DE3833628A1 - Verfahren zum nachweis und zur identifikation toxischer substanzen mit hilfe klonierter mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zum nachweis und zur identifikation toxischer substanzen mit hilfe klonierter mikroorganismen

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis toxischer Substanzen in einer flüssigen oder gasförmigen Umgebung mit Hilfe spezifisch sensitiver und/oder resistenter Mikroorganismen-Stämme, welche
  • 1. natürlicherweise vorkommen,
  • 2. durch wiederholte Labor-Selektion an bestimmte toxische Substanzen adaptiert oder
  • 3. durch molekulare Klonierung mit bestimmten Eigenschaften ausgestattet worden sind.
Dabei sind alle Mikroorganismen durch Einführen eines plasmid-enkodierten Luciferase-Gens zur Emission von Licht (Biolumineszenz) befähigt. Die Biolumineszenz der Indikatororganismen ermöglicht, schnell und mit großer Empfindlichkeit Änderungen in ihrem Metabolismus oder den Verlust ihrer Lebensfähigkeit als Auswirkung einer toxischen Substanz im Testmedium zu erfassen.
Beschreibung bereits bekannter Meßverfahren mit Hilfe von Mikroorganismen
Die Verwendung von Mikroorganismen zur Messung kritischer Belastungen durch toxische Substanzen (US-PS 39 81 777) sowie zur Bestimmung von Antibiotika-Konzentrationen (EP. No. 02 00 226) ist etabliert. Bei den Anwendungen liegt die Erfassung des Wachstums der Test-Organismen durch Auszählen von Kolonien, Trübungsmessungen, Nephelometrie etc. zugrunde. Diese Meßverfahren erfordern die Kultivierung großer Mengen von Mikroorganismen, so daß verläßliche Messungen erst nach einem Zeitraum von 16 bis 72 Stunden durchgeführt werden können. Demgegenüber erlaubt das im folgenden beschriebene Verfahren die Auswertung von Meßergebnissen bereits nach weniger als 2 Stunden.
Natürlich vorkommende zur Biolumineszenz fähige Mikroorganismen sind nach Resistenz-Adaption im Labor zum Nachweis bestimmter Toxine eingesetzt worden (PCT/US84/01 217); dieses Verfahren weist jedoch einige Nachteile auf, welche einen generellen Einsatz dieser Methode nicht erwarten lassen:
  • 1. Natürlich vorkommende biolumineszierende Mikroorganismen sind marinen Ursprungs und benötigen deshalb eine hohe Ionenstärke im Testmedium. Die Herstellung der erforderlichen Osmolarität bedeutet einen möglicherweise verfälschenden Eingriff in die Messung.
  • 2. Die Adaption dieser Mikroorganismen an bestimmte Substanzen durch wiederholte Selektion im Labor ist aufgrund der statistischen Seltenheit eines nützlichen Mutationsereignisses sehr zeitaufwendig, oder,
  • 3. sogar unmöglich.
  • 4. Die Verwendung von natürlicherweise biolumineszierenden Bakterien schließt die Anwendung des Meßprinzips für etablierte und international standardisierte Tests aus, die den Gebrauch eines definierten Bakterienstammes vorschreiben.
Beschreibung der Erfindung
Die hier beschriebene Erfindung macht sich die Methoden experimenteller Genetik zunutze, um prinzipiell jeden gewünschten Bakterienstamm durch Einführung eines speziell konstruierten Plasmid-Vektors (pGL3, s. u.) in einen zur Biolumineszenz befähigten Organismus zu verwandeln. Während das Prinzip der Transformation eines Bakterienstammes mit einem plasmid-enkodierten Luciferase LUX-Gen bereits beschrieben wurde (US-PS 45 81 335), stellt die vorliegende Erfindung eine entscheidende Verbesserung dar: Die Expression des LUX-Gens und damit die Fähigkeit zur Biolumineszenz ist nicht mehr permanent (konstitutiv), sondern in einer temperaturabhängigen Art und Weise an- und abschaltbar. Die Eigenschaft der Regulierbarkeit wird durch Konstruktion eines Plasmid-Vektors erreicht, der sowohl den Luciferase-Gen-Komplex von Vibrio Harveyi (LUX-Gene A und B), als auch das CI857-Allel des Phagen Lambda Repressorgens (thermolabiles Genprodukt!) enthält. Die durch diese Konzeption erreichte induzierbare Biolumineszenz hat verglichen mit permanent Licht emittierenden Testorganismen zwei wichtige Vorteile:
  • 1. Das Signal- zu Rauschverhältnis der Einzelmessung wird verbessert.
  • 2. Der für das Bakterium energetisch aufwendige Prozeß der Lichtemission kann auf den kurzen Meßzeitraum beschränkt werden, dies hat zur Folge, daß auch schlecht wachsende Organismen eingesetzt werden können, die durch permanente Biolumineszenz in ihrem Wachstum besonders beeinträchtigt würden, für Tests aber gerade aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit interessant sind.
Ein weiteres Charakteristikum der erfindungsgemäßen Entwicklung ist die Möglichkeit zur Einführung von zusätzlicher Resistenz- oder Hypersensitivität gegenüber spezifischen Toxinen vermittelnden Genen in den skizzierten Plasmid-Vektor; dies wird durch molekulare Klonierung eines entsprechenden Gens in vorhandene spezifische Restriktions-Endonuklease-Schnittstellen ermöglicht.
Bisher wurde die Einführung verschiedener Antibiotika-Resistenzgene (z. B. Tetrazyklin) in Plasmid pGL3 erfolgreich durchgeführt. Mikroorganismen, die mit Genen ausgestattet sind, welche eine a priori festgelegt, spezifische Reaktivität gegenüber einer toxischen Substanz aufweisen (z. B. Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Tetrazyklin), können schließlich zur Identifikation und Konzentrationsabschätzung der fraglichen Substanz im Testmedium eingesetzt werden.
Weitere Vorteile der hier vorgestellten Entwicklung sind, daß
  • 1. Meßergebnisse mit etwa zehnfach geringerem Zeitaufwand als durch konventionelle mikrobiologische Kultivierungs- und Meßmethoden zustande kommen und
  • 2. prinzipiell jeder geeignete, empfohlene oder in standardisierten Referenztests vorgeschriebene Bakterienstamm für Biolumineszenz-Messungen eingerichtet werden kann.
Als Beispiel eines Bakterienstammes, der zu letzterer Kategorie zählt, sei E. coli ATCC 25 922 angeführt; dieser Stamm ist der offizielle (WHO) Referenzstamm für standardisierte Antibiotika-Hemmhoftests. E. coli ATCC 25 922 und andere in klinischen und industriellen Tests häufig eingesetzten Stämme (E. coli K- und B; chi 1776 etc.) sind von der Anmelderin durch Einführung des Plasmids pGL3 erfolgreich in zur Biolumineszenz fähige Spezies überführt worden.
Zusammenfassend ist festzustellen, daß die hier vorgestellte Toxizitäts-Testung vermittels Licht emittierender Mikroorganismen gegenüber herkömmlichen Meßmethoden eine Weiterentwicklung darstellt, welche die folgenden Vorteile in sich vereint:
  • 1. Biologische Relevanz.
  • 2. Hohe Geschwindigkeit.
  • 3. Bei geeigneter Konstruktion des Klonierungs-Vektors Spezifität gegenüber bestimmten Substanzen und dadurch die Möglichkeit zu deren Identifikation und Konzentrationsabschätzung.
  • 4. Jede durch das LUX-Plasmid transformierbare Spezies ist als Indikator-Organismus einsetzbar, was eine erhebliche Ausweitung möglicher Anwendung bedeutet.
  • 5. Biolumineszenz-Messungen sind mit geringem apparativen Aufwand durchzuführen, deshalb kostengünstig und
  • 6. unter "Feldbedingungen", d. h. dezentral, durchzuführen.
Funktionsweise von Plasmid pGL3 im Vergleich mit LUX-Genkonstruktionen des Standes der Technik
Die molekulare Klonierung der LUX-Genkomplexe verschiedener mariner Bakterien sowie deren Transfer in normalerweise nicht zur Biolumineszenz befähigte Mikroorganismen ist sowohl in der wissenschaftlichen als auch in der Patentliteratur beschrieben (US-PS 45 81 335; EP 01 68 933). Bei diesen Dokumentationen handelt es sich um Plasmid-Vektoren, die LUX-Gene entweder konstitutiv durch ihren ursprünglichen Promotor oder unter Kontrolle des Beta-Galaktosidase-(lac Z-) Gen Promotors von E. coli exprimieren. Plasmid pGL3 hingegen
  • 1. transkribiert den Luciferase-Genkomplex unter der Kontrolle des PRM-Promotors des Phagen Lambda,
  • 2. enkodiert gleichzeitig das CI-Repressorgen des Phagen-Lambda, dessen Genprodukt der sog. Lambda-Repressor, den PRM-Promotor negativ reguliert,
  • 3. die Regulation erfolgt durch Verwendung des Allels 857 des Lambda-Repressors in temperaturabhängiger Weise.
Durch Erhöhung der Temperatur auf über 37°C wird das Repressorprotein inaktiviert, der LUX-Genkomplex zur Transkription in mRNA freigegeben, woraus schließlich eine um mehr als drei Zehnerpotenzen erhöhte Biolumineszenz-Aktivität des Indikatororganismus resultiert. Der Unterschied in der Größe des Biolumineszenzsignals zwischen reprimiertem und transkribiertem Zustand des LUX-Genkomplexes - und damit das Signal- zu Rauschen-Verhältnis der Messungen - ist bei Testorganismen, die mit pGL3 ausgestattet sind, um mehr als eine Zehnerpotenz besser als bei solchen, welche durch chemische Induktion des lacZ-Gens zur Biolumineszenz angeregt werden (vgl. US-PS 45 81 335). Der Grund für diese Eigenschaft von pGL3 liegt darin, daß der Lambda PRM-Promotor, der die Expression der LUX-Gene reguliert, einerseits einen der stärksten, in E. coli funktionstüchtigen, prokaryontischen Promotoren darstellt, zum anderen aber im reprimierten Zustand etwa eine Zehnerpotenz "dichter" geschlossen ist als alle bisher bekannten bakterieneigenen Promotoren. Diese fast absolute Unterdrückung der Biolumineszenz durch pGL3 im reprimierten Zustand der LUX-Gene, d. h. bei Inkubationen unter 35°C, ist eine wichtige Voraussetzung, auch sehr fragile Mikroorganismen für Biolumineszenzmessungen einzusetzen: Der das ohnehin mäßige Wachstum solcher Bakterien durch zusätzlichen Energieverbrauch stark beeinträchtigende Prozeß der Biolumineszenz kann so auf den kurzen Meßzeitraum eingeschränkt werden.
Beschreibung einzelner Aspekte der Entwicklung I. Konstruktion des Plasmid-Vektors pGL3
Das für die Erzeugung regulierbarer Biolumineszenz in Mikroorganismen konzipierte Plasmid pGL3 wurde durch Anwendung gängiger molekularbiologischer Klonierungstechniken konstruiert; es enthält:
  • 1. den Luciferase-Genkomplex (LUX A; LUX B) von Vibrio Harveyi,
  • 2. den PL-Promotor des Bakteriophagen Lambda,
  • 3. das Lambda CI857-Repressorgen unter Kontrolle des
  • 4. PR-Promotors des Bakteriophagen Lambda,
  • 5. ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Ampicillin,
  • 6. incl. seines Promotors und
  • 7. eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease Pst 1.
Der LUX-Genkomplex ist 3′, d. h. "hinter" den PRM-Promotor kloniert und wird deshalb von diesem transkribiert; der PRM-Promotor seinerseits wird negativ vom Genprodukt des CI-Gens - dem Lambda-Repressor - kontrolliert; dieser Lambda-Repressor wird zwar durch konstitutive Expression des PR-abhängigen CI-Gens immer in ausreichender Menge synthetisiert, ist aber durch Verwendung des CI857-Allels hitzelabil. So bleibt der PRM-Promotor durch Bindung des Repressors solange blockiert, bis durch 5- bis 15minütige Temperaturerhöhung auf 37° bis 42°C das Repressor-Protein denaturiert wird und vom PRM-Promotor abfällt. An den freien Promotor bindet dann die DNA-abhängige RNA-Polymerase und bewirkt die massive Transkription des LUX-Genkomplexes. Insgesamt führt diese Konstruktion von pGL3 zu einer regulierbaren, da temperaturabhängigen Synthese des Enzyms Luciferase, welches für die Biolumineszenz der Indikatororganismen verantwortlich ist.
Die Konstruktionsbasis von pGL3 ist das Plasmid pLK915 (s. K. K. Stanley, und J. P. Luzio, EMBO J. 3: 1429 bis 1434, 1984). In die Bam H1 Restriktions-Schnittstelle von pLK915 wurde ein 3,1 Kilobasenpaare großes Sal 1-Bam H1 Restriktionsfragment aus dem Genom von Vibrio Harveyi, das den kompletten Luciferase-Genkomplex (allerdings ohne Promotor) enthält, durch molekulare Klonierung eingefügt; Kompatibilität der Sal 1 Schnittstelle mit Bam H1 wurde durch vorheriges Anligieren des 45 Basenpaare langen Bam H1 - Sal 1-Restruktionsfragments aus der Polylinkerregion des Plasmides "pBluescript" (Firma "STRATAGENE"; San Diego, Cal., USA) an das Sal 1-Ende und anschließender Restriktionsspaltung mit dem Enzym Bam H1 hergestellt. Zuletzt wurde ein Oleonukleotid mit der Länge von 16 Basenpaaren, welches Translations-Stoppsignale in allen 3 Leserastern enthält (Firma Pharmazia, Schweden), in die Sma 1-Schnittstelle des Bam H1-Sal 1 Polylinker-Fragments einkloniert, um jegliche Proteintranslation oberhalb, d. h. 5′, des LUX-Genkomplexes auszuschließen.
II. Herstellung, Aufbewahrung und Handhabung transformierter Mikroorganismen
Das oben beschriebene Plasmid pGL3 kann durch Standardtechniken in prinzipiell jede gewünschte Spezies von Mikroorganismen eingeführt werden, um schließlich in großen Mengen kultiviert zu werden. Es ist möglich, Bakterien als Glycerin-Kulturen bei -20°C oder nach Gefriertrocknung bei Umgebungstemperatur aufzubewahren. Die Gefriertrocknung wird entweder in Glasampullen oder speziell angefertigten Kunststoffbehältern durchgeführt, die z. B. in zwei voneinander abgetrennten Kammern die lyophilisierten Mikroorganismen bzw. die Komponenten für das zur Revitalisierung der Bakterien notwendige Nährmedium enthalten. Um Messungen toxischer Substanzen in einer Gasphase durchzuführen, ist die permanente Trennung der Indikatororganismen von einem Meßkompartiment durch eine für Wasserdampf impermeable Membran vorgesehen. Auf diese Weise wird die konstante Zusammensetzung des Wachstumsmediums und damit auch die Messung über eine längere Meßperiode, wie für Toxizitätstests von Gasen erforderlich, gewährleistet.
III. Anwendung des Verfahrens
Um das beschriebene Biolumineszenz-Toxizitätsmeßverfahren dezentral einsetzen und automatisieren zu können, ist das Aufbringen der lyophilisierten Indikatororganismen auf ein geeignetes Trägermaterial in Form eines Teststreifens eine bevorzugte Anwendungsform. Bei diesem Verfahren werden die Mikroorganismen in definierter Menge auf die Trägermatrix aufgebracht, durch ein Spezialverfahren fixiert, gefriergetrocknet und schließlich als Teststreifen versiegelt. Vor der Durchführung der Biolumineszenz-Tests werden die Indikatorbakterien durch ein- bis zweistündige Inkubation in wässerigem Nährmedium bei Umgebungstemperatur revitalisiert.
Das Meßprinzip der hier beschriebenen Toxizitätstestung beruht auf der Anwendung eines Zweischritt-Verfahrens:
Zunächst wird ein "screening" mit einer Reihe verschiedener Testorganismen definierter Empfindlichkeit zum Nachweis genereller Toxizität in einer Probe durchgeführt. Danach können weitere Nachweisreaktionen mit Stämmen, die mit einer bestimmten, genetisch vorhandenen bzw. durch Transformation eingeführten Eigenschaft der Resistenz bzw. (Hyper-)Sensitivität ausgestattet sind, durchgeführt werden. Ein Toxin, gegen das ein Stamm spezifisch resistent ist, wird bei diesem zu einem nicht- oder nur partiell reduzierten Biolumineszenz-Signal führen; demgegenüber ist ein nicht resistenter Kontrollstamm gravierender in seiner Lebensfähigkeit und, damit korreliert, der Fähigkeit zur Biolumineszenz beeinträchtigt. Das Meßverfahren gemäß der Erfindung ist also einerseits dazu geeignet, das Maß generell vorhandener Toxizität einer Probe durch das Wachstumsverhalten von Mikroorganismen zu erfassen, andererseits ist es darüber hinaus möglich, alle Substanzen, gegenüber welchen eine spezifische Reaktivität bestimmter Testorganismen besteht, zu identifizieren und deren Konzentration näherungsweise einfach und schnell zu bestimmen.
IV. Durchführung eines Toxizitätstests IV.1 Nachweis genereller Toxizität in einer wässerigen Probe mit Hilfe verschieden sensitiver Indikatorstämme
Ein Aliquot (0,01 bis 1 ml) einer Suspension je eines Indikatorstammes in flüssigem Nährmedium wird mit dem gleichen Volumen (etwa 10³ bis 10⁷ Zellen) der zu testenden Probeflüssigkeit versetzt, gemischt und 1 bis 60 min bei 10° bis 34°C inkubiert. Danach wird durch 5- bis 15minütige Erwärmung der Probe auf 37° bis 42°C die Transkription des LUX-Genkomplexes und dadurch die Biolumineszenz in den Mikroorganismen initiiert. Die Messung der Lichtsignale erfolgt in einem geeigneten Lumineszenz-Photometer entweder als Endpunkt- oder als kontinuierliche Messung über einen Zeitraum von 1 bis 60 Minuten. Das Maß genereller Toxizität in einer Testflüssigkeit wird bestimmt durch das abnehmende Biolumineszenz-Meßsignal verschiedener Indikatorstämme im Vergleich untereinander wie mit einer Kontrolle, deren Nährmedium keine Probenflüssigkeit zugesetzt wurde.
IV. 2 Identifikation spezifischer Substanzen
Wie unter IV. 1 beschrieben, werden Indikator-Organismen - diesmal jedoch ausgestattet mit spezifischer Resistenz oder Sensitivität gegenüber bestimmten toxischen Substanzen - mit der Probenflüssigkeit inkubiert, um schließlich Biolumineszenz-Messungen durchzuführen. Ist das Biolumineszenz-Signal nur bei einem der Testorganismen unverändert, etwa in der Höhe des Kontrollwertes, während alle anderen Mikroorganismen eine Reduktion meßbarer Biolumineszenz erfahren, so ist jenes Toxin, gegen welches der betreffende Stamm resistent ist, identifiziert.
V. Anwendungsbeispiel 1
Das in Abb. 2 gezeigte Beispiel verdeutlicht die Anwendung der hier vorgestellten Meßmethode zur Testung von Antibiotika-Konzentration in roher Milch: Ein Stamm des gram-negativen Bakteriums E. coli ATCC 25 922 wurde mit einem Plasmid [(pGL3.T, das zusätzlich zu den Komponenten von pGL3 (s. o.) ein Tetrazyklin-Resistenzgen enthält (Stamm "T" in Abb. 2)] transformiert. Als Kontroll-Stamm (Stamm "C") wurde ein Derivat von ATCC 25 922 - ausgestattet mit pGL3 - verwendet. Mehrere 0,5 ml-Proben roher Milch mit verschiedenen Konzentrationen des Antibiotikums Tetrazyklin wurden mit je 0,1 ml (etwa 2 × 10⁶ Bakterien) Suspensionen der Stämme C und T versetzt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 10minütiger Erwärmung der Kulturen auf 40°C zur Induktion der Biolumineszenz wurden 0,01 ml einer 0,1prozentigen Lösung des Aldehyds Decanal als Substrat der Luciferase zugesetzt und die Proben in einem Lumineszenz-Photometer über einen Zeitraum von 50 Minuten in 4-Minuten-Intervallen gemessen. In Abb. 2 sind die Meßergebnisse von Proben mit fünf verschiedenen Antibiotikakonzentrationen als relative Lichtsignale (RLU; Ordinate) als Funktion der Zeit aufgetragen.
Das Biolumineszenzsignal des tetrazyklin-resistenten Stamms T ist über den Meßzeitraum relativ konstant, während Stamm C ein Abnehmen der emittierten Lichtmenge in einer konzentrationsabhängigen Weise erkennen läßt. Die Tatsache, daß die Wachstumseigenschaften des Indikator-Stammes T durch Tetrazyklin nicht wesentlich beeinträchtigt werden, ermöglicht seine Anwendung auch zur Identifikation dieses Antibiotikums in Proben (z. B. Milch) unbekannter Herkunft. Die Bestimmung absoluter Konzentrationen dieses Antibiotikums, oder anderer toxischer Substanzen, gegen die ein Indikatorstamm spezifisch resistent ist, ist in guter Näherung durch Einbeziehen von Referenzwerten bekannter Konzentration des Toxins in die Meßreihe möglich.
VI. Weitere Anwendungen des Verfahrens
Das oben angeführte Beispiel erläutert nur eine der möglichen Anwendungen des hier vorgestellten Toxizitäts-Meßverfahrens mittels Biolumineszenz. Analog ist die Toxizitätsbestimmung flüssiger Proben im Hinblick auf deren Belastung mit anderen Antibiotika, Schwermetallen, Fluorchlorkohlenwasserstoff-Verbindungen (FCKW) wie Dioxinen, PCB etc. durchzuführen, vorausgesetzt, daß mit entsprechenden Resistenz- bzw. Hypersensitivitäts-Genen ausgestattete Mikroorganismen zur Verfügung stehen.
Effekte toxischer Substanzen in gasförmiger Umgebung können in ähnlicher Weise - wie im Beispiel für flüssige Proben beschrieben -erfaßt werden. Bei dieser Anwendungsform bringt man die gasförmige Probe über eine nur für Gase, nicht aber für Wasserdampf, durchlässige Membran in Kontakt mit den Indikator-Organismen. Diese Meßanordnung erlaubt die Erfassung toxischer Substanzen in der Gasphase über längere Meßzeiten, ohne daß durch Verdunstung von Wasserdampf das Nährmedium der Testbakterien in seiner Zusammensetzung verändert wird.

Claims (10)

1. Verfahren zum Nachweis toxischer Substanzen in flüssiger oder gasförmiger Umgebung mit Hilfe von Mikroorganismen definierter genereller oder spezifischer Resistenz bzw. (Hyper)Sensitivität gegenüber toxischen Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Indikator-Stämme
  • (I) natürlich vorkommen,
  • (II) durch Selektion im Laboratorium an ein bestimmtes Toxin adaptiert werden, oder
  • (III) durch molekularbiologische Techniken mit einem Resistenz bzw. Hypersensitivität gegenüber einem bestimmten Toxin vermittelndem Gen ausgestattet sind und
  • (IV) alle Mikroorganismen durch Transformation mit einem bakteriellen Luciferase-Genkomplex die Eigenschaft zur Biolumineszenz erhalten haben.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mit pGL3 bezeichnete Plasmid folgende Konstruktionsmerkmale aufweist:
  • (I) den LUX-Genkomplex von Vibrio Harveyi,
  • (II) ein bestimmtes Allel des Lambda-Phagen-Repressorgens CI unter der Kontrolle seines natürlichen Promotors, PR,
  • (III) ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Ampicillin,
  • (IV) eine Restriktionsenzym-Schnittstelle, die die Option der Einführung eines zusätzlichen Gens durch Klonierung in pGL3 bietet,
  • (V) den Lambda-Phagen PRM-Promotor, unter dessen Kontrolle der Luciferase-Genkomplex transkribiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der PR-Promotor unter der Kontrolle des hitzelabilen Genproduktes des Lambda-Phagen-Repressorgens CI857 steht; das Repressorprotein durch Erwärmen auf über 37°C für etwa 5 bis 15 Minuten inaktiviert werden kann, woraus das Phänomen temperaturinduzierbarer Biolumineszenz resultiert.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorhandensein einer Schnittstelle für das Restriktionsenzym Pst 1 die Möglichkeit bietet, ein zusätzliches Resistenz oder Hypersensitivität gegen eine bestimmte Substanz vermittelndes Gen durch molekulare Klonierung einzuführen.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dabei toxische Effekte von Antibiotika, Schwermetallen, Enzyminhibitoren, Pestiziden, mikrobiellen Toxinen, flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindungen (FCKW), Desinfektionsmitteln, Konservierungsstoffen oder anderen Substanzen mit cytotoxischen Eigenschaften ausgeübt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die generelle Toxizität einer Probenflüssigkeit getestet wird, indem man einen durch genetische Manipulation zur Biolumineszenz befähigten Stamm von Indikator-Mikroorganismen dieser Flüssigkeit aussetzt und eine Reduktion des Biolumineszenz-Signals im Gegensatz zu Kontrollmessungen ohne Zusatz der zu testenden Probenflüssigkeit feststellt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifikation einer bestimmten toxischen Substanz durch Vergleich der Absterberaten eines sensitiven mit einem gegen das betreffende Toxin spezifisch resistenten Indikator-Organismus vorgenommen wird: Die Lichtemission der nicht spezifisch resistenten Kontrollorganismen ist reduziert, während ein konstantes Biolumineszenz-Signal zur Identifikation derjenigen Substanz führt, gegen die der Organismus spezifisch resistent ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration einer toxischen Substanz durch Messung der Absterbekinetik oder Änderung im Metabolismus von zur Biolumineszenz fähigen Indikatororganismen, die dieser Substanz über den Meßzeitraum ausgesetzt werden, bestimmt, indem man die Abnahme der Biolumineszenz-Signale dieser Messungen mit Kontrollen vergleicht, in denen bekannte Konzentrationen der Testsubstanz auf die Indikator-Organismen einwirken.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen lyophilisiert, durch ein Spezialverfahren auf eine Trägermatrix aus Papier oder einem synthetischen Material aufbringt und in einem speziellen Behältnis aufbewahrt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Testbehälter durch eine Membran in zwei Kompartimente getrennt wird, so daß zwar Gase, nicht aber Wasserdämpfe, in das Kompartiment mit den Mikroorganismen aus dem flüssigen Nährmedium der Testbakterien in den Gasraum übertreten können.
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