JPH06508114A - Palytoxin-related prodrugs and methods of administration thereof - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 バリトキシン　プロドラッグおよび ｉ旦段二方造 皮血豆！ 本発明は、バットキシンのプロドラッグおよびそ１７）関連化合物、並びにその ようなプロドラッグを標的に同はテ放出すれる薬剤と共に投与することに関する 。この投与プロトコルでは、標的に同けて放出される薬剤が毒性薬物を局所的に 放出する媒介となり得る。[Detailed description of the invention] Varitoxin prodrug and i-dan dan nipo-zukuri Skin blood bean! The present invention provides prodrugs of Batxin and related compounds thereof, and Targeting prodrugs such as . In this administration protocol, the drug released at the same time as the target locally releases the toxic drug. It can be a vehicle for release.

！量ユ亘 ／ｌｌトンンは、江江旦」属の熱帯腔腸動物がら単離された、非常に毒性が高く 、非タンパク貫禄で、比較的低分子量の海洋天然生成物である。珊瑚のｈ江■ｎ ｔｏｘｉｃａの毒性は、まず、古代ハワイ人によって認識された。特殊な戦士た ちは、戦いの前に、槍の穂先に珊瑚の滲出物を塗り付けるように指示された。近 代になって、この言伝えによって、ハワイ大学の研究者たちは、マウイ島のハナ （Ｈａｎａ＞の近くでｈｕユ赳圧■」を含む１連の潮溜りを再発見したのである ；　Ｍｏｏｒｅ、Ｒ，Ｅ、ら、０ｃｅａｎｕｓ　（１９８２）２５工ｉ：　５４ −６３゜これらの潮溜りで収集された珊瑚から、高度に精製された毒素が１９７ １年に単離され、その化学構造がＭｏｏｒｅ、　Ｒ，Ｅ、ら、正−υＬ旦胞１− 兆瓜（１９８１）■１３：２４９１によって、そして、別個にＵｅＩＩｕｒａ、 　Ｄ、ら、Ｔｅｔ上ｅｔ　（１９８１）　２２：２７８１によって報告された。! amount of weight /lltong is a highly toxic, highly toxic species isolated from tropical coelenterates of the genus Jiangdan. , a non-proteinaceous, relatively low molecular weight marine natural product. coral river n The toxicity of C. toxica was first recognized by the ancient Hawaiians. special warrior Before the battle, they were instructed to smear coral exudate on the tips of their spears. near In modern times, this legend led researchers at the University of Hawaii to They rediscovered a series of tidal pools near Hana. ; Moore, R.E., et al., 0ceanus (1982) 25th edition: 54 -63゜197 highly purified toxins were found in the coral collected from these tidal pools. It was isolated in 1997, and its chemical structure was described by Moore, R.E., et al. by Zhao Gu (1981) ■13:2491 and separately by UeIIura, Reported by D. et al., Tet et al. (1981) 22:2781.

後者は、より豊富な種であるｈ旦ユ因ｔｕｂｅｒｅｕｌｏｓａがら毒素を単離し た。パット牛ジンカルボン酸、ホモパリトキシン、ビスホモパリトキシン、ネオ バリト牛シン、およびデオ牛シバリド半シンを含む、さらなる毒素関連化合物も また同定された（Ｗａｔｔｅｎｂｅｒｇ、　Ｅ、Ｖ、ら、江肛区」以（１９８９ ）　４９：５Ｈ７−５８４２、およびＵｅｍｕｒａ、　Ｄ、ら、Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ　（１９８５）　唾：１００７−１（１１７）。図１にこれらの化合物 の構造を示す。追加的微量成分も、紐江珪且の種の中でしばしば検出されてきて いる。The latter isolated the toxin from the more abundant species, H. tubereulosa. Ta. Pat beef zinc carboxylic acid, homopalytoxin, bishomopalytoxin, neo Additional toxin-related compounds are also present, including balito-cow-syn, and deo-cow-cibaride-hemisyn. It was also identified (Wattenberg, E., V., et al., 1989 ) 49:5H7-5842, and Uemura, D. et al., Tetrahe dron (1985) Spit: 1007-1 (117). Figure 1 shows these compounds. The structure of Additional trace components have also often been detected in species of Himoe silica. There is.

図１に示すように、パリトキシンは１１５位にアミ７基を有し、このアミン基が カルボン酸で誘導されて、アシル化バリトキシン誘導体が得られ、この誘導体は 、天然のパリトキシンの１００〜１０００倍も細胞毒性が弱いことが示されてい る（Ｗａｔｔｅｎｂｅｒｇ、ＥＪ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　（１９ｇ９）　 ４９：５８３７−５８４２、および０ｈｉｚｔ＋ｍｉ、Ｙ、ら、　Ｐｈａ　ｔａ ａｃｏｌ　ｘ　丁ｈｅｒ　（１９８０）　ｌｕｎｇ：２０９−２１２）　。As shown in Figure 1, palytoxin has an amine 7 group at the 115th position, and this amine group Derivatives with carboxylic acids yield acylated barytoxin derivatives, which are It has been shown that palytoxin is 100 to 1000 times less cytotoxic than natural palytoxin. (Wattenberg, EJ, et al., Cancer Res (19g9) 49:5837-5842, and 0hizt+mi, Y, et al., Pha ta acol x Dingher (1980) lung: 209-212).

このようなアシル化は、分析および構造解析研究に用いられる誘導体に限定され てきた。Ｈｉｒａｔａ、　Ｙ、ら、ｈ」ニアｅｍ　（１９７９）　５１：１８７ ５−１８８３は、ｐ−ニトロフェニルアセテートによってパリトキシンをアセチ ル化して、Ｎ−アセチルパリトキシンを生成することを記載した。この化合物は 、Ｕｅｍｕｒａ、　Ｄ。Such acylation is limited to derivatives used for analytical and structural studies. It's here. Hirata, Y. et al. (1979) 51:187 5-1883 acetylates palytoxin with p-nitrophenyl acetate. It has been described that N-acetylpalytoxin is produced by This compound is , Uemura, D.

ら、シ■−しｌ　（１９８０）ｉｌ：４８５７−４８６０．ＭａｃＦａｒｌａｎ ｅ、Ｒ，Ｄ、ら、Ｊｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｃ　（１９８０）　辻■Ｄ：８７５−８ ７６、およびＭｏｏｒｅ、　Ｒ，Ｅ、、Ｐｒｏ　ｓｓ　’ｎ　ｔ　ｅ　Ｃｈｅｍ ｉｓｔ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｎａｔｕｒａｌ　ｏｄｕｃｔｓ（１９８５）　４８： ８２−２０２によっても記載された。さらに、Ｍｏｏｒｅ、　Ｒ２Ｅ、ら、Ｌハ 」■１」匹（１９８０）庄ニア３７０−７３７２、および上述のＭｏｏｒｅ　（ １９８５）は、Ｎ−（ｐ−ブロモベンゾイル）パリトキシンを調製シ、Ｎ−（ｐ −ブロモベンゾイル）ビスホモパリトキシンｆ）ＫＵｅｍｕｒａら（上述）によ って調製された。Ｌｅｖｉｎｅ、　Ｌ、ら、二ｃｏｎ　（１９８８）’ｎ■ｎ： ０１５−１１２１は、ハリト牛シンノラシオイムノア・２セイに用いるための、 Ｎ−３−（４−ヒドロキシー３−＋　２５　（−ヨードフェニル）プロビオニル パリト手シンの調製をご２載しており、５ａｃｈｉｎｖａｌａ、　Ｎ、Ｄ、ら、 未発表結果（１９８５）は、Ｎ−（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロへ牛サ ンー１−カルボ牛シル）パリトキシン、およびＮ−（３−（２−ビワジルジテオ ）プロピオニル）パリトキシンを、パリトキシンの免疫毒性およヒ免疫原の産生 における、タンパク質への接合のためのハプテンとして調製した。et al. (1980) il:4857-4860. MacFarlan e, R, D, et al., Jm Chew Soc (1980) Tsuji D: 875-8 76, and Moore, R.E., Pross’nteChem. ist Or anic Natural products (1985) 48: 82-202. Furthermore, Moore, R2E, et al. "■1" (1980) Shonia 370-7372, and the above-mentioned Moore ( (1985) prepared N-(p-bromobenzoyl)palytoxin. -bromobenzoyl)bishomopalytoxinf) According to KUemura et al. (supra) It was prepared as follows. Levine, L. et al. (1988)'n■n: 015-1121 is for use in Harito beef Shinnorasio Immunoa 2sei. N-3-(4-hydroxy-3-+25(-iodophenyl)probionyl There are two articles on the preparation of palitteshin, 5achinvala, N, D, et al. Unpublished results (1985) showed that N-(4-(N-maleimidomethyl)cyclo N-(1-carboxyl)palytoxin, and N-(3-(2-biwadylditeo) ) propionyl) palytoxin, immunotoxicity of palytoxin and production of human immunogen was prepared as a hapten for conjugation to proteins.

インビトロのアッセイでは、上記のアミノ基のアシル化誘導体は、天然の分子よ り毒性が弱いことが示された。０ｈｉｚｕｓｉ、　Ｙ、、および５ｈｉｂａｔａ 、　Ｓ、、Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏ　Ｅｘ　Ｔｈｅ　（１９８６＞■虹Ｈ：　２０ ９−２１２は、単離されたモルモットの精管の収縮を誘発する活性が、パリトキ シンより１００倍もＮ−７セチルパリト牛ンが低いということを示した。Ｗａｔ ｔｅｎｂｅｒｇ、　Ｅ４−ら、ｈ匹肛」且（１９８９）　ｉｉ：５８３７−５８ ４２は、Ｎ−（ｐ−ブロモベンゾイル）パリトキシンおよびＮ−アセチルパリト キシンが、３Ｔ３細胞に結合した表皮成長因子を低下させるように変えるのに、 少なくとも１００倍効果が低いということ、そして、これらも天然のパリトキシ ンより毒性が低いということを示した。ＥＬ−４マウスＴ−リンパ球を用いた、 追加的細胞毒性アッセイ（Ｈｅｗｅｔｓｏｎ、　Ｊ。In in vitro assays, the acylated derivatives of the above amino groups are similar to the natural molecule. It was shown that the toxicity was low. 0hizusi, Y, and 5hibata , S,, J Pharmaco Ex The (1986>■ Rainbow H: 20 9-212 has an activity that induces contraction of isolated guinea pig vas deferens compared to Palytokin. It was shown that N-7 cetylparitol was 100 times lower than that of cylindrical. Wat Tenberg, E4-et al., (1989) ii:5837-58 42 is N-(p-bromobenzoyl)palytoxin and N-acetylpalyto Xin changes the epidermal growth factor bound to 3T3 cells to decrease. At least 100 times less effective, and these are also natural palytoxins. It was shown that the toxicity was lower than that of Using EL-4 mouse T-lymphocytes, Additional cytotoxicity assay (Hewetson, J.

Ｆ、ら、ｕ盈■」（１９８９）　皿：Ａ１１９１）が、本発明者らによって示さ れ、パリトキシンとＮ−アセチルパリトキシンとの間の毒性の差が５００倍まで とされた。Ｗａｔｔｅｎｂｅｒｇら（上述）は、Ｎ−７シル化パリトキシンは実 際には非活性であり、残された細胞毒性は混入しているパリトキシンの影響によ るものである、と述べている。F., et al. (1989) Plate: A1191) was shown by the present inventors. The difference in toxicity between palytoxin and N-acetylpalytoxin is up to 500 times It was said that Wattenberg et al. (supra) have shown that N-7 sylated palytoxin is actually In some cases, it is inactive, and the remaining cytotoxicity is due to the influence of the contaminating palytoxin. It states that

調製されたＮ−アシル化バリトキシン誘導体の中には、酵素的加水分解のための 基質として設計されたものはなかった。Some of the prepared N-acylated barytoxin derivatives are suitable for enzymatic hydrolysis. None were designed as substrates.

活性の局所的生成をなし得る技術を利用するために、本発明の化合物は、生物学 的触媒による開裂を起こし易い形態で提供される。In order to take advantage of techniques capable of local production of activity, the compounds of the invention can be It is provided in a form that is susceptible to catalytic cleavage.

標的に向けたプロドラッグ転化を得ようとする初期のアプローチでは、局所的細 胞内アミダーゼを用いて、アミドプロドラッグの加水分解を行うことが提案され た。特に、シクロホスファミドは、特定の上皮腫瘍において高められると考えら れていたホスファミダーゼによって活性化されるように設計された（Ｇｏｍｏｒ ｉ、　Ｇ、、Ｐｒｏｃ　ＳＯＣＥＸ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ　（１９４Ｂ）　６９： ４０７）。シクロホスファミドは、医療的に有用なものではあるが、その場での 開裂についての初期の理論は不正確であることがわかり、一般に、腫瘍細胞にお いて、選択的にプロドラッグを変換する酵素を発見することが困難であった。さ らに最近のアプローチでは、酵素抗体複合体を用いて、プロドラッグ加水分解酵 素を、選択的に標的組織に送達することに焦点が置かれてきた（Ｓｅｎｔｅｒ、 　Ｐ、Ｄ、ら、ＰＮＡＳ　（１９８８）　８５＋４８４２−４８４６；　５ｅｎ ｔｅｒ、Ｐ、Ｄ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　（１９８９）４９：５７８９−５ ７９２：Ｂａｇｓｈａｗｅ、　Ｋ、Ｄ、、紅」」ＩＫ虹（１９８９）　６０：２ ７５−２８１；米国特許第４．９７５．２７８号；　Ｂａｇｓｈａｖｅ、に、Ｄ 、ら、　ｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅ　（１９８８）　５８ニア００−７０３；　Ｋｅｒ ｒ、Ｄ、Ｅ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏ土■工（１９９ ０）　３１：２０２−２０６：　１９８８年１０月６日公開のＰＣＴ出願第ＷＯ ３８１０フ３７８号、　１９８９年２月８日公開のヨーロッパ特許第３０２．４ ７３号：および米国特許第４．９７５．２７８号。このアプローチに関する一般 論については、５ｅｎｔｅｒ、　Ｐ、Ｄ、ら、ｕ上ｌ」（１９９０）　４：１８ ８−１９３を参照のこと。Initial approaches to achieving targeted prodrug conversion It has been proposed that intracellular amidases be used to hydrolyze amide prodrugs. Ta. In particular, cyclophosphamide is thought to be elevated in certain epithelial tumors. was designed to be activated by phosphamidase (Gomor i, G,, Proc SOCEX Biol Med (194B) 69: 407). Although cyclophosphamide is medically useful, it Early theories about cleavage proved inaccurate, and tumor cells generally However, it has been difficult to discover enzymes that selectively convert prodrugs. difference A more recent approach uses enzyme-antibody conjugates to target prodrug hydrolytic enzymes. The focus has been on selectively delivering molecules to target tissues (Senter, P, D, et al., PNAS (1988) 85+4842-4846; 5en ter, P, D, et al. Cancer Res (1989) 49:5789-5 792: Bagshawe, K, D,, Beni'' IK Niji (1989) 60:2 75-281; U.S. Patent No. 4.975.278; Bagshave, D. , et al. r J Cance (1988) 58 Near 00-703; Ker r, D, E, et al. Cancer Immunol Immuno Earthworks (199 0) 31:202-206: PCT Application No. WO published October 6, 1988 3810 F378, European Patent No. 302.4 published February 8, 1989 No. 73: and U.S. Patent No. 4.975.278. General about this approach Regarding the theory, 5enter, P. D. et al. (1990) 4:18 See 8-193.

このアプローチによると、複合体の形の酵素を、固形膿瘍に対するモノクローナ ル抗体を標的として、膿瘍部位でのみ活性化するプロドラッグを送達することに よって、癌を治療するために、酵素／プロドラ・ノブの組合せが用いられる。プ ロドラッグの投与は、酵素複合体が腫瘍の最適部分に位置し、正常な組織および 血漿を取り除くまで遅らされる。用いられた酵素／プロドラッグの組合せには、 アルカリホスファターゼ／エトポンドホスフェート（Ｓｅｎｔｅｒ　Ｐ、Ｄ、ら 、ＰＮＡＳ　（１９８ｇ）８５　：４８４２−４８４６）および細菌カルボキシ ペプチダーゼＧ２／ｐ−Ｎ−ビス−（２−クロロエチル）−アミノベンゾイルグ ルタミン酸（Ｂａｇｓｈａｗｅ、　Ｋ、Ｄ、ら、Ｂｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　（１ ９８８）　５８ニア０Ｏ−７０３）、およびペニシリンＶアミダーゼ／ドキソル ビシンアミド（Ｋｅｒｒ、　Ｄ、　Ｅ。According to this approach, the enzyme in the form of a complex can be used as a monoclonal drug against solid abscesses. target the antibody to deliver a prodrug that is only active at the abscess site. Thus, the enzyme/prodra knob combination is used to treat cancer. P The administration of Rodrug allows the enzyme complex to be located in the optimal part of the tumor and in normal tissues and Delayed until plasma is removed. The enzyme/prodrug combinations used included: Alkaline phosphatase/ethopone phosphate (Senter P, D, et al. , PNAS (198g) 85:4842-4846) and bacterial carboxy Peptidase G2/p-N-bis-(2-chloroethyl)-aminobenzoylg Rutamic acid (Bagshawe, K, D, et al., Br J Cancer (1 988) 58nia0O-703), and Penicillin V Amidase/Doxol Bicinamide (Kerr, D, E.

ら、（１９９０）上述）が含まれる。(1990) supra).

ｌ豆旦笠丞 本発明は、上述のプロドラ・ノブ活性系において、ペニシリンアミダーゼによっ て開裂可能であり、そのために毒素としテ有用な、パリトキシンの新規なアミド および天然に生じたアナログを含む、パリトキシン関連化合物のプロドラッグを 提供する。これらのアミドは、フェニルアセチルアミド、ヒドロキシフェニルア セチルアミド、フェノキシアセチルアミド、またはヒドロキシフェノキシアセチ ルアミドでアル。パリトキシン類のプロドラ・ノブを用いることによって、標的 化剤が使用可能な細胞または組織のいずれかをも標的とした毒性が得られる。l Mamedankasajo The present invention is directed to the above-mentioned Prodra-Knobu activation system, which is activated by penicillin amidase. A novel amide of palytoxin that can be cleaved and is therefore useful as a toxin. and prodrugs of palytoxin-related compounds, including naturally occurring analogs. provide. These amides include phenylacetylamide, hydroxyphenylamino Cetylamide, phenoxyacetylamide, or hydroxyphenoxyacetylamide Al in Ruamide. By using the prodola knob of palytoxins, Targeted toxicity can also be achieved in any cell or tissue to which the activating agent can be used.

上述のように、本発明は、ペニシリンアミダーゼ開裂可能なプロドラッグを参照 して説明されるが、本発明には、生物学的触媒で開裂可能なあらゆるパリトキシ ンプロドラッグを用いる、化合物および方法が含まれる。As mentioned above, the present invention refers to penicillin amidase cleavable prodrugs. However, the present invention includes any palytoxy group that can be cleaved with a biological catalyst. Compounds and methods using the drug prodrugs are included.

１つの局面においては、本発明は、パリトキシン、パリトキシンカルボン酸、ホ モパリトキシン、ビスホモパリトキシン、イソパリトキシン、ネオパリトキシン 、デオキシパリトキシン、および天然に生じた共存アナログからなる群から選択 される、パリトキシン関連プロドラッグを含有する薬学的組成物に関し、所望で ない細胞または組織の作用を、これらのプロドラッグを投与することによって破 壊または損傷する方法に関する。この方法は、典型的には、パリトキシン関連毒 素をプロドラッグから放出し得る、関連の標的に向けた生物学的触媒を投与する ことを包含する、プロトフルによって行われる。In one aspect, the present invention provides palytoxin, palytoxin carboxylic acid, Mopalytoxin, bishomopalytoxin, isopalytoxin, neopalytoxin , deoxypalytoxin, and naturally occurring coexisting analogs. For pharmaceutical compositions containing palytoxin-related prodrugs, By administering these prodrugs, the effects of cells or tissues that are not present can be disrupted. Relating to a method of breaking or damaging. This method typically uses palytoxin-related toxins. administering a biological catalyst directed toward the relevant target that can release the element from the prodrug. This is done by Protoful, which includes:

他の局面においては、本発明は、パリトキシンおよびそのアナログの特異的プロ ドラッグに関する。フェニルアセチル誘導体、ヒドロ牛ジフェニルアセチル誘導 体、フェノキシアセチル誘導体、またはヒドロキシフェノキシアセチル誘導体を 含む、ペニシリンアミダーゼで開裂可能な形態のアミドプロドラッグが好ましい 。In other aspects, the invention provides specific proteins for palytoxin and its analogs. Regarding drugs. Phenylacetyl derivatives, hydrobovine diphenylacetyl derivatives derivatives, phenoxyacetyl derivatives, or hydroxyphenoxyacetyl derivatives. Preferred are penicillin amidase-cleavable forms of the amide prodrug, including .

図面の簡単な説明 図１は、パリトキシンおよびいくつかの天然に生じた共存アナログの構造を示す 。Brief description of the drawing Figure 1 shows the structure of palytoxin and several naturally occurring coexisting analogs. .

図２は、ペニシリンアミダーゼの存在下における本発明のプロドラッグ形態およ びパリトキシン形態の細胞毒性を示すグラフである。Figure 2 shows the prodrug forms of the invention in the presence of penicillin amidase and 1 is a graph showing the cytotoxicity of palytoxin and palytoxin forms.

図３は、ペニシリンアミダーゼの存在下におけるプロドラック、Ｎ−アセチルパ リトキシンおよびパリトキシンの細胞毒性を示すグラフである。Figure 3 shows the prodrug, N-acetylpamine, in the presence of penicillin amidase. 1 is a graph showing the cytotoxicity of litoxin and palytoxin.

Ｕを　るための≦熊 本発明は、組織を標的とし得る特定の生物学的触媒によって開裂し得るプロドラ ッグに変換された、パリトキシン関連の毒素に関する。本発明の組成物は、パリ トキシンおよびそのアナログの顕著な毒性、ならびにこれらトキシンの官能基が 誘導体化してプロドラッグ形態が得られることを利用する。≦bear for U The present invention provides prodrugs that can be cleaved by specific biological catalysts that can be targeted to tissues. Concerning palytoxin-related toxins that have been converted to The composition of the present invention The significant toxicity of toxins and their analogs and the functional groups of these toxins It takes advantage of the fact that it can be derivatized to obtain a prodrug form.

パリトキシンおよびそのアナログは天然源から単離され、パリトキシンは現在で は市販されている。最近、６４個のキラル炭素および従って１０２１個の可能な 異性体を含む、パリトキシンカルボン酸の全ての合成が報告されている（　Ａｒ ｍｓｔｒｏｎｇ。Palytoxin and its analogs have been isolated from natural sources, and palytoxin is currently is commercially available. Recently, 64 chiral carbons and thus 1021 possible All syntheses of palytoxin carboxylic acid, including isomers, have been reported (Ar mstrong.

Ｒ，Ｗ、ら、Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｃ　（１９８９）　１１１７５２５−７ ５３０）。ノくリドキシンの化学、毒物学および薬理学についての総説が、Ｈａ ｂｅｒｍａｎ、　Ｅ、、Ｔｏｘｉｃｏｎ　（１９８９）　ｕ」且：１１７１−１ １８７およびＨｉｒａｔａ、　Ｙ、ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａ ｌ　Ｔｏｘｉｎｓ、第３巻、１１章、ノ寸１ノドキシンの化学および薬理学、Ｔ ｕ、　Ａ、Ｔ、編（１９８ｇ）　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ、　３７−４５頁により公表されて（Ｘる。）ぐリドキシンおよ びそのアナログ、ホモノ（リドキシン、ビスホモノ＜　パリトキシン、ネオパリ トキシン、デオキシ、パリトキシン、イソ示す。ハ江止ｎ種に共存する天然に生 じたアナログ力ｆさら（二発見されることもあり得る。従って、本明細書で（ま 、］（１ノドキシン「およびその天然に生じた共存アナログ」の上述の形態は、 上述の化合物自体、および上述のアナログと共（こ、ム打■慕種に生じる同様の 構造の関連する任意の化合物を指す。R, W, et al., J Am Chew Soc (1989) 1117525-7 530). A review of the chemistry, toxicology and pharmacology of nolidoxin is published by Ha berman, E., Toxicon (1989) u” and: 1171-1 187 and Hirata, Y. et al., Handbook of Natura l Toxins, Volume 3, Chapter 11, Chemistry and Pharmacology of Nodoxins, T u, A, T, ed. (198g) Marcel Dekker, Inc., N Published by EW York, pp. 37-45 (X.) bishomono (lidoxin, bishomono palytoxin, neopali) Toxin, deoxy, palytoxin, iso. Naturally occurring coexisting with species It is also possible that analog forces similar to ] (1 The above-mentioned forms of nodoxin “and its naturally occurring coexisting analogues” are The above-mentioned compounds themselves, and together with the above-mentioned analogues (similar to those occurring in this species) Refers to any structurally related compound.

パリトキシンはきわめて毒性であり、０．０２５−０．４５μｇ／ｋｇの範囲で の２４時間静脈投与量でのＬＤｓｓを有し、これ（よ種ζこ依存する。筋肉内、 皮下および腹腔的注射による投与で（ま毒性ｉｔ低く、胃内投与では静脈投与よ り少なくとも２００倍効果力（低（Ｘ０バＩＪ　）キシンの投与量が多いと、投 与力）ら数分以内で死１こ至る。また、パリトキシンは既知の最も強力な血管収 縮薬の１つであり、アンジオテンシン−１１より約１００倍効力カ５強（１゜イ ンビボにおいて示される効力には、シコ・ツクおよび***を伴う腎不全、壊死 を起こす脈管炎および虚血を伴う全身性のまれる。また、マウス皮膚モデルでは 腫瘍プロモーターであることが報告されている（Ｆｕｊｉｋｉ、　Ｈ，ら、「膿 瘍プロモーターの新しいクラス：テレオシジン、アプリシアトキシン（ａｐｌｙ ｓｉａｔｏｘｉｎ）およびパリトキシン」江■凪よ、堕よ、お工、□１Ｅｎｖｉ ｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｔｕｍｏｒ　Ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ　Ｆｕｊｉｋｉ、Ｈ，ら 編、ＪａｐａｎｅｓｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、　 Ｔｏｋｙｏ／ＶＮＵ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｕｔｒｅｃｈｔ　（１９ ８４）、３７−４５頁；　Ｆｕｊｉｋｉ、Ｆｌ、ら、Ｃａｒｃｆｎｏ　ｅｎｅｓ ｉｓ　（１９８６）　７４０７）。毒性のインビトロにおける実験では、パリト キシンの効力としては、細胞膜における一価陽イオン孔形成、興奮性膜の脱分極 、平滑筋収縮、心筋収縮、赤血球溶血、ノルエピネフリン放出およびヒスタミン 放出、刺激アラ牛トン酸代謝、骨吸収、血小板凝集およびＥＧＦ受容体転形が含 まれる。Palytoxin is highly toxic, in the range of 0.025-0.45 μg/kg. LDss at a 24-hour intravenous dose, which is species dependent. Intramuscular, Administered by subcutaneous and intraperitoneal injections (with low toxicity), intragastric administration is less effective than intravenous administration. At least 200 times more effective (lower (X0) Death occurred within a few minutes. Palytoxin is also the most potent vascular astringent known. It is one of the depressants, and is approximately 100 times more potent than angiotensin-11 (1° Efficacy shown in vivo includes renal failure with cirrhosis and uremia, necrosis. A systemic infection accompanied by vasculitis and ischemia. In addition, in a mouse skin model It has been reported that it is a tumor promoter (Fujiki, H. et al. A new class of tumor promoters: teleosidins, aply siatoxin) and palytoxin” Jiang Nagi, fall, work, □1Envi ronmental Tumor Promotors Fujiki, H, et al. ed., Japanese Scientific 5ociety Press, Tokyo/VNU 5science Press, Utrecht (19 84), pp. 37-45; Fujiki, Fl, et al., Carcfno enes is (1986) 7407). In vitro toxicity experiments showed that Palito The effects of xins include the formation of monovalent cation pores in cell membranes and the depolarization of excitable membranes. , smooth muscle contraction, myocardial contraction, red blood cell hemolysis, norepinephrine release and histamine release, stimulated alatinate metabolism, bone resorption, platelet aggregation and EGF receptor transduction. be caught.

パリトキシンおよびそのアナログは触媒介在の放出システムにおけるプロドラッ グとして使用するのに特に適している。Palytoxin and its analogs are prodrugs in catalyst-mediated release systems. Particularly suitable for use as a tag.

例えば、これらは酵素の非存在下で安定するアミドを形成し得、また、本発明の プロドラッグは内因性酵素によっては開裂し得ない。トキシンの分子量は比較的 低いため、分散による腫瘍への浸透は比較的容易であり、またプロドラッグ形態 は毒性形態よりはるかに効力が低い。これら薬物の毒性形態は効力が極めて高い 。For example, they can form amides that are stable in the absence of enzymes and also Prodrugs cannot be cleaved by endogenous enzymes. The molecular weight of toxins is relatively tumor penetration through dispersion is relatively easy due to the low is much less potent than the toxic form. Toxic forms of these drugs are extremely potent .

パリトキシンは、腫瘍の通常に隣接し、た位置で生成されると、はとんどの細胞 の表面のＮａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅに対して高い親和性を有するため（Ｂｏｔｔ ｉｎｇｅｒ、　Ｆｌ、ら、Ｂｔｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ａｃｔａ（１９８ ６）　８６１：１６５−１７６）、毒素は標的化剤のためのマーカーが存在する かどうかに関わらずすべての膿瘍細胞を結合するようである。さらに、パリトキ シンの強力な血管収縮活性により、腫瘍組織を通して薬物が効果的に分布するの を妨げる対流力が低減するのが期待される。Palytoxin is produced in a location that is usually adjacent to a tumor and is found in most cells. Because it has a high affinity for Na, K-ATPase on the surface of (Bott Inger, Fl, et al., Btochim Biohs Acta (198 6)　861:165-176), toxins have markers for targeting agents It appears to bind all abscess cells, regardless of whether they are present or not. In addition, Palitoki The strong vasoconstrictor activity of Cyn facilitates the effective distribution of the drug through tumor tissue. It is expected that the convective forces that impede this will be reduced.

本発明のパリトキシンプロドラッグは、適切な生物学的触媒の存在下で効果的な パリトキシンへと開裂され得るように設計される。「生物学的触媒」とは、反応 速度への影響に関して、酵素と類似した振舞いをする生体系と適合性のある分子 を意味する。最も一般的に使用される生物学的触媒は酵素である。しかし、抗体 およびＲＮＡのような他の適合性のある分子が触媒活性を示すことが見い出され ている。これらの他の形態もまた本発明の方法で有用な触媒の範囲に含まれる。The palytoxin prodrugs of the present invention are effective in the presence of a suitable biological catalyst. Designed so that it can be cleaved to palytoxin. "Biological catalyst" is a reaction Molecules compatible with biological systems that behave similarly to enzymes with respect to their effect on rate means. The most commonly used biological catalysts are enzymes. However, antibodies and other compatible molecules such as RNA have been found to exhibit catalytic activity. ing. These other forms are also within the scope of catalysts useful in the process of this invention.

本発明の例示的な実施態様は、哺乳類の組織で生じることが知られていない酵素 であるペニシリンアミダーゼによって開裂され易い新規のパリトキシンアミダー ゼを含み、これにより、ペニシリンアミダーゼが処理される被験体内の特定の位 置を標的とする標的化プロトコルで、これらのプロドラッグが有用となる。Exemplary embodiments of the invention provide enzymes that are not known to occur in mammalian tissues. A novel palytoxin amidase that is easily cleaved by penicillin amidase contain enzymes, which allow penicillin amidases to be processed at specific locations within the subject. These prodrugs will be useful in targeting protocols that target

ペニシリンアミダーゼ（ペニシリンアミドヒドロラーゼ、ＥＣ３，５，１，１１ ）は、ペニシリン−Ｇおよびペニシリン−■から６−アミツベニシラン酸を産生 ずるために商業的に使用される８６ｋｄの微生物酵素である（Ｌｉｎｄｓａｙ、 　Ｃ，Ｄ、ら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９０）　ｌｊｌ：１３３−１ ４１）。この酵素はインビトロにおけるドキソルビシンのアミドプロドラッグ誘 導体を活性化するために使用されている（　Ｋｅｒｒ、　Ｄ、　Ｅ、、Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅ（１９９０）　３１：２０２−２０ ６；　５ｅｎｔｅｒ、　Ｐ、Ｄ、、ＦＡＳＥＢ　Ｊ　（１９９０）　４：１！１ ８−１９３）。この酵素のモノクローナル抗体への連結はＫｅｒｒ、　Ｄ、Ｅ、 ら（上述）により記載されており、本明細書において参考として援用されている 。簡単に述べれば、抗体は、２−イミノチオラン塩酸塩による誘導体化によって スルフヒドリル基が与えられ、そしてリンカ−のスクシンイミジル４−（Ｎ−マ レイミドメチル）シクロへ牛サンー１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）により誘 導体化され、反応性マレイミド基を有する酵素を提供するアミダーゼに、標準的 な連結技術を用いて結合させる。ペニシリンアミダーゼの任意の適切な標的化剤 との複合体は本明細書に示す治療方法において有用である。Penicillin amidase (penicillin amidohydrolase, EC3,5,1,11 ) produces 6-amitubenicillanic acid from penicillin-G and penicillin-■ (Lindsay, C, D, et al. Eur J Biochem (1990) ljl:133-1 41). This enzyme induces the amide prodrug of doxorubicin in vitro. used to activate conductors (Kerr, D, E, Canc Er Immunol Immunothe (1990) 31:202-20 6; 5enter, P, D,, FASEB J (1990) 4:1!1 8-193). The linkage of this enzyme to a monoclonal antibody was described by Kerr, D.E. et al. (supra), herein incorporated by reference. . Briefly, antibodies are prepared by derivatization with 2-iminothiolane hydrochloride. a sulfhydryl group is provided and the succinimidyl 4-(N-mer) of the linker Reimidomethyl) cyclo induced by bovine san-1-carboxylate (SMCC) A standard method for amidases provides enzymes with conductive and reactive maleimide groups. Combine using suitable connection techniques. Any suitable targeting agent for penicillin amidase Complexes with are useful in the therapeutic methods provided herein.

パリトキシン関連プロドラッグを対応する毒素に変換するための開裂薬剤として 適切な他の生物学的触媒には、誘導体化されるとき毒性活性を失うパリトキシン の誘導体形態に対して適切であるものが含まれる。候補となる酵素は、例えば上 述のＰＣＴ出願第ＷＯ３８１０７３７８号に示されている。As a cleavage agent to convert palytoxin-related prodrugs to the corresponding toxins Other suitable biological catalysts include palytoxin, which loses toxic activity when derivatized. including those suitable for derivative forms of. Candidate enzymes include, for example, As shown in PCT Application No. WO38107378 mentioned above.

プロドラッグのＡ パリトキシンは、Ｍｏｏｒｅ、　Ｒ，Ｅ、および５ｈｅｕｅｒ、　Ｐ、Ｊ、、５ ｃｉｅｎＣｅ　（１９７１）　１７２：４９５−４９８の方法によってｈ江旦用 ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ盈から単離される。純度は標準的な分析方法を用いて確認 され得る。特に、単離された薬物は、４０％アセトニトリル／　０．０５Ｎ酢酸 、１　ｍ１７分で、２６３　ｒ＋ａ＋でのＵＶ吸光度による検出を行うＺ。Prodrug A Palytoxin has been described by Moore, R.E., and 5heuer, P.J., 5 cienCe (1971) 172:495-498. It is isolated from S. tuberculos. Purity is confirmed using standard analytical methods can be done. Specifically, the isolated drug was tested in 40% acetonitrile/0.05N acetic acid. , 1 m 17 min, Z with detection by UV absorbance at 263 r+a+.

ｒｂａｘ　ＯＤＳカラム（４，６ｘ　２５Ｏｎ＋ｍ）、もしくは１０：１の０． ０２Ｎリン酸緩衝液、ｐＨ４，６：エタノール、１　！１１／分、２６３　ｎｍ のＳｈｏｗｄｅｘ　０Ｈｐａｋ　Ｂ８０４カラム（８Ｘ　５００　ｍｍ）を使用 して、ＨＰＬＣにおける単一ピークとして移動すべきである。rbax ODS column (4,6x 25On+m) or 10:1 0. 02N phosphate buffer, pH 4,6: Ethanol, 1! 11/min, 263 nm Using Showdex 0Hpak B804 column (8X 500 mm) and should migrate as a single peak on HPLC.

アンル化バリトキシンは標準的なアシル化方法を使用して合成される。これらに は、アシルハロゲン化物のような関連するカルボン酸の活性化形態の使用、また は、ジイミド試薬、例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル カルボジイミド（ＥＤＣＩ）のような凝縮剤の使用が含まれる。ペニシリンアミ ダーゼが生物学的触媒として使用される場合は、アシル化反応におけるカルボン 酸の相手は、得られるアミドがこの酵素により開裂し易くなるように選択され、 通常は、フェニル酢酸、ヒドロキシフェニル酢酸、フェノ牛シ酢酸、およびヒド ロキシフェノキシ酢酸よりなる群から選択される。Unarylated barytoxin is synthesized using standard acylation methods. to these The use of activated forms of related carboxylic acids such as acyl halides, and is a diimide reagent, e.g. 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl Includes the use of condensing agents such as carbodiimide (EDCI). Penicillin amyloid When Dase is used as a biological catalyst, the carvone in the acylation reaction The acid partner is selected such that the resulting amide is easily cleaved by this enzyme; Commonly used are phenylacetic acid, hydroxyphenylacetic acid, phenobocyacetic acid, and hydroxide. selected from the group consisting of roxyphenoxyacetic acid.

典型的な調製では、不活性で極性の非プロトン性溶媒中のカルボン酸は、Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミドおよびＥＤＣＩとの反応によって活性化ヒドロキシスク シンイミドエステルに変換される。次に、１０倍過剰のＮＨＳ活性エステルを使 用して、非水性の穏やかな塩基性溶媒中でパリトキシンを処理する。生成物アミ ドを標準的な方法を使用して回収し、そしてクロマトグラフィーによって精製す る。陽イオン交換クロマトグラフィーが特に好適である。In a typical preparation, a carboxylic acid in an inert polar aprotic solvent is Activated hydroxysuccinimide and EDCI Converted to cinimide ester. Next, use a 10-fold excess of NHS active ester. Treat palytoxin in a non-aqueous, mildly basic solvent using product ami The compound is collected using standard methods and purified by chromatography. Ru. Cation exchange chromatography is particularly preferred.

他の生物学的触媒の作用によって可逆性のある非活性化となるＮ−末端アミ７基 または他のパリトキシンの官能性に対する他の誘導体は、選択された触媒に感応 する適切な置換基を選択する必要がある。N-terminal amine 7 group that undergoes reversible deactivation by the action of other biological catalysts or other derivatives to other palytoxin functionalities that are sensitive to the selected catalyst. Appropriate substituents need to be selected.

アシルアミドまたは他の誘導体の調製は他にも様々な標準的な方法が使用され得 る。得られるアミドは、上述のバリト牛シン単離体の純度の基準として示される ＨＰＬＣ方法を使用して非反応性パリトキシンがら、または薄層クロマトグラフ ィーによって分離され得る。分析方法として行われるこれらの方法はまた、プロ ドラッグの酵素による加水分解を評価するために使用され得る。Various other standard methods can be used for the preparation of acylamides or other derivatives. Ru. The resulting amide is indicated as a criterion for the purity of the above-mentioned Baritoxin isolate. Non-reactive palytoxin using HPLC method, or thin layer chromatography can be separated by These methods performed as analytical methods are also It can be used to assess enzymatic hydrolysis of drugs.

精製および単離されたプロドラッグは、望ましくない細胞または組織を傷つける または破壊するように設計された治療法において被験体に投与するための組成物 に処方するのに連木発明のプロドラッグは、一般的に、プロドラッグ自体を投与 する前の、標的化剤−プロドラッグ開裂触媒複合体の予備的な投与を用いるプロ トコルで投与するために設計される。Purified and isolated prodrugs harm unwanted cells or tissues or a composition for administration to a subject in a therapy designed to destroy Renki's prodrugs are generally administered by administering the prodrug itself. Procedures using pre-administration of a targeting agent-prodrug cleavage catalyst complex prior to Designed to be administered in a controlled manner.

本複合体は、標的組織、典型的には腫瘍、においてマーカーと反応するように特 に設計された標的化剤を含む。最も典型的には、標的化剤は、完全な免疫グロブ リンの免疫反応性を保有する抗体、またはその、Ｆａｂ、　Ｆａｂ”、もしくは Ｆ（ａｂ’）２フラクメントなどの、免疫学的に反応するフラグメントである。The complex is specifically designed to react with a marker in a target tissue, typically a tumor. Contains targeting agents designed to Most typically, the targeting agent is a complete immunoglobulin. An antibody possessing phosphorus immunoreactivity, or its Fab, An immunologically reactive fragment, such as an F(ab')2 fragment.

膿瘍を標的する抗体の性質に関する議論は、上記に引用した第Ｗ０８ｇ１０７３ ７８号およびヨーロッパ特許第３０２４７３号の出願書類に見られる。しかし、 標的組織上のレセプター部位または他の表面タンパク質に結合するように設計さ れたリガンドの使用などの、他の標的化戦略もまた用いられ得る。種々の糖タン パク質、炭水化物、および他のリガンドが当該分野で周知であり、適切な標的化 剤の選択は、破壊される細胞または組織の性質に依存する。一般には腫瘍組織が 破壊の候補であるが、上述したように、この戦略は、ウィルス感染細胞、種々の 良性増殖、炎症部位、血管組織の閉塞などの、他の望ましくない細胞および組織 に拡大され得る。これらの細胞および組織に適切な標識化剤は、当業者に理解さ れる。A discussion of the nature of abscess-targeting antibodies can be found in article W08g1073, cited above. No. 78 and European Patent No. 302,473. but, designed to bind to receptor sites or other surface proteins on target tissues. Other targeting strategies may also be used, such as the use of targeted ligands. Various sugar tongues Proteins, carbohydrates, and other ligands are well known in the art and suitable for targeting. The choice of agent depends on the nature of the cells or tissues to be destroyed. Generally, tumor tissue candidates for destruction, but as mentioned above, this strategy Other unwanted cells and tissues, such as benign growths, sites of inflammation, and blockages in vascular tissue can be expanded to Appropriate labeling agents for these cells and tissues will be understood by those skilled in the art. It will be done.

連結された生物学的触媒は、典型的には、アミダーゼなどの通常の酵素であるが 、触媒性抗体またはそれらの機能フラグメントもしくは核酸などの他の形態もま た、用いられ得る。The linked biological catalyst is typically a conventional enzyme such as an amidase, but , catalytic antibodies or functional fragments thereof or other forms such as nucleic acids. It can also be used.

本発明のプロドラッグは、通常の投与様式を用いて、選択された様式に適切な処 方で投与される。そのような処方は、例えば、肚畦旺匡ｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃ 旦旦」二と」皿＝（最新版）、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、Ｅａ ｓｔｏｎ、　ＰＡに見られる。本発明のプロドラッグは、ハンクス液またはリン ゲル液などの種々の担体を用いて注射され得、そして静脈内、腹腔内、筋肉内、 または皮下に、治療する特別な適応症の指示に従って注射され得る。このプロド ラッグはまた、注射用のリポソームまたはマイクロカプセル中に処方され得る。The prodrugs of the invention can be administered using conventional modes of administration as appropriate for the selected mode of administration. administered by the patient. Such formulations are available, for example, from Pharmac. Dandan” Nito” plate = (latest edition), Mack Publishing Co,, Ea ston, seen in PA. The prodrugs of the invention can be used in Hank's solution or in It can be injected using a variety of carriers, such as gel solutions, and can be administered intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, or subcutaneously, as indicated for the particular indication being treated. This prod Lugs can also be formulated into liposomes or microcapsules for injection.

さらに、このプロドラッグは、徐放性処方で移植物として処方され得るか、また は、皮膚パンチ剤、鼻内噴霧剤、坐剤などの経皮もしくは経粘膜用処方で投与さ れ得る。胆汁酸塩、フシデート、界面活性剤などの浸透剤を用いる適切な処方が 、当該分野で公知である。Additionally, this prodrug can be formulated as an implant in a sustained release formulation or is administered in transdermal or transmucosal formulations such as skin punches, nasal sprays, and suppositories. It can be done. Appropriate formulations using penetrants such as bile salts, fucidates, and surfactants may , known in the art.

錠剤、カプセル剤、粉剤、シロップ剤などとしての経口投与もまた、考えられて いる。局所的治療が望ましい、ある種の適応症では、ペースト剤、軟膏剤、ゲル 剤、またはパップ剤の形態の局所治療もまた、用いられ得る。Oral administration as tablets, capsules, powders, syrups, etc. is also being considered. There is. For certain indications where topical treatment is desirable, pastes, ointments, and gels are Topical treatments in the form of agents or poultices may also be used.

典型的なプロトコルでは、プロドラッグの開裂に有効な生物学的触媒に連結され た標的化剤が、全身投与されて標的組織に向かうための任意の適切な経路（上述 した経路に類似する）によって、最初に投与される。この場合はまた、局所的治 療が可能であれば、腫瘍もしくは他の標的中に直接注射するか、または局所治療 によって、これが成し遂げられ得る。A typical protocol involves coupling the prodrug to an effective biological catalyst for cleavage. The targeted agent can be administered systemically to the target tissue by any suitable route (as described above). (similar to the same route). In this case also local treatment If treatment is possible, injection directly into the tumor or other target, or local therapy. This can be accomplished by.

全身投与が用いられるときは、全く正常な組織および血漿に標的化剤／触媒を共 役させて、標的細胞または組織に向かうために十分な時間がかけられる。標的化 剤／触媒の連結が免疫原性であれば、免疫毒素の投与の場合にしばしば見られる ように、／クロスポリンなどの免疫抑制剤の使用によって、この副作用が改善さ れ得る。When systemic administration is used, the targeting agent/catalyst is combined with completely normal tissues and plasma. sufficient time is allowed for the target cell or tissue to reach the target cell or tissue. targeting If the agent/catalyst linkage is immunogenic, this is often the case when administering immunotoxins. This side effect can be improved by using immunosuppressive drugs such as /Crossporin. It can be done.

特定の被験体および適応症のために投与量レベルおよびプロトコールが設計され 、一般に医学および獣医学の専門家によって実施される。投与量レベルは、苦痛 の重篤度およびその性質とともに、投与様式に依存する。しかしながら、プロド ラッグの投与量レベルは、０．１−５０（ｌμｇ／ｋｇ、好ましくは１−５０μ ｇ／ｋｇのプロドラッグの範囲で全身投与のほとんどの場合に投与されることが 期待される。より低いレベルは、局所的治療で用いられ得る。Dosage levels and protocols are designed for specific subjects and indications. , commonly performed by medical and veterinary professionals. Dosage level is painful depends on the mode of administration, as well as the severity and nature of the However, the prod Dosage levels for rags are 0.1-50 (lμg/kg, preferably 1-50μg/kg). g/kg of the prodrug can be administered in most cases for systemic administration. Be expected. Lower levels may be used in topical treatments.

以下の実施例は例証を意図し、本発明を限定するものではない。The following examples are intended to be illustrative and not to limit the invention.

Ｋ施１−」 Ｌｆｆ−ヒドロキシフェニルアセチルパリトキシン正己ジ」泊五 図１に示す、１１５位のアミ７基のアシル化を以下のように行う。４−ヒドロキ シフェニル酢酸（１０７ｍｇ、　７００　μｍｏｌ）のＴＨＦ　（７ｍ　ｌ）溶 液に、アルゴン雰囲気下、室温で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（８１ｍｇ、 　７００μｍｏｌ）およびＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（１４４ｍ ｇ、７００μｍｏｌ）を加えた。１時間攪拌した後、析出したジシクロへキシル ウレアを沈澱させた。シリンジを用いて、７０μＨＤ上清（理論的１：　４−Ｈ ＰＡｃＯＨ（Ｄ　Ｎ）Ｉｓ活性エステル（７０μｍｏｌ）を含有する）を乾燥ピ リジン（０，５ｍ１）中のバリトキシン（２，０ｍｇ、０．７μｍｏｌ）を含有 する第２のバイアルに移した。室温で１．５時間後、ＴＬＣ（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ 製、ＮＨ２Ｆ２ｓａでプレコートしたＨＰＴＬＣ２１５６４７、ピリジン−水− ｎ−ペンタノール（９：８：６）；Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ製、シリカゲル６０　Ｆ２ ５４でプレコードシたＨＰＴＬＣ＄１３７２７、ピリジン−水−〇−ペンタノー ル（７：６：７））は、バリトキシンの完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸 発させた。得られた残留物を水（２ｍｌ）に溶解し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した（ ３ｍ１ｍｌ）。次に水層部分を凍結乾燥し、生成物を陽イオン交換クロマトグラ フィー（ＣＭ−セファデックスｃ−２５，０，０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ４，５ ）により精製した。ＮＨＰＡＰの収率は、ＵＶ分光法により、バリトキシンに関 して報告されている２６３ｎｍにおける吸光係数２３、６００を用いて、０．８ ７ｍｇ（４１％）と推定された。K 1-” Lff-Hydroxyphenylacetylpalytoxin Masami Di”Tomago Acylation of the amine 7 group at position 115 shown in FIG. 1 is performed as follows. 4-Hydroxy Cyphenylacetic acid (107 mg, 700 μmol) dissolved in THF (7 ml) N-hydroxysuccinimide (81 mg, 700 μmol) and N,N-dicyclohexylcarbodiimide (144 m g, 700 μmol) was added. After stirring for 1 hour, dicyclohexyl precipitated Precipitated urea. Using a syringe, add 70 μHD supernatant (theoretical 1:4-H PAcOH(DN)Is containing active ester (70 μmol)) was dried in a pipe Contains baritoxin (2,0 mg, 0.7 μmol) in lysine (0,5 ml) and transferred to a second vial. After 1.5 hours at room temperature, TLC (E, Merck HPTLC215647 pre-coated with NH2F2sa, Pyridine-Water- n-pentanol (9:8:6); E, manufactured by Merck, silica gel 60 F2 HPTLC $13727 precoded with 54, pyridine-water-〇-pentano (7:6:7)) showed complete consumption of baritoxin. Evaporate the solvent under reduced pressure. I let it emanate. The resulting residue was dissolved in water (2 ml) and washed with CH2Cl2 ( 3ml 1ml). The aqueous layer is then freeze-dried and the product is analyzed using cation exchange chromatography. Fi(CM-Sephadex c-25, 0,02M phosphate buffer, pH 4,5 ). The yield of NHPAP was determined with respect to barytoxin by UV spectroscopy. Using the reported extinction coefficient of 23,600 at 263 nm, 0.8 It was estimated to be 7 mg (41%).

ＮＨＰＡＰは少なくとも６力月間の保存において安定であり、ペニシリンアミダ ーゼによって開裂され得る。NHPAP is stable on storage for at least 6 months and is can be cleaved by enzymes.

図１に示す１１５位のアミ７基をｐ−ヒドロ牛ジフェノ牛シ酢酸（Ｎ）ＩＰＯＡ Ｐ）を用いて以下のようにアシル化する。室温テア　ルゴン雰囲気下、（４−ヒ ドロキシフェノキシ）酢酸（１１１３ｍｇ、　７００μｍｏｌ）のＴＨＦ　（７ ｍｌ）溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（８１ｍｇ、　７００ｔ１ｍｏｌ ）およびＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（１４４ｍｇ、ＩＱＯμｍｏ ｌ）を添加する。１時間撹拌シタ後、析出したジシクロへキシルウレアを沈澱さ せる。シリンジを用いて、７０μｍの上清（理論的には（４−ヒドロキシフェノ キシ）酢酸のＮＨ８活性エステルを７．０μｍｏｌ含有している）を、乾燥ビリ ジ７　（０，５ｍ１）中バリトキシン　（２，０Ｉｌ１ｇ、　０．７μｍｏｌ） を含有する第２のバイアルに移す。反応液をＴＬＣ（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ製、Ｎｌ ２　Ｆ２５ｍでブレフートした［（ＰＴＬＣ８１５６４７、ピリジン−水−ｎ− ペンタノール（９：８：６）　：　Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ製、シリカゲル６０　Ｆ２ ５４でプレコートしたＨＰＴＬＣ１ｔ１３７２７、ピリジン−水−ｎ−ペンタノ ール（７：６：７））によりモニターする。バリトキシンを完全に消耗した後、 溶媒を減圧下でエバポレートする。得られた残留物を水（２ｍｌ）中に溶解し、 ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する（３Ｘ１ｍｌ）。水層部分を凍結乾燥した後、生成物を 陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−七ファデックスＣ−２５，０，０２Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ４，５）により精製する。収率を、報告されている２６３ｎ ｍでのパリトキシンの吸光係数２３．６００を用いてＵＶ分光法により推定する 。The amine 7 group at position 115 shown in Figure 1 was replaced with p-hydrobovine diphenobovine cyacetic acid (N) IPOA. Acylation is performed using P) as follows. At room temperature, under a rugone atmosphere, (4-hybrid) (Droxyphenoxy)acetic acid (1113 mg, 700 μmol) in THF (7 ml) solution, N-hydroxysuccinimide (81mg, 700t1mol) ) and N,N-dicyclohexylcarbodiimide (144 mg, IQOμmo Add l). After stirring for 1 hour, the precipitated dicyclohexylurea was precipitated. let Using a syringe, remove the 70 μm supernatant (theoretically (4-hydroxyphenol) (containing 7.0 μmol of NH8 active ester of acetic acid) was added to dry biliary oxide. Varitoxin (2,0Il1g, 0.7μmol) in Di7 (0,5ml) Transfer to a second vial containing . The reaction solution was analyzed by TLC (E, manufactured by Merck, Nl 2 Brefut at F25m [(PTLC815647, pyridine-water-n- Pentanol (9:8:6): E, manufactured by Merck, silica gel 60 F2 HPTLC1t13727 precoated with 54, pyridine-water-n-pentano (7:6:7)). After completely depleting barytoxin, The solvent is evaporated under reduced pressure. The resulting residue was dissolved in water (2 ml) and Wash with CH2Cl2 (3X1 ml). After freeze-drying the aqueous layer, the product is Cation exchange chromatography (CM-7 Fadex C-25,0,02M Purify with phosphate buffer, pH 4,5). The yield was compared to the reported 263n Estimated by UV spectroscopy using the extinction coefficient of palytoxin 23.600 at m .

実」１匹」− ニエΣム？ｙ工三ヱｌユｊ重 クロマトグラフィー　の　。``1 fruit''- NieΣmu? y kosan el yujju of chromatography.

パリトキシンおよびパリトキシンプロドラッグを、シリカゲル６０　Ｆ２５４　 （ＥＭサイエンス）薄層クロマトグラフィープレート上で、ピリジン：水ニアミ ルアルコールの７：６：７混合物を用いて分離する。このシステムでは、パリト キシンはＲ＋；０．５１で移動し、一方Ｎ−（４−ヒドロキシフェニルアセチル ）パリトキシンはＲｔ＝０．６９で移動する。化合物はＵＶ光（２５４ｎｏ＋） により、またはプレートをｐ−アニスアルデヒド試薬（使用書＃２２、「薄層お よび気相クロマトグラフィー用着色試薬」、Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ、　Ｄａｒｍｓｔ ａｄｔ、　Ｇｅｒ＋ａａｎｙｓ　１９８０）を用いて処理することにより目で見 えるようにする。Palytoxin and palytoxin prodrugs were prepared using silica gel 60 F254. (EM Science) On a thin layer chromatography plate, pyridine:water Separate using a 7:6:7 mixture of alcohols. In this system, Palit Xin migrates with R+; 0.51, while N-(4-hydroxyphenylacetyl ) Palytoxin migrates at Rt=0.69. Compound UV light (254no+) or plate with p-anisaldehyde reagent (Instruction #22, “Thin Layer and Coloring Reagents for Gas Phase Chromatography”, E, Merck, Darmst adt, Ger+aanys 1980). make it possible for you to do so.

支皿史１ ■シム滞１１化 ＥＬ−４−マウスのＴ細胞リンパ腫系（ＡＴＣＣＴｌＢ５９）をＤＭＥＭ捕捉し た（フロー）培地中で１０％の仔牛血清、１ｍＭのし一グルタミンおよび２ｍＭ のピルビン酸ナトリウムで培養した。細胞を採取し、１０％（Ｖ／Ｖ）仔牛血清 、１ｍＭのし一グルタミンおよび２ｍＭのピルビン酸ナトリウムで捕捉した、ロ イシンを有さない最少必須培地中で懸濁し、無菌の９６−ウェルコスタ−マイク ロタイタープレート中で１０５細胞／ウエルでプレートした。各ウェルを、全容 量０．１５ｍ１中Ｌ　ｃｏｌｉから調製した０、　３μｇ／ｍｌから３３μｇｅ ｍ　ｌのペニシリン−〇アミダーゼ（ＰＧＡ）の存在下または非存在下で、あら かじめ定められた濃度のＮＨＰＡＰまたはパリトキシンにさらした。アッセイに 用いたＰＧＡの比活性は４７ユニツト／ｍｇであった。History of the plate 1 ■Sim delay 11 DMEM capture of EL-4-mouse T-cell lymphoma line (ATCCTlB59) 10% calf serum, 1mM glutamine and 2mM in flow medium. of sodium pyruvate. Harvest cells and add 10% (V/V) calf serum. , captured with 1mM monoglutamine and 2mM sodium pyruvate. Sterile 96-well Costermic microorganisms were suspended in minimal essential medium without icin. Plated at 105 cells/well in rotator plates. Each well 33μge from 0.3μg/ml prepared from L coli in a volume of 0.15ml In the presence or absence of ml of penicillin-○amidase (PGA), Exposure to predetermined concentrations of NHPAP or palytoxin. to the assay The specific activity of the PGA used was 47 units/mg.

１８時間のインキュベーション後、生存力を決定するためにウェルヲ０．０５μ Ｃｉの［１４Ｃ］−標識されたロイシンで２時間処理した。生存力のある細胞は ［Ｉｊｃ］−ロイシンを細胞タンパク質中に導入し得た。次にウェルをガラスフ ァイバーフィルターの上に採取し、液体シンチレーション計数のために処理した 。After 18 hours of incubation, the wells were diluted with 0.05 μl to determine viability. Treatment with Ci [14C]-labeled leucine for 2 hours. Viable cells are [Ijc]-leucine could be introduced into cellular proteins. Next, place the well in a glass collected on a fiber filter and processed for liquid scintillation counting. .

テストウェル中の生存率を複製未処理フントロールｘｌｏｏの平均ｃｐｍで除算 した複製ウェルから得た平均Ｃｐｌとして計算した。Viability in test wells divided by average cpm of replicate untreated Funtrol xloo It was calculated as the average Cpl obtained from replicate wells.

酵素のみで処理し、薬剤またはプロドラッグで処理しなかったコントロールは未 処理のコントロールに匹敵するｃｐｓを示した。Controls treated with enzyme only and no drug or prodrug were left untreated. showed comparable cps to treated controls.

結果を、ＰＧＡの濃度を様々に変えたＮＨＰＡＰ　（四角）またはパリトキシン （丸）（ピコグラム／＋１）に対する生存率％をプロットで表わして図２に示す 。図に示すように、酵素を添加しない場合、生存率を下げずにＦ１当りＬｏ、０ ００ｐｇ／ｍｌを越えるＮＨＰＡＰを添加し得る；パリトキシンのみを添加する と１０ｐｇ／＋＊ｌでのコントロールの生存率が２０％減少した。しかし、ＰＧ Ａが３．３μｇ／ｒａ　Ｉはどに少ない場合、ＮＨＰＡＰを含有するＮＨＰＡＰ 処理された培養物はパリトキシンのみを用いて得られたものと同様の用量作用曲 線を示した。酵素の存在下でパリトキシンを用いて得られた曲線には影響がなか った。The results are shown for NHPAP (squares) or palytoxin with various concentrations of PGA. (Circle) The survival rate % against (picogram/+1) is plotted and shown in Figure 2. . As shown in the figure, when no enzyme is added, Lo per F1 is 0 without decreasing the survival rate. More than 00 pg/ml of NHPAP can be added; only palytoxin can be added and the control survival rate at 10 pg/+*l decreased by 20%. However, P.G. When A is 3.3μg/ra　I is low, NHPAP containing NHPAP The treated cultures showed a dose-response curve similar to that obtained with palytoxin alone. showed the line. There was no effect on the curve obtained with palytoxin in the presence of the enzyme. It was.

同様の実験において、ＥＬ−４マウスのＴ−リンパ腫細胞（５ｘｌＯ１細胞／ウ エル）を、指定濃度のパリトキシン（ＰＴＸ）　、Ｎ−アセチルパリトキシン（ ＮＡＣＰＴＸ）　、またはＮ−（４−ヒドロキシフェノキシアセチル）パリトキ シン（ＮＨＰＡＰ　）に、ＰＧＡを用いてまたは用いずに、２時間、全容量０． １ｍｌの１０％の仔牛血清（ＭＥＭ）を含有するロイシンを有さないＭＥＭ中に さらした。ＰＧＡを３．３μｇ／＋＋　１のペニシリンＧアミダーゼとして供給 した。次に０．０５μＣｉ［１４Ｃ］−ロロインを容１０．０５ａ＋ｌのＭＥＭ 中に添加し、混合物をさらに２時間インキュベートした。次に細胞をガラスファ イバーフィルターの上に採取し、液体シンチレーション計数のため処理した。生 存力のある細胞は［＋４ｃ］−ロイシンを細胞タンパク質中に導入した。In a similar experiment, EL-4 mouse T-lymphoma cells (5xlO1 cells/u ), palytoxin (PTX), N-acetylpalytoxin ( NACPTX), or N-(4-hydroxyphenoxyacetyl)palitoki Syn (NHPAP) with or without PGA for 2 hours at a total volume of 0. in MEM without leucine containing 1 ml of 10% calf serum (MEM). Exposed. PGA supplied as 3.3μg/++1 penicillin G amidase did. Next, add 0.05 μCi [14C]-roroine to a MEM with a volume of 10.05 a+l. and the mixture was incubated for an additional 2 hours. Next, cells are placed on a glass substrate. were collected on a fiber filter and processed for liquid scintillation counting. Living Competent cells introduced [+4c]-leucine into cellular proteins.

結果を図３に示す。図からＮＨＰＡＰ毒性がＰＧＡの存在下で著しく増加してい ること；　ＰＴＸがＰＧＡの有無に関わらず毒性であり、ＮＡＣＰＴＸの毒性は ＰＧＡの存在下で増加しないことがわかる。The results are shown in Figure 3. The figure shows that NHPAP toxicity increases significantly in the presence of PGA. that PTX is toxic regardless of the presence or absence of PGA, and the toxicity of NACPTX is It can be seen that there is no increase in the presence of PGA.

〒　〒 烏旬重％ ４ｔＩＩｌｉＲ＋１（ｐｇ／ｍＬ） Ｆｉｇ、　３ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。〒 〒 Karasu Junju% 4tIIliR+1 (pg/mL) Fig, 3 Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE.

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。DK, ES, FR, GB, GR, IT, LU, MC, NL, SE), 0A (BF , BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, SN, TD, TG. ), AT, AU, BB, BG, BR, CA, CH, C3, DE.

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ 、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥDK, ES, FI, GB, HU, JP, KP, KR, LK, LU , MG, MN, MW, NL, NO, PL, RO, RU, SD, SE

Claims (15)

【特許請求の範囲】[Claims] １．パリトキシン、パリトキシンカルボン酸、ホモパリトキシン、ビスホモパリ トキシン、イソパリトキシン、ネオパリトキシン、デオキシパリトキシン、およ びそれらの天然に生じた共存アナログからなる群から選択される毒素のプロドラ ッグを、非毒性であり薬学的に受容可能な賦形剤との混合物中に活性成分として 包含する、所望でない細胞または組織をインビボで破壊するための薬学的組成物 。1. palytoxin, palytoxin carboxylic acid, homopalytoxin, bishomopalyx toxins, isopalytoxin, neopalytoxin, deoxypalytoxin, and and their naturally occurring coexisting analogues. as the active ingredient in a mixture with non-toxic, pharmaceutically acceptable excipients. Pharmaceutical compositions for destroying unwanted cells or tissues in vivo, including . ２．さらに前記毒素を前記プロドラッグから放出するのに有効な生物学的触媒を 有効量含有する、請求項１に記載の組成物。2. and a biological catalyst effective to release said toxin from said prodrug. The composition of claim 1, containing an effective amount. ３．前記生物学的触媒が標的特異的試薬に結合する、請求項２に記載の組成物。3. 3. The composition of claim 2, wherein the biological catalyst is coupled to a target-specific reagent. ４．前記標的特異的試薬が抗体またはその免疫学的反応フラグメントである、請 求項３に記載の組成物。4. The claim is that the target-specific reagent is an antibody or an immunologically reactive fragment thereof. The composition according to claim 3. ５．前記生物学的触媒が酵素である、請求項２に記載の組成物。5. 3. The composition of claim 2, wherein the biological catalyst is an enzyme. ６．前記酸素がベニシリンアミダーゼである、請求項５に記載の組成物。6. 6. The composition of claim 5, wherein the oxygen is benicillin amidase. ７．前記生物学的触媒が触媒抗体またはその機能フラグメントである、請求項２ に記載の組成物。7. 2. The biological catalyst is a catalytic antibody or a functional fragment thereof. The composition described in . ８．被験体の所望でない細胞または組織の機能を破壊または損傷する方法であっ て、このような処理が必要である該被験体に請求項１に記載の組成物の有効量を 投与する工程を包含する、方法。8. A method that destroys or damages undesired cell or tissue functions in a subject. administering an effective amount of the composition of claim 1 to the subject in need of such treatment. A method comprising the step of administering. ９．被験体の所望でない細胞または組織の機能を破壊または損傷する方法であっ て、このような処理が必要である該被験体に請求項２に記載の組成物の有効量を 投与する工程を包含する、方法。9. A method that destroys or damages undesired cell or tissue functions in a subject. administering an effective amount of the composition of claim 2 to the subject in need of such treatment. A method comprising the step of administering. １０．被験体の所望でない細胞または組織の機能を破壊または損傷する方法であ って、このような処理が必要である該被験体に、パリトキシン、パリトキシンカ ルボン酸、ホモバリトキシン、ビスホモパリトキシン、イソパリトキシン、ネオ パリトキシン、デオキシパリトキシン、およびそれらの天然に生じた共存アナロ グからなる群から選択される毒素を、そのプロドラッグから放出するのに有効な 生物学的触媒の複合体を包含する組成物を投与する工程、該生物学的触媒は該細 胞または組織と特異的に反応する標的化剤に結合し、該複合体を該細胞または組 織に戻し得る工程、および該被験体に該プロドラッグの有効量を投与する工程を 包含する、方法。10. A method that destroys or damages unwanted cell or tissue function in a subject. Therefore, the subject who requires such treatment is exposed to palytoxin, palytoxin Rubonic acid, homobalitoxin, bishomopalytoxin, isopalytoxin, neo Palytoxin, deoxypalytoxin, and their naturally occurring coexisting analogs effective to release a toxin selected from the group consisting of administering a composition comprising a complex of biological catalysts, wherein the biological catalyst is binds to a targeting agent that specifically reacts with the cell or tissue, and directs the complex to the cell or tissue. and administering to the subject an effective amount of the prodrug. Including, method. １１．前記生物学的触媒が酵素である、請求項１０に記載の方法。11. 11. The method of claim 10, wherein the biological catalyst is an enzyme. １２．前記生物学的触媒が触媒抗体またはその機能フラグメントである、請求項 １０に記載の方法。12. Claim wherein the biological catalyst is a catalytic antibody or a functional fragment thereof. 10. １３．パリトキシン、パリトキシンカルボン酸、ホモパリトキシン、ビスホモパ リトキシン、イソパリトキシン、ネオパリトキシン、デオキシパリトキシン、お よびそれらの天然に生じた共存アナログからなる群から選択される毒素のアミド ブロドラッグであり、ペニシリンアミダーゼで開裂可能なフェニルアセチルアミ ド、ヒドロキシフェニルアセチルアミド、フェノキシアセチルアミド、またはそ れらのヒドロキシフェノキシアセチルアミドである、アミドプロドラッグ。13. Palytoxin, palytoxin carboxylic acid, homopalytoxin, bishomopa litoxin, isopalytoxin, neopalytoxin, deoxypalytoxin, amide of a toxin selected from the group consisting of Phenylacetyl amide, which is a brodrug and can be cleaved by penicillin amidase Hydroxyphenylacetylamide, phenoxyacetylamide, or These hydroxyphenoxyacetylamide, amide prodrugs. １４．Ｎ−（４′−ヒドロキシフェニルアセチル）パリトキシンである、請求項 １３に記載のプロドラッグ。14. The claim is N-(4'-hydroxyphenylacetyl)palytoxin. 13. The prodrug according to 13. １５．Ｎ−（４′−ヒドロキシフェノキシアセチル）パリトキシンである、請求 項１３に記載のプロドラッグ。15. Claimed to be N-(4'-hydroxyphenoxyacetyl)palytoxin Prodrug according to item 13.