JPH0694696A - クロマトグラム解析方法及びクロマトグラフ装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 重なるクロマトグラムピークから正確に、高
速データ処理にてそれぞれのピークを定量計算する。 【構成】 データ解析部４５内にニューラルネットワー
ク式ピーク面積分配機能６１を設け、このニューラルネ
ットワークの結合定数（プロセス処理定数）を用いて未
知試料の重なったクロマトグラムピークのそれぞれの面
積を出力する。なお、ピークの重なりの他に、ピークと
ベースラインの重なりから、そのベースラインをニュー
ラルネットワークの結合定数を用いて決定できる。 【効果】 グリコヘモグロビン分析計においては、ｌ−
Ａｌｃとｓ−Ａｌｃが充分に分離せずショルダーピーク
になっていても、定量正確さがｓ−Ａｌｃで３〜５％、
ｌ−Ａｌｃで約１０％の誤差に抑えられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はクロマトグラフより得ら
れるクロマトグラムの解析に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、クロマトグラムの分離不十分のピ
ークの重なりから各ピークの面積，高さ等を求める場合
には、ピーク間の谷（極小点）から時間軸に対して垂直
分割したり、或いはテーリングピーク、リーディングピ
ークから副なるピークを直線により切り取るように分割
している。この方法は簡便であるが、ピークの定量の正
確さに欠け、真値より±５０％も偏ることもしばしばあ
る。

【０００３】これを改善する方法として、Ｇａｕｓｓｉ
ａｎ（Ｇ関数）やＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｇａｕｓｓｉａｎ（ＥＭＧ関数）等の解析
学的関数を用いた非線形最小２乗法を用いて重なりピー
クをフィッティングする技術や、さらに、非線形最小２
乗法のピークフィッティングを行うに際し、そのデータ
としてクロマトグラムの時間、波長、吸光度（強度）を
３軸とする３次元クロマトグラムのデータを用いるもの
が提案されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記のような
最小２乗法を用いた場合には、非線形最小２乗法に使用
する最適パラメータが思うように得られず、解が収束し
なかったりすることもあり、後者のように３次元クロマ
トグラムを利用する場合には、３次元情報を得なければ
ならい煩わしさがあり、さらに、ピーク同士に波長スペ
クトルの差異がなければフィッティングはかなり困難で
ある。

【０００５】本発明は以上の点に鑑みてなされ、第１の
発明の目的は、時間軸と強度軸の２次元クロマトグラム
の情報から、しかも重なりピークのパターンが様々であ
っても各ピークの特徴（面積比率，ピーク高さ，保持時
間等）を精度良くとらえ、各ピークの定量誤差を数％程
度に抑えることが可能で、しかも、高速データ処理が可
能なクロマトグラム解析方法及びクロマトグラフ装置を
提供することにある。

【０００６】第２の発明の目的としては、ベースライン
とピークの重なりが種々のパターンで存在する場合で
も、これに対応して各クロマトグラムのベースラインの
決定を精度良く行って、精度の良いピーク定量を可能に
するクロマトグラム解析方法及びクロマトグラフ装置を
提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記第１の目
的を達成するために、次のようなクロマトグラム解析法
を提案する。

【０００８】すなわち、ピークの形状関数を用いて、重
なり合うピーク同士の面積、高さ、保持時間等を変えた
種々のパターンの重なりピークを予めシミュレートし、
これらのシミュレートデータから重なった各ピークの面
積、高さ又は保持時間が解として導けるブラックボック
スのプロセス処理定数を成立させ、このプロセス処理定
数を、ブラックボックスに入力される未知のクロマトグ
ラムの重なりピークのデータ解析に適用する（これを第
１−１課題解決手段とする）。

【０００９】或いは、これに代えて、標準試料等の既知
試料におけるクロマトグラムのピーク形状を得ると共
に、未知試料（ここで未知試料は標準試料と同一の成分
と他の成分とからなる一般検体である）におけるクロマ
トグラムのピーク形状を得、前記未知試料のピークに重
なりがあった場合、前記標準試料のピーク面積Ｓ１（或
いはピーク波形Ｐ１），高さｈ１と、前記未知試料の重
なりピークの総面積Ｓ２（或いは重なり波形Ｐ２），標
準試料と同一成分のピーク高さｈ２とから、未知試料の
他の成分のピーク面積Ｓ３（或いはピーク波形Ｐ３）
を、Ｓ３＝Ｓ２−Ｓ１・ｈ２／ｈ１或いはＰ３＝Ｐ２−
Ｐ１・ｈ２／ｈ１の関係式より算出する方法を提案する
（これを第１−２の課題解決手段とする）。

【００１０】また、第２の目的を達成するために、ベー
スラインとピークを合成した種々のパターンを予めシミ
ュレートし、これらのシミュレートデータからベースラ
イン態様が解として導けるブラックボックスのプロセス
処理定数を成立させ、このプロセス処理定数を、ブラッ
クボックスに入力される未知のクロマトグラムのベース
ライン決定のデータ解析に適用する（これを第２の課題
解決手段とする）。

【００１１】なお、第１−１の課題解決手段及び第２の
課題解決手段におけるプロセス処理定数としては、ニュ
ーラルネットワークによる結合定数が代表的なもので、
これについては、実施例で詳述してある。

【００１２】

【作用】第１−１の課題解決手段の作用…ピークの形状
関数を用いて予め種々のパターンの重なりピークのクロ
マトグラムをシミュレートしておく。この場合、シミュ
レートするクロマトグラムの重なりパターンは、ピーク
形状関数に代入するパラメータを試行錯誤して、データ
作成者が望む最適なものを選択できる。これにより、そ
れぞれのピークの面積，ピーク高さ，保持時間等のいず
れかが分かっている様々なピーク重なりクロマトグラム
パターン（シミュレートデータ）が得られる。このピー
ク形状関数は、Ｇ関数やＥＭＧ関数等を使用するが、従
来のように実際のクロマトグラムのピークフィッティン
グに使用するのではなく、次に述べるプロセス処理定数
を成立させるためのシミュレートデータの作成として用
いられる。

【００１３】プロセス処理定数とは、データ（ここでは
重なりピークのクロマトグラム）をデータ処理手段たる
ブラックボックスに入力すると、そのデータの解（ここ
では、重なりピーク同士の面積，高さ、保持時間）を出
力側に導くためのものである。

【００１４】このプロセス処理定数は、予め解の知って
いるシミュレートデータを用いれば、入力するシミュレ
ートデータに対し既知たる解が出力されるプロセス処理
定数値を学習機能により得ることができ、シミュレート
データが多様に存在するほど、それに適応した種々のプ
ロセス処理定数を成立させることができる。このように
して得られたプロセス処理情報を記憶しておく。ブラッ
クボックスに実際の未知のクロマトグラムが入力される
と、このクロマトグラムに近いシミュレートデータのプ
ロセス処理定数が適用されて、重なりピークのデータ解
析（例えば、ピーク同士の面積比率、ピーク高さ、保持
時間等）がされ、各ピークの定量計算が可能となる。

【００１５】この場合、実際のクロマトグラムのデータ
解析が最も近いシミュレートデータのプロセス処理定数
が使用されるので、データ解析に大きな誤差は生ぜず、
しかも、多種多様なパターンのデータ解析に適用でき
る。

【００１６】第１−２課題解決手段の作用…標準試料の
ピーク面積Ｓ１，高さｈ１とし、一方、未知試料の重な
りピークの総面積Ｓ２，標準試料と同一成分のピーク高
さｈ２とした場合、Ｓ１・ｈ２／ｈ１は未知試料の中の
標準試料と同一成分のピーク面積に相当する。したがっ
て、未知試料のピークの総面積Ｓ２からＳ１・ｈ２／ｈ
１を差し引けば、未知試料の残りの成分のピーク面積Ｓ
３を簡易にしかも誤差を少なくして求めることができ
る。この方法は、ピーク面積Ｓ１をピーク波形Ｐ１、重
なりピークの総面積Ｓ２を重なりピーク波形Ｐ２、ピー
ク面積Ｓ３をピーク波形Ｐ３に置き換えることで、同様
に未知試料の各ピークの定量計算が可能となる。

【００１７】第２の課題解決手段の作用…本方式では、
データ解析対象を第１の課題解決手段のピーク同士の重
なりに代えて、ピークのベースラインとした。本発明の
場合、シミュレートしたクロマトグラムにおいては、解
としてのベースラインが既知であるので、この解を導く
ブラックボックスのプロセス処理定数もシミュレートデ
ータをブラックボックスに入力させて学習させることで
得ることができる。

【００１８】そして、このベースラインとピークのシミ
ュレートデータを多種用意しておけば、それに対応のプ
ロセス処理定数を多種成立させて用意することができ
る。

【００１９】ブラックボックスに実際の未知のクロマト
グラムが入力されると、このクロマトグラムに近いシミ
ュレートデータのプロセス処理定数が適用されて、クロ
マトグラムのベースラインが精度良く決定され、各ピー
クの定量計算が正確に行い得る。

【００２０】

【実施例】本発明の実施例を図１〜図８により説明す
る。

【００２１】まず、図４により本発明の適用対象となる
クロマトグラフ装置の構成について説明する。図４はイ
オン交換クロマトグラフィによってグリコヘモグロビン
を分析する液体クロマトグラフのシステム構成図であ
る。

【００２２】溶離液送液ポンプ４０はステップワイズ溶
出を行うために溶離液Ａ４８，溶離液Ｂ４９，溶離液Ｃ
５０を、それぞれ１．９，１．０，０．４分間ずつ３．
３分間サイクルで切り換え送液する。可動ニードルを有
するサンプラ４３はヘモグロビン（Ｈｂ）の標準試料５
２あるいは未知試料５１を５μｌ吸引し、溶血希釈し、
この溶血希釈した試料が溶離液Ａ４８と共に分離カラム
４１に送り込まれて、含有成分が分離展開され、可視吸
光度検出器４２で検出される。この検出データであるク
ロマトグラムはデータ解析部４５に記憶される。

【００２３】データ解析部４５は後述する図１のフロー
チャートにしたがってクロマトグラムについてのピーク
の同定，定量計算を行うデータ分析機能を有し、図５に
示すように、ニューラルネットワーク式ピーク面積分配
機能６１，ピーク検知機能６２，ベースライン決定機能
６３，ピーク同定機能６４，微分計算機能６５，クロマ
トグラム正規化機能６６，定量計算機能６７を備えてい
る。これらの機能については、図１のフローチャートに
おいて述べる。

【００２４】図２は上記分離カラム４１で得られたクロ
マトグラムの一例で、このようにｌ−Ａｌｃ（不安定形
ヘモグロビン）とｓ−Ａｌｃ（安定形ヘモグロビン）の
ピークが重なっている場合には、それぞれのピーク面積
が正確に計量し難い。本実施例では、この計量の正確さ
を期すためにニューラルネットワークを用いて各ピーク
面積を行う。

【００２５】ここで、上記データ解析部４５が実行する
クロマトグラム解析について、図１のフローチャートに
より説明する。

【００２６】このフローは、デジタル化されたクロマト
グラムが得られた時点で開始し（ステップ１）、ステッ
プ２において、クロマトグラムのピーク検知を行う。ピ
ーク検知は、ピーク検知機能６２が各ピークの立上り増
加量がノイズ値の５倍相当量を３回上回った最初の点を
ピーク始点、この逆をピーク終点とする。ステップ３で
は、ベースライン決定機能６３がクロマトグラムの最初
のピークの始点と、２．１５ｍｉｎまでの最後のピーク
始点と、最後のピークの終点との３点をクロマトグラム
を上回らないように直線で結ぶ。例えば、図２に示すよ
うに、Ａｌａの始点、ｓ−Ａｌｃの終点、Ａｏの終点の
３点を直線で結ぶ。ステップ４ではピーク同定を行う。
ピーク同定は、ピーク同定機能６４が予め用意されたタ
イムウィンドウ（ピーク同定の許容時間幅）の中に、リ
テンションタイム（ピーク最大点の時刻）があれば、そ
のタイムウィンドウの成分に固定する。クロマトグラム
上に極大点（各ピークの最大点）があれば、ここでピー
ク同定は完了する。

【００２７】なお、図６のようにｓ−Ａｌｃピークにｌ
−Ａｌｃがショルダーピークとして重なっている場合に
は極大点同定方式では同定が不可能なので、この場合に
は、ピーク同定機能６４はｌ−Ａｌｃが同定されない時
に微分計算機能６５にピーク同定を行うように命令す
る。ピーク同定機能６４は、ｓ−Ａｌｃの立上り側（ピ
ークの左側）にピーク最大点から左へ下に凸の変曲点
（２次微分係数が０で１次微分が下に凸の点）が有るか
探索する。有れば、いずれかの変曲点がタイムウィンド
ウ内の時、ｌ−Ａｌｃと同定する。無ければ同定せず、
ステップ５を経て、ステップ１７へ進む。ここではｓ−
Ａｌｃを単一ピークとして、定量計算機能６７がそのピ
ーク面積より定量し、その後、ステップ１８で終了す
る。

【００２８】ステップ５にてｌ−Ａｌｃとｓ−Ａｌｃの
同定が確認できれば、ステップ６以降にて同定されたピ
ークＡｌａ，Ａｌｂ，Ｆ，ｌ−Ａｌｃ，ｓ−Ａｌｃ，Ａ
ｏのピーク面積を求めて定量計算を行う。この定量計算
は、補正ファクターを各ピーク面積の乗じ、各ピークの
面積百分率を定量計算機能６７により定量する。

【００２９】以下、ｌ−Ａｌｃとｓ−Ａｌｃの定量に焦
点を絞り説明する。

【００３０】ステップ６では、ピーク分離を行う場合
に、ａ．垂直分割で行うか、ｂ．ニューラルネットワー
クで行うか選択するが、この選択は予め操作者が選択し
ておく。

【００３１】垂直分割が選択されている場合には、ステ
ップ７にてｌ−Ａｌｃの後方に谷（極小点）があるか調
べる。あれば、ステップ８にて谷からピーク面積を時間
軸に対して垂直に分割した後、ステップ１０にて定量計
算を行いステップ１８にて処理を終了する。

【００３２】次にステップ６にてニューラルネットワー
クによる定量モードが選択されている場合について説明
する。ニューラルネットワークのフローはステップ１１
からステップ１５に示される。

【００３３】ステップ１１で、ｌ−Ａｌｃのピーク始点
からｓ−Ａｌｃのピーク終点までの区間に谷（極小点）
が１個であるか調べる。２個以上であれば、ステップ１
６にて不能判定処理、すなわちニューラルネットワーク
による定量不能として、ＣＲＴ４６とプリンタ４７から
「ニューロ定量できません」のようなメッセージが出力
され、ステップ６以降の垂直分割処理系へ移行する。０
個の場合は、ｌ−Ａｌｃの１次微分が下に凸の変曲点
で、この変曲点がｌ−Ａｌｃのピーク始点からｓ−Ａｌ
ｃのピーク最大点までの区間に１個であるか調べる。そ
して、谷又は下に凸の変曲点が１個であれば、ステップ
１２に進む。

【００３４】ステップ１２では、クロマトグラム正規化
機能１２がｌ−Ａｌｃとｓ−Ａｌｃの重なったピークを
ニューラルネットワークにより定量するために縦軸，横
軸共

【００３５】に

【０，１】の区間の中に正規化する。すなわち、図３
（ａ）に示すように、実際のクロマトグラムのｌ−Ａｌ
ｃの始点Ａ、ｓ−Ａｌｃの終点Ｂ、ｌ−Ａｌｃかｓ−Ａ
ｌｃの最大点Ｃを正規化クロマトグラムへ投影する。Ａ
を（０．０，０．０）、Ｂを（１．０，０．０）、Ｃを
縦軸の１．０になるようにする。ベースラインからＡ点
が図３のように浮き上がっている場合は、斜線部分を差
し引いて投影する。この正規化クロマトグラムをＣＲＴ
４６とプリンタ４７に出力する。

【００３６】ここで、ステップ１３にてピークの形状が
ニューラルネットワークに適したものかどうかを、正規
化クロマトグラムのｌ−Ａｌｃとｓ−Ａｌｃの合計ピー
ク面積が０．２以上かつ０．８以下であることから確認
する。０．２未満だとピークが充分にシャープであり完
全にピークが分かれているため、ステップ１６にてニュ
ーラル定量不要として、０．８を超えていると異常にブ
ロードであり、ステップ１６にてニューラルネットワー
ク定量不能として出力され、ステップ７に移行し垂直分
割の定量計算のモードになる。合計ピーク面積が０．２
〜０．８の範囲であれば、ステップ１４に移行する。

【００３７】ステップ１４ではニューラルネットワーク
式ピーク面積分配機能６１が正規化クロマトグラムのｌ
−Ａｌｃとｓ−Ａｌｃが何％対何％の面積比率で占めら
れているかを計算する。ステップ１５でこの求められた
面積比率で実際のクロマトグラムの面積で分配して定量
計算する。すなわち、図３に示すように点Ａがベースラ
インから浮き上がっている場合は、便宜上ベースライン
より上の合計のピーク面積をニューラルネットワークで
求められた面積比率で分配する。ここで得られた面積比
率をＣＲＴ４６とプリンタ４７に出力する。後は通常の
処理同様にＡｌａからＡｏのピーク面積を用いて、面積
百分率を計算し、ステップ９にてこのフローが終了す
る。

【００３８】ここで、ニューラルネットワーク式ピーク
面積分配機能６１について図５により詳しく説明する。

【００３９】図５に示すようにこのニューラルネットワ
ークはＲｕｍｅｌｈａｒｔ型であり、ブラックボックス
たるニューラルネットワーク式ピーク面積分配機能６１
が入力層、中間層、出力層からなる階層構造をもち、バ
ックプロゲーションによる教師付き学習方法を採用する
ことにより、予め解答の知っている学習用データ（教師
付きデータ）を入力層に入力させると、中間層が学習機
能によりその解答を出力層に導く結合定数群（プロセス
処理定数）を逐次修正しつつ算出する。出力を〔０，
１〕に正規化する関数にはＳｉｇｍｏｉｄ関数Ｓ（ｘ）
＝１／（１＋ｅｘｐ（−ｘ））を使用している。

【００４０】ここでのニューラルネットワークは、入力
層と中間層、中間層と出力層を結び付ける結合定数群
を、第３図（ｂ）に示すような学習用シミュレーション
データを用いて逐次修正していく。

【００４１】結合定数群を算出するための具体的な学習
例を図３を用いて説明する。

【００４２】学習用シミュレーションデータは、ピーク
の重なりのあるクロマトグラムで、例えばピークの形状
関数を用いてシミュレートすることにより作成でき、簡
単には数１式のＧ関数や数２式のＥＭＧ関数を用いて作
成できる。

【００４３】

【数１】

【００４４】

【数２】

【００４５】すなわち、正規化クロマトグラムの１×１
の正方形の中におけるｌ−Ａｌｃとｓ−Ａｌｃの各ピー
クに関するそれぞれのｔ_R（リテンションタイム），σ
（ピーク幅），τ（テーリングピーク），ピーク高さｈ
等のパラメータ（上記数１或いは数２式に用いるパラメ
ータ）を、適切な区間内でランダムに変動させて、図３
（ｂ）に示すような、例えばピーク面積比率が１０：９
０，２０：８０，３０：７０，４０：６０等の様々な重
なりパターンの学習用シミュレーションデータを数十種
作成する。但し、ｌ−Ａｌｃとｓ−Ａｌｃは実際のクロ
マトグラムでは近接しているのでσとτは共通の値で近
似できる。また、ピーク始点及びピーク終点は正規化強
度軸で０．０１の高さと便宜上決めておく。

【００４６】これらの数十種の学習用シミュレーション
データを補間し、教師データとして入力層に入力してい
く。この入力は、シミュレーションデータのＡからＢの
区間を時間軸座標に対して１６分割してこの分割時点の
強度を１６点与えて行う。出力層には教師データに対応
するｓ−Ａｌｃの面積比率（解答）を図１のステップ１
３に対応して０．２〜０．８の値で提示する。このよう
な教師付きデータを与えることで、各入力データごと
に、その解答を導くための結合定数群を中間層が学習に
より逐次修正しつつ成立する。

【００４７】なお、上記結合定数を算出する基になる学
習用シミュレーションデータは解析学的関数以外でもシ
ミュレートすることができる。例えば、まず、実際のク
ロマトグラムから標準試料のｓ−Ａｌｃのピーク形状を
関数ｆ（ｔ）として抽出する。これは標準試料にはｌ−
Ａｌｃがほとんど含まれていないことによる。この関数
の特徴的パラメータとしてリテンションタイムｔ_Rとピ
ーク幅ｗを採用する。例えば、ｗはピーク面積Ａとピー
ク高さｈを使って数３式と定義しておく。

【００４８】

【数３】

【００４９】この関数形は面積１に規格化し、ｔ_Rとｗ
を定数に持つｆ（ｔ）として表せば、ｔ_Rとσを定数に
持つＧａｕｓｓｉａｎ Ｇ（ｔ）に対応する。以降は前
述した方法でこの実際のピーク形状の関数ｆ（ｔ）を用
いて、時間スケールと強度スケールを伸縮すれば、シミ
ュレートすることができる。

【００５０】以上述べてきたピーク幅に関するパラメー
タσ，τ，ｗはより精密にシミュレートする場合、その
ピークのリテンションタイムを変数とする関数、例えば
σ（ｔ_R）＝ａｔ_R＋ｂのように扱う必要がある。

【００５１】ニューラルネットワークの結合定数はこの
ような学習を通して、クロマトグラフのデータ解析部４
５に予め記憶しておく。このような学習シミュレーショ
ン及び結合定数の算出は、クロマトグラフ装置製作の工
場側に集荷前に行ったり、ユーザ側に必要に応じて行っ
てもよい。また、クロマトグラフ装置に並列分散処理
（ＰＤＰ；Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ
Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）専用のコンピュータを搭載し
ておけば、各分析の最初の標準試料を測定した際に、前
記実際のピーク形状の関数ｆ（ｔ）を用いて学習用教師
データをシミュレートし、これをニューラルネットワー
ク式ピーク面積分配機能６１に入力させれば、その都度
結合定数を刷新することができる。

【００５２】このような結合定数群をデータ解析部４５
に記憶しておけば、未知なるピーク重なりのクロマトグ
ラムを入力層に入力した場合に、それに近い結合定数群
により、図１のステップ１４におけるピーク面積比率が
求めることができる。

【００５３】ここで、正規化機能６６の正規化方法につ
いて補足説明する。前述に実施例では重なったピークの
始点と終点を横軸の（０，０）と（１，０）に一次変換
し、重なったピークの最大点を縦軸１の高さに正規化し
ている。これはニューラルネットワークにより処理する
ため行っているが、他の正規化方法を用いることもでき
る。すなわち、横軸は上記同様に一次変換し、縦軸方向
は重なりピークの合計面積が１になるように正規化す
る。この場合、正規化ピークの高さが一つの指標とな
り、ニューラルネットワーク定量の不要，不能の判定に
利用できる。

【００５４】これ以外の正規化方法には横軸に実際の時
間軸スケールをそのまま採用し、ピーク面積か高さを１
に正規化することもできる。これは補間処理する必要が
ない利点がある反面、教師データを若干多様化させる必
要がある。この他にも合計面積とピークの最大点を両方
とも１に正規化し、横軸をフレキシブルにしておく手法
がある。これはピークの始点、終点という数学的に定義
しにくいあいまいな点を決定する必要がない特徴があ
る。

【００５５】前述のニューラルネットワーク式ピーク面
積分配機能６１では１６点のパターンを入力層に入力し
ていたが、パターンの特徴量を入力させる手法もある。
すなわち、図３の正規化されたクロマトグラムから、最
大点、極大点、極小点（谷）と各変曲点の座標（ｘ，
ｙ）を数値入力することもできる。この方式は、入力層
及び中間層ユニットの数を最少限に減らせる特徴があ
る。

【００５６】また、今まで述べてきたように、一組の結
合定数のニューラルネットワークにより定量することも
可能であるが、クロマトグラムのパターンをクラス分け
し、各クラス専用の結合定数をもつニューラルネットワ
ークを対応させるほうがより効率良く正確に定量するこ
とができる。例えば、谷があるクラスと谷のないクラス
で分類するか、正規化クロマトグラムの面積で分類し、
０．２以上０．４未満をクラス１とし、０．４以上０．
６未満をクラス２とし、０．６以上０．８未満をクラス
３として、各クラス専用に処理する。一般のクロマトグ
ラムでは、ショルダーピークの定量、テーリングピーク
に小さなピークが重なっている場合の定量またはリーデ
ィングピークでの処理等にこのクラス分けの手法が有効
である。

【００５７】なお、図４において、４４はクロマトグラ
フ全体を制御する制御部、５３は分析条件決定部であ
り、分析条件決定部５３は上記手法でクロマトグラムを
定量できない時に、溶離液の切換時間を修正すること等
を制御部４４に命令し、分離の改善を図るフィードバッ
クを可能にしている。

【００５８】なお、上記実施例では出力項目として、前
述に面積比率だけではなく、ピーク高さや保持時間等の
クロマトグラムを記述する特徴量を設定することもでき
る。

【００５９】本実施例によれば、次の効果が得られた。
グリコヘモグロビン分析のｌ−Ａｌｃとｓ−Ａｌｃの分
離において、従来の垂直ピーク分割方法では正確な定量
を得ようすると、７分間要したものが、本実施例では約
半分で３．３分間で同様に定量できるようになった。

【００６０】また、３．３分間分析において、従来の垂
直分割法では定量正確さが、ｓ−Ａｌｃで２０〜３０
％、ｌ−Ａｌｃで約５０％の誤差を含んでいたが、この
ニューラルネットワークを用いる定量法では、ｓ−Ａｌ
ｃで３〜５％、ｌ−Ａｌｃで約１０％の誤差に抑えられ
た。

【００６１】次に本発明の他の実施例を図７により説明
する。

【００６２】本実施例はニューラルネットワーク式手法
を採用せず、クロマトグラムの重なりピークの面積比率
を標準試料の実際のｓ−Ａｌｃのテーブルパターンを利
用して求める。

【００６３】すなわち、まず、図７（ａ）に示すように
実際の標準試料ｓ−Ａｌｃをクロマトグラフで分析し
て、そのクロマトグラムをテーブルパターンとして記憶
しておき、このテーブルパターンからピークの高さｈ１
と面積Ｓ１とを算出する。次に図７（ｂ）に示すよう
に、未知試料のクロマトグラムを得て、ｓ−Ａｌｃのピ
ークｈ２と重なりピーク（ｓ−Ａｌｃとｌ−Ａｌｃの重
なりピーク）の総面積Ｓ２とを算出する。ｓ−Ａｌｃの
ピークが小さく、頂点にならない場合は、変曲点の高さ
をｈ２とする。次いで、標準試料のｓ−Ａｌｃのピーク
面積Ｓ１を実際の未知試料のｓ−Ａｌｃの面積Ｓ１′に
相当させるために、ピーク高さｈ２とｈ１の比率ｈ２／
ｈ１を面積Ｓ１に乗じ（Ｓ１′＝Ｓ１×ｈ２／ｈ１）、
これにより未知試料のｓ−Ａｌｃのピーク面積Ｓ１′が
求まると共に、Ｓ−Ｓ１′より未知試料のｌ−Ａｌｃの
ピーク面積を求めることができる。

【００６４】以上を式でまとめると、次式となる。

【００６５】

【数４】Ｓ３＝Ｓ２−Ｓ１・ｈ２／ｈ１ 具体的には、図７のように、数値が電気量に換算して表
され、ｈ１が３４０μＶ、Ｓ１が１，７００，０００μ
Ｖ・ｓ、ｈ２が４７０μＶ、Ｓ２が２，８００，０００
μＶ・ｓとすると、数４式に代入することで、Ｓ３が４
５０，０００μＶ・ｓとなる。

【００６６】この方法は数値演算により重なりピークの
面積比率を求めるが、クロマトグラムの波形を差し引く
方法へと発展することができる。つまり、一般検体の波
形からある定数を乗じた標準試料の波形を差し引き、ｌ
−Ａｌｃとｓ−Ａｌｃの面積値を求めることができる。

【００６７】これを式であらわせば、次のように表され
る。

【００６８】

【数５】Ｐ３＝Ｐ２−Ｐ１・ｈ２／ｈ１ ここで、Ｐ１は標準試料のピーク波形、Ｐ２は一般検体
の重なりピーク波形、Ｐ３は一般検体のうち標準試料と
同一成分以外の成分のピーク波形である。

【００６９】この場合、その定数はｈ２／ｈ１がほぼ適
切であるが、次のような条件を満たすように若干の調整
を加えてもよい。

【００７０】（１）差し引かれた波形の一部でもベース
ラインを下回らないこと （２）差し引かれた波形は頂点が１個で、その頂点の左
右に変曲点を１個ずつ有すること（第３のピークの影響
のない場合） 最後に今まで実施例としてきたグリコヘモグロビン分析
以外の応用例を説明する。

【００７１】カテコールアミン分析では、血漿、尿等の
生体液を試料とした場合、目的成分に妨害成分が重なる
ことがしばしばある。この場合、ピーク高さに基づいて
定量するほうが、妨害を受けにくい。それでも、図８の
（ｃ）のＤＡ（ドーパミン）のように重なり方がかなり
大きいと定量成分が大きくなる。この場合にも、必要な
成分と妨害成分を上記第１実施例同様にピークの形状関
数を用いてシミュレートし、ニューラルネットワークを
用いて、入力層に正規化クロマトグラムのパターン、出
力層に各ピークの高さの真値を対応させる手法が有効で
ある。アミノ酸分析でもショルダーピーク、テーリング
ピーク上に小さなピークが重なることが起こる。これも
前述したニューラルネットワークを用いてピーク面積比
率を求めることで正確に定量できる。

【００７２】また、アミノ酸分析には、特徴的なベース
ライン変動がある。図８（ｂ）（ｃ）に示すようなＣｙ
ｓ（システイン）直前の溶離液切換ショックによるも
の、ＮＨ₃（アンモニア）付近に盛り上がるプラトーが
ある。この種のベースラインは、各クロマトグラムで大
きさや形状が著しく変化するため、ベースラインの引き
方に影響が出て、ピークの定量に誤差を生じる。これに
はいくつかのパターンをニューラルネットワークに学習
させ、教師データに従ってベースラインを引かせる手法
が有効である。

【００７３】すなわち、ベースラインとピークを合成し
た種々のパターンを予めシミュレートし、これらのシミ
ュレートデータからニューラルネットワークを用いてベ
ースライン態様が解として導ける結合定数群を成立さ
せ、この結合定数を用いて入力される未知のクロマトグ
ラムのベースライン決定のデータ解析に適用する。

【００７４】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、第１−
１，第１−２の課題解決手段では、時間軸と強度軸の２
次元クロマトグラムのデータから、しかも重なりピーク
のパターンが様々であっても、各ピークの特徴を精度良
くとらえ、各ピークの定量誤差を極力小さくして、精度
の良い定量を高速データ処理により行い得る。

【００７５】また、第２の課題解決手段によれば、様々
のベースラインを含むクロマトグラムであっても、その
ベースラインを精度良く決定して、精度の良いピーク定
量を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１実施例に係るクロマトグラム解析
のフローチャート

【図２】定量対象のクロマトグラムの一例を示す図

【図３】ニューラルネットワークの処理の説明図

【図４】第１実施例に用いるクロマトグラフ装置の構成
図

【図５】図４に用いたデータ解析部のシステム構成図

【図６】ショルダーピークの例を示す図

【図７】本発明の第２実施例のクロマトグラム解析の処
理を示す説明図

【図８】本発明の第３実施例のクロマトグラム解析の処
理を示す説明図

【符号の説明】

４０…送液ポンプ、４１…分離カラム、４２…検出器、
４３…サンプラ、４４…制御部、４５…データ解析部、
６１…ニューラルネットワーク式分配機能。

フロントページの続き (72)発明者 佐竹 尋志 茨城県勝田市市毛882番地 株式会社日立 製作所計測機器事業部内 (72)発明者 伊藤 三男 茨城県勝田市市毛882番地 株式会社日立 製作所計測機器事業部内 (72)発明者 関 良明 茨城県勝田市堀口字長久保832番地２ 日 立計測エンジニアリング株式会社内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ピークの形状関数を用いて、重なり合う
   ピーク同士の面積、高さ、保持時間等を変えた種々のパ
   ターンの重なりピークを予めシミュレートし、これらの
   シミュレートデータから重なった各ピークの面積、高さ
   又は保持時間が解として導けるブラックボックスのプロ
   セス処理定数を成立させ、このプロセス処理定数を、ブ
   ラックボックスに入力される未知のクロマトグラムの重
   なりピークのデータ解析に適用することを特徴とするク
   ロマトグラム解析方法。
2. 【請求項２】 請求項１において、前記ピークの形状関
   数がＧａｕｓｓｉａｎ，Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｌｙ
   ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇａｕｓｓｉａｎ（ＥＭＧ）等の解
   析学的関数か、もしくは実際のクロマトグラムより得ら
   れるピークの形状関数であることを特徴とするクロマト
   グラム解析方法。
3. 【請求項３】 ベースラインとピークを合成した種々の
   パターンを予めシミュレートし、これらのシミュレート
   データからベースライン態様が解として導けるブラック
   ボックスのプロセス処理定数を成立させ、このプロセス
   処理定数を、ブラックボックスに入力される未知のクロ
   マトグラムのベースライン決定のデータ解析に適用する
   ことを特徴とするクロマトグラム解析方法。
4. 【請求項４】 請求項１ないし請求項３のいずれか１項
   において、前記プロセス処理定数は、ニューラルネット
   ワークを用いて算出した結合定数群であることを特徴と
   するクロマトグラム解析方法。
5. 【請求項５】 標準試料等の既知試料におけるクロマト
   グラムのピーク形状を得ると共に、未知試料（ここで未
   知試料は標準試料と同一の成分と他の成分とからなる一
   般検体である）におけるクロマトグラムのピーク形状を
   得、前記未知試料のピークに重なりがあった場合、前記
   標準試料のピーク面積Ｓ１，高さｈ１と、前記未知試料
   の重なりピークの総面積Ｓ２，標準試料と同一成分のピ
   ーク高さｈ２とから、未知試料の他の成分のピーク面積
   Ｓ３を、Ｓ３＝Ｓ２−Ｓ１・ｈ２／ｈ１の関係式より算
   出することを特徴とするクロマトグラム解析方法。
6. 【請求項６】 標準試料等の既知試料におけるクロマト
   グラムのピーク形状を得ると共に、未知試料（ここで未
   知試料は標準試料と同一の成分と他の成分とからなる一
   般検体である）におけるクロマトグラムのピーク形状を
   得、前記未知試料のピークに重なりがあった場合、前記
   標準試料のピーク波形Ｐ１，高さｈ１と、前記未知試料
   の重なりピークの波形Ｐ２，標準試料と同一成分のピー
   ク高さｈ２とから、未知試料の他の成分のピーク波形Ｐ
   ３を、Ｐ３＝Ｐ２−Ｐ１・ｈ２／ｈ１の関係式より算出
   することを特徴とするクロマトグラム解析方法。
7. 【請求項７】 請求項１ないし請求項６のいずれか１項
   のクロマトグラム解析法を用いて定量計算を行う機能を
   備えて成ることを特徴とするクロマトグラフ装置。
8. 【請求項８】 請求項７において、並列分散処理システ
   ムを搭載して成ることを特徴とするクロマトグラフ装
   置。