JPH11235198A - Confirmation of polynucleotide using selectable cleavage site - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴヌクレオチ
ド鎖内への選択可能開裂部位の組み込み一般に関し、そ
してより詳細には、オリゴヌクレオチド鎖内への過ヨウ
素酸で開裂し得る結合の導入に有用な、新規な試薬類に
関する。本発明はまた、この新規な試薬類を生化学的ア
ッセイに使用する方法に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates generally to the incorporation of a selectable cleavage site into an oligonucleotide chain, and more particularly, to the introduction of a periodic acid cleavable bond into an oligonucleotide chain. And novel reagents. The present invention also relates to methods of using the new reagents in biochemical assays.
【０００２】[0002]
【従来の技術】オリゴヌクレオチド配列を自由に合成
し、そして、合成的方法で調製された、または、天然の
ソースから得られたポリヌクレオチド配列をクローニン
グし得ることで、染色体(単数あるいは複数)、配列の混
合物、mRNA等の伸張したオリゴヌクレオチド配列中の特
定の配列の存在を検出する機会が著しく拡大しつつあ
る。以下は僅か数例の代表例に過ぎないが、興味深い特
定の配列には、病原体の存在の診断、対立遺伝子の存在
の確認、宿主ゲノム中の損傷の存在、特定のmRNAの検出
または細胞宿主の修飾のモニタリング、が含まれ得る。
試料中の種々の抗原の存在を診断するアッセイを行なう
ための抗体の使用は、ラジオイムノアッセイの出現以
降、技法およびプロトコールの面で爆発的拡大が見られ
るが、つい最近まで、DNAプローブの領域では同様の拡
大はなかった。従って、配列の検出法の殆どは、ポリヌ
クレオチド配列を支持体に結合する必要があり、そして
放射標識したプローブを使用する種々のハイブリダイゼ
ーション技術を含んでいる。BACKGROUND OF THE INVENTION The ability to freely synthesize oligonucleotide sequences and to clone polynucleotide sequences prepared by synthetic methods or obtained from natural sources allows the chromosome (s), The opportunity to detect the presence of a particular sequence in an extended oligonucleotide sequence, such as a mixture of sequences, mRNA, etc., is significantly expanding. The following are just a few representative examples, but specific sequences of interest include diagnosing the presence of a pathogen, confirming the presence of an allele, the presence of a lesion in the host genome, detecting a particular mRNA or Monitoring of modifications may be included.
The use of antibodies to perform assays to diagnose the presence of various antigens in a sample has exploded in technology and protocols since the advent of radioimmunoassays, but until recently, in the area of DNA probes, There was no similar expansion. Thus, most of the methods for detecting sequences require the binding of the polynucleotide sequence to a support and include various hybridization techniques using radiolabeled probes.
【０００３】経済的方法で大量のオリゴヌクレオチド配
列を製造する能力の向上を背景に、研究者らの関心は、
特定のオリゴヌクレオチド配列の検出のための、単純、
正確かつ効果的な技術の提供に向けられている。これら
技術は、迅速で、技術者がエラーを犯す機会を最小に
し、自動化が可能で、そして、単純かつ正確な検出方法
を考慮していることが望ましい。この目的のために、ラ
ジオアイソトープ以外の標識でオリゴヌクレオチドプロ
ーブを標識する手段の提供、および、ゲルから支持体へ
のDNA配列の転写の正確さの向上、および、標識の結合
を考慮した誘導体化オリゴヌクレオチドのための改善さ
れた方法を提供するために、すでに努力がなされてい
る。多様なソースに由来し得るDNAを用いる種々の状況
でも、対象のDNA配列をフレキシブルに検出し得る新し
いプロトコールの提供に対する必要性は存続している。[0003] With the increasing ability to produce large amounts of oligonucleotide sequences in an economical manner, researchers are interested in:
Simple, for the detection of specific oligonucleotide sequences,
It is aimed at providing accurate and effective technology. These techniques should be fast, minimize the opportunity for technicians to make errors, be automatable, and allow for simple and accurate detection methods. For this purpose, providing a means of labeling the oligonucleotide probe with a label other than the radioisotope, improving the accuracy of transcription of the DNA sequence from the gel to the support, and derivatizing in consideration of the binding of the label Efforts have already been made to provide improved methods for oligonucleotides. Even in a variety of situations using DNA from a variety of sources, the need for providing new protocols that can flexibly detect the DNA sequence of interest continues.
【０００４】MeinkothとWahl、Anal. Biochemistry (19
84) 138:267-284は、ハイブリダイゼーション技術の優
れた総説である。Learyら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A (1983) 80:4045-4049は、特定のオリゴヌクレオチド
配列の検出のための、アビジン-酵素複合体と組み合わ
せたビオチン化DNAの使用を記載している。Rankiら、Ge
ne (1983)21:77-85は、オリゴヌクレオチド配列の検出
のための、彼等が「サンドイッチ」ハイブリダイゼーシ
ョンと呼ぶ技術を記載している。PfeufferとHelmrich、
J. of Biol. Chem. (1975)250:867-876は、セファロー
ス4Bへのグアノシン-5'-O-(3-チオトリホスフェート)の
カップリングを記載している。Baumanら、J. of Histoc
hem. and Cytochem. (1981) 29:227-237は、蛍光を用い
るRNAの3'末端の標識化を記載している。PCT出願WO/830
2277号は、標識用の改変リボヌクレオチドのDNAフラグ
メントへの付加および、このようなDNAフラグメントを
分析する方法を記載している。RenzとKurz、Nucl. Acid
s Res. (1984)12:3435-3444は、オリゴヌクレオチドに
酵素を共有結合させる方法を記載している。Wallace、D
NA Recombinant Technology(Woo, S.編集)CRC Press、 B
oca Raton、 Floridaは、診断のためのプローブの使用に
関する一般的背景を提供している。ChouとMerigan、N.
Eng. J. of Med. (1983) 308:921-925は、CMVの検出用
の、ラジオアイソトープ標識化プローブの使用を記載し
ている。Inman、Methods in Enzymol.34B, 24 (1974) 3
0-59は、ポリアクリルアミドへの結合のための手順を記
載し、一方、Parikhら、Methodsin Enzymol. 34B, 24
(1974) 77-102は、アガロースとのカップリング反応を
記載している。Alwineら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1977) 74:5350-5354は、ハイブリダイゼーションのた
めの、ゲルから固相支持体へのオリゴヌクレオチドの転
写方法を記載している。Chuら、Nucl. Acids Res. (19
83)11:6513-6529は、末端のヌクレオチドの誘導体化技
術を記載している。Hoら、Biochmistry (1981)20:64-67
は、リン酸を付してエステルを形成する末端のヌクレオ
チドの誘導体化を記載している。AshleyとMacDonald、
Anal. Biochem. (1984)140:95-103は、表面に結合した
テンプレートからプローブを調製する方法を報告してい
る。これらの技術を記載したこれら参考文献を、標識化
オリゴヌクレオチドの調製方法を支持する記載として、
本明細書に援用する。Meinkoth and Wahl, Anal. Biochemistry (19
84) 138 : 267-284 is an excellent review of hybridization techniques. Leary et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. US
A (1983) 80 : 4045-4049 describes the use of biotinylated DNA in combination with an avidin-enzyme complex for the detection of specific oligonucleotide sequences. Ranki et al., Ge
ne (1983) 21 : 77-85 describes a technique for detecting oligonucleotide sequences, which they refer to as "sandwich" hybridizations. Pfeuffer and Helmrich,
J. of Biol. Chem. (1975) 250 : 867-876 describes the coupling of guanosine-5'-O- (3-thiotriphosphate) to Sepharose 4B. Bauman et al., J. of Histoc
hem. and Cytochem. (1981) 29 : 227-237 describe the labeling of the 3 'end of RNA using fluorescence. PCT application WO / 830
No. 2277 describes the addition of modified ribonucleotides for labeling to DNA fragments and methods for analyzing such DNA fragments. Renz and Kurz, Nucl. Acid
s Res. (1984) 12 : 3435-3444 describes a method for covalently attaching an enzyme to an oligonucleotide. Wallace, D
NA Recombinant Technology (Woo, S. Edit) CRC Press, B
oca Raton, Florida provides a general background on the use of probes for diagnosis. Chou and Merigan, N.
Eng. J. of Med. (1983) 308 : 921-925 describes the use of radioisotope-labeled probes for the detection of CMV. Inman, Methods in Enzymol. 34B, 24 (1974) 3
0-59 describes a procedure for conjugation to polyacrylamide, while Parikh et al., Methods in Enzymol. 34B, 24
(1974) 77-102 describes a coupling reaction with agarose. Alwine et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1977) 74 : 5350-5354 describes a method for transferring oligonucleotides from a gel to a solid support for hybridization. Chu et al . , Nucl. Acids Res. (19
83) 11 : 6513-6529 describes a technique for derivatizing terminal nucleotides. Ho et al., Biochmistry (1981) 20 : 64-67
Describes derivatization of terminal nucleotides to which a phosphate is attached to form an ester. Ashley and MacDonald,
Anal. Biochem. (1984) 140 : 95-103 reports a method for preparing probes from surface-bound templates. These references describing these techniques, as a description supporting the method of preparing a labeled oligonucleotide,
Incorporated herein.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】目的のオリゴヌクレオ
チド配列を検出する、単純、正確かつ効果的な技術を提
供する。SUMMARY OF THE INVENTION A simple, accurate and effective technique for detecting an oligonucleotide sequence of interest is provided.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明は、核酸試料中に
存在する核酸被分析物中の対象オリゴヌクレオチド配列
の存在を検出する方法に関し、この方法は、ハイブリダ
イズ条件下で、該核酸試料とポリヌクレオチド試薬とを
結合する工程であって、該ハイブリダイズ条件では、該
試料または該試薬の成分の何れか一つが支持体と結合さ
れ、そして該被分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハ
イブリダイゼーションは、R1およびR2が独立して、アル
キレン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアル
ケニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリー
ルアルキレン(aralkylene)、およびこれらの組合せから
なる群から選択され、そしてXは過ヨウ素酸で開裂し得
る結合である選択可能な開裂部位-R1-O-X-O-R2-を介し
て、該支持体と結合した標識を生じさせる工程；該選択
可能な開裂部位を介さずに該支持体に結合した標識を該
支持体から実質的に除去する工程；過ヨウ素酸試薬で該
開裂部位を切断する工程；および該支持体から遊離した
標識を検出する工程；を包含する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a method for detecting the presence of an oligonucleotide sequence of interest in a nucleic acid analyte present in a nucleic acid sample, the method comprising detecting the nucleic acid sample under hybridizing conditions. Binding the polynucleotide reagent to the polynucleotide reagent under the hybridization conditions, wherein one of the sample or the components of the reagent is bound to a support, and the analyte and the polynucleotide reagent are hybridized. The hybridization is such that R 1 and R 2 are independently selected from the group consisting of alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, aralkylene, and combinations thereof, and X is -R selectable cleavage site is a bond cleavable by periodate 1 -OXOR 2 - through, bound to the support label Allowing the label to be substantially removed from the support without passing through the selectable cleavage site; cleaving the cleavage site with a periodate reagent; and Detecting the label released from the enzyme.
【０００７】前記ポリヌクレオチド試薬は、支持体と結
合した第一ポリヌクレオチド捕捉プローブおよび第二ポ
リヌクレオチド標識プローブを含有し得、該第一および
第二プローブは、前記ハイブリダイズ条件下で前記被分
析物中に存在する配列と二本鎖を形成する様に、該配列
に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有し得、該第一お
よび第二オリゴヌクレオチド配列の内の少なくとも一つ
は対象配列であり得、前記捕捉プローブは前記選択可能
な開裂部位を含み得る。[0007] The polynucleotide reagent may include a first polynucleotide capture probe and a second polynucleotide label probe bound to a support, wherein the first and second probes are capable of analyzing the analyte under the hybridizing conditions. An oligonucleotide sequence complementary to said sequence so as to form a duplex with the sequence present in the product, wherein at least one of said first and second oligonucleotide sequences is a subject sequence. Thus, the capture probe can include the selectable cleavage site.
【０００８】本発明は、１つの局面で、核酸試料中に存
在する核酸被分析物中の対象オリゴヌクレオチド配列の
存在を検出する方法に関し、この方法は、水性溶媒中の
ハイブリダイズ条件下で、該核酸試料とポリヌクレオチ
ド試薬とを結合する工程であって、該ハイブリダイズ条
件では、該試料または該試薬の成分の何れか一つは支持
体と結合され、そして該被分析物と該ポリヌクレオチド
試薬とのハイブリダイゼーションは、R1およびR2が独立
して、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、
シクロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリー
ル、アリールアルキレン、およびこれらの組合せからな
る群から選択され、そして、Xは過ヨウ素酸開裂し得る
結合である選択可能な開裂部位-R1-O-X-O-R2-を介し
て、該支持体と結合した標識を生じさせる工程；該液媒
から、ポリヌクレオチド試薬が結合した該支持体および
核酸被分析物を分離する工程；前記液媒と異なるハイブ
リダイゼーションストリンジェンシーの溶媒で該支持体
を洗浄し、該選択可能な開裂部位を介さずに該支持体に
結合した標識を除去する工程；過ヨウ素酸試薬で該開裂
部位を切断する工程；および該支持体から遊離した標識
を検出する工程；を包含する。[0008] In one aspect, the present invention relates to a method for detecting the presence of an oligonucleotide sequence of interest in a nucleic acid analyte present in a nucleic acid sample, the method comprising the steps of: Binding the nucleic acid sample to a polynucleotide reagent, wherein under the hybridization conditions, one of the components of the sample or the reagent is bound to a support, and the analyte and the polynucleotide Hybridization with the reagent is such that R 1 and R 2 are independently alkylene, alkenylene, cycloalkylene,
X is selected from the group consisting of cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, arylalkylene, and combinations thereof, and X is via a selectable cleavage site -R 1 -OXOR 2- which is a periodate cleavable bond. Generating a label bound to the support; separating the support and the nucleic acid analyte bound to the polynucleotide reagent from the liquid medium; using a solvent having a different hybridization stringency from the liquid medium. Washing the support to remove the label bound to the support without going through the selectable cleavage site; cleaving the cleavage site with a periodate reagent; and label released from the support Detecting the following.
【０００９】前記ポリヌクレオチド試薬は、支持体と結
合した第一ポリヌクレオチド捕捉プローブおよび第二ポ
リヌクレオチド標識プローブを含有し得、該第一および
第二プローブは、前記ハイブリダイズ条件下で前記被分
析物中に存在する配列と二本鎖を形成する様に、該配列
に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有し得、該第一お
よび第二オリゴヌクレオチド配列の内の少なくとも一つ
は対象配列であり得、前記捕捉プローブは前記選択可能
な開裂部位を含み得る。[0009] The polynucleotide reagent may comprise a first polynucleotide capture probe and a second polynucleotide label probe bound to a support, wherein the first and second probes are capable of analyzing the analyte under the hybridizing conditions. An oligonucleotide sequence complementary to said sequence so as to form a duplex with the sequence present in the product, wherein at least one of said first and second oligonucleotide sequences is a subject sequence. Thus, the capture probe can include the selectable cleavage site.
【００１０】前記Xは、Rが水素あるいはアルキルであ
る、In the above X, R is hydrogen or alkyl;
【００１１】[0011]
【化２】 Embedded image
【００１２】からなる群から選択され得る。May be selected from the group consisting of:
【００１３】本発明は、１つの局面で、一方の末端近傍
で支持体と結合し、そして反対の末端に対象の配列に相
補的な配列を有するポリヌクレオチド配列を含む、核酸
試料中に存在する核酸被分析物中の対象オリゴヌクレオ
チド配列の存在の検出に有用なプローブに関し、このプ
ローブは、さらに、R1およびR2が独立して、アルキレ
ン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニ
レン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリールア
ルキレン、およびこれらの組合せからなる群から選択さ
れ、そして、Xは、過ヨウ素酸開裂し得る結合である、
選択可能な開裂部位-R1-O-X-O-R2-を含む。The present invention, in one aspect, is present in a nucleic acid sample comprising a polynucleotide sequence that binds to a support near one end and has a sequence complementary to the sequence of interest at the opposite end. A probe useful for detecting the presence of an oligonucleotide sequence of interest in a nucleic acid analyte, wherein the probe further comprises, independently for R 1 and R 2 , an alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, X is selected from the group consisting of aryl, arylalkylene, and combinations thereof, and X is a periodate cleavable bond;
Includes a selectable cleavage site -R 1 -OXOR 2- .
【００１４】本発明は、１つの局面で、次式の構造：The present invention provides, in one aspect, a structure of the following formula:
【００１５】[0015]
【化３】 Embedded image
【００１６】ここで、DNA1はDNAの第一鎖であり、DNA2
は、DNAの第二鎖であり、R1およびR2は独立して、アル
キレン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアル
ケニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリー
ルアルキレン、およびこれらの組合せからなる群から選
択され、そして、Xは過ヨウ素酸開裂し得る結合であ
る、を有するポリヌクレオチド試薬に関する。Here, DNA 1 is the first strand of DNA, and DNA 2
Is the second strand of DNA, wherein R 1 and R 2 are independently selected from the group consisting of alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, arylalkylene, and combinations thereof; And X is a bond which can be cleaved with periodate.
【００１７】前記Xは、Rが水素あるいはアルキルであ
る、In the above X, R is hydrogen or alkyl;
【００１８】[0018]
【化４】 Embedded image
【００１９】からなる群から選択され得る。May be selected from the group consisting of:
【００２０】前記-R1-O-X-O-R2-は、The -R 1 -OXOR 2 -is
【００２１】[0021]
【化５】 Embedded image
【００２２】であり得る。[0022]
【００２３】本発明は、１つの局面で、次式の構造：The invention provides, in one aspect, a structure of the following formula:
【００２４】[0024]
【化６】 Embedded image
【００２５】；ここで、R1およびR2は独立して、アルキ
レン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケ
ニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリール
アルキレン、およびこれらの組合せからなる群から選択
され、Xは、過ヨウ素酸開裂し得る結合であり、Y1は、
酸に感受性で、塩基に安定な保護基であり、そしてY
2は、水素、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステ
ル、ホスホジエステル、ホスファイト、H-ホスホネート
およびホスホロチオエートからなる群から選択される；
で表されるポリヌクレオチド合成に有用なポリヌクレオ
チド試薬に関する。Wherein R 1 and R 2 are independently selected from the group consisting of alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, arylalkylene, and combinations thereof; A periodate-cleavable bond, Y 1 is
An acid-sensitive, base-stable protecting group, and Y
2 is selected from the group consisting of hydrogen, phosphoramidite, phosphotriester, phosphodiester, phosphite, H-phosphonate and phosphorothioate;
The present invention relates to a polynucleotide reagent useful for polynucleotide synthesis represented by the formula:
【００２６】このポリヌクレオチド試薬は、構造式：The polynucleotide reagent has the structural formula:
【００２７】[0027]
【化７】 Embedded image
【００２８】；ここで、DMTは、ジメトキシトリチル
を、そして、iPrは、イソプロピルを表わす；であり得
る。Wherein DMT represents dimethoxytrityl and iPr represents isopropyl;
【００２９】固相支持体、少なくとも一種類の標識、お
よび試料と標識化プローブが関与するハイブリダイゼー
ションを使用する、特定のヌクレオチド配列を検出する
ための方法が提供される。この方法では、二本鎖形成の
存在または不在は、支持体と標識(単数あるいは複数の)
との間の空間的関係を改変する能力に変換される。この
技術の例は、標識化プローブと試料DNAとの二本鎖形成
を介して、標識と支持体の間に開裂部位を提供すること
である。この状態では、二本鎖は、支持体に結合してい
る。次に、この開裂部位を切断すると、支持体と標識
(単数あるいは複数の)が分離される。次いで、標識の存
在または不在の検出は、通常の技術に従って、行ない得
る。A method is provided for detecting a specific nucleotide sequence using a solid support, at least one label, and hybridization involving a sample and a labeled probe. In this method, the presence or absence of duplex formation is determined by the support and the label (s)
Is translated into the ability to alter the spatial relationship between An example of this technique is to provide a cleavage site between the label and the support via duplex formation between the labeled probe and the sample DNA. In this state, the duplex is bound to the support. Next, when this cleavage site is cleaved, the support and the label
(Single or multiple) are separated. Detection of the presence or absence of the label can then be performed according to conventional techniques.
【００３０】従来技術に対する本発明の主要な利点は、
本方法が、標識が特異的に結合しているかあるいは非特
異的に結合しているのかの区別を可能にすることであ
る。即ち、従来の技術では、標識は一般に、固相支持体
上で検出されていた。即ち、試料を支持体に付着させ、
そして、相補的な標識化プローブと接触させ；次いで、
二本鎖形成を、支持体上でアッセイしていた。この方法
の問題点は、被分析物が存在しない場合にも標識が支持
体と結合する可能性があり、実際に結合することであ
る。この標識の支持体への直接の結合を、本明細書中で
は「非特異結合」と呼ぶ。任意の有意な量の非特異結合
が生じた場合、被分析物の存在に拘らず支持体上で標識
が検出され、偽陽性の結果が出る。The main advantages of the present invention over the prior art are:
The method is to allow a distinction between whether the label is specifically or non-specifically bound. That is, in the prior art, the label was generally detected on a solid support. That is, the sample is attached to the support,
And contacting with a complementary labeled probe;
Duplex formation was assayed on the support. The problem with this method is that the label can and does bind to the support even in the absence of the analyte. This direct binding of the label to the support is referred to herein as "non-specific binding". If any significant amount of non-specific binding occurs, the label will be detected on the support regardless of the presence of the analyte, yielding a false positive result.
【００３１】対照的に本発明では、対象被分析物が存在
する場合にのみ標識が検出される。即ち「特異的」結合
のみが検出される。好ましい実施態様では、試料と一種
またはそれ以上のプローブ間とから形成された二本鎖を
介して支持体と選択された標識との間に開裂部位を導入
することが実施される。この開裂部位は、米国特許第4,
775,619号(上記に引用し参考文献として援用する)に記
載された制限エンドヌクレアーゼ開裂部位であり得、ま
たは、例えば、本願の親出願である米国出願番号07/25
1,152号に記載された、多くの種類の化学的開裂部位の
一つであり得る。In contrast, in the present invention, the label is detected only when the analyte of interest is present. That is, only "specific" binding is detected. In a preferred embodiment, a cleavage site is introduced between the support and the selected label via a duplex formed between the sample and one or more probes. This cleavage site is disclosed in U.S. Pat.
No. 775,619 (cited above and incorporated herein by reference) or may be, for example, the restriction endonuclease cleavage site described in U.S. Ser.
It can be one of the many types of chemical cleavage sites described in 1,152.
【００３２】本出願は、新しいクラスの化学的開裂部位
に関する。これらの開裂部位は、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイに用いられる条件および試薬類に対しては極
めて安定であるが、開裂が要求される場合には、過ヨウ
素酸イオンにより容易に開裂できる。本発明はまた、こ
の開裂部位を含むポリヌクレオチド試薬類、および、ポ
リヌクレオチド合成に有用な試薬類、即ち、開裂部位を
含み、そして、容易にポリヌクレオチド鎖に組み込まれ
得る単量体の試薬類にも関する。これらの種々の試薬類
は、容易に高い収率で合成され、そして、開裂部位自身
と同様に種々の条件下で非常に安定である。The present application relates to a new class of chemical cleavage sites. These cleavage sites are extremely stable under the conditions and reagents used in hybridization assays, but can be readily cleaved by periodate ions when cleavage is required. The present invention also provides polynucleotide reagents containing this cleavage site, and reagents useful for polynucleotide synthesis, i.e., monomeric reagents containing a cleavage site and which can be easily incorporated into polynucleotide chains. Related to These various reagents are easily synthesized in high yield and are very stable under various conditions, as well as the cleavage site itself.
【００３３】[0033]
【発明の実施の形態】本発明の方法および試薬を詳細に
記載する前に、本発明が本明細書に記載の特定のプロト
コールまたは物質は当然に変化し得るので、これらに限
定されないことは、理解されるべきことである。本明細
書で使用される用語は、特定の実施態様を記述する目的
にのみ使用され、そして、限定を意図しないこともま
た、理解されるべきである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Before describing the methods and reagents of the present invention in detail, it is to be understood that this invention is not limited to the particular protocols or materials described herein, as such may, of course, vary. It should be understood. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to be limiting.
【００３４】本明細書中および添付した請求の範囲中で
使用する限り、単数形冠詞である「a」、「an」および
「the」を付けられた名詞は、その内容が明らかにそう
でないと示さない限り、複数である対象名詞をも包むこ
とを、特記する。従って、「acleavage site(開裂部
位)」という用語は、2つまたはそれ以上の開裂部位をも
包含する。「a label(標識)」という用語は、2つまたは
それ以上の標識をも包含する、等である。As used herein and in the appended claims, nouns designated with the singular articles "a", "an", and "the" denote that the content is clearly otherwise. It should be noted that, unless otherwise indicated, it also encompasses multiple target nouns. Thus, the term "acleavage site" also includes two or more cleavage sites. The term "a label" also includes two or more labels, and so on.
【００３５】本発明の記述および権利請求では以下に記
述した定義に従って、以下の用語が使用される。In describing and claiming the present invention, the following terminology will be used in accordance with the definitions set out below.
【００３６】「アルキル」は、例えば、メチル、エチ
ル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチ
ル、t-ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキ
サデシル、エイコシル、テトラコシル等の、1から24個
の炭素原子を有する、分枝状または分枝状でない飽和炭
化水素基を指す。「低級アルキル」は、1から8個の、よ
り好ましくは1から6個の、炭素原子を有するアルキル基
を指し、従って例えば、メチル、エチル、プロピル、な
どを含む。"Alkyl" refers to 1 to 24 carbon atoms such as, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, octyl, decyl, tetradecyl, hexadecyl, eicosyl, tetracosyl and the like. Refers to a branched or unbranched saturated hydrocarbon group having an atom. "Lower alkyl" refers to an alkyl group having one to eight, more preferably one to six, carbon atoms and thus includes, for example, methyl, ethyl, propyl, and the like.
【００３７】「アルケニル」は、例えば、エテニル、1-
プロペニル、2-プロペニル、1-ブテニル、2-イソブテニ
ル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、Δ8,11-
ヘプタデカジエニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、
テトラコセニル等の様な、2から24個の炭素原子、およ
び、1つまたはそれ以上の不飽和の炭素-炭素結合を有す
る分枝状または分枝状でない不飽和炭化水素基を指す。
「低級アルケニル」は、2から8個の、より好ましくは2
から6個の、炭素原子のアルケニル基を指し、従って例
えば、エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-ブテ
ニル、2-イソブテニルおよびオクテニルを含む。"Alkenyl" includes, for example, ethenyl, 1-
Propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-isobutenyl, octenyl, decenyl, tetradecenyl, delta 8, 11 -
Heptadecadienyl, hexadecenyl, eicosenyl,
Refers to a branched or unbranched unsaturated hydrocarbon group having 2 to 24 carbon atoms and one or more unsaturated carbon-carbon bonds, such as tetracosenyl and the like.
"Lower alkenyl" means from 2 to 8, more preferably 2
To 6 carbon atom alkenyl groups and thus includes, for example, ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-isobutenyl and octenyl.
【００３８】「アルキレン」は、1から6個の炭素原子を
含む二官能性の飽和した分枝状または分枝状でない炭化
水素鎖を指し、そして、例えば、メチレン(-CH2-)、エ
チレン(-CH2-CH2-)、プロピレン(-CH2-CH2-CH2-)、2-メ
チルプロピレン(-CH2-CH(CH3)-CH2-)、ヘキシレン(-(CH
2)6-)等を含む。[0038] "Alkylene" refers to a hydrocarbon chain not difunctional saturated branched or branched containing from 1 to 6 carbon atoms and, for example, methylene (-CH 2 -), ethylene (-CH 2 -CH 2 -), propylene (-CH 2 -CH 2 -CH 2 - ), 2- methylpropylene (-CH 2 -CH (CH 3) -CH 2 -), hexylene (- (CH
2 ) Including 6- ).
【００３９】「アルケニレン」は、例えば、1、3-プロピ
ル-1-エン、1、4-ブト-2-エニレン、1、5-ペント-2-エニ
レン、および1、6-ヘキサ-3-エニレンの様な、2から24個
の炭素原子、および1つまたはそれ以上の不飽和の炭素-
炭素結合の二官能性で、分枝状または分枝状でない不飽
和炭化水素基を指す。"Alkenylene" includes, for example, 1,3-propyl-1-ene, 1,4-but-2-enylene, 1,5-pent-2-enylene and 1,6-hex-3-enylene 2 to 24 carbon atoms, and one or more unsaturated carbons such as
Refers to a bifunctional, branched or unbranched unsaturated hydrocarbon group with carbon bonds.
【００４０】「アリール」は、フェニルまたは1-または
2-ナフチル基を指す。これらの基は、随意に、1から3個
の、好ましくは1から2個の、低級アルキル、低級アルコ
キシ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、および/またはメ
ルカプト置換基で置換される。"Aryl" is phenyl or 1- or
Refers to a 2-naphthyl group. These groups are optionally substituted with one to three, preferably one to two, lower alkyl, lower alkoxy, hydroxy, amino, nitro, and / or mercapto substituents.
【００４１】「アリールアルキレン」は、本明細書で定
義されたアルキレン基の一方の末端に結合された、本明
細書で定義されたアリール基を指す。"Arylalkylene" refers to an aryl group, as defined herein, attached to one end of an alkylene group, as defined herein.
【００４２】「シクロアルキル」は、3から8個の炭素原
子を有する、飽和炭化水素環基を指し、そして例えば、
シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シク
ロヘプチル、シクロヘキシル、メチルシクロヘキシル、
シクロオクチル、等を含む。"Cycloalkyl" refers to a saturated hydrocarbon ring radical having three to eight carbon atoms and is, for example,
Cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cycloheptyl, cyclohexyl, methylcyclohexyl,
Cyclooctyl, and the like.
【００４３】「シクロアルキレン」は、本明細書で定義
されたアルキレン基の一方の末端に結合した、本明細書
で定義されたシクロアルキル基を含む飽和炭化水素を指
す。この用語は、例えば、シクロヘキシルメチレン、シ
クロプロピルメチレン、シクロブチルエチレン、6-シク
ロオクチルヘキシレン等を含む。"Cycloalkylene" refers to a saturated hydrocarbon containing a cycloalkyl group, as defined herein, attached to one end of an alkylene group, as defined herein. The term includes, for example, cyclohexylmethylene, cyclopropylmethylene, cyclobutylethylene, 6-cyclooctylhexylene, and the like.
【００４４】「シクロオキシアルキレン」は、1つまた
はそれ以上のエーテル酸素原子を含む、本明細書で定義
されたシクロアルキレン基を指す。"Cyclooxyalkylene" refers to a cycloalkylene group as defined herein that contains one or more ether oxygen atoms.
【００４５】本発明は、ハイブリダイゼーションを使用
する特異的配列の検出を含み、これにより、試料DNAと
プローブとの二本鎖形成が、標識と支持体との空間的関
係を改変する能力に影響を及ぼす。この様にして、試料
中の特定の配列の存在または不在が、媒質中に遊離した
標識の量により、容易に測定し得る。The present invention involves the detection of specific sequences using hybridization, whereby the duplex formation between the sample DNA and the probe affects the ability to alter the spatial relationship between the label and the support. Effect. In this way, the presence or absence of a particular sequence in a sample can be easily determined by the amount of label released in the medium.
【００４６】本発明の方法は、核酸試料が支持体に結合
している場合、あるいは溶液中に遊離して存在している
場合も考慮して、プロトコールおよび試薬を変え得る。
好ましい実施態様では、本方法は、開裂部位により標識
が支持体から分離する様な核酸の二本鎖の形成を含み、
その結果、選択的な開裂を与える条件下で放出された標
識の量が、核酸試料中の対象の配列の存在および量の尺
度となる。選択可能な開裂部位は、ホモ二本鎖形成によ
る制限酵素認識部位の形成の結果として生じ得る、また
は、一本鎖ポリヌクレオチド鎖中のこの様な選択可能な
開裂部位の存在は、一本鎖中へこの様な部位を予め導入
した結果であり得る。The method of the present invention can vary protocols and reagents, taking into account whether the nucleic acid sample is bound to a support or if it is free in solution.
In a preferred embodiment, the method comprises forming a duplex of nucleic acid such that the label is separated from the support by the cleavage site;
As a result, the amount of label released under conditions that give rise to selective cleavage is a measure of the presence and amount of the sequence of interest in the nucleic acid sample. A selectable cleavage site may result from the formation of a restriction enzyme recognition site by homoduplex formation, or the presence of such a selectable cleavage site in a single-stranded polynucleotide chain may be a single-stranded This may be the result of introducing such sites in advance.
【００４７】対象のオリゴヌクレオチド配列を有し、核
酸被分析物にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含
む試薬が使用される。この試薬は、本明細書中では、場
合により、「捕捉プローブ」と呼ばれ、本方法では、選
択した固相支持体に結合されている。標識化プローブも
また使用され、これには対象の配列が含まれても含まれ
なくてもよい。[0047] Reagents having a polynucleotide sequence of interest and containing a polynucleotide that hybridizes to a nucleic acid analyte are used. This reagent is sometimes referred to herein as a "capture probe" and in the present method is attached to a selected solid support. Labeled probes are also used, which may or may not include the sequence of interest.
【００４８】第１の好ましい実施態様では、本発明の方
法は、ハイブリダイゼーション溶媒中でのポリヌクレオ
チド二本鎖の形成を含み、選択可能な開裂部位を介し
て、標識が支持体と結合する。試料DNAが支持体に結合
している、または溶液中に分散している状況の種々のプ
ロトコールが、使用され得る。In a first preferred embodiment, the method of the invention involves the formation of a polynucleotide duplex in a hybridization solvent, wherein the label is attached to the support via a selectable cleavage site. A variety of protocols in which the sample DNA is bound to a support or dispersed in a solution can be used.
【００４９】関連する種々のヌクレオチド配列を区別す
るために、以下の用語を使用する： 核酸試料-対象のオリゴヌクレオチド配列を有する核酸
配列の含有が考えられる試料； 核酸被分析物-対象のオリゴヌクレオチド配列を有する
前記核酸前記試料中のDNAまたはRNA； 対象のオリゴヌクレオチド配列-一般には、少なくとも
６塩基、より一般には少なくとも約10塩基、好ましくは
少なくとも約16塩基、5 kbかそれ以上でもあり得るが、
通常は0.2 kb以上ではない、ヌクレオチド鎖の全部また
は一部のDNAあるいはRNA配列であり、遺伝上の特徴、病
原体、等の診断に役立つ遺伝子または配列の特徴であ
る、検出されるべき診断上の性質を示す； ポリヌクレオチド配列-対象のオリゴヌクレオチド配列
の検出用の試薬として用いられるDNAまたはRNA配列であ
って、このポリヌクレオチド配列は、標識されていても
されていなくてもよく、支持体に結合していてもしなく
てもよく、そして、対象のオリゴヌクレオチド配列に相
補的な配列を含んでも含まなくてもよい。単独で、また
は核酸被分析物と結合させると、標識と支持体との間の
選択可能な開裂部位とを有し、標識と支持体の間の架橋
として機能する、1つまたは2つのポリヌクレオチドの配
列も存在する；および 選択可能な開裂部位-過ヨウ素酸で、選択的に開裂し得
る単一あるいは複数の官能基。The following terms are used to distinguish the various nucleotide sequences involved: Nucleic acid sample—a sample suspected of containing a nucleic acid sequence having the oligonucleotide sequence of interest; nucleic acid analyte—oligonucleotide of interest Said nucleic acid having a sequence DNA or RNA in said sample; the oligonucleotide sequence of interest-generally at least 6 bases, more usually at least about 10 bases, preferably at least about 16 bases, which may be 5 kb or more. ,
A DNA or RNA sequence of all or part of a nucleotide chain, usually not more than 0.2 kb, which is a diagnostic feature to be detected that is a feature of a gene or sequence that is useful for diagnosing genetic features, pathogens, etc. Polynucleotide sequence-a DNA or RNA sequence used as a reagent for the detection of an oligonucleotide sequence of interest, which may or may not be labeled, It may or may not be bound, and may or may not contain a sequence complementary to the oligonucleotide sequence of interest. One or two polynucleotides, alone or when bound to a nucleic acid analyte, having a selectable cleavage site between the label and the support and functioning as a bridge between the label and the support And a selectable cleavage site-one or more functional groups that can be selectively cleaved at periodic acid.
【００５０】記載の便宜上、選択可能な開裂部位が創出
された本発明の好ましい実施態様は、4つの主要な副次
的実施態様に分割される。これらの第1番目(図２参照)
では、使用する試薬は、単一の構成要素で、試薬は、一
方の末端近傍で支持体と結合し、そして反対の末端近傍
で1つまたはそれ以上の検出し得る標識と結合するポリ
ヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、支持体
と標識の中間に開裂可能な部位を含む。For convenience of description, the preferred embodiment of the invention in which a selectable cleavage site has been created is divided into four main sub-embodiments. The first of these (see Figure 2)
In this, the reagent used is a single component, the reagent being a polynucleotide that binds to the support near one end and binds to one or more detectable labels near the opposite end. is there. The polynucleotide contains a cleavable site intermediate the support and the label.
【００５１】第2の場合(図３参照)では、使用する試薬
は、核酸試料が支持体に結合するか否かで、変更し得る
2つの構成要素を有する。核酸試料が支持体に結合する
場合、2つの構成要素は、(1)架橋用ポリヌクレオチド配
列、および(2)架橋用ポリヌクレオチド配列の一部と相
補的でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であ
る。この相補的ポリヌクレオチド配列は、標識されてい
る。この架橋用ポリヌクレオチド配列は、相補的配列と
二本鎖を形成する配列を有すると同時に、対象のオリゴ
ヌクレオチド配列と二本鎖を形成する領域を有する。In the second case (see FIG. 3), the reagent used can be varied depending on whether the nucleic acid sample binds to the support.
It has two components. When the nucleic acid sample is bound to a support, the two components are (1) a bridging polynucleotide sequence, and (2) a polynucleotide sequence that is complementary to and hybridizes with a portion of the bridging polynucleotide sequence. This complementary polynucleotide sequence is labeled. This cross-linking polynucleotide sequence has a sequence that forms a duplex with a complementary sequence, and also has a region that forms a duplex with the oligonucleotide sequence of interest.
【００５２】試料核酸が溶液中に存在する場合には、こ
の2つの構成要素は、(1)対象のオリゴヌクレオチド配列
を定義し得るかどうかには関係はないが、核酸被分析物
中に存在する配列と相補的な領域を有し、支持体と結合
させた第一のポリヌクレオチド；および、(2)対象オリ
ゴヌクレオチド配列を定義し得るかどうかに関しては、
第一のポリヌクレオチド配列と同じ定義を有し、核酸被
分析物中に存在する配列と相補的領域である、標識化第
二ポリヌクレオチド配列。少なくとも二本鎖化した領域
の少なくとも一つは、対象の配列を明らかに示してい
る。第一または第二ポリヌクレオチド配列のいずれか
は、選択可能な開裂部位を含む。When the sample nucleic acid is present in solution, the two components are (1) irrespective of whether the oligonucleotide sequence of interest can be defined, but not in the nucleic acid analyte. A first polynucleotide having a region complementary to the sequence to be bound to the support; and (2) as to whether the oligonucleotide sequence of interest can be defined:
A labeled second polynucleotide sequence having the same definition as the first polynucleotide sequence and being a region complementary to a sequence present in the nucleic acid analyte. At least one of the at least double stranded regions clearly indicates the sequence of interest. Either the first or second polynucleotide sequence contains a selectable cleavage site.
【００５３】第3の場合(図４参照)では、被分析物が支
持体に結合され、そして使用する試薬が、対象のオリゴ
ヌレオチド配列と相補的な領域を有し、選択可能な開裂
部位を含む、単独の構成要素である。In the third case (see FIG. 4), the analyte is bound to the support and the reagent used has a region complementary to the oligonucleotide sequence of interest and contains a selectable cleavage site. , Is a single component.
【００５４】第4の場合(図５参照)では、結合「Y」を介
して支持体に結合し、そして、その反対側の末端が核酸
被分析物中に存在する第一の配列と相補的である、ポリ
ヌクレオチド鎖の捕捉プローブが提供される。標識した
第二ポリヌクレオチド鎖を含む標識用プローブは、前記
第一の配列と異なり、かつに重複しない被分析物中の第
二配列に相補的な領域を有する。図５で「Y」と略記し
た結合は、プローブを支持体に結合し得る任意の一般的
手段を表わす。結合「X」は、過ヨウ酸開裂し得る結合
を表わす。In the fourth case (see FIG. 5), the support is attached via a linkage "Y" and the opposite end is complementary to the first sequence present in the nucleic acid analyte. A capture probe for a polynucleotide chain is provided. The labeling probe including the labeled second polynucleotide chain has a region different from the first sequence and complementary to the second sequence in the analyte that does not overlap with the first sequence. The bond abbreviated as "Y" in FIG. 5 represents any general means by which the probe can be bound to a support. The bond "X" represents a bond that can be cleaved with periodate.
【００５５】本発明の焦点である選択可能な開裂部位
は、構造式-R1-O-X-O-R2-を有する全ての過ヨウ素酸開
裂結合である。式中、R1およびR2は独立して、アルキレ
ン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニ
レン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリールア
ルキレン、およびこれらの組合せからなる群から選択さ
れ、これらの用語は上記で定義された通りである。ま
た、Xは、過ヨウ酸開裂し得る結合自身である。「X」で
表現し得る過ヨウ酸開裂し得る部分の例には、「R」が
水素あるいはアルキル(一般に低級アルキル)の：The selectable cleavage sites that are the focus of the present invention are all periodate cleavage bonds having the structural formula -R 1 -OXOR 2- . Wherein R 1 and R 2 are independently selected from the group consisting of alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, arylalkylene, and combinations thereof, as defined above. It was as done. X is the bond itself that can be cleaved with periodate. Examples of periodic acid cleavable moieties which may be represented by "X" include those wherein "R" is hydrogen or alkyl (generally lower alkyl):
【００５６】[0056]
【化８】 Embedded image
【００５７】が挙げられる。And the like.
【００５８】本方法を実施するためには、相補的配列間
で二本鎖形成が起こる条件で、核酸を含有する試料と、
適切な試薬とを混合する。この混合物を、対象のオリゴ
ヌクレオチド配列上で少なくともヘテロ二本鎖形成また
はホモ二本鎖形成が起こる様に考慮された予め定めたス
トリンジェンシーの条件下で、ハイブリダイズさせる。
ハイブリダイゼーションが起こるのに充分な時間後、支
持体を上清から分離し、そして、少なくとも非特異に結
合した標識が実質的に全てなくなる様に洗浄し得る。次
に支持体に結合したオリゴヌクレオチドを、過ヨウ素酸
で処理し、その結果、少なくとも1本鎖の開裂が起こ
り、そして支持体に結合した標識の放出が起こる。In order to carry out the present method, a sample containing a nucleic acid is prepared under the condition that double strand formation occurs between complementary sequences.
Mix with appropriate reagents. The mixture is hybridized under conditions of predetermined stringency that allow for at least heteroduplex formation or homoduplex formation on the oligonucleotide sequence of interest.
After sufficient time for hybridization to occur, the support can be separated from the supernatant and washed to remove at least substantially all non-specifically bound label. The support-bound oligonucleotide is then treated with periodate, resulting in at least one strand cleavage and release of the support-bound label.
【００５９】二本鎖形成を起こす特定の配列が試量中に
存在するか否かに依存して、支持体に結合した標識(単
数あるいは複数)の放出が観察される。通常は上清の溶
媒を標識の存在に関してアッセイし得る、種々のプロト
コールが使用し得るが、場合によっては支持体を測定し
ても良い。上清からの支持体の物理的分離が必要か否か
に関わらず、種々のプロトコールおよび試薬類が、使用
され得る。The release of the support-bound label (s) is observed, depending on whether the particular sequence that causes duplex formation is present in the assay. A variety of protocols can be used, usually the supernatant solvent can be assayed for the presence of the label, but in some cases the support may be measured. A variety of protocols and reagents may be used, whether or not physical separation of the support from the supernatant is required.
【００６０】本発明の方法は、広範な状況で、DNAまた
はRNAのいずれのオリゴヌクレオチド配列の検出にも使
用し得る。重要な対象領域の一つは、特定の宿主に感染
し得る病原体、ウイルス、バクテリア、真菌類、原生動
物類等の検出である。例えば、米国特許第4,358,535号
参照。別の対象領域は、対立遺伝子の検出、および、例
えば羊水穿刺液を用いる宿主のゲノム中に存在する変異
あるいは欠失の検出；遺伝子カウンセリング；宿主の過
敏性または感受性試験；および細胞集団のモニタリン
グ；である。第3の対象領域は、転写のモニタリング、R
NAウイルスの検出、未発現のRNAによる微生物の分類等
の様に非常に多様な理由に基づくRNAの存在の確認であ
る。例示を目的とするため包括的ではないが、他の対象
領域には、染色体外DNAまたは組込みDNAの存在；DNA配
列の増幅；このような配列の維持；に関する改変微生物
のモニタリングが含まれる。The method of the present invention may be used in a wide variety of contexts to detect either DNA or RNA oligonucleotide sequences. One important area of interest is the detection of pathogens, viruses, bacteria, fungi, protozoa, etc., that can infect a particular host. See, for example, U.S. Pat. No. 4,358,535. Another area of interest is the detection of alleles, and the detection of mutations or deletions present in the genome of the host using, for example, amniocentesis fluid; gene counseling; testing for hypersensitivity or sensitivity of the host; and monitoring of cell populations; It is. The third area of interest is transcription monitoring, R
Confirmation of the presence of RNA based on a wide variety of reasons, such as detection of NA virus, classification of microorganisms by unexpressed RNA, etc. Although not exhaustive for purposes of illustration, other regions of interest include monitoring of modified microorganisms for the presence of extrachromosomal or integrated DNA; amplification of DNA sequences; maintenance of such sequences.
【００６１】本発明の方法を使用し得る種々の目的から
明白な様に、生理学的試料は広範囲のソースから取得し
得る。ソースは、例えば便、痰、尿、唾液、その他の排
拙物；血漿、血液、血清、接眼レンズ液、脊髄液、リン
パ液、等の、種々の生理学的液体を含み得る。試料は改
変せずに使用し得る。あるいは、試料の増幅、クローニ
ング、等を行い、単離体とし、そのDNAまたはRNAを全体
的に増加し、外来のDNAまたはRNAは全体的に減少する様
に改変し得る。ウイルスを、適合する細胞のローン上に
プレーティングし、ウイルスDNAの量を増大し得る；臨
床的な単離体は、試料を栄養物を加えた寒天培地上に試
料をストリークまたはスポットし、個々のコロニーをア
ッセイすることで得られ得る；あるいは全試料を液体の
培地と細胞の混合物に入れ、選択的にまたは非選択的に
増殖し得る。試料を処理する特定の方法は、試料の性
質、DNAまたはRNAのソースの性質、存在する核酸の全量
に対する存在すると予想される目的のオリゴヌクレオチ
ド配列の量、および、採用したプロトコールおよびラベ
ルの感度に依存する。As will be apparent from the various purposes in which the method of the present invention may be used, physiological samples may be obtained from a wide variety of sources. Sources can include various physiological fluids, for example, stool, sputum, urine, saliva, and other waste products; plasma, blood, serum, ocular fluid, spinal fluid, lymph fluid, and the like. The sample can be used without modification. Alternatively, a sample may be amplified, cloned, or the like to obtain an isolate, which may be modified so that its DNA or RNA is increased as a whole and foreign DNA or RNA is decreased as a whole. The virus can be plated on a loan of compatible cells to increase the amount of viral DNA; clinical isolates can be obtained by streaking or spotting the sample on an agar medium supplemented with nutrients. Alternatively, the whole sample can be placed in a liquid medium and cell mixture and grown selectively or non-selectively. The particular method of processing the sample depends on the nature of the sample, the nature of the source of DNA or RNA, the amount of the oligonucleotide sequence of interest expected to be present relative to the total amount of nucleic acid present, and the sensitivity of the protocols and labels employed. Dependent.
【００６２】試料の核酸または試薬のポリヌクレオチド
の一方は、共有結合または非共有結合の何れかで、拡散
しない様に、支持体に結合し得る(図５で表される実施
態様の場合には、捕捉プローブ単独が固相の支持体に結
合している)。試料の核酸を支持体に結合する場合に
は、種々の支持体が、特別の使用法を有し、その応用範
囲も知られているので、その様な支持体が好ましい。こ
れらの支持体には、非特異結合が低いかあるいは無い、
核酸試料を保持する、取り扱いが容易である、および、
増殖あるいは微生物、洗浄、加熱、転写、標識検出の様
な種々の処理が行える様な望ましい特性を与え、ニトロ
セルロースフィルター、ジアゾ化紙、エクテオラ(ecteo
la)紙、または他の支持体を含が含まれる。One of the nucleic acid of the sample or the polynucleotide of the reagent can be bound to the support, either covalently or non-covalently, so as not to diffuse (in the case of the embodiment represented in FIG. 5). , The capture probe alone is bound to a solid support). When the nucleic acid of the sample is bound to a support, such a support is preferable because various supports have special uses and their application ranges are known. These supports have low or no non-specific binding,
Holds nucleic acid samples, is easy to handle, and
Providing desirable properties to allow for various processes such as growth or microbial, washing, heating, transfer, label detection, nitrocellulose filters, diazotized paper, ecteolas (ecteolas)
la) including paper, or other supports.
【００６３】ポリヌクレオチド試薬の一成分が支持体に
結合という条件で、試料オリゴヌクレオチドと相互作用
するタイプの支持体の範囲内で、支持体のタイプは大き
く変動させ得る。支持体は、粒子、紙、プラスチックシ
ート、コンテナーホルダー壁、分割器具(separator)、
ミリポアフィルター等を含み得る。一方、支持体の材料
は、多糖類、ポリスチレン、ポリアクリル酸およびその
誘導体、例えばポリアクリルアミド、ガラス、セラミッ
ク、金属、炭素、ポリ塩化ビニル、タンパク質、等の様
な、天然または合成の有機ポリマーを含み得る。共有結
合または非共有結合のどちらが望まれるかに依存して、
種々の材料を官能基化、または脱官能基化し得る。The type of support can vary widely within the range of supports that interact with the sample oligonucleotide, provided that one component of the polynucleotide reagent is bound to the support. The support consists of particles, paper, plastic sheet, container holder wall, separator,
It may include a Millipore filter or the like. On the other hand, the material of the support is a natural or synthetic organic polymer such as polysaccharide, polystyrene, polyacrylic acid and derivatives thereof, for example, polyacrylamide, glass, ceramic, metal, carbon, polyvinyl chloride, protein, and the like. May be included. Depending on whether a covalent or non-covalent bond is desired,
Various materials can be functionalized or defunctionalized.
【００６４】核酸試料を支持体に結合する場合、特定の
支持体によっては、核酸の満足な結合に加熱で十分であ
り得る。他の状況では、核酸に結合させるためにジアゾ
基を採用し得る。しかし、ポリヌクレオチド試薬の成分
を支持体に結合する場合、ポリヌクレオチド試薬の支持
体への結合維持を保証するために、広範な異なった技術
を使用し得る。例えば、アルキルアミン類、ヒドラジド
類、またはチオセミカルバジド類を支持体へ結合させて
得られる、結合のための活性アミノ基を持たせる様に、
支持体を官能基化し得る。その後、ターミナルトランス
フェラーゼを用いて、リボヌクレオチドをDNAポリヌク
レオチド試薬に付加し得る。例えば過ヨウ素酸塩、四酸
化オスミウム＋過酸化水素、四酢酸鉛等の適切な酸化剤
でグリコール開裂し、ジアルデヒドを形成し、次いでこ
れを支持体表面のアミノ基に結合し、一置換または二置
換のアミノ基を生成する。あるいは、チオ燐酸と共にア
ルキルチオエステルを形成するマレイミド基も提供し得
る。前出のParikhら、および前出のInmanに記述された
アガロースおよびポリアクリルアミドについての種々の
技術を採用し得、それらの技術は他の物質に対して応用
し得る。When binding a nucleic acid sample to a support, depending on the particular support, heating may be sufficient for satisfactory binding of the nucleic acid. In other situations, diazo groups may be employed for attachment to nucleic acids. However, when attaching the components of the polynucleotide reagent to the support, a wide variety of different techniques may be used to ensure that the polynucleotide reagent remains attached to the support. For example, to have an active amino group for binding, obtained by binding an alkylamine, hydrazide, or thiosemicarbazide to a support,
The support may be functionalized. Thereafter, ribonucleotides can be added to the DNA polynucleotide reagent using terminal transferase. Glycol cleavage with a suitable oxidizing agent such as, for example, periodate, osmium tetroxide + hydrogen peroxide, lead tetraacetate to form a dialdehyde, which is then attached to an amino group on the support surface, is monosubstituted or Generates disubstituted amino groups. Alternatively, a maleimide group that forms an alkylthioester with the thiophosphoric acid may be provided. The various techniques for agarose and polyacrylamide described in Parikh et al., Supra, and Inman, supra, can be employed, and those techniques can be applied to other materials.
【００６５】多くの場合、経験に基づいて決定されるた
め、アッセイ溶媒中で使用し得る支持体上のポリヌクレ
オチド試薬の成分の総数は、変化する。ポリヌクレオチ
ドがハイブリダイゼーションを妨害する密度にならない
限り、支持体上の使用し得る官能基に対して、ポリヌク
レオチドの単位表面積あたりの密度は比較的高くして使
用すべきである。As often determined empirically, the total number of components of a polynucleotide reagent on a support that can be used in an assay solvent will vary. Unless the polynucleotide has a density that interferes with hybridization, the density of the polynucleotide per unit surface area should be relatively high for the available functional groups on the support.
【００６６】ポリヌクレオチドのサイズは大きく変化し
得るが、通常約15塩基以下ではなく、50塩基またはそれ
以上であり得、通常は約500塩基を越えず、より一般に
は250塩基を越えない。ポリヌクレオチド試薬の成分中
には通常少なくとも6塩基、通常は少なくとも12塩基
の、通常は対象配列である、核酸試料中の配列に相同の
部位を有する。ハイブリダイゼーションのための部位
は、16塩基またはそれ以上であり得、通常約1 kbpを越
えない。完全な相同性が要求されない場合、少なくとも
約50%、さらに好ましくは少なくとも80%の相同性があれ
ば十分である(相同性百分率は、ループアウトし得る非
相補的挿入部分、5塩基長を越える挿入部分を無視し
た、相補性を意味する)。The size of the polynucleotide can vary greatly, but usually is not less than about 15 bases, but can be 50 or more bases, usually does not exceed about 500 bases, and more usually does not exceed 250 bases. The components of the polynucleotide reagent usually have at least 6 bases, usually at least 12 bases, and are usually homologous to the sequence in the nucleic acid sample, which is the target sequence. Sites for hybridization can be 16 bases or more and usually do not exceed about 1 kbp. If complete homology is not required, at least about 50%, and more preferably at least 80%, homology is sufficient (percent homology is a non-complementary insert that can loop out, exceeding 5 bases in length). Ignoring insertions, meaning complementarity).
【００６７】特に、対立遺伝子群、多数の異なる株、ま
たは、関連し合った種を対象とする場合、メッセンジャ
ーRNAあるいはゲノムタンパク質は高度に保存されてい
るにもかかわらず、多型が起こっているので、任意の特
定の配列に対する、この相違を反映し、かつ全ての対象
配列への、相同性を最適化したプローブを調製すること
が望まれる場合がしばしばある。In particular, when targeting alleles, many different strains, or related species, polymorphisms occur despite messenger RNA or genomic proteins being highly conserved. As such, it is often desirable to prepare probes that reflect this difference for any particular sequence and that have homology optimized for all sequences of interest.
【００６８】標識したポリヌクレオチド試薬の成分の標
識は、選択的開裂部位または他の結合を介して、ポリヌ
クレオチド配列に結合し得る標識はアッセイを通して保
持される。多くの種類の標識が使用可能である。標識
は、検出可能な信号または検出可能な信号を得る手段を
提供し得る。Labeling of the components of the labeled polynucleotide reagent, via a selective cleavage site or other linkage, the label that can bind to the polynucleotide sequence is retained throughout the assay. Many types of signs are available. The label may provide a detectable signal or a means for obtaining a detectable signal.
【００６９】それゆえ標識は、直接または間接の何れか
で検出可能な信号を提供し得る、リガンド、ラジオアイ
ソトープ、酵素、蛍光物質、化学発光物質、酵素自己不
活性化抑制因子、酵素の補因子、酵素基質、またはその
他の置換基の様な多様な置換基を含んでいる。The label may therefore provide a signal that can be detected either directly or indirectly, such as a ligand, radioisotope, enzyme, fluorescent substance, chemiluminescent substance, enzyme self-inactivation inhibitor, enzyme cofactor. , Enzyme substrates, or other substituents.
【００７０】リガンドが関与する場合、例えば、ビオチ
ンとアビジン、2,4'-ジニトロベンゼンと抗(2,4'-ジニ
トロベンゼン)IgG等の様な、そのリガンドに特異的に結
合するレセプターが一般に使用される。この場合、上述
の様に適切な標識で置換する。このようにして、検出可
能な信号を与えるための、ポリヌクレオチド配列一個当
りの標識の数を検討し得る。When a ligand is involved, receptors that specifically bind to the ligand, such as, for example, biotin and avidin, 2,4′-dinitrobenzene and anti (2,4′-dinitrobenzene) IgG, are generally used. used. In this case, replacement with an appropriate label is performed as described above. In this way, one can consider the number of labels per polynucleotide sequence to provide a detectable signal.
【００７１】種々のイムノアッセイで使用する標識は殆
ど、本発明のアッセイでも利用し得る。これらの標識
は、米国特許第3,850,752号(酵素)；第3,853,914号(ス
ピンラベル)；第4,160,016号(蛍光物質)；第4,174,384
号(蛍光物質および消光物質)；第4,160,645号(触媒)；
第4,277,437号(化学発光物質)；第4,318,707号(消光粒
子)；および第4,318,890号(酵素基質)に説明されてい
る。Most of the labels used in various immunoassays can be utilized in the assays of the present invention. These labels are described in U.S. Pat. Nos. 3,850,752 (enzymes); 3,853,914 (spin labels); 4,160,016 (fluorescent substances); and 4,174,384.
No. (fluorescent and quenching materials); No. 4,160,645 (catalyst);
Nos. 4,277,437 (chemiluminescent substances); 4,318,707 (quenching particles); and 4,318,890 (enzyme substrates).
【００７２】代表的な蛍光性および化学発光性の標識に
は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリ
フェロン、ビリタンパク、ルミノールその他が含まれ
る。Representative fluorescent and chemiluminescent labels include fluorescein, rhodamine, dansyl, umbelliferone, biliprotein, luminol, and the like.
【００７３】代表的な対象とする酵素の例には、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、グルコースー6-燐酸デヒドロゲ
ナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、β-ガラクトシ
ダーゼ、α-アミラーゼ、ウリカーゼ、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ、その他が含まれる。Representative examples of enzymes of interest include horseradish peroxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, acetylcholinesterase, β-galactosidase, α-amylase, uricase, malate dehydrogenase, and the like.
【００７４】標識をポリヌクレオチド配列に結合する方
法は、標識の性質に依存して大きく変化する。すでに示
したように、リボヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配
列に加え、開裂し、得られたジアルデヒドをアミノ基ま
たはヒドラジン基と結合し得る。アルキルアミンの生成
をもたらす還元条件を用いることで、結合の永続性をさ
らに高め得る。あるいは、標識とα−ブロモまたはα−
クロロアセチルの様な、活性ハロゲンで置換し得る。こ
の活性ハロゲンは、チオ燐酸基またはチオエステルと結
合させることができ、チオエステルが形成される。ある
いは、標識はマレイミド官能基を持ち得、この場合、ポ
リヌクレオチド上に存在するメルカプト基がチオエステ
ルを形成する。ポリペプチドの末端の燐酸は、カルボジ
イミドで活性化し得、得られるホスホルイミダゾリドは
アミノ基あるいはアルコールと反応し、ホスホルアミデ
ートまたは燐酸エステルを与える。アミノ修飾したプリ
ンにポリペプチドを形成し得る。従って、標識の選択、
結合の様式、および、結合基の選択には広範な自由度が
ある。The manner in which a label is attached to a polynucleotide sequence can vary widely depending on the nature of the label. As already indicated, ribonucleotides can be added to the oligonucleotide sequence, cleaved, and the resulting dialdehyde linked to an amino or hydrazine group. By using reducing conditions that result in the formation of an alkylamine, the permanence of the bond can be further increased. Alternatively, the label and α-bromo or α-bromo
It can be replaced by an active halogen, such as chloroacetyl. The active halogen can be linked to a thiophosphate group or a thioester, forming a thioester. Alternatively, the label may have a maleimide function, in which case the mercapto group present on the polynucleotide will form a thioester. Phosphoric acid at the terminus of the polypeptide can be activated with carbodiimide, and the resulting phosphorimidazolide reacts with amino groups or alcohols to give phosphoramidates or phosphate esters. Polypeptides can be formed on amino-modified purines. Therefore, the choice of sign,
There is a wide range of freedom in the mode of attachment and the choice of attachment groups.
【００７５】このポリヌクレオチド試薬を試料と結合す
ることで、存在する全ての核酸被分析分が支持体に結合
する。選択可能な開裂部位の開裂で、支持体から放出さ
れる標識の量を被分析物の存在量と関連付け、被分析物
の量もまた定量的に測定し得る。By binding the polynucleotide reagent to the sample, all the nucleic acid analytes present are bound to the support. Upon cleavage of the selectable cleavage site, the amount of label released from the support is related to the abundance of the analyte, and the amount of the analyte can also be measured quantitatively.
【００７６】標識と支持体の空間的関係の改変は、数多
くの方法で達成し得る。既に示したように、プローブと
同じポリヌクレオチドとには、少なくとも一つの共通の
認識部位が存在し得るので、支持体からプローブを放出
し得る。The modification of the spatial relationship between the label and the support can be achieved in a number of ways. As already indicated, the probe may be released from the support since at least one common recognition site may be present on the same polynucleotide as the probe.
【００７７】リガンドが検出可能な信号を直接に与えな
いが、一つ又はそれ以上の標識と結合している受容体と
結合する場合、リガンドで置換したヌクレオチドを使用
し得る。代表的な例には、アビジンと結合するビオチン
化されたヌクレオチオド、免疫グロブリンと結合するハ
プテン、および、レクチンと糖類、細胞表面膜蛋白とホ
ルモンおよび増殖因子、等の様なタンパク質様のレセプ
ターに結合する種々の天然化合物が含まれる。If the ligand does not directly provide a detectable signal, but binds to a receptor that is bound to one or more labels, nucleotides substituted with the ligand may be used. Representative examples include biotinylated nucleotides that bind avidin, haptens that bind immunoglobulins, and protein-like receptors such as lectins and saccharides, cell surface membrane proteins and hormones and growth factors, etc. Various natural compounds that bind are included.
【００７８】図５で表される実施態様では、選択可能な
開裂部位は、二つの方法の内一つで導入し得る。In the embodiment depicted in FIG. 5, a selectable cleavage site can be introduced in one of two ways.
【００７９】先ず、架橋用化合物を、捕捉プローブ1自
体に、即ち図中に示したように位置「X」で組み込み得
る。この目的には、任意の数の架橋用試薬が使用し得、
唯一の制限は、捕捉プローブに導入する開裂部位は、過
ヨウ素酸で開裂できなければならない点である。過ヨウ
素酸開裂可能な結合を導入するための適切な架橋用試薬
の例は、硫黄−硫黄架橋を有するビス(カルボン酸)(Pie
rce Chemicalsから入手可能)、およびジスクシンイミジ
ル酒石酸(DST)である。First, the cross-linking compound can be incorporated into the capture probe 1 itself, ie, at position "X" as shown in the figure. Any number of crosslinking reagents can be used for this purpose,
The only limitation is that the cleavage site introduced into the capture probe must be able to be cleaved with periodate. Examples of suitable cross-linking reagents for introducing a periodate cleavable bond include bis (carboxylic acids) having a sulfur-sulfur bridge (Pie
available from rce Chemicals), and disuccinimidyl tartaric acid (DST).
【００８０】固相の支持体に付着させる前に、捕捉プロ
ーブを適切に改変することでも、選択可能な開裂部位を
導入し得る。この方法は、次の構造式を有するポリヌク
レオチドの調製を含む。Appropriate modification of the capture probe prior to attachment to the solid support may also introduce a selectable cleavage site. The method involves the preparation of a polynucleotide having the structural formula:
【００８１】[0081]
【化９】 Embedded image
【００８２】ただし式中の、Xは上述の様に過ヨウ素酸
開裂可能な部位である、あるいは含む、DNA1はDNAの第1
鎖、DNA2はDNAの第2鎖、そしてR1およびR2は以前に定義
した通りである。特に好適な実施態様では、-R1-O-X-O-
R2-は[0082] However in the formula, X is periodate cleavable site as described above, alternatively, DNA 1 is a first DNA
Chain, DNA 2 is a second strand of DNA and R 1 and R 2, are as previously defined. In a particularly preferred embodiment, -R 1 -OXO-
R 2 -is
【００８３】[0083]
【化１０】 Embedded image
【００８４】である。Is as follows.
【００８５】次にこの化合物を、本技術分野で周知の一
般的な方法を使用して固相の支持体に付着させ、図５に
示した捕捉プローブをとし得る。この様な化合物は、上
の構造式の1,2-ジオール系がDNA合成中にジベンゾイル
混合物として保護され、さらに次の構造式の置換基Y
1に、(ジメトキシトリチル、または「DMT」の様な)酸に
感受性で、塩基に安定な保護基、そして置換基Y2に、水
素あるいは、ホスホルアミダイト、燐酸トリエステル、
燐酸ジエステル、ホスファイト、H-ホスホネートまたは
ホスホチオエートの様なリンの誘導体を含む次式の試
薬：This compound can then be attached to a solid support using general methods well known in the art, resulting in the capture probe shown in FIG. Such compounds have the 1,2-diol system of the above structural formula protected as a dibenzoyl mixture during DNA synthesis, and the substituent Y of the following structural formula
1, sensitive to (dimethoxytrityl or such a "DMT") acid, base stable protecting group and the substituents Y 2, hydrogen or a phosphoramidite, phosphate triesters,
Reagents of the formula comprising derivatives of phosphorus such as phosphoric diesters, phosphites, H-phosphonates or phosphothioates:
【００８６】[0086]
【化１１】 Embedded image
【００８７】を使用し、標準のホスホルアミダイト反応
のプロトコールを用いて、DNA断片中に組み込み、調製
し得る。代表的な化合物は、「DMT」が、ジメトキシト
リチルであり「iPr」はイソプロピルである、Can be incorporated and prepared in DNA fragments using standard phosphoramidite reaction protocols. A representative compound is where "DMT" is dimethoxytrityl and "iPr" is isopropyl.
【００８８】[0088]
【化１２】 Embedded image
【００８９】で表され得る。Can be represented by
【００９０】図２から図５に示した実施態様と同様に、
図５の実施態様は、溶液中で特異的に結合した標識の検
出を(そして、当然被分析物2の正確な測定を)を可能に
し、一方、非特異的に結合した標識6は固相の支持体5に
結合したままである。As in the embodiment shown in FIGS. 2 to 5,
The embodiment of FIG. 5 allows the detection of a specifically bound label in solution (and, of course, accurate measurement of analyte 2), while the non-specifically bound label 6 Remains attached to the support 5.
【００９１】広範な種類の支持体、および、オリゴヌク
レオチド鎖の非拡散的結合の技術が、文献中に報告され
ている。総説は、MeinkothとWhal、Anal. Biochem. (19
84)138:267-284を参照。支持体には、温度80℃で2時間
で十分なニトロセルロースフィルター、さらなる活性化
なしに結合が起こるジアゾ化紙、エクテオラ紙、その他
が含まれる。アガロースビーズは、DNAと直接反応させ
るために、臭化シアンで活性化し得る(Baumanら、J. Hi
stochem. Cytochem. (1981)29: 227-237)；あるいは、
臭化シアンおよびジアミンと反応させ、次ぎに例えば、
ブロモアセチルの様な −ハロアセチルと反応させる、
あるいは、例えば無水マレイン酸のカルボキシル置換活
性オレフィンと反応させ、ポリヌクレオチド鎖上に存在
するチオール官能基と反応し得るビーズを得る。例え
ば、DNAを改変してカップリング用の、 -チオ燐酸を形
成し得る。(PfeufferとHilmreich、J. Biol. Chem. (19
75)250:867-876)。化学的手段により、オリゴヌクレオ
チドを合成しテフロン支持体に結合し、そして次ぎに、
オリゴヌクレオチドを取り除くことなくこの材料を完全
に脱ブロック化することも可能である。(LohrmannらDNA
(1984)3:122)。A wide variety of supports and techniques for non-diffusive attachment of oligonucleotide chains have been reported in the literature. For a review, see Meinkoth and Whal, Anal. Biochem. (19
84) 138 : 267-284. Supports include nitrocellulose filters that are sufficient for 2 hours at a temperature of 80 ° C., diazotized paper, ecteora paper, etc., where binding occurs without further activation. Agarose beads can be activated with cyanogen bromide to react directly with DNA (Bauman et al., J. Hi.
stochem. Cytochem. (1981) 29 : 227-237);
Reacting with cyanogen bromide and diamine, then for example:
Like bromoacetyl Reacting with haloacetyl,
Alternatively, the beads can be reacted with, for example, a carboxyl-substituted activated olefin of maleic anhydride to react with thiol functional groups present on the polynucleotide chain. For example, for coupling by modifying DNA, -It can form thiophosphoric acid. (Pfeuffer and Hilmreich, J. Biol. Chem. (19
75) 250 : 867-876). By chemical means, oligonucleotides are synthesized and attached to a Teflon support, and then
It is also possible to completely deblock this material without removing the oligonucleotide. (Lohrmann et al. DNA
(1984) 3 : 122).
【００９２】標識と試薬が広範な多様性を有するという
観点から、本方法の全般に共通する側面を記載し、その
後いくつかの代表的プロトコルを記載する。本法全般に
共通しているのはハイブリダイゼーションである。ハイ
ブリダイゼーションは、二本鎖形成に要求される相同性
が大きいか小さいかによって、変化する度合のストリン
ジェンシーの程度で実施され得る。殆どの場合で、水性
溶媒が使用され、種々の他の成分の混合物を含み得る。
特に、有機極性溶媒は、ストリンジェンシーの増大のた
めに使用し得る。代表的な溶媒の例には、ジメチルホル
ムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキツ
ドが含まれる。即ち、使用する濃度で水混和する有機溶
媒である。高いイオン強度を得るために加える塩濃度を
高めても、ストリンジェンシーを増大し得る。さらに、
温度上昇もストリンジェンシーに用い得る。各場合共
に、逆にするとストリンジェンシーは低下する。界面活
性材の様な、他の添加物もまた、ストリンジェンシーの
改変に使用し得る。In view of the wide variety of labels and reagents, aspects common to the present method are described, followed by some representative protocols. Hybridization is common to the entire method. Hybridization can be performed with varying degrees of stringency, depending on whether the homology required for duplex formation is large or small. In most cases, an aqueous solvent will be used and may contain a mixture of various other components.
In particular, organic polar solvents can be used for increased stringency. Examples of typical solvents include dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide. That is, it is an organic solvent that is miscible with water at the concentration used. Increasing the salt concentration added to obtain high ionic strength can also increase stringency. further,
Temperature rise can also be used for stringency. In each case, conversely, stringency decreases. Other additives, such as surfactants, may also be used to alter stringency.
【００９３】ハイブリダイゼーションための時間の長さ
は、対象配列の濃度、ストリンジェンシー、相補的配列
の長さ、等により変化する。一般に、ハイブリダイゼー
ションは、少なくとも約15分を要し、そして一般的に
は、約72時間を越えず、より一般には約24時間を越えな
い。さらに、あるストリンジェンシーでハイブリダイゼ
ーションを行い、そして次に、より高いストリンジェン
シーで洗浄し、十分な相同性を欠くヘテロ対合を除去し
得る。The length of time for hybridization varies depending on the concentration of the target sequence, stringency, the length of the complementary sequence, and the like. Generally, hybridization will take at least about 15 minutes, and generally will not exceed about 72 hours, and more usually will not exceed about 24 hours. In addition, hybridization can be performed at a certain stringency, and then washed at a higher stringency to remove heteropairs that lack sufficient homology.
【００９４】核酸試料は、種々の方法で処理し得る。例
えば、完全なゲノム、機械的に切断したまたは制限酵素
で消化した、約0.5 kbから30 kbまで変化するゲノムの
断片、あるいは、例えば電気泳動で大きさに従って分画
された断片を使用し得る。ある場合に、対象配列は、例
えば、例えばM13、の様な一本鎖のDNAまたはRNAウィル
スである適切なベクター中でクローニングされたクロー
ン配列である。[0094] The nucleic acid sample can be processed in various ways. For example, whole genomes, fragments of genomes that have been mechanically cut or digested with restriction enzymes, varying from about 0.5 kb to 30 kb, or fragments that have been fractionated according to size, for example, by electrophoresis, may be used. In some cases, the subject sequence is a cloned sequence cloned in a suitable vector, for example, a single-stranded DNA or RNA virus such as, for example, M13.
【００９５】アッセイ溶媒中には、緩衝剤、例えばSDS
である界面活性剤、フィコール、ポリビニルピロリド
ン、および、非特異的結合を最小化し得る外来のDNA、
を含め得る。これらの添加物の全ては、参考文献中に説
明があるため、詳細な記述を要さない。In the assay solvent, a buffer such as SDS
Surfactant, ficoll, polyvinylpyrrolidone, and foreign DNA that can minimize non-specific binding,
May be included. All of these additives are described in the references and need not be described in detail.
【００９６】特定のプロトコルに従い、試料核酸をポリ
ヌクレオチド試薬(単数あるいは複数)と共に、予め定め
られたストリンジェンシーのハイブリダイゼーション溶
媒中に入れる。ハイブリダイゼーションに十分な時間の
経過後、支持体を、ハイブリダイゼーション溶媒よりも
高いかまたは低いストリンジェンシーの溶媒で、少なく
とも一回洗浄する。次に、結合したポリヌクレオチドと
被分析物を含む支持体を、一本鎖または二本鎖開裂を考
慮した選択可能な開裂部位の開裂に必要な反応物(例え
ば光の様な物理的処理を含む)と接触させる。多くの場
合、制限エンドヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、
ピロホスファターゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、そ
の他の様な加水分解酵素が使用されるが、還元剤、エル
マン試薬の様な他の試薬、または光も用い得る。開裂の
後、支持体と上清とは、標識および測定の様式、そし
て、支持体から放出され測定された標識の量に依存し
て、分離しても分離しなくてもよい。According to a particular protocol, the sample nucleic acid is placed in a hybridization solvent of predetermined stringency with the polynucleotide reagent (s). After a period of time sufficient for hybridization, the support is washed at least once with a solvent of higher or lower stringency than the hybridization solvent. Next, the support containing the bound polynucleotide and the analyte is reacted with a reactant (e.g., a physical treatment such as light) necessary for cleavage of a selectable cleavage site in consideration of single-stranded or double-stranded cleavage. Contact). Often, restriction endonucleases, phosphodiesterases,
Hydrolytic enzymes such as pyrophosphatase, peptidase, esterase, and others are used, but reducing agents, other reagents such as Ellman's reagent, or light may also be used. After cleavage, the support and the supernatant may or may not be separated, depending on the mode of labeling and measurement, and the amount of label released from the support and measured.
【００９７】本発明をさらに説明するため、幾つかの代
表的プロトコルを記載する。第1の代表的プロトコール
中では、蛍光標識されたポリヌクレオチドが各ウェルの
底に結合しているマイクロタイタープレートを使用す
る。クローン化された病原体のDNAを、一つまたはそれ
以上の制限酵素で制限酵素消化し、約0.5 2 kbの断片を
得る。この断片を穏和な塩基性条件下で単離し、変性
し、そしてハイブリダイゼーション溶媒中に分散し、次
に、各ウェルが特定の病原体種の異なる株の配列に特異
的に相同な異なる配列を有する複数のウェルに順次添加
する。To further illustrate the present invention, some representative protocols are described. In a first exemplary protocol, a microtiter plate is used in which a fluorescently labeled polynucleotide is bound to the bottom of each well. The DNA of the cloned pathogen is digested with one or more restriction enzymes to obtain a fragment of about 0.52 kb. This fragment is isolated under mild basic conditions, denatured, and dispersed in a hybridization solvent, and then each well has a different sequence that is specifically homologous to the sequence of a different strain of a particular pathogen species Add sequentially to multiple wells.
【００９８】ハイブリダイゼーションが起こるのに十分
な時間の間、これらのウェルを例えば60℃の高温度に維
持し、その後に、この上清を取り除き、そして、ウェル
をハイブリダイゼーション溶媒より低いストリンジェン
シーの緩衝溶媒で繰り返し完全に洗浄する。二本鎖形成
は、全ての株に共通する制限酵素の認識部位を与える。
次に、各ウェルに二本鎖DNAを消化するための制限酵素
溶媒を添加し、二重鎖DNAを消化し、蛍光性の標識の上
清中への放出が起こる。各ウェルからこの上清を吸引分
取し、励起光照射をする。次に対照配列の存在の指標と
して蛍光の量を測定する。この様にして、液相中の蛍光
の存在を観察することで、どの株が存在するかを迅速に
スクリーニングし得る。The wells are maintained at an elevated temperature, eg, 60 ° C., for a time sufficient for hybridization to occur, after which the supernatant is removed and the wells are subjected to a lower stringency than the hybridization solvent. Repeat washing thoroughly with buffered solvent. Duplex formation provides a restriction enzyme recognition site common to all strains.
Next, a restriction enzyme solvent for digesting the double-stranded DNA is added to each well to digest the double-stranded DNA, and release of the fluorescent label into the supernatant occurs. The supernatant is aspirated from each well and irradiated with excitation light. Next, the amount of fluorescence is measured as an indicator of the presence of the control sequence. In this way, by observing the presence of fluorescence in the liquid phase, one can quickly screen which strain is present.
【００９９】第2の代表的なプロトコールでは、未標識
のポリヌクレオチドを結合したガラスビーズを含むカラ
ムを使用する。次にこのカラムに、哺乳類細胞から得た
DNA断片を含む試料核酸を添加する。この断片は、約0.5
から10 kbの範囲である。この試料DNAを、適切なハイブ
リダイゼーション溶媒に分散し、そしてカラムに添加
し、そしてハイブリダイゼーションが起こるのに十分な
時間の間カラム中に保持する。試料のハイブリダイゼー
ションの後、ハイブリダイゼーション溶媒をカラムから
放出し、そして、第1の溶媒よりも厳密な条件下の第2の
ハイブリダイゼーション溶媒中のジスルフィド結合を介
して西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を標識したポリ
ヌクレオチド試薬を加え、そして、第2の溶媒をハイブ
リダイゼーションが起こるのに十分な時間でカラムから
放出する。標識したポリヌクレオチドは、対象配列に相
補的な配列を有する。ハイブリダイゼーション溶媒を、
カラムから排出する。A second exemplary protocol uses a column containing glass beads to which an unlabeled polynucleotide has been attached. The column was then loaded with mammalian cells
A sample nucleic acid containing a DNA fragment is added. This fragment is about 0.5
To 10 kb. The sample DNA is dispersed in a suitable hybridization solvent and added to the column and held in the column for a time sufficient for hybridization to occur. After hybridization of the sample, the hybridization solvent is released from the column and labeled horseradish peroxidase (HRP) via a disulfide bond in a second hybridization solvent under more stringent conditions than the first solvent. The added polynucleotide reagent is added, and the second solvent is released from the column for a time sufficient for hybridization to occur. The labeled polynucleotide has a sequence that is complementary to the sequence of interest. Hybridization solvent,
Discharge from column.
【０１００】次に、カラムを、より高いストリンジェン
シーを有する溶媒で1またはそれ以上の回数洗浄し、標
識したポリヌクレオチドに対して不充分な相同性を有す
る全てのポリヌクレオチド配列を除去する。次に、エル
マン試薬をカラムに加え、ジスルフィド結合の解裂を起
こし、そしてHRPを放出させる。HRPを含む溶媒をカラム
から排出し、回収し、そして、引き続く、遊離した酵素
がカラム中に残らない様保証する洗浄の洗浄液をも、補
集した。HRP標識を含む得られた溶媒を次に、HRP標識に
関してアッセイし得る。HRPの代わりに、分光学的にま
たは蛍光的に検出し得る生成物を生成する多くの種類の
他の酵素を、使用し得る。The column is then washed one or more times with a higher stringency solvent to remove any polynucleotide sequences having insufficient homology to the labeled polynucleotide. Next, Ellman's reagent is added to the column, causing cleavage of disulfide bonds and release of HRP. The solvent containing the HRP was drained from the column, recovered, and the wash liquor for subsequent washings to ensure that no free enzyme remained in the column was collected. The resulting solvent containing the HRP label can then be assayed for HRP label. Instead of HRP, many types of other enzymes can be used that produce products that can be detected spectroscopically or fluorescently.
【０１０１】第3のプロトコールでは、試料をフィルタ
ーに吸収させ、そして80℃で2時間加熱することで、核
酸試料を、ニトロセルロースフィルターの一端に非拡散
的に結合する。このフィルターを洗浄し、そしてその
後、ハイブリダイゼーション条件下で、エステル結合を
介して、アルキルカルボキシ置換アデニンに結合させた
ウンベリフェロンで標識したポリヌクレオチドのハイブ
リダイゼーション溶液に加える。この標識したポリヌク
レオチドは、対象配列に相補的な配列を有する。ハイブ
リダイゼーションに充分な時間の後、このフィルターを
ハイブリダイゼーション溶媒から取り出し、洗浄し、非
特異的に結合たヌクレオチドを除去し、そして次に、既
知濃度のエステラーゼ溶液中に浸す。蛍光の増加の率
を、核酸試料中の被分析物の量の指標としてモニターす
る。In the third protocol, the nucleic acid sample is non-diffusively bound to one end of the nitrocellulose filter by absorbing the sample onto the filter and heating at 80 ° C. for 2 hours. The filter is washed and then added under hybridization conditions to a hybridization solution of the polynucleotide labeled with umbelliferone conjugated to the alkylcarboxy-substituted adenine via an ester linkage. The labeled polynucleotide has a sequence that is complementary to the sequence of interest. After a sufficient time for hybridization, the filter is removed from the hybridization solvent, washed to remove non-specifically bound nucleotides, and then immersed in a known concentration of an esterase solution. The rate of increase in fluorescence is monitored as an indicator of the amount of analyte in the nucleic acid sample.
【０１０２】他のプロトコールでは、ポリフルオレセイ
ン化した末端を有する被分析物配列に相補的に配列され
た標識したポリヌクレオチドを有するストリップを保持
する、ホルダーを有するプラスチックの材質のディップ
スティックを使用し得る。核酸試料を適切なハイブリダ
イゼーション媒質中で調製し、そして、ディップスティ
ックを入れ、そしてハイブリダイゼーションを進行させ
る。ハイブリダイゼーションが起こるのに十分な時間の
後、このディップスティックを取り出し、そして洗浄
し、非特異的に結合した全てのポリヌクレオチドを取り
除く。対象ポリヌクレオチド配列の存在は、制限酵素認
識部位の形成をもたらし、そして次に、ディップスティ
ックを制限酵素反応混合液に入れ、そして消化を進行さ
せる。消化が進行するのに十分な時間の後、このディッ
プスティックを取り出し、徹底的に洗浄し、そして溶液
中の蛍光を読み取る。また、ベースラインの値より上の
蛍光は、被分析物の存在を示す。Another protocol may use a dipstick made of plastic material with a holder, which holds a strip with labeled polynucleotides arranged complementary to the analyte sequence with polyfluoresceinated ends. . A nucleic acid sample is prepared in a suitable hybridization medium, and a dipstick is placed and hybridization proceeds. After sufficient time for hybridization to occur, the dipstick is removed and washed to remove any non-specifically bound polynucleotide. The presence of the polynucleotide sequence of interest results in the formation of a restriction enzyme recognition site, and then the dipstick is placed in the restriction enzyme reaction mixture and the digestion proceeds. After sufficient time for digestion to proceed, the dipstick is removed, washed thoroughly, and the fluorescence in the solution is read. Also, fluorescence above the baseline value indicates the presence of the analyte.
【０１０３】別のプロトコールでは、ポリヌクレオチド
試薬成分は、核酸被分析物の一つの領域に対し相補的な
配列を有し、マイクロタイタープレートのウェルの壁に
結合している第一のポリヌクレオチド、および核酸被分
析物の他の領域に相補的な配列を有する標識した第2の
ポリヌクレオチドである。この標識は、Ｎ8−アミノヘ
キシルデオキシアデノシントリホスフェートウンベリフ
ェリルカルボキシアミドで尾部伸張ポリヌクレオチドか
ら得られる。ハイブリダイゼーション条件下で、過剰の
標識したポリヌクレオチドと共に、核酸試料をウェル中
に入れる。ハイブリダイゼーションに十分な時間の後、
ハイブリダイゼーション溶液をウェルから吸引して取り
出し、ウェルを洗浄し、そしてウェル中に残留したDNA
を、90%のギ酸溶液を加え、そして60℃で1時間加熱する
か、あるいはピペリジンを加え、90℃で30分加熱するこ
とで、脱プリン化する。In another protocol, the polynucleotide reagent component comprises a first polynucleotide having a sequence complementary to a region of the nucleic acid analyte and bound to the wall of a well of a microtiter plate; And a labeled second polynucleotide having a sequence complementary to the other region of the nucleic acid analyte. The label, N 8 - obtained from tail extension polynucleotides aminohexyl deoxyadenosine triphosphate toe down Beri tocopheryl carboxamide. Under hybridization conditions, a nucleic acid sample is placed into a well with excess labeled polynucleotide. After sufficient time for hybridization,
The hybridization solution is aspirated out of the wells, the wells are washed and the DNA remaining in the wells
Is depurinated by adding a 90% formic acid solution and heating at 60 ° C. for 1 hour or by adding piperidine and heating at 90 ° C. for 30 minutes.
【０１０４】あるいは、標識されるべきポリヌクレオチ
ドと、SilverとFeisht、Biochemistry (1982) 21:6066
に従いクロロアセトアルデヒドで処理して、ポリ-dAを
処理して得られるオリゴマーの過剰量とをライゲーショ
ンし、蛍光性N６-エタノアデノシンを作成することで、
標識が得られる。標識の放出は、1000 ugMの、CaCl２溶
液中のミクロコッカスヌクレアーゼで、37℃で1時間処
理して行われる。Alternatively, the polynucleotide to be labeled is described in Silver and Feisht, Biochemistry (1982) 21 : 6066.
By treating with chloroacetaldehyde according to the above, and ligating the excess amount of the oligomer obtained by treating poly-dA, thereby preparing fluorescent N6-ethanoadenosine.
A label is obtained. Label release is performed by treatment with 1000 ugM of Micrococcus nuclease in CaCl2 solution for 1 hour at 37 ° C.
【０１０５】どちらの場合も、このポリマーの蛍光は自
己消光のために顕著に減少する。溶解すると、蛍光の顕
著な増加が観察される。この様にして、脱ポリマー化に
抵抗性を有する、非特異結合した標識ポリヌクレオチド
は観察される信号に干渉されない。さらに、バックグラ
ウンドの蛍光レベルが低いので、蛍光の増加率を核酸被
分析物の定量的な指標として測定し得る。自己消光の代
わりに、蛍光物質と消光物質が入れ替わったシステム、
あるいは、2成分試薬システムで、非消光性蛍光物質が
一つの成分上に存在し、消光物質が他の成分上に存在す
るシステム、も使用し得る。In both cases, the fluorescence of the polymer is significantly reduced due to self-quenching. Upon dissolution, a significant increase in fluorescence is observed. In this way, non-specifically bound labeled polynucleotides that are resistant to depolymerization do not interfere with the observed signal. In addition, the low background fluorescence level allows the rate of increase in fluorescence to be measured as a quantitative indicator of the nucleic acid analyte. Instead of self-quenching, a system in which the fluorescent substance and the quenching substance are exchanged,
Alternatively, in a two-component reagent system, a system where the non-quenching fluorescent material is on one component and the quenching material is on another component may be used.
【０１０６】以下の実施例は説明を目的に提供され、限
定は意図しない。The following examples are provided for illustrative purposes and are not intended to be limiting.
【０１０７】[0107]
【実施例】PCL(過ヨウ素酸開裂可能リンカー)の合成：
この実験では、略号「X」は、D,L-1，4−ビス-(4-(2-ヒ
ドロキシエチル)フェノキシ)-2,3-ブタンジオールを、
略号「X'」は2,3-イソプロピリデンを、そして略号「DM
T-X(Bz2)-BCE」は2-(4-[4(4-(2-ジメトキシトリチルオ
キシ)エチル)フェノキシ-2,3-ジ(ベンゾイルオキシ)-ブ
タン-オキシ]フェニル)エチル-2-シアノエチル-N,N-ジ
イソプロピルホスホアミダイトを表す。「DMT-X(Bz2)-B
CE2」は次の構造式を有する。EXAMPLES Synthesis of PCL (periodic acid cleavable linker):
In this experiment, the abbreviation “X” refers to D, L-1,4-bis- (4- (2-hydroxyethyl) phenoxy) -2,3-butanediol,
The abbreviation "X '" stands for 2,3-isopropylidene and the abbreviation "DM
TX (Bz 2 ) -BCE '' is 2- (4- [4 (4- (2-dimethoxytrityloxy) ethyl) phenoxy-2,3-di (benzoyloxy) -butane-oxy] phenyl) ethyl-2- Represents cyanoethyl-N, N-diisopropylphosphoramidite. `` DMT-X (Bz 2 ) -B
“CE2” has the following structural formula:
【０１０８】[0108]
【化１３】 Embedded image
【０１０９】4-ヒドロキシフェニルエタノール(21.4 g;
155 mmole)および1,4-ジブロモ-2,3,-ブタンジオール(1
9.3 g;78 mmole)を400 mlの無水エタノールに溶解した
混合物に、NaOH(26 mlの6 M水溶液)を加えた。この反応
混合物を18時間穏やかに還流した。室温に冷却した後、
溶媒の半分を減圧で除去し(-200 ml)、そして、激しく
撹拌しながら1000 mlの水に滴加した。生成した沈澱物
を濾別し、そして真空デシケーター中で、乾燥を補助す
る固体NaOH(10 g)上で完全に乾燥し、11.9 g(33 mmole)
の「X」(収量42%)を得た。4-hydroxyphenylethanol (21.4 g;
155 mmole) and 1,4-dibromo-2,3, -butanediol (1
To a mixture of 9.3 g; 78 mmole) dissolved in 400 ml of absolute ethanol was added NaOH (26 ml of a 6 M aqueous solution). The reaction mixture was gently refluxed for 18 hours. After cooling to room temperature,
Half of the solvent was removed under reduced pressure (-200 ml) and added dropwise to 1000 ml of water with vigorous stirring. The precipitate formed was filtered off and dried completely in a vacuum desiccator over solid NaOH (10 g) to aid drying, 11.9 g (33 mmole)
Of “X” (yield 42%) was obtained.
【０１１０】化合物「X」(33 mmole)をTHFに溶解し、次
にこの溶液(330 ml)を濾過し、そしてN,N-ジメチルアミ
ノピリジン(100 mg)とトリエチルアミン(27 ml;200 mmo
le)を加え、そして最後にt-ブチルジメチルシリルクロ
ライド(TBDMS-Cl)(19.8 g;132 mmole)を上記混合物に加
えた。20℃、18時間の後、全ての出発物質が消滅し(tlc
分析で確認)、そして、メタノール(50 ml)を加え過剰な
TBDMS-Clを消滅した(25分間)。この反応混合物を少容積
に濃縮し、酢酸エチル(250 ml)で希釈し、そして250 ml
の5% NaHCO3で1回、250 mlのNaCl 80％飽和水溶液で1回
洗浄した。有機相を固体Na2SO4上で乾燥した後、溶媒を
減圧下で除去した。粗TBDMS2-Xをピリジンに溶解し、0
℃に冷却し、そして125 mlのCH2Cl2に溶解した塩化ベン
ゾイル(132 mmole)を滴加した。反応溶液を加熱し室温
とし、そして18時間放置した。ピリジン溶媒を減圧下で
除去し、そして残査を酢酸エチルに溶解した。上記と同
様に水性溶媒で処理した後、この粗TBDMS2XBz2(30 mmol
e)を100 mlの濃酢酸を含む200 mlのTHFに溶解し、そし
てテトラブチルアンモニウムフルオライド(100 mlの1M
のTHF溶液)を加え、そして反応混合物を4℃で18時間放
置した。次に溶媒の大部分を減圧下で除去し、そして酢
酸エチル中に入れた残査を固体NaHCO3で処理し、過剰な
酢酸を中和し、上記と同様に洗浄と乾燥を行い、X(Bz2)
(30 mmole;17.0g)を得た。この物質を精製せずに使用
し、そしてピリジン中で30 mmoleのDMT-Clで処理した。
18時間後、溶媒を減圧下で除去し、酢酸エチル中の残査
を上記と同様に洗浄および乾燥し、27 gの粗DMT-X(Bz
２)を得た。この粗生成物を、CH2Cl2/1%トリエチルアミ
ンを溶媒システムとして用い、シリカの大型カラムで精
製し、純粋なDMT-X(Bz2)(13.3 g;15 mmole)を得た。こ
の精製した物質を、以下の様して2-シアノエチルホスホ
ルアミダイト誘導体に変換した：DMT-X(Bz2)(15 mmole)
をN,N-ジイソプロピルエチルアミン(13.1 ml;75 mmole)
を含む50 mlのCH2Cl2に溶解し、そして0℃に冷却した。
この溶液に、アルゴン気流下で、2-シアノエトキシ-N,N
-ジイソプロピルアミノクロロホスフィン(3.3 ml;15 mm
ole)を注射器を用いて加えた。〜30分後、反応は完了
し、そして500 mlの酢酸エチルで希釈した後、有機相を
500 mlの5% NaHCO3で2回、そして500 mlの80%飽和NaCl
で2回洗浄した。固体Na2SO4上で乾燥した後、溶液を濾
過し、蒸発乾固し、16gの白色の泡状のDMT-X(Bz2)BCEア
ミダイトを得た。この粗アミダイトをシリカゲルカラム
で精製しCH2Cl2/酢酸エチル/トリエチルアミン(45:45:1
0 v/v)で溶出し、白色の泡状の純粋なDMT-X(Bz2)BCEア
ミダイト(14.2 g;13 mmole)を得た。(NMR31P δ 144 pp
m;カップリング効率 97%) 本明細書に開示した他の過ヨウ素酸解裂種への、1,2-ジ
オール結合の変換は、有機合成化学の技術分野で周知の
一般的技術を用いて容易に行い得る。Compound (X) (33 mmole) was dissolved in THF, then the solution (330 ml) was filtered and N, N-dimethylaminopyridine (100 mg) and triethylamine (27 ml; 200 mmol
le) and finally t-butyldimethylsilyl chloride (TBDMS-Cl) (19.8 g; 132 mmole) was added to the above mixture. After 18 hours at 20 ° C., all starting material has disappeared (tlc
(Confirmed by analysis), and add methanol (50 ml)
TBDMS-Cl disappeared (25 minutes). The reaction mixture was concentrated to a small volume, diluted with ethyl acetate (250 ml), and
Was washed once with 5% NaHCO 3 and once with 250 ml of a saturated aqueous solution of NaCl 80%. The organic phase was dried over solid Na 2 SO 4, and the solvent removed under reduced pressure. Dissolve the crude TBDMS 2 -X in pyridine and add 0
Cooled to ° C. and benzoyl chloride (132 mmole) dissolved in 125 ml of CH 2 Cl 2 was added dropwise. The reaction solution was heated to room temperature and left for 18 hours. The pyridine solvent was removed under reduced pressure and the residue was dissolved in ethyl acetate. After treatment with an aqueous solvent as above, the crude TBDMS 2 XBz 2 (30 mmol
e) is dissolved in 200 ml of THF containing 100 ml of concentrated acetic acid and tetrabutylammonium fluoride (100 ml of 1M
In THF) and the reaction mixture was left at 4 ° C. for 18 hours. Then most of the solvent was removed under reduced pressure and the residue in ethyl acetate was treated with solid NaHCO 3 to neutralize excess acetic acid, washed and dried as above, X ( Bz 2 )
(30 mmole; 17.0 g) was obtained. This material was used without purification and was treated with 30 mmole of DMT-Cl in pyridine.
After 18 hours, the solvent was removed under reduced pressure, the residue in ethyl acetate was washed and dried as above, and 27 g of crude DMT-X (Bz
2) was obtained. The crude product was purified on a large column of silica using CH 2 Cl 2 /1% triethylamine as the solvent system to give pure DMT-X (Bz 2 ) (13.3 g; 15 mmole). This purified material was converted to a 2-cyanoethyl phosphoramidite derivative as follows: DMT-X (Bz 2 ) (15 mmole)
To N, N-diisopropylethylamine (13.1 ml; 75 mmole)
Was dissolved in 50 ml of CH 2 Cl 2 and cooled to 0 ° C.
To this solution, under a stream of argon, 2-cyanoethoxy-N, N
-Diisopropylaminochlorophosphine (3.3 ml; 15 mm
ole) was added using a syringe. After 3030 minutes, the reaction is complete, and after dilution with 500 ml of ethyl acetate, the organic phase is separated.
2 times with 500 ml of 5% NaHCO 3 and 500 ml of 80% saturated NaCl
And washed twice. After drying over solid Na 2 SO 4 , the solution was filtered and evaporated to dryness to give 16 g of a white foamy DMT-X (Bz 2 ) BCE amidite. The crude amidite was purified by a silica gel column and CH 2 Cl 2 / ethyl acetate / triethylamine (45: 45: 1
0 v / v) to give pure DMT-X (Bz 2 ) BCE amidite (14.2 g; 13 mmole) as a white foam. (NMR 31 P δ 144 pp
m; coupling efficiency 97%) Conversion of the 1,2-diol bond to the other periodate-cleavable species disclosed herein is accomplished using common techniques well known in the art of synthetic organic chemistry. Easy to do.
【０１１１】X'の合成：化合物X(25g, 69 mmole)をCH3C
N(200 ml)に懸濁させ、そして50 mlの2,2-ジメトキシプ
ロパンを加えた。その後の数時間の間に、無水のp-トル
エンスルホン酸(0.1 Mアセトニトリル溶液10 ml)を加え
た。殆ど透明の溶液を得た。18時間後、溶液を濾過し、
そして10 mlのH2Oを加え、そして10分間放置し、過剰な
試薬および他の副生成物を破壊した。ピリジン(50ml)を
加え、そして反応混合物を減圧下で濃縮し、25gのX'生
成物を得た。精製せずに、この物質をDMTに変換し、そ
して以前にX(Bz2)の項で記載した様に、さらにBCEホス
ホルアミダイトに変換した。Synthesis of X ′: Compound X (25 g, 69 mmole) was converted to CH 3 C
N (200 ml) and 50 ml of 2,2-dimethoxypropane was added. During the following hours, anhydrous p-toluenesulfonic acid (10 ml of a 0.1 M solution in acetonitrile) was added. An almost clear solution was obtained. After 18 hours, the solution was filtered,
Then 10 ml H 2 O was added and left for 10 minutes to destroy excess reagents and other by-products. Pyridine (50 ml) was added and the reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give 25 g of the X 'product. Without purification, this material was converted to DMT and further converted to BCE phosphoramidite as previously described in section X (Bz 2 ).
【０１１２】結果：完全に保護されたDMT-X(Bz2)BCEア
ミダイトを、固相の支持体上のオリゴマー、5'ーT10-X-T
15-3'中に組み込んだ。この断片を、ジクロロ酢酸と水
酸化アンモニウムを用いた脱保護を、先ず、20℃で1時
間、(コハク酸結合を解裂するために)、次に60℃でX部
分のベンゾイル基を除去することで行った。オリゴマー
の開裂はまったく観察されなかった。水中のテストオリ
ゴマー試料を水中の100 mMのNaIO4で4℃で1時間、処理
した。次に過剰の試薬を、リボースで還元した。ポリア
クリルアミド電気泳動(PAGE)で開裂が完了したことが示
され、より短い2つの断片、XがO-(CH2)2-C6H4-O-CH2-CH
Oである、5'-T10x-3'および5'-X-T15-3'を生じた。PAGE
の結果： 上記の結果から、本方法が、多様なソースに由来する特
定のポリヌクレオチド配列を検出するための、単純、迅
速かつ正確なアプローチを提供することが明かである。
本方法は、イムノアッセイで使用されてきた検出可能な
信号を含む異なるタイプの標識を考慮した、高い感度と
大きな融通性を提供する。従って、本方法は、放射活
性、分光光度計による光吸収、および、蛍光計あるいは
シンチレーションカウンターによる発光を、検出し得る
イムノアッセイ用の従来の装置中での使用に容易に適応
し得る。本方法は、任意のDNA配列に適用し得、そして
比較的小型のプローブが使用でき偽陽性の減少、および
好ましくないヘテロ対合の最小化をもたらす。測定のた
めに支持体から標識を解裂することで、支持体から離れ
て測定し得るため、バックグラウンド値を大きく減少し
得る。さらに、ポリヌクレオチド鎖からの標識の分離の
必要に基因する、バックグラウンドさらなる変更(redir
ection)がある。従って本方法は、病気の診断、ハイブ
リッドDNAの操作のモニタリング、遺伝的特性の確認、
等のため、正確で経済的なDNA配列確認の方法を提供し
得る。Results: Fully protected DMT-X (Bz 2 ) BCE amidite was converted to an oligomer, 5′-T 10 -XT, on a solid support.
15 -3 '. The fragment is deprotected with dichloroacetic acid and ammonium hydroxide, first at 20 ° C. for 1 hour (to cleave the succinic acid bond), and then at 60 ° C. to remove the benzoyl group of the X moiety I went by that. No cleavage of the oligomer was observed. Test oligomer samples in water were treated with 100 mM NaIO 4 in water at 4 ° C. for 1 hour. The excess reagent was then reduced with ribose. Be cleaved in polyacrylamide electrophoresis (PAGE) has been completed is shown, two shorter fragments, X is O- (CH 2) 2 -C 6 H 4 -O-CH 2 -CH
O, 5'-T 10x -3 'and 5'-XT 15 -3'. PAGE
The result of: From the above results, it is clear that the method provides a simple, rapid and accurate approach for detecting specific polynucleotide sequences from a variety of sources.
The method offers high sensitivity and great flexibility, taking into account different types of labels, including detectable signals, that have been used in immunoassays. Thus, the method can be readily adapted for use in conventional devices for immunoassays that can detect radioactivity, light absorption by a spectrophotometer, and luminescence by a fluorimeter or scintillation counter. The method can be applied to any DNA sequence, and relatively small probes can be used, resulting in a reduction in false positives and minimization of unwanted heteropairing. Cleaving the label from the support for measurement can greatly reduce the background value because it can be measured away from the support. Furthermore, additional background changes (redir) due to the need to separate the label from the polynucleotide chain
Section). Thus, the method can be used to diagnose diseases, monitor the manipulation of hybrid DNA, confirm genetic characteristics,
For example, an accurate and economical method for DNA sequence confirmation can be provided.
【０１１３】以上の様に本発明を、明確な理解を得るた
めに、説明および実施例により、部分的に詳細に記載し
たが、何らかの変更および改変は、添付の請求項の範囲
内で実施し得ることは明かである。Although the present invention has been described in some detail with reference to the description and the examples for a clear understanding of the present invention, any changes and modifications may be made within the scope of the appended claims. It is clear that you will get.
【０１１４】[0114]
【発明の効果】一定のストリンジェンシーでハイブリダ
イゼーションが起こったかどうかが、支持体からの標識
の放出で判断し得る、被検物中の対象配列と実質的に相
同なオリゴヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
を使用する、核酸被検物をアッセイするための新規な方
法が提供される。より詳細には、標識を支持体に結合す
るために、種々の技法が使用され、その後、標識と支持
体間の結合を過ヨウ素酸開裂し、標識を遊離させ、標識
を試料中の特定のオリゴヌクレオチド配列の存在の指標
として検出できる。本方法は、病気の診断、遺伝子のモ
ニタリング、および核酸混合物の分析に使用できる。EFFECT OF THE INVENTION A polynucleotide having an oligonucleotide sequence substantially homologous to a target sequence in a test sample, which can determine whether hybridization has occurred at a constant stringency by the release of the label from the support. Novel methods for assaying nucleic acid analytes are provided. More specifically, various techniques are used to attach the label to the support, followed by periodate cleavage of the bond between the label and the support, release of the label, and labeling of the specific It can be detected as an indicator of the presence of the oligonucleotide sequence. The method can be used for diagnosing disease, monitoring genes, and analyzing nucleic acid mixtures.
【図１】固相支持体に特異結合および非特異結合した標
識の相違を説明する図である。FIG. 1 is a diagram for explaining the difference between a label specifically and non-specifically bound to a solid support.
【図２】本発明の好ましい方法の一例を模式的に説明す
る図である。選択的な開裂部位が、被分析物/プローブ
複合体を介して支持体と標識の間に導入される。FIG. 2 is a diagram schematically illustrating an example of a preferred method of the present invention. A selective cleavage site is introduced between the support and the label via the analyte / probe complex.
【図３】本発明の好ましい方法の一例を模式的に説明す
る図である。選択的な開裂部位が、被分析物/プローブ
複合体を介して支持体と標識の間に導入される。FIG. 3 is a diagram schematically illustrating an example of a preferred method of the present invention. A selective cleavage site is introduced between the support and the label via the analyte / probe complex.
【図４】本発明の好ましい方法の一例を模式的に説明す
る図である。選択的な開裂部位が、被分析物/プローブ
複合体を介して支持体と標識の間に導入される。FIG. 4 is a diagram schematically illustrating an example of a preferred method of the present invention. A selective cleavage site is introduced between the support and the label via the analyte / probe complex.
【図５】本発明の好ましい方法の一例を模式的に説明す
る図である。選択的な開裂部位が、被分析物/プローブ
複合体を介して支持体と標識の間に導入される。FIG. 5 is a diagram schematically illustrating an example of a preferred method of the present invention. A selective cleavage site is introduced between the support and the label via the analyte / probe complex.
Claims (5)
対象オリゴヌクレオチド配列の存在を検出する方法であ
って：ハイブリダイズ条件下で、該核酸試料をポリヌク
レオチド試薬と結合する工程、 ここで、該ハイブリダイズ条件では、該試料または該試
薬の成分の何れか一つが支持体と結合され、そして該被
分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼー
ションが、R1およびR2が独立して、アルキレン、アルケ
ニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シク
ロオキシアルキレン、アリール、アリールアルキレン
（aralkylene）、およびこれらの組合せからなる群から
選択され、そしてXが過ヨウ素酸開裂し得る結合である
選択可能な開裂部位-R1-O-X-O-R2-を介して、該支持体
と結合した標識を生じさせる；該選択可能な開裂部位を
介さずに該支持体に結合した標識を該支持体から実質的
に除去する工程；過ヨウ素酸試薬で該開裂部位を切断す
る工程；および該支持体から遊離した標識を検出する工
程；を包含する方法。1. A method for detecting the presence of an oligonucleotide sequence of interest in a nucleic acid analyte present in a nucleic acid sample, comprising: binding the nucleic acid sample to a polynucleotide reagent under hybridizing conditions. In the hybridization conditions, any one of the components of the sample or the reagent is bound to a support, and the hybridization between the analyte and the polynucleotide reagent is such that R 1 and R 2 are independent. Selected from the group consisting of alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, arylalkylene, and combinations thereof, and wherein X is a periodate cleavable bond. cleavage site -R 1 -OXOR 2 - through, causes a label bound to the support; the selectable cleavage site Substantially removing the label attached to the support from the support without removing the cleavage site with a periodate reagent; and detecting the label released from the support. how to.
対象オリゴヌクレオチド配列の存在を検出する方法であ
って：水性溶媒中のハイブリダイズ条件下で、該核酸試
料とポリヌクレオチド試薬とを結合する工程、 ここで、該ハイブリダイズ条件では、該試料または該試
薬の成分の何れか一つが支持体と結合され、そして、 該被分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイ
ゼーションが、R１およびR２が独立して、アルキレン、
アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレ
ン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリールアル
キレン、およびこれらの組合せからなる群から選択さ
れ、そして、Xが過ヨウ素酸開裂し得る結合である選択
可能な開裂部位-R1-O-X-O-R2-を介して、該支持体と結
合した標識を生じさせる；該液媒から、ポリヌクレオチ
ド試薬が結合した該支持体および核酸被分析物を分離す
る工程；前記液媒と異なるハイブリダイゼーションスト
リンジェンシーの溶媒で該支持体を洗浄し、該選択可能
な開裂部位を介さずに該支持体に結合した標識を除去す
る工程；過ヨウ素酸試薬で該開裂部位を切断する工程；
および該支持体から遊離した標識を検出する工程；を含
む方法。2. A method for detecting the presence of an oligonucleotide sequence of interest in a nucleic acid analyte present in a nucleic acid sample, comprising: combining the nucleic acid sample with a polynucleotide reagent under hybridizing conditions in an aqueous solvent. Binding, wherein in the hybridization conditions, one of the components of the sample or the reagent is bound to a support, and the hybridization of the analyte with the polynucleotide reagent comprises R1 and R2 is independently an alkylene,
A selectable cleavage site -R 1- selected from the group consisting of alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, arylalkylene, and combinations thereof, and wherein X is a periodate-cleavable bond. Generating a label bound to said support via OXOR 2- ; separating said support bound to a polynucleotide reagent and a nucleic acid analyte from said liquid medium; a hybridization string different from said liquid medium Washing the support with a solvent of any kind and removing the label bound to the support without passing through the selectable cleavage site; cleaving the cleavage site with a periodate reagent;
And detecting a label released from the support.
て反対の末端に対象の配列に相補的な配列を有するポリ
ヌクレオチド配列を含む、核酸試料中に存在する核酸被
分析物中の対象オリゴヌクレオチド配列の存在の検出に
有用なプローブであって、さらに、R1およびR2が独立し
て、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、シ
クロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリー
ル、アリールアルキレン、およびこれらの組合せからな
る群から選択され、そして、Xが、過ヨウ素酸開裂し得
る結合である、選択可能な開裂部位-R1-O-X-O-R2-を含
む、プローブ。3. An object in a nucleic acid analyte present in a nucleic acid sample comprising a polynucleotide sequence that binds to a support near one end and has a sequence complementary to the sequence of interest at the opposite end. Probes useful for detecting the presence of an oligonucleotide sequence, further wherein R 1 and R 2 are independently alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, aryl, arylalkylene, and combinations thereof. And X comprises a selectable cleavage site -R 1 -OXOR 2- , wherein X is a periodate cleavable bond.
鎖であり、R1およびR2は独立して、アルキレン、アルケ
ニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シク
ロオキシアルキレン、アリール、アリールアルキレン、
およびこれらの組合せからなる群から選択され、そし
て、Xは過ヨウ素酸開裂し得る結合である、を有するポ
リヌクレオチド試薬。4. The structure of the following formula: Here, DNA 1 is the first strand of DNA, DNA 2 is the second strand of DNA, and R 1 and R 2 are independently alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cyclooxyalkylene, Aryl, arylalkylene,
And X is a periodate-cleavable bond.
レン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロ
オキシアルキレン、アリール、アリールアルキレン、お
よびこれらの組合せからなる群から選択され、Xは、過
ヨウ素酸開裂し得る結合であり、Y1は、酸に感受性で、
塩基に安定な保護基であり、そしてY2は、水素、ホスホ
ルアミダイト、ホスホトリエステル、ホスホジエステ
ル、ホスファイト、H-ホスホネートおよびホスホロチオ
エートからなる群から選択される、で表されるポリヌク
レオチド合成に有用なポリヌクレオチド試薬。5. the following formula structure: Y 1 -OR 1 -OXOR 2 -OY 2 wherein, R 1 and R 2 are independently alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cycloalkylene oxyalkylene, aryl, Selected from the group consisting of arylalkylenes, and combinations thereof, wherein X is a periodate-cleavable bond, Y 1 is acid-sensitive,
Base stable protecting group, and Y 2 is hydrogen, phosphoramidite, phosphotriester, phosphodiester, phosphite, H- is selected from the group consisting of phosphonates and phosphorothioates, in represented by polynucleotide synthesis Useful polynucleotide reagent.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20000525 |