JP2007031389A - Nucleotide derivative and utilization thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヌクレオチド配列中の塩基種を決定するためのヌクレオチド誘導体及びその利用に関する。 The present invention relates to a nucleotide derivative and its use for determining a base species in a nucleotide sequence.
近年、薬剤の有効性やガンなどの各種疾患の予防や予後、広くは体質などの各個体における治療上の診断及び方針並びに疾患を予防するための生活習慣方針の指標としてＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）が用いられるようになってきている。 In recent years, SNP (Single Nucleide Polymorphism: as an index of therapeutic diagnosis and policy in various individuals such as the effectiveness of drugs and cancer, as well as the constitution and treatment policy and lifestyle policy for preventing disease in recent years: Single nucleotide polymorphism) has been used.
ＳＮＰタイピング法としては、ハイブリダイゼーション効率、酵素認識効率等が知られているが、なかでもＤＮＡマイクロアレイ等を利用したヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーション効率による方法について報告されている（非特許文献１）。例えば、ハイブリダイゼーションを用いたＳＮＰタイピングは、プローブと標識したヌクレオチドとハイブリダイゼーション効率、すなわち、ハイブリダイゼーションにおける融解温度を指標とする方法が一般的であるが、このためには、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを標的とするヌクレオチド配列毎に厳密に設定する必要がある。さらに、こうした緻密な条件設定にもかかわらず、ミスハイブリダイゼーションによる測定誤差が避けられないものとなっている。また、こうした融解温度を指標とするのは、ヌクレオチド配列における塩基を間接的に特定するものに過ぎないにも関わらず、多大な労力を要するものとなっていた。 As the SNP typing method, hybridization efficiency, enzyme recognition efficiency, and the like are known. Among them, a method based on hybridization efficiency between nucleotide sequences using a DNA microarray or the like has been reported (Non-patent Document 1). For example, SNP typing using hybridization is generally performed by using a probe and a labeled nucleotide and hybridization efficiency, that is, a melting temperature in hybridization as an index, and for this purpose, hybridization stringency is used. It is necessary to set strictly for each nucleotide sequence targeting the. Furthermore, despite such precise condition settings, measurement errors due to mishybridization are inevitable. In addition, using such a melting temperature as an index is merely an indirect specification of a base in a nucleotide sequence, but requires a lot of labor.
本発明者らは、既にＳＮＰタイピングを省力化するために、標的ヌクレオチド配列中の特定塩基種と相対する時とそれ以外の塩基種と相対する時とにおいて蛍光シグナルが変化するヌクレオチド誘導体を見出し、この特定塩基との相対時における蛍光シグナルで当該特定塩基を識別できることを見出した。そして、このヌクレオチド誘導体をキャプチャープローブとして用いることにより、塩基種を直接的に特定する手法を開発している（特許文献１）。すなわち、この手法によれば、こうしたヌクレオチド誘導体をキャプチャープローブの特定部位に配置し、標識していない標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを行って蛍光を検出し、こうした蛍光シグナルが特定塩基と相対したときの蛍光シグナルかどうかを判定することにより、標的ヌクレオチド配列の特定部位の塩基種を特定することができる。すなわち、塩基種をハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルの変化から直接的に特定することができる。
しかしながら、こうしたヌクレオチド誘導体を用いた蛍光の最大吸収波長が紫外領域に近いほど、蛍光強度が小さくなる傾向があるなど、シグナルの識別性が低くなる傾向がある。この結果、シグナル検出の精度や再現性が低下する傾向があった。 However, as the maximum absorption wavelength of fluorescence using such a nucleotide derivative is closer to the ultraviolet region, the signal distinguishability tends to be lowered, for example, the fluorescence intensity tends to decrease. As a result, the accuracy and reproducibility of signal detection tended to decrease.
そこで、本発明は、ハイブリダイゼーションによるヌクレオチド配列の分析に際して、識別性の高い蛍光発光特性を備えるヌクレオチド誘導体及びその利用を提供する。また、本発明は、容易かつ高精度に塩基種を特定できるヌクレオチド誘導体及びその利用を他の一つの目的とする。なお、ヌクレオチド誘導体の利用には、ヌクレオシド誘導体、プローブ、プローブ固定化体、ハイブリダイゼーション方法などが包含される。 Therefore, the present invention provides a nucleotide derivative having highly discriminating fluorescence emission characteristics and use thereof when analyzing a nucleotide sequence by hybridization. Another object of the present invention is to provide a nucleotide derivative that can easily and accurately specify a base species and its use. Use of nucleotide derivatives includes nucleoside derivatives, probes, probe-immobilized products, hybridization methods, and the like.
本発明者らは、少なくとも上記した一つの課題を解決するために以下の手段を創出した。 The present inventors have created the following means in order to solve at least one of the problems described above.
本発明の一つの形態によれば、以下の一般式（１）で表されるヌクレオチド誘導体が提供される。
この発明において、ヌクレオチドとは、プリン塩基又はピリミジン塩基がβ−Ｎ−グリコシド結合により結合したヌクレオシドのリン酸エステルを意味している。また、ヌクレオチド誘導体とは、ヌクレオチドに、リンカーを介してアントラセン化合物を備えたものを意味している。アントラセン化合物とは、アントラセン骨格を有する化合物である。 In the present invention, the nucleotide means a nucleoside phosphate ester in which purine bases or pyrimidine bases are linked by β-N-glycoside bonds. The nucleotide derivative means a nucleotide having an anthracene compound via a linker. An anthracene compound is a compound having an anthracene skeleton.
このヌクレオチド誘導体によれば、このヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体を少なくとも一つのユニットとして有する一本鎖のヌクレオチド配列がハイブリダイズする相手鎖の相対する塩基の種類によって蛍光発光特性が相違する結果、特定の塩基を識別可能な蛍光発光特性を発揮する。 According to this nucleotide derivative, the fluorescence emission characteristics differ depending on the type of the opposite base of the partner strand to which the single-stranded nucleotide sequence having the phosphate monoester of this nucleotide derivative as at least one unit hybridizes. It exhibits fluorescence emission characteristics that can identify specific bases.
こうしたヌクレオチド誘導体としては、以下の一般式（２）で表されるヌクレオチド誘導体；
以下の一般式（３）で表されるヌクレオチド誘導体；
以下の一般式（４）で表されるヌクレオチド誘導体；
以下の一般式（５）で表されるヌクレオチド誘導体；
A nucleotide derivative represented by the following general formula (5);
また、本発明の別の形態によれば、以下の一般式（６）で表されるヌクレオシド誘導体も提供される。
さらに、具体的には、以下の一般式（７）で表されるヌクレオシド誘導体；
以下の一般式（８）で表されるヌクレオシド誘導体；
以下の一般式（９）で表されるヌクレオシド誘導体；
以下の一般式（１０）で表されるヌクレオチド誘導体；
また、本発明の他の形態によれば、上記ヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体の１種又は２種以上をホスホジエステル結合を介して備える、ポリヌクレオチド誘導体が提供される。 Moreover, according to the other form of this invention, the polynucleotide derivative provided with 1 type, or 2 or more types of the phosphate monoester body of the said nucleotide derivative through a phosphodiester bond is provided.
本発明の他の形態によれば、上記いずれかのヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体の１種又は２種以上をホスホジエステル結合を介して備える、プローブが提供される。このプローブにおいては、前記ヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体は、標的ポリヌクレオチドの検出しようとするｌ個又は２個以上の塩基種に対応して備えられている。 According to another aspect of the present invention, there is provided a probe comprising one or more phosphate monoesters of any of the above nucleotide derivatives via a phosphodiester bond. In this probe, the phosphate monoester of the nucleotide derivative is provided corresponding to one or two or more base species to be detected by the target polynucleotide.
また、本発明の他の形態によれば、上記プローブの１種又は２種以上が固相に固定化されたプローブ固定化体が提供される。この固定化体は、前記固相がプレート状であることが好ましい態様であり、さらに、前記プローブの１種又は２種以上は、それぞれ別個の領域を有して配列されていることが好ましい。また、この形態においては、一塩基多型を検出するためのプローブセットが固定化されていることが好ましい態様である。 According to another aspect of the present invention, there is provided a probe-immobilized body in which one or more of the probes are immobilized on a solid phase. In this immobilized body, the solid phase is preferably in the form of a plate, and one or more of the probes are preferably arranged with separate regions. Moreover, in this form, it is a preferable aspect that the probe set for detecting a single nucleotide polymorphism is immobilized.
また、本発明の他の形態によれば、ハイブリダイゼーション方法であって、上記プローブと標的ポリヌクレオチド配列とをハイブリダイゼーションさせる工程と、前記ハイブリダイゼーションのハイブリダイズ産物の蛍光を測定する工程と、ハイブリダイズ産物の蛍光測定結果と使用したプローブが備えるヌクレオチド誘導体の特定塩基を識別可能な蛍光発光特性とに基づいて標的ポリヌクレオチド中の１個又は２個以上の塩基種を同定する評価工程とを、を備えることを特徴としている。このハイブリダイゼーション工程は、上記プローブを固相に固定化したプローブ固定化体を用いることが好ましい態様である。また、前記プローブとして、一塩基多型を検出するためのプローブセットを用いることも好ましい態様である。 According to another aspect of the present invention, there is provided a hybridization method comprising: a step of hybridizing the probe with a target polynucleotide sequence; a step of measuring fluorescence of a hybridization product of the hybridization; An evaluation step for identifying one or more base species in the target polynucleotide on the basis of the fluorescence measurement result of the soybean product and the fluorescence emission characteristic capable of identifying the specific base of the nucleotide derivative provided in the probe used, It is characterized by having. In this hybridization step, a probe-immobilized body in which the probe is immobilized on a solid phase is preferably used. Moreover, it is also a preferable aspect to use a probe set for detecting a single nucleotide polymorphism as the probe.
本発明のヌクレオチド誘導体は、ピリミジン塩基又はプリン塩基に、リンカーを介してアントラセン化合物を備える、新規なヌクレオチド誘導体である。本発明のヌクレオチド誘導体によれば、標的ポリヌクレオチド等の相手鎖とハイブリダイズしたとき、相手鎖の相対する部位の塩基の種類により、その強度及び／又は最大吸収波長等において異なった蛍光発光を示す。こうした蛍光発光の特性の違いから、特定塩基と相対したときの特徴的な蛍光発光特性を当該ヌクレオチド誘導体に関連付けることができる。これにより、このヌクレオチド誘導体を備えるポリヌクレオチドと相手鎖とのハイブリダイゼーションにおいて両者間の相補性の検出が可能になるとともに、相手鎖の未知の塩基種を特定することができるようになる。したがって、本発明のヌクレオチド誘導体は、塩基識別性を有するヌクレオチド誘導体として用いることができる。 The nucleotide derivative of the present invention is a novel nucleotide derivative comprising an anthracene compound via a linker on a pyrimidine base or purine base. According to the nucleotide derivative of the present invention, when hybridized with a partner strand such as a target polynucleotide, the fluorescent light emission differs in intensity and / or maximum absorption wavelength depending on the type of base at the opposite site of the partner strand. . Due to the difference in the characteristics of the fluorescence emission, the characteristic fluorescence emission characteristic when facing a specific base can be associated with the nucleotide derivative. This makes it possible to detect complementarity between the polynucleotide comprising the nucleotide derivative and the partner strand and to identify an unknown base species of the partner strand. Therefore, the nucleotide derivative of the present invention can be used as a nucleotide derivative having base discrimination.
また、本発明のヌクレオチド誘導体においては、アントラセン化合物を備えており、相手鎖とハイブリダイズして特定塩基と相対したときの蛍光波長は、従来よりも長波長側にシフトしているとともに、蛍光強度が増強されている。したがって、識別性に優れた塩基識別性ヌクレオチド誘導体として用いることができる。さらに、より長波長側での蛍光検出が可能であり蛍光強度の高い塩基識別性ヌクレオチド誘導体によれば、容易にかつ高精度に相手鎖との相補性や塩基種を特定できる。なお、本発明のヌクレオチド誘導体におけるアントラセン化合物は、相手鎖とハイブリダイゼーションする際、相対するヌクレオチド間に結合するインターカレーターとして機能しているものと考えられる。 In addition, the nucleotide derivative of the present invention comprises an anthracene compound, and the fluorescence wavelength when hybridized with the partner strand and opposed to the specific base is shifted to a longer wavelength side than before, and the fluorescence intensity Has been strengthened. Therefore, it can be used as a base discriminating nucleotide derivative having excellent discrimination. Furthermore, according to the base-discriminating nucleotide derivative capable of detecting fluorescence at a longer wavelength side and having high fluorescence intensity, complementarity with the partner strand and base species can be easily and accurately specified. In addition, it is thought that the anthracene compound in the nucleotide derivative of the present invention functions as an intercalator that binds between opposing nucleotides when hybridized with the partner strand.
また、本発明のヌクレオチド誘導体によれば、アントラセン化合物を備えることにより、蛍光物質としてピレンを備える場合よりも蛍光波長を長波長側にシフトさせることができ、この結果、識別性の高い蛍光シグナルを得ることができる。また、固相担体からのノイズを抑制できるため、検出感度が良好で、検出精度や再現性が良好な蛍光シグナルを得ることができる。この結果、塩基種の特定を簡易にかつ精度よく実施できる。 In addition, according to the nucleotide derivative of the present invention, by providing an anthracene compound, the fluorescence wavelength can be shifted to a longer wavelength side than when pyrene is provided as a fluorescent substance, and as a result, a highly distinct fluorescent signal can be obtained. Obtainable. In addition, since noise from the solid phase carrier can be suppressed, a fluorescent signal with good detection sensitivity and good detection accuracy and reproducibility can be obtained. As a result, the base species can be identified easily and accurately.
本発明の他の形態である、ヌクレオシド誘導体、ポリヌクレオチド誘導体、プローブ、ハイブリダイゼーション方法及びプローブ固定化体は、いずれも、本発明のヌクレオチド誘導体に関しており、これらについて順次説明する。 The nucleoside derivative, the polynucleotide derivative, the probe, the hybridization method, and the probe-immobilized form, which are other forms of the present invention, all relate to the nucleotide derivative of the present invention, and these will be sequentially described.
（ヌクレオチド誘導体）
本発明のヌクレオチド誘導体は、一般式（１）に表されるように、Ｂのプリン塩基又はピリミジン塩基にリンカーを介してアントラセン化合物を備えることを特徴としている。また、本発明のヌクレオチド誘導体において、リン酸エステル基のｍは１以上３以下の整数を表している。したがって、本発明のヌクレオチド誘導体は、モノリン酸、ジリン酸又はトリリン酸がエステル結合した化合物を包含している。また、リボースの２’位のＲ１０は、水素原子又は水酸基であり、Ｒ１０が水素原子のときには、デオキシヌクレオチド誘導体であり、同位が水酸基であるときには、リボヌクレオチド誘導体である。
(Nucleotide derivative)
The nucleotide derivative of the present invention is characterized in that an anthracene compound is provided on a purine base or pyrimidine base of B via a linker, as represented by the general formula (1). In the nucleotide derivative of the present invention, m of the phosphate ester group represents an integer of 1 or more and 3 or less. Accordingly, the nucleotide derivatives of the present invention include compounds in which monophosphate, diphosphate or triphosphate is ester-linked. R 10 at the 2 ′ position of ribose is a hydrogen atom or a hydroxyl group. When R 10 is a hydrogen atom, it is a deoxynucleotide derivative, and when the isotope is a hydroxyl group, it is a ribonucleotide derivative.
一般式（１）におけるＡであるアントラセン化合物は、アントラセン骨格を有し、アントラセン骨格に結合する水素原子は置換されていてもよいものである。すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して水素原子又は置換基を表している。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、含酸素基、含窒素基、含硫黄基及びこれらの原子や置換基を有していてもよい炭化水素基若しくは複素環基である。より具体的には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、水酸基、アルコキシ基、エステル基、水酸基、アシルオキシ基、アミノ基、置換アミノ基、ニトロ基、アミド基、シアノ基、カルバメート基、ウレイド基、チオール基、チオエーテル基、チオエステル基が挙げられる。また、これらの原子や置換基を有していてもよいアルキル基、フェニル基及びピロールなどの五員複素環基、ピリジンなどの六員複素環基などが挙げられる。なお、これらの置換基におけるアルキル基は、好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどの炭素数１〜４個程度の直鎖又は分枝状のアルキル基である。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９の隣接するもの同士が結合して置換されていてもよいフェニル基などの芳香族等の環を形成してもよい。 The anthracene compound which is A in the general formula (1) has an anthracene skeleton, and a hydrogen atom bonded to the anthracene skeleton may be substituted. That is, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 and R 9 each independently represent a hydrogen atom or a substituent. Examples of the substituent include a halogen atom, an oxygen-containing group, a nitrogen-containing group, a sulfur-containing group, and a hydrocarbon group or a heterocyclic group which may have these atoms and substituents. More specifically, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, hydroxyl group, alkoxy group, ester group, hydroxyl group, acyloxy group, amino group, substituted amino group, nitro group, amide group, cyano group, carbamate group, Examples thereof include a ureido group, a thiol group, a thioether group, and a thioester group. Moreover, the alkyl group which may have these atoms and a substituent, 5-membered heterocyclic groups, such as a phenyl group and a pyrrole, 6-membered heterocyclic groups, such as a pyridine, etc. are mentioned. The alkyl group in these substituents is preferably a straight chain or branched chain having about 1 to 4 carbon atoms such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl and the like. In the form of an alkyl group. Also, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8, and R 9 adjacent to each other may be bonded to each other and substituted with an aromatic group such as a phenyl group The ring may be formed.
アントラセン化合物Ａは、本発明のヌクレオチド誘導体を備える１本鎖のポリヌクレオチド誘導体が相手鎖とハイブリダイズしたときに、対合する塩基種を特定できる程度の塩基識別能を有している限り、どの部位でリンカーＸに連結されていてもよいが、一般式（１）に表されるように結合することができる。 As long as the anthracene compound A has a base discriminating ability to the extent that it can identify the base species to be paired when a single-stranded polynucleotide derivative comprising the nucleotide derivative of the present invention hybridizes with the partner strand, Although it may be connected to the linker X at the site, it can be bonded as represented by the general formula (1).
アントラセン化合物Ａとプリン塩基又はピリミジン塩基とはリンカーを介して結合している。リンカーは、アントラセン化合物Ａを塩基に結合させるものであれば、特に限定されないが、一般式（１）において塩基Ｂとアントラセン化合物Ａとの間にある構造の全てを含むものとする。リンカーの一部を構成するＸの種類は特に限定しないが、例えば、一般式（１）において表される以下の群から選択されるいずれかとすることができる。なかでも、アミド基やカルボニル基を含む基が好ましい。
ｎ１及びＸに備えられるアルキレン基におけるｎ２及びｎ３は、同一又は異なっていてもよいが、０以上５以下の整数を表している。プリン塩基又はピリミジン塩基におけるリンカーの結合部位は、ピリミジン塩基の場合には、第４位又は第５位とすることができ、プリン塩基の場合には、第７位又は第８位とすることができる。 n 2 and n 3 in the alkylene group provided in n 1 and X may be the same or different, but represent an integer of 0 or more and 5 or less. In the case of a pyrimidine base, the binding site of the linker in the purine base or pyrimidine base can be the 4th or 5th position, and in the case of a purine base, it can be the 7th or 8th position. it can.
また、Ｙは、メチレン基、エチレン基、ビニレン基又はエチニレン基を表している。 Y represents a methylene group, an ethylene group, a vinylene group or an ethynylene group.
一般式（１）において塩基Ｂがピリミジン塩基のウラシルであるヌクレオチド誘導体は一般式（２）に表され、シトシンであるヌクレオチド誘導体は一般式（３）に表され、塩基Ｂがプリン塩基のアデニンであるヌクレオチド誘導体は一般式（４）に表され、グアニンであるヌクレオチド誘導体は一般式（５）に表される。ウラシル誘導体及びシトシン誘導体は、ピリミジン塩基の第５位にリンカーを介してアントラセン化合物Ａが結合した構造を有している。なお、塩基の構造上、このウラシル誘導体は、デオキシリボヌクレオチド誘導体であるチミン誘導体ということもできる。また、アデニン誘導体は、プリン塩基の第７位にリンカーを介してアントラセン化合物Ａが結合した構造を有し、グアニン誘導体は、プリン塩基の第８位にリンカーを介してアントラセン化合物Ａが結合した構造を有している。 In general formula (1), a nucleotide derivative in which base B is a pyrimidine base uracil is represented by general formula (2), a nucleotide derivative in which cytosine is represented by general formula (3), and base B is an adenine of purine base. A certain nucleotide derivative is represented by the general formula (4), and a nucleotide derivative that is guanine is represented by the general formula (5). The uracil derivative and cytosine derivative have a structure in which anthracene compound A is bonded to the 5th position of the pyrimidine base via a linker. In terms of the base structure, this uracil derivative can also be referred to as a thymine derivative that is a deoxyribonucleotide derivative. The adenine derivative has a structure in which the anthracene compound A is bonded to the 7th position of the purine base via a linker, and the guanine derivative has a structure in which the anthracene compound A is bonded to the 8th position of the purine base via the linker. have.
こうしたヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体は、塩基識別性ヌクレオチド誘導体（以下、本発明のヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体を塩基識別性ヌクレオチド誘導体ともいう。）としてプローブなどに用いることができる。例えば、ウラシル誘導体のリン酸モノエステル体がホスホジエステル結合を介して備えるポリヌクレオチド誘導体が相手鎖とハイブリダイズした際、ウラシル誘導体のウラシル基が対合する塩基がアデニンであるときのハイブリダイズ産物の発光強度は３．８、対合塩基がアデニン以外の塩基、すなわち、チミン、グアニン及びシトシンの場合のハイブリダイズ産物よりも大きい。具体的には、対合塩基がシトシンのときには０．８、グアニンのときには１．７及びチミンのときには１．１の発光強度を得ることができる。したがって、ウラシル誘導体は、アデニン識別可能な蛍光発光特性を有しているといえ、ウラシル誘導体は、対合する塩基種がアデニンであるか否かを判定するための塩基識別性ヌクレオチド誘導体として用いることができる。こうした、塩基識別能力は、同様にインターカレーターであり蛍光色素であるピレンをアントラセン化合物に替えて備えるヌクレオチド誘導体における塩基識別性（国際公開パンフレットＷＯ ２００４／０５８７９３号）によってもサポートされている。こうしたことから、シトシン誘導体は、対合する塩基種がグアニンであるか否かを判定するための塩基識別ヌクレオチド誘導体として、アデニン誘導体は、対合する塩基種がシトシンであるか否かを判定するための塩基識別性ヌクレオチド誘導体として、グアニン誘導体は、対合する塩基種がチミン又はウラシル若しくはシトシンであるか否かを判定するための塩基識別性ヌクレオチド誘導体として使用することができる。 Such a phosphate monoester derivative of a nucleotide derivative can be used for a probe or the like as a base-discriminating nucleotide derivative (hereinafter, the phosphate monoester derivative of the nucleotide derivative of the present invention is also referred to as a base-discriminating nucleotide derivative). For example, when a polynucleotide derivative provided in a phosphate monoester of a uracil derivative via a phosphodiester bond is hybridized with a partner strand, the hybridization product when the base to which the uracil group of the uracil derivative is paired is adenine. The emission intensity is 3.8, which is higher than the hybridized product when the paired base is a base other than adenine, that is, thymine, guanine and cytosine. Specifically, it is possible to obtain a light emission intensity of 0.8 when the paired base is cytosine, 1.7 when it is guanine and 1.1 when it is thymine. Therefore, it can be said that the uracil derivative has a fluorescent property capable of distinguishing adenine, and the uracil derivative should be used as a base-discriminating nucleotide derivative for determining whether or not the base species to be paired is adenine. Can do. Such base discrimination ability is also supported by base discrimination (International Publication Pamphlet WO 2004/058793) in a nucleotide derivative that is similarly an intercalator and a fluorescent dye, pyrene, instead of an anthracene compound. Therefore, the cytosine derivative is used as a base identification nucleotide derivative for determining whether or not the base species to be paired is guanine, and the adenine derivative is used to determine whether or not the base species to be paired is cytosine. As a base discriminating nucleotide derivative, a guanine derivative can be used as a base discriminating nucleotide derivative for determining whether or not the base species to be paired is thymine, uracil or cytosine.
また、例えば、ウラシル誘導体を用いたハイブリダイズ産物の励起スペクトルによれば、ウラシル誘導体は、対合塩基がアデニンのときに３７１ｎｍ近傍において励起される。励起される程度は、対合塩基がアデニン以外のときよりも強い。そして、ウラシル誘導体と対合塩基がアデニンである相手鎖のハイブリダイズ産物の蛍光波長は４５０ｎｍ近傍であり、従来ピレンにより得られている蛍光波長である４００ｎｍ近傍よりも長波長側にシフトされている。長波長側へのシフトにより、ハイブリダイズ産物以外からのノイズ、例えば、固相や液相などの媒体に由来するノイズを低減することができる。したがって、ウラシル誘導体は、対合塩基がアデニンの場合の塩基識別能力に優れるとともに、ハイブリダイズ産物が存在する環境下におけるノイズを低減し、これにより対合塩基種の検出感度、検出精度及び再現性を向上させることができる。 For example, according to the excitation spectrum of a hybridized product using a uracil derivative, the uracil derivative is excited in the vicinity of 371 nm when the paired base is adenine. The degree of excitation is stronger than when the paired base is other than adenine. The fluorescence wavelength of the hybridization product of the partner strand whose uracil derivative and the base pair is adenine is around 450 nm, and is shifted to the longer wavelength side than the vicinity of 400 nm, which is the fluorescence wavelength conventionally obtained by pyrene. . By shifting to the longer wavelength side, noise from other than the hybridized product, for example, noise derived from a medium such as a solid phase or a liquid phase can be reduced. Therefore, the uracil derivative has excellent base discrimination ability when the paired base is adenine, and also reduces noise in the environment where the hybridized product is present, thereby detecting sensitivity, detection accuracy and reproducibility of the paired base species. Can be improved.
本発明のヌクレオチド誘導体は、これの前駆体とするヌクレオシド誘導体から常法により得ることができる。すなわち、ヌクレオシド誘導体にＰＯＣｌ３及びリン酸トリメチルを添加することにより、ヌクレオチド誘導体リン酸モノエステル体（ｍ＝１）が得られる。さらに、ピロリン酸トリブチルアンモニウム塩を添加することにより、リン酸トリエステル体が得られる。 The nucleotide derivative of the present invention can be obtained by a conventional method from a nucleoside derivative used as a precursor thereof. That is, by adding POCl 3 and trimethyl phosphate to a nucleoside derivative, a nucleotide derivative phosphate monoester (m = 1) is obtained. Furthermore, a phosphoric acid triester is obtained by adding tributylammonium pyrophosphate.
（ヌクレオシド誘導体）
本発明のヌクレオシド誘導体は、一般式（６）に表される。一般式（６）におけるＡ、Ｘ及びＲ１０についてはヌクレオチド誘導体についての一般式（１）において説明したのと同様の態様が適用される。また、Ｒ１１は、水素原子又は置換基とすることができる。Ｒ１１の置換基としては、例えば、オリゴヌクレオチド合成のためのシアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト基などが挙げられる。また、Ｒ１２についても水素原子又は置換基とすることができる。置換基としては、オリゴヌクレオチド合成のためのジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）などが挙げられる。一般式（６）において塩基Ｂがピリミジン塩基のウラシルであるヌクレオシド誘導体は一般式（７）に表され、シトシンであるヌクレオシド誘導体は一般式（８）に表され、塩基Ｂがプリン塩基のアデニンであるヌクレオシド誘導体は一般式（９）に表され、グアニンであるヌクレオシド誘導体は一般式（１０）に表される。
(Nucleoside derivatives)
The nucleoside derivative of the present invention is represented by the general formula (6). For A, X and R 10 in the general formula (6), the same mode as described in the general formula (1) for the nucleotide derivative is applied. R 11 can be a hydrogen atom or a substituent. Examples of the substituent for R 11 include a cyanoethyl-N, N′-diisopropyl phosphoramidite group for oligonucleotide synthesis. R 12 can also be a hydrogen atom or a substituent. Examples of the substituent include a dimethoxytrityl group (DMTr) for oligonucleotide synthesis. In the general formula (6), the nucleoside derivative in which the base B is pyrimidine base uracil is represented by the general formula (7), the nucleoside derivative in cytosine is represented by general formula (8), and the base B is a purine base adenine. A certain nucleoside derivative is represented by the general formula (9), and a nucleoside derivative that is guanine is represented by the general formula (10).
本発明のヌクレオシド誘導体は、常法により合成することができる。例えば、塩基のリンカー導入部位に脱離基としてのヨウ素原子を導入したものを用意する。一方、アントラセンの第２位にカルボン酸を有するアントラセンカルボン酸のカルボン酸部位に酸アミド結合を介したアセチニル基を導入したものを用意する。これらを常法により反応させることにより、本発明のヌクレオシド誘導体が得られる。 The nucleoside derivative of the present invention can be synthesized by a conventional method. For example, one in which an iodine atom as a leaving group is introduced into a base linker introduction site is prepared. Meanwhile, an anthracene having an acetinyl group via an acid amide bond is prepared at the carboxylic acid site of anthracene carboxylic acid having a carboxylic acid at the second position. By reacting these by a conventional method, the nucleoside derivative of the present invention can be obtained.
（ポリヌクレオチド誘導体）
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、上記ヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体の１種又は２種以上をホスホジエステル結合を介して備えている。こうしたポリヌクレオチド誘導体は、一般式（１１）で表されるユニットの１種又は２種以上を備えることとなる。本発明のポリヌクレオチド誘導体を構成する全てのユニットが上記ユニットを備えていてもよいし、一部が上記ユニットであってもよい。本発明のヌクレオチド誘導体は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡとＲＮＡとのキメラであってもよい。また、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。また、必要に応じてヌクレアーゼ耐性を付与するような修飾がなされていてもよいし、本発明のヌクレオチド誘導体以外のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。
The polynucleotide derivative of the present invention comprises one or more phosphate monoesters of the above nucleotide derivative via a phosphodiester bond. Such a polynucleotide derivative comprises one or more units represented by the general formula (11). All the units constituting the polynucleotide derivative of the present invention may be provided with the above unit, or a part thereof may be the above unit. The nucleotide derivative of the present invention may be DNA, RNA, or a chimera of DNA and RNA. Moreover, a single strand may be sufficient and a double strand may be sufficient. Moreover, the modification which provides nuclease tolerance may be made | formed as needed, and nucleotide derivatives other than the nucleotide derivative of this invention may be included.
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、その重合鎖中のある位置に上記ヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体（塩基識別性ヌクレオチド誘導体）を備えるとき、標的ヌクレオチド中の対合するヌクレオチド（塩基）が当該塩基であるときに、当該塩基を識別できる蛍光発光を発する。例えば、こうした本発明のポリヌクレオチド誘導体は、標的ヌクレオチドのある部位が塩基識別性ヌクレオチドによって識別可能な特定塩基のときには強く発光し、当該特定塩基以外のときには発光しないかあるいは弱く発光する。このために、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ハイブリダイズする相手鎖の特定位置の塩基種を識別できる。したがって、以下の用途に利用できる。 When the polynucleotide derivative of the present invention has a phosphate monoester (base-identifying nucleotide derivative) of the nucleotide derivative at a position in the polymer chain, the nucleotide (base) to be paired in the target nucleotide is the base. When this is, it emits fluorescence that can identify the base. For example, such a polynucleotide derivative of the present invention emits strong light when a certain site of the target nucleotide is a specific base that can be identified by a base-identifying nucleotide, and emits light weakly or not when it is other than the specific base. For this reason, the polynucleotide derivative of the present invention can identify the base species at a specific position of the partner strand to be hybridized. Therefore, it can be used for the following purposes.
（１）標的核酸と相補的なポリヌクレオチド誘導体は、プローブとして用いることにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を決定できる。同様の方法でＳＮＰの検出に利用できる。特に、こうしたポリヌクレオチド誘導体をビーズや基板等の固相に固定化した固定化体とすることにより、特定核酸配列を有するか否かを確認できる。特に、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を決定できる。
（２）アンチセンスポリヌクレオチドに代えて使用する場合には、通常のポリヌクレオチドとは異なるために、核酸分解酵素（例えば制限酵素）や核酸結合タンパク質（例えば転写因子）等の標的核酸への結合を阻害できる。このことから、これらの作用を利用した実験用試薬として利用できる。
（３）それ自体蛍光を発するため、核酸の蛍光ラベルに使用できる。
（４）ＤＮＡ複製において、複製されるＤＮＡと相補的なプローブとして使用すること によりＤＮＡ複製のリアルタイム検出ができる。同様に、ＲＮＡへの転写において 、転写されるＲＮＡと相補的なプローブとして使用することによりＲＮＡ転写のリ アルタイム検出ができる。
（５）相補的配列とハイブリダイズすることにより蛍光波長のシフトが起こるようなポリヌクレオチド誘導体である場合は、蛍光波長のシフトにより当該ポリヌクレオチド誘導体の酸化還元電位が変化する。このため、電極上に本発明のポリヌクレオチド誘導体を固定しておき、被験ポリヌクレオチドをこの電極に作用させて酸化還元電位を測定する方法で、核酸配列応答性のバイオセンサーとして利用できる。
（６）本発明のポリヌクレオチドは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に供される蛍光性プローブとして利用できる。
(1) By using a polynucleotide derivative complementary to a target nucleic acid as a probe, the type of nucleotide at a specific position of the target nucleic acid can be determined. It can be used for detecting SNPs in a similar manner. In particular, it is possible to confirm whether or not the polynucleotide derivative has a specific nucleic acid sequence by using an immobilized body in which such a polynucleotide derivative is immobilized on a solid phase such as a bead or a substrate. In particular, the type of nucleotide at a specific position of the target nucleic acid can be determined.
(2) When used in place of an antisense polynucleotide, since it differs from a normal polynucleotide, it binds to a target nucleic acid such as a nucleolytic enzyme (for example, a restriction enzyme) or a nucleic acid binding protein (for example, a transcription factor). Can be inhibited. Therefore, it can be used as an experimental reagent utilizing these actions.
(3) Since it emits fluorescence itself, it can be used as a fluorescent label for nucleic acids.
(4) In DNA replication, the DNA replication can be detected in real time by using it as a probe complementary to the replicated DNA. Similarly, in transcription to RNA, real time detection of RNA transcription can be performed by using it as a probe complementary to the RNA to be transcribed.
(5) In the case of a polynucleotide derivative that causes a fluorescence wavelength shift by hybridization with a complementary sequence, the redox potential of the polynucleotide derivative changes due to the fluorescence wavelength shift. For this reason, the polynucleotide derivative of the present invention is immobilized on an electrode, and a test polynucleotide is allowed to act on this electrode to measure the oxidation-reduction potential, which can be used as a nucleic acid sequence-responsive biosensor.
(6) The polynucleotide of the present invention can be used as a fluorescent probe to be subjected to fluorescence in situ hybridization (FISH).
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、例えば核酸自動合成機を用いたホスホロアミダイト法による化学合成方法において、特定ヌクレオシドに代えて本発明のヌクレオシド誘導体を用いることにより合成できる。 The polynucleotide derivative of the present invention can be synthesized, for example, by using the nucleoside derivative of the present invention in place of the specific nucleoside in a chemical synthesis method using a phosphoramidite method using an automatic nucleic acid synthesizer.
（プローブ及びプローブセット）
本発明のプローブは、１種又は２種以上の塩基識別性ヌクレオチド誘導体をホスホジエスエル結合を介して備えるポリヌクレオチド誘導体である。本プローブについては、上記した本発明のポリヌクレオチド誘導体としての各種の態様を適用することができる。また、本プローブにおいて、塩基識別性ヌクレオチド誘導体は、標的ポリヌクレオチドの検出しようとする１個又は２個以上の塩基種に対応して備えられている。これにより、試料中に含まれる標的ポリヌクレオチドの特定位置の塩基種を判定できる。プローブにおけるヌクレオチド数は例えば４〜１００個程度、好ましくは１０〜３０個程度とすることができる。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラのいずれであってもよく、１本鎖又は２本鎖である。さらに、試料が細胞抽出液等のヌクレアーゼを含むものである場合には、ヌクレアーゼにより切断され難いように、ホスホロチオエートＤＮＡ又はＲＮＡ、Ｈ−ホスホネートＤＮＡ又はＲＮＡ等の修飾核酸であってもよい。
(Probe and probe set)
The probe of the present invention is a polynucleotide derivative comprising one or more base-identifying nucleotide derivatives via a phosphodiesel bond. Various aspects of the above-described polynucleotide derivative of the present invention can be applied to the probe. In this probe, the base-discriminating nucleotide derivative is provided corresponding to one or more base species to be detected by the target polynucleotide. Thereby, the base type of the specific position of the target polynucleotide contained in the sample can be determined. The number of nucleotides in the probe can be, for example, about 4 to 100, preferably about 10 to 30. The probe may be any of DNA, RNA, and DNA / RNA chimera, and is single-stranded or double-stranded. Furthermore, when the sample contains a nuclease such as a cell extract, it may be a modified nucleic acid such as phosphorothioate DNA or RNA, H-phosphonate DNA or RNA so that it is not easily cleaved by the nuclease.
プローブにおける塩基識別性ヌクレオチド誘導体の導入個数や位置などの態様は、決定しようとする塩基種の数や変異のタイプ等によって適宜設定される。プローブの各種形態については、後段にて説明する。 Aspects such as the number and position of base-discriminating nucleotide derivatives introduced into the probe are appropriately set depending on the number of base species to be determined, the type of mutation, and the like. Various forms of the probe will be described later.
本発明のプローブセットは、例えば、１個又は２個以上の塩基配列の判別等を目的として、２種類以上の本発明のプローブを組み合わせたプローブセットである。本発明のプローブは、標的ポリヌクレオチド中の一つのＳＮＰを特定するためにも、特定部位において２種類以上の塩基識別性ヌクレオチドをそれぞれ備えるプローブを要することが多い。こうしたプローブセットは、例えば、ガン、生活習慣病などの疾患関連遺伝子、体質関連遺伝子、薬剤耐性関連遺伝子等に関するＳＮＰタイピングのためのセットとすることができる。 The probe set of the present invention is a probe set in which two or more kinds of probes of the present invention are combined, for example, for the purpose of discriminating one or two or more base sequences. In order to specify one SNP in the target polynucleotide, the probe of the present invention often requires probes each having two or more kinds of base-identifying nucleotides at a specific site. Such a probe set can be a set for SNP typing related to, for example, disease-related genes such as cancer and lifestyle-related diseases, constitution-related genes, drug resistance-related genes and the like.
（ハイブリダイゼーション方法）
本発明のハイブリダイゼーション方法は、本発明のプローブと標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、前記ハイブリダイゼーションのハイブリダイズ産物の蛍光を測定する工程と、ハイブリダイズ産物の蛍光測定結果と使用したプローブが備えるヌクレオチド誘導体の塩基を識別可能な蛍光発光特性とに基づいて標的ポリヌクレオチド中の１個又は２個以上の塩基種を同定する評価工程とを、を備えることを特徴としている。
(Hybridization method)
The hybridization method of the present invention comprises a hybridization step of hybridizing the probe of the present invention with a target polynucleotide, a step of measuring the fluorescence of the hybridized product of the hybridization, and a result of measuring the fluorescence of the hybridized product. And an evaluation step for identifying one or more base species in the target polynucleotide based on the fluorescence emission characteristic capable of identifying the base of the nucleotide derivative provided in the probe.
標的ポリヌクレオチドとは、本発明のプローブで分析しようとする標的ヌクレオチド又は配列を有するものであればよく、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、また、１本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。また、こうした標的ポリヌクレオチドを含む試料は、通例、細胞抽出液、血液のような体液、ＰＣＲ産物等を用いることができる。 The target polynucleotide only needs to have the target nucleotide or sequence to be analyzed by the probe of the present invention, and may be DNA or RNA, or may be a single-stranded oligonucleotide. Good. In addition, as a sample containing such a target polynucleotide, a cell extract, a body fluid such as blood, a PCR product, or the like can be generally used.
ハイブリダイゼーション工程は、プローブが固定化されていない液相内において行うこともできるし、プローブを固定化した状態で行うこともできる。ハイブリダイゼーション工程は、従来どおり、通常のＤＮＡアレイ等を用いたハイブリダイゼーションと同様に行うことができるが、本発明のハイブリダイゼーション工程における標的ポリヌクレオチドは、標識されていなくてもよい。本方法によれば、プローブ自体が識別性を有しているため、試料ポリヌクレオチドの標識化が不要となっている。したがって、標識誤差による再現性の低下や精度の低下を排除できる。 The hybridization step can be performed in a liquid phase where the probe is not immobilized, or can be performed in a state where the probe is immobilized. The hybridization step can be performed in the same manner as conventional hybridization using a normal DNA array or the like, but the target polynucleotide in the hybridization step of the present invention may not be labeled. According to this method, since the probe itself is discriminating, labeling of the sample polynucleotide is unnecessary. Accordingly, it is possible to eliminate a decrease in reproducibility and a decrease in accuracy due to a labeling error.
本方法では、ハイブリダイゼーション工程後のハイブリダイゼーション後の洗浄工程をすることなく蛍光検出を行うことができる。標的ポリヌクレオチドを標識するものではなく、プローブ自体が相対する塩基を識別可能な蛍光発光特性を有し、相対する塩基が特定塩基以外の場合には、蛍光が発生しないか相対的に低い蛍光しか発生しないからである。したがって、例えば、プローブを基板など固相に固定化して用いる場合など、ハイブリダイズしなかった試料中の核酸がそのまま存在してもよく、こうしたポリヌクレオチドを洗浄により除去する必要もない。したがって、洗浄工程に起因する測定誤差も排除される。したがって、本方法は、プローブが固相に固定化されたプローブ固定化体、特に基板に固定化されたものに好ましく適用される。 In this method, fluorescence detection can be performed without performing a washing step after hybridization after the hybridization step. It does not label the target polynucleotide, but has a fluorescence emission characteristic that allows the probe itself to distinguish the opposite base. When the opposite base is other than a specific base, no fluorescence is generated or only a relatively low fluorescence is generated. This is because it does not occur. Therefore, for example, when the probe is used after being immobilized on a solid phase such as a substrate, the nucleic acid in the sample that has not hybridized may exist as it is, and it is not necessary to remove such a polynucleotide by washing. Accordingly, measurement errors due to the cleaning process are also eliminated. Therefore, this method is preferably applied to a probe-immobilized body in which a probe is immobilized on a solid phase, particularly one that is immobilized on a substrate.
さらに、本ハイブリダイゼーション工程によれば、相対する塩基を識別可能な特異的な蛍光発光特性を示し、本来ハイブリダイゼーションすべきでないヌクレオチドとプローブとのハイブリダイズ産物が誤って生成されてもそうした蛍光発光を発しない。すなわち、ミスハイブリダイゼーションによる塩基識別性への影響は排除されている。したがって、本発明方法のハイブリダイゼーション工程によれば、ミスハイブリダイゼーションによるノイズを排除することができる。 Furthermore, according to the present hybridization step, specific fluorescence emission characteristics that can distinguish the opposite bases are shown, and even if a hybridization product of a nucleotide and a probe that should not be originally hybridized is erroneously generated, such fluorescence emission is caused. Does not emit. That is, the influence on base discrimination due to mishybridization is eliminated. Therefore, according to the hybridization step of the method of the present invention, noise due to mishybridization can be eliminated.
蛍光測定工程における蛍光検出は、常法に従い、照射波長２５０〜６００ｎｍ程度で測定すればよい。ハイブリダイズ前のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトル測定と、ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトル測定とを行うことが好ましい。こうしたハイブリダイズ前後のスペクトルと比較して、塩基識別性ヌクレオチドを含むプローブの本来の識別能力が発揮されたか否かを確認しておくことにより、ハイブリダイゼーション反応が適性であったかどうかを判定できる。 The fluorescence detection in the fluorescence measurement step may be measured at an irradiation wavelength of about 250 to 600 nm according to a conventional method. It is preferable to perform fluorescence spectrum measurement of the polynucleotide derivative before hybridization and fluorescence spectrum measurement of the hybridized product. By comparing with the spectrum before and after such hybridization, it can be determined whether or not the hybridization reaction was appropriate by confirming whether or not the original discrimination ability of the probe containing the base-discriminating nucleotide was exhibited.
また、評価工程では、ハイブリダイズ産物の蛍光測定結果と、用いたプローブにおいて予め取得されている蛍光発光特性とに基づいて標的ポリヌクレオチド中の１個又は２個以上の塩基種を同定する。例えば、標的ポリヌクレオチド中の一つの塩基を特定するために、この塩基に対合する部位に、可能性のある４種の塩基にそれぞれ対応する本発明のヌクレオチド誘導体を備える４種のプローブを用いた場合、この４種のプローブのうちどのプローブが塩基特異的な固有の蛍光発光特性を発現しているかを判定する。そうした固有の蛍光発光特性を発現しているプローブの認識する塩基種が、未知の塩基種である。 In the evaluation step, one or more base species in the target polynucleotide are identified based on the fluorescence measurement result of the hybridized product and the fluorescence emission characteristics acquired in advance in the used probe. For example, in order to specify one base in the target polynucleotide, four types of probes each having a nucleotide derivative of the present invention corresponding to each of four possible bases are used at the site where the base is paired. If so, it is determined which of the four types of probes expresses the specific fluorescence emission characteristic specific to the base. A base species recognized by a probe expressing such a unique fluorescence emission characteristic is an unknown base species.
なお、一つの塩基を２種以上の塩基識別性ヌクレオチド誘導体が識別する場合や、一つの塩基識別性ヌクレオチド誘導体が２種類の塩基を識別する場合がある。このような場合には、こうした塩基識別性ヌクレオチド誘導体による蛍光発光特性を組み合わせて判定する。 There are cases where two or more base-identifying nucleotide derivatives identify one base, or one base-identifying nucleotide derivative identifies two types of bases. In such a case, determination is made by combining the fluorescence emission characteristics of such base-identifying nucleotide derivatives.
本発明のハイブリダイゼーション方法によれば、プローブとして、相手鎖とハイブリダイズしたとき、相対する塩基に特異的な蛍光発光特性を発現する塩基識別性ヌクレオチド誘導体を備えるプローブを用いるため、特定部位の塩基種を直接的に判定できる。したがって、ＳＮＰ検出のほか、未知の塩基配列も決定できるとともに、既知領域との相同性や変異部位も容易に検出できる。 According to the hybridization method of the present invention, since a probe having a base-discriminating nucleotide derivative that expresses fluorescence emission characteristics specific to the opposite base when hybridized with a partner strand is used as a probe, Species can be determined directly. Therefore, in addition to SNP detection, an unknown base sequence can be determined, and homology with a known region and a mutation site can be easily detected.
（ＳＮＰ検出方法）
本発明のＳＮＰ検出方法は、上記したハイブリダイゼーション方法を用いて実施する。すなわち、前記既知配列中の特定塩基種を判定する態様である。ＳＮＰ検出方法においては、プローブを、標的ヌクレオチド配列中のＳＮＰ塩基以外の塩基配列と相補的とするとともに、ＳＮＰ塩基に対合する部位に塩基識別性ヌクレオチド誘導体を備えるようにする。具体的には、ＳＮＰ塩基部位の塩基種を判定するために、ウラシル誘導体、シトシン誘導体、アデニン誘導体及びグアニン誘導体の１種又は２種以上を備えるようにする。どのヌクレオチド誘導体を用いるかは、ＳＮＰのタイプによるが、Ｇ／Ａ多型である場合には、Ｇ／Ｇホモ、Ｇ／Ａへテロ、Ａ／Ａホモを検出するために、少なくともグアニン認識ヌクレオチド誘導体（本発明のＡ誘導体）とアデニン識別ヌクレオチド誘導体（本発明のＵ誘導体）とをそれぞれ特定部位に備えるプローブを用いる。
(SNP detection method)
The SNP detection method of the present invention is carried out using the hybridization method described above. That is, this is an embodiment for determining a specific base species in the known sequence. In the SNP detection method, the probe is complementary to a base sequence other than the SNP base in the target nucleotide sequence, and a base-discriminating nucleotide derivative is provided at a site that matches the SNP base. Specifically, in order to determine the base type of the SNP base site, one or more of uracil derivatives, cytosine derivatives, adenine derivatives, and guanine derivatives are provided. Which nucleotide derivative is used depends on the type of SNP, but in the case of G / A polymorphism, at least guanine-recognizing nucleotide is used to detect G / G homo, G / A hetero, and A / A homo. Probes each having a derivative (A derivative of the present invention) and an adenine-identifying nucleotide derivative (U derivative of the present invention) at specific sites are used.
（未知配列の決定方法）
また、本発明のハイブリダイゼーション方法は、未知の塩基配列の決定方法に用いることができる。配列決定のためのプローブは、決定しようとする未知配列領域（ｎ＝１〜１００個程度）の第１位〜第ｎ位についてそれぞれ本発明の各延期に対する塩基識別ヌクレオチド誘導体を有する、４ｎ個のプローブのセットとすることが好ましい。また、既知配列との相同性やそのうちの変異部位の検出方法にも用いることができる。このためのプローブは、例えば、相同性を検出しようとする第１位〜第ｎ位までの個々のヌクレオチド位置に各塩基に対する塩基識別性ヌクレオチドを備える、４ｎ個のプローブのセットとすることが好ましい。標的ヌクレオチド配列が既知配列と完全に相同である場合には、既知配列の塩基を識別する塩基識別性ヌクレオチド誘導体を備えるプローブの全てがその蛍光発光特性により他のヌクレオチド誘導体を有するプローブから区別されることになる。一方、既知配列中に変異を有する場合には、既知配列の塩基でない塩基を識別するヌクレオチド誘導体を含むプローブによるハイブリダイズ産物の蛍光が他のプローブと区別されることになる。
(Method of determining unknown sequence)
Moreover, the hybridization method of the present invention can be used for a method for determining an unknown base sequence. Probes for sequencing have 4 n nucleotide-identifying nucleotide derivatives for each postponement of the present invention at positions 1 to n in the unknown sequence region (n = 1 to about 100) to be determined. It is preferable to use a set of probes. It can also be used in methods for detecting homology with known sequences and mutation sites. The probe for this purpose may be, for example, a set of 4 n probes comprising base-discriminating nucleotides for each base at individual nucleotide positions from the first position to the n-th position where homology is to be detected. preferable. If the target nucleotide sequence is completely homologous to a known sequence, all probes with base-discriminating nucleotide derivatives that distinguish the bases of the known sequence are distinguished from probes having other nucleotide derivatives by their fluorescence properties It will be. On the other hand, when there is a mutation in the known sequence, the fluorescence of the hybridized product by the probe containing a nucleotide derivative that identifies a base that is not a base of the known sequence is distinguished from other probes.
（プローブ固定化体）
本発明のプローブ固定化体は、本発明のプローブの１種又は２種以上が固相に固定化された固定化体である。こうしたプローブ固定化体は、本発明のハイブリダイゼーション方法等に好ましく用いることができる。
(Probe immobilized body)
The probe-immobilized body of the present invention is an immobilized body in which one or more of the probes of the present invention are immobilized on a solid phase. Such a probe-immobilized body can be preferably used in the hybridization method of the present invention.
プローブが固定化される固相は、特に限定されない、ビーズなどの粒状体、基板などのプレート状体とすることができる。プローブが塩基識別性ヌクレオチド誘導体を有しており、洗浄工程の省略等が可能であることから、本発明を適用するにあたって固相を基板にすることにメリットがある。また、固相の材料は特に限定されないで、樹脂などの有機材料、ガラスや金属などの無機材料、有機−無機複合材料などとすることができる。固相は多孔質性であっても非多孔質性であってもよい。また、固相の表面には、プローブのハイブリダイゼーション反応の領域を区画する凹凸やプローブの固定を強固するための凹凸等を備えていてもよい。 The solid phase on which the probe is immobilized is not particularly limited, and may be a granular body such as a bead or a plate-shaped body such as a substrate. Since the probe has a base-discriminating nucleotide derivative and the washing step can be omitted, there is an advantage in using a solid phase as a substrate in applying the present invention. The solid phase material is not particularly limited, and may be an organic material such as a resin, an inorganic material such as glass or metal, or an organic-inorganic composite material. The solid phase may be porous or non-porous. Further, the surface of the solid phase may be provided with unevenness for partitioning the probe hybridization region, unevenness for strengthening the probe fixation, and the like.
固相に対するプローブの固定化形態は、固相の種類に応じて適宜設定される。基板にプローブを固定化する場合、本ポリヌクレオチド誘導体の１種又は２種以上は、それぞれ別個の領域を有して配列されていることが好ましい。すなわち、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイのような形態が挙げられる。 The immobilization form of the probe to the solid phase is appropriately set according to the type of the solid phase. When immobilizing a probe on a substrate, it is preferable that one or more of the present polynucleotide derivatives are arranged with separate regions. That is, a form such as a so-called DNA chip or DNA microarray can be mentioned.
プローブの固定化形態には、共有結合、非共有結合による固定化を包含しているが、プローブがハイブリダイズ可能に固定化されている限り固定化の形態や固定化の手法は限定されない。例えば、共有結合による固定化には、プローブを基板上で合成するオンチップ合成法と合成したプローブを固相表面の所定部位に供給して共有結合させる方法がある。また、固相表面へのプローブの供給には、インクジェット方式を採用することが好ましい。インクジェット、特に、ピエゾ素子を利用したインクジェット方式によれば、微量かつ供給量を高精度に制御して供給することができるため、本発明のように、蛍光発光特性の相違に基づいて塩基種を特定する場合には、特に有効である。すなわち、本発明のプローブによる塩基種の判定のためには、プローブの固定領域（スポット）毎におけるプローブ量のバラツキが検出精度に影響するからである。 Probe immobilization forms include covalent bond and non-covalent immobilization, but the immobilization form and immobilization technique are not limited as long as the probe is immobilized in a hybridizable manner. For example, for immobilization by covalent bond, there are an on-chip synthesis method in which a probe is synthesized on a substrate and a method in which the synthesized probe is supplied to a predetermined site on a solid surface and covalently bound. Moreover, it is preferable to employ an ink jet method for supplying the probe to the solid surface. According to the inkjet method, in particular, an inkjet method using a piezo element, it is possible to supply a trace amount with a highly accurate supply amount. Therefore, as in the present invention, the base species is selected based on the difference in fluorescence emission characteristics. This is particularly effective when specifying. That is, in order to determine the base type using the probe of the present invention, the variation in the amount of probe in each probe fixed region (spot) affects the detection accuracy.
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples.
（実施例１：ヌクレオチド誘導体(2AntU)の合成）
図１に参照しながら、示すヌクレオチド誘導体(2AntU)の合成法を説明する。なお、化合物の番号は、図１に示す化合物の番号に対応している。
(Example 1: Synthesis of nucleotide derivative ( 2Ant U))
A method for synthesizing the nucleotide derivative (2AntU) shown will be described with reference to FIG. The compound numbers correspond to the compound numbers shown in FIG.
（１）化合物２の合成
窒素雰囲気下、化合物１である2-アントラセンカルボン酸 (150 mg, 0.675 mmol) を無水N,N'-ジメチルホルムアミド6.0 ml に溶解しベンゾトリアゾール−１−ｙｌ−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（４２１．４ｍｇ，０．８１０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、プロパルギルアミン（４４．６ｍｇ，０．８１０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１０４．７ｍｇ，０．８１０ｍｍｏｌ）を加え、１７時間撹拌した。反応溶媒を減圧留去した後、水を加えクロロホルムで抽出して目的の化合物（２）を粗精製物として得て（１６０．６ｍｇ，９２％）、これを用いて化合物（２）を合成した。なお、ＮＭＲによる同定データは以下の通りであった。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ２．３３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，３．６Ｈｚ），４．３５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝３．２，３．６Ｈｚ），７．５０−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，１１．６Ｈｚ），８．０２−８．０８（ｍ，２Ｈ），８．４６−８．５３（ｍ，２Ｈ）．
(1) Synthesis of Compound 2 Under a nitrogen atmosphere, 2-anthracenecarboxylic acid (150 mg, 0.675 mmol) as Compound 1 was dissolved in 6.0 ml of anhydrous N, N′-dimethylformamide to obtain benzotriazole-1-yl-oxy-. Tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) (421.4 mg, 0.810 mmol) was added. After stirring at room temperature for 1 hour and confirming the disappearance of the raw materials by thin layer chromatography (TLC), propargylamine (44.6 mg, 0.810 mmol) and diisopropylethylamine (104.7 mg, 0.810 mmol) were added for 17 hours. Stir. After the reaction solvent was distilled off under reduced pressure, water was added and the mixture was extracted with chloroform to obtain the target compound (2) as a crude product (160.6 mg, 92%), which was used to synthesize the compound (2). . The identification data by NMR was as follows. 1 H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.33 (dd, 1H, J = 3.2, 3.6 Hz), 4.35 (dd, 2H, J = 3.2, 3.6 Hz), 7.50 − 7.55 (m, 2H), 7.80 (dd, 1H, J = 2.4, 11.6 Hz), 8.02-8.08 (m, 2H), 8.46-8.53 (m , 2H).
（２）化合物４の合成
窒素雰囲気下、化合物３（２５２．６ｍｇ，０．３８５ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド６．０ｍｌに溶解し化合物２（１００．０ｍｇ，０．３８５ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（４４．５ｍｇ，０．０３８５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１０７．３μｌ，０．７７０ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（１４．７ｍｇ，０．０７７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１７ 時間撹拌して薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒クロロホルム／メタノール＝１０／１）により精製して目的の化合物４を無色固体（１２０．２ｍｇ，０．１５３ｍｍｏｌ，収率４０％）として得た。なお、ＮＭＲによる同定データは、以下の通りであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）ｄ２．２７−２．３０（ｍ，１Ｈ），２．５４−２．５６（ｍ，１Ｈ），３．２５（ｍ，２Ｈ），３．６６（ｓ，３Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），４．０９−４．０１（ｍ，１Ｈ），４．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２，８．４Ｈｚ），４．５５（ｍ，２Ｈ），６．３２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），６．７６−７．２９（ｍ，１３Ｈ），７．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．４４−７．５０（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．８９−７．９６（ｍ，２Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），８．３２−８．３５（ｍ，２Ｈ）．
(2) Synthesis of Compound 4 Under a nitrogen atmosphere, Compound 3 (252.6 mg, 0.385 mmol) was dissolved in 6.0 ml of anhydrous N, N′-dimethylformamide to dissolve Compound 2 (100.0 mg, 0.385 mmol), tetrakis. Triphenylphosphine palladium (0) (44.5 mg, 0.0385 mmol), triethylamine (107.3 μl, 0.770 mmol) and copper (I) iodide (14.7 mg, 0.077 mmol) were added. After stirring at room temperature for 17 hours and confirming the disappearance of the raw materials by thin layer chromatography (TLC), the reaction solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (silica gel, elution solvent chloroform / methanol = 10/1) to obtain the target compound 4 as a colorless solid (120.2 mg, 0.153 mmol, yield 40%). The identification data by NMR was as follows.
1 H NMR (CD3OD, 400 MHz) d2.27-2.30 (m, 1H), 2.54-2.56 (m, 1H), 3.25 (m, 2H), 3.66 (s, 3H ), 3.67 (s, 3H), 4.09-4.01 (m, 1H), 4.17 (dd, 1H, J = 5.2, 8.4 Hz), 4.55 (m, 2H) ), 6.32 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 6.76-7.29 (m, 13H), 7.38 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.44-7 .50 (m, 1H), 7.64 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.89-7.96 (m, 2H), 8.17 (s, 1H), 8.32-8 .35 (m, 2H).
（３）化合物５の製造
窒素雰囲気下、前記で得た化合物４（４７．０ｍｇ，０．０６０ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン１．０ｍｌに溶解し、１Ｈテトラゾール無水アセトニトリル溶液（０．４５Ｍ，１７３．０μｌ，０．０７８ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２４．８μｌ，０．０７８ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去した。残渣を無水アセトニトリル１．０ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターｓ（溶媒系、ナカライテスク）でろ過した。ろ液を濃縮し、目的の化合物（５）を粗精製物として得た。ＤＮＡ合成には化合物５の粗精製物をそのまま用いた。
(3) Production of Compound 5 Under a nitrogen atmosphere, Compound 4 (47.0 mg, 0.060 mmol) obtained above was dissolved in 1.0 ml of anhydrous dichloromethane, and 1H tetrazole anhydrous acetonitrile solution (0.45 M, 173.0 μl, 0.078 mmol), 2-cyanoethyl-N, N, N ′, N′-tetraisopropyl phosphorodiamidite (24.8 μl, 0.078 mmol) was added. This solution was stirred at room temperature for 2 hours, and after confirming the disappearance of the raw materials by thin layer chromatography (TLC), the reaction solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in 1.0 ml of anhydrous acetonitrile and filtered through Cosmonis filter s (solvent system, Nacalai Tesque). The filtrate was concentrated to obtain the target compound (5) as a crude product. The crude product of compound 5 was used as it was for DNA synthesis.
（実施例２：ヌクレオチド誘導体（２ＡｎｔＵ）を用いたオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成）
実施例１で製造したヌクレオチド誘導体（２ＡｎｔＵ、化合物５）を用いて、ヌクレオチド誘導体含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社のＤＮＡ自動合成機（３４００ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー）で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。なお、５’末端はアミノ修飾されるとともにＳｐａｃｅｒＣ１２（１２−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ドデシル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）］ホスホアミダイト）が導入された。
ＯＤＮ（２ＡｎｔＵ）（５’−ＮＨ２−ＳｐａｃｅｒＣ１２−tgaagggct2Antucttccagata−３’）（配列番号１）
(Example 2: Synthesis of oligodeoxyribonucleotide using nucleotide derivative ( 2Ant U))
The nucleotide derivative-containing oligodeoxyribonucleotide was synthesized using the nucleotide derivative ( 2Ant U, compound 5) produced in Example 1. Oligodeoxyribonucleotide was synthesized according to a normal phosphoramidite method using an automated DNA synthesizer (3400 DNA / RNA synthesizer) manufactured by Applied Biosystems. The synthesized sequence was as follows. In addition, Spacer C12 (12- (4-monomethoxytritylamino) dodecyl-[(2-cyanoethyl)-(N, N′-diisopropyl)] phosphoamidite) was introduced while the 5 ′ end was amino-modified.
ODN ( 2Ant U) (5′-NH 2 -Spacer C12-tgaagggct 2 Ant ucttccagata-3 ′) (SEQ ID NO: 1)
合成後、固層担体からオリゴヌクレオチドをアンモニア水を用いて切り出し、エッペンドルフチューブに移し替え、５５℃で８時間加熱して脱保護を行った。得られたオリゴヌクレオチドの水溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＰＵ−２８０８ｐｌｕｓ，ＪＡＳＣＯ）で精製した。精製後、凍結乾燥機で溶媒を減圧留去することで目的の配列（ＯＤＮ（２ＡｎｔＵ）を得た。なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる質量分析データは以下の通りであった。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（［Ｍ＋Ｈ］−：ｃａｌｃｄ．：６６３９．６６，ｆｏｕｎｄ：６６４０．５１．）
After synthesis, the oligonucleotide was excised from the solid layer carrier using aqueous ammonia, transferred to an Eppendorf tube, and deprotected by heating at 55 ° C. for 8 hours. The obtained aqueous solution of oligonucleotide was purified by high performance liquid chromatography (PU-2808plus, JASCO). After purification, the solvent was distilled off under reduced pressure with a freeze dryer to obtain the target sequence (ODN (2 AntU). Mass spectrometry data by MALDI-TOF was as follows.
MALDI-TOF MS ([M + H]-: calcd.:66339.66, found: 664.51.)
（実施例３：２ＡｎｔＵ 含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ(２ＡｎｔＵ)）の蛍光分析）
実施例２により得られたＢＤＦ プローブＯＤＮ（２ＡＮＴＵ）を２．５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約２５℃で測定したところ、図２に示すように、励起波長３７１ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍであり、４５０ｎｍにおける蛍光強度は、１．４であった。
(: Fluorescence analysis of 2Ant U-containing oligodeoxyribonucleotides (ODN (2Ant U)) Example 3)
A solution was prepared by dissolving the BDF probe ODN ( 2ANT U) obtained in Example 2 in 50 mM phosphate buffer (PH 7.0) containing 0.1 M sodium chloride so that the concentration was 2.5 μM. When the fluorescence spectrum of this solution was measured at about 25 ° C. using a fluorescence spectrophotometer, as shown in FIG. 2, the excitation wavelength was 371 nm, the fluorescence wavelength was 450 nm, and the fluorescence intensity at 450 nm was 1.4. .
２ＡｎｔＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドとの２ＡｎｔＵ以外の部分が相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドを別途合成した。
(A’)；5'- tatctggaaga agcccttca -3'（配列番号２)
(T’)；5'- tatctggaagt agcccttca -3'（配列番号３)
(G’)；5'- tatctggaagg agcccttca -3'（配列番号４）
(C’)；5'- tatctggaagc agcccttca -3'（配列番号５）
An oligodeoxyribonucleotide complementary to a portion other than 2Ant U with a 2AntU- containing oligodeoxyribonucleotide was synthesized separately.
(A ');5'-tatctggaagaagcccttca-3' (SEQ ID NO: 2)
(T ');5'-tatctggaagtagcccttca-3' (SEQ ID NO: 3)
(G ');5'-tatctggaaggagcccttca-3' (SEQ ID NO: 4)
(C ');5'-tatctggaagcagcccttca-3' (SEQ ID NO: 5)
上記溶液に、これらのオリゴデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ２．５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合し、これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、４５０ｎｍにおける蛍光強度は３．８であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、４５０ｎｍにおける蛍光強度は１．１であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ’）を加えた場合には、４５０ｎｍにおける蛍光強度は１．７であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）を加えた場合には、４５０ｎｍにおける蛍光強度は０．８ であった。 These oligodeoxyribonucleotides were added to the above solution so as to be 2.5 μM, mixed with a vortex mixer, and the fluorescence spectrum of these solutions was measured using a fluorescence spectrophotometer. When A ′) was added, the fluorescence intensity at 450 nm was 3.8. When oligodeoxyribonucleotide (T ′) was added, the fluorescence intensity at 450 nm was 1.1, and when oligodeoxyribonucleotide (G ′) was added, the fluorescence intensity at 450 nm was 1.7, When oligodeoxyribonucleotide (C ′) was added, the fluorescence intensity at 450 nm was 0.8.
以上のことから、ＢＤＦプローブＯＤＮ（２ＡＮＴＵ）は、その２ＡｎｔＵにおいて相対する塩基がアデニンであるとき他の塩基の場合に比して高い蛍光を発し、相対する塩基がアデニンであるとき、アデニンを識別可能な蛍光発光特性を有していることがわかった。また、ＢＤＦプローブＯＤＮ（２ＡＮＴＵ）の蛍光波長は４５０ｎｍであって、従来のピリン化合物をインターカレーターとして備えるＢＤＦプローブＯＤＮに比して約５０ｎｍ長波長側にシフトしていた。 From the above, the BDF probe ODN ( 2ANT U) emits a higher fluorescence when the opposite base in 2Ant U is adenine, and when the opposite base is adenine, It was found that they have fluorescent emission characteristics that can be distinguished from each other. The fluorescence wavelength of the BDF probe ODN ( 2ANT U) was 450 nm, which was shifted to a longer wavelength side by about 50 nm compared to the BDF probe ODN provided with a conventional pilin compound as an intercalator.
（実施例６：２ＡｎｔＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドをプローブとして固定したＤＮＡマイクロアレイの作製）
本実施例では、２ＡｎｔＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド(配列番号１)及び従来のＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド(配列番号６)をプローブとして固定したＤＮＡマイクロアレイを作製して、蛍光強度の測定を行った。
(Example 6: Production of DNA microarray in which 2Ant U-containing oligodeoxyribonucleotides are immobilized as probes)
In this example, a DNA microarray was prepared by immobilizing 2 Ant U-containing oligodeoxyribonucleotide (SEQ ID NO: 1) and conventional Py U-containing oligodeoxyribonucleotide (SEQ ID NO: 6) as probes, and the fluorescence intensity was measured.
（プローブ及びサンプルのオリゴヌクレオチドの調製）
これらのプローブとハイブリダイゼーションさせるサンプルは、２ＡｎｔＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブには、配列番号２〜５のオリゴヌクレオチドを用い、ＰｙＵ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブには、配列番号７〜１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。表１にプローブ及びサンプルの塩基配列を示す。
(Preparation of probe and sample oligonucleotides)
Samples for these probes and hybridization, the 2Ant U-containing oligodeoxyribonucleotide probes, using the oligonucleotides SEQ ID NO: 2-5, the Py U-containing oligodeoxyribonucleotide probe, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7-10 The oligonucleotide having was used. Table 1 shows the probe and sample base sequences.
（固定用基板の調製）
１０％ＮａＯＨ−６０％エタノール水溶液に２ 時間浸漬し、純水で１０回洗浄した７６×２６×１ｍｍサイズのガラス製スライド（松波硝子工業社製）を１０％ポリ−Ｌ−リジン水溶液に１時間浸漬した。純水で１０回の洗浄後、８００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、水分を除去して室温で乾燥して、固定用基板を調製した。
(Preparation of fixing substrate)
A 76 × 26 × 1 mm size glass slide (manufactured by Matsunami Glass Industrial Co., Ltd.) immersed in 10% NaOH-60% ethanol aqueous solution for 2 hours and washed 10 times with pure water for 1 hour in 10% poly-L-lysine aqueous solution. Soaked. After washing 10 times with pure water, centrifugation was performed at 800 rpm for 5 minutes to remove moisture and dry at room temperature to prepare a fixing substrate.
（ＤＮＡマイクロアレイの調製）
調製した配列番号１および６の各プローブを、最終濃度が５０ｐｍｏｌ／μｌとなるように調整し、調製した基板に２００ｐｌをそれぞれスポット（１０ｎｍｏｌ）した。その後、８０℃で１時間乾燥処理し、各スポットに水を添加し、基板上にＤＮＡ断片を固定した。この基板を１％ＢＳＡブロッキング溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌ、１０％ＳＤＳ１．２５ｍｌ）で４５分間（４２℃）振盪した。その後、９５℃純水で１分間、９５％エタノールで１分間それぞれ浸漬させ、遠心（８００ｒｐｍ、１分間）し、目的とするＤＮＡマイクロアレイを調製した。
(Preparation of DNA microarray)
The prepared probes of SEQ ID NOs: 1 and 6 were adjusted so that the final concentration was 50 pmol / μl, and 200 pl was spotted (10 nmol) on the prepared substrate. Then, it dried at 80 degreeC for 1 hour, water was added to each spot, and the DNA fragment was fixed on the board | substrate. The substrate was shaken for 45 minutes (42 ° C.) with 1% BSA blocking solution (50 mg / ml) 5 ml, 10% SDS 1.25 ml). Thereafter, the sample was immersed in 95 ° C. pure water for 1 minute and 95% ethanol for 1 minute, and centrifuged (800 rpm, 1 minute) to prepare a target DNA microarray.
（サンプルＤＮＡの調製）
オリゴデオキシリボヌクレオチドからなるサンプル（５ｎｍｏｌ／２５μｌ）をサンプルチューブに加え、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液（２５μｌ）を添加した。９５℃ヒートブロックで２分間加熱した後、室温で５分間放置し遠心してサンプル液を調製した（最終濃度：１００ｎＭ）。
(Preparation of sample DNA)
A sample (5 nmol / 25 μl) composed of oligodeoxyribonucleotide was added to a sample tube, and a solution (25 μl) dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M sodium chloride was added. After heating for 2 minutes in a 95 ° C. heat block, the sample liquid was prepared by centrifuging for 5 minutes at room temperature (final concentration: 100 nM).
（ハイブリダイゼーション）
調製したＤＮＡマイクロアレイ上にサンプル液を２５μｌずつ１点にスポットし、カバーガラスで密閉してハイブリダイゼーション反応を行った（４２℃、１６ 時間）。
(Hybridization)
On the prepared DNA microarray, 25 μl of the sample solution was spotted at one point and sealed with a cover glass to carry out a hybridization reaction (42 ° C., 16 hours).
（測定）
反応終了後、バイオチップリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社製）を使用して、最適測定条件で各ＤＮＡスポットの画像ファイルを取込み、蛍光強度を数値化した。結果を表２に示す。
After completion of the reaction, using a biochip reader (Applied Precision), an image file of each DNA spot was captured under optimum measurement conditions, and the fluorescence intensity was digitized. The results are shown in Table 2.
表２に示すように、２ＡｎｔＵ含有プローブは、高い蛍光強度を示しており、しかも蛍光波長が長波長側にシフトしていることから優れた塩基識別能を示すことが分かった。 As shown in Table 2, it was found that the 2Ant U-containing probe showed high fluorescence intensity and also showed excellent base discrimination ability because the fluorescence wavelength was shifted to the long wavelength side.
Claims (19)
請求項１２又は１３に記載のプローブと標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせる工程と、
前記ハイブリダイゼーションのハイブリダイズ産物の蛍光を測定する工程と、
ハイブリダイズ産物の蛍光測定結果と使用したプローブが備えるヌクレオチド誘導体の特定塩基を識別可能な蛍光発光特性とに基づいて前記標的ポリヌクレオチド中の１個又は２個以上の塩基種を同定する評価工程とを、
を備える、方法。 A hybridization method comprising:
Hybridizing the probe of claim 12 or 13 with a target polynucleotide;
Measuring the fluorescence of the hybridized product of the hybridization;
An evaluation step for identifying one or more base species in the target polynucleotide based on a fluorescence measurement result of the hybridized product and a fluorescence emission characteristic capable of identifying a specific base of the nucleotide derivative provided in the probe used; The
A method comprising:
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