JPH06508154A - peptide - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド 本発明は新規な治療法、特に特定のプロティンキナーゼＣに対するペプチドタイ プの新規な阻害剤に関係し、またその調製法及びそれを含んでなる医薬組成物な らびに、医療におけるその使用に関するものである。[Detailed description of the invention] peptide The present invention provides novel therapeutic methods, particularly peptide titers for specific protein kinase C. The present invention relates to novel inhibitors of phytochemistry, as well as methods for their preparation and pharmaceutical compositions comprising the same. and its use in medicine.

細胞***のシグナル伝達の過程における決定的な段階を明らかにするため、多く の努力が払われている。成長因子の刺激により強力に増幅されるリン脂質の分解 （Ｍ　Ｊ　Ｂｅｒｒｉｄｇｅ、＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　５６ ．１５９（１９８７）ａｎｄ　Ｊ　ＨＥｘｔｏｎ、　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ、　２５Ｂ、ｌ　（１９９０））が最近の研究の中心を占めている。はとんど の研究がホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の代謝回転に向けられているが、 ホスホジェステラーゼの関与したホスファチジルコリン（ＰＣ）の加水分解のよ うなＰｌとは独立したシグナル伝達のカスケードが存在することを示した研究も 数多くなされている（Ｊ　ＨＥｘｔｏｎ　（１９９０，Ｉｏｃ　ｃｉｔ）；　Ｊ 　Ｍ　Ｂｅｓｔｅｒｍａｎｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３．６７８５（１９８６）；Ｌａ５ｅｌ　ｅｔ　ａｔ、、 　Ｎａｔｕｒｅ　３３０．２６９　（４９８７ａ）；　Ｍ　Ｓ　Ｐｅ５ｓｉｎｅ ｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５．７９５９　（１９９０） 　ａｎｄ　ＰＬａｒｒｏｄｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｃｅ１ｌ　Ｂ１．１１１３ 　（１９９０））　ｏ最近、ホスホリパーゼＣが触媒するホスファチジルコリン の加水分解の活性化（ＰＣ−ＰＬＣ）が、血小板由来成長因子（ＰＤＧＰ）の細 胞***シグナルの重要な部分に十分近似していることを示す証拠が集まりつつあ る（Ｐ、　Ｌａｒｒｏｄｅｒａ　ｅｔａｔ、　（１９９０）、　ｆｏｅ　ｅｆｔ 、）　ｏホスホリパーゼＣによるホスファチジルコリンの加水分解はまた、がん 遺伝子ｒａｓの産物であるｒａｓ　ｐ２１によっても活性化されることが示され （Ｊ　ＣＬａｃａｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７ａ）　ｔｏｅ　ｃｌｔ；Ｂ　Ｄ 　Ｐｒ１ｃｅ　ｅｔａｌ、　Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２８４．１８６３ ８（１９８９）；　Ｉ　Ｄｉａｚ−ＬａｖＩａｄａ　ｅｔ　ａｔ、、　ＥＭＢＯ Ｊ　９，３９０７（１９９０）；　Ｍ　Ｌｏｐｅｚ−Ｂａｒａｈｏｎａ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２６５．９０２２（１９９０））、 細胞***カスケードにおけるｒａｓ　ｐ２１の役割が示されている（Ｍ　ＲＳｍ １ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２０．５４０　（１９８Ｂ））。In order to reveal the critical steps in the process of cell division signaling, many efforts are being made. Phospholipid degradation strongly amplified by growth factor stimulation (MJ Berridge, ^nnu, Rev, Blochem, 56 ．． 159 (1987) and J HExton, J, Blol, Che W, 25B, l (1990)) has been the focus of recent research. Hatondo Although research has been directed at the turnover of phosphatidylinositol (PI), Hydrolysis of phosphatidylcholine (PC) involving phosphogesterase Studies have also shown that there is a signal transduction cascade independent of Pl. Many have been done (J HExton (1990, Ioc cit); J M Bestermanet al, Proc, Natl, Acad, Sci, USA 83.6785 (1986); La5el et at. Nature 330.269 (4987a); M S Pe5sine tal, J., Biol, Chew, 265.7959 (1990) and PLarrodera et al, + Ce1l B1.1113 (1990)) Recently, phosphatidylcholine catalyzed by phospholipase C Activation of hydrolysis (PC-PLC) of platelet-derived growth factor (PDGP) Evidence is accumulating that it closely approximates important parts of the cell division signal. (P, Larrodera etat, (1990), foe eft. ,) o Hydrolysis of phosphatidylcholine by phospholipase C also It has been shown that it is also activated by ras p21, a product of the gene ras. (J CLacal et al, (1987a) toe clt; B D Pr1ce etal, J, Blot, Chew, 284.1863 8 (1989); I Diaz-LavIada et at, EMBO J 9, 3907 (1990); M Lopez-Barahona et al., J. Blot, Chew, 265.9022 (1990)), The role of ras p21 in the cell division cascade has been shown (M RSm 1th et al., Nature 320.540 (198B)).

Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｌｓ　（アフリカッメガエル）の卵は、がん遺伝子に 制御された適当なシグナル伝達において、異なった酵素活性の関与を探る上で適 した実験系である（ＬＪ　Ｗｏｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８ ．８４０（１９８７）；　Ｊ　ＣＬａｃａｌａｔ　ａｌ、、５ｃｊｅｎｃｅ　２ Ｈ，５３３（１９８７ｂ）　）　ｏすなわち、Ｘｅｎｏｐｕｓの卵はインスリン やプロゲステロンの刺激によって成熟卵へと変化し、そしてインスリン／　ＩＣ Ｆ−１により活性化される成熟シグナルカスケードにおいてｒａｓｐ２１が特異 的に関与することを示す証拠がいくつか挙げられている： １］卵にｒａｓ　ｐ２１をマイクロインジェクションすることによって、卵の成 熟が促進された。Xenopus Iaevls (African frog) eggs contain cancer genes Ideal for exploring the involvement of different enzyme activities in controlled and appropriate signal transduction. It is an experimental system (LJ Worn et al., 5science 238 ．． 840 (1987); J C Lacalat al, 5cjence 2 H, 533 (1987b)) o That is, Xenopus eggs contain insulin. The egg transforms into a mature egg due to the stimulation of progesterone and insulin, and then insulin/IC rasp21 is specific in the maturation signal cascade activated by F-1 Some evidence points to the involvement of: 1] By microinjecting rasp21 into eggs, the development of eggs is Ripening was accelerated.

（Ｃ，Ｂｌｒｃｈｓｅｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１４３．Ｂ１５（１９８５ ））２、　ｒａｓ　ｐ２１の活性を阻害する抗ｒａｓ　ｐ２１抗体（Ｙ１３−２ ５９）をマイクロインジェクトすることにより、プロゲステロンではなくインス リンによって誘発された卵の成熟がブロックされる。（Ｌ　Ｊ　Ｋｏｒｎ　ｅｔ 　ａｌ、、（１９８７）ｔｏｅ　ｃｉｔ）インスリン／　ｒａｓ　ｐ２１によっ て活性化された卵の成熟過程におけるＰＣ−ＰＬＣの重要性と関与の決定的な証 拠が、最近の研究で明らかになった（Ｇａｒｃｉａ　ｄｅ　Ｈｅｒｒｅｒｏｓ　 ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２８６．８８２５−１３８２９ （１９９１））　、すなわち、ＰＬＣによるＰＣの加水分解がインスリン／　ｒ ａｓ　Ｐ２１によるＸｅｎｏｐｕｓ　Ｌａｅｖｌｓ卵の成熟の活性化に必要かつ 十分であることが、卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）の誘発と成熟促進因子であるＩｌｌ 　キナーゼの活性化の測定から示された。これらの結果は、ＰＣ−ＰＬＯの活性 が細胞***の制御とがん化への機構に密接に関わっていることを示している。(C, Blrchseler et al., Ce1143.B15 (1985 )) 2. Anti-ras p21 antibody that inhibits ras p21 activity (Y13-2 By microinjecting 59), insulin rather than progesterone can be Phosphorus-induced egg maturation is blocked. (LJ Korn et al., (1987) toe cit) by insulin/ras p21 Conclusive evidence of the importance and involvement of PC-PLC in the maturation process of activated eggs A recent study revealed that the basis of etal, J, Blot, Chew, 286.8825-13829 (1991)), that is, the hydrolysis of PC by PLC is as necessary for the activation of Xenopus Laevls egg maturation by P21 and Ill, which is a factor that induces germinal vesicle collapse (GVBD) and promotes maturation, is sufficient. This was shown through measurement of kinase activation. These results indicate that the activity of PC-PLO These results indicate that the cells are closely involved in the control of cell division and the mechanism of canceration.

卵の成熟を制御する生化学的なパラメーターは哺乳動物の細胞***に関与するも のと同じであることが示されているが（Ａ、　Ｌ　Ｈｕｒｒａｙ　＆　Ｍ、　Ｖ 、　Ｋｌｒｓｃｈｎｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ３３９．２７５　（１９８９））　、 このような研究には哺乳類の体細胞の培養細胞、特に、特異的な成長因子または 血清で活性化されたマウスの繊維芽細胞が有用である。The biochemical parameters that control egg maturation are also involved in mammalian cell division. (A, L Hurray & M, V , Klrschner, Nature 339.275 (1989)), Such studies involve cultured mammalian somatic cells, especially specific growth factors or Serum activated mouse fibroblasts are useful.

しかしながら、ＰＣ−ＰＬＯが成長因子の***シグナルを変換する機構は明らか になっていない。ＰＬＯによるＰＣの加水分解は、プロティンキナーゼＣの重要 な活性化物質であるジアシルグリセロール（ＤＡＣ）　（Ｙ、　Ｎ１５ｈｉｚｕ ｋａ。However, the mechanism by which PC-PLO transduces growth factor division signals is unclear. It has not become. Hydrolysis of PC by PLO is important for protein kinase C. diacylglycerol (DAC) (Y, N15hizu Ka.

Ｎａｔｕｒｅ　３３４．６６１　（１９８８））を発生させることがら、ｐｃ− ＰＬＣにより活性化される細胞***シグナルカスケードにおけるこの酵素の関与 は興味ある可能性として存在する。Nature 334.661 (1988)), pc- Involvement of this enzyme in the cell division signal cascade activated by PLC exists as an interesting possibility.

ＰＫＣは大別すると２種類に分類されるが、クローニングし解析した結果、さら にいくつかのサブグループを形成することがわかった（Ｙ、　Ｎ１５ｈｉｚｕｋ ａ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５８゜６０７−６１４　（１９９２）参照）。これら のアイソタイプはすべて保存された偽基質自己阻害領域（ｐｓｅｕｄｏｓｕｂｓ ｔｒａｔｅａｕｔｏｉｎｈｉｂｌｔｏｒｙ　ｄｏＩａｉｎ　）を保持している（ Ｔ、　Ｓ。PKC can be broadly classified into two types, but as a result of cloning and analysis, It was found that several subgroups were formed in (Y, N15hizuk a, 5science 258°607-614 (1992)). these All isotypes have a conserved pseudosubstrate autoinhibition region (pseudosubs traitautoinhibitory　doIain　) T, S.

Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２８５．　１８２３　（１９９ ０））　、ａ　、βおよびアイソタイプの偽基質領域の１９から３１番残基に対 応する合成ペプチドは、ラット脳のＰＫＣの活性を強く阻害することがインビト ロの実験で示されている（Ｃ。Soderling, J., Biol, Chew, 285. 1823 (199 0)), a, β and residues 19 to 31 of the isotype pseudosubstrate region. The corresponding synthetic peptide was shown to strongly inhibit PKC activity in rat brain in vitro. It was shown in the experiment of C.

Ｈｏｕｓｅ　＆Ｂ、　Ｅ、　Ｋｅｅｐ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３Ｌ　１７２Ｂ　 （１９８７））。House &B, E, Keep, 5science 23L 172B (1987)).

我々は、今般、プロティンキナーゼＣイソタイプゼータ（ζ）の活性を阻害する あるペプチドを見出した。We now inhibit the activity of protein kinase C isotype zeta (ζ). I discovered a certain peptide.

したがって、本発明は一般式（１）のペプチドおよび薬学許容されるその塩であ って、３〜１５アミノ酸残基からなるものを提供する。Therefore, the present invention provides a peptide of general formula (1) and a pharmaceutically acceptable salt thereof. This provides a compound consisting of 3 to 15 amino acid residues.

Ｘ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｊ　（１）（ここで、ＸはＨまたは１つまたはそ れ以上のアミノ酸を、モしてｊはＯＨまたは１つまたはそれ以上のアミノ酸を表 す。） ここで用いる”誘導体“という用語は本発明によるペプチドの塩と溶媒和物を含 み、またひとつもしくはそれ以上の末端の修飾構造を有する本発明によるペプチ ドも含むが、ただし、Ｃ端のアミノ酸はアルギニンのアルキルエステル以外のも のである。末端の修飾構造には、欠失、アシル化（例えばアセチル化やベンゾイ ル化）、アルキル化、脂肪酸のアセチル化（例えばｗｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｌｏ ｎ）もしくはＮ端のアミノ基の環状化および欠失アミド化（モノ−、ジアルキル アミド化を含む）、Ｃ端のカルボキシル基の環状化と還元が含まれる。Ｎ−アシ ル、例えばＮ−アセチルの誘導体が好ましい。X-Ala-Arg-Arg-J (1) (where X is H or one or more more than one amino acid, and j represents OH or one or more amino acids. vinegar. ) The term "derivatives" as used herein includes salts and solvates of the peptides according to the invention. peptides according to the invention, which also have one or more terminal modification structures. However, the C-terminal amino acid may be other than the alkyl ester of arginine. It is. Terminal modification structures include deletions, acylations (e.g. acetylation and benzoylation). alkylation, acetylation of fatty acids (e.g. n) or cyclization and deletion amidation of the amino group at the N-terminus (mono-, dialkyl amidation), cyclization and reduction of the C-terminal carboxyl group. N-Ashi Preferred are derivatives of N-acetyl, such as N-acetyl.

式（１）のペプチドの適切な塩とは、無機酸および有機酸から誘導される生理学 的に許容される付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、硝酸塩、シュウ 酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フマル 酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、スルホン酸塩、例えば、パラトルエンスルホ ン酸塩およびメタンスルホン酸塩が含まれる。式（１）のペプチドの適切な溶媒 和物は、例えば水和物である。Suitable salts of the peptide of formula (1) include physiological salts derived from inorganic and organic acids. addition salts, such as hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, nitrates, Acid, Phosphate, Tartrate, Acetate, Citrate, Trifluoroacetate, Fumar acid salts, maleates, succinates, sulfonates, e.g. Includes phosphate and methanesulfonate salts. Suitable solvent for the peptide of formula (1) The hydrate is, for example, a hydrate.

この発明に従うペプチドはプロティンキナーゼＣイソタイプゼータ（ζ−ＰＫＣ ）の特異的な阻害剤である。ここで用いる”プロティンキナーゼＣイソタイプゼ ータ”（ζ−ＰＫＣ）とは特定のに自己阻害する偽基質領域ＲＲＧＡＲＲＷＲＫ 　（配列番号５）の配列を含むプロティンキナーゼＣのいずれかのサブスピーシ ーズをも意味する。この特定の配列は、ラット脳ζ−ＰＫＣ（Ｏｎｏ　ｅｔ　ａ ！、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６．３ ０９９−３１０３（１９８９））、アフリカッメガエルζ−ＰＫＣ，ζｎ−ＰＫ Ｃ（現在研究中）を含む多くの異なる生物から単離されたζ−ＰＫＣに完全に１ ００％保存されている。The peptide according to the invention is protein kinase C isotype zeta (ζ-PKC ) is a specific inhibitor of “Protein kinase C isotypese” used here (ζ-PKC) is a pseudosubstrate region RRGARRWRK that autoinhibits specific Any subspecies of protein kinase C containing the sequence (SEQ ID NO: 5) It also means This particular sequence is derived from rat brain ζ-PKC (Ono et al. ! ,, Proc, Natl, Ac1d, Sci, USA, 86.3 099-3103 (1989)), African frog ζ-PKC, ζn-PK ζ-PKC isolated from many different organisms including C. 00% preserved.

好ましい式（Ｉ）のペプチドは３から９アミノ酸残基ものであり、特に３から６ アミノ酸残基のものが挙げられる。Preferred peptides of formula (I) are of 3 to 9 amino acid residues, especially 3 to 6 amino acid residues. Examples include amino acid residues.

好ましい式（Ｉ）のペプチドの群としては、Ｘが水素、アセチル基、Ｇｌｙ　、 　Ａｒｇ−ＧｌｙまたはＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを表わし、Ｊが水酸基、Ｔｒｐ 　、　Ｔｒｐ−ＡｒｇまたはＴｒｐ−＾ｒｇ−Ｌｙｓのものが挙げられる。As a preferable group of peptides of formula (I), X is hydrogen, an acetyl group, Gly, Represents Arg-Gly or Arg-Arg-Gly, J is a hydroxyl group, Trp , Trp-Arg or Trp-^rg-Lys.

本発明による好ましいペプチドとしは下記のものが挙げられる： ＾１ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ　（配列番号、１）、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ 　（配列番号、２）、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ　（配列番号、 ３）、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ　（配列番号、４）、 Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ　 （配列番号、５）、および Ｎ−アセチル−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号、１７）、ならびに薬学上許 容されるその誘導体。Preferred peptides according to the invention include: ^1a-Arg-Arg (SEQ ID NO: 1), Ala-Arg-Arg-Trp (SEQ ID NO: 2), Ala-Arg-Arg-Trp-Arg (SEQ ID NO: 3), Ala-Arg-Arg-Trp-^rg-Lys (SEQ ID NO: 4), Arg-Arg-Gly-^1a-Arg-Arg-Trp-^rg-Lys (SEQ ID NO: 5), and N-acetyl-Ala-Arg-Arg (SEQ ID NO: 17) and pharmaceutically acceptable derivatives thereof that are tolerated.

式（１）のペプチドは少なくとも３つのキシル中心をもっていると考えられる。It is believed that the peptide of formula (1) has at least three xyl centers.

式（Ｉ）は本発明によるペプチドのジアステレオイソマーとラセミ体を含むその 混合物とを包括する意味に理解さなければならない。アミノ酸は自然界に存在す るＬ型かＤ型かもしくはその混合物、例えば、Ｌ型とＤ型のラセミ混合物である 。しかしながら、式（Ｉ）のペプチドは好ましくは自然界のＬ型のアミノ酸を含 んでなる。Formula (I) represents the diastereoisomers and racemic forms thereof of the peptides according to the invention. It must be understood to include mixtures. Amino acids exist in nature or a mixture thereof, e.g., a racemic mixture of L and D forms. . However, the peptide of formula (I) preferably contains naturally occurring L-type amino acids. That's what happens.

本発明によるペプチドは実質的に精製された状態で製造され、他のペプチドやア ミノ酸を実質的に倉ない。好ましくはペプチドは９０％以上の精製度（例えば９ ５％）を有するが、臨床での使用では９８％以上の精製度（存在する全てのペプ チド基＄）がよい。The peptides according to the invention are produced in a substantially purified state and are Contains virtually no amino acids. Preferably the peptide has a purity of 90% or higher (e.g. 9 5%), but in clinical use it has a purity level of over 98% (all existing peptides Tide group $) is good.

本発明による新規ペプチドの合成には、従来のペプチド合成の方法を用いること ができる。すなわち、ペプチドは、所望の配列に従って伸張するペプチドに、一 連のカップリング反応によって、アミノ酸をつなぐことにより合成される。様々 なアミノ基の保護基、例えばカルボベンジルオキシ基またはｔ−ブチルオキシカ ルボニル基（ＢＯＣ）　、様々なカップリング試薬、例えばジシクロへキシルカ ルボジイミドまたはカルボジイミダゾール、様々な活性化エステル、例えばＮ− ヒドロキシブタルイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル、様々 な切り出し試薬、例えばトリフルオロ酢酸、ジオキサンに溶かした塩化水素、は う素−トリス（トリフルオロ酢酸）、臭化シアン、ならびに中間体の単離と精製 を伴う溶液中の反応は、従来から周知のペプチドの方法論にしたがった。Conventional peptide synthesis methods can be used to synthesize the novel peptide according to the present invention. Can be done. That is, the peptides are combined into a peptide that extends according to the desired sequence. It is synthesized by linking amino acids together through a series of coupling reactions. various protective groups for amino groups, such as carbobenzyloxy or t-butyloxycarboxylic groups. carbonyl group (BOC), various coupling reagents, e.g. rubodiimide or carbodiimidazole, various activated esters such as N- Esters of hydroxybutylimide or N-hydroxysuccinimide, various Excision reagents such as trifluoroacetic acid, hydrogen chloride in dioxane, Isolation and Purification of Uron-Tris (Trifluoroacetic Acid), Cyanogen Bromide, and Intermediates Reactions in solution involving peptides followed conventionally well-known peptide methodologies.

好ましくは、本発明によるペプチドは周知のメリフィールドの固相法の方法によ り製造する （Ｍｅｒｒｌｆｉｅｌｄ、　Ｊ、　Ａｌ１ｅｒ、　Ｃｈｅａ、　Ｓｏｃ、　８５ ．２１４９−５４（１９６３）ａｎｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　１５０．　１７８−８ ５　（１９６５））　。Preferably, the peptides according to the invention are prepared by the well-known Merrifield solid phase method. manufacture (Merrfield, J., Al1er, Chea, Soc., 85 ．． 2149-54 (1963) and 5science 150. 178-8 5 (1965)).

従って、本発明による別の能様によれば次のようなペプチドの製造の方法が提供 され、その方法は：（ａ）所望の保護されたＣ端のアミノ酸を適当な固相担体へ 結合させ、 （ｂ）所望の配列に、他の保護アミノ酸と担体に固定されたＣ末端アミノ酸とを 反応させ、そして、（Ｃ）保護基を除去し、得られたペプチドを固相担体から切 り出すことを含んでなる。Therefore, according to another feature of the present invention, the following method for producing peptides is provided. The method is to: (a) transfer the desired protected C-terminal amino acid to a suitable solid support; combine, (b) adding other protected amino acids and a C-terminal amino acid immobilized to a carrier to the desired sequence; and (C) removing the protecting group and cutting the obtained peptide from the solid phase support. This includes taking out.

この方法は古典的なペプチド合成でたくさんの試薬と保護基を使用するが、Ｃ端 のアミノ酸を介し通常はポリスチレンやスチレンジビニルベンゼンの混合ポリマ ーなどの固相担体に結合した状態で、ペプチド鎖を伸張させていく。この方法は 各段階において、固相担体を洗うことによって過剰な試薬を除去できるため、多 くの操作が単純化されており都合がよい。This method uses many reagents and protecting groups in classical peptide synthesis, but A mixed polymer, usually polystyrene or styrene divinylbenzene, The peptide chain is extended while bound to a solid support such as -. This method is At each step, excess reagent can be removed by washing the solid phase support, allowing for multiple Many operations are simplified and convenient.

すなわち、適当に保護されたａ−アミノ基を持つＣ端アミノ酸を固相担体へ結合 させる。そして、例えばトリフルオロ酢酸の塩化メチレン溶液を用いて、ａ−ア ミノ基の保護基を除去し、次のステップの反応に備える。特定のアミノ基の保護 基を除去するための、通常使用される他の試薬や条件も、論文に記されたように 用いることができる。That is, a C-terminal amino acid with an appropriately protected a-amino group is bound to a solid support. let Then, using a methylene chloride solution of trifluoroacetic acid, for example, The protecting group of the mino group is removed to prepare for the next step of reaction. Protection of specific amino groups Other commonly used reagents and conditions for removing groups may also be used as described in the paper. Can be used.

そして他のａ−アミノ基や側鎖の保護されたアミノ酸を、求める配列に応じ各段 階ごとに、担体に固定された中間体ペプチドに結合していく。各アミノ酸を独立 に加える過程で、その内のいくつかは、担体に固定されたペプチド鎖に付加する 前にお互いに結合してしまう可能性がある。特定の結合試薬の選択は当業者に容 易であろうペプチドの化学合成における共通点は、様々なアミノ酸分子の不安定 な側鎖の適当な保護基による保護であり、その保護基はペプチド鎖が結合した後 、完全に除去される。また、ａ−アミノ基の保護も共通点であり、カルボキシル 基の反応後、ａ−アミノ基の保護基の選択的な除去を行ない、次の反応に備える 。それ故、合成のある段階で側鎖の保護基を持った様々なアミノ酸を含む中間体 が生じるのも共通点である。そしてこれらの保護基は共に実質的に同時に除去さ れ請求める最終産物がその後精製することにより得られる。Then, add other a-amino groups or side chain-protected amino acids at various stages depending on the desired sequence. At each stage, it binds to the intermediate peptide immobilized on the carrier. Each amino acid independently In the process of adding to the peptide, some of them are added to the peptide chain immobilized on the carrier. There is a possibility that they will be combined with each other before. Selection of specific binding reagents is within the skill of the art. A common feature in the chemical synthesis of peptides, which may be easy, is the instability of various amino acid molecules. This is the protection of the side chain by an appropriate protecting group, and the protecting group is protected after the peptide chain is attached. , completely removed. In addition, protection of the a-amino group is also common, and carboxyl After the reaction of the group, the protecting group of the a-amino group is selectively removed to prepare for the next reaction. . Therefore, at some stage of the synthesis intermediates containing various amino acids with side chain protecting groups A common feature is that this occurs. and both of these protecting groups are removed substantially simultaneously. A claimable final product is obtained by subsequent purification.

求めるアミノ酸配列の通りに合成が完了した後に、液体フッ化水素の様な試薬で 処理することによりペプチドを担体から切り出すが、このとき、残った側鎖の保 護基も除去される。そしてペプチドは、例えば、ゲル濾過、ＨＰＬＣ（Ｒｌｖｉ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ｐｅｐｔｌｄｅｓ　：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄＢｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　（１９７９）　ｐＩ）、１２５−１２８ ）　、イオン交換ゲル、分配クロマトグラフィー、向流分配、その他の方法で精 製される。After the synthesis is completed according to the desired amino acid sequence, it is processed using a reagent such as liquid hydrogen fluoride. The peptide is excised from the carrier by treatment, but at this time, the remaining side chain is Protecting groups are also removed. The peptide can then be analyzed, for example, by gel filtration, HPLC (Rlvi er et al,, peptldes: 5structure andBi Logical Function (1979) pI), 125-128 ), ion exchange gel, partition chromatography, countercurrent partition, and other methods. Manufactured.

ペプチドを例えば酸の付加された塩の形で得ようとするときは、ペプチドの塩基 の部分を適当な酸で、できれば同じ当量で処理することによって得られる。When trying to obtain a peptide in the form of an acid addition salt, for example, the base of the peptide by treating the portion with a suitable acid, preferably in the same equivalent amount.

本発明によるペプチドはζ−ＰＫＣの強く特異的な阻害剤であることが見いださ れた。それ故このペプチドは生体におけるζ−ＰＫＣの役割を研究するための科 学的な道具であり、特に生殖細胞の成熟や哺乳動物の体細胞の異常増殖などの、 細胞***のシグナル伝達におけるζ−ＰＫＣの役割の研究において有用である。It has been found that the peptides according to the invention are strong and specific inhibitors of ζ-PKC. It was. Therefore, this peptide is a suitable candidate for studying the role of ζ-PKC in living organisms. It is a scientific tool, especially for the maturation of germ cells and abnormal proliferation of mammalian somatic cells. It is useful in studying the role of ζ-PKC in cell division signaling.

すなわち、本発明によれば細胞のζ−ＰＫＣ活性を阻害する方法が提供され、そ の方法は、ζ−ＰＫＣの活性に応答する細胞と、有効量のζ−ＰＫＣの阻害剤と を接触させることを含んでなる。化合物がζ−ＰＫＣの阻害剤であるかどうか、 すなわちそれが本発明に包含されるか否かは、知られた実験、例えばＯｎｏ　ｅ ｔ　ａｌ　１９ｇ９゜１ｏｃ、ｃｉｔ、や以下に示すような、概に報告されたイ ンビトロのアッセイ系を用いて容易に評価されるであろう。有用なζ−ＰＫＣの 阻害剤は好ましくは、本発明による好ましいペプチドであるＡｌａ−Ａｒｇ−Ａ ｒｇ　（配列番号１）のような効力と選択性を示す。適当なアッセイ系としては 、例えば、ラット脳や牛の脳またアフリカッメガエルの卵などの適当な組織から 得られたζ−ＰＫＣ，または、上記Ｏｎｏ　ｅｔ　ａｔ　（１９８９）によって 示された組換えζ−ＰＫＣ体を用いた、リン酸化アッセイが挙げられる。様々な アッセイの手法は以下に示す適当なマイクロインジェクションの技術を用ことが できる。例えば、旧キナーゼや卵核胞崩壊のような卵成熟過程の分析、哺乳動物 細胞の異常増殖の分析、ＤＮＡ合成（複製）の分析などが挙げられる。これらの 手法は、特に細胞***シグナル伝達ニオケるζ−ＰＫＣの活性のインビトロの研 究に有用であり、また新規なζ−ＰＫＣに対する阻害剤をスクリーニングする方 法としても有用である。インビボスクリーニングの適切な手法は、マウスなどの 形質転換動物（トランスジェニックアニマル）を用いた慣用されている技術によ って確立されるであろう。That is, according to the present invention, a method for inhibiting cellular ζ-PKC activity is provided, and The method comprises a cell responsive to ζ-PKC activity and an effective amount of an inhibitor of ζ-PKC. including contacting. whether the compound is an inhibitor of ζ-PKC; That is, whether it is included in the present invention or not can be determined by known experiments, such as Ono e tal 19g9゜1oc, cit, and generally reported events such as This will be easily evaluated using an in vitro assay system. Useful ζ-PKC The inhibitor is preferably Ala-Arg-A, which is a preferred peptide according to the invention. rg (SEQ ID NO: 1)-like potency and selectivity. As a suitable assay system, , for example, from a suitable tissue such as rat brain, cow brain or African frog egg. The obtained ζ-PKC or according to Ono et at (1989) mentioned above Phosphorylation assays using the indicated recombinant ζ-PKC bodies are included. various The assay method can use the appropriate microinjection technique shown below. can. For example, analysis of oocyte maturation processes such as paleokinase and oocyst collapse, mammalian Examples include analysis of abnormal cell proliferation and analysis of DNA synthesis (replication). these The method specifically focuses on the in vitro study of the activity of ζ-PKC, which plays a role in cell division signaling. useful for research and for screening novel inhibitors of ζ-PKC. It is also useful as a law. A suitable technique for in vivo screening is by commonly used techniques using transformed animals (transgenic animals). will be established.

本発明の更に別の能様によれば、ζ−ＰＫＣの活性が媒介する病理的症状の予防 と治療に適した医薬を選択するスクリーニング方法が提供され、その方法は：ａ ）被試験試薬を含むサンプルを、ζ−ＰＫＣ活性の阻害および／または活性化を 示すことができるアッセイ系においてインキュベート、 ｂ）その試薬がζ−ＰＫＣ活性を変化させるかどうか、必要ならば活性の変化の 程度を決定し、そしてＣ）ζ−ＰＫＣを強力かつ選択的に阻害した試薬を選別す ることを含んでなる。According to yet another aspect of the present invention, prevention of pathological symptoms mediated by ζ-PKC activity A screening method for selecting a suitable drug for treatment is provided, the method comprising: a. ) The sample containing the reagent to be tested is used to inhibit and/or activate ζ-PKC activity. Incubate in an assay system that can be shown, b) whether the reagent changes ζ-PKC activity and, if necessary, the change in activity; and C) screening for reagents that potently and selectively inhibited ζ-PKC. It includes things.

出願人は、インスリン／　ｒａｓ　Ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＣの特異的な経路に 反応する細胞***シグナル伝達機構においてζ−ＰＫＣが重要であることを見出 した。予備的な実験によって得られた証拠はまた、ζ−ＰＫＣは、細胞活性化を ウィルスゲノムの複製につなぐ事象のカスケードにおいて一つの役割を担ってい る可能性のあることを示している。今までインビボにおけるζ−ＰＫＣの重要性 について評価されたことがなかったが、我々出願人はζ−ＰＫＣのインビトロの 阻害剤を、ζ−ＰＫＣ活性が関与する病理的症状の診断、予防または治療におい てインビボにおける有効であると初めて認識したのである。特に出願人は、適当 なモデル系を用いて、ζ−ＰＫＣの阻害剤が広く腫瘍に対して、また乾鼾のよう な高増殖症、そして）ＩＩＶのようなウィルスの感染に対して、有効であるかど うかということを明らかにした。The applicant has identified the insulin/ras P21/PC-PLC specific pathway. We discovered that ζ-PKC is important in the responsive cell division signal transduction mechanism. did. Preliminary experimental evidence also suggests that ζ-PKC promotes cell activation. plays a role in the cascade of events that lead to viral genome replication. This indicates that there is a possibility that The importance of ζ-PKC in vivo Although it has never been evaluated for ζ-PKC, we, the applicant, The inhibitor may be used in the diagnosis, prevention or treatment of pathological symptoms involving ζ-PKC activity. For the first time, it was recognized that it was effective in vivo. In particular, applicants should Using a model system, we have shown that ζ-PKC inhibitors are widely effective against tumors and hyperproliferative disease, and) infection with viruses such as IIV. It became clear that it was.

ここで用いた“腫瘍”という語は、良性、悪性の腫瘍、がん、がん性の成長、ま たは新生物（体細胞に由来した腫瘍のこと）を意味している。これらの“腫瘍“ は特に限定されず広くヒトを含め哺乳動物の腫瘍、例えば、がん腫、腺腫、黒色 腫、肉腫、リンパ腫、白血病等のことをいう。具体的な例としては、口腔および 咽頭（唇、舌、口、咽頭）、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肝臓および胆嚢道、 膵臓、喉頭、肺、骨、結合組織、皮膚、結腸、***、子宮、子宮内膜、卵巣、前 立腺、精巣、膀胱、腎臓および他の泌尿器の組織、目、脳および中枢神経、甲状 腺および他の内分泌腺、白血病（リンパ球性、顆粒球性、単球性）、ホジキン病 、非ホジキン病リンパ腫、多発性骨髄腫等のがんが挙げられる。出願人は、例え ば上顎顔面扁平上皮癌（ｌＩａｘｉｌｏｒａｃｌａｌ　５ｑｕａ＊ｕｓ　ｃｅｌ ｌｃａｒｃｉｎｏｍａ　）のような特定の腫瘍がζ−ＰＫＣの特異な高発現に関 連することを明らかにした。さらに、繊維芽細胞ＨＩＨ３Ｔ３を用い強力なウィ ルスのプロモーターをもつプラスミドによるＺ−ＰＫＣの高発現は、細胞の著し い増殖制御の低下を引き起こし、血清要求性の低下、***速度の上昇、細胞の高 密度増殖、さらに半固体培地（ｓｅｍｉ−ｓｏｌｉｄ　ｍｅｄｉｕｍ　）におい てコロニーを形成させた。As used herein, the term “tumor” refers to benign or malignant tumors, cancer, cancerous growths, or or neoplasm (a tumor derived from somatic cells). These “tumors” It is widely used in tumors of mammals including humans without particular limitation, such as carcinoma, adenoma, and melanoma. This refers to cancer, sarcoma, lymphoma, leukemia, etc. Specific examples include oral cavity and pharynx (lips, tongue, mouth, pharynx), esophagus, stomach, small intestine, large intestine, rectum, liver and cystic tract, Pancreas, larynx, lungs, bones, connective tissue, skin, colon, breasts, uterus, endometrium, ovaries, anterior Standing glands, testes, bladder, kidneys and other urinary tissues, eyes, brain and central nervous system, thyroid glands and other endocrine glands, leukemia (lymphocytic, granulocytic, monocytic), Hodgkin's disease , non-Hodgkin's lymphoma, multiple myeloma, and other cancers. The applicant may Maxillofacial squamous cell carcinoma Certain tumors, such as carcinoma), are associated with a uniquely high expression of ζ-PKC. It was revealed that it would be connected. Furthermore, we used fibroblast cells HIH3T3 to demonstrate a strong High expression of Z-PKC by a plasmid with a promoter of This leads to decreased control of proliferation, decreased serum requirement, increased division rate, and increased cell density. Density growth, as well as semi-solid medium colonies were formed.

従って、式（Ｉ）のペプチドは、ヒトを含めた哺乳動物における広範な腫瘍、高 増殖症およびウィルス感染に対し有効であり、そして腫瘍、乾１のような高増殖 症および旧■等のウィルス感染の治療に用いられる。Therefore, the peptide of formula (I) can be used to treat a wide range of tumors and tumors in mammals, including humans. Effective against hyperproliferative diseases and viral infections, and highly proliferative tumors such as tumors, psoriasis, etc. It is used to treat viral infections such as the disease and old .

本発明は更に、特に、動物（特にヒト）におけるζ−ＰＫＣ活性に関連する病因 学的状態の治療に有効成分として用いられる式（１）のペプチドおよびその生理 学的に許容される誘導体が提供される。The present invention further particularly relates to pathogenesis related to ζ-PKC activity in animals (particularly humans). Peptide of formula (1) used as an active ingredient in the treatment of medical conditions and its physiology A chemically acceptable derivative is provided.

本発明の特定の態様によれば、例えば上顎顔面偏平上皮がん（ｌＩａｘｉｌｏｒ ａｃｌａｌ　ｓｑｕａｗｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）のようながん の治療に用いられる、式（Ｉ）のペプチドおよびその生理学的に許容される誘導 体が提供される。According to certain aspects of the invention, for example, maxillofacial squamous cell carcinoma (IAxilor cancers such as aclal squawous cell carcinoma) Peptides of formula (I) and physiologically acceptable derivatives thereof for use in the treatment of The body is provided.

さらに本発明の別の態様によれば、式（１）のペプチドおよびその生理学的に許 容される誘導体を投与することを含んでなる、ヒトを含む哺乳動物においてζ− ＰＫＣ活性を阻害する方法が提供される。Furthermore, according to another aspect of the present invention, the peptide of formula (1) and its physiologically acceptable ζ- Methods of inhibiting PKC activity are provided.

さらにまた、哺乳動物においてζ−ＰＫＣ活性を阻害する医薬の製造のための、 式（１）のペプチドおよびその生理学的に許容される誘導体の更なるまたは他の 態様が提供される。Furthermore, for the production of a medicament that inhibits ζ-PKC activity in a mammal, Further or other peptides of formula (1) and physiologically acceptable derivatives thereof Aspects are provided.

ここで言う治療は確立した症候の治療とともに予防にも及ぶことは当業者に明ら かであろう。It is clear to those skilled in the art that the treatment referred to here includes prevention as well as treatment of established symptoms. Or maybe.

本発明によるペプチドを患者に未加工の化学物質として投与することは可能であ ろうが、しかし、医薬処方物の活性成分として存在させるのが好ましい。It is not possible to administer the peptides according to the invention to patients as raw chemicals. It is preferred, however, that the wax is present as the active ingredient of the pharmaceutical formulation.

従って、本発明によれば、式（１）のペプチドまたは生理学的に許容されるその 誘導体を、−またはそれ以上の生理学上許容される担体と、場合によって他の治 療または予防成分と共に含んでなる医薬組成物が提供される。According to the invention, therefore, the peptide of formula (1) or its physiologically acceptable The derivative may be combined with - or more physiologically acceptable carriers and optionally other treatments. Pharmaceutical compositions comprising the therapeutic or prophylactic ingredients are provided.

その担体は他の成分と相容性できるという意味で”許容される”ものでなければ ならず、投与される側にとって有害であってはならない。医薬処方物には、経口 、経直腸、経鼻、局所投与、移植または非経口の投与（筋肉、皮下、静脈注射な ど）、吸入法や通気法による投与に適した形態が含まれる。この処方物は、適切 には、別個の投薬単位とされるのが通常であり、製剤の技術分野で良く知られて いるあらゆる方法によって製造されてよい。The carrier must be "acceptable" in the sense of being compatible with the other ingredients. It must not be harmful to the recipient. Pharmaceutical formulations include oral , rectal, nasal, topical, implanted or parenteral administration (such as intramuscular, subcutaneous, or intravenous injection). ), forms suitable for administration by inhalation or insufflation. This formulation is suitable are usually presented in separate dosage units and are well known in the formulation art. May be manufactured by any method.

いずれの方法も活性化合物を液体担体または細かく粉砕した固形担体と混合する 工程を有し、さらに必要であればその生成物を所望の処方形とする工程を含む。Both methods involve mixing the active compound with a liquid carrier or a finely divided solid carrier. and, if necessary, a step of forming the product into a desired formulation.

経口投与のために、医薬組成物は例えは錠剤またはカプセル剤の形態をとり、そ れらは薬学上許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、ゼラチン状トウモロコ シ澱粉、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、賦活 剤（例えば、乳糖、セルロースやリン酸カルシウムの微結晶）、潤滑剤（例えば 、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガ イモ澱粉、澱粉グリコールのナトリウム塩）、浸潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム ）を用いて、慣用されている方法で製造することができる。錠剤は当該技術分野 で周知の方法によってコートされてもよい。経口投与のための液体処方物は、例 えば溶液、シロップ、けん濁液、または、使用に際して水または他の適当なビヒ クルと共に構成される乾燥品として提供されてよい。そのような液体処方物は、 けん局側（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、水素添加された 食用の脂肪）、乳化剤（例えば、レクチン、アカシア）、非水系ビヒクル（例え ば、アーモンドオイル、エステル系の脂質、エタノール）、防腐剤（例えば、メ チルまたはプロピルバラヒドロキシ安息好酸塩、ソルビン酸）などの薬学上許容 される添加剤を用い慣用されている方法によって製造されてよい。For oral administration, the pharmaceutical composition may take the form of a tablet or capsule, for example. They contain pharmaceutically acceptable excipients, such as binders (e.g. gelatinous corn). starch, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropyl methylcellulose), activation agents (e.g. lactose, cellulose or calcium phosphate microcrystals), lubricants (e.g. , magnesium stearate, talc or silica), disintegrants (e.g. Potato starch, sodium salt of starch glycol), wetting agent (sodium lauryl sulfate) ) can be produced by a commonly used method. Tablets are in the technical field It may be coated by a well-known method. Liquid formulations for oral administration are e.g. solutions, syrups, suspensions, or water or other suitable vehicles for use. It may be provided as a dry product consisting of cru. Such liquid formulations are Preservatives (e.g. sorbitol syrup, methylcellulose, hydrogenated edible fats), emulsifiers (e.g. lectins, acacia), non-aqueous vehicles (e.g. (e.g. almond oil, ester-based lipids, ethanol), preservatives (e.g. Pharmaceutically acceptable salts such as chloride or propylvala hydroxybenzoate, sorbic acid) It may be manufactured by a conventional method using additives.

口内局所投与のために、医薬組成物は慣用されている方法によって舌下錠、ドロ ップ、ロゼンジの形態であってよい。For topical administration in the mouth, the pharmaceutical compositions can be formulated into sublingual tablets, drops, etc. by conventional methods. It may be in the form of a cup or lozenge.

表皮への局所的投与のために、ペプチドはクリーム、ゲル、軟膏、ローションま たは経皮バッチの形態であってよい。それらの処方物は、例えば適切な濃化剤、 ゲル化剤、乳化剤、安定剤、分散剤、けん局側、および／または、着色剤などの 添加と共に水系または脂質を基本にして処方されてよい。For topical administration to the epidermis, peptides can be applied in creams, gels, ointments, lotions or or in the form of a transdermal batch. Their formulations include, for example, suitable thickening agents, Gelling agents, emulsifiers, stabilizers, dispersants, hydrating agents, and/or coloring agents, etc. With addition it may be formulated on an aqueous or lipid basis.

本発明によるペプチドはまた、デポ−製剤として処方されてもよい。このような 効能が長期にわたる処方は、移植（例えば、皮下や筋肉中）または筋肉注射によ って投与される。それゆえ、例えば、ペプチドは適切な重合体、疎水性の物質（ 例えば、許容可能なオイルによる乳化物）、イオン交換樹脂、難溶性の誘導体、 例えば難溶性の塩などにより処方される。Peptides according to the invention may also be formulated as a depot preparation. like this Long-acting formulations may be administered by implantation (e.g., subcutaneously or intramuscularly) or by intramuscular injection. It is administered as follows. Therefore, for example, peptides can be synthesized from suitable polymers, hydrophobic substances ( emulsions with acceptable oils), ion exchange resins, poorly soluble derivatives, For example, it is formulated with poorly soluble salts.

本発明によるペプチドは注射によって非経口的に投与されるよう処方されてよく 、好ましくは静脈注射、筋肉注射、皮下注射として、例えば、ポーラス注射また は連続投与などにより投与される。注射剤としての処方は、防腐剤が添加された 、例えばアンプルまたは多投与容器中の単位投与形態とされてよい。組成物は、 脂質または水系のビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとされてよく、 それらは懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方化剤を含んでいて もよい。さらには、活性成分は、使用の際に、例えば滅菌された発熱物質を含ま ない水のような適当なビヒクルで構成されるものとしての粉末とされてもよい。Peptides according to the invention may be formulated to be administered parenterally by injection. , preferably as an intravenous, intramuscular or subcutaneous injection, such as a porous injection or is administered by continuous administration or the like. Preservatives are added to the injectable formulation. may be presented in unit dosage form, eg, in ampoules or multi-dose containers. The composition is may be a suspension, solution or emulsion in a lipid or aqueous vehicle; They contain formulation agents such as suspending, stabilizing and/or dispersing agents. Good too. Furthermore, the active ingredient may be sterile, pyrogen-free, for example when used. It may also be made into a powder with a suitable vehicle such as water.

本発明によるペプチドは、例えばココアバターや他のグリセリドのような慣用さ れた生薬基材を含んでなる、生薬や浣腸などの直腸投与処方物とされてもよい。The peptides according to the invention can be used in conventional sources such as cocoa butter or other glycerides. Rectally administered formulations such as herbal medicines and enemas may also be prepared, containing the herbal medicine base.

鼻腔への投与のために、本発明によるペプチドは例えば液体状のスプレー、パウ ダー、ドロップの形で用いられてよい。For administration to the nasal cavity, the peptides according to the invention can be administered, for example, in the form of liquid sprays, powders, etc. It may be used in the form of a drop.

吸入による投与のために、本発明によるペプチドは好ましくはエアロゾルスプレ ーの形態とされてよく、加圧バンクまたはネブライザーから、適当な噴射剤（例 えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフ ルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当な気体）を用いてエアロゾルとされ る。加圧エアロゾルの場合、単位投与量は計量された量を与えるバルブを備える ことで決定されてよい。。例えば吸入や通気投与に用いられる例えばゼラチンか らなるカプセルまたはカートリッジは、本発明によるペプチドと、乳糖または澱 粉のような適当な粉末との粉末状混合物を含有する形態とされてい。For administration by inhalation, the peptides according to the invention are preferably administered in an aerosol spray. from a pressurized bank or nebulizer with a suitable propellant (e.g. For example, dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetraph (fluoroethane, carbon dioxide, or other suitable gas). Ru. In the case of pressurized aerosols, the unit dose is equipped with a valve that gives a metered amount It may be decided by that. . For example, gelatin used for inhalation or insufflation administration. A capsule or cartridge comprising a peptide according to the invention and lactose or starch. It is in the form of a powder mixture with a suitable powder such as a powder.

上記したすべての医薬組成物は、規制として公開された様式に基づくものでなけ ればならないであろう。All pharmaceutical compositions mentioned above must be based on regulatory published forms. would have to be.

本発明医薬組成物は鼻腔、局所的投与または非経口投与が好ましい。The pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered nasally, locally or parenterally.

治療に用いられる式（１）のペプチドの量は、選択したペプチドの種類だけでな く投与の経路、治療される側の条件の性質、患者の年令や体重と状態によっても 変化し、また担当の医師や獣医の判断に完全に任せられていることからも変化す ることは明らかであろう。しかしながら、一般に好ましい投薬量は一日に約１− ５００ｍｇの範囲であり、−日に２０−２００ｍｇの範囲が好ましく、−日に５ ０−１２０ｍｇの範囲が最も好ましい。The amount of the peptide of formula (1) used for treatment depends not only on the type of peptide selected. depending on the route of administration, the nature of the condition being treated, and the age, weight, and condition of the patient. changes, and also because they are left entirely to the judgment of the attending physician or veterinarian. It should be clear that However, the generally preferred dosage is about 1- in the range of 500 mg, preferably in the range of 20-200 mg on day -, and 50 mg on day - A range of 0-120 mg is most preferred.

予防のための適切な一日の投薬量は一般に０．１−５０ｍｇの範囲であろう。A suitable daily dosage for prophylaxis will generally be in the range of 0.1-50 mg.

必要とされる投与は、好ましくは一日に一回または適切な間隔をおいて分割した 投与、例えば二回、三回、四回、あるいはそれ以上であってよい。ペプチドは好 ましくは単位投与形態として用いられる。好ましい１単位投与処方は活性成分を ０．１　５００ｍｇ含有する。The required administration is preferably once a day or divided at appropriate intervals. The administration may be, for example, two, three, four, or more times. Peptides are good Preferably, it is used in unit dosage form. A preferred unit dosage formulation contains the active ingredient Contains 0.1 500mg.

本発明によるペプチドは、また、他の治療剤例えば他の制がん剤と共に用いられ てもよい。特に本発明による化合物は公知の制がん剤と共に用いられてよい。The peptides according to the invention may also be used with other therapeutic agents, such as other anticancer agents. It's okay. In particular, the compounds according to the invention may be used together with known anticancer agents.

更に他の態様によれると、本発明によれば、本発明による式（１）のペプチドと 他の治療剤との組み合わせが提供される。According to yet another aspect, according to the invention, the peptide of formula (1) according to the invention and Combinations with other therapeutic agents are provided.

この組み合わせは、通常、医薬組成物の形態において利用され、従って、その組 み合わせと薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物は、さらなる本発明 による別の態様を提供することとなる。This combination is usually utilized in the form of a pharmaceutical composition and therefore A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier is a further aspect of the present invention. This will provide another aspect.

式（１）のペプチドを第二の治療剤と共に使用する場合には、活性成分はあらゆ る経路によって順次または同時に投与されてよい。When the peptide of formula (1) is used in conjunction with a second therapeutic agent, the active ingredient is may be administered sequentially or simultaneously by any route.

上記の組み合わせとしての使用に適した治療剤には、例えばシクロフォスフアミ ドのようなアルキル化剤、メソトレキセートのような抗代謝剤、ビンブラスチン のような***阻害剤、アドリアマイシンのような抗腫瘍抗生物質、タモキシフェ ン、フルタミド、ゴセリリン酢酸、メトロキシプロゲステロン酢酸などの内分泌 系治療薬、放射性治療、免疫治療が含まれる。Therapeutic agents suitable for use in combination with the above include, for example, cyclophosphamide alkylating agents such as methotrexate, anti-metabolites such as methotrexate, vinblastine anti-mitotic agents such as adriamycin, anti-tumor antibiotics such as tamoxife endocrine drugs such as chlorine, flutamide, goselylin acetate, and methoxyprogesterone acetate. This includes therapeutic drugs, radiotherapy, and immunotherapy.

式（１）のペプチドを第二の治療剤と共に使用する際、それぞれの化合物の投薬 量は単一で用いる場合とは変化するであろう。それゆえ、式（１）のペプチドを 第二の治療剤と共に用いる場合には、それぞれの化合物の投与量は単一で用いる 場合と同じかまたは異なるものとされてよい。適切な当業者に容易に認識される であろう。When the peptide of formula (1) is used with a second therapeutic agent, the dosing of each compound The amount will vary when used alone. Therefore, the peptide of formula (1) When used in conjunction with a second therapeutic agent, a single dose of each compound may be used. may be the same or different. readily recognized by a person of appropriate skill in the art Will.

さらに別の態様によれば、本発明よって、ζ−ＰＫＣをコードするＤＮＡ　、好 ましくはζ−ＰＫＣの制御領域、に対する相補鎖オリゴヌクレオチド（アンチセ ンスオリゴヌクレオチド）およびその誘導体、またその縮重した誘導体が提供さ れる。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドはζ−ＰＫＣ，好ましくは哺乳 動物のζ−ＰＫＣ１特にヒトのζ−ＰＫＣ，のコード領域の初めの部分に対応す るｌ　５−ｓｅｒである。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの好ま しい例は、 ＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴ　（配列番号：１４）または誘導体またはその 縮重した等価物である。According to yet another aspect, the present invention provides a DNA encoding ζ-PKC, preferably Preferably, a complementary strand oligonucleotide (antisense) to the control region of ζ-PKC. oligonucleotides) and derivatives thereof, as well as degenerate derivatives thereof. It will be done. Preferred antisense oligonucleotides are ζ-PKC, preferably mammalian Corresponds to the first part of the coding region of animal ζ-PKC1, especially human ζ-PKC. It is 5-ser. Preferences for antisense oligonucleotides according to the invention A good example is GGTCCTGCTGGGCAT (SEQ ID NO: 14) or derivative or its It is a degenerate equivalent.

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸分解酵素による分解を減らすため、好 ましくは糖リン酸バックボーンがホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈ ｌｏａｔｅｓ　）に修飾されている。Antisense oligonucleotides are preferred because they reduce degradation by nucleases. Preferably, the sugar phosphate backbone is phosphorothioate (phosphorothioate). loates).

本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその等価物は、以下に示す 慣用された方法で作成されてよい。Antisense oligonucleotides according to the invention and their equivalents are shown below. It may be prepared using conventional methods.

本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ζ−ＰＫＣの強力で特異的な 阻害剤であることが示され、インビトロにおける科学的な道具として有用であり 、またインビボにおいても、特に腫瘍、乾癖のような増殖異常および旧Ｖのよう なウィルスの感染のようなζ−ＰＫＣ活性が介在する病理学的な状態の治療に対 し有効である。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む適切な医薬 組成物およびその投薬については、本発明によるペプチドについて上に記した通 りである。The antisense oligonucleotides according to the present invention are potent and specific for ζ-PKC. It has been shown to be an inhibitor and is useful as a scientific tool in vitro. , also in vivo, particularly in tumors, proliferative abnormalities such as psoriasis, and old V. for the treatment of pathological conditions mediated by ζ-PKC activity, such as viral infections. and is valid. Suitable medicaments containing antisense oligonucleotides according to the invention Regarding the composition and its administration, please refer to the general information given above for the peptides according to the invention. It is.

本発明をさらに以下に示す限定を意図しない実施例および図によって説明する。The invention is further illustrated by the following non-limiting examples and figures.

天然体のアミノ酸に共通の三文字略記と−・文字略記、核酸残基の通常の一文字 表記を以下に用いる。Three letter abbreviations common to natural amino acids, - letter abbreviations, and normal one letter abbreviations for nucleic acid residues. The notation is used below.

精製されたウシ脳ＰＫＣ（Ｎ＋５ｈｉｚｕｋａ　（１９８ｇ）、　５ｃｉｅｎｃ ｅ３３４．６１．）　ｌｎｇをマイクロインジェクトしまたはしていない６段階 目の卵に、緩衝液コントロール（小点のバー）または５ｗＭ　（卵に入ったとき の終濃度）の三種のペプチドの混合物、すなわちＩ）　Ｋ　Ｃアイソタイプα、 βおよびγ（ペプチドＡ、配列番号６）、δ（ペプチドＤ１配列番号７）および ε（ペプチドＥ、配列番号８）の偽基質領域に対応する三種のペプチドの混合物 （縞のバー）、または、ζ−ＰＫＣの偽基質領域に対応するペプチド（ペプチド Ｚ１配列番号５）（１ｍＭ）（黒ツバ−・りをマイクロインシュ、クトした。そ の後、卵に２５＊ＵのＢ、　ｃｅｒｅｕｓ由来Ｐ　Ｃ−Ｐ　Ｌ　Ｃまたは２０ｎ ｇの形質転換ｖ−ｔ（−ｒａｓ　ｐ２１をマイクロインジェクトするか、または 、Ｐ　Ｍ　Ａ　（１１００ｎ／ｍｌ）、インスリン（１＋ｇＭ）またプロゲステ ロン（ｌｄ）の存在下でインキュベートした。反応は刺激してから２時間後に止 め、抽出液をアガロースのビーズに結合したｐ１３ｓＵＣＩで沈殿させた後、Ｈ １キナーゼの活性を測定した。偽基質ペプチドは以下の配列を有する。Purified bovine brain PKC (N+5hizuka (198g), 5cienc e334.61. )　6 steps with or without microinjection of lng Add buffer control (small dotted bar) or 5wM (when entering the egg) to the egg. a mixture of three peptides, i.e. I) KC isotype α, β and γ (Peptide A, SEQ ID NO: 6), δ (Peptide D1 SEQ ID NO: 7) and Mixture of three peptides corresponding to the pseudosubstrate region of ε (peptide E, SEQ ID NO: 8) (striped bar), or a peptide corresponding to the pseudosubstrate region of ζ-PKC (peptide Z1 SEQ ID NO: 5) (1mM) (black tuber) was microinjected. After that, add 25*U of B, cereus derived P C-P L C or 20n to the egg. Transformation of g by microinjecting v-t(-ras p21 or , PMA (1100n/ml), insulin (1+gM) and progesterone Incubated in the presence of lon(ld). The reaction stopped 2 hours after stimulation. For this purpose, the extract was precipitated with p13sUCI bound to agarose beads, followed by H 1 kinase activity was measured. The pseudosubstrate peptide has the following sequence.

（Ａ）ＰＫＣイソタイプα、βおよびγに特異的なペプチド：　ＲＫＧＡＬＲＱ ＫＮ　（配列番号６）（Ｄ）ＰＫＣδに特異的なペプチド：　ＲＲＧ＾ＩＫＱＡ Ｋ　（配列番号７） （Ｅ）ＰＫＣε１．：特異的なペプチド：　ＲＱＧＡＶＲＩＩＩＲＶ　（配列番 号８） （Ｚ）ＰＫＣζ１．：特異的なペプチド：　ＲＲＧＡｌ？ＲＷ）？Ｋ　（配列番 号５） コントロールＨ１キナーゼ活性のレベルは７８ｒｉｏｌ／　ｗｉｎ／卵であり、 偽基質のマイクロインジェクションで影響を受けなかった。同様の他の３回の実 験でもほぼ同様の結果が得られた。(A) Peptide specific for PKC isotypes α, β and γ: RKGALRQ KN (SEQ ID NO: 6) (D) PKCδ-specific peptide: RRG^IKQA K (Sequence number 7) (E) PKCε1. :Specific peptide: RQGAVRIIIRV (SEQ ID NO. No. 8) (Z)PKCζ1. :Specific peptide: RRGAl? RW)? K (sequence number No. 5) The level of control H1 kinase activity is 78riol/win/egg; was unaffected by microinjection of mock substrate. Similar 3 other fruit Almost similar results were obtained in the experiment.

卵の抽出液は５Ｏ８−ＰＡＧＥで分離した後、電気的プロッティングを行ない、 対応するイソ酵素に特異的なペプチドの存在下、非存在下においてＰＫＣアイソ タイプα、βおよびγ（Ａ）またはζ（Ｂ）に特異的な抗体とインキュベートし た。同様の他の３回の実験でもほぼ同様の結果が得られた。After separating the egg extract by 5O8-PAGE, electrical plotting was performed. PKC isoenzymes in the presence and absence of peptides specific for the corresponding isoenzymes. Incubate with antibodies specific for types α, β and γ (A) or ζ (B). Ta. Almost similar results were obtained in three other similar experiments.

図３ ζ−ＰＫＣの自己リン酸化活性におけるペプチドＡ（配列番号６）とペプチドＺ （配列番号５）の効果卵の抽出液を、ＩＯＢの抗ζ−ＰＫＣ抗体と共にインキュ ベートし、免疫複合体をプロティンＧアガロースで回収１．５だ。免疫沈降物の ζ〜Ｐ　Ｋ、　Ｃの自己リン酸化活性を、３００ｍＭの　［ｇ−”Ｐｌ＾ＴＰ　 、５０１ｇ／ｍｌのホスファチジルセリン（Ｐ　Ｓ）の存在、非存在下で測定し た。インキュベーションは異なる濃度のペプチドＡまたはＺについて行なった（ 図１に示した）。反応は４５分で止め、タンパクを５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した 。抗体の非存在下でプロティンＧアガロースと共に卵の抽出液をインキコベー　 トした場合には、キナーゼの活性は全く検出されなかった。同様の他の３回の実 験でもほぼ同様の結果が得られた。Figure 3 Peptide A (SEQ ID NO: 6) and Peptide Z in the autophosphorylation activity of ζ-PKC Effect of (SEQ ID NO: 5) Egg extract was incubated with IOB anti-ζ-PKC antibody. and collect the immune complexes with protein G agarose. immunoprecipitate The autophosphorylation activity of ζ~P K, C was determined by 300 mM [g-”Pl^TP , measured in the presence and absence of 501 g/ml phosphatidylserine (PS). Ta. Incubations were performed with different concentrations of peptide A or Z ( (shown in Figure 1). The reaction was stopped after 45 minutes, and proteins were separated by 5DS-PAGE. . Incubate egg extract with protein G agarose in the absence of antibodies. When tested, no kinase activity was detected. Similar 3 other fruit Almost similar results were obtained in the experiment.

図４ ＲＮＡをマイクロインジェクトした卵からの抽出液中におけるζ−ＰＫＣ量のイ ムノプロット分析ζ−ＰＫＣの制御領域の断片を含むプラスミドからインビトロ で合成したセンス鎖とアンチセンス鎖のＲＮＡを６段階目の卵にマイクロインジ ェクトした。ＲＮＡまたは蒸留水をマイクロインジェクトしてから４８時間後に 、卵をホモジナイズし抽出液を５ＯＳ−ＰＡＧＥで分離後、エレクトロブロッテ ィングを行ない、ＰＫＣアイソタイプα、βおよびγ（Ａ）またはζ（Ｂ）に特 異的な抗体とインキュベートシた。同様の他の３回の実験でもほぼ同様の結果が 得られた。Figure 4 The amount of ζ-PKC in the extract from eggs microinjected with RNA. Munoplot analysis from a plasmid containing a fragment of the control region of ζ-PKC in vitro. Microinject the sense strand and antisense strand RNA synthesized in step 6 into eggs at the 6th stage. was applied. 48 hours after microinjecting RNA or distilled water After homogenizing eggs and separating the extract by 5OS-PAGE, electroblotting specific for PKC isotypes α, β and γ (A) or ζ (B). and incubated with different antibodies. Similar results were obtained in three other experiments. Obtained.

（Ａ）６段階目の卵に水（白のバー）、または、２５ｎｇのセンス鎖（しま模様 のバー）もしくはアンチセンス鎖（黒のバー）合成ＲＮＡをマイクロインジェク トした。(A) Water (white bar) or 25 ng of sense strand (striped pattern) to the egg at the 6th stage microinject synthetic RNA (bar) or antisense strand (black bar) I did it.

（Ｂ）他の卵のセットに水（白のバー）、または、卵あたり１５０ｎｇのζ−Ｐ ＫＣに特異的なセンス鎖（しま模様のバー）、アンチセンス鎖（黒のバー）もし くはナンセンス鎖（小点のバー）オリゴヌクレオチドをマイクロインジェクトし た。続いて、卵に２０ｎｇの形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１または２５＊Ｕの Ｂ、　ｅｅｒｅｕｑＰＣ−ＰＬＣをマイクロインジェクトし、もしくはインスリ ン（ｌｓＭ）またはプロゲステロン（１ｍＭ）の存在下でインキュベートした。(B) Water (white bar) in other egg sets or 150 ng ζ-P per egg KC-specific sense strand (striped bar), antisense strand (black bar) or microinject nonsense strand (small dotted bar) oligonucleotides. Ta. Subsequently, eggs were injected with 20 ng of transformed v-H-ras p21 or 25*U. B. Microinject eereuqPC-PLC or administer insulin The cells were incubated in the presence of progesterone (lsM) or progesterone (1mM).

その後、卵が５０％の卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）を示したときに、実験の手順にし たがい、抽出液中の旧キナーゼの活性測定した。結果は、同じインキュベーショ ン反応を独立に３回二重に行なった平均値士ＳＤである。Then, when the eggs showed 50% vesicular vesicle collapse (GVBD), the experimental procedure The activity of the former kinase in the extract was measured. The results show that the same incubation The average value and SD of each reaction were independently performed three times in duplicate.

後記する標準的手順で調製した６段階目の卵にコントロールとして緩衝液とｌａ Ｍ　（卵に入ったときの終濃度）のペプチドＺＳＺｌ、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４または Ａ４　（配列番号はそれぞれ５．４．３．２．１、または９である）をマイクロ インジェクトした。その後、卵は２５ｓＵのＢ。As a control, buffer and la Peptide ZSZl, Z2, Z3, Z4 or M (final concentration when entering the egg) A4 (sequence numbers are 5.4.3.2.1 or 9, respectively) in micro Injected. After that, the eggs were 25sU of B.

ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＩ、Ｃまたは２０ｎｇのｒａｓ　ｐ２１をマイクロイン ジェクトするか、もしくは、インスリン（１ｍＭ）またはプロゲステロン（１ｍ Ｍ）存在下において、卵をインキュベートシた。続いて、刺激後２時間で反応を 止め、図１の説明に示した方法で旧キナーゼの活性を測定した。コントロールの 旧キナーゼのレベルは８０℃ｍｏｌ　／１ｎ　／卵でペプチドのマイクロインジ ェクションによって影響を受けなかった。同様の他の３回の実験でもほぼ同様の 結果が得られた。Microinject cereus PC-PI, C or 20 ng of ras p21. or insulin (1mM) or progesterone (1mM). M) Eggs were incubated in the presence of M). Then, 2 hours after stimulation, the response was determined. The activity of the former kinase was measured by the method shown in the explanation of FIG. of control The level of old kinase was 80°C mol/1n/egg. was not affected by the Similar results were obtained in three other similar experiments. The results were obtained.

異なる濃度のペプチドＡＬＲ（配列番号９）およびＡＲＲ（配列番号１）を、血 清飢餓（２４時間）のスイス−３Ｔ３繊維芽細胞の細胞質に標識抗体とともにイ ンジェクトした。インジェクションの後直ちに、ブロモデオキシウリジンを培地 中で１０００倍希釈となるよう加え、細胞を３７℃で２０時間インキュベートし た。その後、細胞を固定化し、抗標識抗体を用いた免疫蛍光法、および、ブロモ デオキシウリジン抗体を用いた免疫化学分析を標準的手法によって行った。結果 は少なくとも３回の独立した実験による。Different concentrations of peptides ALR (SEQ ID NO: 9) and ARR (SEQ ID NO: 1) were administered to blood. Injected with labeled antibody into the cytoplasm of serum-starved (24 hours) Swiss-3T3 fibroblasts. was injected. Immediately after injection, add bromodeoxyuridine to the medium. cells were incubated at 37°C for 20 hours. Ta. Cells were then fixed and subjected to immunofluorescence using anti-labeled antibodies and bromofluorescence. Immunochemical analysis using deoxyuridine antibodies was performed by standard techniques. result from at least three independent experiments.

１０％のＦＣ８供給ＤＭＥＭ中で４Ｘ１０４／培養皿（ＢＯｓｍ）になるように 細胞を蒔いた。２４時間後、正確なブレーティングを確かめるため細胞数を数え 、培地を取り除き０，５％のＦＣＳを含むＤＭＥＭを再び与えた。細胞数は１日 おきに数えた。結果は、同じインキュベーション反応を独立に３回二重に行なっ た平均値±ＳＤである。4X104/culture dish (BOsm) in 10% FC8-supplied DMEM Cells were seeded. After 24 hours, count the cells to ensure accurate blating. Then, the medium was removed and DMEM containing 0.5% FCS was fed again. Cell count per day I counted every once in a while. The results were obtained by performing the same incubation reaction three times independently in duplicate. Mean values±SD.

実験の手順 卵は次に示す標準的な手順で調製された（Ｇａｒｃｉａ　ｄｅＨｅｒｒｅｒｏｓ 　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　ｆｏｅ　ｃｌｔ、）　。簡単に述べると、アフ リカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）　（ＢｌａｄｅｓＢｌｏｌｏ ｇｌｃａｌｓ、　ＵＫ）の卵巣を２ｓｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ　ｍａｎｎｈｅｉｇ＋、　Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、カルシウムイオン（ Ｃａ２＋）の含まないＭｏｄｉｆ’　ｌｅｄ　Ｂａｒｔｈ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ ＭＢＳ）　（１１０＋＊Ｍ　ＮａＣ１，２ｓＭ　ＫＣＩ、　１．ｓＭ　ＭｇＣｌ ２．１ｓＭ　ＣａＣｌ２゜２ｗＭ　ＮａＨＣＯ３，１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７，５）中で４５分間インキュベートした。十分に洗浄した後、６段階目（ｓｔ ａｇｅ　ｌ／Ｉ）の卵が選択され２０℃で一晩インキユベートした。Experimental procedure Eggs were prepared using the following standard procedure (Garcia de Herreros et al, (1991) foe clt,). Simply put, Af Lick frog (Xenopus Iaevis) (BladesBlolo glcals, UK) was treated with 2 sg/ml collagenase (Boehrin). mannheig+, Germany), as well as calcium ions ( Modif’ led Barth Solution (Ca2+)-free ( MBS) (110+*M NaCl, 2sM KCI, 1.sM MgCl 2.1sM CaCl2゜2wM NaHCO3, 10mM Hepes, pH 7,5) for 45 minutes. After thorough cleaning, the 6th stage (st Age l/I) eggs were selected and incubated overnight at 20°C.

ツメガエル卵のζ−ＰＫＣのクローニングアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ 　）の卵からζ−ＰＫＣホモローグのｃＤＮＡをクローニングするため、プロー ブを、ラット脳のラムダ−ＺＡＰ　ライブラリーから以下に示すオリゴヌクレオ チドを用い直接ＰＣＲ法により、ＤＮＡの断片を増幅することによって成長させ た。Cloning of ζ-PKC in Xenopus eggs In order to clone the cDNA of ζ-PKC homolog from eggs of from the rat brain lambda-ZAP library as shown below. It is grown by amplifying DNA fragments by direct PCR using Ta.

５°−ＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧ＾＾ＧＧＣＧＣＡＣＴＡＣ−３’　（配列番号１０ ）５−ＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＴＴＡ−３’　（配列番号１ １）その結果、ラット脳ζ−ＰＫＣの塩基配列５２−７０８番を含む６５６塩基 対の断片が得られた（Ｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ。5°-ATGAATTCTG^^GGCGCACTAC-3' (SEQ ID NO. 10 )5-ATGAATTCTCGATGACAGGCTTA-3' (SEQ ID NO: 1 1) As a result, 656 bases containing the base sequence 52-708 of rat brain ζ-PKC Paired fragments were obtained (Ono et al.

＋Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６．３０９９（ １９８９）　）　、この断片をランダムブライ７−　（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｓｅ　 ＤＮＡ　ｌａｂｅｌｌｌｎｇＳｙｓｔｅｍ；　Ａｍｅｒｓｈａｓ　Ｉｎｔ、）を 用い３２Ｐで標識し、オリゴｄＴで逆転写を行い作成したアフリカッメガエル卵 のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。ハイブリダイゼーションは ５０％ホルムアミド存在下において４２℃で行ない、フィルターはｏ、ｔ　ｘｓ ｓｃ　、　ｏ、ｉ％ＳＤＳ溶液を用イ６５℃で洗浄した。陽性のシグナルを拾い ファージを精製した。挿入断片をプラスミドｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクロ ーニングを行なった。クローンはｒ■ｏｆ　（商品名）　ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃ ｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＭａｄＩｓｏｎ）を用いたＤＮＡ　シ ーフェンスにより分析した。+Proc, Natl, Acad, Sci, USA 86.3099 ( 1989)), this fragment was randomly printed 7- (Multiprise). DNA labeling System; Amershas Int.) African frog eggs were labeled with 32P and reverse transcribed with oligo-dT. was used to screen a cDNA library. Hybridization is It was carried out at 42°C in the presence of 50% formamide, and the filter was o, txs. The sc, o, i% SDS solution was washed at 65°C. Pick up a positive signal The phages were purified. Subcloned the insert into plasmid pBIuescript. - training was carried out. Clone is r■of (product name) DNA Sequenc ing System (Promega, MadIson) - Analyzed by fence.

インビトロ転写反応 バクテリオファージＴ３またはＴ７のＲＮＡポリメラーゼを用い、１０■ｇの直 鎖状ＤＮＡを鋳型とし、ｃａｐの類似物であるＧｌ）Ｉ）Ｉ）Ｇ存在化において 、センス鎖とアンチセンス鎖のＲＮＡを合成した（ｍｃＡＰ（商品名）　５ＲＮ Ａ　ｃａｐｐｉｎｇ　Ｋｉｔ　：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ、）。In vitro transcription reaction Using bacteriophage T3 or T7 RNA polymerase, 10 g of direct Using stranded DNA as a template, in the presence of Gl)I)I)G, which is an analogue of cap. , sense strand and antisense strand RNA were synthesized (mcAP (trade name) 5RN A capping kit: Stratagene, CA).

オリゴヌクレオチド アフリカッメガエルζ−ＰＫＣのコード領域の初めの部分（開始コドンから始ま る）に同じ配列または相補的な配列の１５塩基の核酸を、バックボーンにホスホ ロチオエートの修飾を入れて合成した（Ｏｐｅｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ。oligonucleotide The beginning of the coding region of African frog ζ-PKC (starting from the start codon) A 15 base nucleic acid with the same or complementary sequence to the backbone Synthesized with lotioate modification (Operon Technology s.

ＡＩａ＊ｅｄａ、Ｃ，）。さらにコントロールとしてランダムの配列をもち意味 を持たないオリゴヌクレオチドを合成した。AIa*eda, C,). In addition, a random sequence was used as a control. We synthesized oligonucleotides without.

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓからのＰＣ−ＰＬＣの単離バチルスセレウス５ Ｅ−１菌体からのＰＣ−ＰＬＣの単離は従前の報告に従って行った（１、ａｒｒ ｏｄｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、（１０）１掲　；Ｇａｒｃｉａ　ｄｅ　Ｈｅｒｒｅｒ ｏｓ　ｅｔ　ａｌ、（１１）１掲）。そのプロトコルの後に、酵素の調製を精製 して、完全に単一のものに精製されているを５ＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色によって 確認した。Isolation of PC-PLC from Bacillus cereus Bacillus cereus 5 PC-PLC was isolated from E-1 cells according to a previous report (1, arr. odera et al, (10) 1; Garcia de Herrer os et al, (11) 1). After that protocol, purify the enzyme preparation completely purified into a single product by silver staining on 5DS-PAGE. confirmed.

精製された酵素の比活性は１．５Ｕ／■ｇであった。The specific activity of the purified enzyme was 1.5 U/g.

ｒａｓ　ｐ２１タンパクの調製 形質転換または通常のｒａｓ　ｐ２１タンパクは、従前の報告に従って細菌を用 いて発現させた（Ｄｏｗｉｎｇｕｅｚ　ｅｔ　ａｔ。Preparation of ras p21 protein Transformation or normal ras p21 protein was obtained using bacteria according to previous reports. (Dowinguez et al.).

、ＥＭＢＯＪ、１０．３２１５（１９９１））　。精製の最終段階で２．５　Ｘ 　９０ｃｍの５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００カラムを用だゲル濾過クロマトグラ フィーを行い、精製されたタンパクを含むフラクションはプールし尿素を除くた めに大量の２０ｗＭ　Ｔｒｌｓ−４１ＣＩ　ｐＨ７，５緩衝液に対して透析を行 ない、使用するまで一７０℃で保存した。, EMBOJ, 10.3215 (1991)). 2.5X at the final stage of purification Gel filtration chromatography using a 90cm 5ephadex G-100 column The purified protein-containing fractions were pooled to remove urea. Dialysis was performed against a large amount of 20 wM Trls-41CI pH 7.5 buffer. Stored at -70°C until use.

異なったＰＫＣイソタイプのイムノプロット分析１００會ｇの全細胞タンパク量 を含むアフリカッメガエル卵の細胞抽出液を、ＳＤＳサンプルバッファーで変性 させた後、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離させた。その後、ポリビ ニリジンジフルオライド膜（Ｉｓ■ｏｂｉｌｏｎ・Ｍｉｌｌｆｐｏｒｅ　Ｃｏｎ ｔｉｎｅｎｔａｌ　Ｗａｔｅｒ　Ｓｙｓｔｅｇ＋ｓ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ ）にタンパクを電気泳動的に移した。そして膜を、ＰＫＣアイソタイプα、βお よびγ（Ａ）またはζ（Ｂ）に特異的な抗体と共に、対応するイソ酵素に特異的 なペプチドＡまたはＺ（配列番号６または５にそれぞれ対応）の存在、非存在下 においてインキュベートした。対応する抗体と共にプロットした膜をインキュベ ートした後、ＰＫ　Ｃアイソタイプα、βおよびγ（Ａ）またはζ（Ｂ）を＾ｕ ｔｏＰｒｏｂｅＴＭ　ＢＬ　ｐｌｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｗｅｒｓｈａｓ、Ｉ ｎｔ、）を用いて視覚化した。アイソタイプα、βおよびγの検出のために、γ −ＰＫＣのアミノ酸残基３８１−３９４番に対応するペプチドＩＬＫＫＤＶＶＩ ＱＤＤＤＶＥ　（配列番号１２）ニ対すル抗ヘプチド抗体を用いた。アイソタイ プζを検出するために、ζ−ＰＫＣのアミノ酸残基５７７−５９２番に対応する ペプチド（配列ＧＦＥＹ　Ｉ　ＮＰＬＬＬＳＡＥＥＳＶ、配列番号１３）を用い て作成した抗ペプチド抗体を用いた。これらの抗体はＧ　ｉ　ｖｃ。Immunoplot analysis of different PKC isotypes Total cell protein content of 100 g Denature African frog egg cell extract with SDS sample buffer. After that, separation was performed on a 10% SDS polyacrylamide gel. After that, polyvinyl Nyridine difluoride membrane (Is■ obilon・Millfpore Con tinental Water System+s, Bedford, MA ), the proteins were electrophoretically transferred. The membrane is then separated into PKC isotypes α, β, and and antibodies specific for γ (A) or ζ (B), along with antibodies specific for the corresponding isoenzymes. In the presence or absence of peptide A or Z (corresponding to SEQ ID NO: 6 or 5, respectively) Incubated at. Incubate the membrane plotted with the corresponding antibody. After converting PK C isotypes α, β and γ (A) or ζ (B) toProbeTM BL plus system (Awershas, I nt,). For detection of isotypes α, β and γ, γ - Peptide ILKKDVVI corresponding to amino acid residues 381-394 of PKC An anti-heptide antibody was used against QDDDVE (SEQ ID NO: 12). Isotie To detect ζ-PKC, amino acid residues 577-592 of ζ-PKC were detected. Using the peptide (sequence GFEY I NPLLLSAESV, SEQ ID NO: 13) We used an anti-peptide antibody prepared by These antibodies are G i vc.

ＢＲＬ　（Ｇａｊｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ　）より購入した。Purchased from BRL (Gajthersburg, MD).

卵成熟の分析 ２０個ずつの卵のグループを修正Ｂａｒｔｔ＋溶液中において２０℃で培養した 。そして卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）を動物極に出現した白いスポットから算定した 。いくつかの場合では、核崩壊は１０％トリクロロ酢酸固定卵を分解して決定し た（Ｇａｒｃｉａ　ｄｅ　Ｈｅｒｒｅｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）　ｌｏ ｔ、ｃｉｔ、）。Analysis of egg maturation Groups of 20 eggs were incubated at 20°C in modified Bartt+ solution. . Then, the germinal vesicle collapse (GVBD) was calculated from the white spot that appeared at the animal pole. . In some cases, nuclear decay was determined by dissolving 10% trichloroacetic acid fixed eggs. (Garcia de Herreros et al. (1991) lo t, cit,).

成熟促進因子ヒストン１キナーゼ分析 ２０個の卵を、２０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，０）、　１０■Ｍｂ−グリセロ ホスフェート（ｂ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）　、　５ｓＭ　ＥＧＴ Ａ、　５ｍＭＭｇＣＩ２．５０＋＊Ｍ　ＮａＦ、　２ｍＭ　ジチオスレイトール （ＤＴＴ　）　。Maturation-promoting factor histone 1 kinase analysis 20 eggs, 201M HEPES (pH 7,0), 10Mb-glycero Phosphate (b-glycerophosphate), 5sM EGT A, 5mM MgCI2.50+*M NaF, 2mM dithiothreitol (DTT).

１０（ｌａｇ／ｍｌ　ロイペプチン（Ｉｅｕｐｅｐｔ、１ｎｅ）　、　１００ｗ Ｍフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌ ｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏ　ｒｉｄｅ）を含む緩衝液中でホモジェナイズした。10 (lag/ml leupeptin (Ieupept, 1ne), 100w M phenylmethylsulfonyl fluoride The mixture was homogenized in a buffer containing Fonyl Fluoride).

１３０００　Ｘｇ、１５分の遠心分離後、抽出液（１−２ｍｇ／アッセイ）は、 ２０５Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，０）、　５■Ｍｂ−メルカプトエタノール、 　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１００５Ｍ　［ｇ−１２Ｐ］＾ＴＰ（２−５ｄｐｓ＋ ／ｆｍｏｌ）。After centrifugation at 13,000 Xg for 15 minutes, the extract (1-2 mg/assay) was 205M HEPES (pH 7,0), 5■Mb-mercaptoethanol, 10mM MgCl2.1005M [g-12P]^TP (2-5dps+ /fmol).

０．２ｅ＋Ｍ耐熱性ｃＡＭＰ依存性プロティンキナーゼおよびＯＪＢ／ｓｌ　Ｓ Ｉｇ＊ａ　ｔｙｐｅ　ｌｌｌ−３子ウシ胸腺ヒストンを含む最終反応容積５０μ ｌ中で３０℃で１０分間分析した。反応停止後、Ｖａｌａｎ　ｐ８１ホスホセル ロース紙にスポットし、洗浄後、従前報告されている方法で定量した（Ｇａｒｃ ｉａ　ｄｅｌ（ｅｒｒｅｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１，）前掲）。い（っか の実験では、抽出液をｐ１３ｓｕｃｌが結合したアガロースビーズと共にインキ ュベートし、５Ｏ８−ＰＡＧＥで分離後、沈殿のヒストン１キナーゼの活性を決 定した（Ｄｏｍｊｎｇｕｅｚ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）前掲）。0.2e+M thermostable cAMP-dependent protein kinase and OJB/sl S Final reaction volume 50μ containing Ig*a type lll-3 calf thymus histones The samples were analyzed for 10 minutes at 30° C. After stopping the reaction, Valan p81 phosphocell It was spotted on a loin paper, washed, and quantified using a previously reported method (Garc ia del (erreros et al. (1991, supra)). one's family In this experiment, the extract was inked together with agarose beads bound to p13sucl. After separation by 5O8-PAGE, the activity of histone 1 kinase in the precipitate was determined. (Domjnguez et al. (1991) supra).

免疫沈降と自己リン酸化の分析 卵の抽出液は１０５ｇの抗ζ−ＰＫＣ抗体と共にインキュベ−１−Ｌ、免疫複合 体をプロティンＧアガロースで回収した。免疫沈殿物の自己リン酸化活性を、３ ００ｍＭ［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ、　８０ｎＭ　Ｃａ、２＋の存在または非存在、 ５０Ｂ／ｍｌホスファチジルセリン（、ＰＳ）の存在または非存在の混合液中で 測定しまた。印きゅベーしょんはペプチドＡまたはＺ（配列番号６または５にそ れぞれ対応）の異なる濃度の存在下おいて行なった。反応を４５分で停止させ、 タンパクを５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。卵の抽出液を抗体の非存在下において プロティンＧアガロースと共４こ保温した場合には、キナーゼの活性は検出され なかった。同様の結果が３つの独立した実験から得られた。Immunoprecipitation and autophosphorylation analysis The egg extract was incubated with 105 g of anti-ζ-PKC antibody, immunoconjugated with Bodies were collected with protein G agarose. The autophosphorylation activity of the immunoprecipitates was 00mM [g-32P]ATP, 80nM Ca, presence or absence of 2+, In a mixture with or without 50B/ml phosphatidylserine (PS) Measure again. The incubation is peptide A or Z (sequence number 6 or 5). (corresponding to each other) in the presence of different concentrations. The reaction was stopped in 45 minutes, Proteins were separated by 5DS-PAGE. Egg extract in the absence of antibodies When incubated with protein G agarose, no kinase activity was detected. There wasn't. Similar results were obtained from three independent experiments.

例１ Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｇ　（ペプチドＺ４）（配列番号１）例２ Ａｌａ−＾ｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（ペプチドｚ３）（配列番号２）例３ Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（ペプチドＺ２）（配列番号３）例４ Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ（ペプチドＺ１）（配列番号 ４）例５ ＾ｒｇ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｇ−Ｔ　ｒｐ− ＾ｒｇ−Ｌｙｓ（ペプチド２）（配列番号５） 例１から６のペプチド（配列番号ｌから５と１７にそれぞれ対応）はすべてメリ フィールドの固相化法によって合成され、アミノ酸分析と逆相のＨＰＬＣによっ て分析された。すべてのペプチドは構造から予測されるアミノ酸配列を持ち、少 なくとも９５％の精製度が得られた（逆相のＨＰＬＣで単一のピークとしてえら れた）。ペプチドの濃度はアミノ酸分析データから算出された。Example 1 AI a-A rg-A rg (peptide Z4) (SEQ ID NO: 1) Example 2 Ala-^rg-Arg-Trp (peptide z3) (SEQ ID NO: 2) Example 3 Ala-Arg-Arg-Trp-Arg (peptide Z2) (SEQ ID NO: 3) Example 4 Ala-Arg-Arg-Trp-^rg-Lys (peptide Z1) (SEQ ID NO: 4) Example 5 ＾rg-A rg-G I y-A I a-A rg-A rg-T rp- ^rg-Lys (peptide 2) (SEQ ID NO: 5) The peptides in Examples 1 to 6 (corresponding to SEQ ID NOs: 1 to 5 and 17, respectively) are all Synthesized by field solid-phase method, analyzed by amino acid analysis and reversed-phase HPLC. was analyzed. All peptides have amino acid sequences predicted from their structures, and A purity of at least 95% was obtained (selected as a single peak on reversed-phase HPLC). ). Peptide concentrations were calculated from amino acid analysis data.

例７ アフリカッメガエルの卵とウシの脳のＰＫＣ活性アフリカッメガエルの卵を用い た実験によって、異なる刺激または阻害剤のマイクロインジェクションに反応し て生じた細胞***シグナルにおける様々な酵素活性の役割を探ることができる。Example 7 PKC activity in African frog eggs and cow brain using African frog eggs Depending on the experiment, the response to microinjection of different stimuli or inhibitors. The role of various enzymatic activities in cell division signals generated by cell division can be explored.

アフリカッメガエルの卵成熟における　ＰＫＣの機能的な重要性を知るため・に 、我々はまず、古典的なＰＫＣ亜種の非常に良く知られた活性化剤であるホルボ ールミリステート酢酸（ＰＭＡ　／　ｐｈｏｒｂｏｌｓｙｒｉｓｔａｔｅ　ａｃ ｅｔａｔｅ　）　（Ｙ、Ｎ１５ｈｉｚｕｋａ、（１９８ｇ）　ｆｏｅ、　ｃｉｔ 、）が、卵において成熟促進因子であるヒストンｌキナーゼ（Ｈｌ−ｋｉｎａｓ ｅ）を活性化するかどうかを調べた（　Ｇａｒｃｌａｄｅ　Ｈｅｒｒｅｒｏｓ　 ｅｔ　ａｌ、、（１９９１）、Ｉｏｃ、　ｃｉｔ、）　ｏ図１の結果から明らか に２００ｎｇ／ｌまでのＰＭＡの添加は、形質転換Ｖ−）１−ｒａｓ　ｐ２１ま たはに活性化されたＢ、ｃｅｒｅｕｓからのＰＣ−Ｐｌ、Ｃのマイクロインジェ クションによって活性化されたものと比較して、旧キナーゼの非常に弱い活性化 をもたらした（Ｌａｒｒｏｄｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０）、ｆｏｅ、　ｃ ｌｔ　；　Ｇａｒｃｌａ　ｄｅＨｅｒｒｅｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）、 Ｉｏｃ、ｃｊｔ、）　ｏ　これらの結果より、ＰＭＡ感受性ＰＸＣの活性がアフ リカッメガエルの卵には豊富に存在せず、もし存在したとしても旧キナーゼの活 性に直接的に関与はしていないと理解される。To understand the functional importance of PKC in egg maturation of African frogs , we first investigated phorbo, a very well-known activator of classical PKC subspecies. PMA/phorbolsyristate ac etate) (Y, N15hizuka, (198g) foe, cit ) is a maturation-promoting factor, histone l kinase (Hl-kinas), which is a maturation-promoting factor in eggs. e) was investigated whether it activates (Garclad Herreros et al., (1991), Ioc, cit,) o It is clear from the results in Figure 1. Addition of up to 200 ng/l PMA to transformed V-)1-ras p21 or Microinjection of PC-Pl, C from activated B, cereus very weak activation of the old kinase compared to that activated by (Larrodera et al. (1990), foe, c. lt; Garcla de Herreros et al. (1991), Ioc, cjt,) o These results indicate that the activity of PMA-sensitive PXC is affected. It is not abundantly present in the eggs of Licatta frog, and even if it is present, the activity of the old kinase is It is understood that it is not directly involved in sex.

それゆえ、ＰＫＣの活性はアフリカッメガエルの卵の抽出物を用いて分析した。Therefore, the activity of PKC was analyzed using African frog egg extract.

表１の結果はＰＫＣの活性は卵の抽出液で明らかに検出できることを示している が、しかしながらそのレベルは、例えばウシの脳のような他の組織と比較して非 常に低い（表１のペプチド−無添加）。The results in Table 1 show that PKC activity can be clearly detected in egg extracts. However, the levels are non-existent compared to other tissues, such as bovine brain. Always low (peptides from Table 1 - no additions).

表　１ アフリカッメガエル卵とウシの脳の抽出液のプロティンキナーゼＣの活性 ６段階目（ｓｔａｇｅ　Ｖｌ）の卵とウシの脳を、２０５Ｍ　Ｔｒｌｓ−）ＩＣ １，ｐＨ７，４，５ｍＭ　ｂ−メルカプトエタノール、　０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ 、　２ｍＭＥＤＴ＾、１０μＭ　ＰＭＳＦ、　１０　μｇ／ｍｌ　ロイペプチン 。Table 1 Activity of protein kinase C in African frog egg and bovine brain extracts Eggs and bovine brains at the 6th stage (stage Vl) were transferred to 205M Trls-) IC. 1, pH 7, 4, 5mM b-mercaptoethanol, 0.5mM EGTA , 2mMEDT^, 10μM PMSF, 10μg/ml leupeptin .

１％トライトンｘ−ｉｏｏを含む溶液中でホモゲナイズした。Homogenized in a solution containing 1% Triton x-ioo.

４５分間氷上で静置後、抽出液を３０分間１００．０００　Ｘｇで遠心分離した のち、ＰＫＣをＮ１５ｈｌｚｕｋａ　（１９８Ｂ）　ｌｏｃ、ｃｉｔ、によって 示された方法にしたがって精製した。プロティンキナーゼＣの活性は、リン酸の 受容体としてミニリン塩基性タンパクを用い、５−１０−ｇの異なったタンパク 量の抽出液で測定した。インキュベーションはＣａ””　（１００ｍＭ）の存在 下で、１００μｇ／ｍｌのホスファチジルセリン（ＰＳ）とＰＭＡ（５μｇ／ｌ ）の存在下、または非存在下で行なった。After standing on ice for 45 minutes, the extract was centrifuged at 100,000×g for 30 minutes. Later, PKC was established by N15hlzuka (198B) loc, cit. Purified according to the method indicated. The activity of protein kinase C is Using miniphosphobasic protein as the receptor, 5-10-g of different proteins The amount of extract was measured. Incubation in the presence of Ca'' (100mM) Below, 100 μg/ml phosphatidylserine (PS) and PMA (5 μg/l ) in the presence or absence of

ＰＫＣアイソタイプα、βおよびγに対応するペプチドＡ（配列番号６）、ζに 対応するペプチドＤ（配列番号７）およびεに対応するペプチドＥ　（配列番号 ８）の混合液を終濃度で５ｍＭになるようにいくつかのチューブに加えた。結果 は、同じ反応を二重に独立して３回行なった平均値±ＳＤである。Peptide A (SEQ ID NO: 6), corresponding to PKC isotypes α, β and γ, to ζ Corresponding peptide D (SEQ ID NO: 7) and peptide E corresponding to ε (SEQ ID NO: The mixture of 8) was added to several tubes at a final concentration of 5mM. result are the mean ± SD of the same reaction performed three times independently in duplicate.

我々は次に、卵において、ＰＭＡによって旧キナーゼの活性化がおこるＰＫＣに 依存した経路の再構成を試みた。Next, we investigated PKC in eggs, where PMA activates the old kinase. An attempt was made to reconstruct the dependent routes.

従ってすでに確立されたプロトコルにしたがいウシの脳からＰＫＣを部分精製し 、アフリカッメガエルの卵にマイクロインジェクトした。これによって旧キナー ゼの活性に何の効果も見られなかったが、ＰＫＣをマイクロインジェクトした卵 をＩＱＯｎｇ／ｍｌのＰＭＡと共にインキュベーションしたところ、旧キナーゼ を著しく活性化させた。すなわち、精製されたＰＫＣをマイクロインジェクトす ることによって卵成熟に関与する少なくともいくつかのパラメーターが活性化さ れ、障＾に活性化されるＰＫＣ依存経路の再構成が可能である。したがって、ウ シ脳のＰＫＣの供給がなければ、ＰＭＡ−ＰＫＣ依存の経路が卵成熟において決 定的な役割を担ってはいないことは明らかとならなかった。Therefore, PKC was partially purified from bovine brain according to established protocols. , was microinjected into African frog eggs. This makes the old Kinner Although no effect was observed on PKC activity, eggs microinjected with PKC When incubated with IQOng/ml of PMA, the old kinase was significantly activated. That is, by microinjecting purified PKC. At least some parameters involved in oocyte maturation are activated by As a result, it is possible to reconstitute PKC-dependent pathways activated by the disorder. Therefore, Without the brain's supply of PKC, the PMA-PKC-dependent pathway is determined during oocyte maturation. It was not clear that he had no fixed role.

いくつかのキナーゼは偽基質領域と呼ばれる自己阻害領域を持っている（Ｓｏｄ ｅｒｌｌｎｇ、　１９９０．　ｆｏｅ、　ｃｌｔ、）　ｏ我々はアフリカッメガ エルの卵を用い、それぞれのＰｌ［Ｃに特異的な偽基質領域のペプチドをマイク ロインジェクトすることによって、細胞***シグナルの伝達における異なったＰ ＫＣアイソタイプの役割を探ることができるかも知れないと考えた。ＰＫＣアイ ソタイプが卵に存在することを考慮して、ペプチドＡ、Ｄ、Ｅおよび２を合成し た。ペプチドＡ　（配列番号６）はＰＫＣアイソタイプα、βおよびγに保存さ れた偽基質領域の配列を持っており、それゆえこれらのＰＫＣに対する阻害剤と して候補になりうる（Ｏｓａｄａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、ｅｈｅｍ、 　２６５．２２４３４　（１９９０）　）。Some kinases have an autoinhibitory region called the pseudosubstrate region (Sod erllng, 1990. foe, clt,) o we are african mega Using L. eggs, the peptides in the pseudosubstrate region specific to each Pl[C were identified. By injecting different P in the transmission of cell division signals. We thought it might be possible to explore the role of the KC isotype. PKC eye Considering that sotypes exist in eggs, synthesize peptides A, D, E and 2. Ta. Peptide A (SEQ ID NO: 6) is conserved in PKC isotypes α, β and γ. These PKC inhibitors have can be a candidate (Osada et al., J. Biol, ehem. 265.22434 (1990)).

ペプチドＤ、Ｅおよび２　（それぞれ配列番号７．８および５に対応）はアイソ タイプδ、εおよびこの偽基質領域と同じ配列をそれぞれ持っており、そしてそ れらはＰＫＣアイソタイプα、βまたはγの配列とはかなり異なっている（Ｏｓ ａｄａ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０）！ｏｃ、ａｌｔ、図１の説明を見よ）それゆ え、ＰＫＣアイソタイプα、β、γ、δおよびεの良い阻害剤であると考えられ ている保存された偽基質領域に対応する３種のペプチドの混合液を卵にマイクロ インジェクトしたのち、２５ｍＵのＢ、　ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣまたは２ ０ｎｇの形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１をマイクロインジェクトし、もしくは 、インスリン（１ｓＭ）またはプロゲステロン（１１Ｍ）と共にインキュベート した。対照実験としてウシの脳由来ＰＫＣをマイクロインジェクトしインキュベ ートした後、１１００ｎ　／−１のＰＭＡを加えた。図１の結果から、Ｉ’ＫＣ のマイクロインジェクトされた卵にＰＭＡを加えることによりその機能的パラメ ーターの活性化を完全に阻害したにもかかオ）らず、明らかに偽基質ペプチドＡ 、Ｄ、Ｅ　（配列番号Ｂ、７．８　）は、プロゲステロン、インスリン、形質転 換ｖ−Ｈ−ｒａｓ、　Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣのＨｌキナーゼに対する 活性化に影響を及ぼさないことを示している。Peptides D, E and 2 (corresponding to SEQ ID NO: 7.8 and 5, respectively) are iso types δ, ε and each have the same sequence as this pseudosubstrate region, and They differ considerably from the sequences of PKC isotypes α, β or γ (Os ada et al, (1990)! oc, alt, see explanation in Figure 1) It is considered to be a good inhibitor of PKC isotypes α, β, γ, δ and ε. A mixture of three peptides corresponding to the conserved pseudosubstrate region is microinjected into eggs. After injecting, 25 mU of B, cereus PC-PLC or 2 Microinject 0 ng of transformed v-H-ras p21, or , incubated with insulin (1sM) or progesterone (11M) did. As a control experiment, bovine brain-derived PKC was microinjected and incubated. After heating, 1100n/-1 of PMA was added. From the results in Figure 1, I'KC The functional parameters of microinjected eggs can be improved by adding PMA to the microinjected eggs. Although the activation of peptide A was completely inhibited, it was clear that the pseudosubstrate peptide A , D, E (SEQ ID NO: B, 7.8) are progesterone, insulin, transformation Converting v-H-ras, B, cereus to Hl kinase of PC-PLC This shows that it does not affect activation.

注意すべき点はウシ脳とアフリカッメガエル卵のインビトロのアッセイ系におい て、偽基質ペプチドの混合液は完全にＰＫＣの活性を阻害したことである（表１ ）。これらすべてのデータから上に挙げたＰＫＣアイソタイプは、インスリン／ 　ｒａｓ　Ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＯによる成熟シグナルの伝達に関与していな いことが強く示唆された。It should be noted that the in vitro assay system using bovine brain and African frog eggs Therefore, the mixture of pseudosubstrate peptides completely inhibited PKC activity (Table 1). ). All these data indicate that the PKC isotypes listed above are insulin/ Not involved in maturation signal transmission by ras P21/PC-PLO It was strongly suggested that

これまでに示された結果は、継続的な線維芽細胞のホルボールエステルへの暴露 によるＰＭＡ感受性ＰＫＣアイソタイプの下方制御（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔ ｉｏｎ　）は、ｒａｓ　ｐ２１／　ＰＣ−ＰＬＣに対するシグナル応答に影響し ない（Ｐ。The results shown so far demonstrate that continuous fibroblast exposure to phorbol esters down-regulate PMA-sensitive PKC isotypes by ion) affects the signal response to ras p21/PC-PLC. No (P.

Ｌａｒｒｏｄｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、（１９９０シロｏｃ、ｃｉｔ、；　Ｍ、Ｔ 、Ｄｌａｓ−Ｍｅｃ。Larrodere et al, (1990 Shiro oc, cit,; M, T , Dlas-Mec.

ｅｔ　ａｌ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２ＢＢ、２２５９７（１９９１）　） という過去に示された実験結果と一致する。アフリカッメガエルの卵に存在する 他のＰＫＣアイソタイプ、すなわちζ−ＰＫＣ。et al J, Biol, Chem, 2BB, 22597 (1991)) This is consistent with the experimental results shown in the past. Present in African frog eggs Other PKC isotypes, namely ζ-PKC.

の中で一つの重要な性質はＰＭＡに対する感受性を欠いているということである （Ｙ、　Ｏｎａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｂ１．ｏｌ、　Ｃｈｅｗ。One important property is that it lacks susceptibility to PMA. (Y, Ona et al, J, B1.ol, Chew.

２８３．８９２７（１９８Ｂ）　ａｎｄ　Ｙ、　Ｏｎａ　ｅｔ　ａｌ、、　（１ ９８９）　ｌｏｃ、ｃｉ’ｔ、　）。それゆえ、アフリカッメガエルの卵成熟に おいてＰＫＣアイソタイプが何らかの役割を演じるとすれば、アイソタイプζは よい候補であると思われる。283.8927 (198B) and Y, Ona et al, (1 989) loc, ci’t, ). Therefore, egg maturation in African frogs If the PKC isotype plays a role in Seems like a good candidate.

ζ−ＰＫＣに関するこの仮説を実証するため、我々はまずアフリカッメガエルか らζ−ＰＫＣのホモローブのｃＤＮＡをクローニングした。この目的のために、 我々はアフリカッメガエルの卵から作成したｃＤＮ＾ライブラリーを利用し、ラ ットの脳のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法で増幅した６５６塩基対のＤＮＡ 断片をプローブとし、そして適当なプライマーを用いた。このプローブはシステ ィン残基に富む領域を含むこの酵素の制御領域を包んでいる。To test this hypothesis regarding ζ-PKC, we first tested the African frog frog The cDNA of the homolobe of ζ-PKC was cloned. For this purpose, We used a cDN^ library created from African frog eggs to 656 base pair DNA amplified by PCR method from a human brain cDNA library The fragment was probed and appropriate primers were used. This probe is It encompasses the regulatory region of this enzyme, including a region rich in phosphoryl residues.

このクローンの塩基配列から、アフリカッメガエルのζ−ＰＫＣはアミノ酸のレ ベルでラット脳の同族体と　９２％の相同性を持つことが明らかになった。シス ティンに富む領域、ＡＴＰ結合領域を含めてこの酵素の重要な特徴は、すべて完 全に保存されていた。興味深いことに偽基質領域に対応する配列はアミノ酸のレ ベルで、ラット脳の同族体と１００％の相同性が見られた。Based on the nucleotide sequence of this clone, ζ-PKC of African frog has an amino acid level. It was revealed that it has 92% homology with the rat brain homologue. Sith All important features of this enzyme, including the tin-rich and ATP-binding regions, are completely intact. It was completely preserved. Interestingly, the sequence corresponding to the pseudosubstrate region is 100% homology with the rat brain homologue.

結局、ζｎ　Ｐ　Ｋ　Ｃと名付けられた新しいＰＫＣのイソ酵素は、ラット脳の 同じ６５６塩基対の断片を用いて、アフリカッメガエルの卵より単離された。こ の酵素はラット脳のζ−ＰＫＣ同族体と非常に類似しているが別個のものである 。そしてζ−ＰＫＣと非常に高い相同性を持ち（ラット脳の同族体とアミノ酸の レベルで７３％の相同性を持っている）全体の構造が良く似ている。偽基質領域 はアフリカッメガエルのζ−ＰＫＣおよびζｎＰＫＣおよびラット脳ζ−ＰＫＣ 間で完全に保存されている。Eventually, a new PKC isoenzyme named ζnPKC was discovered in the rat brain. The same 656 base pair fragment was isolated from African frog eggs. child The enzyme is very similar to, but distinct from, the rat brain ζ-PKC homolog. . It has very high homology with ζ-PKC (rat brain homolog and amino acid (73% homology) Their overall structures are very similar. Pseudostromal region are African frog ζ-PKC and ζnPKC and rat brain ζ-PKC. perfectly preserved between.

ＰＫＣアイソタイプこの偽基質領域と同一の配列（配列番号５）を持つ合成ペプ チドをマイクロインジェクトされた卵は、プロゲステロンの添加に対し反応した が、インスリン、ｒａｓ　Ｐ２１またはＰＣ−ＰＬＣによる刺激に対し反応しな いことが、図１の結果から証明される。ＰＫＣをマイクロインジェクトされた卵 において旧キナーゼを刺激するＰＭＡの能力は、このペプチドを加えることによ って影響されなかった。このことからインスリン／　ｒａｓ　Ｐ２１／　ＰＣ− ＰＬＯに応答する細胞***シグナルの伝達において、ζ−ＰＫＣは特異的なさら に重要な過程を担っていることが強く指示される。プロゲステロンによって活性 化される成熟過程にこのペプチドが関与しないという事実は、インスリンが関与 する経路のへの影響という特異性に対する良いコントロールである。PKC isotype Synthetic peptide with sequence identical to this pseudosubstrate region (SEQ ID NO: 5) Eggs microinjected with Tido responded to the addition of progesterone. does not respond to stimulation by insulin, rasP21 or PC-PLC. This is proven from the results shown in Figure 1. Eggs microinjected with PKC The ability of PMA to stimulate the old kinase in It didn't affect me. From this, insulin/ras P21/PC- In transducing cell division signals in response to PLO, ζ-PKC plays a specific role. It is strongly suggested that this process plays an important role in activated by progesterone The fact that this peptide is not involved in the maturation process that occurs suggests that insulin is involved. This is a good control for the idiosyncrasies of the effect on the pathway.

アフリカッメガエルの６段階目の卵にどのタイプの特異的ＰＫＣアイソタイプが 存在するかを決定するため、それぞれのＰＫＣアイソタイプに特異的な抗体を用 い、卵の抽出液のイムノプロットを行なった。アイソタイプα、βおよびγに特 異的な抗体を用いたイムノブロッティングにより、卵の抽出液中に８０ｋＤａの バンドが検出されたことを図２　（パネルＡ）の結果は示している。同様に、ζ −ＰＫＣに特異的な抗体を用いたイムノブロッティングから、明らかに約８５ｋ Ｄａの分子量のバンドが検出された（図２、パネルＢ）。このサイズはラット脳 のｃＤＮＡの塩基配列データ（Ｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．Ｉｏｃ、ｃ ｉｔ、　）とアフリカッメガエルの卵（例９を見よ）からのデータに一致する。Which type of specific PKC isotype is present in the 6th stage egg of the African frog? antibodies specific for each PKC isotype were used to determine whether Immunoplotting of the egg extract was performed. Specific to isotypes α, β and γ Immunoblotting using different antibodies revealed that 80 kDa was detected in egg extract. The results in Figure 2 (panel A) show that the band was detected. Similarly, ζ - Immunoblotting using antibodies specific for PKC revealed that approximately 85k A band with the molecular weight of Da was detected (Figure 2, panel B). This size is a rat brain cDNA base sequence data (Ono et al., 1989. Ioc, c ) and data from African frog eggs (see Example 9).

これらのバンドはイソ酵素に特異的なペプチドが抗体をブロックすることにより 、特異的に消去された（図２、＋ペプチド）。アイソタイプζおよびεのみにそ れぞれ特異的な抗体を用い、卵の抽出液のイムノブロッティングを行なったとこ ろ、これらの抗体はラット脳の抽出液を用いた場合は対応するＰＫＣアイソタイ プが検出されたが、卵の抽出液では検出されなかった（データは示していない） 。These bands are caused by isoenzyme-specific peptides blocking antibodies. , specifically deleted (Fig. 2, + peptide). Only available for isotypes ζ and ε. We performed immunoblotting of egg extracts using specific antibodies. However, when using rat brain extract, these antibodies were tested with the corresponding PKC isotype. but not in the egg extract (data not shown). .

実際にペプチド２　（配列番号５）がζ−ＰＫＣの活性をブロックするかどうか を決めるため、以下の実験を行なった。卵の抽出液を特異的な抗ζ−ＰＫＣ抗体 を用い、上に記した方法で免疫沈降を行なった。そしてプロティンＧアガロース で回収した免疫複合体のζ−ＰＫＣの自己リン酸化活性を測定した。図３の結果 から、ホスファチジルセリンの存在下において免疫複合体をインキュベート【ま た時に、ζ−ＰＫＣの劇的な自己リン酸化が確認された。興味深いことに、０． １μＭという少ない濃度のペプチドＺ　（配列番号５）により、ζ−ＰＫＣの自 己リン酸化が完全に阻害された（図３）。同様のレベルのこの活性の阻害が、ペ プチドＺ　（配列番号５）の２０倍の濃度のペプチド＾　（配列番号６）で検出 された。これらの結果からペプチドＺ　（配列番号５）によるζ−ＰＫＣの阻害 は確かに特異的であることが示された。Whether peptide 2 (SEQ ID NO: 5) actually blocks the activity of ζ-PKC To determine this, we conducted the following experiment. Anti-ζ-PKC antibody specific for egg extract Immunoprecipitation was performed using the method described above. and protein G agarose The autophosphorylation activity of ζ-PKC in the immune complexes collected was measured. Results of Figure 3 Incubate the immune complexes in the presence of phosphatidylserine from At the same time, dramatic autophosphorylation of ζ-PKC was confirmed. Interestingly, 0. Peptide Z (SEQ ID NO: 5) at a concentration as low as 1 μM inhibits ζ-PKC. Autophosphorylation was completely inhibited (Figure 3). Similar levels of inhibition of this activity Detected with peptide^ (SEQ ID NO: 6) at a concentration 20 times that of Putide Z (SEQ ID NO: 5) It was done. These results indicate that inhibition of ζ-PKC by peptide Z (SEQ ID NO: 5) was indeed shown to be specific.

１旦 卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）の阻害 アフリカッメガエル卵ではＨ１キナーゼの活性化が卵成熟の制御に重要であるた め、おそらくは、ペプチドＺ（配列番号５）をマイクロインジェクションするこ とにより、プロゲステロンではなくインスリン経路の刺激に応答して卵核胞崩壊 （ＧＶＢＤ）が阻害される。表２の結果は実際にこのことが事実であることを示 している。Once Inhibition of germinal vesicle breakdown (GVBD) In African frog eggs, activation of H1 kinase is important for controlling egg maturation. Therefore, it is probably possible to microinject peptide Z (SEQ ID NO: 5). and follicle collapse in response to stimulation of the insulin pathway rather than progesterone. (GVBD) is inhibited. The results in Table 2 show that this is indeed the case. are doing.

従って、形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１やまたはＢ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−Ｐ ＬＣをマイクロインジェクションすることにより、インスリンまたはプロゲステ ロンの添加による場合と同等に強力な卵成熟の応答が促進される。精製されたウ シ脳のＰＫＣを前もって卵にマイクロインジェクトしなければ、ＰＭＡのみの添 加で卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）は誘発しない。これは旧キナーゼのデータと一致す る。ペプチドＡ　（配列番号Ｂ）をマイクロインジェクションすることにより、 ＰＫＣをマイクロインジェクトされた卵においてＰＭＡに誘発される卵成熟が阻 害されたことは注目すべき点であるが、しかし、インスリン／　ｒａｓ　ｐ２１ 　／　ＰＣ−ＰＬＯまたはプロゲステロンに対しては卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）の 誘発の効果は、はんのわずかかあるいは全く見られなかった。興味深いことに、 ペプチドＺ　（配列番号５）のマイクロインジェクションは、形質転換ｖ−Ｈ− ｒａｓ　ｐ２１．　Ｂ、ｃｅｒｅｕｓＰＣ−ＰＬＣのマイクロインジェクション あるいはインスリンの添加に対して、卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）を完全に阻害した 。Therefore, transformed v-H-ras p21 or B, cereus PC-P insulin or progesterone by microinjection of LC. An equally strong oocyte maturation response is promoted by the addition of Ron. refined cormorant If PKC from the brain is not previously microinjected into the eggs, the addition of only PMA It does not induce germinal vesicle collapse (GVBD). This is consistent with the data for older kinases. Ru. By microinjecting peptide A (SEQ ID NO: B), PMA-induced oocyte maturation is inhibited in eggs microinjected with PKC. It is noteworthy that insulin/ras p21 / For PC-PLO or progesterone, the Little or no effect of induction was seen. Interestingly, Microinjection of peptide Z (SEQ ID NO: 5) ras p21. B. Microinjection of cereusPC-PLC Alternatively, in response to the addition of insulin, germinal vesicle collapse (GVBD) was completely inhibited. .

プロゲステロンまたはＰＫＣをマイクロインジェクトされた卵のＰＭＡに応答し て誘発される卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）は、ペプチドＺ　（配列番号５）のマイク ロインジェクションによって影響を受けないことは注目すべき点である。in response to PMA in eggs microinjected with progesterone or PKC. Vulcanic vesicle collapse (GVBD) induced by peptide Z (SEQ ID NO: 5) It is noteworthy that it is not affected by loin injection.

表　２ アフリカッメガエル卵の成熟における偽基質ペプチドＡとＺ　（配列番号はそれ ぞれ６と５）の効果２０個ずつの卵のグループを修正Ｂａｒｔｈ　溶液中におい て２０℃でインキュベートし、卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）を動物極に出現した白い スポットから算定した。いくつかの場合では、核崩壊は１０％トリクロロ酢酸固 定化卵を分解して決定した。卵には対照として緩衝液またはｌｏｇの精製したウ シのＰＫＣをマイクロインジェクトした。その後、対応する卵に水またはペプチ ド＾が２　（終濃度で５ｍＭになるよう卵に加える）をそれぞれマイクロインジ ェクトした。ソノ後、卵をＰＭＡ　（１１００ｎ／ｓｌ）　、インスリン（１１ Ｍ）またはプロゲステロン（ｌｓＭ）存在下でインキュベートするか、形質転換 ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２ｆ　（２０ｎｇ）またはＢ。Table 2 Pseudosubstrate peptides A and Z in the maturation of African frog eggs (SEQ ID NO: Effects 6 and 5) of each group of 20 eggs were placed in a modified Barth solution. Incubate at 20°C to observe germinal vesicle collapse (GVBD). Calculated from spot. In some cases, nuclear decay is induced by 10% trichloroacetic acid solids. Determined by disassembling embryonic eggs. Eggs were treated with buffer or log of purified eggs as a control. microinjected PKC. Then add water or peptide to the corresponding eggs Microinject 2 (add to the eggs to a final concentration of 5mM) into each was applied. After sowing, eggs were treated with PMA (1100n/sl) and insulin (11 M) or incubation in the presence of progesterone (lsM) or transformation. v-H-ras p2f (20 ng) or B.

ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣ（２５１ＩＵ）をマイクロインジェクトし、卵核胞 崩壊（ＧＶＢＤ）を６時間後に決定した。結果は、同じ実験を繰り返し　３回独 立に行なった平均値±ＳＤである。Microinject cereus PC-PLC (251 IU) and Disintegration (GVBD) was determined after 6 hours. The results were obtained by repeating the same experiment three times. The average value ±SD is the average value ±SD.

乳す アフリカッメガエル卵の成熟促進因子Ｈ１キナーゼ活性化におけるζ−ＰＫＣに 対するアンチセンスＲＮＡの効果卵成熟におけるζ−ＰＫＣの重要性をさらに示 すため、塩基配列で−１０から＋６００を含むζ−ＰＫＣの制御領域のＤＮＡ断 片をｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングをした。センス鎖とアンチセン ス鎖のＩ？ＮＡをそのプラスミドがらインビトロで合成し、６段階目の卵にマイ クロインジェクトＬ７た。マイクロインジェクトしたのち異なった時間に、卵を 抽出し、イムノブロッティングにより異なるＰＫＣアイソタイプの存在量を測定 し７た。図４の結果がら、２５ｎｇのζ−ＰＫＣに対するアンチセンスＲＮ＾を マイクロインジェクトしたのち４８時間後に、このタンパクの相当な減少が確認 されが、アイソタイプα、βおよびγに特異的な抗体を用い免疫反応したバンド には、影響を与えなかった。それゆえ、この方法論を用いて我々は卵におけるζ −ＰＫＣを特異的に消去することに成功した。水または対照としてセンス鎖のＲ ＮＡをマイクロインジェクトした場合は、いずれのＰＫＣアイソタイプに対し何 の影響も与えなかった（図４）。milk ζ-PKC in the activation of maturation-promoting factor H1 kinase in African frog eggs The effect of antisense RNA on oocyte maturation further demonstrates the importance of ζ-PKC in oocyte maturation. In order to The fragment was subcloned into pBIuescript. sense strand and antisene Su chain I? NA is synthesized from the plasmid in vitro and transferred to eggs at the 6th stage. Cloinject L7. eggs at different times after microinjection. Extract and measure the abundance of different PKC isotypes by immunoblotting It was seven years ago. Based on the results in Figure 4, 25 ng of antisense RN^ against ζ-PKC was A significant decrease in this protein was confirmed 48 hours after microinjection. The bands were immunoreacted using antibodies specific for isotypes α, β, and γ. had no impact. Therefore, using this methodology we - Succeeded in specifically eliminating PKC. Water or R of the sense strand as a control When microinjected with NA, there is no effect on either PKC isotype. (Figure 4).

従って、ζ−ＰＫＣに対するセンス鎖、アンチセンス鎖のＲＮＡと共に４８時間 インキュベートした卵に、２５μＵのＢ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣ、または ２０ｎｇの形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓｐ２１をマイクロインジェクトするか、また は、インスリン（１μＭ）かプロゲステロン（ｌμＭ）と共に保温した。図５Ａ の結果から、ζ−ＰＫＣの消去した卵は、プロゲステロンの添加に対して完全に 応答するのに対し、インスリン、ｒａｓ　ｐ２１　ｓまたはＰＣ−ＰＬＯの刺激 に対して効果的には応答しないことが明らかになった。この結果は、ζ−ＰＫＣ がインスリン／　ｒａｓ　ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＣに応答する成熟シグナル伝 達において、特異的で重要な役割を果たしていることを強く示している。プロゲ ステロンに活性化される成熟過程がζ−ＰＫＣの消去により影響を受けないとい う事実は、インスリン経路におけるこの効果の特異性に対する良いコントロール となる。水またはセンス鎖のＲＮＡをマイクロインジェクトしたコントロールの 卵には、同時に形質転換Ｖ−Ｈ−ｒａｓ　またはＰＣ−ＰＬＣをマイクロインジ ェクトし、もしくは、インスリンまたはプロゲステロン存在化でインキュベート した（図５Ａ）。水またはζ−ＰＫＣのセンス鎖ＲＮＡをマイクロインジェクト した場合には、これらの分子のＩ１１キナーゼを活性化するは能力には影響を与 えなかった。Therefore, for 48 hours together with sense and antisense strand RNA for ζ-PKC. Incubated eggs were treated with 25 μU of B, cereus PC-PLC, or Microinject 20 ng of transformed v-H-rasp21 or were incubated with insulin (1 μM) or progesterone (1 μM). Figure 5A From the results of In response, stimulation of insulin, rasp21s or PC-PLO It has become clear that they do not respond effectively to This result shows that ζ-PKC maturation signal transduction in response to insulin/ras p21/PC-PLC. This strongly suggests that it plays a specific and important role in this process. pro game The maturation process activated by steroids is not affected by the deletion of ζ-PKC. The fact is that there is good control over the specificity of this effect in the insulin pathway. becomes. Controls microinjected with water or sense strand RNA At the same time, the eggs were microinjected with transformed V-H-ras or PC-PLC. or incubated in the presence of insulin or progesterone. (Figure 5A). Microinject water or ζ-PKC sense strand RNA In this case, the ability of these molecules to activate I11 kinase may be affected. I couldn't.

小さいアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、卵においてタンパクの発現阻 害に利用可能な方法である（Ｓｕｓｉｋａｗａ　ａｎｄ　Ｍ目ｅｄｌ、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃ１．ｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ８５、１３０２（１９８８））。そ れゆえ、卵におけるζ−ＰＫＣを消去する独立した方法として、我々はζ−ＰＫ Ｃの開始コドンから始まる１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、対応 するセンス鎖と対照としてナンセンス鎖（意味を持たない配列）と共に合成した 。核酸分解酵素による消化を防ぐために、オリゴヌクレオチドのバックボーンを ホスホロチオエートに修飾した（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８７）、８４（２１） 、７７０６；Ａｇｒａｖａｌ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。The use of small antisense oligonucleotides can inhibit protein expression in eggs. It is a method that can be used to harm (Susikawa and M edl, Proc. , Natl, Ac1. d, Sci, LISA85, 1302 (1988)). So Therefore, as an independent method to eliminate ζ-PKC in eggs, we A 15 base antisense oligonucleotide starting from the start codon of Synthesized with a sense strand and a nonsense strand (sequence without meaning) as a control. . The backbone of the oligonucleotide is modified to prevent digestion by nucleolytic enzymes. modified to phosphorothioate (Matsukura et al., Pro c, Na11. Ac1d, Sci, USA (1987), 84(21) , 7706; Agraval et at, Proc, Natl.

＾ｃｌｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ（１，９８８）、１ｉ５（１９）、７０７９）　 、　ｆ５０ｎｇのセンス鎖（配列番号１５）、アンチセンス鎖（配列番号１４） 、およびナンセンスオリゴヌクレオチドを卵にマイクロインジェクトした。アン チセンスオリゴヌクレオチドをマイクロインジェクトした卵の抽出液をウェスタ ンプロットしたところζ−ＰＫＣの相当な減少が確認された。他のＲＫＣアイソ タイプに対しては全く影響を及ぼさなかった（データは示していない）。センス 鎖、ナンセンス鎖オリゴヌクレオチドのマイクロインジェクションでは、卵中の どのＰＫＣアイソタイプの存在量にも影響を与えなかった。それゆえ、卵に２５ μＵのＢ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣまたは２０ｎｇの形質転換ｖ−Ｈ−ｒａ ｓ　ｐ２１をマイクロインジェクトするか、またはインスリン（１μＭ）または プロゲステロン（１μＭ）存在下でインキュベートした。図５Ｂの結果から、ζ −ＰＫＣを減少させた卵はプロゲステロンの添加に対しては通常の応答を示した が、インスリン、ｒａｓ　ｐ２１またはＰＣ−ＰＬＣに対しては応答力が大きく 減少した。センス鎖、ナンセンス鎖オリゴヌクレオチドのマイクロインジェクシ ョンは、この研究で試されたあらゆる刺激に対する旧キナーゼの活性に影響を及 ぼさなかった。^cld, Set, USA (1,988), 1i5 (19), 7079) , f50ng sense strand (SEQ ID NO: 15), antisense strand (SEQ ID NO: 14) , and nonsense oligonucleotides were microinjected into eggs. Ann Wester the egg extract microinjected with thisense oligonucleotide. When plotted, a considerable decrease in ζ-PKC was confirmed. Other RKC iso There was no effect on type (data not shown). sense microinjection of strand, nonsense strand oligonucleotides in eggs. There was no effect on the abundance of any PKC isotypes. Therefore, 25 eggs μU of B, cereus PC-PLC or 20 ng of transformed v-H-ra Microinject sp21 or insulin (1 μM) or It was incubated in the presence of progesterone (1 μM). From the results in Figure 5B, ζ - Eggs with reduced PKC showed a normal response to the addition of progesterone. However, the response power is large for insulin, rasp21, or PC-PLC. Diminished. Microinjection of sense and nonsense strand oligonucleotides effect on the activity of the old kinase in response to all stimuli tested in this study. I didn't lose it.

アフリカッメガエルの卵におけるζ−ＰＫＣの減少は、プロゲステロンではなく インスリン／　ｒａｓ　ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＣに応答して生じる卵核胞崩壊 に対する阻害を引き起こすと考えられる。表３の結果はこのことが事実であるこ とを示している。The decrease in ζ-PKC in African frog eggs is due to progesterone, not progesterone. Nuclear follicle collapse that occurs in response to insulin/ras p21/PC-PLC This is thought to cause inhibition of The results in Table 3 indicate that this is true. It shows.

それゆえ、形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１またはＢ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−Ｐ ＬＣのマイクロインジェクションは、インスリンまたはプロゲステロンの添加よ り生じるものと類似の強い成熟応答を引き起こす。興味深いことに、アンチセン スＲＮＡのマイクロインジェクションによるζ−ＰＫＣの減少は、形質転換ｖ− Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１、Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣのマイクロインジェクシ ョン、または、インスリンの添加により誘導される卵核胞崩壊を劇的に阻害した 。この効果の特異性の好ましいコントロールは、プロゲステロンに応答して誘導 された卵核胞崩壊はζ−ＰＫＣの減少により影響されないことである。Therefore, transformed v-H-ras p21 or B, cereus PC-P Microinjection of LC is similar to the addition of insulin or progesterone. induces a strong maturational response similar to that produced by Interestingly, antisene Depletion of ζ-PKC by microinjection of SRNAs in transformed v- H-ras p21, B, cereus PC-PLC microinjection Dramatically inhibited follicular collapse induced by the addition of insulin or the addition of insulin. . A preferred control for the specificity of this effect is induction in response to progesterone. The induced follicle collapse is not affected by the reduction of ζ-PKC.

コントロールと、アンチセンスＲＮＡのマイクロインジェクションによりζ’− ＰＫＣを減少させた卵２０個ずつの両方のグループを、修正Ｂａｒｔｈ溶液中で インキュベートし、異なる処理をした後、動物極に生じた白いスポットから卵核 胞崩壊（ＧＶＢＤ）を算定した。いくつかの場合では、１０％トリクロロ酢酸固 定化卵を分解することで核崩壊を決定した。卵は、ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｉ＞ 　、インスリン（１１Ｍ）、またはプロゲステロン（１ｓＭ）の存在下でインキ ュベートし、または形質転換ｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１　（２０ｎｇ）Ｂ、ｃｅｒ ｅｕｓ　ＰＣ−ＰＬＣ（２５μＵ　）をマイクロインジェクトしたのち、６時間 後誘導された卵核胞崩壊を決定した。結果は、同じ実験を繰り返し３回独立に行 なった平均値上ＳＤである。ＮＤは実験を行なっていないことを示す。Control and ζ'- by microinjection of antisense RNA. Both groups of 20 PKC-depleted eggs were placed in modified Barth's solution. Egg nuclei from white spots that appeared on the animal pole after incubation and different treatments Vesicle breakdown (GVBD) was calculated. In some cases, 10% trichloroacetic acid solids Nuclear decay was determined by disassembling the embryonic eggs. Eggs contain PMA (100ng/mi> Ink in the presence of , insulin (11M), or progesterone (1sM) v-H-ras p21 (20 ng) B, cer 6 hours after microinjecting eus PC-PLC (25μU) Post-induced follicular collapse was determined. The results are based on repeating the same experiment three times independently. The average value is SD. ND indicates that no experiment was conducted.

このキナーゼに対する可能性ある阻害剤の合理的な設計のために、異なるＰＫＣ の偽基質領域のアミノ酸配列の比較を行なった。図６から、これらの配列の始め の３アミノ酸が最も保存されていることが明らかである。それゆえ、この部分は 可能性あるペプチド阻害剤の特異性に寄与しないと思われる。したがって、我々 は始めの３アミノ酸を欠いたペプチドＺｌ　（配列番号４）を合成し、旧キナー ゼに対する印書の能力を試験した。図７の結果がらアフリカッメガエルの卵への Ｚｌ　（配列番号４）のマイクロインジェクションは、完全長の偽基質２（配列 番号５）による阻害の程度と同程度に旧キナーゼの活性化をブロックしｌ二。For the rational design of potential inhibitors against this kinase, different PKC We compared the amino acid sequences of the pseudosubstrate regions of . From Figure 6, the beginning of these arrays It is clear that the three amino acids are the most conserved. Therefore, this part It does not appear to contribute to the specificity of potential peptide inhibitors. Therefore, we synthesized peptide Zl (SEQ ID NO: 4) lacking the first three amino acids, and The ability of printing against ze was tested. The results in Figure 7 show that the effects on African frog eggs are Microinjection of Zl (SEQ ID NO: 4) No. 5) blocks the activation of the old kinase to a similar degree to the degree of inhibition by I2.

さらにＺｌ　（配列番号４）のＣ端を削った偽基質ベブヂドＺ２．　Ｚ３および Ｚ４　（配列番号はそれぞれ３，２．１　）を合成した（図６）。興味深いこと に、Ａ）ＩＲ（Ｚ４．配列番号ｌ）の配列を持つトリペプチドでさえも旧キナー ゼの活性化を阻害した。特異性のコントロールとしてトリペプチドＡＬＲ（Ａ４ ．図６）（配列番号９）を合成した。このペプチドはＰＫＣアイソタイプα、β およびγに特異的な偽基質Ａの欠落させた配列を持つ（図６参照）。図７の結果 は、ペプチドＡ４　（配列番号９）のマイクロインジェクションは旧キナーゼの 活性化に影響を与えないことがわかる。Furthermore, a pseudosubstrate Bebuzido Z2. Z3 and Z4 (SEQ ID NOs: 3 and 2.1, respectively) was synthesized (Figure 6). interesting thing A) Even the tripeptide with the sequence IR (Z4.SEQ ID NO: l) The activation of the enzyme was inhibited. Tripeptide ALR (A4 ．． Figure 6) (SEQ ID NO: 9) was synthesized. This peptide contains PKC isotypes α and β. and a sequence lacking the γ-specific pseudosubstrate A (see Figure 6). Results of Figure 7 The microinjection of peptide A4 (SEQ ID NO: 9) was performed on the old kinase. It can be seen that this does not affect activation.

ζ−ＰＫＣの偽基質領域の配列を含むペプチドの哺乳動物の体細胞の成長を阻害 する能力に関する問題を扱うために、以下の実験を行なった。Peptides containing the pseudosubstrate region sequence of ζ-PKC inhibit the growth of mammalian somatic cells. To address the question of the ability to do things, we conducted the following experiment.

１０％のウシ胎児血清の存在下で成長しているマウス線維芽細胞Ｎ１）１３Ｔ３ にペプチドＺｌ　（配列番号５）をマイクロインジェクトし、ＤＮＡ合成を表４ の説明に示したように測定した。コントロールとして、ＰＫＣアイソタイプα、 βおよびγの偽基質領域に対応する９アミノ酸残基のペプチドＡ　（配列番号６ ）も同様にマイクロインジェクトした。表４の結果、ペプチドｚｌ（配列番号５ ）のマイクロインジェクションにより、増殖する線維芽細胞Ｎ！Ｈ３Ｔ３のＤＮ Ａ合成が劇的に阻害されていることがわかる。一方、ペプチド＾　（配列番号６ ）は、多少あるいは全く影響をり、えていなかった。Mouse fibroblasts N1)13T3 growing in the presence of 10% fetal bovine serum Peptide Zl (SEQ ID NO: 5) was microinjected into the cell, and DNA synthesis was performed as shown in Table 4. Measurements were made as shown in the description. As a control, PKC isotype α, Peptide A of 9 amino acid residues corresponding to the β and γ pseudosubstrate regions (SEQ ID NO: 6 ) was also microinjected in the same way. As a result of Table 4, peptide zl (SEQ ID NO: 5 ), proliferating fibroblasts N! H3T3 DN It can be seen that A synthesis is dramatically inhibited. On the other hand, peptide ^ (SEQ ID NO: 6 ) had some or no influence.

血清を供給してから８から１０時間後（９期から始めて）の線維芽細胞ＮＩＨ３ Ｔ３の細胞質に標識抗体と共にペプチドＡか２　（配列番号はそれぞれ６，５） をマイクロインジェクトした。マイクロインジェクションし、た後直に、チミジ ンの類似体であるブロモデオキシウリジン（Ａｗｅｒｓｈａ■ｊｎｔｅｒｎａｔ ｌｏｎａｌ）を培地に１０００倍希釈になるように加え、細胞を３７℃で２４時 間培養した。細胞を固定し、通常の操作の後、抗標識抗体を用いた免疫蛍光法ま たはブロモデオキシウリジンの取り込みの免疫化学的な検出法を行なった。他の ２回の実験も同じもしくは似たような結果であった。Fibroblasts NIH3 8 to 10 hours after serum feeding (starting at stage 9) Peptide A or 2 (SEQ ID NOs: 6 and 5, respectively) together with labeled antibody in the cytoplasm of T3 was microinjected. Immediately after microinjection, chimiji Bromodeoxyuridine (Awersha jternat) is an analogue of lonal) was added to the medium at a 1000-fold dilution, and the cells were incubated at 37°C for 24 hours. It was cultured for a period of time. Cells were fixed and, after the usual manipulations, immunofluorescence or immunofluorescence using anti-labeled antibodies was performed. An immunochemical detection method for bromodeoxyuridine incorporation was performed. other The two experiments had the same or similar results.

１０％のウシ胎児血清存在下に成育している線維芽細胞スイス−３Ｔ３に異なる ペプチドをマイクロインジェクトした。マイクロインジェクションの２４時間前 に血清飢餓状態にし細胞を同調させた。そしてＤＮＡ合成を表５の説明に示した 方法で測定した。Different from fibroblast Swiss-3T3 growing in the presence of 10% fetal bovine serum. Peptides were microinjected. 24 hours before microinjection Cells were synchronized by serum starvation. And the DNA synthesis is shown in the explanation in Table 5. It was measured by the method.

表５の結果から、ζ−ＰＫＣの偽基質領域の配列を基にしたペプチドのマイクロ インジェクションは、血清に刺激された線維芽細胞スイス−３Ｔ３のＤＮＡ合成 を劇的に阻害し、ＰＫＣアイソタイプα、βおよびγの偽基質領域に対応するペ プチドの場合は、ＤＮＡ合成をほとんど阻害【２なかつたことがわかる。From the results in Table 5, it is clear that the peptide microorganism based on the sequence of the pseudosubstrate region of ζ-PKC is Injection of DNA synthesis in serum-stimulated fibroblast Swiss-3T3 peptides corresponding to the pseudosubstrate regions of PKC isotypes α, β, and γ. It can be seen that in the case of peptide, there was almost no inhibition of DNA synthesis.

トリペプチドＡＬＩ？　（配列番号９）とＡＡＲ（配列番号１）の量に依存した カーブが図８に示されている。これらの結果は、少なくとも８０％の線維芽細胞 スイス−３Ｔ３のＤＮＡ合成が、用いた条件下において１−２μＮという少量の ペプチドＡＩ？Ｒ（配列番号１）に阻害されたことを示している。反対に、ペプ チドＡＬＲ（配列番号９）の場合は、１０倍高い濃度（１６μＭ）でせいぜい５ ０％の細胞のＤＮＡ合成が阻害されたにすぎない。このことは本発明によるペプ チドが強力で敏感な阻害の性質を持っていることを証明している。Tripeptide ALI? (SEQ ID NO: 9) and AAR (SEQ ID NO: 1) The curve is shown in FIG. These results indicate that at least 80% of fibroblasts DNA synthesis of Swiss-3T3 was performed using a small amount of 1-2 μN under the conditions used. Peptide AI? It is shown that it was inhibited by R (SEQ ID NO: 1). On the contrary, pep In the case of TidoALR (SEQ ID NO: 9), at a 10-fold higher concentration (16 μM), at most 5 Only 0% of cells had DNA synthesis inhibited. This means that the peptide according to the present invention It proves that Tido has strong and sensitive inhibitory properties.

血清飢餓（２４時間）にしだ線維芽細胞スイス−３Ｔ３　（Ｇ１期から始めて） の細胞質に標識抗体と共に、異なるペプチドをマイクロインジェクトした。マイ クロインジェクト後すぐに、ブロモデオキシウリジンを培地中に　１０００倍希 釈になるように加え、細胞を３８℃で２０時間培養した。Serum starvation (24 hours) of Ida fibroblasts Swiss-3T3 (starting from G1 phase) Different peptides were microinjected together with labeled antibodies into the cytoplasm of the cells. My Immediately after clonal injection, add bromodeoxyuridine to the medium at a 1000-fold dilution. The cells were incubated at 38°C for 20 hours.

その後細胞を固定し、通常の操作を行なった後、抗標識抗体を用いた免疫蛍光法 および抗ブロモデオキシウリジン抗体を用いた免疫化学的分析を行なった。結果 は少なくとも独立に行なった３回の実験と同じであり、それを代表するものであ る。The cells were then fixed and, after the usual manipulations, immunofluorescence using anti-labeled antibodies was performed. and immunochemical analysis using anti-bromodeoxyuridine antibody. result is the same as at least three independent experiments and is representative. Ru.

Ｘ：マイクロインジェクションピペット内のペプチドの濃度は８μＮであった。X: The concentration of peptide in the microinjection pipette was 8 μN.

ひとたび分子が細胞に入ると２０から５０倍に希釈される。Once the molecule enters the cell, it is diluted 20 to 50 times.

１０％のウシ胎児血清存在下で成育しているヒト請内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）に 異なるペプチドをマイクロインジェクトした。細胞はマイクロインジェクション の２４時間前に血清飢餓の状態にすることにより同調させており、ＤＮＡ合成を 表６に示した方法で測定した。Human endothelial cells (HUVECs) growing in the presence of 10% fetal bovine serum Different peptides were microinjected. cells microinjected DNA synthesis is synchronized by serum starvation 24 hours before It was measured by the method shown in Table 6.

表６の結果は例１８の結果を裏付けている。The results in Table 6 confirm the results of Example 18.

表　６ Ｙ：マイクロインジェクションピペット内のペプチドの濃度は８μＸであった。Table 6 Y: The concentration of peptide in the microinjection pipette was 8 μX.

ひとたび分子が細胞に入ると２０から５０倍に希釈される。Once the molecule enters the cell, it is diluted 20 to 50 times.

血清飢餓（２４時間）にしたヒト慶内皮細胞（Ｇ１期から始めて）の細胞質に指 標抗体と共に、異なるペプチドをマイクロインジェクトした。マイクロインジェ クト後すぐに、ブロモデオキシウリジンを培地中に１０００倍希釈になるように 加え、細胞を３７℃で２０時間培養した。その後細胞を固定し、通常の操作を行 なった後、抗指標抗体を用いた免疫蛍光法および抗ブロモデオキシウリジン抗体 を用いた免疫化学的分析を行なった。結果は、少なくとも独立に行なった３回の 実験と同じであり、それらを代表するものである。Injected into the cytoplasm of serum-starved (24 hours) human Kei endothelial cells (starting from G1 phase). Different peptides were microinjected together with standard antibodies. micro inject Immediately after treatment, add bromodeoxyuridine to the medium at a 1000-fold dilution. In addition, cells were cultured at 37°C for 20 hours. Then fix the cells and proceed with normal operations. Immunofluorescence using anti-indicator antibody and anti-bromodeoxyuridine antibody Immunochemical analysis was performed using Results are based on at least three independent It is the same as the experiment and is representative of them.

ζ−ＰＫＣの高発現による線維芽細胞Ｎｌｌｌ３Ｔ３の細胞系統の成育性質を決 定した。ζ−ＰＫＣのｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターの強力な転写プロモータ ーの支配下にサブクローニングしくｐＲｃｃＭＶ−１ｎｖｆｔｒｏｇｅｎ、　Ｕ ＳＡ）　、ｒａｓで形質転換した細胞系統を正のコントロールとしまた対応する 負のコントロールを用い、低濃度の血清（０，５％ＰＣ８）存在下においてζ− ＰＫＣの高発現クローン（ｐＲｃｃＭＶｚ４およびｐＲｃｃＭＶｚ６）の***速 度を比較した。図９の結果から、ｐＲｃｃＭＶｚ４およびｐＲｃｃＭＶｚ６のク ローンは、０．５％の血清存在下においてｒａｓで形質転換した細胞系統と同様 に劇的な***速度の上昇を示した。このことはζ−ＰＫＣを高発現させると細胞 増殖の際に***促進因子要求性が減少することを示している。さらに、表７のデ ータによるとコントロールと比較して形質転換体は、細胞が倍になる時間が短く なり増殖飽和濃度が上昇する。Determining the growth characteristics of the fibroblast Nlll3T3 cell lineage by high expression of ζ-PKC. Established. ζ-PKC cDNA as a strong transcriptional promoter in a mammalian expression vector pRccMV-1nvftrogen, U SA), cell lines transformed with ras were used as positive controls and corresponding Using a negative control, ζ- Division speed of high PKC expression clones (pRccMVz4 and pRccMVz6) compared the degrees. From the results in Figure 9, it can be seen that the clones of pRccMVz4 and pRccMVz6 The loan was similar to the cell line transformed with ras in the presence of 0.5% serum. showed a dramatic increase in the rate of division. This indicates that when ζ-PKC is highly expressed, cells This indicates that mitogen requirement decreases during proliferation. Furthermore, the data in Table 7 According to the data, the cells of the transformants doubled faster than the controls. The saturation concentration for proliferation increases.

表　７ ζ−ＰＫＣを高発現させた細胞の増殖性１０％のＰＣ８（ウシ胎児性血清）を供 給したＤＭＥＭ中で４×１０４個の細胞を培養皿（３５ｍ５）にまき、単層にお ける増殖を測定した。培地は１日おきに交換した。２日おきに細胞数を数えるこ とにより倍化時間を測定した。飽和濃度は細胞が集密化したのち７日後の細胞数 である。結果は、同じ実験を繰り返し３回独立に行なった平均値比ＳＤである。Table 7 Provide PC8 (fetal bovine serum) with 10% proliferation of cells that highly express ζ-PKC. 4 x 104 cells were seeded in a culture dish (35 m5) in the supplied DMEM, and were grown into a monolayer. The growth of the cells was measured. The medium was replaced every other day. Count the number of cells every two days. The doubling time was measured by The saturation concentration is the number of cells 7 days after cells become confluent. It is. The results are the average value ratio SD of the same experiment repeated three times independently.

これらの結果からζ−ＰＫＣの単なる高発現はいくつかの形質を変化させた。こ のことは、この酵素が細胞***のシグナル伝達において重要な役割を担っている という考えと一致する。From these results, mere high expression of ζ-PKC changed several traits. child This means that this enzyme plays an important role in signal transduction for cell division. This is consistent with this idea.

例２１ ζ−ＰＫＣの活性を決める感度の高い自己リン酸化分析は、従来の組換えＤＮＡ 技術を用いてラット脳ζ−ＰＫＣの制御領域を欠失させることにより行った。そ のようにして得られた永続的に活性化されたζ−ＰＫＣ変異体のｃＤＮＡは、組 換え融合タンパク（ＭＢＰ−ｚＰＫｃｄｅｌ）を得るためにプラスミドＰＭＡＬ ｃ２にサブクローニングした。このプラスミドを有する菌体を誘導し、発現した タンパクをアミロース−セファロースカラムのアフィニティークロマトグラフィ ーで精製した。ζ−プロティンキナーゼＣの活性はリン酸の受容体としてミニリ ン塩基性タンパクを用い上記した方法で決定した。典型的な活性測定の条件は最 終的に反応容量４０μｌで以下の組成である。Example 21 A sensitive autophosphorylation assay to determine the activity of ζ-PKC can be performed using conventional recombinant DNA. This was done by deleting the regulatory region of rat brain ζ-PKC using a technique. So The cDNA of the permanently activated ζ-PKC mutant obtained as described above was assembled. Plasmid PMAL to obtain the recombinant fusion protein (MBP-zPKcdel) subcloned into c2. A bacterial cell containing this plasmid was induced and expressed. Affinity chromatography of proteins on amylose-Sepharose columns It was purified by The activity of ζ-protein kinase C is influenced by minireduction as a phosphate receptor. It was determined using the above-described method using basic protein. Typical activity measurement conditions are The final reaction volume was 40 μl and the composition was as follows.

２μｍの酵素、緩衝液（終濃度で、５０５Ｍ　ＨＥＰＥＳ、　１０５ＭＭｇＣＩ ２．　ＣａＣｌ２１ｍＭ、　ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＡＴＰ　１０５Ｍ　）　、１　 μｃｉの［ａ−３２ＰＩＡＴＰ　、２ｍｇのミニリン塩基性タンパク、可能性あ る阻害剤、例えば１μＮのペプチド。３０℃でインキュベーションを行ない、例 えば１０分後にＳＯＳサンプルバッファー中で煮沸させることにより反応を止め 、例えば５ＤＳ−ＰＡＧＥ等でサンプルを分画した。ゲルは乾燥し２日間感光さ せた。2μm of enzyme, buffer (final concentration, 505M HEPES, 105MMgCI) 2. CaCl21mM, EGTA, 1mM ATP 105M), 1 μci [a-32PIATP, 2 mg miniphosphorus basic protein, possible inhibitor, such as 1 μN of peptide. Incubation at 30°C, e.g. For example, stop the reaction after 10 minutes by boiling in SOS sample buffer. The sample was fractionated using, for example, 5DS-PAGE. The gel was dried and exposed for 2 days. I set it.

リン酸化されたタンパクに対応するスポットはレーザー走査型濃度計で定量化し た。Spots corresponding to phosphorylated proteins were quantified with a laser scanning densitometer. Ta.

永続的に活性化されたζ−ＰＫＣの測定は少なくとも天然のζ−ＰＫＣを用いた 前述の自己リン酸化活性測定よりも感度が少なくとも１０倍高い。Measurement of permanently activated ζ-PKC used at least natural ζ-PKC. It is at least 10 times more sensitive than the autophosphorylation activity measurements described above.

３回の独立した実験の代表的な結果は表８に示される通りである。Representative results of three independent experiments are shown in Table 8.

ここで示されたすべての結果から、ＰＫＣイソ酵素α、βおよびγは、インスリ ン／　ｒａｓ　ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＯによって活性化される成熟経路には関 与しないことは明らかである。６段階目の卵に検出できる量のδまたはεＰＫＣ が存在しないことから、それらについても関与していないことが明らかである。All the results presented here indicate that PKC isoenzymes α, β, and γ are The maturation pathway activated by PLO/ras p21/PC-PLO is It is clear that it will not. Detectable amounts of δ or εPKC in eggs at stage 6 Since they do not exist, it is clear that they are not involved either.

これらのデータは、卵のｃＤＮＡライブラリーをアイソタイプδまたはεに特異 的なプローブでζ−ＰＫＣのホモローブのスクリーニングを行ったところ、アフ リカッメガエルの卵においてこれらのアイソタイプが完全に欠失していることが 明らかになったという事実と一致する。さらに、ＰＫＣ亜種亜種上びεに対応す る偽基質ペプチド阻害剤をマイクロインジェクトした場合に、この研究で示した あらゆる刺激に対して反応する成熟および旧キナーゼの活性化にほんのわずか影 響するかまたは全く影響を及ぼさなかった。興味深いことに、これらのアイソタ イプはすべてＰＭＡによって活性化され、そして継続的なホルボールエステルへ の暴露によって活性が減少制御される（　Ｎ１５ｈｌｚｕｋａ、　１９８８；Ｏ ｎｏ　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８９１０ｅ、Ｃ１ｔ　）　Ｏ線維芽細胞の長期的な ＰＭＡへの暴露によるＰＫＣの活性減少は、ＰＣ−ＰＬＯのＤＮＡ合成を誘導す る能力（Ｌａｒｒｏｄｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０））とまたはｒａｓ　ｐ ２１　／　ＰＣ−ＰＬＣがストロメリシン遺伝子の発現を活性化する能力（Ｄｉ ａｓ−Ｍｅｃｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）ｔｏｅ　ｃｌｔ　）に影響を与えな いという我々の最近の結果と、ここで示したデータと一致する。These data demonstrate that egg cDNA libraries can be isolated to isotypes specific for δ or ε. When we screened for homolobes of ζ-PKC using a typical probe, we found that These isotypes are completely deleted in the eggs of the frog frog. This is consistent with the fact that it has become clear. Furthermore, corresponding to PKC subspecies subspecies and ε, This study showed that when microinjected with a pseudosubstrate peptide inhibitor, Only a slight influence on the activation of mature and old kinases in response to any stimulus impact or no impact at all. Interestingly, these isota All ips are activated by PMA and continue to phorbol esters. The activity is decreased by exposure to (N15hlzuka, 1988; O no et al, +198910e, C1t) Long-term study of O fibroblasts Decreased PKC activity by exposure to PMA induces PC-PLO DNA synthesis. (Larrodera et al. (1990)) and the ability to 21 / Ability of PC-PLC to activate stromelysin gene expression (Di as-Meco et al. (1991) toeclt). This is consistent with our recent results and the data presented here.

それゆえ、ラット脳から部分精製したＰＫＣを前もってマイクロインジェクトし なければ、ＰＭＡはアフリカッメガエルの卵成熟を促進しないことがここで示さ れた。Therefore, we previously microinjected partially purified PKC from rat brain. We show here that without PMA, it does not promote egg maturation in African frogs. It was.

ＰＫＣ調製におけるイムノプロット分析により、アイソタイプα、βおよびγに 特異的な抗体とδおよびεアイソタイプに特異的な抗体によってそれぞれのバン ドが明らかとなった。それゆえ、これらの条件の下でＰＭＡの成熟を誘導する能 力は、ＰＫＣアイソタイプα＋β＋γの過剰な投入とまたは通常アフリカッメガ エルの卵には存在しないアイソタイプδおよびεの存在に依存するのであろう。Immunoplot analysis of PKC preparations reveals isotypes α, β and γ. Each band was isolated by specific antibodies and antibodies specific for the δ and ε isotypes. It became clear that Therefore, the ability to induce maturation of PMA under these conditions Force is associated with excessive input of PKC isotypes α+β+γ or This may depend on the presence of isotypes δ and ε, which are absent in L. eggs.

ＰＫＣ種の中で距離的に関連のある新しいイソ酵素、すなわちζ−ＰＫＣ，はた くさんの興味深い性質を示し、このＰＫＣの比較的詳しい生化学的な性質の分析 から、ＰＭ＾に結合しない（Ｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９８９）ｆｏｅ　ｃｉｔ 　）　、この薬理学的な薬によって活性化されない、ホルボールエステルの活性 の減少制御に抵抗性があることなどが明らかになった。このことに関して、ζ− ＰＫＣに類似の酵母由来のＰＫＣはＰＨ＾に対して感受性がないということから 始まる最近の研究と、遺伝的な研究から細胞周期の制御において、ζ−ＰＫＣに 似た酵母のＰＫＣは重要な役割を担っている可能性が示唆されている（Ｌｅｖｉ ｎ　ｅｔ　ａｔ、。A new isoenzyme that is distantly related among the PKC species, namely ζ-PKC, A relatively detailed analysis of the biochemical properties of this PKC shows many interesting properties. , does not bind to PM^ (Ono et al. (1989) foe cit ), the activity of phorbol esters, which is not activated by this pharmacological drug It has become clear that there is resistance to controlling the reduction of In this regard, ζ− This is because yeast-derived PKC, which is similar to PKC, is not sensitive to PH^. Recent research and genetic studies have shown that ζ-PKC plays a role in cell cycle control. It has been suggested that the similar yeast PKC may play an important role (Levi n et at.

Ｃｅ１ｌ　Ｂ２．２１３（１９９０）　；　０ｇ１ｔａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ。Ce1l　B2.213(1990)　;　0g1ta　et　at,,　Pr oc, Natl, Ac1d.

Ｓｅｔ、　ＵＳ八へ７．５０１１　（１９９０）；　ａｎｄ　０ｓａｄａ　ｅｔ 　ａｌ、（１９９０）ｆｏｅ　ｃＨ）ことは、特筆すべきことである。注目に値 するのは、ζ−ＰＫＣ亜種の減少またはζ−ＰＫＣの偽基質領域に特異的な配列 を持つペプチド阻害剤をマイクロインジェクトすることにより、インスリン／　 ｒａｓ　ｐ２１　／ＰＣ−ＰＬＯの卵成熟を活性化する能力を阻害し、プロゲス テロンで活性化された経路には効果を与えないことを示したことである。それゆ え、この酵素は増殖カスケードの制御に重要な役割を担っていると考えられる。Set, US 8 to 7.5011 (1990); and 0sada et al, (1990) FOECH) is noteworthy. Worth noting This may be due to the reduction of ζ-PKC subspecies or the presence of sequences specific to the pseudosubstrate region of ζ-PKC. By microinjecting a peptide inhibitor with Inhibits the ability of ras p21/PC-PLO to activate oocyte maturation and inhibits progesterone. This showed that it had no effect on the pathway activated by teron. That's it Indeed, this enzyme is thought to play an important role in controlling the proliferation cascade.

我々の結果は以下のことを強く指示する。Our results strongly suggest that:

！　）　ｒａｓ　ｐ２１　／　ＰＣ−ＰＬＯの特異的な経路で伝わる細胞***シ グナルの伝達においてζ−ＰＫＣは重要な役目を担い； ２）ζ−ＰＫＣの偽基質領域に対応する式（１）のペプチド、特にＡＲＲ（配列 番号ｌ）の配列を持つトリヌクレオチドは、その経路に活性化された細胞***を 特異的に阻害し；そして、 ３）ζ−ＰＫＣの阻害ペプチドを補乳動物細胞、特にヒトの細胞、にマイクロイ ンジェクトすることによる阻害効果（例えばＤＮＡ合成が強く阻害される）は、 インビボにおいて抗増殖効果がある。! ) ras p21/Cell division signal transmitted through the PC-PLO specific pathway ζ-PKC plays an important role in GNAR transmission; 2) The peptide of formula (1) corresponding to the pseudosubstrate region of ζ-PKC, especially ARR (sequence The trinucleotide with the sequence number l) activates cell division in the pathway. specifically inhibit; and 3) Microinjecting ζ-PKC inhibitory peptides into mammalian cells, especially human cells. The inhibitory effect (for example, strong inhibition of DNA synthesis) caused by injection is It has antiproliferative effects in vivo.

配列表：配列番号１−１７ 配列番号：　１ 配列の長さ＝３ 翫ｊりの型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ 配列番号：　２ 翫ｌりの長さ＝４ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ翫ｊり番号：　３ 配列の長さ＝５ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド ♂１賢タリの闘：ＡＩａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ配列番号：　４ 配列の長さ二〇 翫ツリの型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ配列番号＝　 ５ 配列の長さ：９ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド ｉｓ９りの種類：＾「ｇ　Ａｒｇ　ｃｌｙ　Ａｌａ＾ｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａ ｒｇ　Ｌｙｓ配列番号二　〇 配列の長さ：９ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｌ ｙｓ　Ａｓｎ翫ｊり番号：　７ 配列の長さ：９ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 酉１セフリの夛４Ｃ１１：　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ 　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ配列番号：　８ 配列の長さ：９ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド ｉ！ＢりのＷＩＭ：　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｒ ｇ　Ａｒｇ　Ｖａ１配列番号＝　９ 配列の長さ：３ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ■ 配列番号＝１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：　核酸 鎖の数：　−水路 トボロジー：直鎖状 分子の型：　他の核酸（合成りＮ＾） 相補鎖：Ｎ。Sequence list: Sequence number 1-17 Sequence number: 1 Array length = 3 Ribbon type: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide Array type: Ala Arg Arg Sequence number: 2 Length of rod = 4 Sequence type: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide Array type: Ala Arg Arg Trp number: 3 Array length = 5 Sequence type: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide ♂1 Kentari's battle: AIa Arg Arg Trp Arg Sequence number: 4 Array length 20 Shape of the tree: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide Sequence type: Ala Arg Arg Trp Arg Lys Sequence number = 5 Array length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide Type of is9: ＾``g Arg cly Ala＾rg Arg Trp A rg Lys sequence number 20 Array length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide Array type: Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gin L ys Asn number: 7 Array length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide Tori 1 Sefuri no Taku 4C11: Arg Arg Gly Ala Ile Lys Gln Ala Lys sequence number: 8 Array length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide i! B WIM: Arg Gln Gly Ala Val Arg Ar g Arg Va1 sequence number = 9 Array length: 3 Sequence type: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide Array type: Ala Leu Arg■ Sequence number = 10 Array length: 22 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: - waterway Tobology: linear Molecule type: Other nucleic acids (synthetic N^) Complementary strand: N.

配列の種類：　ＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧ　ＡＡＧＧＣＧＣＡ（Ｔ　ＡＣ翫ｌり番号 ＝１１ 配列の長さ：２３ Ｖりの型：　核酸 鎖の数：　−水路 トポロジー：直鎖状 分子の型：　他の核酸（合ａＮＡ） 相補鎖：Ｎ。Array type: ATGAATTCTG AAGGCGCA (T AC number =11 Array length: 23 Type of Vri: Nucleic acid Number of chains: - waterway Topology: linear Molecule type: Other nucleic acids (ANA) Complementary strand: N.

配列の種類：ＡＴＧＡＡＴｒＣＴＣＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＴｒＡ配列番号＝１２ 配列の長さ＝１４ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類＋ｌＩｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ｌｌ ｅ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｔ　Ｇ配列番号二１３ 配列の長さ：１６ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：ＧＩｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｉ　Ｉｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　rｅｒ　Ｖａｌ ｌ　５　１０　１５ 配列番号：１４ 配列の長さ：１５ 配列の型：　核酸 鎖の数：　−水路 トポロジー：直鎖状 分子の型；　他の核酸（合勅ＮＡ） 相補鎖：　Ｙｅｓ 配列の種類：田冗σ記冗ＧＧＣＡＴ 配列番号：１５ 配列の長さ＝１５ 配列の型：　核酸 鎖の数二　−水路 トポロジー：直鎖状 分子の型：　他の核酸（合勅ＮＡ） 相補鎖：Ｎ。Sequence type: ATGAATrCTCGATGACAGGCTrA Sequence number = 12 Array length = 14 Sequence type: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide Array type + lIe Leu Lys Lys Asp Val Val ll e Gin Asp Asp Asp Vat G Sequence number 213 Array length: 16 Sequence type: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide Array type: GIy Phe Glu Tyr I Ie Asn Pro L eu Leu Leu Ser Ala Glu Glu rer Val l　5　10　15 Sequence number: 14 Array length: 15 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: - waterway Topology: linear Molecule type; Other nucleic acids (combined NA) Complementary strand: Yes Array type: GGCAT Sequence number: 15 Array length = 15 Sequence type: Nucleic acid Chain number 2 - Waterway Topology: linear Molecule type: Other nucleic acids (combined NA) Complementary strand: N.

配列の種類：　ＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡ、　ＧＧＡＣＣ配列番号＝１６ 配列の長さ＝３ 配列の型、アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ 配列の特徴： ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　Ｍｉｓｃ、ｒｅａｔｕｒｅ位置目 その他の情報；　ＸａａはＮ−アセチルアラニン配列番号：１７ 配列の長さ：３ 配列の型：　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：　ペプチド 配列の種類：Ｘａａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ ■ 配列の特徴： ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　Ｍｉｓｃ、ｒｅａｔｕｒｅ位置＝１ その他の情報：　ＸａａはＮ−アセチルアラニン偽基質ペプチドの濃度（）ＬＭ ） 日 、、、ム一−，−，，，ＰＣＴ／ＥＰ　９３１００８１６１ｍ＋ｍ＋＋１Ａ−− １＋＋−Ｎ−ρＣＴ／ＥＰ９３１００８１６国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　５／１０　８ ３１８−４Ｈ ７１０６８３１８−４Ｈ ７１０８８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１５／１１ ／／　Ｃ０７Ｋ　９９：００　８３１８−４ＨＩSequence type: ATGCCCAGCA, GGACC sequence number = 16 Array length = 3 sequence type, amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide Array type: Xaa Leu Arg Array characteristics: NAME/KEY: Misc, reature position Other information; Xaa is N-acetylalanine SEQ ID NO: 17 Array length: 3 Sequence type: Amino acid Topology: linear Molecule type: Peptide Array type: Xaa Arg Arg ■ Array characteristics: NAME/KEY: Misc, reature position = 1 Other information: Xaa is the concentration of N-acetylalanine pseudosubstrate peptide ()LM ) Day ,,,Muichi-,-,,,PCT/EP 931008161m+m++1A-- 1++-N-ρCT/EP93100816 International Search Report Continuation of front page (51) Int, C1,5 identification code Office serial number CO7K 5/10 8 318-4H 71068318-4H 71088318-4H C12N 15/11 // C07K 99:00 8318-4HI

Claims (24)

【特許請求の範囲】[Claims] １．下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドおよび薬学上許容されるその誘導体 であって、３〜１５アミノ酸残基からなるペプチド。 【配列があります】（Ｉ） （ここで、Ｘは水素または１またはそれ以上のアミノ酸を表し、Ｊは水酸基また は１またはそれ以上のアミノ酸を表す。）1. Peptides represented by the following general formula (I) and pharmaceutically acceptable derivatives thereof A peptide consisting of 3 to 15 amino acid residues. [There is an array] (I) (Here, X represents hydrogen or one or more amino acids, and J represents a hydroxyl group or represents one or more amino acids. ) ２．３〜９アミノ酸残基からなる、請求項１記載のペプチド。The peptide according to claim 1, consisting of 2.3 to 9 amino acid residues. ３．Ｘが水素、アセチル基、Ｇｌｙ、Ａｒｇ−Ｇｌｙまたは【配列があります】 を表し、Ｊが水酸基、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ　Ａｒｇまたは【配列があります】を表す 、請求項１または２記載のペプチド。3. X is hydrogen, acetyl group, Gly, Arg-Gly or [sequences available] , J represents hydroxyl group, Trp, Trp Arg or [sequence available] , peptide according to claim 1 or 2. ４．次の式： 【配列があります】（配列番号１） 【配列があります】（配列番号２） 【配列があります】（配列番号３） 【配列があります】（配列番号４） 【配列があります】（配列番号５） および薬学上許容されるその誘導体である、請求項１〜３いずれか一項記載のペ プチド。4. The following formula: [There is an array] (Array number 1) [There is an array] (Array number 2) [There is an array] (Array number 3) [There is an array] (Array number 4) [There is an array] (Array number 5) and a pharmaceutically acceptable derivative thereof, according to any one of claims 1 to 3. Petite. ５．Ｎ−アセチル【配列があります】（配列番号１７）および薬学上許容される その誘導体。5. N-Acetyl [Sequence available] (SEQ ID NO: 17) and pharmaceutically acceptable its derivatives. ６．実質的に純粋な状態の請求項１〜５いずれか一項記載のペプチド。6. 6. A peptide according to any one of claims 1 to 5 in substantially pure form. ７．ζ−ＰＫＣ活性を阻害する方法であって、ζ−ＰＫＣの活性に応答し得る細 胞と有効量のζ−ＰＫＣ阻害剤とを接触させることを含んでなる、方法。7. A method of inhibiting ζ-PKC activity, the method comprising a cell capable of responding to ζ-PKC activity. A method comprising contacting a cell with an effective amount of a ζ-PKC inhibitor. ８．ζ−ＰＫＣ活性を阻害する方法であって、ζ−ＰＫＣの活性に応答し得る細 胞と有効量の請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドとを接触させることを 含んでなる、方法。8. A method of inhibiting ζ-PKC activity, the method comprising a cell capable of responding to ζ-PKC activity. contacting the cells with an effective amount of the peptide according to any one of claims 1 to 6. A method comprising: ９．ζ−ＰＫＣが媒介する病理的状態の予防または治療に適した医薬を選択する スクリーニング法であって、ａ）被試験試薬を含むサンプルを、ζ−ＰＫＣ活性 の阻害および／または活性化を示すことができるアッセイ系においてインキュベ ートし、 ｂ）その試薬がζ−ＰＫＣ活性を変化させるかどうか、必要ならば活性の変化の 程度を決定し、そしてｃ）ζ−ＰＫＣを強力かつ選択的に阻害したとされた医薬 を選択すること を含んでなる、方法。9. Selecting drugs suitable for the prevention or treatment of pathological conditions mediated by ζ-PKC A screening method comprising the steps of: a) testing a sample containing a test reagent for ζ-PKC activity; in an assay system that can show inhibition and/or activation of Start, b) whether the reagent changes ζ-PKC activity and, if necessary, the change in activity; and c) a drug that was found to potently and selectively inhibit ζ-PKC. to choose A method comprising: １０．選択された医薬が、腫瘍、高増殖疾患およびウイルスの感染の治療に適す るものである、請求項９記載のスクリーニング法。10. The selected medicine is suitable for the treatment of tumors, hyperproliferative diseases and viral infections 10. The screening method according to claim 9. １１．医薬の活性成分として用いられる、請求項１〜６いずれか一項記載のペプ チドまたはその生理学的に許容される誘導体。11. Peptide according to any one of claims 1 to 6, used as an active ingredient of a medicine. tide or its physiologically acceptable derivatives. １２．ζ−ＰＫＣ活性に関連した病理学的状態の利用に用いられる、請求項１〜 ６いずれか一項記載のペプチドまたはその生理学的に許容される誘導体。12. Claims 1 to 3 are used for the utilization of pathological conditions related to ζ-PKC activity. 6 or a physiologically acceptable derivative thereof. １３．腫瘍、高増殖疾患およびウイルスの感染の治療に用いられる、請求項１〜 ６いずれか一項記載のペプチドまたはその生理学的に許容される誘導体。13. Used in the treatment of tumors, hyperproliferative diseases and viral infections, claims 1- 6 or a physiologically acceptable derivative thereof. １４．請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドまたはその生理学的に許容さ れるその誘導体を、−またはそれ以上の生理学的に許容される担体とともに含ん でなる、医薬組成物。14. The peptide according to any one of claims 1 to 6 or its physiologically acceptable a derivative thereof together with - or more physiologically acceptable carriers. A pharmaceutical composition comprising: １５．ζ−ＰＫＣをコードするＤＮＡ、特にζ−ＰＫＣの制御領域、またはそれ らの縮重等価物に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許 容されるその誘導体。15. DNA encoding ζ-PKC, especially the control region of ζ-PKC, or Antisense oligonucleotides corresponding to degenerate equivalents of derivatives thereof that are tolerated. １６．【配列があります】（配列番号 １４）の配列を有するオリゴヌクレオチドおよび生理的に許容されるその誘導体 ならにびその縮重等価物。16. [There is an array] (array number 14) Oligonucleotides having the sequence and physiologically acceptable derivatives thereof Nanibi's degenerate equivalent. １７．バックボーンがホスホロチオエート修飾された請求項１５または１６記載 のオリゴヌクレオチド誘導体またはその縮重等価物。17. Claim 15 or 16, wherein the backbone is modified with phosphorothioate. oligonucleotide derivatives or degenerate equivalents thereof. １８．請求項１５〜１７のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド またはその生理学的に許容される誘導体もしくはその縮重等価物を、−またはそ れ以上の担体と共に含んでなる、医薬組成物。18. Antisense oligonucleotide according to any one of claims 15 to 17. or its physiologically acceptable derivatives or degenerate equivalents thereof; - or its physiologically acceptable derivatives or degenerate equivalents; A pharmaceutical composition comprising one or more carriers. １９．請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドの製造法であって、 ａ）所望の保護されたＣ端アミノ酸を適当な固相担体に結合させ、 ｂ）所望に配列となるよう、他の保護アミノ酸と、担体に結合されたＣ端アミノ 酸とを反応させ、そして、ｃ）保護基を除去し、得られたペプチドを固相担体か ら切り出すこと を含んでなる、方法。19. A method for producing the peptide according to any one of claims 1 to 6, comprising: a) coupling the desired protected C-terminal amino acid to a suitable solid support; b) the C-terminal amino acid bound to the carrier with other protected amino acids in the desired sequence. and c) removing the protecting group and transferring the resulting peptide to a solid phase support. to cut out from A method comprising: ２０．請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドまたはその生理学的に許容さ れるその誘導体の有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物におけるζ−Ｐ ＫＣ活性を阻害する方法。20. The peptide according to any one of claims 1 to 6 or its physiologically acceptable ζ-P in a mammal comprising administering an effective amount of a derivative thereof A method of inhibiting KC activity. ２１．請求項１５〜１７のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドの効果量を投 与することを含んでなる、哺乳動物におけるζ−ＰＫＣ活性を阻害する方法。21. administering an effective amount of the oligonucleotide according to any one of claims 15 to 17. A method of inhibiting ζ-PKC activity in a mammal, the method comprising administering to a mammal. ２２．ζ−ＰＫＣ阻害剤の有効量の投与を含んでなる、腫瘍、高増殖疾患または ウイルス感染に敏感なまたは病む患者の治療法。22. tumor, hyperproliferative disease or Treatment of patients susceptible to or sick with viral infections. ２３．ζ−ＰＫＣ阻害剤が請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドである、 請求項２２記載の方法。23. The ζ-PKC inhibitor is a peptide according to any one of claims 1 to 6. 23. The method according to claim 22. ２４．ζ−ＰＫＣ阻害剤が請求項１５〜１７のいずれか一項記載のオリゴヌクレ オチドである、請求項２２記載の方法。24. The ζ-PKC inhibitor is an oligonucleotide according to any one of claims 15 to 17. 23. The method according to claim 22, wherein the method is otide.