JPH06508114A - パリトキシン関連プロドラッグおよびその投与方法 - Google Patents
パリトキシン関連プロドラッグおよびその投与方法Info
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- JPH06508114A JPH06508114A JP4509678A JP50967892A JPH06508114A JP H06508114 A JPH06508114 A JP H06508114A JP 4509678 A JP4509678 A JP 4509678A JP 50967892 A JP50967892 A JP 50967892A JP H06508114 A JPH06508114 A JP H06508114A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
バリトキシン プロドラッグおよび
i旦段二方造
皮血豆!
本発明は、バットキシンのプロドラッグおよびそ17)関連化合物、並びにその
ようなプロドラッグを標的に同はテ放出すれる薬剤と共に投与することに関する
。この投与プロトコルでは、標的に同けて放出される薬剤が毒性薬物を局所的に
放出する媒介となり得る。
!量ユ亘
/llトンンは、江江旦」属の熱帯腔腸動物がら単離された、非常に毒性が高く
、非タンパク貫禄で、比較的低分子量の海洋天然生成物である。珊瑚のh江■n
toxicaの毒性は、まず、古代ハワイ人によって認識された。特殊な戦士た
ちは、戦いの前に、槍の穂先に珊瑚の滲出物を塗り付けるように指示された。近
代になって、この言伝えによって、ハワイ大学の研究者たちは、マウイ島のハナ
(Hana>の近くでhuユ赳圧■」を含む1連の潮溜りを再発見したのである
; Moore、R,E、ら、0ceanus (1982)25工i: 54
−63゜これらの潮溜りで収集された珊瑚から、高度に精製された毒素が197
1年に単離され、その化学構造がMoore、 R,E、ら、正−υL旦胞1−
兆瓜(1981)■13:2491によって、そして、別個にUeIIura、
D、ら、Tet上et (1981) 22:2781によって報告された。
後者は、より豊富な種であるh旦ユ因tubereulosaがら毒素を単離し
た。パット牛ジンカルボン酸、ホモパリトキシン、ビスホモパリトキシン、ネオ
バリト牛シン、およびデオ牛シバリド半シンを含む、さらなる毒素関連化合物も
また同定された(Wattenberg、 E、V、ら、江肛区」以(1989
) 49:5H7−5842、およびUemura、 D、ら、Tetrahe
dron (1985) 唾:1007−1(117)。図1にこれらの化合物
の構造を示す。追加的微量成分も、紐江珪且の種の中でしばしば検出されてきて
いる。
図1に示すように、パリトキシンは115位にアミ7基を有し、このアミン基が
カルボン酸で誘導されて、アシル化バリトキシン誘導体が得られ、この誘導体は
、天然のパリトキシンの100〜1000倍も細胞毒性が弱いことが示されてい
る(Wattenberg、EJ、ら、Cancer Res (19g9)
49:5837−5842、および0hizt+mi、Y、ら、 Pha ta
acol x 丁her (1980) lung:209−212) 。
このようなアシル化は、分析および構造解析研究に用いられる誘導体に限定され
てきた。Hirata、 Y、ら、h」ニアem (1979) 51:187
5−1883は、p−ニトロフェニルアセテートによってパリトキシンをアセチ
ル化して、N−アセチルパリトキシンを生成することを記載した。この化合物は
、Uemura、 D。
ら、シ■−しl (1980)il:4857−4860.MacFarlan
e、R,D、ら、Jm Chew Soc (1980) 辻■D:875−8
76、およびMoore、 R,E、、Pro ss ’n t e Chem
ist Or anic Natural oducts(1985) 48:
82−202によっても記載された。さらに、Moore、 R2E、ら、Lハ
」■1」匹(1980)庄ニア370−7372、および上述のMoore (
1985)は、N−(p−ブロモベンゾイル)パリトキシンを調製シ、N−(p
−ブロモベンゾイル)ビスホモパリトキシンf)KUemuraら(上述)によ
って調製された。Levine、 L、ら、二con (1988)’n■n:
015−1121は、ハリト牛シンノラシオイムノア・2セイに用いるための、
N−3−(4−ヒドロキシー3−+ 25 (−ヨードフェニル)プロビオニル
パリト手シンの調製をご2載しており、5achinvala、 N、D、ら、
未発表結果(1985)は、N−(4−(N−マレイミドメチル)シクロへ牛サ
ンー1−カルボ牛シル)パリトキシン、およびN−(3−(2−ビワジルジテオ
)プロピオニル)パリトキシンを、パリトキシンの免疫毒性およヒ免疫原の産生
における、タンパク質への接合のためのハプテンとして調製した。
インビトロのアッセイでは、上記のアミノ基のアシル化誘導体は、天然の分子よ
り毒性が弱いことが示された。0hizusi、 Y、、および5hibata
、 S、、J Pharmaco Ex The (1986>■虹H: 20
9−212は、単離されたモルモットの精管の収縮を誘発する活性が、パリトキ
シンより100倍もN−7セチルパリト牛ンが低いということを示した。Wat
tenberg、 E4−ら、h匹肛」且(1989) ii:5837−58
42は、N−(p−ブロモベンゾイル)パリトキシンおよびN−アセチルパリト
キシンが、3T3細胞に結合した表皮成長因子を低下させるように変えるのに、
少なくとも100倍効果が低いということ、そして、これらも天然のパリトキシ
ンより毒性が低いということを示した。EL−4マウスT−リンパ球を用いた、
追加的細胞毒性アッセイ(Hewetson、 J。
F、ら、u盈■」(1989) 皿:A1191)が、本発明者らによって示さ
れ、パリトキシンとN−アセチルパリトキシンとの間の毒性の差が500倍まで
とされた。Wattenbergら(上述)は、N−7シル化パリトキシンは実
際には非活性であり、残された細胞毒性は混入しているパリトキシンの影響によ
るものである、と述べている。
調製されたN−アシル化バリトキシン誘導体の中には、酵素的加水分解のための
基質として設計されたものはなかった。
活性の局所的生成をなし得る技術を利用するために、本発明の化合物は、生物学
的触媒による開裂を起こし易い形態で提供される。
標的に向けたプロドラッグ転化を得ようとする初期のアプローチでは、局所的細
胞内アミダーゼを用いて、アミドプロドラッグの加水分解を行うことが提案され
た。特に、シクロホスファミドは、特定の上皮腫瘍において高められると考えら
れていたホスファミダーゼによって活性化されるように設計された(Gomor
i、 G、、Proc SOCEX Biol Med (194B) 69:
407)。シクロホスファミドは、医療的に有用なものではあるが、その場での
開裂についての初期の理論は不正確であることがわかり、一般に、腫瘍細胞にお
いて、選択的にプロドラッグを変換する酵素を発見することが困難であった。さ
らに最近のアプローチでは、酵素抗体複合体を用いて、プロドラッグ加水分解酵
素を、選択的に標的組織に送達することに焦点が置かれてきた(Senter、
P、D、ら、PNAS (1988) 85+4842−4846; 5en
ter、P、D、ら、Cancer Res (1989)49:5789−5
792:Bagshawe、 K、D、、紅」」IK虹(1989) 60:2
75−281;米国特許第4.975.278号; Bagshave、に、D
、ら、 r J Cance (1988) 58ニア00−703; Ker
r、D、E、ら、Cancer Immunol Immuno土■工(199
0) 31:202−206: 1988年10月6日公開のPCT出願第WO
3810フ378号、 1989年2月8日公開のヨーロッパ特許第302.4
73号:および米国特許第4.975.278号。このアプローチに関する一般
論については、5enter、 P、D、ら、u上l」(1990) 4:18
8−193を参照のこと。
このアプローチによると、複合体の形の酵素を、固形膿瘍に対するモノクローナ
ル抗体を標的として、膿瘍部位でのみ活性化するプロドラッグを送達することに
よって、癌を治療するために、酵素/プロドラ・ノブの組合せが用いられる。プ
ロドラッグの投与は、酵素複合体が腫瘍の最適部分に位置し、正常な組織および
血漿を取り除くまで遅らされる。用いられた酵素/プロドラッグの組合せには、
アルカリホスファターゼ/エトポンドホスフェート(Senter P、D、ら
、PNAS (198g)85 :4842−4846)および細菌カルボキシ
ペプチダーゼG2/p−N−ビス−(2−クロロエチル)−アミノベンゾイルグ
ルタミン酸(Bagshawe、 K、D、ら、Br J Cancer (1
988) 58ニア0O−703)、およびペニシリンVアミダーゼ/ドキソル
ビシンアミド(Kerr、 D、 E。
ら、(1990)上述)が含まれる。
l豆旦笠丞
本発明は、上述のプロドラ・ノブ活性系において、ペニシリンアミダーゼによっ
て開裂可能であり、そのために毒素としテ有用な、パリトキシンの新規なアミド
および天然に生じたアナログを含む、パリトキシン関連化合物のプロドラッグを
提供する。これらのアミドは、フェニルアセチルアミド、ヒドロキシフェニルア
セチルアミド、フェノキシアセチルアミド、またはヒドロキシフェノキシアセチ
ルアミドでアル。パリトキシン類のプロドラ・ノブを用いることによって、標的
化剤が使用可能な細胞または組織のいずれかをも標的とした毒性が得られる。
上述のように、本発明は、ペニシリンアミダーゼ開裂可能なプロドラッグを参照
して説明されるが、本発明には、生物学的触媒で開裂可能なあらゆるパリトキシ
ンプロドラッグを用いる、化合物および方法が含まれる。
1つの局面においては、本発明は、パリトキシン、パリトキシンカルボン酸、ホ
モパリトキシン、ビスホモパリトキシン、イソパリトキシン、ネオパリトキシン
、デオキシパリトキシン、および天然に生じた共存アナログからなる群から選択
される、パリトキシン関連プロドラッグを含有する薬学的組成物に関し、所望で
ない細胞または組織の作用を、これらのプロドラッグを投与することによって破
壊または損傷する方法に関する。この方法は、典型的には、パリトキシン関連毒
素をプロドラッグから放出し得る、関連の標的に向けた生物学的触媒を投与する
ことを包含する、プロトフルによって行われる。
他の局面においては、本発明は、パリトキシンおよびそのアナログの特異的プロ
ドラッグに関する。フェニルアセチル誘導体、ヒドロ牛ジフェニルアセチル誘導
体、フェノキシアセチル誘導体、またはヒドロキシフェノキシアセチル誘導体を
含む、ペニシリンアミダーゼで開裂可能な形態のアミドプロドラッグが好ましい
。
図面の簡単な説明
図1は、パリトキシンおよびいくつかの天然に生じた共存アナログの構造を示す
。
図2は、ペニシリンアミダーゼの存在下における本発明のプロドラッグ形態およ
びパリトキシン形態の細胞毒性を示すグラフである。
図3は、ペニシリンアミダーゼの存在下におけるプロドラック、N−アセチルパ
リトキシンおよびパリトキシンの細胞毒性を示すグラフである。
Uを るための≦熊
本発明は、組織を標的とし得る特定の生物学的触媒によって開裂し得るプロドラ
ッグに変換された、パリトキシン関連の毒素に関する。本発明の組成物は、パリ
トキシンおよびそのアナログの顕著な毒性、ならびにこれらトキシンの官能基が
誘導体化してプロドラッグ形態が得られることを利用する。
パリトキシンおよびそのアナログは天然源から単離され、パリトキシンは現在で
は市販されている。最近、64個のキラル炭素および従って1021個の可能な
異性体を含む、パリトキシンカルボン酸の全ての合成が報告されている( Ar
mstrong。
R,W、ら、J Am Chew Soc (1989) 1117525−7
530)。ノくリドキシンの化学、毒物学および薬理学についての総説が、Ha
berman、 E、、Toxicon (1989) u」且:1171−1
187およびHirata、 Y、ら、Handbook of Natura
l Toxins、第3巻、11章、ノ寸1ノドキシンの化学および薬理学、T
u、 A、T、編(198g) Marcel Dekker、Inc、、 N
ew York、 37−45頁により公表されて(Xる。)ぐリドキシンおよ
びそのアナログ、ホモノ(リドキシン、ビスホモノ< パリトキシン、ネオパリ
トキシン、デオキシ、パリトキシン、イソ示す。ハ江止n種に共存する天然に生
じたアナログ力fさら(二発見されることもあり得る。従って、本明細書で(ま
、](1ノドキシン「およびその天然に生じた共存アナログ」の上述の形態は、
上述の化合物自体、および上述のアナログと共(こ、ム打■慕種に生じる同様の
構造の関連する任意の化合物を指す。
パリトキシンはきわめて毒性であり、0.025−0.45μg/kgの範囲で
の24時間静脈投与量でのLDssを有し、これ(よ種ζこ依存する。筋肉内、
皮下および腹腔的注射による投与で(ま毒性it低く、胃内投与では静脈投与よ
り少なくとも200倍効果力(低(X0バIJ )キシンの投与量が多いと、投
与力)ら数分以内で死1こ至る。また、パリトキシンは既知の最も強力な血管収
縮薬の1つであり、アンジオテンシン−11より約100倍効力カ5強(1゜イ
ンビボにおいて示される効力には、シコ・ツクおよび***を伴う腎不全、壊死
を起こす脈管炎および虚血を伴う全身性のまれる。また、マウス皮膚モデルでは
腫瘍プロモーターであることが報告されている(Fujiki、 H,ら、「膿
瘍プロモーターの新しいクラス:テレオシジン、アプリシアトキシン(aply
siatoxin)およびパリトキシン」江■凪よ、堕よ、お工、□1Envi
ronmental Tumor Promotors Fujiki、H,ら
編、JapaneseScientific 5ociety Press、
Tokyo/VNU 5cience Press、 Utrecht (19
84)、37−45頁; Fujiki、Fl、ら、Carcfno enes
is (1986) 7407)。毒性のインビトロにおける実験では、パリト
キシンの効力としては、細胞膜における一価陽イオン孔形成、興奮性膜の脱分極
、平滑筋収縮、心筋収縮、赤血球溶血、ノルエピネフリン放出およびヒスタミン
放出、刺激アラ牛トン酸代謝、骨吸収、血小板凝集およびEGF受容体転形が含
まれる。
パリトキシンおよびそのアナログは触媒介在の放出システムにおけるプロドラッ
グとして使用するのに特に適している。
例えば、これらは酵素の非存在下で安定するアミドを形成し得、また、本発明の
プロドラッグは内因性酵素によっては開裂し得ない。トキシンの分子量は比較的
低いため、分散による腫瘍への浸透は比較的容易であり、またプロドラッグ形態
は毒性形態よりはるかに効力が低い。これら薬物の毒性形態は効力が極めて高い
。
パリトキシンは、腫瘍の通常に隣接し、た位置で生成されると、はとんどの細胞
の表面のNa、 K−ATPaseに対して高い親和性を有するため(Bott
inger、 Fl、ら、Btochim Bio h s Acta(198
6) 861:165−176)、毒素は標的化剤のためのマーカーが存在する
かどうかに関わらずすべての膿瘍細胞を結合するようである。さらに、パリトキ
シンの強力な血管収縮活性により、腫瘍組織を通して薬物が効果的に分布するの
を妨げる対流力が低減するのが期待される。
本発明のパリトキシンプロドラッグは、適切な生物学的触媒の存在下で効果的な
パリトキシンへと開裂され得るように設計される。「生物学的触媒」とは、反応
速度への影響に関して、酵素と類似した振舞いをする生体系と適合性のある分子
を意味する。最も一般的に使用される生物学的触媒は酵素である。しかし、抗体
およびRNAのような他の適合性のある分子が触媒活性を示すことが見い出され
ている。これらの他の形態もまた本発明の方法で有用な触媒の範囲に含まれる。
本発明の例示的な実施態様は、哺乳類の組織で生じることが知られていない酵素
であるペニシリンアミダーゼによって開裂され易い新規のパリトキシンアミダー
ゼを含み、これにより、ペニシリンアミダーゼが処理される被験体内の特定の位
置を標的とする標的化プロトコルで、これらのプロドラッグが有用となる。
ペニシリンアミダーゼ(ペニシリンアミドヒドロラーゼ、EC3,5,1,11
)は、ペニシリン−Gおよびペニシリン−■から6−アミツベニシラン酸を産生
ずるために商業的に使用される86kdの微生物酵素である(Lindsay、
C,D、ら、Eur J Biochem(1990) ljl:133−1
41)。この酵素はインビトロにおけるドキソルビシンのアミドプロドラッグ誘
導体を活性化するために使用されている( Kerr、 D、 E、、Canc
er Immunol Immunothe(1990) 31:202−20
6; 5enter、 P、D、、FASEB J (1990) 4:1!1
8−193)。この酵素のモノクローナル抗体への連結はKerr、 D、E、
ら(上述)により記載されており、本明細書において参考として援用されている
。簡単に述べれば、抗体は、2−イミノチオラン塩酸塩による誘導体化によって
スルフヒドリル基が与えられ、そしてリンカ−のスクシンイミジル4−(N−マ
レイミドメチル)シクロへ牛サンー1−カルボキシレート(SMCC)により誘
導体化され、反応性マレイミド基を有する酵素を提供するアミダーゼに、標準的
な連結技術を用いて結合させる。ペニシリンアミダーゼの任意の適切な標的化剤
との複合体は本明細書に示す治療方法において有用である。
パリトキシン関連プロドラッグを対応する毒素に変換するための開裂薬剤として
適切な他の生物学的触媒には、誘導体化されるとき毒性活性を失うパリトキシン
の誘導体形態に対して適切であるものが含まれる。候補となる酵素は、例えば上
述のPCT出願第WO38107378号に示されている。
プロドラッグのA
パリトキシンは、Moore、 R,E、および5heuer、 P、J、、5
cienCe (1971) 172:495−498の方法によってh江旦用
tuberculos盈から単離される。純度は標準的な分析方法を用いて確認
され得る。特に、単離された薬物は、40%アセトニトリル/ 0.05N酢酸
、1 m17分で、263 r+a+でのUV吸光度による検出を行うZ。
rbax ODSカラム(4,6x 25On+m)、もしくは10:1の0.
02Nリン酸緩衝液、pH4,6:エタノール、1 !11/分、263 nm
のShowdex 0Hpak B804カラム(8X 500 mm)を使用
して、HPLCにおける単一ピークとして移動すべきである。
アンル化バリトキシンは標準的なアシル化方法を使用して合成される。これらに
は、アシルハロゲン化物のような関連するカルボン酸の活性化形態の使用、また
は、ジイミド試薬、例えば、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチル
カルボジイミド(EDCI)のような凝縮剤の使用が含まれる。ペニシリンアミ
ダーゼが生物学的触媒として使用される場合は、アシル化反応におけるカルボン
酸の相手は、得られるアミドがこの酵素により開裂し易くなるように選択され、
通常は、フェニル酢酸、ヒドロキシフェニル酢酸、フェノ牛シ酢酸、およびヒド
ロキシフェノキシ酢酸よりなる群から選択される。
典型的な調製では、不活性で極性の非プロトン性溶媒中のカルボン酸は、N−ヒ
ドロキシスクシンイミドおよびEDCIとの反応によって活性化ヒドロキシスク
シンイミドエステルに変換される。次に、10倍過剰のNHS活性エステルを使
用して、非水性の穏やかな塩基性溶媒中でパリトキシンを処理する。生成物アミ
ドを標準的な方法を使用して回収し、そしてクロマトグラフィーによって精製す
る。陽イオン交換クロマトグラフィーが特に好適である。
他の生物学的触媒の作用によって可逆性のある非活性化となるN−末端アミ7基
または他のパリトキシンの官能性に対する他の誘導体は、選択された触媒に感応
する適切な置換基を選択する必要がある。
アシルアミドまたは他の誘導体の調製は他にも様々な標準的な方法が使用され得
る。得られるアミドは、上述のバリト牛シン単離体の純度の基準として示される
HPLC方法を使用して非反応性パリトキシンがら、または薄層クロマトグラフ
ィーによって分離され得る。分析方法として行われるこれらの方法はまた、プロ
ドラッグの酵素による加水分解を評価するために使用され得る。
精製および単離されたプロドラッグは、望ましくない細胞または組織を傷つける
または破壊するように設計された治療法において被験体に投与するための組成物
に処方するのに連木発明のプロドラッグは、一般的に、プロドラッグ自体を投与
する前の、標的化剤−プロドラッグ開裂触媒複合体の予備的な投与を用いるプロ
トコルで投与するために設計される。
本複合体は、標的組織、典型的には腫瘍、においてマーカーと反応するように特
に設計された標的化剤を含む。最も典型的には、標的化剤は、完全な免疫グロブ
リンの免疫反応性を保有する抗体、またはその、Fab、 Fab”、もしくは
F(ab’)2フラクメントなどの、免疫学的に反応するフラグメントである。
膿瘍を標的する抗体の性質に関する議論は、上記に引用した第W08g1073
78号およびヨーロッパ特許第302473号の出願書類に見られる。しかし、
標的組織上のレセプター部位または他の表面タンパク質に結合するように設計さ
れたリガンドの使用などの、他の標的化戦略もまた用いられ得る。種々の糖タン
パク質、炭水化物、および他のリガンドが当該分野で周知であり、適切な標的化
剤の選択は、破壊される細胞または組織の性質に依存する。一般には腫瘍組織が
破壊の候補であるが、上述したように、この戦略は、ウィルス感染細胞、種々の
良性増殖、炎症部位、血管組織の閉塞などの、他の望ましくない細胞および組織
に拡大され得る。これらの細胞および組織に適切な標識化剤は、当業者に理解さ
れる。
連結された生物学的触媒は、典型的には、アミダーゼなどの通常の酵素であるが
、触媒性抗体またはそれらの機能フラグメントもしくは核酸などの他の形態もま
た、用いられ得る。
本発明のプロドラッグは、通常の投与様式を用いて、選択された様式に適切な処
方で投与される。そのような処方は、例えば、肚畦旺匡n’s Pharmac
旦旦」二と」皿=(最新版)、Mack Publishing Co、、Ea
ston、 PAに見られる。本発明のプロドラッグは、ハンクス液またはリン
ゲル液などの種々の担体を用いて注射され得、そして静脈内、腹腔内、筋肉内、
または皮下に、治療する特別な適応症の指示に従って注射され得る。このプロド
ラッグはまた、注射用のリポソームまたはマイクロカプセル中に処方され得る。
さらに、このプロドラッグは、徐放性処方で移植物として処方され得るか、また
は、皮膚パンチ剤、鼻内噴霧剤、坐剤などの経皮もしくは経粘膜用処方で投与さ
れ得る。胆汁酸塩、フシデート、界面活性剤などの浸透剤を用いる適切な処方が
、当該分野で公知である。
錠剤、カプセル剤、粉剤、シロップ剤などとしての経口投与もまた、考えられて
いる。局所的治療が望ましい、ある種の適応症では、ペースト剤、軟膏剤、ゲル
剤、またはパップ剤の形態の局所治療もまた、用いられ得る。
典型的なプロトコルでは、プロドラッグの開裂に有効な生物学的触媒に連結され
た標的化剤が、全身投与されて標的組織に向かうための任意の適切な経路(上述
した経路に類似する)によって、最初に投与される。この場合はまた、局所的治
療が可能であれば、腫瘍もしくは他の標的中に直接注射するか、または局所治療
によって、これが成し遂げられ得る。
全身投与が用いられるときは、全く正常な組織および血漿に標的化剤/触媒を共
役させて、標的細胞または組織に向かうために十分な時間がかけられる。標的化
剤/触媒の連結が免疫原性であれば、免疫毒素の投与の場合にしばしば見られる
ように、/クロスポリンなどの免疫抑制剤の使用によって、この副作用が改善さ
れ得る。
特定の被験体および適応症のために投与量レベルおよびプロトコールが設計され
、一般に医学および獣医学の専門家によって実施される。投与量レベルは、苦痛
の重篤度およびその性質とともに、投与様式に依存する。しかしながら、プロド
ラッグの投与量レベルは、0.1−50(lμg/kg、好ましくは1−50μ
g/kgのプロドラッグの範囲で全身投与のほとんどの場合に投与されることが
期待される。より低いレベルは、局所的治療で用いられ得る。
以下の実施例は例証を意図し、本発明を限定するものではない。
K施1−」
Lff−ヒドロキシフェニルアセチルパリトキシン正己ジ」泊五
図1に示す、115位のアミ7基のアシル化を以下のように行う。4−ヒドロキ
シフェニル酢酸(107mg、 700 μmol)のTHF (7m l)溶
液に、アルゴン雰囲気下、室温で、N−ヒドロキシスクシンイミド(81mg、
700μmol)およびN、N−ジシクロへキシルカルボジイミド(144m
g、700μmol)を加えた。1時間攪拌した後、析出したジシクロへキシル
ウレアを沈澱させた。シリンジを用いて、70μHD上清(理論的1: 4−H
PAcOH(D N)Is活性エステル(70μmol)を含有する)を乾燥ピ
リジン(0,5m1)中のバリトキシン(2,0mg、0.7μmol)を含有
する第2のバイアルに移した。室温で1.5時間後、TLC(E、 Merck
製、NH2F2saでプレコートしたHPTLC215647、ピリジン−水−
n−ペンタノール(9:8:6);E、 Merck製、シリカゲル60 F2
54でプレコードシたHPTLC$13727、ピリジン−水−〇−ペンタノー
ル(7:6:7))は、バリトキシンの完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸
発させた。得られた残留物を水(2ml)に溶解し、CH2Cl2で洗浄した(
3m1ml)。次に水層部分を凍結乾燥し、生成物を陽イオン交換クロマトグラ
フィー(CM−セファデックスc−25,0,02Mリン酸緩衝液、pH4,5
)により精製した。NHPAPの収率は、UV分光法により、バリトキシンに関
して報告されている263nmにおける吸光係数23、600を用いて、0.8
7mg(41%)と推定された。
NHPAPは少なくとも6力月間の保存において安定であり、ペニシリンアミダ
ーゼによって開裂され得る。
図1に示す115位のアミ7基をp−ヒドロ牛ジフェノ牛シ酢酸(N)IPOA
P)を用いて以下のようにアシル化する。室温テア ルゴン雰囲気下、(4−ヒ
ドロキシフェノキシ)酢酸(1113mg、 700μmol)のTHF (7
ml)溶液に、N−ヒドロキシスクシンイミド(81mg、 700t1mol
)およびN、N−ジシクロへキシルカルボジイミド(144mg、IQOμmo
l)を添加する。1時間撹拌シタ後、析出したジシクロへキシルウレアを沈澱さ
せる。シリンジを用いて、70μmの上清(理論的には(4−ヒドロキシフェノ
キシ)酢酸のNH8活性エステルを7.0μmol含有している)を、乾燥ビリ
ジ7 (0,5m1)中バリトキシン (2,0Il1g、 0.7μmol)
を含有する第2のバイアルに移す。反応液をTLC(E、 Merck製、Nl
2 F25mでブレフートした[(PTLC815647、ピリジン−水−n−
ペンタノール(9:8:6) : E、 Merck製、シリカゲル60 F2
54でプレコートしたHPTLC1t13727、ピリジン−水−n−ペンタノ
ール(7:6:7))によりモニターする。バリトキシンを完全に消耗した後、
溶媒を減圧下でエバポレートする。得られた残留物を水(2ml)中に溶解し、
CH2Cl2で洗浄する(3X1ml)。水層部分を凍結乾燥した後、生成物を
陽イオン交換クロマトグラフィー(CM−七ファデックスC−25,0,02M
リン酸緩衝液、pH4,5)により精製する。収率を、報告されている263n
mでのパリトキシンの吸光係数23.600を用いてUV分光法により推定する
。
実」1匹」−
ニエΣム?y工三ヱlユj重
クロマトグラフィー の 。
パリトキシンおよびパリトキシンプロドラッグを、シリカゲル60 F254
(EMサイエンス)薄層クロマトグラフィープレート上で、ピリジン:水ニアミ
ルアルコールの7:6:7混合物を用いて分離する。このシステムでは、パリト
キシンはR+;0.51で移動し、一方N−(4−ヒドロキシフェニルアセチル
)パリトキシンはRt=0.69で移動する。化合物はUV光(254no+)
により、またはプレートをp−アニスアルデヒド試薬(使用書#22、「薄層お
よび気相クロマトグラフィー用着色試薬」、E、 Merck、 Darmst
adt、 Ger+aanys 1980)を用いて処理することにより目で見
えるようにする。
支皿史1
■シム滞11化
EL−4−マウスのT細胞リンパ腫系(ATCCTlB59)をDMEM捕捉し
た(フロー)培地中で10%の仔牛血清、1mMのし一グルタミンおよび2mM
のピルビン酸ナトリウムで培養した。細胞を採取し、10%(V/V)仔牛血清
、1mMのし一グルタミンおよび2mMのピルビン酸ナトリウムで捕捉した、ロ
イシンを有さない最少必須培地中で懸濁し、無菌の96−ウェルコスタ−マイク
ロタイタープレート中で105細胞/ウエルでプレートした。各ウェルを、全容
量0.15m1中L coliから調製した0、 3μg/mlから33μge
m lのペニシリン−〇アミダーゼ(PGA)の存在下または非存在下で、あら
かじめ定められた濃度のNHPAPまたはパリトキシンにさらした。アッセイに
用いたPGAの比活性は47ユニツト/mgであった。
18時間のインキュベーション後、生存力を決定するためにウェルヲ0.05μ
Ciの[14C]−標識されたロイシンで2時間処理した。生存力のある細胞は
[Ijc]−ロイシンを細胞タンパク質中に導入し得た。次にウェルをガラスフ
ァイバーフィルターの上に採取し、液体シンチレーション計数のために処理した
。
テストウェル中の生存率を複製未処理フントロールxlooの平均cpmで除算
した複製ウェルから得た平均Cplとして計算した。
酵素のみで処理し、薬剤またはプロドラッグで処理しなかったコントロールは未
処理のコントロールに匹敵するcpsを示した。
結果を、PGAの濃度を様々に変えたNHPAP (四角)またはパリトキシン
(丸)(ピコグラム/+1)に対する生存率%をプロットで表わして図2に示す
。図に示すように、酵素を添加しない場合、生存率を下げずにF1当りLo、0
00pg/mlを越えるNHPAPを添加し得る;パリトキシンのみを添加する
と10pg/+*lでのコントロールの生存率が20%減少した。しかし、PG
Aが3.3μg/ra Iはどに少ない場合、NHPAPを含有するNHPAP
処理された培養物はパリトキシンのみを用いて得られたものと同様の用量作用曲
線を示した。酵素の存在下でパリトキシンを用いて得られた曲線には影響がなか
った。
同様の実験において、EL−4マウスのT−リンパ腫細胞(5xlO1細胞/ウ
エル)を、指定濃度のパリトキシン(PTX) 、N−アセチルパリトキシン(
NACPTX) 、またはN−(4−ヒドロキシフェノキシアセチル)パリトキ
シン(NHPAP )に、PGAを用いてまたは用いずに、2時間、全容量0.
1mlの10%の仔牛血清(MEM)を含有するロイシンを有さないMEM中に
さらした。PGAを3.3μg/++ 1のペニシリンGアミダーゼとして供給
した。次に0.05μCi[14C]−ロロインを容10.05a+lのMEM
中に添加し、混合物をさらに2時間インキュベートした。次に細胞をガラスファ
イバーフィルターの上に採取し、液体シンチレーション計数のため処理した。生
存力のある細胞は[+4c]−ロイシンを細胞タンパク質中に導入した。
結果を図3に示す。図からNHPAP毒性がPGAの存在下で著しく増加してい
ること; PTXがPGAの有無に関わらず毒性であり、NACPTXの毒性は
PGAの存在下で増加しないことがわかる。
〒 〒
烏旬重%
4tIIliR+1(pg/mL)
Fig、 3
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IT、LU、MC,NL、SE)、0A(BF
、BJ、CF、CG、CI、CM、GA、GN、ML、MR,SN、TD、TG
)、AT、 AU、 BB、 BG、 BR,CA、 CH,C3,DE。
DK、 ES、 FI、 GB、 HU、JP、 KP、 KR,LK、 LU
、 MG、 MN、 MW、 NL、 NO,PL、RO、RU、SD、SE
Claims (15)
- 1.パリトキシン、パリトキシンカルボン酸、ホモパリトキシン、ビスホモパリ トキシン、イソパリトキシン、ネオパリトキシン、デオキシパリトキシン、およ びそれらの天然に生じた共存アナログからなる群から選択される毒素のプロドラ ッグを、非毒性であり薬学的に受容可能な賦形剤との混合物中に活性成分として 包含する、所望でない細胞または組織をインビボで破壊するための薬学的組成物 。
- 2.さらに前記毒素を前記プロドラッグから放出するのに有効な生物学的触媒を 有効量含有する、請求項1に記載の組成物。
- 3.前記生物学的触媒が標的特異的試薬に結合する、請求項2に記載の組成物。
- 4.前記標的特異的試薬が抗体またはその免疫学的反応フラグメントである、請 求項3に記載の組成物。
- 5.前記生物学的触媒が酵素である、請求項2に記載の組成物。
- 6.前記酸素がベニシリンアミダーゼである、請求項5に記載の組成物。
- 7.前記生物学的触媒が触媒抗体またはその機能フラグメントである、請求項2 に記載の組成物。
- 8.被験体の所望でない細胞または組織の機能を破壊または損傷する方法であっ て、このような処理が必要である該被験体に請求項1に記載の組成物の有効量を 投与する工程を包含する、方法。
- 9.被験体の所望でない細胞または組織の機能を破壊または損傷する方法であっ て、このような処理が必要である該被験体に請求項2に記載の組成物の有効量を 投与する工程を包含する、方法。
- 10.被験体の所望でない細胞または組織の機能を破壊または損傷する方法であ って、このような処理が必要である該被験体に、パリトキシン、パリトキシンカ ルボン酸、ホモバリトキシン、ビスホモパリトキシン、イソパリトキシン、ネオ パリトキシン、デオキシパリトキシン、およびそれらの天然に生じた共存アナロ グからなる群から選択される毒素を、そのプロドラッグから放出するのに有効な 生物学的触媒の複合体を包含する組成物を投与する工程、該生物学的触媒は該細 胞または組織と特異的に反応する標的化剤に結合し、該複合体を該細胞または組 織に戻し得る工程、および該被験体に該プロドラッグの有効量を投与する工程を 包含する、方法。
- 11.前記生物学的触媒が酵素である、請求項10に記載の方法。
- 12.前記生物学的触媒が触媒抗体またはその機能フラグメントである、請求項 10に記載の方法。
- 13.パリトキシン、パリトキシンカルボン酸、ホモパリトキシン、ビスホモパ リトキシン、イソパリトキシン、ネオパリトキシン、デオキシパリトキシン、お よびそれらの天然に生じた共存アナログからなる群から選択される毒素のアミド ブロドラッグであり、ペニシリンアミダーゼで開裂可能なフェニルアセチルアミ ド、ヒドロキシフェニルアセチルアミド、フェノキシアセチルアミド、またはそ れらのヒドロキシフェノキシアセチルアミドである、アミドプロドラッグ。
- 14.N−(4′−ヒドロキシフェニルアセチル)パリトキシンである、請求項 13に記載のプロドラッグ。
- 15.N−(4′−ヒドロキシフェノキシアセチル)パリトキシンである、請求 項13に記載のプロドラッグ。
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---|---|---|---|
US66974591A | 1991-03-15 | 1991-03-15 | |
US669,745 | 1991-03-15 | ||
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---|---|
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-
1992
- 1992-03-10 AU AU17623/92A patent/AU1762392A/en not_active Abandoned
- 1992-03-10 WO PCT/US1992/001958 patent/WO1992016203A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-03-10 EP EP19920910620 patent/EP0575556A4/en not_active Withdrawn
- 1992-03-10 JP JP4509678A patent/JPH06508114A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
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