JPH07111428B2 - レーザ磁気免疫測定方法及び測定装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原抗体反応を利用したレーザ免疫測定方法お
よび測定装置に関する。さらに詳しくは、極めて微量の
検体から特定の抗体または抗原を検出可能なレーザ免疫
測定方法および測定装置に関するものである。

〔従来技術とその問題点〕 エイズ、成人Ｔ細胞白血病等の新型ウイルス性疾病、な
らびに各種癌の早期検査法として、抗原抗体反応を利用
した免疫測定法の開発が現在世界的規模で進められてい
る。これは、抗原であるウイルス等が生体に侵入した場
合に形成される抗体が、上記抗原と特異的に反応する性
質（抗原抗体反応）を利用して、抗体または抗原そのも
のを検出しようとするものである。このための微量免疫
測定法として、従来からRIA（ラジオイムノアッセ
イ）、EIA（酵素イムノアッセイ）、FIA（蛍光イムノア
ッセイ）等が実用化されてきた。これらの方法は、アイ
ソトープ、酵素、蛍光体で標識された抗原または抗体を
用い、これと特異的に反応する抗体または抗原の有無を
検出するものである。

このうちRIAは、抗原抗体反応に寄与した検体の量を、
標識化されたアイソトープの放射線量を測定することに
より定量するものであり、現在のところ、ピコグラム程
度の超微量測定が唯一可能な方法である。しかし、RIA
は放射性物質を取り扱わなければならないため、特殊設
備が必要であり、半減期や廃棄物処理等の点から、使用
時期、場所等の制約があった。また、酵素、蛍光体を用
いる方法では、発色や、発光を用いて抗原抗体反応の有
無を確認するものであるため、測定が半定量的であり、
検出限界もナノグラム程度であった。従って、RIAと同
程度の検出感度を有し使用上の制限のない免疫測定方法
が求められていた。

抗原抗体反応の有無の検出にレーザ光を用いる方法とし
ては、肝臓癌の検出を目的として、プラスチックの微粒
子にAFP（アルファ・フェト・プロテイン）に対する抗
体をつけ、抗原抗体反応に基づく該プラスチック同士の
凝集により生じた質量変化を、レーザー光の散乱または
透過状態の変化から調べる方法が発表されている。この
方法では、検出感度は10^-10ｇであり、従来のレーザー
光を用いた方法の百倍以上とされているが、RIAの感度
の百分の一以下である。この方法は、水溶液中での抗原
抗体のブラウン運動の変化を利用しているため、測定に
際しては、検体を含む水溶液の温度制御を精密に行う必
要があり、気温や振動等の外界の影響を受け易い欠点が
あった。

また、従来のレーザ光の散乱測定は、検体が分散してい
る水溶液の一部分のみを照射するため、本質的に検出感
度向上には限界があり、多量の検体が必要であった。

このような事情から、従来よりRIAに匹敵する検出感度
並びに精度を有し、実施上の制限のない免疫測定方法及
び測定装置の開発が望まれていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の第１の発明に従うと、所定の抗原あるいは抗体
に磁性体微粒子を標識として付加した磁性体標識体と、
磁性たる抗体あるいは抗原とを抗原抗体反応させる第１
工程と、該第１工程後の磁性体標識体と検体との複合体
である磁性体標識検体複合体を含む溶液に磁界を作用さ
せて該磁性体標識検体複合体を定められた位置に誘導・
濃縮させる第２の工程とを少なくとも含む、レーザ磁気
免疫測定方法において、磁性体標識検体複合体の存在す
る前記濃縮位置と、該磁性体標識検体複合体が存在しな
い溶液部の非濃縮位置にレーザ光を同時あるいは時系列
的に照射し、受光した該濃縮位置からの出射光と該非濃
縮位置からの出射光との差分を検出することを特徴とす
るレーザ磁気免疫測定方法が提供される。

また、本発明の第１の発明の一つの変形例に従うと、前
記第２工程が上方に開口を有する検体容器を用いて行わ
れ、該検体容器の下方に置かれた磁石と該磁石に対向し
て該検体容器の水面真上に置かれた磁石片によって誘導
・濃縮がなされ、前記検出工程が該磁極片真下の水面
と、該磁極片近傍の水面を同時あるいは時系列的に照射
することによって行われる。

さらに、本発明の第１の発明の別の変形例に従うと、前
記第２工程が細管状の検体容器を用いて行われ、該検体
容器の定められた１点の磁界が最大であって、該磁界の
最大点に向かって磁界が増大するように構成されている
磁石により誘導・濃縮がなされ、磁界が最大になる該検
体容器部と、その近傍の該検体容器を同時あるいは時系
列的に照射することによって行われる。

前記検出工程において該検体からの出射光として、散乱
光、透過光、反射光、干渉光および回折光のいずれを選
んでもよい。

また、前記検出工程において、レーザ光を２つに分解す
ることにより同時照射を行なうことができる。

さらに、前記検出工程において、レーザ光を前記濃縮位
置と非濃縮位置の間で走査することにより時系列的照射
を行なうこともできる。

レーザ光を２分割する場合も走査する場合も、従来光学
測定でよく用いられている２ビーム法による検出感度向
上が可能である。すなわち、光源のゆらぎ、空気中の散
乱物あるいは溶液中の不純物等による検体と無関係な信
号雑音が除去できる。

この場合、レーザの走査周波数に同期した出射光を選択
的に検出することによって検体の定量を行なえば検出感
度を向上させることができる。

本発明の第２の発明に従うと、磁性体微粒子によって標
識された検体を収容する検体容器と、該検体容器内の１
点に磁性体標識検体複合体を誘導・濃縮する機構と、レ
ーザ光線を該検体容器内の該磁性体標識体が誘導・濃縮
された１点と、その１点以外の計２箇所に導くための機
構を有する入射光学系と、その検体容器内の前記２箇所
からのレーザ散乱あるいは透過あるいは反射あるいは干
渉光あるいは回折光を受光する光学系と、を少なくとも
含むレーザ磁気免疫測定装置であって、傾斜磁場発生装
置と、ビームスプリッターあるいは偏向器を具備してな
ることを特徴とするレーザ磁気免疫測定装置が提供され
る。

この際、ビームスプリッタ又はレーザ光線を空間操作す
る偏向器は、レーザ光源と検体容器の間に設置すること
が望ましい。

本発明の第２の発明の好ましい変形例に従うと傾斜磁場
発生装置が、永久磁石又は電磁石と、該永久磁石又は電
磁石に対向して前記検体容器を挟むように設置された磁
極片とから構成されている。

また、本発明の第２の発明の別の変形例に従うと、前記
検体容器または前記永久磁石又は電磁石と、前記磁極片
のいずれかが、水平面内で移動可能となるように構成さ
れている。

磁性体標識検体複合体を外部磁力により溶液内部で駆動
する方法を採った場合、溶液の粘性抵抗のため外部磁力
への追従は自ずから限度がある。従って、S/N比を向上
させる目的で、該磁性体標識検体複合体からの出射光あ
るいは透過あるいは反射あるいは干渉光を繰返し加算・
平均化処理する場合、測定時間がかかる問題があった
が、本発明においては磁性体標識検体複合体からの信号
に妨害となる検体以外からのバックグラウンド雑音を排
除し得るので、短時間で高S/N比の測定が可能となる。

なお、本発明に用いられる磁性微粒子が放射線あるいは
毒性等の問題を有しないことはいうまでもなく、これを
利用することに格別の制約はない。また、磁性体微粒子
には、マグネタイトやγ−フェライト等の各種化合物磁
性体あるいは鉄、コバルト等の金属磁性体等種々の材料
によるものがあり、検体に対して安定な標識物質を容易
に選択することができる。

本発明では、標識物質が磁性体であることを利用して、
標識物質、検体あるいは抗原抗体複合物質を磁力によっ
て選択的に操作することが出来る。即ち、未反応の磁性
体標識体を検体から分離除去したり、磁性標識体との抗
原抗体複合体を特定の位置に誘導しあるいは濃縮するこ
とが容易である。

これら本発明によれば、同じレーザ光を利用しながら、
AFPを利用した方法の限界を突破することが出来る。ま
た、このような構成は、単に検出感度の向上に寄与する
のみならず測定の自動化をも極めて容易にする。

以下に図面を参照して本発明をより具体的に詳述する
が、以下に示すものは本発明の一実施例に過ぎず、本発
明の技術的範囲を何等制限するものではない。

〔実施例１〕 第１図は本発明のレーザ磁気免疫測定装置の一例を示す
ものである。

図中符号１は検体容器、２は磁性体標識検体複合体、３
は傾斜磁界発生装置、４はレーザ光源、５はビームスプ
リッタ、6a及び6bは分割レーザ光線、7a及び7bは透過光
または回折光、8a及び8bはNDフィルタ、9a及び9bはフォ
トダイオード、10a及び10bは散乱光束、11a及び11bはス
リット、12a及び12bは集光レンズ、13a及び13bは光電子
増倍管、14a及び14bは電子回路である。

垂直に配設された透明ガラスからなるシリンダ状の検体
容器１には、検体と磁性体標識体との間で抗原抗体反応
を行なった後の磁性体標識検体複合体２が収容されてい
る。検体の調製方法には、先に本発明者らが出願した特
願昭61−224567、61−254164に記載の方法を適用でき
る。傾斜磁界発生装置３は鋭利な先端形状をもつ一対の
希土類磁石3a,3aを前記検体容器を挟むように、対向し
て設置してなるものである。該磁石3a,3aの先端部の検
体容器側面の磁界が最も高いために、磁性体標識検体複
合体２はこの位置に誘導・濃縮される。なお、磁界発生
装置には、先に本発明者らが出願した特願昭62−152791
に記載の電磁石を用いることもできる。

また、検体容器１の側方には、He−Neレーザ光源４と該
光源４から出射されるレーザ光を二つに分割するビーム
スプリッタ５とが検体容器１に関し一方の側に適当な入
射角度を成すように設置されており、他方の側にはそれ
ぞれの分割レーザ光6a,6bに対応する透過光または回折
光を検知するためのフォトダイオード9a,9bが配設され
ている。又、別の位置にはスリット11a,11bと集光レン
ズ12a,12bと光電子増倍管13a,13bとから成る散乱光に対
する二つの受光系がそれぞれ分割された入射光に対して
配置されている。散乱光受光系は好ましくは入射系に対
して直角の散乱光を受光できるように配置されている。
二つのフォトダイオード9a,9bおよび光電子増倍管13a,1
3bは得られた出射信号の処理をするための電子回路14b,
14aにそれぞれ接続されている。

レーザ光源４からのレーザ光は、ビームスプリッタ５を
経て二つに分割されそれぞれ検体容器１の管壁を通して
磁性体標識検体複合体を含有する液体に入射される。な
お、入射光はシリンダ状の検体容器１の軸方向に直角に
入射されるのが好ましい。一方の分割レーザ光6aは傾斜
磁界発生装置３により吸い寄せられて検体容器１内の最
大磁界点の近傍に集合した磁性体標識検体複合体の存在
する濃縮位置を通過して透過光または回折光として出射
される。また、他方の分割レーザ光6bは磁性体標識検体
複合体の存在しない非濃縮位置を通過して透過光または
回折光として出射される。これらの出射光はNDフィルタ
8a,8bで適当に減光調節された後、フォトダイオード9a,
9bで受光され、電子回路14bによって信号の差分が検出
される。

また、磁性体標識検体複合体の粒径が大きい場合、分割
レーザ光線6aは回折されるので、回折光線を検出する方
法を用いることもできる。さらに、透過光、回折光を検
出する方法の他に、前記濃縮位置及び非濃縮位置からの
散乱光を用いることもできる。散乱光測定の場合は、一
方の分割レーザ光線6aは濃縮位置で散乱され、他方の分
割レーザ光線6bは非濃縮位置で散乱されてそれぞれ散乱
光束10a,10bとして出射され、これら散乱光束10a,10bス
リット11a,11b及び集光レンズ12a,12bによって光電子増
倍管13a,13bに導かれ、電子回路14aによって信号の差分
が検出される。

なお、レーザ光源としては、He−Neに限られるものでは
なく、He−Cdレーザのように波長の短いものを用いれ
ば、磁性体標識検体複合体が小さなものの検出には感度
が向上するため、特に有効である。

本実施例ではピコグラムオーダーの極微量な検体を瞬時
に検出することかできた。

〔実施例２〕 第２図は本発明のレーザ磁気免疫測定装置の他の例を示
すものである。

3aは電磁石、3bは磁極片、８はNDフィルタ、９はフォト
ダイオード、10は散乱光束、11はスリット、12は集光レ
ンズ、13は光電子増倍管、15は偏向器である。

上方に開口を有する検体容器１内には磁性体標識検体複
合体２が収容されている。そしてこの検体容器１は電磁
石（または永久磁石）3aの上に直接または台を介して水
平方向移動可能に載置されており、検体容器１の真上に
は磁性体標識検体複合体２を誘導・濃縮するための磁極
片3cが載置されている。この磁極片3cはその先端が鋭利
な形状となっていることから、上記電磁石3bからでた磁
束が磁極片3bの先端に集中するようになっている。従っ
て、該磁極片3b真下の水面の磁界が最も高く、この部分
に磁性体標識検体複合体２が濃縮される。

上記のような磁極片3cと上記電磁石3bとは傾斜磁界発生
装置３を構成している。なお、この装置３は、この例に
限定されることなく、電磁石の代わりに例えば希土類磁
石を用いた構成であってもよい。

また、検体容器１の上方には、例えばHe−Neレーザ光源
４と該光源４から出射されるレーザ光6a,6bの方向を変
えるTeO₂を用いた音響光学素子からなる偏向器15とが磁
極片3cに関し一方の側に適当な入射角度を成すように設
置されており、他方の側には反射光、干渉光、または回
折光を検知するためのフォトダイオード９が配置されて
いる。又、別の位置には散乱光に対するスリット11と集
光レンズ12と光電子増倍管13とからなる受光系が配置さ
れている。なお、散乱光が微弱である場合は、フォトカ
ウンティング型の光電子増倍管を用いるのがよい。

レーザ光源４からの入射光6a,6bは偏向器15を経て検体
容器１の液面に対してそれぞれ30°の角度で磁極片3cの
真下またはその近傍の水面に入射せしめられ、磁極片3c
により吸い寄せられて水面近傍に集合した磁性体標識検
体複合体２の存在する領域で散乱光、反射光、干渉光ま
たは回折光として出射される。これら出射光はフォトダ
イオード９または光電子増倍管13で検知される。この場
合、レーザ光は偏向器15により偏向されて液面上を走査
され磁性体標識検体複合体２の密に集合した濃縮位置と
磁性体標識検体複合体２が存在しない非濃縮位置との間
を経時的に照射するとによって、該濃縮位置と非濃縮位
置からの出射光信号はそれぞれフォトダイオード９また
は光電子増倍管13により検知された該濃縮位置からの信
号と該非濃縮位置からの信号との差分が公知の手段によ
り検出される。なお、反射光、干渉光を検出する方法の
他に、散乱光を検出する方法も適用できる。この場合
は、濃縮された磁性体標識検体複合体及び磁性体標識検
体複合体の存在しない水面からの反射光を時系列的に１
台の光電子増倍管13によって検出する方法が適用でき
る。

実施例１と同様に、本実施例においてもピコグラムオー
ダーの極微量な検体を１秒以内の瞬時に検出することか
できた。

この例のレーザ磁気免疫測定装置を用いて、磁性超微粒
子を標識したインフルエンザウイルスの検出を試みた結
果、従来の酵素免疫測定法（EIA）の場合、１億個程度
ウイルスが存在しなければ検出できなかったのに対し
て、本発明の方法では10個程度のウイルスでも検出する
ことが明らかになった。

〔発明の効果〕

以上詳述のように、本発明に従うレーザ磁気免疫測定方
法及び装置によれば、標識物質として磁性微粒子を用い
た場合に最も特徴を発揮でき、極めて短時間のうちにRI
A法に匹敵する超高感度な抗原抗体反応検査を実施出来
る。従って、従来は限定された施設でRIA法によらなけ
れば実施できなかった精密な測定を、一般的な環状で広
く実施することが可能となる。例えば集団検診等のよう
な一般的な状況で、各種のウイルス、癌等のスクリーニ
ング検査等の精密な測定が広く実施できれば、癌あるい
はウイルス性疾患等の早期診断が可能となり、有効な早
期治療を的確に実施することが可能となる。また、本発
明に従うレーザ磁気免疫測定方法及び装置は、抗原抗体
反応のみに止まらず、従来RIA法が適用されていたペプ
チドホルモン等の種々のホルモンあるいは種々の酵素、
ビタミン、薬剤などの測定にも応用することも可能であ
る。このように、本発明が医学・医療の分野で果たすこ
とは計り知れない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のレーザ磁気免疫測定装置の一例を示
す概略構成図、第２図は、本発明のレーザ磁気免疫測定
装置の他の例を示す概略構成図である。 １……検体容器、２……磁性体標識検体複合体、３……
傾斜磁界発生装置、４……レーザ光源、５……ビームス
プリッタ、6a及び6b……分割レーザ線、7a及び7b……透
過光または回折光、8a及び8b……NDフィルタ、9a及び9b
……フォトダイオード、10a及び10b……散乱光束、11a
及び11b……スリット、12a及び12b……集光レンズ、13a
及び13b……光電子増倍管、14a及び14b……電子回路、1
5……偏向器。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】所定の抗原あるいは抗体に磁性体微粒子を
   標識として付加した磁性体標識体と、検体たる抗体ある
   いは抗原とを抗原抗体反応させる第１工程と、該第１工
   程後の磁性体標識体と検体との複合体である磁性体標識
   検体複合体を含む溶液に磁界を作用させて該磁性体標識
   検体複合体を定められた位置に誘導・濃縮させる第２の
   工程とを少なくとも含む、レーザ磁気免疫測定方法にお
   いて、 磁性体標識検体複合体の存在する前記濃縮位置と、該磁
   性体標識検体複合体が存在しない溶液部の非濃縮位置に
   レーザ光を同時あるいは時系列的に照射し、受光した該
   濃縮位置からの出射光と該非濃縮位置からの出射光との
   差分を検出することを特徴とするレーザ磁気免疫測定方
   法。
2. 【請求項２】前記第２工程が上方に開口を有する検体容
   器を用いて行われ、該検体容器の下方に置かれた磁石と
   該磁石に対向して該検体容器の水面真上に置かれた磁極
   片によって誘導・濃縮がなされ、前記検出工程が該磁極
   片真下の液面と、該磁極片近傍の液面を同時あるいは時
   系列的に照射することによって行われることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載のレーザ磁気免疫測定方
   法。
3. 【請求項３】前記第２工程が細管状の検体容器を用いて
   行われ、該検体容器の定められた１点の磁界が最大であ
   って、該磁界の最大点に向かって磁界が増大するように
   構成されている磁石により誘導・濃縮がなされ、磁界が
   最大になる該検体容器部と、その近傍の該検体容器を同
   時あるいは時系列的に照射することによって行われるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のレーザ磁気
   免疫測定方法。
4. 【請求項４】前記検出工程が該検出体からの散乱光又は
   透過光又は反射光又は干渉光又は回折光を検出すること
   によりなされることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載のレーザ磁気免疫測定方法。
5. 【請求項５】前記検出工程において、レーザ光を２つに
   分割することにより同時照射がなされることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載のレーザ磁気免疫測定方
   法。
6. 【請求項６】前記検出工程において、レーザ光線を前記
   濃縮位置と非濃縮位置の間で走査することにより時系列
   的照射がなされることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載のレーザ磁気免疫測定方法。
7. 【請求項７】前記検出工程において、検体の定量がレー
   ザ光の走査周波数に同期した信号を選択的に検出するこ
   とによってなされることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載のレーザ磁気免疫測定方法。
8. 【請求項８】磁性体超微粒子によって標識された検体を
   収容する検体容器と、該検体容器内の１点に磁性体標識
   体を誘導・濃縮する機構と、レーザ光線を該検体容器内
   の該磁性体標識体が誘導・濃縮された１点と前記１点以
   外の計２箇所に導くための機構を有する入射光学系と、
   該検体容器内の前記２箇所からの出射光を受光する光学
   系と、を少なくとも含むレーザ磁気免疫測定装置であっ
   て、 傾斜磁場発生装置と、ビームスプリッターあるいは偏向
   器を具備してなることを特徴とするレーザ磁気免疫測定
   装置。
9. 【請求項９】該レーザ光源と該検体容器の間にビームス
   プリッタを設置したことを特徴とする特許請求の範囲第
   ８項記載のレーザ磁気免疫測定装置。
10. 【請求項１０】該レーザ光源と該検体容器の間にレーザ
    光線を空間操作する偏向器を設置したことを特徴とする
    特許請求の範囲第８項記載のレーザ磁気免疫測定装置。
11. 【請求項１１】前記傾斜磁場発生装置が、永久磁石又は
    電磁石と、該永久磁石又は電磁石に対向して前記検体容
    器を挟むように設置された磁極片とから構成されている
    ことを特徴とする特許請求の範囲第８項ないし第10項の
    いずれかに記載のレーザ磁気免疫測定装置。
12. 【請求項１２】前記検体容器または前記永久磁石又は電
    磁石と、前記磁極片のいずれかが、水平面内で移動可能
    とされたことを特徴とする特許請求の範囲第８項ないし
    第10項のいずれかに記載のレーザ磁気免疫測定装置。