JPH06508154A - ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド 本発明は新規な治療法、特に特定のプロティンキナーゼＣに対するペプチドタイ プの新規な阻害剤に関係し、またその調製法及びそれを含んでなる医薬組成物な らびに、医療におけるその使用に関するものである。

細胞***のシグナル伝達の過程における決定的な段階を明らかにするため、多く の努力が払われている。成長因子の刺激により強力に増幅されるリン脂質の分解 （Ｍ　Ｊ　Ｂｅｒｒｉｄｇｅ、＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　５６ ．１５９（１９８７）ａｎｄ　Ｊ　ＨＥｘｔｏｎ、　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ、　２５Ｂ、ｌ　（１９９０））が最近の研究の中心を占めている。はとんど の研究がホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の代謝回転に向けられているが、 ホスホジェステラーゼの関与したホスファチジルコリン（ＰＣ）の加水分解のよ うなＰｌとは独立したシグナル伝達のカスケードが存在することを示した研究も 数多くなされている（Ｊ　ＨＥｘｔｏｎ　（１９９０，Ｉｏｃ　ｃｉｔ）；　Ｊ 　Ｍ　Ｂｅｓｔｅｒｍａｎｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３．６７８５（１９８６）；Ｌａ５ｅｌ　ｅｔ　ａｔ、、 　Ｎａｔｕｒｅ　３３０．２６９　（４９８７ａ）；　Ｍ　Ｓ　Ｐｅ５ｓｉｎｅ ｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５．７９５９　（１９９０） 　ａｎｄ　ＰＬａｒｒｏｄｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｃｅ１ｌ　Ｂ１．１１１３ 　（１９９０））　ｏ最近、ホスホリパーゼＣが触媒するホスファチジルコリン の加水分解の活性化（ＰＣ−ＰＬＣ）が、血小板由来成長因子（ＰＤＧＰ）の細 胞***シグナルの重要な部分に十分近似していることを示す証拠が集まりつつあ る（Ｐ、　Ｌａｒｒｏｄｅｒａ　ｅｔａｔ、　（１９９０）、　ｆｏｅ　ｅｆｔ 、）　ｏホスホリパーゼＣによるホスファチジルコリンの加水分解はまた、がん 遺伝子ｒａｓの産物であるｒａｓ　ｐ２１によっても活性化されることが示され （Ｊ　ＣＬａｃａｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７ａ）　ｔｏｅ　ｃｌｔ；Ｂ　Ｄ 　Ｐｒ１ｃｅ　ｅｔａｌ、　Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２８４．１８６３ ８（１９８９）；　Ｉ　Ｄｉａｚ−ＬａｖＩａｄａ　ｅｔ　ａｔ、、　ＥＭＢＯ Ｊ　９，３９０７（１９９０）；　Ｍ　Ｌｏｐｅｚ−Ｂａｒａｈｏｎａ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２６５．９０２２（１９９０））、 細胞***カスケードにおけるｒａｓ　ｐ２１の役割が示されている（Ｍ　ＲＳｍ １ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２０．５４０　（１９８Ｂ））。

Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｌｓ　（アフリカッメガエル）の卵は、がん遺伝子に 制御された適当なシグナル伝達において、異なった酵素活性の関与を探る上で適 した実験系である（ＬＪ　Ｗｏｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８ ．８４０（１９８７）；　Ｊ　ＣＬａｃａｌａｔ　ａｌ、、５ｃｊｅｎｃｅ　２ Ｈ，５３３（１９８７ｂ）　）　ｏすなわち、Ｘｅｎｏｐｕｓの卵はインスリン やプロゲステロンの刺激によって成熟卵へと変化し、そしてインスリン／　ＩＣ Ｆ−１により活性化される成熟シグナルカスケードにおいてｒａｓｐ２１が特異 的に関与することを示す証拠がいくつか挙げられている： １］卵にｒａｓ　ｐ２１をマイクロインジェクションすることによって、卵の成 熟が促進された。

（Ｃ，Ｂｌｒｃｈｓｅｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１４３．Ｂ１５（１９８５ ））２、　ｒａｓ　ｐ２１の活性を阻害する抗ｒａｓ　ｐ２１抗体（Ｙ１３−２ ５９）をマイクロインジェクトすることにより、プロゲステロンではなくインス リンによって誘発された卵の成熟がブロックされる。（Ｌ　Ｊ　Ｋｏｒｎ　ｅｔ 　ａｌ、、（１９８７）ｔｏｅ　ｃｉｔ）インスリン／　ｒａｓ　ｐ２１によっ て活性化された卵の成熟過程におけるＰＣ−ＰＬＣの重要性と関与の決定的な証 拠が、最近の研究で明らかになった（Ｇａｒｃｉａ　ｄｅ　Ｈｅｒｒｅｒｏｓ　 ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２８６．８８２５−１３８２９ （１９９１））　、すなわち、ＰＬＣによるＰＣの加水分解がインスリン／　ｒ ａｓ　Ｐ２１によるＸｅｎｏｐｕｓ　Ｌａｅｖｌｓ卵の成熟の活性化に必要かつ 十分であることが、卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）の誘発と成熟促進因子であるＩｌｌ 　キナーゼの活性化の測定から示された。これらの結果は、ＰＣ−ＰＬＯの活性 が細胞***の制御とがん化への機構に密接に関わっていることを示している。

卵の成熟を制御する生化学的なパラメーターは哺乳動物の細胞***に関与するも のと同じであることが示されているが（Ａ、　Ｌ　Ｈｕｒｒａｙ　＆　Ｍ、　Ｖ 、　Ｋｌｒｓｃｈｎｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ３３９．２７５　（１９８９））　、 このような研究には哺乳類の体細胞の培養細胞、特に、特異的な成長因子または 血清で活性化されたマウスの繊維芽細胞が有用である。

しかしながら、ＰＣ−ＰＬＯが成長因子の***シグナルを変換する機構は明らか になっていない。ＰＬＯによるＰＣの加水分解は、プロティンキナーゼＣの重要 な活性化物質であるジアシルグリセロール（ＤＡＣ）　（Ｙ、　Ｎ１５ｈｉｚｕ ｋａ。

Ｎａｔｕｒｅ　３３４．６６１　（１９８８））を発生させることがら、ｐｃ− ＰＬＣにより活性化される細胞***シグナルカスケードにおけるこの酵素の関与 は興味ある可能性として存在する。

ＰＫＣは大別すると２種類に分類されるが、クローニングし解析した結果、さら にいくつかのサブグループを形成することがわかった（Ｙ、　Ｎ１５ｈｉｚｕｋ ａ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５８゜６０７−６１４　（１９９２）参照）。これら のアイソタイプはすべて保存された偽基質自己阻害領域（ｐｓｅｕｄｏｓｕｂｓ ｔｒａｔｅａｕｔｏｉｎｈｉｂｌｔｏｒｙ　ｄｏＩａｉｎ　）を保持している（ Ｔ、　Ｓ。

Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２８５．　１８２３　（１９９ ０））　、ａ　、βおよびアイソタイプの偽基質領域の１９から３１番残基に対 応する合成ペプチドは、ラット脳のＰＫＣの活性を強く阻害することがインビト ロの実験で示されている（Ｃ。

Ｈｏｕｓｅ　＆Ｂ、　Ｅ、　Ｋｅｅｐ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３Ｌ　１７２Ｂ　 （１９８７））。

我々は、今般、プロティンキナーゼＣイソタイプゼータ（ζ）の活性を阻害する あるペプチドを見出した。

したがって、本発明は一般式（１）のペプチドおよび薬学許容されるその塩であ って、３〜１５アミノ酸残基からなるものを提供する。

Ｘ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｊ　（１）（ここで、ＸはＨまたは１つまたはそ れ以上のアミノ酸を、モしてｊはＯＨまたは１つまたはそれ以上のアミノ酸を表 す。） ここで用いる”誘導体“という用語は本発明によるペプチドの塩と溶媒和物を含 み、またひとつもしくはそれ以上の末端の修飾構造を有する本発明によるペプチ ドも含むが、ただし、Ｃ端のアミノ酸はアルギニンのアルキルエステル以外のも のである。末端の修飾構造には、欠失、アシル化（例えばアセチル化やベンゾイ ル化）、アルキル化、脂肪酸のアセチル化（例えばｗｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｌｏ ｎ）もしくはＮ端のアミノ基の環状化および欠失アミド化（モノ−、ジアルキル アミド化を含む）、Ｃ端のカルボキシル基の環状化と還元が含まれる。Ｎ−アシ ル、例えばＮ−アセチルの誘導体が好ましい。

式（１）のペプチドの適切な塩とは、無機酸および有機酸から誘導される生理学 的に許容される付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、硝酸塩、シュウ 酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フマル 酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、スルホン酸塩、例えば、パラトルエンスルホ ン酸塩およびメタンスルホン酸塩が含まれる。式（１）のペプチドの適切な溶媒 和物は、例えば水和物である。

この発明に従うペプチドはプロティンキナーゼＣイソタイプゼータ（ζ−ＰＫＣ ）の特異的な阻害剤である。ここで用いる”プロティンキナーゼＣイソタイプゼ ータ”（ζ−ＰＫＣ）とは特定のに自己阻害する偽基質領域ＲＲＧＡＲＲＷＲＫ 　（配列番号５）の配列を含むプロティンキナーゼＣのいずれかのサブスピーシ ーズをも意味する。この特定の配列は、ラット脳ζ−ＰＫＣ（Ｏｎｏ　ｅｔ　ａ ！、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６．３ ０９９−３１０３（１９８９））、アフリカッメガエルζ−ＰＫＣ，ζｎ−ＰＫ Ｃ（現在研究中）を含む多くの異なる生物から単離されたζ−ＰＫＣに完全に１ ００％保存されている。

好ましい式（Ｉ）のペプチドは３から９アミノ酸残基ものであり、特に３から６ アミノ酸残基のものが挙げられる。

好ましい式（Ｉ）のペプチドの群としては、Ｘが水素、アセチル基、Ｇｌｙ　、 　Ａｒｇ−ＧｌｙまたはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを表わし、Ｊが水酸基、Ｔｒｐ 　、　Ｔｒｐ−ＡｒｇまたはＴｒｐ−＾ｒｇ−Ｌｙｓのものが挙げられる。

本発明による好ましいペプチドとしは下記のものが挙げられる： ＾１ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ　（配列番号、１）、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ 　（配列番号、２）、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ　（配列番号、 ３）、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ　（配列番号、４）、 Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ　 （配列番号、５）、および Ｎ−アセチル−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号、１７）、ならびに薬学上許 容されるその誘導体。

式（１）のペプチドは少なくとも３つのキシル中心をもっていると考えられる。

式（Ｉ）は本発明によるペプチドのジアステレオイソマーとラセミ体を含むその 混合物とを包括する意味に理解さなければならない。アミノ酸は自然界に存在す るＬ型かＤ型かもしくはその混合物、例えば、Ｌ型とＤ型のラセミ混合物である 。しかしながら、式（Ｉ）のペプチドは好ましくは自然界のＬ型のアミノ酸を含 んでなる。

本発明によるペプチドは実質的に精製された状態で製造され、他のペプチドやア ミノ酸を実質的に倉ない。好ましくはペプチドは９０％以上の精製度（例えば９ ５％）を有するが、臨床での使用では９８％以上の精製度（存在する全てのペプ チド基＄）がよい。

本発明による新規ペプチドの合成には、従来のペプチド合成の方法を用いること ができる。すなわち、ペプチドは、所望の配列に従って伸張するペプチドに、一 連のカップリング反応によって、アミノ酸をつなぐことにより合成される。様々 なアミノ基の保護基、例えばカルボベンジルオキシ基またはｔ−ブチルオキシカ ルボニル基（ＢＯＣ）　、様々なカップリング試薬、例えばジシクロへキシルカ ルボジイミドまたはカルボジイミダゾール、様々な活性化エステル、例えばＮ− ヒドロキシブタルイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル、様々 な切り出し試薬、例えばトリフルオロ酢酸、ジオキサンに溶かした塩化水素、は う素−トリス（トリフルオロ酢酸）、臭化シアン、ならびに中間体の単離と精製 を伴う溶液中の反応は、従来から周知のペプチドの方法論にしたがった。

好ましくは、本発明によるペプチドは周知のメリフィールドの固相法の方法によ り製造する （Ｍｅｒｒｌｆｉｅｌｄ、　Ｊ、　Ａｌ１ｅｒ、　Ｃｈｅａ、　Ｓｏｃ、　８５ ．２１４９−５４（１９６３）ａｎｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　１５０．　１７８−８ ５　（１９６５））　。

従って、本発明による別の能様によれば次のようなペプチドの製造の方法が提供 され、その方法は：（ａ）所望の保護されたＣ端のアミノ酸を適当な固相担体へ 結合させ、 （ｂ）所望の配列に、他の保護アミノ酸と担体に固定されたＣ末端アミノ酸とを 反応させ、そして、（Ｃ）保護基を除去し、得られたペプチドを固相担体から切 り出すことを含んでなる。

この方法は古典的なペプチド合成でたくさんの試薬と保護基を使用するが、Ｃ端 のアミノ酸を介し通常はポリスチレンやスチレンジビニルベンゼンの混合ポリマ ーなどの固相担体に結合した状態で、ペプチド鎖を伸張させていく。この方法は 各段階において、固相担体を洗うことによって過剰な試薬を除去できるため、多 くの操作が単純化されており都合がよい。

すなわち、適当に保護されたａ−アミノ基を持つＣ端アミノ酸を固相担体へ結合 させる。そして、例えばトリフルオロ酢酸の塩化メチレン溶液を用いて、ａ−ア ミノ基の保護基を除去し、次のステップの反応に備える。特定のアミノ基の保護 基を除去するための、通常使用される他の試薬や条件も、論文に記されたように 用いることができる。

そして他のａ−アミノ基や側鎖の保護されたアミノ酸を、求める配列に応じ各段 階ごとに、担体に固定された中間体ペプチドに結合していく。各アミノ酸を独立 に加える過程で、その内のいくつかは、担体に固定されたペプチド鎖に付加する 前にお互いに結合してしまう可能性がある。特定の結合試薬の選択は当業者に容 易であろうペプチドの化学合成における共通点は、様々なアミノ酸分子の不安定 な側鎖の適当な保護基による保護であり、その保護基はペプチド鎖が結合した後 、完全に除去される。また、ａ−アミノ基の保護も共通点であり、カルボキシル 基の反応後、ａ−アミノ基の保護基の選択的な除去を行ない、次の反応に備える 。それ故、合成のある段階で側鎖の保護基を持った様々なアミノ酸を含む中間体 が生じるのも共通点である。そしてこれらの保護基は共に実質的に同時に除去さ れ請求める最終産物がその後精製することにより得られる。

求めるアミノ酸配列の通りに合成が完了した後に、液体フッ化水素の様な試薬で 処理することによりペプチドを担体から切り出すが、このとき、残った側鎖の保 護基も除去される。そしてペプチドは、例えば、ゲル濾過、ＨＰＬＣ（Ｒｌｖｉ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ｐｅｐｔｌｄｅｓ　：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄＢｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　（１９７９）　ｐＩ）、１２５−１２８ ）　、イオン交換ゲル、分配クロマトグラフィー、向流分配、その他の方法で精 製される。

ペプチドを例えば酸の付加された塩の形で得ようとするときは、ペプチドの塩基 の部分を適当な酸で、できれば同じ当量で処理することによって得られる。

本発明によるペプチドはζ−ＰＫＣの強く特異的な阻害剤であることが見いださ れた。それ故このペプチドは生体におけるζ−ＰＫＣの役割を研究するための科 学的な道具であり、特に生殖細胞の成熟や哺乳動物の体細胞の異常増殖などの、 細胞***のシグナル伝達におけるζ−ＰＫＣの役割の研究において有用である。

すなわち、本発明によれば細胞のζ−ＰＫＣ活性を阻害する方法が提供され、そ の方法は、ζ−ＰＫＣの活性に応答する細胞と、有効量のζ−ＰＫＣの阻害剤と を接触させることを含んでなる。化合物がζ−ＰＫＣの阻害剤であるかどうか、 すなわちそれが本発明に包含されるか否かは、知られた実験、例えばＯｎｏ　ｅ ｔ　ａｌ　１９ｇ９゜１ｏｃ、ｃｉｔ、や以下に示すような、概に報告されたイ ンビトロのアッセイ系を用いて容易に評価されるであろう。有用なζ−ＰＫＣの 阻害剤は好ましくは、本発明による好ましいペプチドであるＡｌａ−Ａｒｇ−Ａ ｒｇ　（配列番号１）のような効力と選択性を示す。適当なアッセイ系としては 、例えば、ラット脳や牛の脳またアフリカッメガエルの卵などの適当な組織から 得られたζ−ＰＫＣ，または、上記Ｏｎｏ　ｅｔ　ａｔ　（１９８９）によって 示された組換えζ−ＰＫＣ体を用いた、リン酸化アッセイが挙げられる。様々な アッセイの手法は以下に示す適当なマイクロインジェクションの技術を用ことが できる。例えば、旧キナーゼや卵核胞崩壊のような卵成熟過程の分析、哺乳動物 細胞の異常増殖の分析、ＤＮＡ合成（複製）の分析などが挙げられる。これらの 手法は、特に細胞***シグナル伝達ニオケるζ−ＰＫＣの活性のインビトロの研 究に有用であり、また新規なζ−ＰＫＣに対する阻害剤をスクリーニングする方 法としても有用である。インビボスクリーニングの適切な手法は、マウスなどの 形質転換動物（トランスジェニックアニマル）を用いた慣用されている技術によ って確立されるであろう。

本発明の更に別の能様によれば、ζ−ＰＫＣの活性が媒介する病理的症状の予防 と治療に適した医薬を選択するスクリーニング方法が提供され、その方法は：ａ ）被試験試薬を含むサンプルを、ζ−ＰＫＣ活性の阻害および／または活性化を 示すことができるアッセイ系においてインキュベート、 ｂ）その試薬がζ−ＰＫＣ活性を変化させるかどうか、必要ならば活性の変化の 程度を決定し、そしてＣ）ζ−ＰＫＣを強力かつ選択的に阻害した試薬を選別す ることを含んでなる。

出願人は、インスリン／　ｒａｓ　Ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＣの特異的な経路に 反応する細胞***シグナル伝達機構においてζ−ＰＫＣが重要であることを見出 した。予備的な実験によって得られた証拠はまた、ζ−ＰＫＣは、細胞活性化を ウィルスゲノムの複製につなぐ事象のカスケードにおいて一つの役割を担ってい る可能性のあることを示している。今までインビボにおけるζ−ＰＫＣの重要性 について評価されたことがなかったが、我々出願人はζ−ＰＫＣのインビトロの 阻害剤を、ζ−ＰＫＣ活性が関与する病理的症状の診断、予防または治療におい てインビボにおける有効であると初めて認識したのである。特に出願人は、適当 なモデル系を用いて、ζ−ＰＫＣの阻害剤が広く腫瘍に対して、また乾鼾のよう な高増殖症、そして）ＩＩＶのようなウィルスの感染に対して、有効であるかど うかということを明らかにした。

ここで用いた“腫瘍”という語は、良性、悪性の腫瘍、がん、がん性の成長、ま たは新生物（体細胞に由来した腫瘍のこと）を意味している。これらの“腫瘍“ は特に限定されず広くヒトを含め哺乳動物の腫瘍、例えば、がん腫、腺腫、黒色 腫、肉腫、リンパ腫、白血病等のことをいう。具体的な例としては、口腔および 咽頭（唇、舌、口、咽頭）、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肝臓および胆嚢道、 膵臓、喉頭、肺、骨、結合組織、皮膚、結腸、***、子宮、子宮内膜、卵巣、前 立腺、精巣、膀胱、腎臓および他の泌尿器の組織、目、脳および中枢神経、甲状 腺および他の内分泌腺、白血病（リンパ球性、顆粒球性、単球性）、ホジキン病 、非ホジキン病リンパ腫、多発性骨髄腫等のがんが挙げられる。出願人は、例え ば上顎顔面扁平上皮癌（ｌＩａｘｉｌｏｒａｃｌａｌ　５ｑｕａ＊ｕｓ　ｃｅｌ ｌｃａｒｃｉｎｏｍａ　）のような特定の腫瘍がζ−ＰＫＣの特異な高発現に関 連することを明らかにした。さらに、繊維芽細胞ＨＩＨ３Ｔ３を用い強力なウィ ルスのプロモーターをもつプラスミドによるＺ−ＰＫＣの高発現は、細胞の著し い増殖制御の低下を引き起こし、血清要求性の低下、***速度の上昇、細胞の高 密度増殖、さらに半固体培地（ｓｅｍｉ−ｓｏｌｉｄ　ｍｅｄｉｕｍ　）におい てコロニーを形成させた。

従って、式（Ｉ）のペプチドは、ヒトを含めた哺乳動物における広範な腫瘍、高 増殖症およびウィルス感染に対し有効であり、そして腫瘍、乾１のような高増殖 症および旧■等のウィルス感染の治療に用いられる。

本発明は更に、特に、動物（特にヒト）におけるζ−ＰＫＣ活性に関連する病因 学的状態の治療に有効成分として用いられる式（１）のペプチドおよびその生理 学的に許容される誘導体が提供される。

本発明の特定の態様によれば、例えば上顎顔面偏平上皮がん（ｌＩａｘｉｌｏｒ ａｃｌａｌ　ｓｑｕａｗｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）のようながん の治療に用いられる、式（Ｉ）のペプチドおよびその生理学的に許容される誘導 体が提供される。

さらに本発明の別の態様によれば、式（１）のペプチドおよびその生理学的に許 容される誘導体を投与することを含んでなる、ヒトを含む哺乳動物においてζ− ＰＫＣ活性を阻害する方法が提供される。

さらにまた、哺乳動物においてζ−ＰＫＣ活性を阻害する医薬の製造のための、 式（１）のペプチドおよびその生理学的に許容される誘導体の更なるまたは他の 態様が提供される。

ここで言う治療は確立した症候の治療とともに予防にも及ぶことは当業者に明ら かであろう。

本発明によるペプチドを患者に未加工の化学物質として投与することは可能であ ろうが、しかし、医薬処方物の活性成分として存在させるのが好ましい。

従って、本発明によれば、式（１）のペプチドまたは生理学的に許容されるその 誘導体を、−またはそれ以上の生理学上許容される担体と、場合によって他の治 療または予防成分と共に含んでなる医薬組成物が提供される。

その担体は他の成分と相容性できるという意味で”許容される”ものでなければ ならず、投与される側にとって有害であってはならない。医薬処方物には、経口 、経直腸、経鼻、局所投与、移植または非経口の投与（筋肉、皮下、静脈注射な ど）、吸入法や通気法による投与に適した形態が含まれる。この処方物は、適切 には、別個の投薬単位とされるのが通常であり、製剤の技術分野で良く知られて いるあらゆる方法によって製造されてよい。

いずれの方法も活性化合物を液体担体または細かく粉砕した固形担体と混合する 工程を有し、さらに必要であればその生成物を所望の処方形とする工程を含む。

経口投与のために、医薬組成物は例えは錠剤またはカプセル剤の形態をとり、そ れらは薬学上許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、ゼラチン状トウモロコ シ澱粉、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、賦活 剤（例えば、乳糖、セルロースやリン酸カルシウムの微結晶）、潤滑剤（例えば 、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガ イモ澱粉、澱粉グリコールのナトリウム塩）、浸潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム ）を用いて、慣用されている方法で製造することができる。錠剤は当該技術分野 で周知の方法によってコートされてもよい。経口投与のための液体処方物は、例 えば溶液、シロップ、けん濁液、または、使用に際して水または他の適当なビヒ クルと共に構成される乾燥品として提供されてよい。そのような液体処方物は、 けん局側（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、水素添加された 食用の脂肪）、乳化剤（例えば、レクチン、アカシア）、非水系ビヒクル（例え ば、アーモンドオイル、エステル系の脂質、エタノール）、防腐剤（例えば、メ チルまたはプロピルバラヒドロキシ安息好酸塩、ソルビン酸）などの薬学上許容 される添加剤を用い慣用されている方法によって製造されてよい。

口内局所投与のために、医薬組成物は慣用されている方法によって舌下錠、ドロ ップ、ロゼンジの形態であってよい。

表皮への局所的投与のために、ペプチドはクリーム、ゲル、軟膏、ローションま たは経皮バッチの形態であってよい。それらの処方物は、例えば適切な濃化剤、 ゲル化剤、乳化剤、安定剤、分散剤、けん局側、および／または、着色剤などの 添加と共に水系または脂質を基本にして処方されてよい。

本発明によるペプチドはまた、デポ−製剤として処方されてもよい。このような 効能が長期にわたる処方は、移植（例えば、皮下や筋肉中）または筋肉注射によ って投与される。それゆえ、例えば、ペプチドは適切な重合体、疎水性の物質（ 例えば、許容可能なオイルによる乳化物）、イオン交換樹脂、難溶性の誘導体、 例えば難溶性の塩などにより処方される。

本発明によるペプチドは注射によって非経口的に投与されるよう処方されてよく 、好ましくは静脈注射、筋肉注射、皮下注射として、例えば、ポーラス注射また は連続投与などにより投与される。注射剤としての処方は、防腐剤が添加された 、例えばアンプルまたは多投与容器中の単位投与形態とされてよい。組成物は、 脂質または水系のビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとされてよく、 それらは懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方化剤を含んでいて もよい。さらには、活性成分は、使用の際に、例えば滅菌された発熱物質を含ま ない水のような適当なビヒクルで構成されるものとしての粉末とされてもよい。

本発明によるペプチドは、例えばココアバターや他のグリセリドのような慣用さ れた生薬基材を含んでなる、生薬や浣腸などの直腸投与処方物とされてもよい。

鼻腔への投与のために、本発明によるペプチドは例えば液体状のスプレー、パウ ダー、ドロップの形で用いられてよい。

吸入による投与のために、本発明によるペプチドは好ましくはエアロゾルスプレ ーの形態とされてよく、加圧バンクまたはネブライザーから、適当な噴射剤（例 えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフ ルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当な気体）を用いてエアロゾルとされ る。加圧エアロゾルの場合、単位投与量は計量された量を与えるバルブを備える ことで決定されてよい。。例えば吸入や通気投与に用いられる例えばゼラチンか らなるカプセルまたはカートリッジは、本発明によるペプチドと、乳糖または澱 粉のような適当な粉末との粉末状混合物を含有する形態とされてい。

上記したすべての医薬組成物は、規制として公開された様式に基づくものでなけ ればならないであろう。

本発明医薬組成物は鼻腔、局所的投与または非経口投与が好ましい。

治療に用いられる式（１）のペプチドの量は、選択したペプチドの種類だけでな く投与の経路、治療される側の条件の性質、患者の年令や体重と状態によっても 変化し、また担当の医師や獣医の判断に完全に任せられていることからも変化す ることは明らかであろう。しかしながら、一般に好ましい投薬量は一日に約１− ５００ｍｇの範囲であり、−日に２０−２００ｍｇの範囲が好ましく、−日に５ ０−１２０ｍｇの範囲が最も好ましい。

予防のための適切な一日の投薬量は一般に０．１−５０ｍｇの範囲であろう。

必要とされる投与は、好ましくは一日に一回または適切な間隔をおいて分割した 投与、例えば二回、三回、四回、あるいはそれ以上であってよい。ペプチドは好 ましくは単位投与形態として用いられる。好ましい１単位投与処方は活性成分を ０．１　５００ｍｇ含有する。

本発明によるペプチドは、また、他の治療剤例えば他の制がん剤と共に用いられ てもよい。特に本発明による化合物は公知の制がん剤と共に用いられてよい。

更に他の態様によれると、本発明によれば、本発明による式（１）のペプチドと 他の治療剤との組み合わせが提供される。

この組み合わせは、通常、医薬組成物の形態において利用され、従って、その組 み合わせと薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物は、さらなる本発明 による別の態様を提供することとなる。

式（１）のペプチドを第二の治療剤と共に使用する場合には、活性成分はあらゆ る経路によって順次または同時に投与されてよい。

上記の組み合わせとしての使用に適した治療剤には、例えばシクロフォスフアミ ドのようなアルキル化剤、メソトレキセートのような抗代謝剤、ビンブラスチン のような***阻害剤、アドリアマイシンのような抗腫瘍抗生物質、タモキシフェ ン、フルタミド、ゴセリリン酢酸、メトロキシプロゲステロン酢酸などの内分泌 系治療薬、放射性治療、免疫治療が含まれる。

式（１）のペプチドを第二の治療剤と共に使用する際、それぞれの化合物の投薬 量は単一で用いる場合とは変化するであろう。それゆえ、式（１）のペプチドを 第二の治療剤と共に用いる場合には、それぞれの化合物の投与量は単一で用いる 場合と同じかまたは異なるものとされてよい。適切な当業者に容易に認識される であろう。

さらに別の態様によれば、本発明よって、ζ−ＰＫＣをコードするＤＮＡ　、好 ましくはζ−ＰＫＣの制御領域、に対する相補鎖オリゴヌクレオチド（アンチセ ンスオリゴヌクレオチド）およびその誘導体、またその縮重した誘導体が提供さ れる。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドはζ−ＰＫＣ，好ましくは哺乳 動物のζ−ＰＫＣ１特にヒトのζ−ＰＫＣ，のコード領域の初めの部分に対応す るｌ　５−ｓｅｒである。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの好ま しい例は、 ＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴ　（配列番号：１４）または誘導体またはその 縮重した等価物である。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸分解酵素による分解を減らすため、好 ましくは糖リン酸バックボーンがホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈ ｌｏａｔｅｓ　）に修飾されている。

本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその等価物は、以下に示す 慣用された方法で作成されてよい。

本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ζ−ＰＫＣの強力で特異的な 阻害剤であることが示され、インビトロにおける科学的な道具として有用であり 、またインビボにおいても、特に腫瘍、乾癖のような増殖異常および旧Ｖのよう なウィルスの感染のようなζ−ＰＫＣ活性が介在する病理学的な状態の治療に対 し有効である。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む適切な医薬 組成物およびその投薬については、本発明によるペプチドについて上に記した通 りである。

本発明をさらに以下に示す限定を意図しない実施例および図によって説明する。

天然体のアミノ酸に共通の三文字略記と−・文字略記、核酸残基の通常の一文字 表記を以下に用いる。

精製されたウシ脳ＰＫＣ（Ｎ＋５ｈｉｚｕｋａ　（１９８ｇ）、　５ｃｉｅｎｃ ｅ３３４．６１．）　ｌｎｇをマイクロインジェクトしまたはしていない６段階 目の卵に、緩衝液コントロール（小点のバー）または５ｗＭ　（卵に入ったとき の終濃度）の三種のペプチドの混合物、すなわちＩ）　Ｋ　Ｃアイソタイプα、 βおよびγ（ペプチドＡ、配列番号６）、δ（ペプチドＤ１配列番号７）および ε（ペプチドＥ、配列番号８）の偽基質領域に対応する三種のペプチドの混合物 （縞のバー）、または、ζ−ＰＫＣの偽基質領域に対応するペプチド（ペプチド Ｚ１配列番号５）（１ｍＭ）（黒ツバ−・りをマイクロインシュ、クトした。そ の後、卵に２５＊ＵのＢ、　ｃｅｒｅｕｓ由来Ｐ　Ｃ−Ｐ　Ｌ　Ｃまたは２０ｎ ｇの形質転換ｖ−ｔ（−ｒａｓ　ｐ２１をマイクロインジェクトするか、または 、Ｐ　Ｍ　Ａ　（１１００ｎ／ｍｌ）、インスリン（１＋ｇＭ）またプロゲステ ロン（ｌｄ）の存在下でインキュベートした。反応は刺激してから２時間後に止 め、抽出液をアガロースのビーズに結合したｐ１３ｓＵＣＩで沈殿させた後、Ｈ １キナーゼの活性を測定した。偽基質ペプチドは以下の配列を有する。

（Ａ）ＰＫＣイソタイプα、βおよびγに特異的なペプチド：　ＲＫＧＡＬＲＱ ＫＮ　（配列番号６）（Ｄ）ＰＫＣδに特異的なペプチド：　ＲＲＧ＾ＩＫＱＡ Ｋ　（配列番号７） （Ｅ）ＰＫＣε１．：特異的なペプチド：　ＲＱＧＡＶＲＩＩＩＲＶ　（配列番 号８） （Ｚ）ＰＫＣζ１．：特異的なペプチド：　ＲＲＧＡｌ？ＲＷ）？Ｋ　（配列番 号５） コントロールＨ１キナーゼ活性のレベルは７８ｒｉｏｌ／　ｗｉｎ／卵であり、 偽基質のマイクロインジェクションで影響を受けなかった。同様の他の３回の実 験でもほぼ同様の結果が得られた。

卵の抽出液は５Ｏ８−ＰＡＧＥで分離した後、電気的プロッティングを行ない、 対応するイソ酵素に特異的なペプチドの存在下、非存在下においてＰＫＣアイソ タイプα、βおよびγ（Ａ）またはζ（Ｂ）に特異的な抗体とインキュベートし た。同様の他の３回の実験でもほぼ同様の結果が得られた。

図３ ζ−ＰＫＣの自己リン酸化活性におけるペプチドＡ（配列番号６）とペプチドＺ （配列番号５）の効果卵の抽出液を、ＩＯＢの抗ζ−ＰＫＣ抗体と共にインキュ ベートし、免疫複合体をプロティンＧアガロースで回収１．５だ。免疫沈降物の ζ〜Ｐ　Ｋ、　Ｃの自己リン酸化活性を、３００ｍＭの　［ｇ−”Ｐｌ＾ＴＰ　 、５０１ｇ／ｍｌのホスファチジルセリン（Ｐ　Ｓ）の存在、非存在下で測定し た。インキュベーションは異なる濃度のペプチドＡまたはＺについて行なった（ 図１に示した）。反応は４５分で止め、タンパクを５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した 。抗体の非存在下でプロティンＧアガロースと共に卵の抽出液をインキコベー　 トした場合には、キナーゼの活性は全く検出されなかった。同様の他の３回の実 験でもほぼ同様の結果が得られた。

図４ ＲＮＡをマイクロインジェクトした卵からの抽出液中におけるζ−ＰＫＣ量のイ ムノプロット分析ζ−ＰＫＣの制御領域の断片を含むプラスミドからインビトロ で合成したセンス鎖とアンチセンス鎖のＲＮＡを６段階目の卵にマイクロインジ ェクトした。ＲＮＡまたは蒸留水をマイクロインジェクトしてから４８時間後に 、卵をホモジナイズし抽出液を５ＯＳ−ＰＡＧＥで分離後、エレクトロブロッテ ィングを行ない、ＰＫＣアイソタイプα、βおよびγ（Ａ）またはζ（Ｂ）に特 異的な抗体とインキュベートシた。同様の他の３回の実験でもほぼ同様の結果が 得られた。

（Ａ）６段階目の卵に水（白のバー）、または、２５ｎｇのセンス鎖（しま模様 のバー）もしくはアンチセンス鎖（黒のバー）合成ＲＮＡをマイクロインジェク トした。

（Ｂ）他の卵のセットに水（白のバー）、または、卵あたり１５０ｎｇのζ−Ｐ ＫＣに特異的なセンス鎖（しま模様のバー）、アンチセンス鎖（黒のバー）もし くはナンセンス鎖（小点のバー）オリゴヌクレオチドをマイクロインジェクトし た。続いて、卵に２０ｎｇの形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１または２５＊Ｕの Ｂ、　ｅｅｒｅｕｑＰＣ−ＰＬＣをマイクロインジェクトし、もしくはインスリ ン（ｌｓＭ）またはプロゲステロン（１ｍＭ）の存在下でインキュベートした。

その後、卵が５０％の卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）を示したときに、実験の手順にし たがい、抽出液中の旧キナーゼの活性測定した。結果は、同じインキュベーショ ン反応を独立に３回二重に行なった平均値士ＳＤである。

後記する標準的手順で調製した６段階目の卵にコントロールとして緩衝液とｌａ Ｍ　（卵に入ったときの終濃度）のペプチドＺＳＺｌ、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４または Ａ４　（配列番号はそれぞれ５．４．３．２．１、または９である）をマイクロ インジェクトした。その後、卵は２５ｓＵのＢ。

ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＩ、Ｃまたは２０ｎｇのｒａｓ　ｐ２１をマイクロイン ジェクトするか、もしくは、インスリン（１ｍＭ）またはプロゲステロン（１ｍ Ｍ）存在下において、卵をインキュベートシた。続いて、刺激後２時間で反応を 止め、図１の説明に示した方法で旧キナーゼの活性を測定した。コントロールの 旧キナーゼのレベルは８０℃ｍｏｌ　／１ｎ　／卵でペプチドのマイクロインジ ェクションによって影響を受けなかった。同様の他の３回の実験でもほぼ同様の 結果が得られた。

異なる濃度のペプチドＡＬＲ（配列番号９）およびＡＲＲ（配列番号１）を、血 清飢餓（２４時間）のスイス−３Ｔ３繊維芽細胞の細胞質に標識抗体とともにイ ンジェクトした。インジェクションの後直ちに、ブロモデオキシウリジンを培地 中で１０００倍希釈となるよう加え、細胞を３７℃で２０時間インキュベートし た。その後、細胞を固定化し、抗標識抗体を用いた免疫蛍光法、および、ブロモ デオキシウリジン抗体を用いた免疫化学分析を標準的手法によって行った。結果 は少なくとも３回の独立した実験による。

１０％のＦＣ８供給ＤＭＥＭ中で４Ｘ１０４／培養皿（ＢＯｓｍ）になるように 細胞を蒔いた。２４時間後、正確なブレーティングを確かめるため細胞数を数え 、培地を取り除き０，５％のＦＣＳを含むＤＭＥＭを再び与えた。細胞数は１日 おきに数えた。結果は、同じインキュベーション反応を独立に３回二重に行なっ た平均値±ＳＤである。

実験の手順 卵は次に示す標準的な手順で調製された（Ｇａｒｃｉａ　ｄｅＨｅｒｒｅｒｏｓ 　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　ｆｏｅ　ｃｌｔ、）　。簡単に述べると、アフ リカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）　（ＢｌａｄｅｓＢｌｏｌｏ ｇｌｃａｌｓ、　ＵＫ）の卵巣を２ｓｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ　ｍａｎｎｈｅｉｇ＋、　Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、カルシウムイオン（ Ｃａ２＋）の含まないＭｏｄｉｆ’　ｌｅｄ　Ｂａｒｔｈ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ ＭＢＳ）　（１１０＋＊Ｍ　ＮａＣ１，２ｓＭ　ＫＣＩ、　１．ｓＭ　ＭｇＣｌ ２．１ｓＭ　ＣａＣｌ２゜２ｗＭ　ＮａＨＣＯ３，１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７，５）中で４５分間インキュベートした。十分に洗浄した後、６段階目（ｓｔ ａｇｅ　ｌ／Ｉ）の卵が選択され２０℃で一晩インキユベートした。

ツメガエル卵のζ−ＰＫＣのクローニングアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ 　）の卵からζ−ＰＫＣホモローグのｃＤＮＡをクローニングするため、プロー ブを、ラット脳のラムダ−ＺＡＰ　ライブラリーから以下に示すオリゴヌクレオ チドを用い直接ＰＣＲ法により、ＤＮＡの断片を増幅することによって成長させ た。

５°−ＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧ＾＾ＧＧＣＧＣＡＣＴＡＣ−３’　（配列番号１０ ）５−ＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＴＴＡ−３’　（配列番号１ １）その結果、ラット脳ζ−ＰＫＣの塩基配列５２−７０８番を含む６５６塩基 対の断片が得られた（Ｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ。

＋Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６．３０９９（ １９８９）　）　、この断片をランダムブライ７−　（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｓｅ　 ＤＮＡ　ｌａｂｅｌｌｌｎｇＳｙｓｔｅｍ；　Ａｍｅｒｓｈａｓ　Ｉｎｔ、）を 用い３２Ｐで標識し、オリゴｄＴで逆転写を行い作成したアフリカッメガエル卵 のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。ハイブリダイゼーションは ５０％ホルムアミド存在下において４２℃で行ない、フィルターはｏ、ｔ　ｘｓ ｓｃ　、　ｏ、ｉ％ＳＤＳ溶液を用イ６５℃で洗浄した。陽性のシグナルを拾い ファージを精製した。挿入断片をプラスミドｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクロ ーニングを行なった。クローンはｒ■ｏｆ　（商品名）　ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃ ｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＭａｄＩｓｏｎ）を用いたＤＮＡ　シ ーフェンスにより分析した。

インビトロ転写反応 バクテリオファージＴ３またはＴ７のＲＮＡポリメラーゼを用い、１０■ｇの直 鎖状ＤＮＡを鋳型とし、ｃａｐの類似物であるＧｌ）Ｉ）Ｉ）Ｇ存在化において 、センス鎖とアンチセンス鎖のＲＮＡを合成した（ｍｃＡＰ（商品名）　５ＲＮ Ａ　ｃａｐｐｉｎｇ　Ｋｉｔ　：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ、）。

オリゴヌクレオチド アフリカッメガエルζ−ＰＫＣのコード領域の初めの部分（開始コドンから始ま る）に同じ配列または相補的な配列の１５塩基の核酸を、バックボーンにホスホ ロチオエートの修飾を入れて合成した（Ｏｐｅｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ。

ＡＩａ＊ｅｄａ、Ｃ，）。さらにコントロールとしてランダムの配列をもち意味 を持たないオリゴヌクレオチドを合成した。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓからのＰＣ−ＰＬＣの単離バチルスセレウス５ Ｅ−１菌体からのＰＣ−ＰＬＣの単離は従前の報告に従って行った（１、ａｒｒ ｏｄｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、（１０）１掲　；Ｇａｒｃｉａ　ｄｅ　Ｈｅｒｒｅｒ ｏｓ　ｅｔ　ａｌ、（１１）１掲）。そのプロトコルの後に、酵素の調製を精製 して、完全に単一のものに精製されているを５ＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色によって 確認した。

精製された酵素の比活性は１．５Ｕ／■ｇであった。

ｒａｓ　ｐ２１タンパクの調製 形質転換または通常のｒａｓ　ｐ２１タンパクは、従前の報告に従って細菌を用 いて発現させた（Ｄｏｗｉｎｇｕｅｚ　ｅｔ　ａｔ。

、ＥＭＢＯＪ、１０．３２１５（１９９１））　。精製の最終段階で２．５　Ｘ 　９０ｃｍの５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００カラムを用だゲル濾過クロマトグラ フィーを行い、精製されたタンパクを含むフラクションはプールし尿素を除くた めに大量の２０ｗＭ　Ｔｒｌｓ−４１ＣＩ　ｐＨ７，５緩衝液に対して透析を行 ない、使用するまで一７０℃で保存した。

異なったＰＫＣイソタイプのイムノプロット分析１００會ｇの全細胞タンパク量 を含むアフリカッメガエル卵の細胞抽出液を、ＳＤＳサンプルバッファーで変性 させた後、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離させた。その後、ポリビ ニリジンジフルオライド膜（Ｉｓ■ｏｂｉｌｏｎ・Ｍｉｌｌｆｐｏｒｅ　Ｃｏｎ ｔｉｎｅｎｔａｌ　Ｗａｔｅｒ　Ｓｙｓｔｅｇ＋ｓ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ ）にタンパクを電気泳動的に移した。そして膜を、ＰＫＣアイソタイプα、βお よびγ（Ａ）またはζ（Ｂ）に特異的な抗体と共に、対応するイソ酵素に特異的 なペプチドＡまたはＺ（配列番号６または５にそれぞれ対応）の存在、非存在下 においてインキュベートした。対応する抗体と共にプロットした膜をインキュベ ートした後、ＰＫ　Ｃアイソタイプα、βおよびγ（Ａ）またはζ（Ｂ）を＾ｕ ｔｏＰｒｏｂｅＴＭ　ＢＬ　ｐｌｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｗｅｒｓｈａｓ、Ｉ ｎｔ、）を用いて視覚化した。アイソタイプα、βおよびγの検出のために、γ −ＰＫＣのアミノ酸残基３８１−３９４番に対応するペプチドＩＬＫＫＤＶＶＩ ＱＤＤＤＶＥ　（配列番号１２）ニ対すル抗ヘプチド抗体を用いた。アイソタイ プζを検出するために、ζ−ＰＫＣのアミノ酸残基５７７−５９２番に対応する ペプチド（配列ＧＦＥＹ　Ｉ　ＮＰＬＬＬＳＡＥＥＳＶ、配列番号１３）を用い て作成した抗ペプチド抗体を用いた。これらの抗体はＧ　ｉ　ｖｃ。

ＢＲＬ　（Ｇａｊｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ　）より購入した。

卵成熟の分析 ２０個ずつの卵のグループを修正Ｂａｒｔｔ＋溶液中において２０℃で培養した 。そして卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）を動物極に出現した白いスポットから算定した 。いくつかの場合では、核崩壊は１０％トリクロロ酢酸固定卵を分解して決定し た（Ｇａｒｃｉａ　ｄｅ　Ｈｅｒｒｅｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）　ｌｏ ｔ、ｃｉｔ、）。

成熟促進因子ヒストン１キナーゼ分析 ２０個の卵を、２０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，０）、　１０■Ｍｂ−グリセロ ホスフェート（ｂ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）　、　５ｓＭ　ＥＧＴ Ａ、　５ｍＭＭｇＣＩ２．５０＋＊Ｍ　ＮａＦ、　２ｍＭ　ジチオスレイトール （ＤＴＴ　）　。

１０（ｌａｇ／ｍｌ　ロイペプチン（Ｉｅｕｐｅｐｔ、１ｎｅ）　、　１００ｗ Ｍフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌ ｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏ　ｒｉｄｅ）を含む緩衝液中でホモジェナイズした。

１３０００　Ｘｇ、１５分の遠心分離後、抽出液（１−２ｍｇ／アッセイ）は、 ２０５Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，０）、　５■Ｍｂ−メルカプトエタノール、 　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１００５Ｍ　［ｇ−１２Ｐ］＾ＴＰ（２−５ｄｐｓ＋ ／ｆｍｏｌ）。

０．２ｅ＋Ｍ耐熱性ｃＡＭＰ依存性プロティンキナーゼおよびＯＪＢ／ｓｌ　Ｓ Ｉｇ＊ａ　ｔｙｐｅ　ｌｌｌ−３子ウシ胸腺ヒストンを含む最終反応容積５０μ ｌ中で３０℃で１０分間分析した。反応停止後、Ｖａｌａｎ　ｐ８１ホスホセル ロース紙にスポットし、洗浄後、従前報告されている方法で定量した（Ｇａｒｃ ｉａ　ｄｅｌ（ｅｒｒｅｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１，）前掲）。い（っか の実験では、抽出液をｐ１３ｓｕｃｌが結合したアガロースビーズと共にインキ ュベートし、５Ｏ８−ＰＡＧＥで分離後、沈殿のヒストン１キナーゼの活性を決 定した（Ｄｏｍｊｎｇｕｅｚ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）前掲）。

免疫沈降と自己リン酸化の分析 卵の抽出液は１０５ｇの抗ζ−ＰＫＣ抗体と共にインキュベ−１−Ｌ、免疫複合 体をプロティンＧアガロースで回収した。免疫沈殿物の自己リン酸化活性を、３ ００ｍＭ［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ、　８０ｎＭ　Ｃａ、２＋の存在または非存在、 ５０Ｂ／ｍｌホスファチジルセリン（、ＰＳ）の存在または非存在の混合液中で 測定しまた。印きゅベーしょんはペプチドＡまたはＺ（配列番号６または５にそ れぞれ対応）の異なる濃度の存在下おいて行なった。反応を４５分で停止させ、 タンパクを５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。卵の抽出液を抗体の非存在下において プロティンＧアガロースと共４こ保温した場合には、キナーゼの活性は検出され なかった。同様の結果が３つの独立した実験から得られた。

例１ Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｇ　（ペプチドＺ４）（配列番号１）例２ Ａｌａ−＾ｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（ペプチドｚ３）（配列番号２）例３ Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（ペプチドＺ２）（配列番号３）例４ Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ（ペプチドＺ１）（配列番号 ４）例５ ＾ｒｇ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｇ−Ｔ　ｒｐ− ＾ｒｇ−Ｌｙｓ（ペプチド２）（配列番号５） 例１から６のペプチド（配列番号ｌから５と１７にそれぞれ対応）はすべてメリ フィールドの固相化法によって合成され、アミノ酸分析と逆相のＨＰＬＣによっ て分析された。すべてのペプチドは構造から予測されるアミノ酸配列を持ち、少 なくとも９５％の精製度が得られた（逆相のＨＰＬＣで単一のピークとしてえら れた）。ペプチドの濃度はアミノ酸分析データから算出された。

例７ アフリカッメガエルの卵とウシの脳のＰＫＣ活性アフリカッメガエルの卵を用い た実験によって、異なる刺激または阻害剤のマイクロインジェクションに反応し て生じた細胞***シグナルにおける様々な酵素活性の役割を探ることができる。

アフリカッメガエルの卵成熟における　ＰＫＣの機能的な重要性を知るため・に 、我々はまず、古典的なＰＫＣ亜種の非常に良く知られた活性化剤であるホルボ ールミリステート酢酸（ＰＭＡ　／　ｐｈｏｒｂｏｌｓｙｒｉｓｔａｔｅ　ａｃ ｅｔａｔｅ　）　（Ｙ、Ｎ１５ｈｉｚｕｋａ、（１９８ｇ）　ｆｏｅ、　ｃｉｔ 、）が、卵において成熟促進因子であるヒストンｌキナーゼ（Ｈｌ−ｋｉｎａｓ ｅ）を活性化するかどうかを調べた（　Ｇａｒｃｌａｄｅ　Ｈｅｒｒｅｒｏｓ　 ｅｔ　ａｌ、、（１９９１）、Ｉｏｃ、　ｃｉｔ、）　ｏ図１の結果から明らか に２００ｎｇ／ｌまでのＰＭＡの添加は、形質転換Ｖ−）１−ｒａｓ　ｐ２１ま たはに活性化されたＢ、ｃｅｒｅｕｓからのＰＣ−Ｐｌ、Ｃのマイクロインジェ クションによって活性化されたものと比較して、旧キナーゼの非常に弱い活性化 をもたらした（Ｌａｒｒｏｄｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０）、ｆｏｅ、　ｃ ｌｔ　；　Ｇａｒｃｌａ　ｄｅＨｅｒｒｅｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）、 Ｉｏｃ、ｃｊｔ、）　ｏ　これらの結果より、ＰＭＡ感受性ＰＸＣの活性がアフ リカッメガエルの卵には豊富に存在せず、もし存在したとしても旧キナーゼの活 性に直接的に関与はしていないと理解される。

それゆえ、ＰＫＣの活性はアフリカッメガエルの卵の抽出物を用いて分析した。

表１の結果はＰＫＣの活性は卵の抽出液で明らかに検出できることを示している が、しかしながらそのレベルは、例えばウシの脳のような他の組織と比較して非 常に低い（表１のペプチド−無添加）。

表　１ アフリカッメガエル卵とウシの脳の抽出液のプロティンキナーゼＣの活性 ６段階目（ｓｔａｇｅ　Ｖｌ）の卵とウシの脳を、２０５Ｍ　Ｔｒｌｓ−）ＩＣ １，ｐＨ７，４，５ｍＭ　ｂ−メルカプトエタノール、　０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ 、　２ｍＭＥＤＴ＾、１０μＭ　ＰＭＳＦ、　１０　μｇ／ｍｌ　ロイペプチン 。

１％トライトンｘ−ｉｏｏを含む溶液中でホモゲナイズした。

４５分間氷上で静置後、抽出液を３０分間１００．０００　Ｘｇで遠心分離した のち、ＰＫＣをＮ１５ｈｌｚｕｋａ　（１９８Ｂ）　ｌｏｃ、ｃｉｔ、によって 示された方法にしたがって精製した。プロティンキナーゼＣの活性は、リン酸の 受容体としてミニリン塩基性タンパクを用い、５−１０−ｇの異なったタンパク 量の抽出液で測定した。インキュベーションはＣａ””　（１００ｍＭ）の存在 下で、１００μｇ／ｍｌのホスファチジルセリン（ＰＳ）とＰＭＡ（５μｇ／ｌ ）の存在下、または非存在下で行なった。

ＰＫＣアイソタイプα、βおよびγに対応するペプチドＡ（配列番号６）、ζに 対応するペプチドＤ（配列番号７）およびεに対応するペプチドＥ　（配列番号 ８）の混合液を終濃度で５ｍＭになるようにいくつかのチューブに加えた。結果 は、同じ反応を二重に独立して３回行なった平均値±ＳＤである。

我々は次に、卵において、ＰＭＡによって旧キナーゼの活性化がおこるＰＫＣに 依存した経路の再構成を試みた。

従ってすでに確立されたプロトコルにしたがいウシの脳からＰＫＣを部分精製し 、アフリカッメガエルの卵にマイクロインジェクトした。これによって旧キナー ゼの活性に何の効果も見られなかったが、ＰＫＣをマイクロインジェクトした卵 をＩＱＯｎｇ／ｍｌのＰＭＡと共にインキュベーションしたところ、旧キナーゼ を著しく活性化させた。すなわち、精製されたＰＫＣをマイクロインジェクトす ることによって卵成熟に関与する少なくともいくつかのパラメーターが活性化さ れ、障＾に活性化されるＰＫＣ依存経路の再構成が可能である。したがって、ウ シ脳のＰＫＣの供給がなければ、ＰＭＡ−ＰＫＣ依存の経路が卵成熟において決 定的な役割を担ってはいないことは明らかとならなかった。

いくつかのキナーゼは偽基質領域と呼ばれる自己阻害領域を持っている（Ｓｏｄ ｅｒｌｌｎｇ、　１９９０．　ｆｏｅ、　ｃｌｔ、）　ｏ我々はアフリカッメガ エルの卵を用い、それぞれのＰｌ［Ｃに特異的な偽基質領域のペプチドをマイク ロインジェクトすることによって、細胞***シグナルの伝達における異なったＰ ＫＣアイソタイプの役割を探ることができるかも知れないと考えた。ＰＫＣアイ ソタイプが卵に存在することを考慮して、ペプチドＡ、Ｄ、Ｅおよび２を合成し た。ペプチドＡ　（配列番号６）はＰＫＣアイソタイプα、βおよびγに保存さ れた偽基質領域の配列を持っており、それゆえこれらのＰＫＣに対する阻害剤と して候補になりうる（Ｏｓａｄａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、ｅｈｅｍ、 　２６５．２２４３４　（１９９０）　）。

ペプチドＤ、Ｅおよび２　（それぞれ配列番号７．８および５に対応）はアイソ タイプδ、εおよびこの偽基質領域と同じ配列をそれぞれ持っており、そしてそ れらはＰＫＣアイソタイプα、βまたはγの配列とはかなり異なっている（Ｏｓ ａｄａ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０）！ｏｃ、ａｌｔ、図１の説明を見よ）それゆ え、ＰＫＣアイソタイプα、β、γ、δおよびεの良い阻害剤であると考えられ ている保存された偽基質領域に対応する３種のペプチドの混合液を卵にマイクロ インジェクトしたのち、２５ｍＵのＢ、　ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣまたは２ ０ｎｇの形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１をマイクロインジェクトし、もしくは 、インスリン（１ｓＭ）またはプロゲステロン（１１Ｍ）と共にインキュベート した。対照実験としてウシの脳由来ＰＫＣをマイクロインジェクトしインキュベ ートした後、１１００ｎ　／−１のＰＭＡを加えた。図１の結果から、Ｉ’ＫＣ のマイクロインジェクトされた卵にＰＭＡを加えることによりその機能的パラメ ーターの活性化を完全に阻害したにもかかオ）らず、明らかに偽基質ペプチドＡ 、Ｄ、Ｅ　（配列番号Ｂ、７．８　）は、プロゲステロン、インスリン、形質転 換ｖ−Ｈ−ｒａｓ、　Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣのＨｌキナーゼに対する 活性化に影響を及ぼさないことを示している。

注意すべき点はウシ脳とアフリカッメガエル卵のインビトロのアッセイ系におい て、偽基質ペプチドの混合液は完全にＰＫＣの活性を阻害したことである（表１ ）。これらすべてのデータから上に挙げたＰＫＣアイソタイプは、インスリン／ 　ｒａｓ　Ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＯによる成熟シグナルの伝達に関与していな いことが強く示唆された。

これまでに示された結果は、継続的な線維芽細胞のホルボールエステルへの暴露 によるＰＭＡ感受性ＰＫＣアイソタイプの下方制御（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔ ｉｏｎ　）は、ｒａｓ　ｐ２１／　ＰＣ−ＰＬＣに対するシグナル応答に影響し ない（Ｐ。

Ｌａｒｒｏｄｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、（１９９０シロｏｃ、ｃｉｔ、；　Ｍ、Ｔ 、Ｄｌａｓ−Ｍｅｃ。

ｅｔ　ａｌ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２ＢＢ、２２５９７（１９９１）　） という過去に示された実験結果と一致する。アフリカッメガエルの卵に存在する 他のＰＫＣアイソタイプ、すなわちζ−ＰＫＣ。

の中で一つの重要な性質はＰＭＡに対する感受性を欠いているということである （Ｙ、　Ｏｎａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｂ１．ｏｌ、　Ｃｈｅｗ。

２８３．８９２７（１９８Ｂ）　ａｎｄ　Ｙ、　Ｏｎａ　ｅｔ　ａｌ、、　（１ ９８９）　ｌｏｃ、ｃｉ’ｔ、　）。それゆえ、アフリカッメガエルの卵成熟に おいてＰＫＣアイソタイプが何らかの役割を演じるとすれば、アイソタイプζは よい候補であると思われる。

ζ−ＰＫＣに関するこの仮説を実証するため、我々はまずアフリカッメガエルか らζ−ＰＫＣのホモローブのｃＤＮＡをクローニングした。この目的のために、 我々はアフリカッメガエルの卵から作成したｃＤＮ＾ライブラリーを利用し、ラ ットの脳のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法で増幅した６５６塩基対のＤＮＡ 断片をプローブとし、そして適当なプライマーを用いた。このプローブはシステ ィン残基に富む領域を含むこの酵素の制御領域を包んでいる。

このクローンの塩基配列から、アフリカッメガエルのζ−ＰＫＣはアミノ酸のレ ベルでラット脳の同族体と　９２％の相同性を持つことが明らかになった。シス ティンに富む領域、ＡＴＰ結合領域を含めてこの酵素の重要な特徴は、すべて完 全に保存されていた。興味深いことに偽基質領域に対応する配列はアミノ酸のレ ベルで、ラット脳の同族体と１００％の相同性が見られた。

結局、ζｎ　Ｐ　Ｋ　Ｃと名付けられた新しいＰＫＣのイソ酵素は、ラット脳の 同じ６５６塩基対の断片を用いて、アフリカッメガエルの卵より単離された。こ の酵素はラット脳のζ−ＰＫＣ同族体と非常に類似しているが別個のものである 。そしてζ−ＰＫＣと非常に高い相同性を持ち（ラット脳の同族体とアミノ酸の レベルで７３％の相同性を持っている）全体の構造が良く似ている。偽基質領域 はアフリカッメガエルのζ−ＰＫＣおよびζｎＰＫＣおよびラット脳ζ−ＰＫＣ 間で完全に保存されている。

ＰＫＣアイソタイプこの偽基質領域と同一の配列（配列番号５）を持つ合成ペプ チドをマイクロインジェクトされた卵は、プロゲステロンの添加に対し反応した が、インスリン、ｒａｓ　Ｐ２１またはＰＣ−ＰＬＣによる刺激に対し反応しな いことが、図１の結果から証明される。ＰＫＣをマイクロインジェクトされた卵 において旧キナーゼを刺激するＰＭＡの能力は、このペプチドを加えることによ って影響されなかった。このことからインスリン／　ｒａｓ　Ｐ２１／　ＰＣ− ＰＬＯに応答する細胞***シグナルの伝達において、ζ−ＰＫＣは特異的なさら に重要な過程を担っていることが強く指示される。プロゲステロンによって活性 化される成熟過程にこのペプチドが関与しないという事実は、インスリンが関与 する経路のへの影響という特異性に対する良いコントロールである。

アフリカッメガエルの６段階目の卵にどのタイプの特異的ＰＫＣアイソタイプが 存在するかを決定するため、それぞれのＰＫＣアイソタイプに特異的な抗体を用 い、卵の抽出液のイムノプロットを行なった。アイソタイプα、βおよびγに特 異的な抗体を用いたイムノブロッティングにより、卵の抽出液中に８０ｋＤａの バンドが検出されたことを図２　（パネルＡ）の結果は示している。同様に、ζ −ＰＫＣに特異的な抗体を用いたイムノブロッティングから、明らかに約８５ｋ Ｄａの分子量のバンドが検出された（図２、パネルＢ）。このサイズはラット脳 のｃＤＮＡの塩基配列データ（Ｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．Ｉｏｃ、ｃ ｉｔ、　）とアフリカッメガエルの卵（例９を見よ）からのデータに一致する。

これらのバンドはイソ酵素に特異的なペプチドが抗体をブロックすることにより 、特異的に消去された（図２、＋ペプチド）。アイソタイプζおよびεのみにそ れぞれ特異的な抗体を用い、卵の抽出液のイムノブロッティングを行なったとこ ろ、これらの抗体はラット脳の抽出液を用いた場合は対応するＰＫＣアイソタイ プが検出されたが、卵の抽出液では検出されなかった（データは示していない） 。

実際にペプチド２　（配列番号５）がζ−ＰＫＣの活性をブロックするかどうか を決めるため、以下の実験を行なった。卵の抽出液を特異的な抗ζ−ＰＫＣ抗体 を用い、上に記した方法で免疫沈降を行なった。そしてプロティンＧアガロース で回収した免疫複合体のζ−ＰＫＣの自己リン酸化活性を測定した。図３の結果 から、ホスファチジルセリンの存在下において免疫複合体をインキュベート【ま た時に、ζ−ＰＫＣの劇的な自己リン酸化が確認された。興味深いことに、０． １μＭという少ない濃度のペプチドＺ　（配列番号５）により、ζ−ＰＫＣの自 己リン酸化が完全に阻害された（図３）。同様のレベルのこの活性の阻害が、ペ プチドＺ　（配列番号５）の２０倍の濃度のペプチド＾　（配列番号６）で検出 された。これらの結果からペプチドＺ　（配列番号５）によるζ−ＰＫＣの阻害 は確かに特異的であることが示された。

１旦 卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）の阻害 アフリカッメガエル卵ではＨ１キナーゼの活性化が卵成熟の制御に重要であるた め、おそらくは、ペプチドＺ（配列番号５）をマイクロインジェクションするこ とにより、プロゲステロンではなくインスリン経路の刺激に応答して卵核胞崩壊 （ＧＶＢＤ）が阻害される。表２の結果は実際にこのことが事実であることを示 している。

従って、形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１やまたはＢ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−Ｐ ＬＣをマイクロインジェクションすることにより、インスリンまたはプロゲステ ロンの添加による場合と同等に強力な卵成熟の応答が促進される。精製されたウ シ脳のＰＫＣを前もって卵にマイクロインジェクトしなければ、ＰＭＡのみの添 加で卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）は誘発しない。これは旧キナーゼのデータと一致す る。ペプチドＡ　（配列番号Ｂ）をマイクロインジェクションすることにより、 ＰＫＣをマイクロインジェクトされた卵においてＰＭＡに誘発される卵成熟が阻 害されたことは注目すべき点であるが、しかし、インスリン／　ｒａｓ　ｐ２１ 　／　ＰＣ−ＰＬＯまたはプロゲステロンに対しては卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）の 誘発の効果は、はんのわずかかあるいは全く見られなかった。興味深いことに、 ペプチドＺ　（配列番号５）のマイクロインジェクションは、形質転換ｖ−Ｈ− ｒａｓ　ｐ２１．　Ｂ、ｃｅｒｅｕｓＰＣ−ＰＬＣのマイクロインジェクション あるいはインスリンの添加に対して、卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）を完全に阻害した 。

プロゲステロンまたはＰＫＣをマイクロインジェクトされた卵のＰＭＡに応答し て誘発される卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）は、ペプチドＺ　（配列番号５）のマイク ロインジェクションによって影響を受けないことは注目すべき点である。

表　２ アフリカッメガエル卵の成熟における偽基質ペプチドＡとＺ　（配列番号はそれ ぞれ６と５）の効果２０個ずつの卵のグループを修正Ｂａｒｔｈ　溶液中におい て２０℃でインキュベートし、卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）を動物極に出現した白い スポットから算定した。いくつかの場合では、核崩壊は１０％トリクロロ酢酸固 定化卵を分解して決定した。卵には対照として緩衝液またはｌｏｇの精製したウ シのＰＫＣをマイクロインジェクトした。その後、対応する卵に水またはペプチ ド＾が２　（終濃度で５ｍＭになるよう卵に加える）をそれぞれマイクロインジ ェクトした。ソノ後、卵をＰＭＡ　（１１００ｎ／ｓｌ）　、インスリン（１１ Ｍ）またはプロゲステロン（ｌｓＭ）存在下でインキュベートするか、形質転換 ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２ｆ　（２０ｎｇ）またはＢ。

ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣ（２５１ＩＵ）をマイクロインジェクトし、卵核胞 崩壊（ＧＶＢＤ）を６時間後に決定した。結果は、同じ実験を繰り返し　３回独 立に行なった平均値±ＳＤである。

乳す アフリカッメガエル卵の成熟促進因子Ｈ１キナーゼ活性化におけるζ−ＰＫＣに 対するアンチセンスＲＮＡの効果卵成熟におけるζ−ＰＫＣの重要性をさらに示 すため、塩基配列で−１０から＋６００を含むζ−ＰＫＣの制御領域のＤＮＡ断 片をｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングをした。センス鎖とアンチセン ス鎖のＩ？ＮＡをそのプラスミドがらインビトロで合成し、６段階目の卵にマイ クロインジェクトＬ７た。マイクロインジェクトしたのち異なった時間に、卵を 抽出し、イムノブロッティングにより異なるＰＫＣアイソタイプの存在量を測定 し７た。図４の結果がら、２５ｎｇのζ−ＰＫＣに対するアンチセンスＲＮ＾を マイクロインジェクトしたのち４８時間後に、このタンパクの相当な減少が確認 されが、アイソタイプα、βおよびγに特異的な抗体を用い免疫反応したバンド には、影響を与えなかった。それゆえ、この方法論を用いて我々は卵におけるζ −ＰＫＣを特異的に消去することに成功した。水または対照としてセンス鎖のＲ ＮＡをマイクロインジェクトした場合は、いずれのＰＫＣアイソタイプに対し何 の影響も与えなかった（図４）。

従って、ζ−ＰＫＣに対するセンス鎖、アンチセンス鎖のＲＮＡと共に４８時間 インキュベートした卵に、２５μＵのＢ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣ、または ２０ｎｇの形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓｐ２１をマイクロインジェクトするか、また は、インスリン（１μＭ）かプロゲステロン（ｌμＭ）と共に保温した。図５Ａ の結果から、ζ−ＰＫＣの消去した卵は、プロゲステロンの添加に対して完全に 応答するのに対し、インスリン、ｒａｓ　ｐ２１　ｓまたはＰＣ−ＰＬＯの刺激 に対して効果的には応答しないことが明らかになった。この結果は、ζ−ＰＫＣ がインスリン／　ｒａｓ　ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＣに応答する成熟シグナル伝 達において、特異的で重要な役割を果たしていることを強く示している。プロゲ ステロンに活性化される成熟過程がζ−ＰＫＣの消去により影響を受けないとい う事実は、インスリン経路におけるこの効果の特異性に対する良いコントロール となる。水またはセンス鎖のＲＮＡをマイクロインジェクトしたコントロールの 卵には、同時に形質転換Ｖ−Ｈ−ｒａｓ　またはＰＣ−ＰＬＣをマイクロインジ ェクトし、もしくは、インスリンまたはプロゲステロン存在化でインキュベート した（図５Ａ）。水またはζ−ＰＫＣのセンス鎖ＲＮＡをマイクロインジェクト した場合には、これらの分子のＩ１１キナーゼを活性化するは能力には影響を与 えなかった。

小さいアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、卵においてタンパクの発現阻 害に利用可能な方法である（Ｓｕｓｉｋａｗａ　ａｎｄ　Ｍ目ｅｄｌ、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃ１．ｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ８５、１３０２（１９８８））。そ れゆえ、卵におけるζ−ＰＫＣを消去する独立した方法として、我々はζ−ＰＫ Ｃの開始コドンから始まる１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、対応 するセンス鎖と対照としてナンセンス鎖（意味を持たない配列）と共に合成した 。核酸分解酵素による消化を防ぐために、オリゴヌクレオチドのバックボーンを ホスホロチオエートに修飾した（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８７）、８４（２１） 、７７０６；Ａｇｒａｖａｌ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃｌｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ（１，９８８）、１ｉ５（１９）、７０７９）　 、　ｆ５０ｎｇのセンス鎖（配列番号１５）、アンチセンス鎖（配列番号１４） 、およびナンセンスオリゴヌクレオチドを卵にマイクロインジェクトした。アン チセンスオリゴヌクレオチドをマイクロインジェクトした卵の抽出液をウェスタ ンプロットしたところζ−ＰＫＣの相当な減少が確認された。他のＲＫＣアイソ タイプに対しては全く影響を及ぼさなかった（データは示していない）。センス 鎖、ナンセンス鎖オリゴヌクレオチドのマイクロインジェクションでは、卵中の どのＰＫＣアイソタイプの存在量にも影響を与えなかった。それゆえ、卵に２５ μＵのＢ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣまたは２０ｎｇの形質転換ｖ−Ｈ−ｒａ ｓ　ｐ２１をマイクロインジェクトするか、またはインスリン（１μＭ）または プロゲステロン（１μＭ）存在下でインキュベートした。図５Ｂの結果から、ζ −ＰＫＣを減少させた卵はプロゲステロンの添加に対しては通常の応答を示した が、インスリン、ｒａｓ　ｐ２１またはＰＣ−ＰＬＣに対しては応答力が大きく 減少した。センス鎖、ナンセンス鎖オリゴヌクレオチドのマイクロインジェクシ ョンは、この研究で試されたあらゆる刺激に対する旧キナーゼの活性に影響を及 ぼさなかった。

アフリカッメガエルの卵におけるζ−ＰＫＣの減少は、プロゲステロンではなく インスリン／　ｒａｓ　ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＣに応答して生じる卵核胞崩壊 に対する阻害を引き起こすと考えられる。表３の結果はこのことが事実であるこ とを示している。

それゆえ、形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１またはＢ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−Ｐ ＬＣのマイクロインジェクションは、インスリンまたはプロゲステロンの添加よ り生じるものと類似の強い成熟応答を引き起こす。興味深いことに、アンチセン スＲＮＡのマイクロインジェクションによるζ−ＰＫＣの減少は、形質転換ｖ− Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１、Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣのマイクロインジェクシ ョン、または、インスリンの添加により誘導される卵核胞崩壊を劇的に阻害した 。この効果の特異性の好ましいコントロールは、プロゲステロンに応答して誘導 された卵核胞崩壊はζ−ＰＫＣの減少により影響されないことである。

コントロールと、アンチセンスＲＮＡのマイクロインジェクションによりζ’− ＰＫＣを減少させた卵２０個ずつの両方のグループを、修正Ｂａｒｔｈ溶液中で インキュベートし、異なる処理をした後、動物極に生じた白いスポットから卵核 胞崩壊（ＧＶＢＤ）を算定した。いくつかの場合では、１０％トリクロロ酢酸固 定化卵を分解することで核崩壊を決定した。卵は、ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｉ＞ 　、インスリン（１１Ｍ）、またはプロゲステロン（１ｓＭ）の存在下でインキ ュベートし、または形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１　（２０ｎｇ）Ｂ、ｃｅｒ ｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣ（２５μＵ　）をマイクロインジェクトしたのち、６時間 後誘導された卵核胞崩壊を決定した。結果は、同じ実験を繰り返し３回独立に行 なった平均値上ＳＤである。ＮＤは実験を行なっていないことを示す。

このキナーゼに対する可能性ある阻害剤の合理的な設計のために、異なるＰＫＣ の偽基質領域のアミノ酸配列の比較を行なった。図６から、これらの配列の始め の３アミノ酸が最も保存されていることが明らかである。それゆえ、この部分は 可能性あるペプチド阻害剤の特異性に寄与しないと思われる。したがって、我々 は始めの３アミノ酸を欠いたペプチドＺｌ　（配列番号４）を合成し、旧キナー ゼに対する印書の能力を試験した。図７の結果がらアフリカッメガエルの卵への Ｚｌ　（配列番号４）のマイクロインジェクションは、完全長の偽基質２（配列 番号５）による阻害の程度と同程度に旧キナーゼの活性化をブロックしｌ二。

さらにＺｌ　（配列番号４）のＣ端を削った偽基質ベブヂドＺ２．　Ｚ３および Ｚ４　（配列番号はそれぞれ３，２．１　）を合成した（図６）。興味深いこと に、Ａ）ＩＲ（Ｚ４．配列番号ｌ）の配列を持つトリペプチドでさえも旧キナー ゼの活性化を阻害した。特異性のコントロールとしてトリペプチドＡＬＲ（Ａ４ ．図６）（配列番号９）を合成した。このペプチドはＰＫＣアイソタイプα、β およびγに特異的な偽基質Ａの欠落させた配列を持つ（図６参照）。図７の結果 は、ペプチドＡ４　（配列番号９）のマイクロインジェクションは旧キナーゼの 活性化に影響を与えないことがわかる。

ζ−ＰＫＣの偽基質領域の配列を含むペプチドの哺乳動物の体細胞の成長を阻害 する能力に関する問題を扱うために、以下の実験を行なった。

１０％のウシ胎児血清の存在下で成長しているマウス線維芽細胞Ｎ１）１３Ｔ３ にペプチドＺｌ　（配列番号５）をマイクロインジェクトし、ＤＮＡ合成を表４ の説明に示したように測定した。コントロールとして、ＰＫＣアイソタイプα、 βおよびγの偽基質領域に対応する９アミノ酸残基のペプチドＡ　（配列番号６ ）も同様にマイクロインジェクトした。表４の結果、ペプチドｚｌ（配列番号５ ）のマイクロインジェクションにより、増殖する線維芽細胞Ｎ！Ｈ３Ｔ３のＤＮ Ａ合成が劇的に阻害されていることがわかる。一方、ペプチド＾　（配列番号６ ）は、多少あるいは全く影響をり、えていなかった。

血清を供給してから８から１０時間後（９期から始めて）の線維芽細胞ＮＩＨ３ Ｔ３の細胞質に標識抗体と共にペプチドＡか２　（配列番号はそれぞれ６，５） をマイクロインジェクトした。マイクロインジェクションし、た後直に、チミジ ンの類似体であるブロモデオキシウリジン（Ａｗｅｒｓｈａ■ｊｎｔｅｒｎａｔ ｌｏｎａｌ）を培地に１０００倍希釈になるように加え、細胞を３７℃で２４時 間培養した。細胞を固定し、通常の操作の後、抗標識抗体を用いた免疫蛍光法ま たはブロモデオキシウリジンの取り込みの免疫化学的な検出法を行なった。他の ２回の実験も同じもしくは似たような結果であった。

１０％のウシ胎児血清存在下に成育している線維芽細胞スイス−３Ｔ３に異なる ペプチドをマイクロインジェクトした。マイクロインジェクションの２４時間前 に血清飢餓状態にし細胞を同調させた。そしてＤＮＡ合成を表５の説明に示した 方法で測定した。

表５の結果から、ζ−ＰＫＣの偽基質領域の配列を基にしたペプチドのマイクロ インジェクションは、血清に刺激された線維芽細胞スイス−３Ｔ３のＤＮＡ合成 を劇的に阻害し、ＰＫＣアイソタイプα、βおよびγの偽基質領域に対応するペ プチドの場合は、ＤＮＡ合成をほとんど阻害【２なかつたことがわかる。

トリペプチドＡＬＩ？　（配列番号９）とＡＡＲ（配列番号１）の量に依存した カーブが図８に示されている。これらの結果は、少なくとも８０％の線維芽細胞 スイス−３Ｔ３のＤＮＡ合成が、用いた条件下において１−２μＮという少量の ペプチドＡＩ？Ｒ（配列番号１）に阻害されたことを示している。反対に、ペプ チドＡＬＲ（配列番号９）の場合は、１０倍高い濃度（１６μＭ）でせいぜい５ ０％の細胞のＤＮＡ合成が阻害されたにすぎない。このことは本発明によるペプ チドが強力で敏感な阻害の性質を持っていることを証明している。

血清飢餓（２４時間）にしだ線維芽細胞スイス−３Ｔ３　（Ｇ１期から始めて） の細胞質に標識抗体と共に、異なるペプチドをマイクロインジェクトした。マイ クロインジェクト後すぐに、ブロモデオキシウリジンを培地中に　１０００倍希 釈になるように加え、細胞を３８℃で２０時間培養した。

その後細胞を固定し、通常の操作を行なった後、抗標識抗体を用いた免疫蛍光法 および抗ブロモデオキシウリジン抗体を用いた免疫化学的分析を行なった。結果 は少なくとも独立に行なった３回の実験と同じであり、それを代表するものであ る。

Ｘ：マイクロインジェクションピペット内のペプチドの濃度は８μＮであった。

ひとたび分子が細胞に入ると２０から５０倍に希釈される。

１０％のウシ胎児血清存在下で成育しているヒト請内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）に 異なるペプチドをマイクロインジェクトした。細胞はマイクロインジェクション の２４時間前に血清飢餓の状態にすることにより同調させており、ＤＮＡ合成を 表６に示した方法で測定した。

表６の結果は例１８の結果を裏付けている。

表　６ Ｙ：マイクロインジェクションピペット内のペプチドの濃度は８μＸであった。

ひとたび分子が細胞に入ると２０から５０倍に希釈される。

血清飢餓（２４時間）にしたヒト慶内皮細胞（Ｇ１期から始めて）の細胞質に指 標抗体と共に、異なるペプチドをマイクロインジェクトした。マイクロインジェ クト後すぐに、ブロモデオキシウリジンを培地中に１０００倍希釈になるように 加え、細胞を３７℃で２０時間培養した。その後細胞を固定し、通常の操作を行 なった後、抗指標抗体を用いた免疫蛍光法および抗ブロモデオキシウリジン抗体 を用いた免疫化学的分析を行なった。結果は、少なくとも独立に行なった３回の 実験と同じであり、それらを代表するものである。

ζ−ＰＫＣの高発現による線維芽細胞Ｎｌｌｌ３Ｔ３の細胞系統の成育性質を決 定した。ζ−ＰＫＣのｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターの強力な転写プロモータ ーの支配下にサブクローニングしくｐＲｃｃＭＶ−１ｎｖｆｔｒｏｇｅｎ、　Ｕ ＳＡ）　、ｒａｓで形質転換した細胞系統を正のコントロールとしまた対応する 負のコントロールを用い、低濃度の血清（０，５％ＰＣ８）存在下においてζ− ＰＫＣの高発現クローン（ｐＲｃｃＭＶｚ４およびｐＲｃｃＭＶｚ６）の***速 度を比較した。図９の結果から、ｐＲｃｃＭＶｚ４およびｐＲｃｃＭＶｚ６のク ローンは、０．５％の血清存在下においてｒａｓで形質転換した細胞系統と同様 に劇的な***速度の上昇を示した。このことはζ−ＰＫＣを高発現させると細胞 増殖の際に***促進因子要求性が減少することを示している。さらに、表７のデ ータによるとコントロールと比較して形質転換体は、細胞が倍になる時間が短く なり増殖飽和濃度が上昇する。

表　７ ζ−ＰＫＣを高発現させた細胞の増殖性１０％のＰＣ８（ウシ胎児性血清）を供 給したＤＭＥＭ中で４×１０４個の細胞を培養皿（３５ｍ５）にまき、単層にお ける増殖を測定した。培地は１日おきに交換した。２日おきに細胞数を数えるこ とにより倍化時間を測定した。飽和濃度は細胞が集密化したのち７日後の細胞数 である。結果は、同じ実験を繰り返し３回独立に行なった平均値比ＳＤである。

これらの結果からζ−ＰＫＣの単なる高発現はいくつかの形質を変化させた。こ のことは、この酵素が細胞***のシグナル伝達において重要な役割を担っている という考えと一致する。

例２１ ζ−ＰＫＣの活性を決める感度の高い自己リン酸化分析は、従来の組換えＤＮＡ 技術を用いてラット脳ζ−ＰＫＣの制御領域を欠失させることにより行った。そ のようにして得られた永続的に活性化されたζ−ＰＫＣ変異体のｃＤＮＡは、組 換え融合タンパク（ＭＢＰ−ｚＰＫｃｄｅｌ）を得るためにプラスミドＰＭＡＬ ｃ２にサブクローニングした。このプラスミドを有する菌体を誘導し、発現した タンパクをアミロース−セファロースカラムのアフィニティークロマトグラフィ ーで精製した。ζ−プロティンキナーゼＣの活性はリン酸の受容体としてミニリ ン塩基性タンパクを用い上記した方法で決定した。典型的な活性測定の条件は最 終的に反応容量４０μｌで以下の組成である。

２μｍの酵素、緩衝液（終濃度で、５０５Ｍ　ＨＥＰＥＳ、　１０５ＭＭｇＣＩ ２．　ＣａＣｌ２１ｍＭ、　ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＡＴＰ　１０５Ｍ　）　、１　 μｃｉの［ａ−３２ＰＩＡＴＰ　、２ｍｇのミニリン塩基性タンパク、可能性あ る阻害剤、例えば１μＮのペプチド。３０℃でインキュベーションを行ない、例 えば１０分後にＳＯＳサンプルバッファー中で煮沸させることにより反応を止め 、例えば５ＤＳ−ＰＡＧＥ等でサンプルを分画した。ゲルは乾燥し２日間感光さ せた。

リン酸化されたタンパクに対応するスポットはレーザー走査型濃度計で定量化し た。

永続的に活性化されたζ−ＰＫＣの測定は少なくとも天然のζ−ＰＫＣを用いた 前述の自己リン酸化活性測定よりも感度が少なくとも１０倍高い。

３回の独立した実験の代表的な結果は表８に示される通りである。

ここで示されたすべての結果から、ＰＫＣイソ酵素α、βおよびγは、インスリ ン／　ｒａｓ　ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＯによって活性化される成熟経路には関 与しないことは明らかである。６段階目の卵に検出できる量のδまたはεＰＫＣ が存在しないことから、それらについても関与していないことが明らかである。

これらのデータは、卵のｃＤＮＡライブラリーをアイソタイプδまたはεに特異 的なプローブでζ−ＰＫＣのホモローブのスクリーニングを行ったところ、アフ リカッメガエルの卵においてこれらのアイソタイプが完全に欠失していることが 明らかになったという事実と一致する。さらに、ＰＫＣ亜種亜種上びεに対応す る偽基質ペプチド阻害剤をマイクロインジェクトした場合に、この研究で示した あらゆる刺激に対して反応する成熟および旧キナーゼの活性化にほんのわずか影 響するかまたは全く影響を及ぼさなかった。興味深いことに、これらのアイソタ イプはすべてＰＭＡによって活性化され、そして継続的なホルボールエステルへ の暴露によって活性が減少制御される（　Ｎ１５ｈｌｚｕｋａ、　１９８８；Ｏ ｎｏ　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８９１０ｅ、Ｃ１ｔ　）　Ｏ線維芽細胞の長期的な ＰＭＡへの暴露によるＰＫＣの活性減少は、ＰＣ−ＰＬＯのＤＮＡ合成を誘導す る能力（Ｌａｒｒｏｄｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０））とまたはｒａｓ　ｐ ２１　／　ＰＣ−ＰＬＣがストロメリシン遺伝子の発現を活性化する能力（Ｄｉ ａｓ−Ｍｅｃｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）ｔｏｅ　ｃｌｔ　）に影響を与えな いという我々の最近の結果と、ここで示したデータと一致する。

それゆえ、ラット脳から部分精製したＰＫＣを前もってマイクロインジェクトし なければ、ＰＭＡはアフリカッメガエルの卵成熟を促進しないことがここで示さ れた。

ＰＫＣ調製におけるイムノプロット分析により、アイソタイプα、βおよびγに 特異的な抗体とδおよびεアイソタイプに特異的な抗体によってそれぞれのバン ドが明らかとなった。それゆえ、これらの条件の下でＰＭＡの成熟を誘導する能 力は、ＰＫＣアイソタイプα＋β＋γの過剰な投入とまたは通常アフリカッメガ エルの卵には存在しないアイソタイプδおよびεの存在に依存するのであろう。

ＰＫＣ種の中で距離的に関連のある新しいイソ酵素、すなわちζ−ＰＫＣ，はた くさんの興味深い性質を示し、このＰＫＣの比較的詳しい生化学的な性質の分析 から、ＰＭ＾に結合しない（Ｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９８９）ｆｏｅ　ｃｉｔ 　）　、この薬理学的な薬によって活性化されない、ホルボールエステルの活性 の減少制御に抵抗性があることなどが明らかになった。このことに関して、ζ− ＰＫＣに類似の酵母由来のＰＫＣはＰＨ＾に対して感受性がないということから 始まる最近の研究と、遺伝的な研究から細胞周期の制御において、ζ−ＰＫＣに 似た酵母のＰＫＣは重要な役割を担っている可能性が示唆されている（Ｌｅｖｉ ｎ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｃｅ１ｌ　Ｂ２．２１３（１９９０）　；　０ｇ１ｔａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳ八へ７．５０１１　（１９９０）；　ａｎｄ　０ｓａｄａ　ｅｔ 　ａｌ、（１９９０）ｆｏｅ　ｃＨ）ことは、特筆すべきことである。注目に値 するのは、ζ−ＰＫＣ亜種の減少またはζ−ＰＫＣの偽基質領域に特異的な配列 を持つペプチド阻害剤をマイクロインジェクトすることにより、インスリン／　 ｒａｓ　ｐ２１　／ＰＣ−ＰＬＯの卵成熟を活性化する能力を阻害し、プロゲス テロンで活性化された経路には効果を与えないことを示したことである。それゆ え、この酵素は増殖カスケードの制御に重要な役割を担っていると考えられる。

我々の結果は以下のことを強く指示する。

！　）　ｒａｓ　ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＯの特異的な経路で伝わる細胞***シ グナルの伝達においてζ−ＰＫＣは重要な役目を担い； ２）ζ−ＰＫＣの偽基質領域に対応する式（１）のペプチド、特にＡＲＲ（配列 番号ｌ）の配列を持つトリヌクレオチドは、その経路に活性化された細胞***を 特異的に阻害し；そして、 ３）ζ−ＰＫＣの阻害ペプチドを補乳動物細胞、特にヒトの細胞、にマイクロイ ンジェクトすることによる阻害効果（例えばＤＮＡ合成が強く阻害される）は、 インビボにおいて抗増殖効果がある。

配列表：配列番号１−１７ 配列番号：　１ 配列の長さ＝３ 翫ｊりの型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ 配列番号：　２ 翫ｌりの長さ＝４ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ翫ｊり番号：　３ 配列の長さ＝５ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド ♂１賢タリの闘：ＡＩａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ配列番号：　４ 配列の長さ二〇 翫ツリの型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ配列番号＝　 ５ 配列の長さ：９ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド ｉｓ９りの種類：＾「ｇ　Ａｒｇ　ｃｌｙ　Ａｌａ＾ｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａ ｒｇ　Ｌｙｓ配列番号二　〇 配列の長さ：９ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｌ ｙｓ　Ａｓｎ翫ｊり番号：　７ 配列の長さ：９ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 酉１セフリの夛４Ｃ１１：　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ 　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ配列番号：　８ 配列の長さ：９ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド ｉ！ＢりのＷＩＭ：　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｒ ｇ　Ａｒｇ　Ｖａ１配列番号＝　９ 配列の長さ：３ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ■ 配列番号＝１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：　核酸 鎖の数：　−水路 トボロジー：直鎖状 分子の型：　他の核酸（合成りＮ＾） 相補鎖：Ｎ。

配列の種類：　ＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧ　ＡＡＧＧＣＧＣＡ（Ｔ　ＡＣ翫ｌり番号 ＝１１ 配列の長さ：２３ Ｖりの型：　核酸 鎖の数：　−水路 トポロジー：直鎖状 分子の型：　他の核酸（合ａＮＡ） 相補鎖：Ｎ。

配列の種類：ＡＴＧＡＡＴｒＣＴＣＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＴｒＡ配列番号＝１２ 配列の長さ＝１４ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類＋ｌＩｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ｌｌ ｅ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｔ　Ｇ配列番号二１３ 配列の長さ：１６ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：ＧＩｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｉ　Ｉｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　rｅｒ　Ｖａｌ ｌ　５　１０　１５ 配列番号：１４ 配列の長さ：１５ 配列の型：　核酸 鎖の数：　−水路 トポロジー：直鎖状 分子の型；　他の核酸（合勅ＮＡ） 相補鎖：　Ｙｅｓ 配列の種類：田冗σ記冗ＧＧＣＡＴ 配列番号：１５ 配列の長さ＝１５ 配列の型：　核酸 鎖の数二　−水路 トポロジー：直鎖状 分子の型：　他の核酸（合勅ＮＡ） 相補鎖：Ｎ。

配列の種類：　ＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡ、　ＧＧＡＣＣ配列番号＝１６ 配列の長さ＝３ 配列の型、アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ 配列の特徴： ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　Ｍｉｓｃ、ｒｅａｔｕｒｅ位置目 その他の情報；　ＸａａはＮ−アセチルアラニン配列番号：１７ 配列の長さ：３ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：Ｘａａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ ■ 配列の特徴： ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　Ｍｉｓｃ、ｒｅａｔｕｒｅ位置＝１ その他の情報：　ＸａａはＮ−アセチルアラニン偽基質ペプチドの濃度（）ＬＭ ） 日 、、、ム一−，−，，，ＰＣＴ／ＥＰ　９３１００８１６１ｍ＋ｍ＋＋１Ａ−− １＋＋−Ｎ−ρＣＴ／ＥＰ９３１００８１６国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　５／１０　８ ３１８−４Ｈ ７１０６８３１８−４Ｈ ７１０８８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１５／１１ ／／　Ｃ０７Ｋ　９９：００　８３１８−４ＨＩ

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドおよび薬学上許容されるその誘導体 であって、３〜１５アミノ酸残基からなるペプチド。 【配列があります】（Ｉ） （ここで、Ｘは水素または１またはそれ以上のアミノ酸を表し、Ｊは水酸基また は１またはそれ以上のアミノ酸を表す。）
2. ２．３〜９アミノ酸残基からなる、請求項１記載のペプチド。
3. ３．Ｘが水素、アセチル基、Ｇｌｙ、Ａｒｇ−Ｇｌｙまたは【配列があります】 を表し、Ｊが水酸基、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ　Ａｒｇまたは【配列があります】を表す 、請求項１または２記載のペプチド。
4. ４．次の式： 【配列があります】（配列番号１） 【配列があります】（配列番号２） 【配列があります】（配列番号３） 【配列があります】（配列番号４） 【配列があります】（配列番号５） および薬学上許容されるその誘導体である、請求項１〜３いずれか一項記載のペ プチド。
5. ５．Ｎ−アセチル【配列があります】（配列番号１７）および薬学上許容される その誘導体。
6. ６．実質的に純粋な状態の請求項１〜５いずれか一項記載のペプチド。
7. ７．ζ−ＰＫＣ活性を阻害する方法であって、ζ−ＰＫＣの活性に応答し得る細 胞と有効量のζ−ＰＫＣ阻害剤とを接触させることを含んでなる、方法。
8. ８．ζ−ＰＫＣ活性を阻害する方法であって、ζ−ＰＫＣの活性に応答し得る細 胞と有効量の請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとを接触させることを 含んでなる、方法。
9. ９．ζ−ＰＫＣが媒介する病理的状態の予防または治療に適した医薬を選択する スクリーニング法であって、ａ）被試験試薬を含むサンプルを、ζ−ＰＫＣ活性 の阻害および／または活性化を示すことができるアッセイ系においてインキュベ ートし、 ｂ）その試薬がζ−ＰＫＣ活性を変化させるかどうか、必要ならば活性の変化の 程度を決定し、そしてｃ）ζ−ＰＫＣを強力かつ選択的に阻害したとされた医薬 を選択すること を含んでなる、方法。
10. １０．選択された医薬が、腫瘍、高増殖疾患およびウイルスの感染の治療に適す るものである、請求項９記載のスクリーニング法。
11. １１．医薬の活性成分として用いられる、請求項１〜６いずれか一項記載のペプ チドまたはその生理学的に許容される誘導体。
12. １２．ζ−ＰＫＣ活性に関連した病理学的状態の利用に用いられる、請求項１〜 ６いずれか一項記載のペプチドまたはその生理学的に許容される誘導体。
13. １３．腫瘍、高増殖疾患およびウイルスの感染の治療に用いられる、請求項１〜 ６いずれか一項記載のペプチドまたはその生理学的に許容される誘導体。
14. １４．請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドまたはその生理学的に許容さ れるその誘導体を、−またはそれ以上の生理学的に許容される担体とともに含ん でなる、医薬組成物。
15. １５．ζ−ＰＫＣをコードするＤＮＡ、特にζ−ＰＫＣの制御領域、またはそれ らの縮重等価物に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許 容されるその誘導体。
16. １６．【配列があります】（配列番号 １４）の配列を有するオリゴヌクレオチドおよび生理的に許容されるその誘導体 ならにびその縮重等価物。
17. １７．バックボーンがホスホロチオエート修飾された請求項１５または１６記載 のオリゴヌクレオチド誘導体またはその縮重等価物。
18. １８．請求項１５〜１７のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド またはその生理学的に許容される誘導体もしくはその縮重等価物を、−またはそ れ以上の担体と共に含んでなる、医薬組成物。
19. １９．請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドの製造法であって、 ａ）所望の保護されたＣ端アミノ酸を適当な固相担体に結合させ、 ｂ）所望に配列となるよう、他の保護アミノ酸と、担体に結合されたＣ端アミノ 酸とを反応させ、そして、ｃ）保護基を除去し、得られたペプチドを固相担体か ら切り出すこと を含んでなる、方法。
20. ２０．請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドまたはその生理学的に許容さ れるその誘導体の有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物におけるζ−Ｐ ＫＣ活性を阻害する方法。
21. ２１．請求項１５〜１７のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドの効果量を投 与することを含んでなる、哺乳動物におけるζ−ＰＫＣ活性を阻害する方法。
22. ２２．ζ−ＰＫＣ阻害剤の有効量の投与を含んでなる、腫瘍、高増殖疾患または ウイルス感染に敏感なまたは病む患者の治療法。
23. ２３．ζ−ＰＫＣ阻害剤が請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドである、 請求項２２記載の方法。
24. ２４．ζ−ＰＫＣ阻害剤が請求項１５〜１７のいずれか一項記載のオリゴヌクレ オチドである、請求項２２記載の方法。