JP3220471B2 - 組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法 - Google Patents
組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法Info
- Publication number
- JP3220471B2 JP3220471B2 JP10692791A JP10692791A JP3220471B2 JP 3220471 B2 JP3220471 B2 JP 3220471B2 JP 10692791 A JP10692791 A JP 10692791A JP 10692791 A JP10692791 A JP 10692791A JP 3220471 B2 JP3220471 B2 JP 3220471B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gdh
- dna
- escherichia coli
- bacillus megaterium
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、バチルス・メガテリウ
ム(Bacillus megaterium)由来の
グルコースデヒドロゲナーゼ(以下「GDH」とい
う。)をコードするDNAのアミノ酸配列で示される特
定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することによ
って得られる改良型DNAを大腸菌用DNA導入ベクタ
ーに組み込んだ大腸菌内で複製可能な改良型組換えDN
A、それを含む形質転換体及びそれを用いるGDHの製
造法に関する。
ム(Bacillus megaterium)由来の
グルコースデヒドロゲナーゼ(以下「GDH」とい
う。)をコードするDNAのアミノ酸配列で示される特
定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することによ
って得られる改良型DNAを大腸菌用DNA導入ベクタ
ーに組み込んだ大腸菌内で複製可能な改良型組換えDN
A、それを含む形質転換体及びそれを用いるGDHの製
造法に関する。
【0002】
【従来の技術】GDH〔EC 1.1.1.47〕は、
グルコース定量用酵素として臨床検査及び食品工業の分
野において重要な酵素として使用されている。従来、G
DHを生産する微生物としては、バチルス・メガテリウ
ム、バチルス・セレウス(Bacillus cere
us)等のバチルス属菌が知られている(特開昭53−
137199号)。
グルコース定量用酵素として臨床検査及び食品工業の分
野において重要な酵素として使用されている。従来、G
DHを生産する微生物としては、バチルス・メガテリウ
ム、バチルス・セレウス(Bacillus cere
us)等のバチルス属菌が知られている(特開昭53−
137199号)。
【0003】バチルス・メガテリウム由来のGDHは分
子量約30,000の同一サブユニットからなる四量体
酵素として知られている。GDHはアルカリ側では可逆
的に解離して失活する性質を有している。しかし、イオ
ン強度が高いときは失活しないことが知られている。
子量約30,000の同一サブユニットからなる四量体
酵素として知られている。GDHはアルカリ側では可逆
的に解離して失活する性質を有している。しかし、イオ
ン強度が高いときは失活しないことが知られている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】しかしながらグルコー
ス測定用酵素としてGDHを使用するためには、より安
定性に優れた性質を持つことが望まれ、更にイオン強度
が低い場合においてもpHによる影響を受けにくく、熱
に対しても安定性の優れたGDHをより安価に製造する
ことが望まれていた。
ス測定用酵素としてGDHを使用するためには、より安
定性に優れた性質を持つことが望まれ、更にイオン強度
が低い場合においてもpHによる影響を受けにくく、熱
に対しても安定性の優れたGDHをより安価に製造する
ことが望まれていた。
【0005】最近になってバチルス・メガテリウム由来
のGDH遺伝子を大腸菌に組み入れた組換え体を用いた
GDHの生産方法が開示された〔ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー(Eur.J.Bio
chem.)174巻、485〜490、(198
8)〕。
のGDH遺伝子を大腸菌に組み入れた組換え体を用いた
GDHの生産方法が開示された〔ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー(Eur.J.Bio
chem.)174巻、485〜490、(198
8)〕。
【0006】しかし、バチルス・メガテリウム由来のG
DH遺伝子は複数個存在することが示され、それらを用
いて形質転換体を得、GDHを生産しているが、使用し
ているベクターはGDHの大量生産には向かないもので
あり、かつGDHをより安定化するための改良は何らな
されていないのであった。
DH遺伝子は複数個存在することが示され、それらを用
いて形質転換体を得、GDHを生産しているが、使用し
ているベクターはGDHの大量生産には向かないもので
あり、かつGDHをより安定化するための改良は何らな
されていないのであった。
【0007】本発明者らは、既にGDHをより安価に製
造するため、バチルス・メガテリウム由来のGDH遺伝
子を高発現ベクターpKK223−3に組み入れて形質
転換体を得、該形質転換体を栄養培地で培養することに
よってGDHを高生産することに成功し、さらに検討し
てバチルス・メガテリウム由来のGDHをコードするD
NAのアミノ酸配列で示される特定の位置のアミノ酸を
他のアミノ酸で置換して得られる改良型DNAを大腸菌
に組み入れた形質転換体を栄養培地で培養したところ、
培養物中に従来のGDHより熱安定性に優れたGDHを
大量に製造せしめることに成功している(特開平2−8
6779)。
造するため、バチルス・メガテリウム由来のGDH遺伝
子を高発現ベクターpKK223−3に組み入れて形質
転換体を得、該形質転換体を栄養培地で培養することに
よってGDHを高生産することに成功し、さらに検討し
てバチルス・メガテリウム由来のGDHをコードするD
NAのアミノ酸配列で示される特定の位置のアミノ酸を
他のアミノ酸で置換して得られる改良型DNAを大腸菌
に組み入れた形質転換体を栄養培地で培養したところ、
培養物中に従来のGDHより熱安定性に優れたGDHを
大量に製造せしめることに成功している(特開平2−8
6779)。
【0008】
【課題を解決するための手段・作用】本発明は前記発明
について更に検討を重ね、一組の特定のアミノ酸を他の
一組の特定のアミノ酸に置換することによって得られる
DNAを大腸菌に組み入れた形質転換体を栄養培地で培
養したところ、熱安定性に優れたGDHを製造すること
ができること、更にどのpHにおいても四量体の形で存
在し、熱にも安定なGDHを製造することができること
を見いだして本発明を完成した。
について更に検討を重ね、一組の特定のアミノ酸を他の
一組の特定のアミノ酸に置換することによって得られる
DNAを大腸菌に組み入れた形質転換体を栄養培地で培
養したところ、熱安定性に優れたGDHを製造すること
ができること、更にどのpHにおいても四量体の形で存
在し、熱にも安定なGDHを製造することができること
を見いだして本発明を完成した。
【0009】バチルス・メガテリウム由来のGDH組換
えDNAを調製するためには、まずGDHをコードする
組換えDNAを調製する必要がある。そのために使用す
る菌株としては、GDH生産能を有するバチルス・メガ
テリウムであればいずれのものも使用できるが、好まし
くはバチルス・メガテリウムIAM1030及び土壌か
ら分離されたバチルス・メガテリウムIWG3を用いる
のがよい。
えDNAを調製するためには、まずGDHをコードする
組換えDNAを調製する必要がある。そのために使用す
る菌株としては、GDH生産能を有するバチルス・メガ
テリウムであればいずれのものも使用できるが、好まし
くはバチルス・メガテリウムIAM1030及び土壌か
ら分離されたバチルス・メガテリウムIWG3を用いる
のがよい。
【0010】このうち土壌から得られた菌株のバチルス
・メガテリウムIWG3は以下のようにして同定された
ものである。
・メガテリウムIWG3は以下のようにして同定された
ものである。
【0011】菌学的諸性質の試験は、ルース・イー・ゴ
ードン著,ザ・ジーナス・バチルス(Ruth E.G
ordon:The Genus Bacillus
(1973)〕に準拠し、分類方法はバージェイス・マ
ニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジ
ー (Bergey’s Manual of Deter
minative Bacteriology)(第8
版)及び前記のThe Genus Bacillus
によった。
ードン著,ザ・ジーナス・バチルス(Ruth E.G
ordon:The Genus Bacillus
(1973)〕に準拠し、分類方法はバージェイス・マ
ニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジ
ー (Bergey’s Manual of Deter
minative Bacteriology)(第8
版)及び前記のThe Genus Bacillus
によった。
【0012】A.形態 (1) 細胞の大きさは1.1〜1.6μ×3.0〜
5.0μで桿菌である。またグルコース栄養培地(gl
ucosenutrient agar)で生育した細
胞をフクシンで染めると細胞内は粒状である。 (2) 運動性はない。 (3) 胞子を形成し、大きさは1.0〜1.3μ×
2.0〜2.5μで、卵形ないしは円柱形である。胞子
のうは膨らまない。中立ないしは準端立である。 (4) グラム染色性は陽性である。
5.0μで桿菌である。またグルコース栄養培地(gl
ucosenutrient agar)で生育した細
胞をフクシンで染めると細胞内は粒状である。 (2) 運動性はない。 (3) 胞子を形成し、大きさは1.0〜1.3μ×
2.0〜2.5μで、卵形ないしは円柱形である。胞子
のうは膨らまない。中立ないしは準端立である。 (4) グラム染色性は陽性である。
【0013】B・生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元:陰性 (2) 脱窒反応 :陰性 (3) VPテスト :陰性。ブロスのpHは7日間
の培養で4.6〜5.0である。 (4) インドールの生成:陰性 (5) デンプンの加水分解:陰性 (6) クエン酸塩の利用:陽性 (7) 無機窒素源の利用:アンモニウム塩と硝酸塩
を共に利用する。 (8) 色素の生成:チロシン培地で茶褐色の水溶性
色素を生成する。 (9) ウレアーゼ:弱陽性 (10) カタラーゼ:陽性 (11) 酸素に対する態度:好気性 (12) 糖類からの酸及びガスの生成:アラビノー
ス,キシロース,グルコース,フラクトース,ガラクト
ース,マルトース,シュクロース,ラクトース,トレハ
ロース,マンニット,イノシット,グリセリン,デンプ
ンから酸を生成するが、ガスは生成しない。マンノー
ス,ソルビットからは酸もガスも生成しない。 (13) 7% NaCl培地での生育:生育しない (14) 45℃における生育:生育する (15) 65℃における生育:生育しない (16) サブロー・デキストローズ(Saboura
ud dextrose)培地における生育:生育する (17) フェニルアラニンのデアミネーション:陽性 (18) ゼラチンの液化性:陽性 (19) カゼインの分解性:陽性 (20) チロシンの分解性:陽性 (21) 卵黄反応:陰性
の培養で4.6〜5.0である。 (4) インドールの生成:陰性 (5) デンプンの加水分解:陰性 (6) クエン酸塩の利用:陽性 (7) 無機窒素源の利用:アンモニウム塩と硝酸塩
を共に利用する。 (8) 色素の生成:チロシン培地で茶褐色の水溶性
色素を生成する。 (9) ウレアーゼ:弱陽性 (10) カタラーゼ:陽性 (11) 酸素に対する態度:好気性 (12) 糖類からの酸及びガスの生成:アラビノー
ス,キシロース,グルコース,フラクトース,ガラクト
ース,マルトース,シュクロース,ラクトース,トレハ
ロース,マンニット,イノシット,グリセリン,デンプ
ンから酸を生成するが、ガスは生成しない。マンノー
ス,ソルビットからは酸もガスも生成しない。 (13) 7% NaCl培地での生育:生育しない (14) 45℃における生育:生育する (15) 65℃における生育:生育しない (16) サブロー・デキストローズ(Saboura
ud dextrose)培地における生育:生育する (17) フェニルアラニンのデアミネーション:陽性 (18) ゼラチンの液化性:陽性 (19) カゼインの分解性:陽性 (20) チロシンの分解性:陽性 (21) 卵黄反応:陰性
【0014】以上の諸性質をバージェイス・マニュアル
・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー(第8
版)の分類方法にしたがって検索すると、本菌株はグラ
ム陽性の好気性桿菌で胞子を形成するのでバチルス属に
分類される。
・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー(第8
版)の分類方法にしたがって検索すると、本菌株はグラ
ム陽性の好気性桿菌で胞子を形成するのでバチルス属に
分類される。
【0015】種については、 (1) 栄養細胞の大きさが1.0〜1.6μ×3.0
〜5.0μであり、グルコース培地で細胞内が粒状であ
る。 (2) 胞子のうが膨らまないこと、胞子形成部位は中
央部ないしはやや末端よりである。 (3) グルコースから酸を生成すること、VPテスト
が陰性である。 (4) 嫌気条件下では生育しない。 (5) サブロー・デキストローズ(Sabourau
d dextrose)培地で生育する。 (6) アラビノース、キシロース、マンニットから酸
を生成する。 (7) 卵黄反応が陰性である。 こと等の性質からバチルス・メガテリウムと同定され、
本発明者らは、本菌株をバチルス・メガテリウムIWG
3と命名した。
〜5.0μであり、グルコース培地で細胞内が粒状であ
る。 (2) 胞子のうが膨らまないこと、胞子形成部位は中
央部ないしはやや末端よりである。 (3) グルコースから酸を生成すること、VPテスト
が陰性である。 (4) 嫌気条件下では生育しない。 (5) サブロー・デキストローズ(Sabourau
d dextrose)培地で生育する。 (6) アラビノース、キシロース、マンニットから酸
を生成する。 (7) 卵黄反応が陰性である。 こと等の性質からバチルス・メガテリウムと同定され、
本発明者らは、本菌株をバチルス・メガテリウムIWG
3と命名した。
【0016】以下、実施例を記載しながら本発明を詳述
する。
する。
【0017】形質転換体Aの調製 (1) GDHの精製 バチルス・メガテリウムIWG3を2XTYブロスに植
菌し、培養後集菌し、菌体破砕後、遠心分離して得られ
る上清液を脱塩濃縮後、凍結乾燥して得られたGDH粗
酵素粉末105μgをグリセロール10%含有イミダゾ
ール緩衝液(20mM、pH6.5)15mlに溶解
し、DEAE−セファデックスA−50に吸着させた
後、食塩濃度勾配(0.1M−0.5M)により溶出さ
せ、活性画分を集め脱塩濃縮する。次にTSK−ゲルD
EAE−3−SWを担体とする高速液体クロマトグラフ
ィーにより分子量分画を行い、さらにTSK−ゲル G
3000−SWを担体とする高速液体クロマトグラフィ
ーにより吸着溶離して電気泳動的に均一な活性画分(蛋
白質量として約5mg)を得た。
菌し、培養後集菌し、菌体破砕後、遠心分離して得られ
る上清液を脱塩濃縮後、凍結乾燥して得られたGDH粗
酵素粉末105μgをグリセロール10%含有イミダゾ
ール緩衝液(20mM、pH6.5)15mlに溶解
し、DEAE−セファデックスA−50に吸着させた
後、食塩濃度勾配(0.1M−0.5M)により溶出さ
せ、活性画分を集め脱塩濃縮する。次にTSK−ゲルD
EAE−3−SWを担体とする高速液体クロマトグラフ
ィーにより分子量分画を行い、さらにTSK−ゲル G
3000−SWを担体とする高速液体クロマトグラフィ
ーにより吸着溶離して電気泳動的に均一な活性画分(蛋
白質量として約5mg)を得た。
【0018】(2) GDHのアミノ基末端アミノ酸配
列の決定 前記(1)により得た精製酵素蛋白質のアミノ基末端ア
ミノ酸配列をABI〔アプライド・バイオシステム(A
pplied Biosystem)〕社製ペプチドシ
ーケンサーGas Phase 470Aにより分析
し、N末端より29アミノ酸残基の配列(配列番号:
2)を決定した。尚、下線部はプローブ合成に用いられ
た配列を示す。
列の決定 前記(1)により得た精製酵素蛋白質のアミノ基末端ア
ミノ酸配列をABI〔アプライド・バイオシステム(A
pplied Biosystem)〕社製ペプチドシ
ーケンサーGas Phase 470Aにより分析
し、N末端より29アミノ酸残基の配列(配列番号:
2)を決定した。尚、下線部はプローブ合成に用いられ
た配列を示す。
【0019】(3) DNAプローブの合成 前記アミノ酸配列(配列番号:2)から下線で示した1
ヶ所の配列を選択し、これらのアミノ酸配列から推定さ
れる遺伝子上の可能なDNA塩基配列のうち、枯草菌の
コドン利用頻度を参考にしてDNA塩基配列を推定し、
38merの1種のDNAプローブの塩基配列(配列番
号:3)を決定した。DNAの合成はABI社製でシン
セサイザー(Synthesizer)モデル381A
を用いて行った。
ヶ所の配列を選択し、これらのアミノ酸配列から推定さ
れる遺伝子上の可能なDNA塩基配列のうち、枯草菌の
コドン利用頻度を参考にしてDNA塩基配列を推定し、
38merの1種のDNAプローブの塩基配列(配列番
号:3)を決定した。DNAの合成はABI社製でシン
セサイザー(Synthesizer)モデル381A
を用いて行った。
【0020】(4) バチルス・メガテリウムからの全
DNAの抽出と切断 斉藤、三浦らの方法〔バイオキミカ・バイオフィジカ・
アクタ(Biochim.Biophys.Act
a)、72巻、619頁(1963)]に従ってバチル
ス・メガテリウムIWG3から全DNAを抽出精製し
た。このDNA240μgをとり、制限酵素EcoR
I、BglIIそれぞれ150単位と37℃、3時間反
応させた。反応液の全量を1%アガロースゲル電気泳動
に供し、3〜4Kbの大きさに相当するDNAを含む部
分を切出して、電気抽出法によりゲルからDNA断片を
溶出させた。次いで溶出液を当量のフェノール及びフェ
ノール・クロロホルムで順次抽出し、得られた水層にエ
タノールを添加してDNAを沈澱させた後、TE緩衝液
100μlに溶かした。
DNAの抽出と切断 斉藤、三浦らの方法〔バイオキミカ・バイオフィジカ・
アクタ(Biochim.Biophys.Act
a)、72巻、619頁(1963)]に従ってバチル
ス・メガテリウムIWG3から全DNAを抽出精製し
た。このDNA240μgをとり、制限酵素EcoR
I、BglIIそれぞれ150単位と37℃、3時間反
応させた。反応液の全量を1%アガロースゲル電気泳動
に供し、3〜4Kbの大きさに相当するDNAを含む部
分を切出して、電気抽出法によりゲルからDNA断片を
溶出させた。次いで溶出液を当量のフェノール及びフェ
ノール・クロロホルムで順次抽出し、得られた水層にエ
タノールを添加してDNAを沈澱させた後、TE緩衝液
100μlに溶かした。
【0021】(5) ベクターへのDNA断片の挿入 ベクターとしてはpBR322を用いたが、DNA断片
挿入のためには、pBR322 20μgをEcoRI
−BamHIで完全分解して得られた直鎖状ベクターD
NAをTE緩衝液200μlに溶解して使用した。上記
工程(4)で得られたDNA断片との結合は、工程
(4)で得られた溶液と直鎖状ベクターDNA溶液を1
0:1の割合に混合し、T4DNAリガーゼを14℃で
一夜反応させることにより行った。
挿入のためには、pBR322 20μgをEcoRI
−BamHIで完全分解して得られた直鎖状ベクターD
NAをTE緩衝液200μlに溶解して使用した。上記
工程(4)で得られたDNA断片との結合は、工程
(4)で得られた溶液と直鎖状ベクターDNA溶液を1
0:1の割合に混合し、T4DNAリガーゼを14℃で
一夜反応させることにより行った。
【0022】(6) バチルス・メガテリウムのDNA
ライブラリーの作成 上記工程(5)で得られた組換えDNAを形質転換によ
り宿主大腸菌エシエリヒア・コリ(Escherich
ia coli)C600に導入し、アンピシリン50
μg/mlを含むL−ブロス寒天培地上で生育してきた
コロニーを集めてバチルス・メガテリウムIWG3のD
NAライブラリーと称した。
ライブラリーの作成 上記工程(5)で得られた組換えDNAを形質転換によ
り宿主大腸菌エシエリヒア・コリ(Escherich
ia coli)C600に導入し、アンピシリン50
μg/mlを含むL−ブロス寒天培地上で生育してきた
コロニーを集めてバチルス・メガテリウムIWG3のD
NAライブラリーと称した。
【0023】(7) DNAライブラリーからGDHク
ローンの選択・分離 上記工程(3)で得られたDNAプローブを各々イング
リア(Inglia)らの方法〔ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ(Nucleic AcidsRe
s.)、9巻、1627〜1642頁(1982)〕に
従ってT4ポリヌクレオチドキナーゼとγ−32P−A
TPを用いてラベルした。
ローンの選択・分離 上記工程(3)で得られたDNAプローブを各々イング
リア(Inglia)らの方法〔ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ(Nucleic AcidsRe
s.)、9巻、1627〜1642頁(1982)〕に
従ってT4ポリヌクレオチドキナーゼとγ−32P−A
TPを用いてラベルした。
【0024】次に前記工程(6)で得られた大腸菌をア
ンピシリン50μg/mlを含むL−ブロス寒天培地上
でコロニーとして生育させ、これをレプリカ法によっ
て、アマーシャム(Amersham)ナイロンメンブ
ランへ移し、リゾチーム溶菌し、アルカリでDNA変性
させ、塩酸による中和処理を行った後、前記プローブと
ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーショ
ンは6倍濃度のSSC(0.15M NaCl、0.0
15Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、5倍濃度の
デンハルト(Denhardt)液(0.02%フィコ
ール,0.02%ポリビニルピロリドン,0.02%牛
血清アルブミン)、0.5%SDS、牛胸腺DNA20
μg/ml(終濃度)及びラベルしたDNAプローブ約
5×105cpm/mlを用いてプレハイブリダイゼー
ションを45℃、3時間行った後、45℃、一夜のハイ
ブリダイゼーションを行った。
ンピシリン50μg/mlを含むL−ブロス寒天培地上
でコロニーとして生育させ、これをレプリカ法によっ
て、アマーシャム(Amersham)ナイロンメンブ
ランへ移し、リゾチーム溶菌し、アルカリでDNA変性
させ、塩酸による中和処理を行った後、前記プローブと
ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーショ
ンは6倍濃度のSSC(0.15M NaCl、0.0
15Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、5倍濃度の
デンハルト(Denhardt)液(0.02%フィコ
ール,0.02%ポリビニルピロリドン,0.02%牛
血清アルブミン)、0.5%SDS、牛胸腺DNA20
μg/ml(終濃度)及びラベルしたDNAプローブ約
5×105cpm/mlを用いてプレハイブリダイゼー
ションを45℃、3時間行った後、45℃、一夜のハイ
ブリダイゼーションを行った。
【0025】この後、5倍濃度のSSCを用いて45℃
で2回、つづいて5倍濃度のSSC(0.1%SDSを
含む)を用いて45℃で2回、4倍濃度のSSCで2回
ナイロンメンブランを洗浄した。この後ナイロンメンブ
ランを乾燥させ、オートラジオグラフィー(条件:−8
0℃、一夜)に供した。その結果、ハイブリダイゼーシ
ョン陽性のコロニーが3つ見出された。そこで陽性のコ
ロニーについて液体培養をした後、バーンボイム(Bi
rnboim)らの方法〔ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ(Nucleic Acids Res.)、7
巻、1513〜1523頁(1979)〕によりプラス
ミドDNAを調製した。
で2回、つづいて5倍濃度のSSC(0.1%SDSを
含む)を用いて45℃で2回、4倍濃度のSSCで2回
ナイロンメンブランを洗浄した。この後ナイロンメンブ
ランを乾燥させ、オートラジオグラフィー(条件:−8
0℃、一夜)に供した。その結果、ハイブリダイゼーシ
ョン陽性のコロニーが3つ見出された。そこで陽性のコ
ロニーについて液体培養をした後、バーンボイム(Bi
rnboim)らの方法〔ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ(Nucleic Acids Res.)、7
巻、1513〜1523頁(1979)〕によりプラス
ミドDNAを調製した。
【0026】得られたプラスミドDNAを制限酵素Ec
oRI、SalIで切断し、アガロースゲル電気泳動を
行った後、ラベルしたDNAプローブとサザン(Son
thern)ハイブリダイゼーション〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー (J.Mol.Bi
ol)、98巻、503〜517頁(1975)〕を行
った。その結果、EcoRI、SalI切断で生成する
約3.6KbのDNA断片にDNAプローブが強くハイ
ブリダイズすることが見出された。なお分離された3株
は同一のプラスミドを有することが示され、GDHクロ
ーンの候補としてこのプラスミドをpGDA1と命名し
た。
oRI、SalIで切断し、アガロースゲル電気泳動を
行った後、ラベルしたDNAプローブとサザン(Son
thern)ハイブリダイゼーション〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー (J.Mol.Bi
ol)、98巻、503〜517頁(1975)〕を行
った。その結果、EcoRI、SalI切断で生成する
約3.6KbのDNA断片にDNAプローブが強くハイ
ブリダイズすることが見出された。なお分離された3株
は同一のプラスミドを有することが示され、GDHクロ
ーンの候補としてこのプラスミドをpGDA1と命名し
た。
【0027】(8) GDHクローンの同定とDNA塩
基配列の決定 プラスミドpGDA1よりEcoRI、Sau3AI切
断により生成する930bpのDNA断片についてサン
ガー(Sanger)らの方法〔プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ユーエス
エー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.)、74巻、5463〜5467頁(197
7)〕に従ってDNA塩基配列を決定した。
基配列の決定 プラスミドpGDA1よりEcoRI、Sau3AI切
断により生成する930bpのDNA断片についてサン
ガー(Sanger)らの方法〔プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ユーエス
エー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.)、74巻、5463〜5467頁(197
7)〕に従ってDNA塩基配列を決定した。
【0028】その結果、上記工程(2)で得られたGD
Hのアミノ基末端アミノ酸配列に完全に一致するアミノ
酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断片がG
DH遺伝子の一部を含むことが明らかになった。プラス
ミドpGDA1については、制限酵素切断の結果にもと
づいて図1に表される制限酵素地図を作成した。すでに
決定された塩基配列から遺伝子読取り方向の下流部位の
DNA塩基配列を決定したところ、配列番号:4に示さ
れる261個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする塩
基配列が存在することが示された。
Hのアミノ基末端アミノ酸配列に完全に一致するアミノ
酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断片がG
DH遺伝子の一部を含むことが明らかになった。プラス
ミドpGDA1については、制限酵素切断の結果にもと
づいて図1に表される制限酵素地図を作成した。すでに
決定された塩基配列から遺伝子読取り方向の下流部位の
DNA塩基配列を決定したところ、配列番号:4に示さ
れる261個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする塩
基配列が存在することが示された。
【0029】以上の結果によりプラスミドpGDA1中
のバチルス・メガテリウムIWG3由来のDNA断片中
にはGDHの構造遺伝子が完全に含まれているものと推
定される。
のバチルス・メガテリウムIWG3由来のDNA断片中
にはGDHの構造遺伝子が完全に含まれているものと推
定される。
【0030】(9) GDH遺伝子の発現 クローニングされたGDH遺伝子を大腸菌で発現させる
ためにプラスミドpGDA1中のバチルス・メガテリウ
ムIWG3由来のDNA断片から、以下に示す工程に従
い遺伝子の発現を試みた。
ためにプラスミドpGDA1中のバチルス・メガテリウ
ムIWG3由来のDNA断片から、以下に示す工程に従
い遺伝子の発現を試みた。
【0031】プラスミドpGDA1 10μgをEco
RI及びPvuIIで切断し、1%アガロース電気泳動
に供し、約1.5Kbの大きさの断片を回収した。得ら
れた断片1μgにdATP、dGTP、dCTP、dT
TPを終濃度各1mM、DNAポリメラーゼクレノウフ
ラグメント(Klenow fragment)4単位
を加え、10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、
7mM MgCl2、1mMジチオスレイトールの反応
液20μl中で、30℃、20分間反応させた。これに
より両端が平滑末端にされたDNA断片を精製し、その
約0.5μgにPstIリンカーとT4DNAリガーゼ
10単位を加え、66mMトリス−塩酸緩衝液(pH
7.5)、5mM MgCl2、5mMジチオスレイト
ール、1mM ATPの反応液20μl中で、14℃、
一夜反応させた。反応後DNA断片を精製し、BanI
Iで切断後、この断片にマングビーンヌクレアーゼ(M
ung bean nuclease)1単位を加え、
40mM酢酸ナトリウム(PH4.5)、100mM
NaCl、2mM ZnCl2、10%グリセロールの
反応液50μl中で、30℃、30分間反応させた。こ
の操作によりBanIIの突出末端を平滑末端にし、さ
らに上述したのと同様の方法でEcoRIリンカーを連
結した。反応後DNA断片を精製し、EcoRIとPs
tIで両端を切断し、EcoRI−PstI断片として
回収した。
RI及びPvuIIで切断し、1%アガロース電気泳動
に供し、約1.5Kbの大きさの断片を回収した。得ら
れた断片1μgにdATP、dGTP、dCTP、dT
TPを終濃度各1mM、DNAポリメラーゼクレノウフ
ラグメント(Klenow fragment)4単位
を加え、10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、
7mM MgCl2、1mMジチオスレイトールの反応
液20μl中で、30℃、20分間反応させた。これに
より両端が平滑末端にされたDNA断片を精製し、その
約0.5μgにPstIリンカーとT4DNAリガーゼ
10単位を加え、66mMトリス−塩酸緩衝液(pH
7.5)、5mM MgCl2、5mMジチオスレイト
ール、1mM ATPの反応液20μl中で、14℃、
一夜反応させた。反応後DNA断片を精製し、BanI
Iで切断後、この断片にマングビーンヌクレアーゼ(M
ung bean nuclease)1単位を加え、
40mM酢酸ナトリウム(PH4.5)、100mM
NaCl、2mM ZnCl2、10%グリセロールの
反応液50μl中で、30℃、30分間反応させた。こ
の操作によりBanIIの突出末端を平滑末端にし、さ
らに上述したのと同様の方法でEcoRIリンカーを連
結した。反応後DNA断片を精製し、EcoRIとPs
tIで両端を切断し、EcoRI−PstI断片として
回収した。
【0032】本実施例に用いられる発現用ベクターpK
K223−3は、ブロシウス (Brosius.
J.)ら〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・サイエンス・ユーエスエー(Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.)、81巻、6
929〜6933頁(1984)〕により報告されたも
のであり、プロモーターとしてtacプロモーターを有
している。
K223−3は、ブロシウス (Brosius.
J.)ら〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・サイエンス・ユーエスエー(Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.)、81巻、6
929〜6933頁(1984)〕により報告されたも
のであり、プロモーターとしてtacプロモーターを有
している。
【0033】この発現ベクターpKK223−3を制限
酵素EcoRIとPstIで切断した後、回収したEc
oRI−PstI断片と混合し、T4DNAリガーゼで
結合反応を行わせた。その反応液を用いてエシエリヒア
・コリJM105を形質転換し、アンピシリン50μg
/ml、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシ
ド(IPTG)を含むL−ブロス寒天培地上で生育して
くるコロニーを選択した。
酵素EcoRIとPstIで切断した後、回収したEc
oRI−PstI断片と混合し、T4DNAリガーゼで
結合反応を行わせた。その反応液を用いてエシエリヒア
・コリJM105を形質転換し、アンピシリン50μg
/ml、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシ
ド(IPTG)を含むL−ブロス寒天培地上で生育して
くるコロニーを選択した。
【0034】得られたコロニーについてGDHの発現を
確認するために、色素共役法を用いたコロニーアッセイ
を行った。コロニーをろ紙上にレプリカし、50mMト
リス−塩酸(pH7.5)、10mM EDTA緩衝液
にリゾチームを1mg/mlの濃度に調整したリゾチー
ム溶液をろ紙上のコロニーに加え、30℃、20分間保
温後、1%トリトン溶液を加え室温で5分間放置した。
さらに熱処理用の緩衝液[50mMリン酸緩衝液(pH
6.5)、2M−NaCl、50mM−EDTA〕を加
え、60℃、20分間熱処理を行った。
確認するために、色素共役法を用いたコロニーアッセイ
を行った。コロニーをろ紙上にレプリカし、50mMト
リス−塩酸(pH7.5)、10mM EDTA緩衝液
にリゾチームを1mg/mlの濃度に調整したリゾチー
ム溶液をろ紙上のコロニーに加え、30℃、20分間保
温後、1%トリトン溶液を加え室温で5分間放置した。
さらに熱処理用の緩衝液[50mMリン酸緩衝液(pH
6.5)、2M−NaCl、50mM−EDTA〕を加
え、60℃、20分間熱処理を行った。
【0035】次に基質混合液〔20mMトリス−塩酸
(pH8.0)、1M−NaCl、100mMグルコー
ス、0.5mMフェナジンエトサルフェート(PE
S)、0.5mM 3−(4′,5′−ジメチルチアゾ
ール−2−イール−2,5−ジフェニルテトラゾリウム
ブロマイド(MTT)、50μM−NAD〕を加え、3
7℃、5分間暗所にて放置する。対照実験として上記基
質混合液中のグルコースを除いたものを用いた。反応の
停止は、10%酢酸溶液を加えることにより行った。コ
ロニーの選択は、コロニーが青紫色に変化したものを選
んだ。コロニーアッセイの結果、多数の陽性コロニーを
得、この中の1株からプラスミドDNAを抽出し、これ
をpGDA2と命名し、制限酵素による切断で予想され
る構造、図2を確認した。
(pH8.0)、1M−NaCl、100mMグルコー
ス、0.5mMフェナジンエトサルフェート(PE
S)、0.5mM 3−(4′,5′−ジメチルチアゾ
ール−2−イール−2,5−ジフェニルテトラゾリウム
ブロマイド(MTT)、50μM−NAD〕を加え、3
7℃、5分間暗所にて放置する。対照実験として上記基
質混合液中のグルコースを除いたものを用いた。反応の
停止は、10%酢酸溶液を加えることにより行った。コ
ロニーの選択は、コロニーが青紫色に変化したものを選
んだ。コロニーアッセイの結果、多数の陽性コロニーを
得、この中の1株からプラスミドDNAを抽出し、これ
をpGDA2と命名し、制限酵素による切断で予想され
る構造、図2を確認した。
【0036】なお、本プラスミドをエシエリヒア・コリ
JM105へ形質転換により導入してGDH高発現株エ
シエリヒア・コリJM105/pGDA2を得た。本菌
株は工業技術院微生物工業技術研究所にFERM BP
−2584として寄託されている。 形質転換体Bの調製
JM105へ形質転換により導入してGDH高発現株エ
シエリヒア・コリJM105/pGDA2を得た。本菌
株は工業技術院微生物工業技術研究所にFERM BP
−2584として寄託されている。 形質転換体Bの調製
【0037】バチルス・メガテリウムIWG3にかえて
バチルス・メガテリウムIAM1030を用い、上記の
形質転換体の調製の(1)〜(9)と同様に操作し、
高GDH発現プラスミドDNAを抽出し、pGDA3と
命名した。次いで本プラスミドを形質転換してGDH高
発現株エシエリヒア・コリJM105/pGDA3を得
た。
バチルス・メガテリウムIAM1030を用い、上記の
形質転換体の調製の(1)〜(9)と同様に操作し、
高GDH発現プラスミドDNAを抽出し、pGDA3と
命名した。次いで本プラスミドを形質転換してGDH高
発現株エシエリヒア・コリJM105/pGDA3を得
た。
【0038】なお、バチルス・メガテリウムIAM10
30より得られたGDHのアミノ酸配列(配列番号:
5)は、配列番号:4で示されたバチルス・メガテリウ
ムIWG3由来GDHのDNAアミノ酸配列と比較して
そのN末端より22位のセリンがアラニンに、43位の
アスパラギン酸がグルタミン酸に、79位のアラニンが
セリンにそして95位のロイシンがメチオニンにそれぞ
れ置き換わったにすぎないことがわかった。
30より得られたGDHのアミノ酸配列(配列番号:
5)は、配列番号:4で示されたバチルス・メガテリウ
ムIWG3由来GDHのDNAアミノ酸配列と比較して
そのN末端より22位のセリンがアラニンに、43位の
アスパラギン酸がグルタミン酸に、79位のアラニンが
セリンにそして95位のロイシンがメチオニンにそれぞ
れ置き換わったにすぎないことがわかった。
【0039】即ちバチルス・メガテリウム由来GDHを
コードするDNAのアミノ酸配列は(配列番号:1)に
要約される。バチルス・メガテリウムIWG3由来GD
HのDNAのN末端より96位、252位及び253位
のアミノ酸に対応する塩基配列の変換
コードするDNAのアミノ酸配列は(配列番号:1)に
要約される。バチルス・メガテリウムIWG3由来GD
HのDNAのN末端より96位、252位及び253位
のアミノ酸に対応する塩基配列の変換
【0040】部位特異的変異手法〔ゾーラーら(M.Z
oller、M.Smith)、ヌクレイック・アシド
・リサーチ(Nucleic Acids Res)、
10巻、6487頁(1982)〕を用いてGDH遺伝
子のN末端より96位に対応する塩基配列GAA(グル
タミン酸)をGTA(バリン)に変換した変異遺伝子
(以下、E96V遺伝子という。)を調整した。更にN
末端より96位に対応する塩基配列GAA(グルタミン
酸)をAAA(リジン)に変換した変異遺伝子(以下、
E96K遺伝子という。)を調整した。次いで252位
に対応する塩基配列CAG(グルタミン)をCTG(ロ
イシン)に、253位に対応する塩基配列TAC(チロ
シン)をGAA(グルタミン酸)に変換して変異遺伝子
(以下、Q252L−Y253E遺伝子という。)を調
整した。
oller、M.Smith)、ヌクレイック・アシド
・リサーチ(Nucleic Acids Res)、
10巻、6487頁(1982)〕を用いてGDH遺伝
子のN末端より96位に対応する塩基配列GAA(グル
タミン酸)をGTA(バリン)に変換した変異遺伝子
(以下、E96V遺伝子という。)を調整した。更にN
末端より96位に対応する塩基配列GAA(グルタミン
酸)をAAA(リジン)に変換した変異遺伝子(以下、
E96K遺伝子という。)を調整した。次いで252位
に対応する塩基配列CAG(グルタミン)をCTG(ロ
イシン)に、253位に対応する塩基配列TAC(チロ
シン)をGAA(グルタミン酸)に変換して変異遺伝子
(以下、Q252L−Y253E遺伝子という。)を調
整した。
【0041】更にE96K遺伝子を含む形質転換体及び
Q252L−Y253E遺伝子を含む形質転換体を用い
た読みとりわく中にただ1箇所存在する制限酵素部位を
用いた組換え法を用いて96位、252位及び253位
を変換した変異型酵素遺伝子(以下、E96K−Q25
2L−Y253E遺伝子という。)を得た。
Q252L−Y253E遺伝子を含む形質転換体を用い
た読みとりわく中にただ1箇所存在する制限酵素部位を
用いた組換え法を用いて96位、252位及び253位
を変換した変異型酵素遺伝子(以下、E96K−Q25
2L−Y253E遺伝子という。)を得た。
【0042】変異二本鎖遺伝子断片の調製 前記の各変異処理DNA(E96V遺伝子、Q252L
−Y253E遺伝子及びE96K−Q252L−Y25
3E遺伝子)10μgに10倍濃度の逆転写酵素用緩衝
液〔70mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5),70m
M塩化マグネシウム,0.5M塩化ナトリウム,20m
Mジチオスレイトール〕10μlと20pmolのプラ
イマーを含む溶液2μlと蒸留水74μlを加えて85
℃,5分間,40℃,15分間保温した後、10mMの
dNTP 13μlと逆転写酵素1μl(20単位)を
加えて37℃で反応を行った。1時間後フェノール抽出
を行った後エタノール沈澱を行い、沈澱物を溶解後、制
限酵素EcoRI,PstIで分解し、アガロースゲル
電気泳動を行い、ゲルより変異二本鎖遺伝子断片を常法
に従い回収した。
−Y253E遺伝子及びE96K−Q252L−Y25
3E遺伝子)10μgに10倍濃度の逆転写酵素用緩衝
液〔70mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5),70m
M塩化マグネシウム,0.5M塩化ナトリウム,20m
Mジチオスレイトール〕10μlと20pmolのプラ
イマーを含む溶液2μlと蒸留水74μlを加えて85
℃,5分間,40℃,15分間保温した後、10mMの
dNTP 13μlと逆転写酵素1μl(20単位)を
加えて37℃で反応を行った。1時間後フェノール抽出
を行った後エタノール沈澱を行い、沈澱物を溶解後、制
限酵素EcoRI,PstIで分解し、アガロースゲル
電気泳動を行い、ゲルより変異二本鎖遺伝子断片を常法
に従い回収した。
【0043】耐熱化GDH遺伝子保持株の選択 前工程により得られた変異二本鎖遺伝子断片を発現ベク
ターpKK223のEcoRI,PstI切断部位へ組
み込み、大腸菌エシエリヒア・コリJM103を形質転
換した。シャーレ培地上に生育したコロニーについて、
ろ紙を用いるレプリカプリント法により酵素活性を調べ
た。ろ紙上に強い発色が認められた菌株をマスタープレ
ートから鈎菌する。
ターpKK223のEcoRI,PstI切断部位へ組
み込み、大腸菌エシエリヒア・コリJM103を形質転
換した。シャーレ培地上に生育したコロニーについて、
ろ紙を用いるレプリカプリント法により酵素活性を調べ
た。ろ紙上に強い発色が認められた菌株をマスタープレ
ートから鈎菌する。
【0044】次に上記方法により選択された菌株を各々
2XTY培地5mlに接種して37℃,18時間振盪培
養を行なった。集菌洗浄後、菌体懸濁液を超音波処理
し、遠心分離を行って上清液を得た。
2XTY培地5mlに接種して37℃,18時間振盪培
養を行なった。集菌洗浄後、菌体懸濁液を超音波処理
し、遠心分離を行って上清液を得た。
【0045】変異酵素遺伝子の塩基配列決定と変異の同
定 変異酵素遺伝子保持株よりプラスミドDNAを調製し、
常法に従って遺伝子断片の塩基配列の決定を行い、変異
点を明らかにし、酵素蛋白質のアミノ酸配列上の変化を
確認した。
定 変異酵素遺伝子保持株よりプラスミドDNAを調製し、
常法に従って遺伝子断片の塩基配列の決定を行い、変異
点を明らかにし、酵素蛋白質のアミノ酸配列上の変化を
確認した。
【0046】即ち、バチルス・メガテリウムIWG3由
来GDH天然型DNAのアミノ酸配列のN末端より96
位のグルタミン酸がバリンに変化した改良型組換えDN
AであるpGDA2F−30、252位のグルタミンが
ロイシンに、253位のチロシンがグルタミン酸に変化
した改良型組換えDNAであるpGDA2F−40、同
じくN末端より96位のグルタミン酸がアラニンに、2
52位のグルタミンがロイシンに、更に253位のチロ
シンがグルタミン酸に変化した改良型組換えDNAであ
るpGDA2F−50の各改良型組換えDNAが得られ
た。
来GDH天然型DNAのアミノ酸配列のN末端より96
位のグルタミン酸がバリンに変化した改良型組換えDN
AであるpGDA2F−30、252位のグルタミンが
ロイシンに、253位のチロシンがグルタミン酸に変化
した改良型組換えDNAであるpGDA2F−40、同
じくN末端より96位のグルタミン酸がアラニンに、2
52位のグルタミンがロイシンに、更に253位のチロ
シンがグルタミン酸に変化した改良型組換えDNAであ
るpGDA2F−50の各改良型組換えDNAが得られ
た。
【0047】次いで各プラスミドでエシエリヒア・コリ
JM103を形質転換して得られた各形質転換体(エシ
エリヒア・コリJM103/pGDA2F−30、エシ
エリヒア・コリJM103/pGDA2F−40及びエ
シエリヒア・コリJM103/pGDA2F−50)に
ついて2XTYブロス培地で37℃,18時間培養し、
集菌後、菌体懸濁液を超音波処理し、遠心分離後、得ら
れた上澄液をDEAE−セファロースカラムクロマトグ
ラフィーで電気泳動的に均一まで精製した。この酵素に
ついて以下の試験を行った。
JM103を形質転換して得られた各形質転換体(エシ
エリヒア・コリJM103/pGDA2F−30、エシ
エリヒア・コリJM103/pGDA2F−40及びエ
シエリヒア・コリJM103/pGDA2F−50)に
ついて2XTYブロス培地で37℃,18時間培養し、
集菌後、菌体懸濁液を超音波処理し、遠心分離後、得ら
れた上澄液をDEAE−セファロースカラムクロマトグ
ラフィーで電気泳動的に均一まで精製した。この酵素に
ついて以下の試験を行った。
【0048】エシエリヒア・コリJM103/pGDA
2F−50より得られたGDHを、各緩衝液中において
2MのNaClの存在下および非存在下の条件で、30
℃、20分間処理したときのpH安定性を検討した(p
H4〜6は75mM酢酸緩衛液、pH6〜7.5および
pH11〜12は75mMリン酸緩衝液、pH7.5〜
8.5は75mMトリスー塩酸緩衝液、PH8.5〜1
0.5は75mMグリシン−NaOH緩衝液を使用)。
その結果を、図4に示す。
2F−50より得られたGDHを、各緩衝液中において
2MのNaClの存在下および非存在下の条件で、30
℃、20分間処理したときのpH安定性を検討した(p
H4〜6は75mM酢酸緩衛液、pH6〜7.5および
pH11〜12は75mMリン酸緩衝液、pH7.5〜
8.5は75mMトリスー塩酸緩衝液、PH8.5〜1
0.5は75mMグリシン−NaOH緩衝液を使用)。
その結果を、図4に示す。
【0049】エシエリヒア・コリJM103/pGDA
2F−50より得られたGDHを、各温度においてNa
Cl非存在下の条件で、50mMリン酸緩衝液(pH
6.5)中で20分間処理したときの温度安定性を検討
した。その結果を図5に示す。
2F−50より得られたGDHを、各温度においてNa
Cl非存在下の条件で、50mMリン酸緩衝液(pH
6.5)中で20分間処理したときの温度安定性を検討
した。その結果を図5に示す。
【0050】エシエリヒア・コリJM103/pGDA
2F−40より得られたGDHを、各温度においてNa
Cl非存在下の条件で、50mMリン酸緩衝液(pH
6.5)中で20分間処理したときの温度安定性を検討
した。その結果も図5に示す。
2F−40より得られたGDHを、各温度においてNa
Cl非存在下の条件で、50mMリン酸緩衝液(pH
6.5)中で20分間処理したときの温度安定性を検討
した。その結果も図5に示す。
【0051】図3、図4および図5より明らかのよう
に、GDHをコードするアミノ酸配列で示される特定の
アミノ酸、即ちN末端より96位のグルタミン酸がアラ
ニンに、252位のグルタミンがロイシンに更に253
位のチロシンがグルタミン酸に置換することによって、
イオン強度が低い場合において、どのpHにおいても活
性を保持し、さらに天然型と比較して熱にも安定なGD
Hが生産されることがわかる。
に、GDHをコードするアミノ酸配列で示される特定の
アミノ酸、即ちN末端より96位のグルタミン酸がアラ
ニンに、252位のグルタミンがロイシンに更に253
位のチロシンがグルタミン酸に置換することによって、
イオン強度が低い場合において、どのpHにおいても活
性を保持し、さらに天然型と比較して熱にも安定なGD
Hが生産されることがわかる。
【0052】図5より明らかなように96位のグルタミ
ン酸がバリンに置換することによって、天然型と比較し
てGDHの耐熱性が向上することがわかる。
ン酸がバリンに置換することによって、天然型と比較し
てGDHの耐熱性が向上することがわかる。
【0053】更に、252位のグルタミンがロイシン
に、253位のチロシンがグルタミン酸に置換すること
によって、天然型と比較してGDHの耐熱性が向上する
ことがわかる。
に、253位のチロシンがグルタミン酸に置換すること
によって、天然型と比較してGDHの耐熱性が向上する
ことがわかる。
【0054】形質転換体エシエリヒア・コリをアンピシ
リン50μg/mlを含む2XTYブロス100mlに
植菌し、37℃で13時間振盪培養後、IPTG(終濃
度0.1mM)を添加して2時間後に遠心分離により集
菌し、2MのNaClを含む50mMリン酸塩緩衝液
(pH6.5)で洗浄後、10mlの同緩衝液に懸濁
し、超音波破砕機により破砕後、遠心分離して上清液を
得た。一方、対照としてバチルス・メガテリウムIWG
3を2XTYブロス100mlに植菌し、37℃,24
時間振盪培養した。次に上記と同様に集菌し、洗浄後、
超音波破砕処理した後、遠心分離し、その上清を酵素液
とした。
リン50μg/mlを含む2XTYブロス100mlに
植菌し、37℃で13時間振盪培養後、IPTG(終濃
度0.1mM)を添加して2時間後に遠心分離により集
菌し、2MのNaClを含む50mMリン酸塩緩衝液
(pH6.5)で洗浄後、10mlの同緩衝液に懸濁
し、超音波破砕機により破砕後、遠心分離して上清液を
得た。一方、対照としてバチルス・メガテリウムIWG
3を2XTYブロス100mlに植菌し、37℃,24
時間振盪培養した。次に上記と同様に集菌し、洗浄後、
超音波破砕処理した後、遠心分離し、その上清を酵素液
とした。
【0055】GDHの酵素活性は以下の方法にしたがっ
て測定した。D−グルコース 0.1M、NAD 20
mMを含む75mMトリス塩酸緩衝液に酵素液を加えて
光度計セル内にて30℃で反応させ、340nmにおけ
る吸光度の増大を測定する。反応の1分間に1μmol
eのNADHを生成する酵素活性を1単位と定め、比活
性は酵素液中の蛋白質1mg当りの単位数として示し
た。
て測定した。D−グルコース 0.1M、NAD 20
mMを含む75mMトリス塩酸緩衝液に酵素液を加えて
光度計セル内にて30℃で反応させ、340nmにおけ
る吸光度の増大を測定する。反応の1分間に1μmol
eのNADHを生成する酵素活性を1単位と定め、比活
性は酵素液中の蛋白質1mg当りの単位数として示し
た。
【0056】その結果、エシエリヒア・コリJM103
/pGDA2F−50より得られたGDHの比活性(p
H6.5)は2MのNaCl存在下では12.7u/m
gを示し、非存在下では9.20u/mgを示した。つ
まリ、エシエリヒア・コリJM103/pGDA2F−
50より生産されたGDHはイオン強度に関係なく四量
体で存在して活性を示すものと考えられる。
/pGDA2F−50より得られたGDHの比活性(p
H6.5)は2MのNaCl存在下では12.7u/m
gを示し、非存在下では9.20u/mgを示した。つ
まリ、エシエリヒア・コリJM103/pGDA2F−
50より生産されたGDHはイオン強度に関係なく四量
体で存在して活性を示すものと考えられる。
【0057】エシエリヒア・コリJM103/pGDA
2F−40より得られたGDHの比活性は2MのNaC
l存在下では7.67u/mgを示し、非存在下では
0.96u/mgを示した。つまりエシエリヒア・コリ
JM103/pGDA2F−40より生産されたGDH
はイオン強度の低い状態では解離して活性を示さないも
のと考えられる。
2F−40より得られたGDHの比活性は2MのNaC
l存在下では7.67u/mgを示し、非存在下では
0.96u/mgを示した。つまりエシエリヒア・コリ
JM103/pGDA2F−40より生産されたGDH
はイオン強度の低い状態では解離して活性を示さないも
のと考えられる。
【0058】バチルス・メガテリウムIWG3より得ら
れたGDHの比活性(pH6.5)は2MのNaCl存
在下及び非存在下のいずれにおいても510u/mgを
示した。しかし、pH9.0における非活性は2MのN
aCl存在下では475u/mgを示したが、非存在下
では活性を示さなかった。つまリバチルス・メガテリウ
ムIWG3より生産されたGDHはイオン強度の低い状
態では解離して活性を示さないものと考えられる。
れたGDHの比活性(pH6.5)は2MのNaCl存
在下及び非存在下のいずれにおいても510u/mgを
示した。しかし、pH9.0における非活性は2MのN
aCl存在下では475u/mgを示したが、非存在下
では活性を示さなかった。つまリバチルス・メガテリウ
ムIWG3より生産されたGDHはイオン強度の低い状
態では解離して活性を示さないものと考えられる。
【0059】バチルス・メガテリウムIWG3に代え
て、バチルス・メガテリウムIAM1030を用いて同
様にして形質転換体を得、GDHを生産したところ、上
記と同様の結果となった。
て、バチルス・メガテリウムIAM1030を用いて同
様にして形質転換体を得、GDHを生産したところ、上
記と同様の結果となった。
【0060】
【発明の効果】本発明は、バチルス・メガテリウム由来
のGDHをコードするDNAのアミノ酸配列で示される
特定位置のアミノ酸を、他のアミノ酸で置き換えて得ら
れる改良型DNAをを提供し、更にGDH高発現用ベク
ターに組み込んだ大腸菌内で複製可能な改良型組換えD
NAを含む形質転換体を培養することによって、イオン
強度に影響されずどのpHにおいても四量体の形で存在
し、さらに熱にも安定なGDHを安価に大量に供給する
ことを可能としたものである。
のGDHをコードするDNAのアミノ酸配列で示される
特定位置のアミノ酸を、他のアミノ酸で置き換えて得ら
れる改良型DNAをを提供し、更にGDH高発現用ベク
ターに組み込んだ大腸菌内で複製可能な改良型組換えD
NAを含む形質転換体を培養することによって、イオン
強度に影響されずどのpHにおいても四量体の形で存在
し、さらに熱にも安定なGDHを安価に大量に供給する
ことを可能としたものである。
【0061】
【0062】
【0064】
【0065】
【図1】プラスミドpGDA1の制限酵素地図を示すも
のである。
のである。
【図2】プラスミドpGDA2の制限酵素地図を示すも
のである。
のである。
【図3】改良型組換えDNAであるpGDA2F−40
を組み込んだ形質転換体を培養することによって生産さ
れるGDHのpH安定性を示すものである。図中におい
て、−−は2MのNaCl存在下での結果を示し、−●
−はNaClの非存在下での結果を示す。
を組み込んだ形質転換体を培養することによって生産さ
れるGDHのpH安定性を示すものである。図中におい
て、−−は2MのNaCl存在下での結果を示し、−●
−はNaClの非存在下での結果を示す。
【図4】改良型組換えDNAであるpGDA2F−50
を組み込んだ形質転換体を培養することによって生産さ
れるGDHのpH安定性を示すものである。図中におい
て、−−は2M NaClの存在下での結果を示し、−
●−はNaClの非存在下での結果を示す。
を組み込んだ形質転換体を培養することによって生産さ
れるGDHのpH安定性を示すものである。図中におい
て、−−は2M NaClの存在下での結果を示し、−
●−はNaClの非存在下での結果を示す。
【図5】改良型組換えDNAであるpGDA2F−3
0,pGDA2F−40及びpGDA2F−50を組み
込んだ形質転換体を培養することによって生産されるG
DHの温度安定性を示すものである。図中において、−
■−はバチルス・メガテリウムIWG3より得られたG
DHを示し、−□−はpGDA2F−30の場合を示
し、−●−はpGDA2F−40の場合を示し−−はp
GDA2F−50の場合を示す。
0,pGDA2F−40及びpGDA2F−50を組み
込んだ形質転換体を培養することによって生産されるG
DHの温度安定性を示すものである。図中において、−
■−はバチルス・メガテリウムIWG3より得られたG
DHを示し、−□−はpGDA2F−30の場合を示
し、−●−はpGDA2F−40の場合を示し−−はp
GDA2F−50の場合を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI (C12N 9/04 C12R 1:19) C12R 1:19) 1:11) (C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA C12R 1:11) C12R 1:11) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/21 C12N 9/04 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG) JICSTファイル(JOIS)
Claims (3)
- 【請求項1】 配列表の配列番号:1で示されるバチル
ス・メガテリウム由来のグルコースデヒドロゲナーゼを
コードするDNAのN末端から96位のグルタミン酸を
リジンに、252位のグルタミンをロイシンに、253
位のチロシンをグルタミン酸に置換し、大腸菌導入ベク
ターに組み込んだ大腸菌内で複製可能な組換えDNA。 - 【請求項2】 請求項1の組換えDNAを導入したエシ
エリヒア・コリ。 - 【請求項3】 請求項2の形質転換体を栄養培地で培養
し、グルコースデヒドロゲナーゼを培養物中に産生せし
め、該培養物中よりグルコースデヒドロゲナーゼを採取
することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼの製
造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10692791A JP3220471B2 (ja) | 1991-02-13 | 1991-02-13 | 組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10692791A JP3220471B2 (ja) | 1991-02-13 | 1991-02-13 | 組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04258293A JPH04258293A (ja) | 1992-09-14 |
JP3220471B2 true JP3220471B2 (ja) | 2001-10-22 |
Family
ID=14446047
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10692791A Expired - Fee Related JP3220471B2 (ja) | 1991-02-13 | 1991-02-13 | 組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3220471B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101980065B1 (ko) | 2011-03-30 | 2019-05-21 | 니프로 가부시키가이샤 | 개변형 글루코스 데히드로게나제 |
-
1991
- 1991-02-13 JP JP10692791A patent/JP3220471B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH04258293A (ja) | 1992-09-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2017129136A1 (zh) | 一种d-乳酸脱氢酶、含有该酶的工程菌株及其构建和应用 | |
CN113862233B (zh) | 提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体q241e/r499e、基因和应用 | |
EP0774512A2 (en) | A method for production of protein using molecular chaperon | |
US5114853A (en) | Recombinant dna, transformant containing said dna, and process for preparing heat-stable glucose dehydrogenase by use of said transformant | |
JP2729628B2 (ja) | 巨大菌からのグルコース・デヒドロゲナーゼの調製方法 | |
JP3948027B2 (ja) | 核酸類の製造方法 | |
JP4216719B2 (ja) | ハロゲン化合物耐性新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法 | |
US5229286A (en) | Cloning and overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc dextranicus | |
CN113088501A (zh) | 一种用于生产l-草铵膦的谷氨酸脱氢酶突变体及l-草铵膦生产方法 | |
JP3220471B2 (ja) | 組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法 | |
JP2971218B2 (ja) | ウリカーゼ遺伝子およびウリカーゼの製造法 | |
CN116144622A (zh) | 一种溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备 | |
JP4287144B2 (ja) | 新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法 | |
JP4880859B2 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 | |
CN108624568B (zh) | 变异黄嘌呤脱氢酶及其应用 | |
JP4352286B2 (ja) | 変異型グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼおよびその製造法 | |
WO2012133761A1 (ja) | 改変型グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JP2942564B2 (ja) | 乳酸オキシダーゼの遺伝情報を有するdnaおよびその用途 | |
JP2003274964A (ja) | 新規グルコース脱水素酵素及びそれをコードする遺伝子 | |
KR102688095B1 (ko) | 변이형 SpoT 단백질 및 이를 이용한 L-아미노산을 생산하는 방법 | |
JPS63157986A (ja) | 遺伝子組換によるl−フエニルアラニンの製造方法 | |
JP3508871B2 (ja) | クレアチニンデイミナーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するdna並びにクレアチニンデイミナーゼの製造法 | |
JPH10248574A (ja) | 新規な乳酸酸化酵素 | |
JP2000350585A (ja) | 耐熱耐酸素性ヒドロゲナーゼ遺伝子 | |
JPH11313683A (ja) | 新規キシロシダーゼ遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体及びその利用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |