedes i 0,2 ml lysebuffer, 50 mM glucose/10 mM EDTA/0,2 procent lysozym/ 25 mM Tris-HCl pH 8,0 og inkuberedes ved 0°C i 10 minutter. Dertil tilsattes 0,4 ml alkalin SDS, 0,2 M Na0H/1 procent w/v SDS og efter 10 minutter ved 0°C tilsattes 0,3 ml 3 M Na acetat pH 4,8. Efter 15-30 minutter ved 0°C fjernedes det resulterende hvide pracipitat ved centrifugering. Plas-midindholdet af 0,8 ml af supernatanten pracipi te redes ved tilsætning af 0,7 ml isopropanol, nedkøledes til -70°C og cent rifugeredes ved 15.000 x g i 5 minutter. Pellet’en genopløstes i 0,4 ml TE og præcipiteredes ved tilsatning af 40 f/λ. 3 M Na acetat pH 7,5 og 0,8 ml ethanol, nedkøling og centrifugering som ovenfor. Den endelige pellet tørredes in vacuo og opløstes i 0,2 ml TE. En prøve p§ 20^u,l diges-teredes med 20 enheder Pst I fra Boehringer i et endeligt volumen på 40 jjJl TA buffer, 66 mM ka li umacet at/10 mM magnesiumacetat/0,5 mM DTT/ 0,1 mg/ml BSA/33 mM Tris-ace-tat pH 7,9 indeholdende ΙΟ^μ^/ml RNAse A ved 37°C i 60 minutter og udsattes derefter for elektrophorese på polyacryl-amidgeler, op til 10 procent acry lamid/0,27 procent bis acrylamid i TBE buffer, 2,5 mM EDTA/133 mM Tris/89 mM Bor-syre. Prøver af pBR322 digesteret med Alu I fra Boehringer anvendtes som størrelsesstandarder. Klonerne, der indledningsvis identificeredes, er opført i tabel 2.

24 DK 173446 B1 S. Sekvenseringsstrategier. Egnede restriktionsenxymfragmenter, der var dannet med et eller flere af enzymerne Pst I, Pvu II, Sau 3AI eller Sma I rensedes fra polyacryl-amidgeler ved eluering i 0,5 M ammoniumacetat/10 mM magne-siumacetat/0,1 M EDTA/0,1 procent SDS ved 37°C natten over og præci pite redes derefter med ethanol, genopløstes i TE og underklonedes til kopiformerne af bakteriofager M13 mp8 og M13 mp9 til sekvensering ved dideoxykædeterminerings- · metoden ifølge Sanger F*. et al. (1977; Proc.Natl.Acad.

Sci. USA 74, 5463-5467) under anvendelse af en universel grundsubstans (17 mers; Nr. 1211 eller nr. 1212; New England Biolabs) eller oli gonucleotidgrundsubstanser, der er komplementære til cDNA i sig selv. Sidstnævnte er i særdeleshed anvendelig til isolerende overlapning af cDNA-ar-ter og til udstrækning af kendte sekvenser fra overlappende cDNA-arter eller til sekvensering fra dG/dC ender mod midten af cDNA'et.

Til al sekvensering, subkloning og ekspressionsarbejde, se eksempel 10, anvendtes restriktionsenzymer i TA, eksempel 5B og T4 ligase fra Boehringer ifølge fabrikantens instruktioner.

Tabel 2 - PLASMIDER OG BAKTERIESTAMMER.

BAKTERIE- PLASMID FORÆLDR E UNDER- RESTRIKTION Kodea STAMME INDHOLD PLASMID ENHEDS- STØRRELSE*» _ _ _ _ FRAGMENT _ BTA123 ED8654C - ED8654 pBR322d BTA404 ED86S4 pBTA22 pBR322 Λ; Pst I;215/17$ BTA40S ED8654 pBTA23 pBR322 A; Pst I;480/295/150 25 DK 173446 B1

Tabel 2 - fortsat

Kodea BAKTERIE- PLASMID- FORÆLDRE- UNDER- RESTRIKTION

STAMME INDHOLD PLASMID ENHED, STØRRELSE*» _ _ _ _ FRAGMENTER _ B7A647® pUR292* B7A410 BTA647 pB7A28 pOR292 A; pBTA23 Pst I;480 BTA411 B7A647 pBTA29 pDC9 A; pBTA23 Pst I;480 BTA412 ED8654 pBTA30 pBR322 A; Pst I;300/240/480/410 BTA413 ED8654 pBTA290 PBR322 A; Pst I;480/360 BTA415 BTA647 pBTA292 pUR291 A; pBTA30 Pst I;410 BTA416 ED86S4 pBTA293 pBR322 B; 13S/S10 BTA417 ED86S4 pBTA294 pBR322 B; 165/320/530 BTA418 ED8654 pBTA29S pBR322 A; 300/500

BTA419 BTA6348 pBTA296 pUR290 A; Sau 3A I-Ssu 3A I

BTA420 BTA634 pBTA297 pB7A286b A; pB7A296;EeoRI-EeoRI

(BTA420 « ATCC67054) BTA421 BTA634 pBTA298 pUR290 Ac; Ha· II-San 3A I plus adapter

BTA422 BTA634 pBTA299 pBTA286 Ac; pBIA298 EcoRI-EeoRI

(BTA422 « ATCC67059)

BTA423 BTA634 pBIA300 pOR291 B; pBTA293 Pst I; SIO

BTA424 BTA634 pBTA301 pBTA286 B; pBTA300 EeoRI-EcoRI

(BTA424 - ATCC67058) BTA42S BTA634 pBTA286 pOR291

BTA426 BTA6S2^ pBTA302 pUC7J Λ; pBTA296 Sau 3A Ι-Sau 3A I

(BTA426 « ATCC670S7) BTA427 B7AS4S* pBTA3.03 pUC13 Ac; Hae II-Sau 3A I plus adapter*.

(BTA427 » ATCC67056)

BTA1360 BTA6371 pB7A304 pUG8 B; pB7A293 Pst I; SIO

tm»60 - ATCC6705S) 26 DK 173446 B1 (a) kodenummer for Biotechnology Australia Pty. Ltd.

Culture Collection, (b) størrelser, når disse er opgivet, er bp anslået ud fra e lektrophorese på polyacrylamidgeler mod standarder af pBR322 digesteret med Alu I. Disse værdier afviger lidt fra de virkelige størrelser, der er afledt ved DNA-se-kvense ri ng.

(c) Murray, N.K. et al, )1977), Mol.Gen.Genet. 150; 53-61.

(d) Botivar, F. et al, C1977) Gene 2; 95-113.

(e) BTA647 - E. coli K12, hsdR^, supE44, supF58, lac Y1, gaIT22, galK2, trpR55/F·lacIq, Δ(lacZ)Ml5, lacY+A+, proA+B+, tra+.

(f) Ruther, U. og Muller-Hill, B. >1983) EMBO J. 2; 1791-1794.

(g) BTA634 = E. coli K12 AClac,pro), supECglnV), thi,lon-l, za j :: Tn5/F1 proA+B+, laclq, Δ(lacZ)M15, lacY+A+, traD36.

(h) pBTA286 er et derivat af pUR291, hvori en Hpa I - Ava I DNA fragment af 2355 basepar er slettet fra kodningssekvensen af lacZ genet, siledes at kodningssekvensen forbliver i rammen.

<i) BTA 652 = E. coli K12 AClac, pro), thi , supE(glnV)44, hsdRK17 endAl, gyrA96, relAl/F’ proA+B·*·, laclq, ClacZ)Ml5, lacY+A+ traD36.

(j) Viera, J. og Messing, J. C1982) Gene 19, 259-268.

(k) BTA545 = E. coli K12 thi , AClac, arg F), U169 (lon)100, j f115 0, zje/zjf::Tn10, rpsL, hsdRK /F' laclq, A(lacZ)M15, lacY+A+, proA+B+, tra+.

Cl) BTA637 = BTA652, lon-1, zaj::Tn5.

Eksempel 6 INHIBINKLONER

a. A C43 kD) UNDERENHEDSKLONER. To plasmider pBTA22 og pBTS 23, der indholder dele af 43 kD underenheden, opnåedes oprindeligt ved anvendelse af prøve 1, fig. 3. Sekvensanalyse af deres cDNA’er indicerede, at de ikke havde fuld længde, så der foretoges specifikke oligonucleotidprøver for at isolere cDNA, der forløb 5'- fra pBTA22, prøve 3, og 27 DK 173446 B1 3’- fra pBTA23, prøve 4. pBTA290 isoleredes under anvendelse af prøve 3 medens pBTA30 og pBTA295 isoleredes under anvendelse af prøve 4.

Pst I kortet og strategien for sekvensering af cDNA insert-erne fra plasmiderne er opgivet i fig. 4 og en komposit-nucleotidsekvens, der indkoder A underenheden, er vist i fig. 5. Denne sekvens er i sin helhed indeholdt i cDNA fra plasmiderne pBTA290 og pBTA295. 410 bp fragmenter af pBTA 30 indeholder stop-codon og de naste 6 baser fra 3'-utransla-teret region før dG/dC enderne. CAG, der indkoder His 1 af A underenheden er til stede i 5'-Pst I cDNA fragmenter af pBTA22, pBTA23, pBTA290 men ikke i hverken 240 eller 300 basepar Pst I cDNA fragmenter af pBTA30. Disse to fragmenter har ingen Sbne udlæsningsrammer eller sekvenser til fælles med de andre kloner og kan derfor repræsentere en del af en usplejset intron.

cDNA sekvensen indeholder en Sben udlæsningsramme fra base 1 til 1140. I denne udlæsningsramme er det første ATG ved base 61 (Met-60) og aminosyresekvensen, der efterfølge Met-60 er indikativ for et signalpeptid, men modsat de fleste signalpeptider er der ingen arginin eller lysin før rækken af hydrofobe leuciner, se Watson, M.E.E. (1984) Nucl.Ac.Res. JK2, 5145-5164. Dette signalpeptid er forventet at ende mellem Gly-44 og Gly-41, der efterlader et propeptid pi omkring 40 aminosyrer, der går forud for His-1. Således syntetiseres A-underenheden af inhibin til at begynde med som et præ-proprotein af 38,310 Dalton, der forløber fra Met-60 til Ile-300.

A-underenheden er afledt fra dets forstadium ved kløvning ved parvise argininrester (-2, -1), et fælles signal for proteolytisk behandling af forstadieproteiner, se Steiner, D.F. et al (1980) Ann.N.Y. Acad.Sci. 343, 1-16. A under-enhedsproproteinet indeholder tre andre par argininrester 28 DK 173446 B1 ved lokaliteterne -6, -5, 8, 9 og 165, 166. Kløvning af A underenheden ved resterne 165, 166 ville danne to frag-menter af lignende størrelse, der her benævnes og A^..

A^ fragmentet danner 20-kD underenheden af 31-k Da bovi n-inhib in, se eksempel 9. A underenheden beregnes at indeholde 11 cysteinrester, af hvilke fire er i A^ fragmentet fra His 1 til Arg 166. Disse fire rester forventes at vare internt bundet, hvilket tillader fjernelse af fragmentet fra Ac underenheden. A^. underenheden indeholder syv cysteiner og i det mindste en af disse forventes at danne en disulfidkade til B underenheden. A underenheden har to potentielle N-glycosyleringsbindingssteder ved Asn 80 o Asn 202 baseret på genkendelsessekvensen Asn-X-Ser/Thr, se Wagh, P.V. og Bahl, O.P. (1981) CRC Crit. Rev .Biochem. 10, 307-377, og Asn 202 er indeholdt i A^ underenheden. De beregnede molekylvægte af proteinkæderne af underenhederne A og Ac er 32,298 og 14,624, hvilket er ca. 25 procent mindre end de, der er anslået ved SDS-PAGE for naturligt in-hibin, henholdsvis 43 kD og 20 kD. Dette kan delvist skyldes carbohydratindholdet i de naturligt forekommende molekyler, som kan ændre både deres molekylvægt og molære omfang.

Ud fra disse forskelle forventes både A., og A- delene at være glycosyleret, formentlig med Asn 80 og Asn 202, men hvorvidt 0-bundet glycosylering af serin og threoninrester er involveret, vides ikke. Carbohydratindholdet af glyco-prote i nhormonerne bovin IH, human CG og PMSC er skønnet at være 16 vægtprocent, 29-31 vægtprocent og 45 vægtprocent, se Pierce, J.G. og Parsons, T.F., (1981) Ann.Rev. Biochem.

50; 465-495, så vort tal på ca. 25 procent baseret på den forekommende molekylvægt kan repræsentere den lavere del af dette område.

cDNA sekvensen forudsiger en 3'-ut rans lateret region i mRNA af 42 baser. Dette indbefatter et typisk polyadenylerings-signal (AATAAA) 16 baser før enden af poly(A), se Nevins, J.R. (1983) Ann.Rev.Biochem. 52, 441-466). Den 3'-utransla- 29 DK 173446 B1 terede region er A+T rig, 40,4 procent G+C i modsætning tiL kodningssekvensen 66,3 procent G+C og den 5'-utransla-terede region 71,6 procent G+C.

b. B (15 kD) UNDERENHEDSKLONER. Fem uafhængige kloner detek-teredes med prøve 2 og det cDNA, der indholder den modne B underenhed fra to repræsentanter er vist i fig. 4. De andre tre kloner indeholdt cDNA med et restriktionsmønster magen til pBTA293, men med kortere 3*-Pst I fragmenter.

Nucleotidsekvensen af B underenheds cDNA opnåedes ved sekvensering af pBTA293 og pBTA294, se fig. 6. B underenheden syntetiseres i det mindste som et proprotein og i lighed med Ac underenheden er den C-terminus af dens respektive proprotein. Den separeres fra pro-sektionen ved hjalp af 5 konsekutive argininrester. Den indeholder to par lysinres-ter ved positionerne 13, 14 og 102, 103, men det er usandsynligt, at disse er behandLingsbindingssteder, se Steiner, D.F. et al. (1980) se ovenfor. Der er ni cysteinrester og dette mærkelige antal antyder, at i det mindste en er til rådighed for krydsbinding til A^ underenheden. Fra cDNA sekvensen beregnes det, at proteinkæden af B underenheden har en molekylmasse på 12,977 Dalton, hvilket er tat på den aktuelle molekylvægt på 14,900, der anslås ved SDS-PAGE af den oprindelige B underenhed. Der er ingen forekommende N-glycosyleringssekvenser i den modne B underenhed, men Asn-145 i proproteinet kan være glycosyleret.

Den 3'-utranslaterede region af B underenheden er 94 nucleo-tider lang, og der er intet AATAAA polyadenyleringssignal, som i cDNA kodningen for A underenheden. De sidste tolv baser af den 31-ut rans late rede region før poly(A)enderne passer nøje sammen med de sidste 12 baser af erythropoietin 3*-utranslateret cDNA (ACTGAAACCACC), som heller ikke har nogen AATAAA sekvens, se Jacobs, K. et al (1985) Nature 313, 806-810. G+C indholdet af B underenhedskodningsregionen, baserne 157 til 504, er 54,2 procent og indeholdet af 30 DK 173446 B1 den 3'-utransLaterede region er tilsvarende 55,3 procent i modsætning til de fo-skelle, der observeredes for A underenhedskodningssekvensen og 3*-ut rans lakeret region.

Eksempel 7 IDENTIFIKATION AF BOVIN INHIBINLICNENDE SEKVENSER I GENOMISK DNA.

Sekvenser i lighed med eller homologe med de gener, der koder for de store 43 kD og små 15 kD underenheder af bovin inhibin identificeredes i human, ovin, porcin, fishe- og hønse genomisk DNA.

Dette opnåedes i det væsentlige ved standard Southern Blot hybridiseringsteknikker, se Maniatis T. et al (1982), "Molecular Cloning", Cold Spring Harbour). I det væsentlige opløses genomisk DNA med et restriktionsenzym og de resultrende fragmenter frasepareres efter størrelse ved elektro-phorese på agarosegeler. DNA overføres til en nitrocellulose eller anden membran, som derefter undersøges med £«p] mærket cDNA, der koder for væsentlige dele af 43 kD eller 15 kD bovininhibinunderenheder. Dette resulterer i detekteringen af genomiske DNA fragmenter, som ligner eller er identiske i henseende til nucleotid sekvens.

Specifikt frembringes genomisk DNA enten fra en human makro-fag cellestamme U937 CATCC CRL 1539) eller fra menneskeblod, svineblod og hønseblod eller fra blødt væv fra okser eller får. Fra de bløde væv og den humane cellestamme var den anvendte fremgangsmåde i det væsentlige som beskrevet i Maniatis, T. et al, se ovenfor. Fra blod frembragtes DNA som følger: 10-15 ml blod (+ 0,625 procent citrat) fortyndedes til 40 ml med kold 10 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, pH 7,5, TE 10-10) og anbragtes på is i 5 minutter til lysering af blodcellerne. Efter centrifugering i 5 minutter ved 4.000 x g resuspenderedes pellet'en i 10 ml kold TE 10-10, fortyndedes til 40 ml med TE 10-10 og centrifugeredes i 5 31 DK 173446 B1 minutter ved 3.000 x g. Pellet'en disaggregeredes i 10 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, samme volumen som udgangsblodvolumenet. 10 procent SDS tilsattes til 0,5 procent, proteinase K tilsattes til 50 g/ml og blandingen inkuberedes ved 37° natten over under svag rystning. 10 ml phenol mættet med 0,1 mM Tris HCl pH 8,0 og indeholdende 0,1 procent ^-hydroxyquinoLin tilsattes og blandedes forsigtigt i 5-10 minutter ved stuetemperatur. 10 ml CHCl^: isoamylal-kohol (24:1) tilsattes og blandedes i 5-10 minutter efterfulgt af centrifugering ved 8.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Den vandige fase reekstraheredes to gange mere med 15 ml CHCl^: isoamylalkoholl 1/20 rumfang af 5 M NaCl og 2 rumfang ethanol tilsattes ved stuetemperatur og blandedes. DNA fjernedes med en pasteur-pipette, lufttørredes 30-60 sekunder og opløstes i 4 ml TE ved svag rystning ved 37° i 3 timer. DNA'et repræcipite redes som beskrevet ovenfor og genopløstes i 3 ml TE.

Prøver p9 generelt 10 g af dette DNA blev udskåret med forskellige restriktionsendonucleaser ifølge fabrikantens instruktioner ved en koncentration p§ 40-50 ^tg/ml under anvendelse af op til 500 enheder/ml enzym og inkuberedes i 16 timer. Produkterne deproteiniseredes ved ekstraktion med et lignende rumfang phenol efterfulgt af tre ekstraktioner med chloroform og præcipitering i 0,2 M NaCl med 2,5 rumfang ethanol. Den pelleterede DNA opløstes i vand og størelsesopdeLtes ved elektrophorese, 75 volt/4 timer på en 11 x 14 cm 1 procent agarosegel i TAE buffer.

DNA denatureredes ved nedsænkning af gelen i en opløsning på 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH i 45 minutter efterfulgt af neutralisering i 2 x 45 minutter i 3,0 M NaCl/0,5 M Tris-HCl pH 7. DNA'ét overførtes ved kapillærvirkning til en nitrocellulosemembran, Schleicher og SchnelL, og fikseredes ved bagning under vacuum ved 80°C i 2 timer. Filtrene præhybri-diseredes med en opløsning indeholdende 50 procent formamid, 5 x SSPE, se Maniatis et al, se ovenfor, 5 x Denhardts og 25 g/ml lydbehandlet sildesperma DNA i 2-4 timer.

32 DK 173446 B1

Hybri di seringsprøverne var som følger: a) 790 bp Sph I - Sma I fragment fra A underenheds cDNA genet af pBTA23, se fig. 5.

b) et 1109 bp Sph I - Eco RI fragment opnået fra bovin δ underenhedsklonen pBTS293, se fig. 4. Denne indeholdt B underenheds cDNA fra basepositionen 361 til 718, se fig. 6, samt et 751 bp fragment fra Pst I til Eco RI bindingsstederne af pBR322. Disse fragmenter isoleredes fra lav geldannelsestemperaturagarosegeler efter elek- - 32 trophorese og markedes mede*- p dATP ved metoden ifølge Feinberg A.P. og Vogelstein, B. (1984) Anal.Biochem.

137, 266-267.

Ca. 30 ng af DNA mærkedes til en specifik aktivitet af 8 9 2 x 10 til 10 tællinger pr. minut (CPM)/ g af DNA og mellem 3 og 4 x 10^ CPM af prøven blandedes efter opvarmning til 100°C med en opløsning indeholdende 1 x Denhardt/ 50 procent formamid/ 5 x SSPE/1X Denhardts/10 procent dex-transuIphat/25 /JLgtml lydbehandlet sildesperma DNA. Hybri-disering af filtrene foretoges i 20 timer ved 42°C. Filteret rensedes ved stuetemperatur i 2 x SCC 0,1 procent S DS og vaskedes derefter ved 50°C i 30 minutter hver i 2 x SCC/ 0,1 procent SDS og derefter 1 x SSC/0,1 procent SDS og derefter 0,1 x SSC/0,1 procent SDS. Betingelserne for hybri-disering er s3danne, at hybrid i seringssekvenser skal være mindst 70-75 procent generelt homologe til bovin cDNA-sek-venserne. Efter eksponering på Fuji RX røntgenfilm i mindst 24 timer kunne størrelserne af hybridiseringsfragmenterne bestemmes på baggrund af markerings DNA fragmenter af kendte større Iser.

Den omtrentlige størrelse i basepar af fragmenterne af human, bovin, ovin, portin og hønse genomiske DNA'er somhybridi-seredes kraftigt til A eller B bovin underenhedsgenprøverne, er som følger: 33 DK 173446 B1

Tabel 3

A UNDERENHEDSPRØVE

GENOM ENZYM FRAGMENTER ENZYM FRAGMENTER ENZYM FRAGMENTER

Bovin Pst I 3400/2700,960,480 PvuII 1700 BamHI 13000

Human ” 2450,1200,480 " 700 " 18000

Ovin " 2650,980,480 " ND " 11000

Porcin " 2200,2000,480 " ND " 2150 Høns " (nogen hybridise ring) " . ND " 6600

Bovin EcoRI 5-6000 Hindlll 5000

Human " 150000 " 20000

B UNDERENHEDSPROVE

GENOM ENZYM FRAGMENTER ENZYM FRAGMENTER ENZYM FRAGMENTER

Bovin EcoRI 7000 Hindlll 3300 PstI ND

Human " 9000 " 11000 " 650

Ovin " 7000 " 3900 " 680

Porcin " . 7000 " 6000 " 1100,680 Høns " 14000 " 4350 " 1310

Fisk (Melanotaenia splendida) ND ND " 3600 (ND = ikke bestemt) DNA fra hver art, der blev testet, besidder et begrænset antal (generelt et og i særlige tilfælde helt op til tre efter digestion med Pst I) af fragmenter, der hybridiserer til de store eller små bovininhibinunderenheds cDNA prøver. Karakteristisk var et ca. 480 bp Pst I fragment, der var fælles for alle arterne, der undersøgtes, med den store underenhed cDNA. Disse hybridiseringsfragmenter påviser tilstedevære Isen af andre arter end kvæg af gener, der ligner eller er homologe med bovininhibingener. Det er ikke udelukket, at inhibin cDNA sekvenser, der ikke er omfattet af det foreliggende valg af prøver, kan hybridisere til genomisk DNA i andre fragmenter end de i tabel 3 viste.

I en separat serie eksperimenter detekteredes A og B underenhedsforstadie mRNA arter i RNA fra rotteovarier under anvendelse af bovinunderenheds cDNA som prøver. Disse mRNA arter fandtes at være mere rigelige i rotteovarier, som var 34 DK 173446 B1 behandlet med PMSG og påviste således anvendeligheden af inhibin DNA som diagnostisk prøve.

cDNA generne, der koder for bovin A og B inhibinunderenhe-de r, kan derfor anvendes til identifikation af DNA og RNA , der koder for inhibinmolekyler i andre arters genomer og organer. På grund heraf er de inhibinmolekyler, som de indkoder, homologer af bovininhibin og kan anvendes pi lignende måde.

35 DK 173446 B1

Eksempel 8 og tabel 4 udgår.

Detekteringen af inhibinunderenhedsgener i forskellige hvirveldyrsarter tnder anvendelse af bovin cDNA

som prøve efterfulgt af kloningen og sekvenseringen af human inhibinunderenhedsgener for at vise omfattende ligheder i aminosyresekvens afslører, at andre hvirveldyrs inhibiner er homologe, om ikke identiske, med det bovininhibinprotein, der defineredes internationalt i patentansøgning PCT/AU85/ 00119 og i fig. 5 og 6.

Vi har detekteret inhibinaktivitet i follikelvaske eller ovarieekstrakter fra mange hvirveIdyrsarter, f.eks. se tabel 5, og har renset oprindeligt inhibin fra human FF og ovin FF ved hjalp af fremgangsmåderne ifølge international patentansøgning PCT/AU85/00119 og eksempel 9 og fundet, at begge arter funktionelt ligner bovin inhibin og har 58 kD og 31 kD former med underenhedsstrukturer, der: ligner bovi nf orme rn.e.

Kanin-, bovin- og humane.inhibiner neutraliseres også med kaninåntiserum beskrevet i international patentansøgning PCT/AU85/00119, som blev fremhævet overfor renset 58 kD bovin inhibin og også krydsreager et i en RIA, hvilket igen indicerer tat strukturmass i g homo logi, se tabel 5.

Det faktum, at naturlig bovininhibin er i stand til at fremkalde en immun respons i kaninen, indicerer ikke desto mindre, at der er forskelle mellem kanin og bovininhibiner, som genkendes af kaninens immunsystem som fremmede og på denne måde kan inhibin fra en art anvendes som antigen i en anden til dannelse af antistoffer, der er i stand til at genkende et endogent inhibin.

De antistoffer, der produceres af kaninen, kryds reagerer ikke navnevardigt med bovin eller rotteinhibiner, hvilket indicerer specificitet for antiserum for særlige epitoper, selvom DK 173446 Bl 36 alle de i tabel 5 viste arter er aktive i rottehypofysecelle-kulturen, hvilket vise r en konform homologi for interaktion med hypofysecellereceptoren .

Det fremgår også af den foregående diskussion, at eftersom B underenheden er godt bevaret og måske identisk i de fleste arter, vil anvendelsen af et mutant B underenheds protein som et antigen til frembringelse af antistoffer, som krydsreagerer med B underenheden af endogent inhibin, finde stor anvendelse i og virkningsfuldhed i mange arter. Sådan et antigen kan frembringes ved teknikker, såsom in vitro muta-genese af DNA efterfulgt af ekspression af det nye gen som beskrevet i eksempel 10, eller ved kemisk modifikation af B underenhedsproteinet eller ved isolering af et B underenhedsgen fra en art med en B underenhed, der ligner, men ikke er identisk med den i figur 6 beskrevne, efter fulgt af ekspression af dette gen som beskrevet i eksempel 10.

Tabel 5 INTERAKTION AF INHIB1NER FRA FOLLIKELVÆSKER HED KANIN 474 ANTIBOVIN 58 kD INHIBIN ANTISERUM.

Art_ Neutralisering Procent krydsreakt i vitet i RIA* 58 kD sporstof 31 kD sporstof

Bovin + 100 100

Human + 27 28

Ovin - 8,0 0,3

Rotte - 6,0 ND

Kanin + ND ND

* se eksempel 16a ND = ikke bestemt

Eksempel 9 FORHOLDET HELLEN 58 kD og 31 kD FORMER AF INHIBIN.

Inhibin er fremstillet af granulosacel lerne og sekreteret i fol likelvæsken. Der eksisterer de primart som en 58 kD form som tidligere vist, se international patentansøgning PCT/AU85/00119.

37 DK 173446 B1

Bevis på en mindre form for inhibin opnåedes ved studier, der tog sigte på at forbedre effektiviteten af rensningen af inhibin fra bovin follikeIvæske. Ved anvendelse af rensningsproceduren ifølge Robertson, D.M. et al C1985, Biochem. Biophys .Research Commun. 126, 220-226; International patentansøgning No. PCT/AU85/00119> indsattes et pH 4,75 præcipite-ringstrin mellem det indledende neutrale og det sure buffer getfiLtreringschroma tografitrin. Dette resulterede i dannelsen af en sekundær genomisk aktiv art, som separeredes fra den første under anvendelse af det sure gelf iItreringstrin. Efter følgende omvendt fase HPLC og præparativ polyacrylami ri-gele lektrophorese på denne sekundære art fandtes den at være et protein med en sand molekylvægt pS 31.000 sammensat af to underenheder af sand molekylvægt på 20.000 og 15.000 med lignende biologisk aktivitet som det originale 58 kD materiale. De sande mokekyIvægte af de mindre underenheder af de to inhibinarter er meget ens, ca. 15 kD, hvilket antyder, at forskellen i sand ' molekylvægt af de to inhibinarter hovedsagelig skyldes ændringer i 43 kD underenheden, som er forkortet til ca. 20 kD.

Endvidere konverteres ren 58 kD inhibin til 31 kD formen under inkubering med studeserum eller (SS) human post-meno-pausalt serum (PMS) . Denne opdeling finder ikke sted under lignende inkubation med bFF, se fig. 9. Derfor må den mindre 31 kD form af inhibin og specielt dens større 20 kD underenhed betragtes som direkte derivater af 58 kD formen af inhibin beskrevet i international patentansøgning PCT/AU85/ 00119 og hos Robertson, D.M. et al (1985), Biochem.Biophys. Res.Commun. 126, 220-226 og kan afledes direkte af underenhedsgenerne beskrevet her.

Det er også klart, at serum, der er frit for naturligt inhibin (SS og PMS) kan anvendes til behandling af rekombi-nant inhibin eller dets underenheder inwitro, og at det enzym, der er ansvarligt herfor, kan renses fra serum eller 38 DK 173446 B1 fra celletyper, der udfører denne reaktion og anvendes til et lignende formål. Denne enzymaktivitet er karakteriseret i henseende til proteaseinhibitorer. Efter inkubering af serum med i odineret 58 kD inhibin ved 30°C i 17 timer i nærvær af SS eller PMS reduceredes konvertionen af 58 kD til 31 kD inhibin fra 24 procent til 4,5 procent ved indeslutning af 3 mM parachloromercuribenzoat eller 10 mM EDTA. Bacitracin og Pepstatin A på hver 0,3 mM var uden virkning. Dette proteaseinhibitionsmønster er karakteristisk for behandlingsenzymer, se Lazure, C. et al (1983) Can.J.Biochem. Cell Biol. 61, 501-515, og i overensstemmelse med disse opdagelser findes et anerkendt behandlingsbindingssted (Arg-Arg) foran Ser 167 i A underenheden, se fig. 5, som anvendes i denne reaktion.

Opdeling af inhibin efter frigivelse til serum resulterer i to molekyler, 31 kD formen af inhibin og A^ fragmentet (aminosyrer 1-166 af den store underenhed). Medens 31 kD formen vides at undertrykke syntesen og frigivelsen af FSH af hypofyseceller, er det også muligt, at et eller flere molekyler vender tilbage til kønskirtlerne og regulerer kønskir-telfunktionen direkte, eller at inhibin i sig selv, fragmenter af inhibin eller dets forstadiemolekyler, såsom A„, har

N

andre biologiske funktioner end hypofyseregulering af FSH.

En indikation herpå er tilvejebragt af det faktum, at immuniseringen af kanin 699 med peptid 1 tilvejebragte et dramatisk fald til nul i FSH titrering, se eksempel 15.

Begge underenheder af inhibin er formet som præ pro molekyler, og propeptiderne fra hver underenhed har egne biologiske aktiviteter, hvilket igen omfatter cellevækst og regulering. 31 kD formen af inhibin i sig selv har betydelig homo-logi med transformationsvækstf aktor^3, se Derynck, R et al (1985) Nature 316, 701-705, og foreslår en rolle for det oprindelige molekyle i celleregulering ud over dets kendte effekter på FSH syntese af hypofysece l ler.

39 DK 173446 B1

Eksempel 10

EKSPRESSION AF INHIBIN cDNA

a. 43 kD og 20 kD underenheder. Selvom klon BTA405, se tabel 2, indeholder cDNA, der ioder for en del af den store underenhed af inhibin, forventes den ikke at udgøre nogen del af inhibinet, fordi cDNA er dC afsluttet, se eksempel 3a, og der er intet ribosom-bindingssted eller initierende ATG <f-Met) codon i sekvensen. For at opnå ekspression af en del af inhibingenet fremstilledes et fusionspeptid ved kloning af det største <ca. 480 bp) Pst I fragment af cDNA i pBTA23 til Pst I bindingsstedet på pUR292. I den korrekte orientering frembringer dette et protein, der består af det meste af E. coli proteinet ^5-galactosidase efterfulgt af aminosyrerne 27 til 183 af 43 kD underenheden af inhibin. Plasmidkonstruktionerne transformeredes til E. coli BTA647, se tabel 2.

For at identificere sådanne kloner anvendtes en immunologisk sorteringsmetode. Efter transformation udbredtes cellerne på LB agar indeholdende SO^g/ml natriumampici llin i 16 timer ved 37°C for at udvælge transformanter. Kolonierne kbpieredes på nitrocelLulosemembraner fra Schleicher og Schuell og orienteringsmærker påførtes ved gennemstikning af membranerne ned i agaren med en nål dyppet i tusch. Masterpladerne oplagredes ved 4°C indtil de skulle bruges, og kopifiltrene inkuberedes med forsiden opad på friske LB agarplader indeholdende 50 g/ml natriumampic i 11in i 3 timer. Fusionsproteinerne tilførtes på LB agar indeholdende 0,5 mM isopropyl B-D-thio-galactosid (IPTG) ved 37°C i 2 timer. Filtrene blev lagt på et ark Whatman 3MM papir mættet med 0,2 M Na0H/1 procent (w/v) SDS i 5 minutter og derpå neutraliseret på papir mættet med 0,5 M Tris-HCl pH 7,5. Proteiner frigjort fra kolonierne bindes til nitrocellulosen i situ. Alle proteinbindingsstederne, der blev tilbage på nitrocellulosen, blokeredes ved nedsænkning af filtrene under Let omrøring i TST (150 mM NaCl/0,05 procent (v/v) Tween 20 fra Sigma/10 mM Tris-HCl 40 DK 173446 B1 pH 8,0) indeholdende yderligere <0,5 procent (v/v)) Tween 20 i 1 time. Filtrene behandledes ved stuetemperatur natten over med en opløsning indeholdende kanin antibovin 58 kD inhibinantiserum, se international patentansøgning PCT/AU85/001 19, opløst i forholdet 1:50 i TST og derpå vasket adskillige gange i TST til fjernelse af overskydende antistof. Filtrene behandledes i 1 time ved stuetemperatur med en 1:200 opløsning i TST af svineantikaninimmunbglobulin-peberrodperoxidasekonjugat fra Cakopatts og vaskedes derpå i TST. Endelig vaskedes de i 20 mM Tris HCl pH 7,5 og farvedes med en opløsning indeholdende 0,5 mg/ml 4-chloronaph-thol/0,03 procent <v/v) HgOg^O mM Tris-HCl pH 7,5.

Kolonier i ndehoIdende fusionspeptidet identificeredes fra områder på filtrene, som var mere intenst farvede end områder, på hvilke kontrolstammen BTA647 (pUR292) var dyrket. Nogen baggrundsfarvning af andre kolonier var synlig til trods for forsøg på at reducere anti-E. coli anti stoftitre-ring af kam* nant i inhi bi nant i serum ved prsinkuber ing af det fortyndede antiserum med filtre, på hvilke der var dyrket og lyseret et område af t*i Iført E. coli BTA647 (pUR292) .

Tre sådanne kolonier rensedes, og deres plasmidindhold analyseredes. Alle indeholdt pUR292 med det ventede cDNA fragment i korrekt orientering, og en af disse stammer betegnedes BTA410 og dens plasmid pBTA28, se tabel 2. Identiteten af fusionspeptidet kontrolleredes ved Western plet-proceduren, se Towbin, H., et al (1979) Proc.Natl. Acad.Sci. USA 76, 4350-4354, hvori proteinerne denatureres med natrium-dodecylsulfat og deles op efter størrelse ved polyacrylamid-gelelektrophorese og overføres derefter sideværts til et ark med nitrocellulose. Nitrocellulosen behandledes derefter som beskrevet ovenfor til bestemmelse af, hvilket protein-bånd, der indeholder inhi binanti geni ske determinanter. Proteinprøverne frembragtes som følger: 41 DK 173446 B1

Kulturer af BTA647 (pUR292) og BTA410 dyrket natten over ved 37°C i LB opløstes i forholdet 1:100 i et frisk medium og inkuberedes indtil en uklarhed pS A^gg 0,4 opnåedes og gjordes derefter 0,5 mM i IPTG og inkuberedes i yderligere 2 timer før høst. Ce 11 epellet1 erne resuspenderedes direkte i 0,1 volumendele ladningsbuffer Celektrophoresebuffer indeholdende 30 procent (w/v) sucrose/1 procent (w/v) SDS/0,1 M B-mercaptoethanol/0,01 procent bromophenolblåt) og opvarmedes i et kogende vandbad i 5 minutter. Prøver på 10-30 yuX tilførtes polyacrylamidgeler, se Laemmli, U.K. <1970) Nature, 227, 680-685, Mattick, J.S. et al, C1980) Eur. J. Biochem. 114, 643-651, og elektrophoresen gennemførtes, indtil den bromo-phenolblå farve nåede gelens bund. Den sideværts overførsel udførtes under anvendelse af et Hoeffer Transblot apparat ved 1 ampere i 1 time i 15,6 mM Tris base/120 mM glycin. Blokering og behandling af filtrene med antisera var som beskrevet ovenfor. Til direkte visualisering af proteinerne i polyacrylamidgelerne neddyppedes gelerne i en affarvningsopløsning på 10 procent v/v methanol/5 procent v/v iskold eddikesyre i 30 minutter og farvedes med 0,5 procent w/v Coomassie Brilliant Blue R250 frambragt i den samme opløsning i 1 time. Gelerne affarvedes ved let omrøring i adskillige affarvningsop løsningssk ift, og proteinbåndene sammenlignedes med de, der blev fundet ved Western plet og im-munodetektering. Stammen BTA410 viste sig at indeholde i det mindste to proteiner, som sammen kan repræsentere hen imod 5-10 procent af det totale celleprotein, som tilføres ved IPTG og detekteres af antiinhibinantiserum, se fig. 13, spalte 10, og som ikke forefindes i stammen BTA647 <pUR292), se fig. 13, spalte 11. De er større, ca. 130 og 117 kD, end oprindelig ^»-galactosidase, 116 kD, og repræsenterer derfor galactosidaseinhibinfusionsproteiner. De største af fusions-proteinerne er kompatible med det, der ansloges ud fra DNA-analysen, ca. 132 kD.

Under anvendelse af en Lignende fremgangsmåde ekspresseredes 42 DK 173446 B1 410 bp Pst I fragmentet af pBTA30 i pUR291. Det resulterende plasmid betegnes pBTA292, se tabel 2, og igen kunne fusions-proteinet detekteres under anvendelse af antiinhibinantiserum, se fig. 13, spalte 9.

For at opnå ekspression af hele underenheden splejsedes cDNA fra pBTA290 og pBTA30, og den anvendte strategi er vist i fig. 10. I korthed involverede denne rensning af Sau 3A I fragmenter fra hver af klonerne, spaltning af dem på det unikke Rsa I bindingssted og nedrykning. Blandingen af ligationsprodukter spaltedes med Sau 3A I og produkterne ligeredes til pUR290. Klonerne frasorteredes derefter med prøverne 3 og 4/ se fig. 3, for at identificere kloner, der indeholdt både 5'-Sau 3A I-Rsa I fragment af pBTA290 og 3'-Rsa I-Sau 3A I fragment af pBTA30. Produktionen af et -ga lactosi-daseinhibinfusionsprotein sikres, når inserten er i den'korrekte orientering, fordi pUR290 giver den korrekte udlæsningsramme fra Asp -10 til Ile 300. Korrekt ekspression af 480 og 410 bp Pst I sektionerné kan kontrolleres uafhængigt ved hjælp af de specifikke antistoffer isoleret fra søjler indeholdende fusionsprodukterne af pBTA28 og pBTA292, se eksempel 9. Det resulterende plasmid er blevet benævnt ΡΒΤΑ296, se tabel 2. Dette komplette A under enhedsgen er altså klonet til Barn HI bindingsstedet af pUC7 som et Sau 3A I- Sau 3A I fragment og det reulterende plasmid pBTA302, se fig. 12, er overført til BTA652 til frembringelse af BTA426 (ATCC67Q57). Sekvensen Asp-Pro ved Sau 3A 1 bindingsstedet kan anvendes til at spalte inhibindelen af fusionsproteinet fra proteinet opstrøms, fordi denne sekvens er labil i myresyre, se Nilsson, B. et al, (1985), Nucl.Ac.Res.

13, 1151-1162.

Ekspressionen af en fuld længde 43 kD underenhed smeltet sammen med ^-galactosidase, aminosyrerne Asp -10 til Ile 300 fra stammen BTA419 er vist i fig. 13, spalte 8. Ud over φ-galactos idaseinhi binproteinet af fuld længde er der mindst 43 DK 173446 B1 tre andre bånd af mindre størrelse ned til en molekylvagt på ca. den samme som den oprindelige ~gala ctos i dase, der måske repræsenterer proteolytisk degradation af produktet af fuld længde eller præmatur termination af transkription eller translation. Størstedelen af fusionsproteinet er opløseligt. Inhibin DNA og flankerende (i-galactosidase ONA fjernedes fra pBTA296 som et Eco RI restriktionsfragment og indsattes i pBTA286, se tabel 2, fig. 13, spalte 4, til dannelse af pBTA297, se tabel 2, kloner, der ekspresserede inhibin DNA ved C-terminus af det af kortede β-galactosidase-protein fra pBTA286 udvalgtes ved koloniimmunohybridisering som beskrevet ovenfor. Undersøtelse af sådanne kloner under fasekontrastmi kroskopi, f.eks. BTA420, se tabel 2, afslørede, at de producerede fusionsproteiner som et uopløseligt produkt benævnt et inklusionslegeme, som yder nogen beskyttelse mod proteolytisk degradation i cellen og i høj grad forenkler rensningen til antigendannelse, se eksempel 12 og 13. Stammen BTA420 er benævnt ATCC67054 og proteinet fra rensede inklusionslegemer af BTA420 er vist i fig. 13, spalte 3. Ekspresssionen af A underenheden i BTA426 er vist i fig. 13, spalte 14 og igen er dette protein fortrinsvis dannet som et inklusi ons legeme. I modsætning til fusionsproteinet i BTA420 er det Længste fusionsprotein i BTA426 også det mest rigelige og det mest reaktive i Western plet analyse, hvilket indicerer, at det er en god værtsvektorkombination til produktion af inhibinlignende protein.

Det vil fremgå af det foregående, at andre restriktions-enzymbipdingssteder kan anvendes i ekspressionen af A underenheden. Først og fremmest er det unikke Sph I bindingssted som spænder codon for His 1 og oligonucleotidbindere kan udformes til tilladelse af ekspression af A underenheden eller Atø fragmentet i flere forskellige værter og vektorer, enten som fusionsprodukter eller som et fusionsuafhængigt protein, hvor et nyt f-Met codon introduceres.umiddeIbart før CA6, der indkoder His 1 eller hvor et signalpeptid er 44 DK 173446 B1 tilvejebragt forud for His 1. Sådanne konstruktioner er velkendte for fagfolk, og et eksempel herpå er givet i fig. 11.

Denne ekspresssionsbinder er udformet med henblik på at yde ekspression af 43 kD proteinet via et nyt N-terminalt methionin efter indsættelse i et trp promoter plasmid, såsom ptrpLI, se Edman, J.C. et al. (1981) Nature 291, 503-506, under anvendelse af Cla I bindingsstedet og som et {3-galactosidaseinhibinfusionsprotein efter indsættelse i pUC7, pUC13 eller pl)R290 under anvendelse af Bam HI bindingsstedet og som et trp E-inhibinfusionsprotein efter indsætning i pWH21, se Tacon W. et al (1980) Molec.Gen.

Genet. 177, 427-438.

Den metode, er anvendes til rekonstruktion af et fuld længde præ pro A underenheds forstadium er angivet i fig. 12. Grundlæggende omfatter det isolering af Pvu II-Pvu II fragmentet fra pBTA295 og tilsættelse af en binder, der er ikke phospha-taseret, vist i fig. 11 A i i som rekonstruerer de første fire aminosyrer af signalpeptidet (Met -60 til Gin -57), 5' til det første Pvu II bindingssted og tilvejebringer et Bam HI bindingssted ved 5' enden. Det bundne molekyle overskæres med Sph I og ligeres ind i pBTA297, overskæres med Bam HI og Sph I, hvilket giver pBTA305. Denne mellemoperation ekspresserer præ pro A underenhed som et fusionsprotein. Inhibin DNA sekvenserne kan fjernes som et Hind III-Hind III fragment eller som et Eco RI - Eco RI fragment til efterfølgende manipulering. Navnlig kan dette Eco RI - Eco RI fragment underklones til pUC8 eller pUC9. Inhibin cDNA sekvenserne fjernes som et Bam Hi - Bam HI fragment og genklones i vektoren pZIP Neo SVCX51. Se Cepko, C.L. et al (1984) Cell 37, 1053-1062.

Dette ekspressionssystemrtil brug i eukaryotiske celler og forventes at yde sekreterede og glycosylerede former for 43 kD proteinet i modsætning til det tidligere beskrevene prokaryot i ske system.

45 DK 173446 B1 Således tilvejebringer 5' Pvu II, Sai 3A I og Sph I bindingsstederne alle passende bindingssteder til ekspression af 43 kD proteinet. Hai II bindingsstedet, der starter ved base 734, tilvejebringer et egnet punkt til ekspression af A^ delen af A underenheden, der begynder med arginin 165.

Det er blevet ekspresseret som ^-ga lactosidasefusi onsprodukter i pUR290, pBTA286 og pUCl3 ved hjælp af Hae II bindingsstedsbinderne beskrevet i fig. 11A iii. Til opnåelse heraf rensedes den krævede Hae II-Sau 3A I fragment fra pBTA30 og bindere tilsattes. De resulterende konstruktioner blev udskåret med Sau 3A I og derefter præcipiterede DNA to gange med isopropanol, som er effektivt tilat præcipitere store DNA fragmenter, men som præcipiterer små DNA fragmenter, såsom bindere, ueffektivt. Det præcipiterede DNA genopløstes i TE og ligeredes til pUR290. Plasmiderne transformeredes til BTA634. De resulterende kloner kopieredes på duplikatfiltre og derefter frasorteredes et filter af hvert par som beskrevet i eksempel 4 med E^pjmærket Hae II binder, den øverste række af DNA parret vist i fig. 11A iii og den anden med prøve 4, se fig. 3. Kloner, som detekteredes ved begge prøver, udvalgtes og blev testet for ekspression ved Western plet analyse. Kun en klone er vist i fig. 13, spalte 7, og er betegnet 3TA421, se tabel 2. DNA fragmentet der indkoder inhibin Ac underenheden og dens flankerende ^-galactosidase DNA sekvenser er også fjernet som et Eco RI fragment og ligeret til pBTA286 for ekspression som et fusionsprotein, som igen er uopløseligt og yder således fordele i form af rensning og beskyttelse mod degradation. Denne stamme er betegnet BTA422 (ATCC67059, se tabel 2, fig. 13, spalte 2.

Det nye Barn HI-Sau 3A I fragment, der indkoder Ac underenheden, er også udskåret fra pBTA 298 og underklonet til pUC13 for at frembringe et kort fusionsprotein. Stammen BTA427, ATCC67056, tabel 2, producerer dette protein som et inklusionslegeme og gelanalyse viser, se fig. 13, spalte 15, at 46 DK 173446 B1 igen, som det er tilfældet med BTA426, er det længeste fusionsprotein også det mest rigelige og det mest synlige ved Western plet analysen, hvilket indicerer, at BTA427 er en god værtsvektorkombination til produktion af inhibin-lignende protein.

En detalje, der bør bemærkes ved hver af binderne vist i fig. 11 er, at når DNA er korrekt ekspresseret fra Bam HI-bindingsstedet, optages aminosyresekvensen Asp.Pro i fusionsproteinet. Som nævnte ovenfor er denne sekvens labil i myresyre Og kan anvendes til at fraspalte inhibinproteinet fra proteinet opstrøms, se Nilsson, B. et al, (1985) Nucl.Ac.

Res. 13; 1151-1162, hvorunder er ikke er nogen Asp-Pro sekvens i A underenhedsproteinet. Det er ogs§ muligt at optage andre 'spaltningsmidler i en given sekvens fra fusionsproteinet. Eksempler inlkuderer optagelsen af protease-recognitionssekvenser, f.eks. faktor X recognitionssekven-

O

ser, se Nagai, K. og Thogerson, H.C. (1984) Nature 309, 810-812, eller collagenoaserecognitionssekvenser, se Sermino, J og Bastia, D. (1984) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81, 4692-4696, og muligheden af at anvende enzymer, som genkender parrede argini nrester, er nylig blevet diskuteret i eksempel 9.

Ved optagelse af et methionin før inhibinsekvensen ovenfor er det muligt at fraspalte fusionsproduktet med cyanogen-bromid til opnåelse af inhi binfragmenter, der er frie for (3-galactosidase. Met hi oninrester inde i inhibinsekvensen kan konverteres til alternative aminosyrer ved in vitro mutage-nese af cDNA og således forøge anvendelse af cyanogenbromid-spaltningsteknikken, fordi et inhibinlignende protein af fuld længde vil være frigjort fra f usionsproteinfors'tadiet. Konvertering af de interne methi on inrester kan også resultere i. et molekyle med mere ønskelige antigenegenskaber eller inhibinlignende agonist* eller antagonistegenskaber.

b. Ekspression af 15 kD underenheden. 510 bp Pst I cDNA fragmentet af pBTA293, se fig. 4, li geredes i Pst I bindingsstedet af pUR291 og derpå transformeredes plasmiderne 47 DK 173446 B1 i E. coli BTA634. De resulterende kloner frasorteredes for tilstedeværelse af rekombinant plasmider under anvendelse af de 24 gange degenererede 14 mer oligonucleotider, som indledningsvis var anvendt til at isolere pBTA293 og PBTA294 , prøve 2, fig. 3. Adskillige rekombinant plasmider kortlagdes derefter under anvende.se af restri<tionsen2ymet Hind II, og to plasmider, soa indeholdt inserten i den korrekte orientering, analyseredes for ekspression på polyacryl-amidgeler. En sådan stamme er blévet benævnt ΘΤΑ423, se tabel 2.

510 bp Pst I cDNA fragmentet af pBTA293 klonedes direkte i Pst I bindingsstedet af pBTA286 og transformeredes til bTA634 til ekspression som et fusionsprodukt. pBTA286 var afledt af pUR291, så udlæsningsrammen tværs over Pst I bindingsstedet tillader denne direkte kloning. Den resulterende stamme er betegnet BTA424 (ATCC67058, se tabel 2) og producerer fusionsproduktet som et inklusions legeme.

510 bp Pst I cDNA fragmentet af pBTA293 klonedes også i Pst I bindingsstedet af pUC8 og transformeredes til pBTA 637 for ekspression som et uopløseligt kort fusionsprotein, der frembragte stammen BTA1360 CATCC67055, se tabel 2).

Ingen af fusionsproteinerne fra BTA423 eller BTA424 eller BTA1360 detekteredes ved kaninantiinhibinanti se rum, se fig.

13, spalte 1, 6 og 16, selvom hver af A og A. underenheds- v fusionerne blev. Dette indicerer, at niveauet af antistoffer til 15 kD proteinet er ekstremt lav eller nul, og det synes derfor sandsynligt, at de biologiske effekter, der associeres med immunisering mod inhibin, kan opnås under anvendelse af A eller A^ underenheder alene, se også eksemplerne 17-20.

Ekspression af 15 kD sekvensen kan også opnås ved isolering af Hae II fragmentet, som spænder over hele 15 kD sekvensen plus argininer -5 til -1 og ved tilsætning af Hae II bindings- 48 DK 173446 B1 stedsbindere beskrevet i fig. 11A iii. Den resulterende fusion koder som vist i fig. 11B i,og som beskrevet ovenfor er den anvendelig til ekspression af en^-galactosidasefusion i Pur290/pUC7/pUC13 under anvendelse af Barn HI bindingsstedet med potentialet for myresyrespaLtning af fusionen ved Asp-Pro sekvensen. Endvidere er Cla I bindingsstedet anvendeligt til ekspression i ptrpLl, se Edman, J.C. et al C1981c)> se ovenfor, hvor ATG fungerer som et nyt trans lat i one It initiationsbindingssted.

En tredie mulighed for ekspression er at anvende det unikke Hind II bindingssted og at syntetisere DNA sekvensen og indkode aminosyrerne 1-8 med de ønskede bindere og Met -1 sekvensen som vist i fig. 11B iii.

Således er Pst I, Hae II og Hind II bindingsstederne alle egnede bindingssteder for tilsætning af ekspressionsbindere.

Det er også muligt at anvende Hae III bindingsstedet (GGCC), der spænder over aminosyrerne 1 og 2 efter en delvis Hae III opløsning af 510 bp Pst I fragmentet. Igen er variationer i ekspressionssystemet velkendt for fagfolk, og de muligheder, der er beskrevet for A og A^ underenhederne ovenfor, gælder også for B underenheden.

Det er også klart, at dele af underenhedsforstadierne kan ekspresseres uafhængigt af inhibin Ac og B underenhedssek-venserne med henblik på studium af deres funktion. F.eks. kan fragmentet DNA isoleres som et Sph I-Hae II (delvist) fragment og ekspresseres i pUC7 eller pUC13 under anvendelse af bindere vist i fig. 11A i og 11A iii for at konvertere begge ender til Barn HI bindingssteder.

Endvidere er det klart, at ekspression af i nhi bi nproteiner eller inhibinlignende proteiner eller peptider ikke behøver at begrænses til de ovenfor angivne eksempler. Der er mange forskellige ekspressionssystemer, der er anvendelige i pro- 49 DK 173446 B1 karyotiske og eukaryotiske celler, som er velkendte for fagfolk, hvilke systemer er egnede til ekspression af de her givne sekvenser.

Eftersom aminosyresekvenserne af bovin og human B underenheder er identiske, er det klart, at idet produktet har ekspresseret cDNA, der indkoder bovin B underenheden, er det identisk med det, som kunne opnås ved en Lignende ekspression af den humane DNA sekvens. Således kan også stammerne BTA423, BTA424 og BTA1360 antages at producere B underenheden af human inhibin.

INDUSTRIEL BRUG Anvendelser af inhibin

Inhibin eller dele deraf fremstillet ved hjalp af den foreliggende opfindelse kan anvendes enten som antigener eller som bioaktive forbindelser; de effekter, der skyldes den ene brugsmetode, forventes at vare modsat de, der er fremstillet ved den anden brugsmetode.

50 DK 173446 B1 I en form kan inhibin eller dele deraf produceret ifølge den foreliggende opfindelse og/eller modificeret bagefter anvendes som et antigen og således anvendes til fremkaldelse af frugtbarhed. Forøgelse af ovulationshyppigheden hos hvirveldyr incl. mennesker kan forbedre forplantningen og således forøge frugtbarheden eller forbedre den reproduktive effektivitet. Produkter ifølge opfindelsen kan anvendes til forøgelse af ovulationshyppigheden og kan således finde anvende Ise i in vitro frugtbarhedsprogrammer, såsom for husdyr eller for mennesker. Det kan også anvendes i vilde dyr, f.eks. til lettelse af opdrætsprogrammer i zoologiske haver. Endvidere kan produkterne ifølge denne opfindelse anvendes til fremskyndelse af seksuel modenhed eller pubertet til forøgelse af den reproduktive levetid og/ eller til fremskyndelse af brunst hos produktionsdyr for at mindske perioden mellem fødsel og parring og/eller for at reducere sæsonbetonet eller post partum anaøstral periode.

Hos hanner kan produkterne ifølge opfindelsen anvendes til at stimulere spermatogenesen.

Produktionen af tamdyr, såsom køer, får, svin, geder, hjorte, heste, fisk og høns kan således nyde godt af disse anvendelser af inhibin.

Inhibin som et aktivt middel kan anvendes som et middel til at kontrollere ovulation hos hunner eller undertrykke spermatogenesen i hanner og således anvendes som kontracep-tivt middel eller middel til at synkronisere ovulationen.

Dele af inhibin, f.eks. syntetiske peptider eller fragment, kan anvendes som antigener til undertrykkelse af FSH niveauer og således fungere som kontraceptive midler eller molekyler til undertrykkelse af brunst.

Eftersom produkterne ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes til at aktivere antistoffer og disse også udgør en del af den foreliggende opfindelse, kan antiinhibinantistof - 51 DK 173446 B1 fer anvendes som diagnostiske midler. F.eks. omfatter sådanne anvendelser midler til overvågning af status af den reproduktive cyklus hos hvirveldyr indbefattende mennesker. På denne måde kan tidspunktet for ovulationen og antallet af afgivne ag forudsiges og således tillade fastsættelse af terapeutiske procedurer til indgreb i den reproduktive cyklus. Antistofferne kan anvendes til bestemmelse af granulosacellefunktionen hos hunnen,som en markering af Sertolicellefunktionen i hanner og muligvis som en markering for genetisk selektion af gode avlsdyr.

Således kan rekombinant inhibinerne, der tidligere er beskrevet, og derivater eller homologer eller analoger deraf, finde mange anvendelser, hvilke omfatter: a) anvendelse som antigener eller inhibinantagonister for at regulere eller fjerne nogle eller alle de fysiologiske virkninger, der skyldes det originale inhibin eller dets forstadier in vivo, b) anvendelse som antigener for at producere monoclonale eller polyclonale antistoffer, c) anvendelse som forstadier for produktion af biologisk aktiv rekombinant inhibin in vivo eller in vitro, d) anvendelse som standarder i en i nhibinradioimmunoanalyse (RIA) og enzymbundne immunosorbent (ELISA) analyser eller analyser, der anvender andre detekteringssystemer, såsom kemilluminescens eller fluorescens, e) anvendelse i sortering af monoclonale og polyclonale antistofpræparater, f) anvendelse i rensning af antistoffer som genkender inhibin eller inhibinlignende aminosyresekvenser, se eksempel 9, g) anvendelse som inhibinagonister til muliggørelse af nogle eller alle de fysiologiske virkninger, der skyldes originalt inhibin eller dets forstadier in vivo. Bioaktivt rekombinant inhibin kan fremstilles ved koekspression af begge underenheder eller forstadier dertil i den samme celle eller ved korrekt refolding af individuelle underenheder 52 DK 173446 B1 eller forstadier/ analoger, homologer eller derivater deraf in vitro.

Inhibin cDNA sekvenserne finder forskellig anvendelse/ som f.eks. omfatter: 1) anvendelse som cDNA skabeloner for proteinsyntese i pro-karyotiske eller eukaryotiske celler/ · 2) anvendelse som DNA skabeloner for fremstilling af radio mærkede inhibin cONA prøver. Disse prøver kan anvendes til detektering og isolering af inhibin eller inhibi ni ignende sekvenser i det genomiske DNA af forskellige arter eller i mRNA af celler/ der fremstiller inhibin ellerinhibinlignende peptider/ se eksempel 7,

De har således et potentiale i henseende til diagnosticering af defekter i inhibinsyntesen og regulering hos mennesker og husdyr og til kloning og manipulering af i nhibingener/ 3) anvendelse som DNA skabeloner til fremstilling af radiomærkede RNA prøver til anvendelser som angivet under 2)/ og 4) anvendelse som DNA skabeloner til fremstilling af radio-market inhibin.

Claims (6)

53 DK 173446 B1

1. En polynucleotidsekvens, som koder for inhibin, hvilken sekvens har den aminosyresekvens, som er illustreret i 5 fig. 5 og 6, eller derivater af inhibin med samme biologiske egenskaber.

2. En polynucleotidsekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er i det væsentlige i ren form. 10

3. Polynucleotidsekvens ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den koder for 43 kD underenheden af inhibin.

4. Polynucleotidsekvens ifølge krav 1 eller 2, kendeteg- 15 net ved, at den koder for 20 kD underenheden af inhibin.

5. Polynucleotidsekvens ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den koder for 15 kD underenheden af inhihin.

6. Polynucleotidsekvens ifølge krav 1 eller 2, kendeteg net ved, at den koder for -60 til 166 aminosyresekvensen ifølge fig. 5, -10, til 166 aminosyresekvensen ifølge fig. 5, eller biologiske ækvivalenter dertil.