JPH06505880A - 農薬を測定するためのキットおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ！藁を測定するためのキットおよび方法従来技術 多くの種類の生物（節足動物、鳥類、哺乳動物）が農薬に対して感受性をもつ。

農薬とは一般に除草剤、殺菌剤および殺虫剤に分類される。農薬は生物の神経系 並びに酵素系に作用する。このような毒物は神経細胞上に位置する結合体（イオ ンチャンネル）またはその周囲に位！する酵素やその他に結合する。農薬はまた 、種々の保護機構、例えば分解酵素や非特異的結合体に作用する。

農業における害虫コントロールと人間の備康のため、殺虫剤が開発された初期（ １９４０年代）以来、殺虫剤の標的は一般に昆虫の脳および神経系であった。

作用部位として昆虫の脳を標的とする殺虫剤は通常迅速な作用を示し、低い投与 量で良好なコントロールができる。

１９７０年代の初めから、！！薬の作用形態を研究するのにｉｎ　ｖｉｔｒｏの 脳調製物を用いる試みがなされてきた。農薬をモニターするのにこの方法を用い る研究に関しては限られた報告があるのみである。従来のガスクロマトグラフィ ー　（ＧＣ）またはマススペクトルと比較して安定性および感度に欠けることが これらの初期の試みを無用のものにしてきた。脳調製物の活性をモニターするた めに色素反応を用いると、高濃度の酵素と基質を必要とし、結果は感度に劣る。

用いる酵素を手間をかけて精製した結果、非常に限られた農薬のスペクトルだけ が検出できることが明らかとなった。明らかに、材料と精！！Ｊ：Ｊ調製物の感 度は限られており、少数の！！薬にのみ用いられるので、このためモニターおよ び検出アッセイとしては不適当なものであった。

最近になって、ごく微量物質の検出に生物発光または化学発光が用いらるように なった。これらのシグナルを用いるアッセイはＡＴＰ’ＰＮＡＤＨなどの基質、 およびアルカリホスファターゼなどの酵素を測定するために開発された。アッセ イ系として生物発光を用いる利点は、反応の感度と反応を測定することのできる 速膚にある。例えば、酵素ルシフェラーゼを用いる生物発光反応は、ルシフェリ ンとＡＴＰとの反応を触媒して数ミリ秒のうちに光を生じる。

儂康や安全の目的で土壌や水などの各種物質中の！！薬の濃度を試験することが 望まれている。特に、５０ｐｐｂ以下、さらには５ｐｐｂといった低いレベルの 有機リン酸塩およびカルバミン酸塩の濃度を測定するための有効な試験キットお よび方法を提供することが望まれている。特定の有機リン酸塩殺虫剤は抗体を用 いて試験することができるかも知れないが、広範なスペクトルをスクリーニング する方法としては限界がある。除草剤は色原性酵素に基づく試験方法による特定 の基について試験することができるが、これらの試験は低濃度では正確な結果を 与えず、また色の解釈に疑問がある。

したがって、有機リン酸塩やカルバミン酸塩のような農薬を測定するための新規 で正確、かつ有効な試験キットおよび方法が望まれている。

発明の概要 本発明は農薬を測定するための試験キットおよび方法に関する。とりわけ、本発 明は５０ｐｐｂ以下のレベルの有機リン酸塩およびカルバミン酸塩型の農薬を測 定するための化学発光または生物発光による試験方法および試験キットに関する 。

本発明の試験キットおよび方法は迅速に、一般には１０から１５分で実施でき、 ５ｏｐｐｂもしくはそれ以下と感度がよく、水、土壌、食物（例えば、食肉、魚 、果物および野菜）やその他の物質中の有機リン酸塩およびカルバミン酸塩農薬 を複数検出するための方法として開発された。この試験方法は、受容体または酵 素と、農薬と相互作用する部位、特に有機リン酸塩およびカルバミン酸塩農薬と 作用または相互作用する部位との混合物を含む昆虫の脳調製物を用いる。農業は 昆虫の脳調製物の脳活性に変化を与え、あるいは有意な低下をもたらし、この低 下が逆に試験サンプル中に存在する農薬の量と関連する。昆虫の脳調製物にさら したときに化学的に、および／または物理的に変化するトレーサー類似体または 基質を用いて活性を測定し、変化を発光反応によってモニターする。活性は酵素 反応におけるように化学的であるか、あるいは受容体の結合におけるように物理 的でありうる。

例えば、酵素反応における１態様においては、脳調製物によるルシフェリン誘導 体のルシフェリンへの加水分解は有機リン酸塩およびカルバミン酸塩に極めて感 受性であることが明らかとなった。この反応によって放出されるルシフェリンは 酵素ルシフェラーゼとエネルギー供与体であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に よって酸化され、生物発光または化学発光として測定される光を発する。放出さ れた生物発光または化学発光は、ルミノメータ−またはシンチレーシランカウン ターによって低レベルでも高速で測定およびモニターされる。このアッセイは試 験サンプルと脳調製物を短時間、例えば２−１０分間インキュベージランする、 ルシフェリン誘導体などの基質トレーサーまたは農薬類似体トレーサーを添加し てさらに例えば２−５分間インキュベーションする：そして直接または分離工程 の後、酵素による活性化（ルシフェリン−ルシフェラーゼ）によって発光する液 体分画を得て測定する、という３つの簡単な工程によって実施する。一般的なア ッセイ法を表１に記載する。

か（して、昆虫の脳調製物に感受性の農薬、特に有機リン酸塩およびカルバミン 酸塩！Ｉａを盤するための試験方法が発見された。この試験方法は、試験サンプ ルと昆虫の脳調製物との混合物をインキュベートし：このインキュベート混合物 に、農薬の存在下でその加水分解が阻害される新規化合物である酢酸Ｄルシフェ リンのような（しかし、これに限定されるものではない）Ｄルシフェリン誘導体 を加え：試験サンプル、脳調製物およびＤルシフェリン誘導体の混合物をインキ ュベートしてルシフェリンを放出させ：インキユベートしたＤルシフェリン誘導 体含有混合物の一部を反応混合物としてのＡＴＰおよびルシフェラーゼと混合し て酸化ルシフェリン（オキジルシフェリン）と発光とを生じさせ：この発光を例 えばルミノメータ−で測定し；そして標準品または対照サンプルから生じた測定 発光と比較することによって、試験サンプル中の農薬の濃度を決定することから なる。

本発明の農薬測定用試験キットは、！ｊ４藁に感受性の昆虫の脳調製物、例えば ハチの脳のホモジエネート、酢酸Ｄルシフェリンのような農薬の存在下で加水分 解が阻害されるＤルシフェリン誘導体と：インキユベートした試験サンプル、脳 調型物およびＤルシフェリン誘導体に添加したときに反応混合物を生成するため の酵素ルシフェラーゼおよびＡＴＰの組み合わせからなる。試験キットは試験を 実施し、含まれる結果を測定するために必要な緩衝液（しかし、これに限定され るものではない）：インキュベーション周囲またはプレートおよびインキュベー ジラン槽など；緩衝液；生じた発光を測定するためのルミノメータ−；農薬濃度 を比較し測定するための発光量対農薬濃度を示す標準対照チャートまたはグラフ ：およびクロマトグラフ用カラムなどの分離装置またはインキュベートした混合 物の液体分画を得るための限外濾過膜のような標準的実験器具および化学物質を 含ん、特に節足動物、例えばハチ、甲虫、アブラムシ、力、カイコ、ダニ、ハエ およびイエバエ（Ｍｕｓｃａ　ｄｏｍｅ＋５ｔｉｃａ）（Ｌかし、これに限定さ れるものではない）のホモジエネートを単独あるいは組み合わせて用いることが できる。

各種の材料から得た脳調製物は！Ｉｓに対する特異性が異なる。したがって、モ ニターする目的で用いるには広範囲の農薬スペクトルと反応する１またはそれ以 上の脳調製物を得ることが重要である。農薬の標的となる昆虫が脳調製物の最適 の材料の１つである。昆虫ごとに特異性と感受性が異なる。ハチは各種の農薬に 対する感受性が知られているので、好ましい選択である。ハチの脳調製物は従来 報告されている全てのアッセイ系よりも生物発光アッセイにおいて約２から４対 数倍（２ｔｏ　４　１ｏｇｓ）感受性があることが見いだされた。

農薬の試験方法に用いるのに適した新規なりルシフェリン誘導体は、６−アセチ ルＤルシフェリンまたはその同族体としての新規化合物である酢酸ルシフェリン からなる。好適なルシフェリン誘導体はこれらの６−置換Ｄルシフェリン化合物 であって、この化合物は昆虫の脳調製物の存在下で反応してＤルシフェリン誘導 体の６−位にある置換エステルを開裂してＤルシフェリンを生成し、これがざら にＡＴＰおよびルシフェラーゼと反応して発光を生じ、この発光を測定する。

ルシフェラーゼ誘導体である６−アセチルＤルシフェリンはＤルシフェリンを過 剰のアセチルイミダゾールと水性溶媒溶液などの溶液中で反応させて、温和な条 件下で約１００％の効率でＤルシフェリンをアセチル化して６．アセチルＤルシ フェリンを生成することにより製造できる。

リン酸塩およびカルバミン酸塩農薬はいずれも、昆虫の脳調製物によるＤアセチ ルルシフェリンの加水分解を阻害することが見いだされた。試験方法における基 質として酢酸Ｄルシフェリンのようなりルシフェリン誘導体を使用することには 大きな利点がある。ハチまたはカイコの脳調製物には酢酸Ｄルシフェリンに対す る例外的かつ予期せぬ高い特異性があり、アッセイには非常に少量の酢酸Ｄルシ フェリンを要するのみである。例えば、インキュベーション混合物中の酢酸Ｄル シフェリンの濃度は１　ｘ　１０”モルまたはそれ以下であり、ルシフェリンの アッセイ感度は１から５　ｘ　１０−”モルである。アッセイ時間は全部で約１ ０分である。本発明の試験方法に用いるには酢酸Ｄルシフェリンが好ましいＤル シフェリン誘導体であることが判明したが、同様な反応をするその他のＤルシフ ェリン誘導体も使用できる。Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙの「生物 発光増強化酵素免疫アッセイ−酵素免疫アッセイのための新規超高感度検出系に 使用するルシフェリン誘導体の合成および特徴」と題する文献（夏１ｓｋａ　ｅ ｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

Ｃｈｅｗ、　Ｃ１１ｎ、　ＢｉｏｃｈｅＬ２５（１）　１９８７．　ｐｐ、　２ ｌ−３０）に記載されたルシフェリン誘導体は本発明の方法には適しておらず、 これらには特にＤ−ルシフェリンメチルエステル、Ｄ−ルシフェリンーし一フェ ニルアラニン、Ｄ−ルシフエリルーＬ−Ｎａ−アルギニン、Ｄ−ルシフェリン− 〇−サルフェートおよびＤ−ルシフェリン−〇−ホス、フェートが含まれる。

食物中のａ！薬の存在をモニターするためのアッセイ系の能力を試験するために 、異なる入手先の６個のりんごを試験した。６個のりんごのうち、４個は陽性で 、２個は陰性であった。この４個の陽性りんごは地区の果樹園から得たものであ り、一方陰性のりんごは地区のスーパーマーケットから買った。地区の水を試験 してみると、ぎりぎりで陽性であった。表３は１５種類の有機リン酸塩およびカ ルバミン酸塩農薬についての水中で予期される検出レベルである。

有機リン酸塩およびカルバミン酸塩農薬に用いる試験手法１、サンプルをあらか じめ定量した脳調製物（希釈率１；２００）とともに５分間インキュベートする 。

２、酢酸ルシフェリン（２００ｐｍｏｌｅ）をインキュベーション混合物にさら に５分間加える。

３、このインキュベージラン混合物の一部（１００μｌ）を取り出し、ルシフェ ラーゼとＡＴＰの反応混合物（１ｍｌ）に加える。

４．２−５秒後に生物発光をモニターする。

５、ｊｌ薬サンプルの測定値と対照サンプルと比較してサンプルの阻害率を定量 化する（表３．４．５および６を参照）。

本発明を特定の態様と関連させて以下に説明するが、当業者には説明する態様に 関しての各種の改良、付加、変更および修飾が可能であり、これらは全て本発明 の精神および範囲に含まれることを認識すべきである。

実施例 Ａ、酢酸ルシフェリン（６−アセチルＤルシフェリン）の合成り一ルシフエリン ナトリウム（ホタルから精！り２ｍｇを水２ｍｌに溶解するか、あるいは合成り 一ルシ７エリン２ｍｇをメタノール２ｍｌに溶解して、褐色ビン中で３．３ｍＭ のルシフェリンストック溶液とする。いずれかのストック溶液から２５μｌを取 り出し、褐色遠心管中の蒸留水１ｍｌに加えて、８２．５μＭのルシフェリン溶 液を得る。Ｎ−アセチルイミダゾール６０ｍｇをアセトン１゜０ｍｌ中に溶解し 、５４５ｍＭのＮ−アセチルイミダゾール溶液を得る。５４５ｒｎＭのＮ−アセ チルイミダゾール溶液３０μｍを８２．５μＭのルシフェリン水溶液に加える。

数回混合し、反応が続いて完了するまで生物発光の減少をモニターする。上記反 応混合物をルシフェリンの材料として用いるときには生物発光がもはや観察され なくなったら反応は完了である。溶液を水上に保持する。この反応混合物中のＮ −アセチルイミダゾールの濃度は１６．３５ｍＭまたはルシフェリン濃度の約２ ００倍である。

ホタルからのＤ−ルシフェリンはＳ　ｉ　ｇｍａ社から購入した。合成り一ルシ フエリンはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｃｉｍ社から購入した。また、Ｄ −ルシフェリンはＢｌｏ−０ｒｂｉｔ社からも入手可能である。５ｌｇｍａ社か らのルシフェリンストック溶液は水に溶解したが、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒまたは Ｂｌｏ−０ｒｂｉｔ社からのＤ−ルシフェリンストック溶液はメタノールに溶解 した。

Ｎ−アセチルイミダゾールはＳｉｇｍａ社から購入した。上記の反応は、１ｍｌ かつ１濃度範囲で実施したが、より大きな容量で実施することもできる。リン酸 ルシフエリス硫酸ルシフェリン、ルシフェリンアルギニンなどのその他のルシフ ェリン誘導体が文献には記載されているが、我々の知見によれば、酢酸ルシフェ リンは未だ記載されておらず、我々の知る限りではこれが農薬をモニターするた めに脳油出物とのカブプリング反応に用いられたという記載はない。

Ｂ、昆虫の脳油出物の調製 昆虫は一２０℃またはそれ以下で保存する。昆虫の頭部をメスで切除して回収し 、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）および１ＭＭフェニルチオ尿素 を含む水冷０．０７Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７−０約１５ｍ１を入れた５０ｍ １のビーカー中に入れる。昆虫の頭部をＴｅｋｍａｒ　Ｔｉｓｓｕｍｉｚｅｒ中 で低速で穏やかにホモジエナイズする。この粗抽出物の少量を遠心管に取って遠 心する。上清を保持して１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１μＭ　フェニルチオ尿素を含 む０．０７Ｍ　リン酸バッファー、ｐＨ７，０で平衡化したセファデックスＧ− ２５カラムに適用した。２分ごとに両分を取り、酢酸ルシフェリンを基質として 用い、生物発光を測定することによりエステラーゼ活性をモニターする。エステ ラーゼ活性をもつ両分を集めて、農薬アッセイに用いるための昆虫頭部抽出物と して用いた。

脳油出物は主としてミツバチから調製したが、カイコや／Ｓ工からも抽出した。

ハチ頭部のタンパク質濃度は２から５ｍｇ／ｍｌである。アッセイをするには、 １アツセイにつき５から１０μ！を用いる。

Ｃ０生物発光反応 １、生物発光のための反応バッファー：トリシン４．４８ｇ、硫酸マグネシウム ０．６ｇ、ＥＤＴＡ　Ｏ，１４６ｇ、ウシ血清アルブミンＬＯＯｍｇおよびジチ オスレイトール７７ｍｇを水６００ｍ１中に秤量する。１０％水酸化ナトリウム でｐＨを７．８に調整し、蒸留水を加えて１リツトルにする。

２、ルシフェラーゼ調製物：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社から購 入したホタル由来のルシフェラーゼ（１ｍｇ）については、０．　５Ｍ　Ｔｒ　 ｉＳ−酢酸バッファー、ｐＨ７，５に溶解し、３０分間静置する。この溶液４０ μｌをガラス製試験管に取り、−２０℃で凍結する。凍結ストックを生物発光バ ッファー１ｍｌで再溶解する。Ｂｌｏ−０ｒｂｉｔ社から購入したルシフェラー ゼについては、３ｍｇを取り、生物発光バッファー１ｍｌに溶解する。各ルシフ ェラーゼ溶液は氷上に保存する。各生物発光アッセイにつき、上記のいずれかの ルシフェラーゼ溶液３０μｌを使用する。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社のルシフェラ ーゼについては、酵素的１μｇを各アッセイに用いる。

３、　ＡＴＰ：ＩＩ調製物Ｓｉｇｍａ社からのＡＴＰ　（アデノシン５゛−三リ ン酸）をあらかじめ秤量し、これはＡＴＰｌｍｇおよび硫酸マグネシウム４０ｍ ｇを含む。このバイアルに水１０ｍ１および１．０Ｍ　ＭＣＩ　１００μｌを加 えて撹拌する。ＡＴＰｆｓＭは氷上に保存する。ストック溶液は１．８ｍＭであ り、各生物発光アッセイには３０μｌを用いて、最終濃度５４μＭとする。

４、酢酸ルシフェリン：上記Ａの部で記載の方法により調製した酢酸ルシフェリ ンの８２．５μＭ溶液１００μｌおよび蒸留水９００μｍを取り、褐色遠心管に 加える。この溶液は８．２５μＭである。農薬アッセイには８．２５μＭ溶液２ ５μｌを０．０７Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７，０２ｍｌに加えて、酢酸ルシフ ェリンの濃度を０．１μＭとする。この溶液１００μｌを抜き取り、生物発光バ ッファー１ｍｌとともにインキュベートする。最終濃度は約１０ｎＭ酢酸ルシフ ェリンまたは１０μｍｏｌｅ酢酸ルシフェリンである。

５、生物発光の測定：生物発光バッファー１ｍｌを１３ｘ１００ｍｍの試験管に 加える。酢酸ルシフェリン溶液（０，１μＭ）１００μｌを抜き取り、加える。

次いでルシフェラーゼ溶液およびＡＴＰＩＳ液を各３０μＩ取り、試験管に加え る。

試験管を撹拌し、ルミノメータ−を用いて２から５秒後に生物発光を測定する。

酢酸ルシフェリンを用いる生物発光の読みは陰性であろう。もしもルシフェリン を１０μｍｏｌｅで測定するとルミノメータ−の読みは約１００．０００であろ う。もしも上記の試薬のいずれかの濃度が増加すると、光の読みも増加するであ ろう。上記濃度は許容できる値を与えるが、試薬濃度を変更して最適の実施を得 ることができる。上記の液体試薬は試薬の安定性および一定性を得るために、不 活性セルロース充填剤とともに圧縮錠剤とするなど、個別の錠剤の形で固定化す ることもできる。

Ｄ、生物発光を用いるｍ薬のアッセイ １．１３ｘｌＯＯｍｍの試験管に０．０７Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７，０を２ ｍｌ加える。陽性の！！藁対照（有機リン酸塩および／またはカルバミン酸塩農 薬）２５μｍ、水２５μｌを陰性対照の管に加え、試験サンプル２５μｌを他の 管に加える。もしも試験サンプルが水辺外の溶媒を含んでいる場合には、この溶 媒を陰性対照管として用いる。

上では２５μＩと記載したが、脳活性が溶媒によって影響されない限り、サンプ ルの量はこれよりも多くても少なくてもよい。

２、昆虫の脳波出物（活性により５から１０μｌ）を工程１に記載のインキュベ ージラン混合物２ｍｌに加えて、撹拌し、温度ブロック中、３５℃で１０分間イ ンキュベージランする。時間をモニターするためにアラーム付きのタイマーを使 用する。

３．１０分後に工程２のインキュベージラン混合物２ｍｌに８．２５μＭ酢酸ル シフェリン溶液２５μｌを加える。タイマーをゼロに戻して再び作動させる。

４．５分後に、各サンプルから１００μｌを取り出す。各サンプルにつき異なる ピペット先端を用い、生物発光バッファー１ｍｌを含む別々の１３ｘｌＯＯｍｍ の試験管にこの１００μｌを加える。

この反応では、サンプルを５分後に取り出す。反応は速度論的であるので、反応 で生成するルシフェリンの濃度が時間とともに増加する。したがって、少量を取 り出す時間は、それが反応曲線の直線部分にある限り変更することができ、サン プルから少量を取り出すのは一定時間に行う。

５、工程４のアッセイ管の１つにＡＴＰｔｓＭ３０μｌ、次いでルシフェリン溶 液３０μｌを加える。撹拌して２から５秒で生物発光を測定する。測定値を記録 してから上記と同様に次の管に進む。

６、ゼロ対照の生物発光反応は農薬によって阻害されず、高い生物発光の読みを 示すであろう。陽性サンプルでは、ノ１チ抽出物のエステル分解活性は阻害され て、より少ないルシフェリンが生成するので低い生物発光の読みを与える。サン プルの読みまたは陽性対照をゼロ対照で割り、１００を掛けると阻害率が得られ る。

いくつかの化学物質の入手源がここに記載されているが、その他の会社もこれら の化学物質を供給することができるので、酢酸ルシフェリンの調製を除いて、本 発明の方法は特定の試薬の入手源に左右されない。

表５−１１はそれぞれ試験アッセイにおける時間、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ。

酢酸ルシフェリンおよびノ１チ頭部脳調製物を関数とした生物発光の増加を示す データである。

表２ Ｄルシフェリンエステルの製造 ＲＤルシフェリン アセチルイミダゾール 凡例 ＲはＣ＋　Ｃａなどのアルキル木またはフェニル基表３ Ａｃ−ルシフェリンに対するノ１チ脳活性の有機リン酸塩およびカルバニン酸塩 阻害に対するチャーム農薬アッセイ〜 有機リン酸塩 ａ）Ｉｓ。は、生物発光で測定したときの酵素活性にお（Ａで５０％減少をもた らす阻害剤の濃度を示す 表５ 罎迂」ル見μμ■見し早１１すｊ射王叫恨空躇表７ 対照反応における農薬アッセイを用いる時間を関数とする生物発光の増加表８ 対照反応における農薬アッセイを用いる表９ 対照反応における農薬アッセイを用いるＡＴＰを関数とする生物発光の増加表１ ０ 対照反応における農薬アッセイを用いる酢酸ルシフェリン濃度を関数とする生物 発光の増加対照反応における農薬アッセイを用いる１１１１１．ｌ１１＋　’σ ルＳ　９３／■４３６．　、、　ＰＣＴ／１１５９３１００４３６フロントペー ジの続き （７２）発明者　チャーム、スタンレイ・イーアメリカ合衆国マサチューセッツ 州０２１１０゜ボストン、ロウズ・ワーフ　１０

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．試験サンプル中の有機リン酸塩およびカルバミン酸塩農薬の濃度を測定する ための方法であって、該方法は以下の工程：ａ）試験サンプルと昆虫の脳物質を インキュベートし；ｂ）このインキュベート混合物に、Ｄルシフェリン誘導体を 加え、該Ｄルシフェリン誘導体は農薬の存在下で加水分解が阻害され：ｃ）上記 Ｄルシフェリン誘導体の混合物をインキュベートしてＤルシフェリンを放出させ ； ｄ）アデノシン三リン酸およびルシフェラーゼとＤルシフェリン混合物の一部と の反応混合物を加えて、オキシルシフェリンと発光とを生じさせ；ｅ）一定時間 に生じた発光を測定し；そしてｆ）対照サンプルまたは標準品の発光と、生じた 測定発光とを比較することによって、試験サンプル中の農薬の濃度を決定する、 ことからなる。
2. ２．ルシフェリン誘導体が酢酸Ｄルシフェリンである請求の範囲第１項に記載の 方法。
3. ３．昆虫の脳物質がハチ、ハエ、イエバエ、カイコまたはその他の節足動物から なる群から選択される請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．昆虫の脳物質がミツバチ頭部の脳ホモジェネートからなる請求の範囲第１項 に記載の方法。
5. ５．５０ｐｐｂまたはそれ以下の農薬濃度を決定することを含む請求の範囲第１ 項に記載の方法。
6. ６．試験サンプルおよび昆虫の脳物質を約２から１０分間インキュベートするこ とを含む請求の範囲第１項に記載の方法。
7. ７．Ｄルシフェリン誘導体混合物を約２から５分間インキュベートすることを含 む請求の範囲第１項に記載の方法。
8. ８．混合物中の酢酸Ｄルシフェリンの濃度が約１×１０−１１Ｍまたはそれ以下 である請求の範囲第２項に記載の方法。
9. ９．農薬に対する試験感度が約０から５０ｐｐｂである請求の範囲第８項に記載 の方法。
10. １０．農薬がメトミル（ｍｅｔｈｏｍｙｌ）、プロポキサール（ｐｒｏｐｏｘｕ ｒ）、カルボフラン（ｃａｒｂｏｆｕｒａｎ）、ベンドカルブ（ｂｅｎｄｏｃａ ｒｂ）、メヴィンホス（ｍｅｖｉｎｐｈｏｓ）、エチオン（ｅｔｈｉｏｎ）、ク ロルピリホス（ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｆｏｓ）、フォレート（ｐｈｏｒａｔｅ）、 マラチオン（ｍａｌａｔｈｉｏｎ）、オキシデメトン−メチル（ｏｘｙｄｅｍｅ ｔｏｎ−ｍｅｔｈｙｌ）、ジスルフォトン（ｄｉｓｕｌｆｏｔｏｎ）、メチルパ ラチオン（ｍｅｔｈｙｌ　ｐａｒａｔｈｉｏｎ）、ＤＤＶＰ、ナレド（ｎａｌｅ ｄ）およびジアジノン（ｄｉａｚｉｎｏｎ）からなる群から選択される請求の範 囲第１項に記載の方法。
11. １１．試験サンプル中の有機リン酸塩およびカルバミン酸塩農薬の濃度を測定す るための方法であって、該方法は以下の工程：ａ）試験サンプルとハチ、ハエお よびカイコからなる群から選択される昆虫の脳ホモジェネート物質をインキュベ ートし；ｂ）このインキュベート混合物に、酢酸Ｄルシフェリンを加え；ｃ）上 記酢酸Ｄルシフェリン混合物をインキュベートしてＤルシフェリンを放出させ； ｄ）アデノシン三リン酸およびルシフェラーゼとＤルシフェリン混合物の一部と の反応混合物を加えて、オキシルシフェリンと発光とを生じさせ；ｅ）一定時間 に生じた発光を測定し；そしてｆ）対照サンプルまたは標準品の発光と、生じた 測定発光とを比較することによって、試験サンプル中の農薬の濃度を決定する、 ことからなる。
12. １２．試験サンプル中の有機リン酸塩およびカルバミン酸塩農薬の濃度を測定す るための試験キットであって、該キットは以下のもの：ａ）農薬に対して感受性 である昆虫の脳調製粉；ｂ）インキュベートした試験サンプルおよび脳物質に加 えるべき農薬によってその加水分解が阻害されるルシフェリン誘導体；ｃ）イン キュベートしたルシフェリン誘導体混合物の一部に加えるべきルシフェラーゼお よびＡＴＰ； ｄ）最初に脳物質を含む試験サンプルをインキュベートし、次いでルシフェリン 誘導体を含む試験サンプルおよび脳物質をインキュベートするためのインキュベ ーション手段； ｅ）生じた発光を測定するための手段；およびｆ）生じた測定発光と比較して試 験サンプル中の農薬濃度を決定するための発光対照および標準手段、 を組み合わせてなる。
13. １３．ルシフェリン誘導体が酢酸Ｄルシフェリンである請求の範囲第１２項に記 載の試験キット。
14. １４．脳物質がハチ、ハエおよびカイコからなる群から選択される脳ホモジェネ ートである請求の範囲第１２項に記載の試験キット。
15. １５．以下の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＲはＣ１−Ｃ６アルキルおよびベンジルからなる群から選択される一価 の有機基である］ を有するルシフェリン誘導体化合物。
16. １６．酢酸Ｄルシフェリンである化合物。
17. １７．ＲがＣ１−Ｃ６アルキルおよびベンジルからなる群から選択される一価の 有機基である構造を有する置換Ｒアシル化イミダゾール化合物と、Ｄルシフェリ ンとを液体溶媒中で反応させて以下の式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＲはＣ１−Ｃ６アルキルおよびベンジルからなる群から選択される一価 の有機基である］ を有するＤルシフェリン誘導体を生成することからなるＤルシフェリン誘導体化 合物の製造方法。
18. １８．置換イミダゾールがアセチルイミダゾールであり、Ｄルシフェリン誘導体 が酢酸Ｄルシフェリンである請求の範囲第１７項に記載の方法。