JPH0710901A - 多糖体ｍ−１００物質群およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 コレトトリクム（Colletotrichum）属に属す
る糸状菌の菌体から、β−１，３−グルカナーゼの一般
的な単離法によって得られ、β−１，３−グルカナーゼ
処理によって失活し、植物病原菌に対する植物体自体の
抵抗性を発現させるための有用な新規物質多糖体Ｍ−１
００物質群であり、たとえば、コレトトリクム・フラガ
リエ（Colletotrichum fragariae）Ｍ６０１３（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２６２５）のようなコレトトリクム属に属す
る糸状菌を使用する多糖体Ｍ−１００物質群の製造法で
ある。 【効果】 多糖体Ｍ−１００物質群は、この多糖体Ｍ−
１００物質群を植物に接触せしめることにより、植物が
病原菌と接触する前に、植物体は病原体に対する抵抗性
を発現せしめられ、これにより植物は発病に至ることな
く、病原体に対する植物の抵抗性を増加させるエリシタ
ー様活性効果を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物、例えば、トマト
の病原体に対する抵抗性反応である少なくともキチナー
ゼおよび過敏感反応を誘導する分子量７５００から１３
０００に包含される多糖体Ｍ−１００物質群とその製造
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】病原体の植物への感染を防ぐために、一
般に殺菌剤の散布が行われる。一方、植物は病原体の侵
入に対して、これを識別して、ファイトアレキシン等の
抗菌性物質を合成して自己防衛する。このような抵抗性
反応を誘導する物質はエリシター（植物細胞工学、第２
巻、補１、第３９９頁、１９９０年）と呼ばれる。植物
自身のもつ抵抗性を利用する病害防除法としては、病原
体の一部を用いて、植物に疑似感染させることにより抵
抗性を誘導する方法が知られている（北日本病虫研報、
第３８巻、第１０頁、１９８７年）が、弱毒ウイルスの
場合（植物防疫、第４３巻、第１号、第１１頁、１９８
９年）以外は実用化されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一般に行なわれている
農薬散布による病害防除は、作物に残留した農薬による
人体への影響、環境に対する汚染等、安全性に関する問
題が多い。さらに、農薬の効果の面でも、いったん病原
体が植物に侵入してしまうと、農薬はもはや殺菌効果を
発揮できないという問題点がある。

【０００４】植物が認識できる病原体の多糖成分を単離
し、これを植物に散布して疑似感染を起こさせることに
より、植物の病原体に対する抵抗性反応を発現させる。
多糖成分は、容易に分解されるため、人体、環境に対す
る汚染の心配がない。さらに、多糖は植物に情報伝達物
質として作用し、植物細胞はこれを認識して抗菌性物質
を合成するため、植物に侵入した病原体に対して増殖を
阻止する（植物細胞工学、第２巻、補１、３９９頁、１
９９０年）ものであるが、本発明の多糖体Ｍ−１００物
質群はこのような知見に基づいて、新規に検索されたも
のである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は新規物資である
多糖体Ｍ−１００物質群であり、植物病原体に対する植
物体自体が持っている抵抗性反応を誘導する活性をも
ち、たとえば、コレトトリクム・フラガリエ Ｍ６０１
３（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６２５；Colletotrichumfragar
iae Ｍ６０１３）の菌体成分であり、β−１，３−グ
ルカンの一般的単離法で得られ、かつ、β−１，３−グ
ルカナーゼ処理によって失活する、少なくともキチナー
ゼ活性を誘導する分子量７５００から１３０００に包含
される多糖体Ｍ−１００物質群であり、コレトトリクム
属に属し、多糖体Ｍ−１００物質群を生産する能力を有
する微生物を使用する多糖体Ｍ−１００物質群の製造法
である。

【０００６】本発明において使用される微生物は、多糖
体Ｍ−１００物質群を生産する能力を有するコレクトト
リクム属に属する糸状菌であり、その代表的な菌株とし
て、たとえば、コレトトリクム・フラガリエ（Colletot
richum fragariae）Ｍ６０１３が挙げられる。この菌株
は微工研菌寄第１２６２５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６２
５）として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。この菌学的性質を次に示す。 ・各培地における生育状態 １．ツァペック寒天平板培地（Cz） 25℃の場合には、生育はやや速く、コロニーの大きさは
７日間で直径40-43mm、14日間で直径60mm以上となる。
菌叢は厚く、表面は気中菌糸により綿毛状となる。コロ
ニーの色は淡灰色−灰色 pale grey-grey(1-3B1)。周辺
部は全縁。無色の浸出液を出す。拡散性色素は出さな
い。裏面は灰色、緑灰色もしくは暗緑色grey,greenish
grey or dark green（28-30F1-3）。 ２．麦芽汁寒天平板培地（MA） 25℃の場合には、生育はやや速く、コロニーの大きさは
７日間で直径40-45mm、14日間で直径60mm以上となる。
菌叢はツァペック寒天平板培地の場合よりやや厚く、や
やきめの細かい綿毛状となる。コロニーの色は黄灰色 y
ellowish grey(2BC-2)。無色の浸出液を出す。拡散性
色素は出さない。凸レンズ型。周囲はほぼ全縁。裏面は
黄灰色−灰黄色 yellowish grey-greyish yellow（2B2-
3）。 ３．バレイショ−ブドウ糖寒天平板培地（PAG） 25℃の場合には、生育はやや速く、コロニーの大きさは
７日間で直径42-44mm、14日間で直径60mm以上となる。
表面は気中菌糸により綿毛状からややベルベット状とな
る。コロニーの色は緑灰色−黄灰色 greenish grey-yel
lowish grey(1-3C2)。無色の浸出液を出す。拡散性色素
は出さない。裏面は黄灰色。

【０００７】・顕微鏡下における形態的特徴 分生子形成様式はフィアロフォア型、菌糸から直接単一
の分生子形成細胞を生ずる。分生子形成細胞は短く、分
布はまばら。分生子は形成細胞の先端に粘塊状に生ず
る。分生子は大きさ 12-22×4-6μm。細い円筒型で両端
が丸いもの、細い楕円形および卵型のものが見られ、無
色で、表面は滑壁である。発芽前には僅かに褐色を呈し
て１隔壁を生ずるが、時として、２隔壁を生ずるものも
ある。褐色で円形に近い、もしくは不規則な大きさ 7-1
2×6-10μm の付着器を菌糸から直接または菌糸の先端
に生じたり、側枝状に生じたりする。分生子座またはそ
れに伴う剛毛、子のう殻は形成されなかった。なお、前
記の各培地における生育状態の色の表示は、Kornerup,
A. and Wanscher,J.H. 1978.“Methuen handbook of co
lour. 3rd ed.”Eyre Methuen, Londonの表示に準拠し
た。

【０００８】・生理的諸性状 生育し得るpH ：3.5-7.5 最適生育pH ：4.5-6.5 生育し得る温度 ：13-37℃ 最適生育温度 ：21-30℃

【０００９】・同定 イチゴから分離されたＭ６０１３株は、分生子の形、付
着器を有するなどの形態的特徴からコレトトリクム属 C
olletotrichumに属する微生物であると考えられた。本
菌株を詳細に観察した結果、「山本 勉，イチゴの新病
害『炭そ病』，植物防疫 第25巻，第61-64頁，1971」
および「岡山 健夫，イチゴ炭そ病の病原菌と発生形
態，植物防疫 第42巻，第559-563頁，1988」によって
報告されているコレトトリクム・フラガリエ（Colletot
richum fragariae）と一致した。よって、本菌株は、C.
fragariaeと考えられた。“von Arx ,J.A. Die Arten d
er Gattung Colletotrichum Corda. Phytopathol. Z. 2
9：413-468.1957”,“von Arx.J.A. Plant Pathogenic
Fungi, J.CRAMER, Berlin. 288p,1987”は子のう菌類で
ある Glomerella cingulataの不完全世代を C.gloeospo
rioidesとし C.fragariaeはシノニム（異名）として扱
っている。一方、“Howard,C.M. and Albregts,E.E. Bl
ack Leaf Spot Phase of Strawberry Anthracnose Caus
ed by Colletotr ichum gloeosporioides（C.fragaria
e）， Plant disease.67：1144-1146,1983”によると
C.gloeosporioidesは培養中に子のう殻を形成する（子
のう菌類である。）が、 C.fragariaeは培養中に子のう
殻を形成しない（不完全菌である。）とし、区別できる
としている。なお、本菌株は子のう殻の形成が認められ
ていない。以上のように、形態的特徴が一致し、子のう
殻を形成せず、イチゴから分離されたことなどから、
“Howard,C.M. and Albregts,E.E. Black Leaf Spot Ph
ase of Strawberry Anthracnose Caused by Colletotri
chum gloeospirioides（C.fragariae）. Plant diseas
e.67：1144-1146,1983”に倣い、本菌株をコレトトリク
ム・フラガリエ Colletotrichum fragariaeと同定し
た。ただし、子のう殻の形成が認められたときには、 C
olletotrichum gloeosporioidesとされるべきである。

【００１０】本発明で使用される微生物を培養するため
の培地成分は、該微生物が利用できる物質であればよ
く、特に制限はないが、培地成分の代表例は次の如くで
ある。すなわち、炭素源としては、澱粉、デキストリン
およびグルコース、好ましくは可溶性澱粉である。窒素
源としては、カゼインおよびペプトン、好ましくは酵母
エキスである。無機塩類としては、リン酸塩およびマグ
ネシウム塩、好ましくはリン酸２カリウムおよび硫酸マ
グネシウムである。培地には、消泡剤を添加することが
でき、かつ、好ましい。消泡剤として、たとえば、ジス
フォームＣＣー２２２などが好適に使用される。本発明
における培地の代表的な培地組成は、培地１リットル当
り、たとえば、次の如くである。すなわち、 可溶性澱粉 1.5-150g、好ましくは 15g 酵母エキス 0.5-50g、好ましくは 5g リン酸１カリウム 0.1-10g、好ましくは 1g 硫酸マグネシウム 0.05-5g、好ましくは 0.5g ジスフォームＣＣ−２２２ 0.1-100ml、好ましくは 0.
4ml この培地は塩酸で pH6.0に補正される。このような培地
で、微生物を２０〜４０℃、好ましくは３０℃で５日
間、通気攪拌培養すれば菌体を含有する培養液が得られ
る。本発明の多糖体Ｍ−１００物質群はこのようにして
得られた菌体から、たとえば、β-1,3-グルカナーゼを
単離、精製する一般的な方法により、分離、精製するこ
とができる。たとえば、次のようにして分離、精製され
る。すなわち、菌体の懸濁液をホモゲナイズし、これを
熱水抽出し、Dowex-1等の強塩基性陰イオン交換樹脂
に、pH１０以上のアルカリ性で吸着させ、５０mMＮａＣ
ｌ等の塩類で溶出させる。さらに、分画分子量３０００
の限外濾過膜による濃縮区分を集め、ゲル濾過により分
子量７５００〜１３０００の各成分を得、少なくとも強
いキチナーゼ活性誘導の活性を示す一群の新規物質を得
た。

【００１１】本発明の多糖体Ｍ−１００物質群を植物に
接触させることにより、病原体に対する植物の抵抗性を
増大させることが可能である。本発明の多糖体Ｍ−１０
０物質群を植物に接触させる手段には、特に制限はな
く、たとえば、種子への塗布、該物質溶液への種子の浸
漬、葉面への散布、栽培土壌への添加、水耕栽培におけ
る液体肥料への添加およびウイルス・フリー苗の馴化培
地への添加などが可能である。

【００１２】

【実施例】本発明を、実施例によりさらに具体的に説明
する。なお、本発明は、これらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１ 培養 生産菌株コレトトリクム・フラガリエ Ｍ６０１３（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２６２５ Colletotrichum fragariae Ｍ
６０１３）を、可溶性澱粉１５g／リットル、酵母エキ
ス５g／リットル、リン酸１カリウム１g／リットル、硫
酸マグネシウム０．５g／リットル（ｐＨ６．０）の組
成の培地１５０mlを分注した５００ml容三角フラスコで
３０℃、３日間培養したものを種菌とし、種菌１０ml／
リットル、種菌用培地に消泡剤としてジスフォームＣＣ
−２２２（日本油脂製）０．２ml／リットルを加えた培
地４０リットルを充填した５０リットル容ジャーファー
メンターで、３０℃で通気１１リットル／分、撹拌１０
０ｒｐｍの条件で４〜５日間培養し、バスケット遠心で
１．３kgの菌体を得た。

【００１３】実施例２ 製造 １．３kgの菌体を４リットルのアセトンで２回、４リッ
トルのクロロホルム−メタノール（１：１混合物）で２
回処理することにより菌体から脱脂し、９リットルの蒸
留水に懸濁し、ポリトロン・ホモジナイザー（KINEMATI
CA製）で粉砕後、１２０℃、３０分間加熱抽出し、３０
００ｒｐｍ，５分間遠心により粗抽出液を得た。この粗
抽出液を限外濾過（孔径０．２５μm、旭化成製ポリオ
レフィン膜）で白濁粒子を除き、１０mMとなるようにグ
リシンを加えＮａＯＨでpH８に補正後、２０mMのグリシ
ンーＮａＯＨバッファー（pH８．０）で平衡化したDowe
x-1 カラム（内径４４mm）を通過させることにより蛋白
等の不用成分を除去した。この通過液にさらにＮａＯＨ
を加えpH１０．５に補正し、２０mMのグリシン−ＮａＯ
Ｈバッファー（pH１０．５）で平衡化した Dowex-1 カ
ラム（内径４４mm）に活性成分を吸着させ、水洗後、５
０mMＮａＣｌで溶出した分画２〜４（１分画９９９９
滴）を限外濾過（孔径０．２５μ、旭化成製ポリオレフ
ィン膜）により白濁粒子を除き、さらに限外濾過（分画
分子量３０００、旭化成製ポリアクリルニトリル膜）に
より脱塩濃縮した活性画分８８mgを得た。活性画分から
活性成分を単離するために Bio-Gel A-5m（カラム内径
３２mm、１分画１０００滴）（図３）のフラクションＮ
ｏ．２５〜３０を回収し、さらにBio-Gel P-30（カラム
内径３２mm、１分画２５０滴）（図４）によるゲル濾過
を行ってフラクションＮｏ．８、Ｎｏ．９およびＮｏ．
１０を回収した。まず、このフラクションＮｏ．１０か
ら減圧乾固して分子量７６５０付近の多糖体（多糖体Ｍ
−１００−１）１５mgを得、次いでフラクションＮｏ．
９から減圧乾固して分子量１００００付近の多糖体（多
糖体Ｍ−１００−２）２２mgを得、さらにフラクション
Ｎｏ．８から減圧乾固して分子量１３０００付近の多糖
体（多糖体Ｍ−１００−３）３２mgを得た。これらの多
糖体は下記の理化学的性状を有し、強いキチナーゼ活性
誘導の活性を示す各ピーク成分である多糖体Ｍ−１００
物質群として得た。各分画はフェノール硫酸法により全
糖量を測定し、その各ピークについて実施例３に示す方
法にて活性を測定した。

【００１４】理化学的性状 分子量：７５００〜１３０００に包含される。 Asahipak GS-510 によるゲル濾過高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ、移動相：水、分子量標準：プルラン
（昭和電工））により測定。 各ピーク成分の上記ＨＰＬＣでのリテンション・タイム フラクションＮｏ．８：分子量１３０００付近：リテン
ション・タイム１６．００分間。 フラクションＮｏ．９：分子量１００００付近：リテン
ション・タイム１６．４３分間。 フラクションＮｏ．１０：分子量７６５０付近：リテン
ション・タイム１６．８７分間。 構成糖：各フラクションからの多糖体Ｍ−１００物質群
のいずれもグルコースが１００％である。 1.2N ＨＣｌ、８０℃、２４時間の条件で加水分解を行
い、TOSOH Amide-80による高速液体クロマトグラフィー
（移動相：アセトニトリル−水 60:40）にて遊離グルコ
ースを測定することにより決定。 呈色反応 フェノール硫酸反応：陽性 Lowry 反応：陰性 Elson-Morgan 反応：陰性 カルバゾール硫酸反応：陰性 溶解性 水：可溶 エタノール：不溶 アセトン：不溶 クロロホルム：不溶 ベンゼン：不溶 酸性、中性、塩基性の区別：中性 物質の色：白色 IR吸収スペクトル：図１．（KBr）3400, 2950, 1670, 1
560, 1400および 1350cm^-1付近の各波数に吸収を示す。 UV吸収スペクトル：図２．特に特徴的なピークなし
（水：１mg/ml）

【００１５】実施例３ 作用 病原体の感染に対する植物の防御反応の指標としてキチ
ナーゼを用いて、本発明の多糖体Ｍ−１００物質群の作
用を測定した。すなわち、トマト種子（品種：桃太郎）
を蒸留水を含む脱脂綿上で、２６℃、１４日間放置し得
られた芽生えを、多糖体Ｍ−１００物質群の各成分の水
溶液に浸漬し、１８時間後に、下記の方法で、芽生え抽
出液のキチナーゼ活性を測定した。この結果、図５（多
糖体Ｍ−１００−１）、図６（多糖体Ｍ−１００−２）
および図７（多糖体Ｍ−１００−３）に示す通り、本発
明の多糖体Ｍ−１００物質群における、多糖体Ｍ−１０
０−１は２μg／ml以上、多糖体Ｍ−１００−２は４μg
／ml以上、多糖体Ｍ−１００−３は１０μg／ml以上の
濃度でトマト芽生えのキチナーゼ活性を誘導することが
認められた。なお、活性は次のようにして測定した。す
なわち、芽生えを水洗後、芽生え表面の水分を除き、−
１００℃、１時間凍結後、芽生えの重量（g）の４倍量
の酢酸緩衝液（０．２M、pH５．２、２．５％ ポリビニ
ルピロリドン，分子量４４０００、０．５％ポリエチレ
ングリコール，, 分子量６０００、０．０１％β-メル
カプトエタノールを含む）を加え、乳鉢中で破砕し、４
重のガーゼで絞り、１２０００×ｇ、１０分間遠心し、
その上清を粗酵素液とした。この粗酵素液０．１mlに
０．０５％ エチレングリコールキチン（シグマ）を含
む上記の酢酸緩衝液１mlを加え、２８℃、１５分間反応
後、０．５g／リットルのフェリシアン化カリウムを含
む０．５M炭酸ナトリウム溶液２mlを加え、１５分間煮
沸し、冷却後、ＯＤ４２０nmを測定した。ＯＤ値を１分
間に、０．１低下させる活性を１mUとする。活性は芽生
えの新鮮重量１００g当りに換算して表示する。

【００１６】実施例４ 作用 多糖体Ｍ−１００−１によって誘導される植物の防御反
応の他の指標として、個体中の一部の植物細胞が自ら合
成する抗菌性物質の過剰生産によって細胞致死をもたら
せることにより個体を防御する過敏感反応を測定した。
その結果、図８に示すように、多糖体Ｍ−１００−１は
１μg／ml以上の濃度で、過敏感反応を誘導することが
認められた。なお、活性は次のようにして測定した。す
なわち、トマト（品種：桃太郎）の芽生えから１mg／リ
ットルのナフタリン酢酸、０．５mg／リットルのベンジ
ルアデニン、０．５mg／リットルの２，４−Ｄ（２，４
−ジクロルフェノキシ酢酸）、０．７％寒天を含むリン
スマイヤー・スクーグ培地でカルス誘導し、得られたカ
ルスを寒天を含まない以外は同様の液体培地で２０日間
振とう培養し、培養液をナイロン篩（３２メッシュ）で
濾過して大きい細胞塊を除き、均一にカルスを分散した
培養液０．２５mlに、実施例２で得られた多糖体Ｍ−１
００−１を水で希釈した液０．２５mlを加え、２６℃、
３時間インキュベート後、基質としてＭＴＴ（3-(4,5-d
imethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium brom
ide）液０．０５mlを加え、さらに３０℃、２時間イン
キュベート後、０．０４Ｎ塩酸を含むイソプロピルアル
コール０．５mlを加えて、細胞中に生成した反応生成物
のフォルマザンを抽出し、これをＯＤ５７０nmで測定し
た。このフォルマザン生成は生細胞の指標となるもので
あり、過敏感反応は、無処理の細胞の生存率を１００％
とした相対的生存率で表示した。

【００１７】実施例５ 酵素分解 本物質の性状を調べるために、各種多糖の加水分解酵素
による分解を行い、反応生成物のトマト芽生えに対する
キチナーゼ誘導効果をみた。糖の加水分解酵素として
は、α−アミラーゼ（生化学工業製）、セルラーゼＴＣ
（生化学工業製）、β−１，３−グルカナーゼを含むザ
イモリエイス１００Ｔ（生化学工業製）を用いた。それ
ぞれ、１００μg／mlの本多糖体Ｍ−１００物質を基質
として、１０U／mlとなるように酵素及び、それを１０
分間沸騰水中で熱失活させたものを加え、pH６．０の１
０mMリン酸バッファー中で、４５℃、１時間反応させ
た。この反応液にトマト芽生えを浸漬し、実施例４に示
した方法に準拠して、トマト芽生えのキチナーゼ誘導効
果をみた。その結果、表１（多糖体Ｍ−１００−１）、
表２（多糖体Ｍ−１００−２）および表３（多糖体Ｍ−
１００−３）に示したように、本多糖体Ｍ−１００物質
群はいずれもβ−１，３−グルカナーゼを含むザイモリ
エイス１００Ｔ処理により失活することが認められた。

【００１８】 表１．多糖体Ｍ−１００−１に対する酵素分解による トマト芽生えのキチナーゼ誘導 キチナーゼ活性（U/100g) 添加酵素 反応生成物 熱失活酵素による反応生成物 − 33.7 36.4 α−アミラーゼ 31.7 29.0 セルラーゼＴＣ 33.4 37.6 ザイモリエイス１００Ｔ 0 31.3

【００１９】 表２．多糖体Ｍ−１００−２に対する酵素分解による トマト芽生えのキチナーゼ誘導 キチナーゼ活性（U/100g) 添加酵素 反応生成物 熱失活酵素による反応生成物 − 28.9 28.1 α−アミラーゼ 29.7 27.2 セルラーゼＴＣ 26.9 29.4 ザイモリエイス１００Ｔ 0 27.1

【００２０】 表３．多糖体Ｍ−１００−３に対する酵素分解による トマト芽生えのキチナーゼ誘導 キチナーゼ活性（U/100g) 添加酵素 反応生成物 熱失活酵素による反応生成物 ー 31.5 32.3 α−アミラーゼ 30.6 29.8 セルラーゼＴＣ 30.4 31.8 ザイモリエイス１００Ｔ 0 31.5

【００２１】実施例６ 新規性 いくつかのグルコースを構成成分とする多糖について、
実施例３に示す方法に準拠して、キチナーゼ誘導効果を
検討した。その結果、表４で示されるように、多糖体Ｍ
−１００物質以外は、キチナーゼ誘導効果を示さなかっ
た。

【００２２】 表４．各種多糖のトマト芽生えのキチナーゼ誘導に及ぼす効果 多糖（100μg/ml） 分子量 結合 キチナーゼ活性（U/100g） 無添加 0 プルラン R-5 （昭和電工） 5,800 α-1,6 0 アミロース Ex-1 （生化学工業） 2,900 α-1,4 0 ラミナリン（生化学工業） 1,153 β-1,3 0 多糖体Ｍ−１００−１ 7,650 β-1,3 32.5

【００２３】実施例７ 用途 イチゴ（品種：女峰）のウイルスフリー親株のランナー
より得られた子苗を、プラスワン（緑産製完熟堆肥、C/
N=6.6, N-P-K=1.4-0.6-0.06%）１５０g／１０リット
ル、ヨーグロス２号（東洋醸造製有機物資材、N-P-K=5-
2-3%）１５g／１０リットル、イチゴ配合肥料（静岡県
経済農業協同組合連合会製化成肥料、N-P-K=6-7-6%）１
３．５g／１０リットル、ロング１４０（旭化成工業製
遅効性化成肥料、N-P-K=13-3-11%）５g／１０リット
ル、ほう砂０．１５g／１０リットルの組成の培土を充
填した直径１０cmの育苗ポットに定植した。１株当り２
本の葉柄と６枚の葉をもつイチゴの苗を実験に用いた。
病原菌の感染方法は、植物体の地上部に、分生胞子を噴
霧することにより接種した。以下に詳細に実験方法を記
載する。すなわち、実施例２と同様の方法で得られた多
糖体Ｍ−１００−１を１０μg／mlの濃度に調整し、上
記の苗に１本当り１mlを噴霧した。炭そ病生菌コレトト
リクム・フラガリエ Ｍ６０１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１２
６２５）を、可溶性デンプン１５g／リットル、酵母エ
キス４g／リットル、K₂HPO₄ １g／リットル、MgSO₄・7a
q. ０．５g／リットル（pH６）の組成の培地１００mlを
５００ml容のフラスコに分注したものに接種し、２８
℃、５日間振とう培養したのち、ガーゼで濾過して菌糸
を除いて、分生胞子を１０⁶ ｃｆｕ／ml含むものを用い
た。このようにして調整した病原菌胞子液を、多糖体Ｍ
−１００−１を噴霧してから３日後に、イチゴ苗に１本
当り１mlを噴霧接種し、２日間は湿度１００％に保ち、
接種した胞子を発芽させた。その後の栽培は、ビニール
温室内で２０〜３５℃の温度範囲で、ポット中の土壌の
水分が最大容水量の８０％になるように毎日散水して行
なった。病原菌を接種してから１４日後の、発病状況を
調べた。発病状況の調査に当たっては、病徴の進行度合
を表わす発病指数を表５の通り設定し、実験に用いたす
べての葉および葉柄について発病指数を測定し、１枚の
葉および１本の葉柄当りの平均発病指数を求めた。この
平均発病指数より、 （無処理区発病指数−処理区発病指数）／無処理区発病
指数 を算出し、これを防除価とした。その結果、表６に示さ
れるように、多糖体Ｍ−１００−１の処理区と無処理区
の発病指数の間には高度の有意差がみられ、無処理区で
は大部分の苗が、炭疽病の発病により枯死に至るのに対
し、処理区では病徴の進行が抑えられた。

【００２４】 表５．イチゴ炭疽病の発病指数の設定 発病指数 葉 葉柄 １ 病斑数 １−１０ 小型病斑数１−２ ２ 病斑数１１−２０ 小型病斑数３−５ ３ 病斑数２１−３０ 小型病斑数６以上 ４ 病斑数３１以上 中−大型病斑の形成 ５ 大型病斑による葉のしおれ 大型病斑による葉柄折れ あるいは葉の萎凋

【００２５】 表６．多糖体Ｍ−１００−１による発病の抑制 調査部位 多糖体Ｍ−１００−１ 発病指数 防除価（％） 葉 無処理 3.7 0 処理 1.5 59 ** 葉柄 無処理 3.2 0 処理 1.2 63 ** （１区 10 株） **：累積カイ２乗検定で高度に有意差あり

【００２６】

【発明の効果】本発明の多糖体Ｍ−１００物質群は新規
な物質であり、この多糖体Ｍ−１００物質群を植物に接
触せしめることにより、植物は病原菌と接触する以前
に、病原体に対する抵抗性を発現させられることによっ
て、病原体が感染しても、あらかじめ存在するキチナー
ゼ等の抗菌性物質により、植物内で病原体が増殖でき
ず、発病に至らないもので、植物の病原体に対する抵抗
性を増加させるエリシター様活性効果を示すものであ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の多糖体Ｍ−１００物質群のＩＲ吸収ス
ペクトルである。

【図２】本発明の多糖体Ｍ−１００物質群のＵＶ吸収ス
ペクトルである。

【図３】コレトトリクム・フラガリエ Ｍ−６０１３の
菌体成分からＢｉｏ−ＧｅｌＡ−５ｍによるゲル濾過に
より得られたフラクション中の多糖体Ｍ−１００物質群
の含有量を示す。

【図４】コレトトリクム・フラガリエ Ｍ−６０１３の
菌体成分からＢｉｏ−ＧｅｌＰ−３０によるゲル濾過に
より得られたフラクション中の多糖体Ｍ−１００物質群
の含有量を示す。

【図５】トマト種子芽生えのキチナーゼ活性誘導におよ
ぼす多糖体Ｍ−１００−１の影響を示す。

【図６】トマト種子芽生えのキチナーゼ活性誘導におよ
ぼす多糖体Ｍ−１００−２の影響を示す。

【図７】トマト種子芽生えのキチナーゼ活性誘導におよ
ぼす多糖体Ｍ−１００−３の影響を示す。

【図８】トマトの培養細胞におよぼす多糖体Ｍ−１００
−１の影響を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性状を有することを特徴
   とする多糖体Ｍ−１００物質群。 分子量：７５００から１３０００ Asahipak GS-510 によるゲル濾過高速液体クロマトグラ
   フィー（移動相：水、分子量標準：プルラン（昭和電
   工））により測定。 作用：少なくともキチナーゼ活性誘導活性を有する。 構成糖：グルコースが１００％ 1.2N ＨＣｌ、８０℃、２４時間の条件で加水分解を行
   い、TOSOH Amide-80による高速液体クロマトグラフィー
   （移動相：アセトニトリル−水 60:40）にて遊離グルコ
   ースを測定することにより決定。 呈色反応 フェノール硫酸反応：陽性 Lowry 反応：陰性 Elson-Morgan 反応：陰性 カルバゾール硫酸反応：陰性 溶解性 水：可溶、エタノール、アセトン、クロロホルム、ベン
   ゼン：不溶 酸性、中性、塩基性の区別：中性 物質の色：白色 IR吸収スペクトル：図１．（KBr）3400, 2950, 1670,
   1560, 1400および 1350cm^-1付近の各波数に吸収を示
   す。 UV吸収スペクトル：図２．特に特徴的なピークなし
   （水：１mg/ml）
2. 【請求項２】 コレトトリクム属に属する下記の理化学
   的性状を有する多糖体Ｍ−１００物質群生産菌を培地に
   培養し、次いで培養物から該多糖体Ｍ−１００物質群を
   採取することを特徴とする該多糖体Ｍ−１００物質群の
   製造法。 分子量：７５００から１３０００ Asahipak GS-510 によるゲル濾過高速液体クロマトグラ
   フィー（移動相：水、分子量標準：プルラン（昭和電
   工））により測定。 作用：少なくともキチナーゼ活性誘導活性を有する。 構成糖：グルコースが１００％ 1.2N ＨＣｌ、８０℃、２４時間の条件で加水分解を行
   い、TOSOH Amide-80による高速液体クロマトグラフィー
   （移動相：アセトニトリル−水 60:40）にて遊離グルコ
   ースを測定することにより決定。 呈色反応 フェノール硫酸反応：陽性 Lowry 反応：陰性 Elson-Morgan 反応：陰性 カルバゾール硫酸反応：陰性 溶解性 水：可溶、エタノール、アセトン、クロロホルム、ベン
   ゼン：不溶 酸性、中性、塩基性の区別：中性 物質の色：白色 IR吸収スペクトル：図１．（KBr）3400, 2950, 1670,
   1560, 1400および1350cm^-1付近の各波数に吸収を示
   す。 UV吸収スペクトル：図２．特に特徴的なピークなし
   （水：１mg/ml）
3. 【請求項３】 コレトトリクム属に属する多糖体Ｍ−１
   ００物質群生産菌が、コレトトリクム・フラガリエ Ｍ
   ６０１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６２５）である請求項２
   記載の製造法。