JP2785164B2 - ヒトパピローマウイルスの検出方法 - Google Patents
ヒトパピローマウイルスの検出方法Info
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Description
ス(以下HPVと略記する)の検出方法に関し、更に詳
細には良性型及び/又は悪性型HPVの特異的な検出方
法に関する。
a virus)科に属する小型DNAウイルスで、ヒ
トの皮膚のいぼ、口腔、肛門、性器の尖圭コンジローマ
などから分離され、昔からいぼをつくるウイルスとして
知られてきた。HPVは、現在60種以上もの異なった
タイプが見つかっている。このうちHPV6、HPV1
1は尖圭コンジローマ等、主に性器に良性の腫瘍を引起
こす良性型HPVである。またがんに至る悪性腫瘍を引
起こす代表的HPVとして、以前よりHPV16、HP
V18が知られていたが、現在HPV31、HPV33
等の悪性型HPVの存在が知られている〔デ ビラース
(de Villiers)、ジャーナルオブ ビロロ
ジー(Jounal of Virology)、第6
3巻、第4898〜4903頁(1989)〕。HPV
が子宮頸がんを引起こす要因の一つである〔M.デュル
スト(M.Duerst)ほか、プロシーディングス
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシ
ーズ オブ ザ USA(Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA)、第80巻、第3812〜381
5頁(1983)〕という報告がなされて以来、子宮頸
部組織からHPVを検出する様々な試みが行われてき
た。残念ながら、HPVはいまだウイルス粒子での存在
が認められず、試験管内増殖系を持たないため、その検
出は抗体による方法とウイルスDNAを検出する方法が
取られている。HPV DNAを検出する代表的方法と
して、従来よりサザンハイブリダイゼーション法がとら
れている。実際、M.デュルストらはこの方法で、子宮
頸がん組織より約60%の試料にHPV16型あるいは
18型DNAを検出している。更に簡便で高感度な検出
方法として、PCR(Polymerase Chai
n Reaction)法がある〔メソッズ イン エ
ンザイモロジー(Methods in Enzymo
logy)、第155巻、第335〜350頁(198
7)〕。PCR法は、増幅したいDNA領域の両端に一
対のオリゴヌクレオチドプライマーを設定し、耐熱性タ
ックポリメラーゼを用いて、目的DNAを指数的に増幅
させる方法である。DNAの変性→プライマーDNAの
アニーリング→DNA相補鎖の酵素的合成といった温度
サイクルを25回繰返せば、目的DNAは約10万倍に
増幅される。
のうち、HPV抗体を用いる方法は操作が煩雑で、また
感度の点で問題がある。一方、ヒト性器や子宮頸部組織
よりHPV DNAを検出する際、従来のサザンハイブ
リダイゼーション法やPCR法では、一種類のHPVに
限定してプローブやプライマー対を設定するため、特定
の型しか検出できない。このため、複数種のHPVを検
出するにはその都度プローブやプライマー対を設定し別
々の反応系で行わねばならず、操作が煩雑になる。性器
腫瘍に数多くのHPVが関与することが認められている
現状において、一回の反応系でできるだけ多種のHPV
を検出することが求められている。すなわち、本発明の
目的は、良性型及び/又は悪性型に共通なHPVのDN
A領域を決定し、その配列の検出方法及びキットを提供
することにある。
発明の第1の発明はHPVの検出方法に関し、良性型及
び/又は悪性型HPVの検出方法において、該HPVの
DNA配列を、配列表の配列番号26及び/又は配列番
号27で示される塩基配列のプライマーと、配列表の配
列番号28で示される塩基配列のプライマーの組合せを
用いて検出することを特徴とする。また、本発明の第2
の発明は第1の発明の方法を用いてHPVの検出を行う
ための検出キットに関し、配列表の配列番号26及び/
又は配列番号27で示される塩基配列のプライマーと、
配列表の配列番号28で示される塩基配列のプライマー
の組合せを含有していることを特徴とする。
ピソーム状態のほかヒトゲノム中に挿入された形で存在
することが明らかとなっており、しかも組込まれたHP
VDNAは、通常多くの欠損がみられ、完全に保存され
ているのは初期遺伝子E6及びE7の領域のみである例
が多く見出されている〔E.シュワルツ(E.Schw
arz)ほか、ネーチャー(Nature)、第314
巻、第111〜114頁(1985)〕。本発明におい
て、良性型及び/又は悪性型のHPVのDNAの検出に
用いる領域は、E6及び/又はE7領域より、そのホモ
ロジーの高い配列を含む領域(高ホモロジー領域)を選
択する。良性型のHPVとしては、例えばHPV6、H
PV11等が、悪性型のHPVとしては、例えばHPV
16、HPV18、HPV31、HPV33、HP52
b及びHPV58等があり、その一部については以下の
様にDNA塩基配列が知られている〔HPV6;E.シ
ユワルツほか、ジエンボ ジャーナル(the EMB
O J.)第2巻、第2341頁(1983)、HPV
11;K.ダートマン(K.Dartmann)ほか、
ビロロジー(Virology)、第151巻、第12
4頁(1986)、HPV16;K.シードルフ(K.
Seedorf)ほか、ビロロジー、第145巻、第1
81頁(1985)、HPV31;S.T.コール
(S.T.Cole)ほか、ジャーナル オブ モレキ
ュラー バイオロジー(J.Mol.Biol.)、第
193巻、第599頁(1987)、HPV31;M.
D.ゴールズボロー(M.D.Goldsboroug
h)ほか、ビロロジー、第171巻、第306頁(19
89)、HPV33;S.T.コールほか、ジャーナル
オブ ビロロジー、第58巻、第991頁(198
6)〕。
中の高ホモロジー領域、あるいはHPV16とHPV1
8、HPV31、HPV33等のE6・E7領域中の高
ホモロジー領域は、例えばDNAシーケンス入力解析シ
ステムDNASIS(宝酒造社)を用いて検索すること
ができる。
の高ホモロジー領域として利用できる塩基配列の例を配
列表の配列番号1〜23に示す。すなわち、配列表の配
列番号1〜4はHPV6、配列番号5〜8はHPV1
1、配列番号9〜12はHPV16、配列番号13〜1
5はHPV18、配列番号16〜19はHPV31、配
列番号20〜23はHPV33についてそれぞれ高ホモ
ロジー領域として利用できる塩基配列の例を示すもので
ある。また、これらの塩基配列を、ホモロジーの高い部
分ごとにまとめた例を表1及び表2に示す。なお配列表
の各配列及び表1及び表2において示した塩基番号は前
述の引用文献に記載されたものと一致する。
は、例えば、PCR法を簡便で高感度な方法として用い
ることができる。すなわち、良性型及び/又は悪性型H
PVの高ホモロジー領域について共通プライマーを選定
し、これを用いてDNA配列を増幅し、検出すれば良
い。各共通プライマーは、例えばDNA合成機で合成
し、HPLCで精製して、用いることができる。この様
なプライマーの例を配列表の配列番号24〜28に示
す。
の配列番号24,25でそれぞれ表されるpU−O、p
16−1は表1及び表2に示した高ホモロジー領域のI
の塩基配列に、配列表の配列番号26で表されるpU−
31Bは領域Vの塩基配列に、配列表の配列番号27で
表されるpU−1Mは領域IIIの塩基配列に、配列表
の配列番号28で表されるpU−2Rは領域IIの塩基
配列の相補的配列にそれぞれ相同性が高い配列を有して
おり、これらのプライマーは共通プライマーとして有効
である。配列表の配列番号24〜28に示した5種のプ
ライマーのうち、例えばpU−O又はp16−1とpU
−2Rの対を用いればHPV6、HPV11、HPV1
6、HPV18、HPV31、HPV33のDNA配列
を、pU−31BとpU−2Rの対を用いれば良性型H
PVであるHPV6、HPV11のDNA配列を、pU
−1MとpU−2Rの対を用いれば悪性型HPVである
HPV16、HPV18、HPV31、HPV33のD
NA配列を特異的に増幅させることができる。
ローニングしたプラスミド、尖圭コンジローマ、子宮頸
がん及び前がん病変等の病理試料等を用いることができ
る。また、細胞、組織からのDNAの調製は、公知の確
立された方法を用いればよい。
を含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が、宝
酒造社から市販されており、上記のプライマー対を用
い、特定のDNA領域の増幅反応を行えば良い。増幅後
のHPV DNAは、例えばアガロースゲル電気泳動と
エチジウムブロマイド染色にて検出することができる。
アガロースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色で
増幅領域を確認できないときは、例えばドットハイブリ
ダイゼーション法を用いて検出することができる。
ハイブリダイゼーションするとき、例えば増幅領域内で
プライマー部位とは別の高いホモロジーを有する部位を
元にデザインした各型共通のオリゴヌクレオチドプロー
ブ(ユニバーサルプローブ)等を用いると便利である。
このプローブはハイブリダイゼーションにおける特異性
を高めるため、ミスマッチの起こりうる箇所に塩基を重
複させたミックスプローブ、あるいはその様な箇所をイ
ノシンに置き換えたプローブにすればよい。その様な配
列の例を配列表の配列番号29〜31に示す。
29で表されるpBU−1は、表2に示した高ホモロジ
ー領域のIVの塩基配列部分、配列表の配列番号31で
表されるpBU−3はIVの塩基配列部分を認識する共
通プローブである。また、配列表の配列番号30で表さ
れるpBU−2はHPV18の特異的塩基配列であり、
前出の文献記載の塩基番号の635〜663の部分に相
当する。例えば、悪性型の4種のHPVを同時に検出し
たい場合には、pBU−1とpBU−2を混合して使用
すればよい。
て、型の同定を行うには、例えば各型に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを用いればよい。悪性HPVの各
型に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの例を配列表
の配列番号32〜35に示す。配列表の配列番号32で
表されるpSB−16はHPV16に、配列表の配列番
号33で表されるpSB−18はHPV18に、配列表
の配列番34で表されるpSB−31はHPV31に、
配列表の配列番号35で表されるpSB−33はHPV
33に、それぞれ特異的なプローブである。
たプライマー対を用いて、各HPVDNAをPCR法で
増幅させたフラグメントを各HPVに特異的なプローブ
として用いることもできる。
ーDNAと同様の方法で合成・精製することができる。
該プローブDNAは標識化することにより、高感度な検
出が可能となる。標識化の方法としては、公知の方法な
らなんでもよいが、例えばT4ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いプローブDNAの5′末端を32Pで標識化す
るアイソトープ標識方法でも良いし、プローブDNAの
酵素標識、ビオチン−アビジン系での標識、またケミプ
ローブのようにプローブDNAにスルホン基を導入し、
それを抗体を用いて認識するような方法での標識方法等
の、非アイソトープ標識方法でも良い。
従来行われているハイブリダイゼーション法によるHP
V DNA配列の検出を行うこともできる。この場合、
配列表の配列番号24〜28に示した各共通プライマー
もプローブとして用いることができる。すなわち、pU
−O、p16−1若しくはpU−2Rを用いればHPV
6、HPV11、HPV16、H PV18、HPV3
1、HPV33を、pU−31Bを用いればHPV6、
HPV11を、pU−1Mを用いればHPV16、HP
V18、HPV31、HPV33を検出することができ
る。本発明の方法により検出することができるHPVの
うち、悪性型HPVとしては、前述のHPV16、HP
V18、HPV31、HPV33のほかに、例えばイト
ウら、又はマツクラらにより報告され、そのHPV D
NAがクローニングされている、HPV52b、HPV
58等があり〔キャンサー リサーチ(Cancer
Res.)、第48巻、第7164頁(1988)、1
990年5月30日、日本癌学会発行、第49回 日本
癌学会総会記事第123頁、講演番号第370番〕、こ
れらのHPVDNAも、本発明の方法により効率よく増
幅され、検出されうる。
PCR)後、更に内側のプライマー対により再びPCR
を行い(2次PCR)、感度よく目的DNAを検出する
方法すなわち二重PCR法を用いて、HPV DNAの
検出の感度をより高めることができる。すなわち、例え
ばプライマーpU−O又はp16−1と、プライマーp
U−2Rを用いて1次PCRを行い、良性型及び悪性型
HPVのDNAを増幅し、更に、プライマーpU−31
B及びpU−2Rを用いた2次PCRで良性型のHPV
DNAを、プライマーpU−1M及びpU−2Rを用
いた2次PCRで良性型のHPV DNAを、より効率
よく増幅し、感度よくHPV DNAを検出することが
できる。
Aを特定の制限酵素で処理した後、その切断パターン
を、例えば、アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロ
マイド染色により解析することにより、各HPVのタイ
ピングを行うことができる。例えば、p16−1とpU
−2Rの1次PCR後にpU−1M及びpU−2Rによ
り増幅されたHPV16DNAは、制限酵素AvaII
により切断され、電気泳動によって157 bp及び8
1bpのDNA断片が特異的に検出されて、増幅された
HPV DNAがHPV16であることが確認できる。
pU−1M及びpU−2R又はpU−31B及びpU−
2Rにより増幅された各HPV DNAと制限酵素の組
合せの例及び検出されたDNA断片の例を表3に示す
(表中−は制限酵素が作用しないことを示す)。
による切断パターンにより同定されなかったHPVは、
例えば、その未同定HPVが検出された試料より、ヒト
ゲノムDNAを調製し、好適なベクターを用いライブラ
リーを作成し、クローニングし、目的のDNAの塩基配
列を決定する。
VのDNAを増幅させるためのプライマー対をそろえて
キットとしておくことで、各型のHPVDNAを効率よ
く検出することができる。また、キット中にはユニバー
サルプローブ、各HPV型特異的プローブ、制限酵素等
を含有させておいても良い。なお、キットに用いる試薬
は溶液状でも良いし、凍結乾燥物でも良い。
れば試料中に存在する複数種のHPV DNAを一回の
反応で検出することができ、また、特定の制限酵素の切
断パターンや、型特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、各HPV型の簡便なタイピングが可能とな
る。更に、本発明のキットは新種のHPVのスクリーニ
ングにおいても有力な手段となる。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
R法によるHPV DNA特定領域の増幅
ーDNA及びプローブDNAの合成及び精製 PCR法により特定のDNA配列を増幅させるには、そ
の領域の5′末端より約20塩基のセンス配列及び3′
末端より約20塩基のアンチセンス配列のオリゴヌクレ
オチドプライマーDNAが必要である。またドットハイ
ブリダイゼーション法により感度良くHPV DNAを
検出する共通のオリゴヌクレオチドプローブDNAや、
タイピング用の型特異的オリゴヌクレオチドプローブD
NAが必要である。配列表の配列番号24〜35でそれ
ぞれ表されるプライマーDNA及びプローブDNAをア
プライドバイオシステムズ社のDNA合成機を用いて合
成し、脱保護の後、イオン交換HPLC(TSKゲル、
DEAE−2SWカラム)で精製し、セプ パク(Se
p−pak)C18(ウォーターズ社)で脱塩し、各D
NA約50μgを得た。
用いたHPV DNA特定領域のPCR法による増幅 それぞれHPV6、HPV11、HPV16、HPV1
8、HPV31、HPV33、HPV52b、HPV5
8DNAの全長が挿入されているプラスミド8種類を入
手した。なお、例えばHPV6 DNA全長が挿入され
たプラスミドは、pHPV6というように命名した〔p
HPV6;ジャーナル オブ ビロロジー、第40巻、
第932頁(1981)、pHPV11;ジャーナル
オブ ビロロジー、第44巻、第393頁(198
2)、pHPV16;プロシーディングス オブ ザナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ USA、第80巻、第3812頁 (198
4)、pHPV18;ジ エンボ ジャーナル、第3
巻、第1151頁(1984)、pHPV31;ジャー
ナル オブ ビロロジー、第58巻、第225頁(19
86)、pHPV33;ネーチャー、第321巻、第2
46頁 (1986)、pHPV52b;キャンサー
リサーチ(Cancer Res.)、第48巻、第7
164頁(1988)、pHPV58;1990年5月
30日、日本癌学会発行、第49回 日本癌学会総会記
事第123頁、講演番号第370番、及び同年7月3日
に行われた同総会での講演参照〕。これらプラスミドD
NA1ngを、0.5ml用チューブ(バイオビック
社)に取り、94℃、10分加熱処理した後、ジーン
アンプ キット (GeneAmpTMKit)(宝酒
造社)中の10μlの10×増幅用バッファー〔100
mM トリス・HCl、pH8.3、500mM KC
l、15mM MgCl2、0.1%(w/v)ゼラチ
ン〕、10μlの1.25mM dNTPの混合液(d
ATP、dGTP、dCTP、dTTP)、1μlの2
0μM pU−1Mプライマー、1μlの20μM p
U−2Rプライマー、0.5μlの5ユニット/μlの
タックポリメラーゼを加え、更に滅菌水を加えて100
μlの溶液にした。この反応液は上層に100μlのミ
ネラルオイル(シグマ社)を加えた後、自動遺伝子増幅
装置サーマルサイクラー(宝酒造社)により増幅反応を
行った。反応条件は94℃、1分の変性→55℃、2分
間のプライマーのアニーリング→72℃、2分間の合成
反応のサイクルを30サイクル行った。反応後上層のミ
ネラルオイルを除去した後、反応液の10μlを取り、
3%ヌシーブ(Nusieve)GTGアガロース−1
%シーケム(SeaKem)アガロース(FMC社)ゲ
ル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでDNAを染
色し、増幅されたDNAを確認した。前記8種類のHP
VプラスミドDNAを鋳型とした場合、pHPV16、
pHPV18、pHPV31、pHPV33、pHPV
52b、pHPV58からそれぞれ238bp、268
bp、232bp、244bp、231bp、244b
pのバンドが検出された。pHPV6、pHPV11か
らはバンドが検出されなかった。すなわちプライマー対
pU−1M及びpU−2Rは、悪性腫瘍で広く見出され
ている悪性型HPV16、HPV18、HPV31、H
PV33、HPV52b、HPV58DNAを特異的に
増幅していた。
タイピング (1−2)で増幅したDNA断片を含む反応液90μl
に、フェノールとクロロホルムの等量混合液90μlを
加え、静かにかくはんし、12000rpm、5分間遠
心後、水層を分離した。この水層に90μlのクロロホ
ルムを加え、静かにかくはんし、同様に遠心して水層を
分離した。この水層に9μlの3M酢酸ナトリウム、2
00μlのエタノールを加え、充分かくはんし、−70
℃、15分間放置後、12000rpm、10分間遠心
し、DNA断片を精製、回収した。沈殿は80%エタノ
ールでリンスした後、乾燥させ、34μlの滅菌水に溶
解した。このDNA溶液8.5μlに10×AvaII
反応用バッファー〔100mMトリス・HCl、pH
8.0、70mM MgCl2、600mM NaC
l、70mM2−メルカプトエタノール〕1μl、制限
酵素AvaII0.5μlを加え、全量を10μlの溶
液にした。この液を37℃、2時間反応させた後、反応
液全量を前記の3%ヌシーブGTGアガロース−1%シ
ーケムアガロース電気泳動し、エチジウムブロマイド染
色後、DNAの切断パターンを観察した。その結果、p
HPV16由来の断片は、157bpと81bpに、p
HPV18由来の断片は172bpと96bpに、pH
PV33由来の断片は、136bpと108bpに切断
され、3者の切断パターンははっきりと区別された。p
HPV31、pHPV52b、pHPV58由来の断片
は切断されなかった。次にこれら6種類をRsaIで反
応させたところ、pHPV31由来の断片のみが118
bpと114bpに切断された。同様にこれら6種類を
BglIIで反応させたところ、pHPV52b由来の
断片のみが176bpと55bpに切断された。最後に
これら6種類をAccIで反応させたところ、pHPV
58由来の断片のみが126bpと118bpに切断さ
れた。したがってAvaII、RsaI、BglII、
AccIの4種類の制限酵素を組合せることにより、プ
ライマー対pU−1M及びpU−2R由来の6種のDN
A断片は、すべてタイピングできることが確認された。
を用いたHPV DNA特定領域のPCR法による増幅
とタイピング (1−2)に記したHPV DNA全長が挿入されたプ
ラスミド8種類を鋳型に、プライマー対pU−31B及
びpU−2Rを用いてPCRを行った。反応液の組成、
温度サイクル、電気泳動法等は、(1−2)と全く同様
に行った。その結果、pHPV6、pHPV11を鋳型
にしたときに、両者とも230bpのバンドが検出され
た。pHPV16、pHPV18、pHPV31、pH
PV33、pHPV52b、pHPV58からはいずれ
もバンドは検出されなかった。すなわちプライマー対p
U−31B及びpU−2Rは、良性腫瘍で広く見出され
る良性型HPV6、HPV11DNAを特異的に増幅し
ていた。更にpHPV6、11由来の増幅DNA断片を
制限酵素RsaIで反応させたところ、pHPV6由来
の断片は134bpと96bpに、pHPV11由来の
断片は166bpと64bpに切断され、両者の切断パ
ターンは、はっきり区別された。これによりpU−31
B及びpU−2R由来の2種類のDNA断片は、制限酵
素RsaIでタイピングできることが確認された。
ライマーを用いたpU−1M及びpU−2R増幅断片の
高感度検出 pU−1M及びpU−2R増幅断片がアガロースゲル電
気泳動とエチジウムブロマイド染色で確認できないと
き、検出感度を上げるため、配列表の配列番号29〜3
1に示した型共通オリゴヌクレオチドプローブを用い
て、ドットハイブリダイゼーションを行った。まず型共
通プローブが、pU−1M及びpU−2R増幅断片との
み特異的にハイブリダイズすることを検討した。子宮筋
腫患者より得た健常な子宮頸部組織片100mgを解剖
はさみで充分細かく切った後、ポリスチレン製チューブ
に回収した。このチューブに100μg/mlになるよ
うにプロテネースKを加えたTEバッファー5mlを加
え、70℃、2時間処理した。この後(1−3)で示し
たようなフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈
殿を行い、約100μgのゲノムDNAを回収し、1μ
g/1μlとなるようにTEバッファーに溶かした。こ
の健常組織DNA液と、(1−2)、(1−4)で得た
PCR反応液を94℃、10分間処理し、氷中で急冷し
てDNAを変性させた。これらDNA液1μl分をナイ
ロンメンブラン(シュライヘルウントシュエル)上にス
ポットし、紫外線トランスイルミネーター(254n
m)に10分照射し、DNAをメンブランに固定した。
このメンブランは、プレハイブリダイゼーションバッフ
ァー(5×デンハーツ液、5×SSC、100μg/m
lサケ***DNA)10ml中で50℃、4時間プレハ
イブリダイゼーションを行った。次に32Pにて5′末
端をラベルしたプローブDNApBU−1、pBU−2
を加え、50℃、2時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブの32Pラベルはメガラベルキット(宝酒
造社)を用いて次のように行った。10pmol/μl
のプローブDNA1μl、1μlの×10リン酸化バッ
ファー、10μCi/μlの〔γ−32P〕ATP(ア
マシャム)5μl、10ユニットのT4−ポリヌクレオ
チドキナーゼ1μlを含む反応液に滅菌水2μlを加え
て10μlにし、37℃、30分間反応させた。反応後
65℃、10分間処理し、この反応液の2μl(約10
8cpm)をハイブリダイゼーションに用いた。ハイブ
リダイゼーション後メンブランを6×SSC、0.5%
SDSを含む洗浄液1で室温で数分洗浄し、続いて、2
×SSC、0.1%SDSを含む洗浄液2で50℃、1
0分間で2回洗浄した。メンブランは乾燥させた後、X
線フィルム(富士フィルム)を入れたカセット内で−7
0℃、1時間感光させ、オートラジオグラフをとった。
この結果、pU−1M及びpU−2Rで増幅したpHP
V16、pHPV18、pHPV31、pHPV33、
pHPV52b、pHPV58由来のDNA断片はpB
U−1、pBU−2混合プローブとハイブリダイズし、
ドットが現れた。その他pU−31B及びpU−2Rで
増幅したpHPV6、pHPV11由来のDNA断片
や、健常子宮頸部組織DNAからは、ハイブリダイゼー
ションは全く認められなった。この結果は、混合プロー
ブpBU−1、pBU−2により、悪性腫瘍で広く見出
されるHPV16、HPV18、HPV31、HPV3
3、HPV52b、HPV58DNAが特異的に検出で
きることを示すものである。そこで、このプローブのド
ットハイブリダイゼーションによる検出限界を、pHP
V16を用いたモデル実験系をつくり、検定した。ヒト
の全ゲノムDNAの鎖長を3×109bpとして、pH
PV16が10コピー/ゲノムDNAとなるように、p
HPV16を健常な子宮頸部から上述で得たゲノムDN
Aにて希釈した。すなわち、406pgのpHPV16
を10μgの健常なゲノムDNAで希釈した。これを健
常なゲノムDNAで順次10倍希釈し、pHPV16の
10〜10−6コピー/ゲノムDNAのモデルテンプレ
ートDNAを段階的に調製した。各モデルテンプレート
DNA1μgを用いて、(1−2)に示した方法でPC
RによりDNA断片を増幅させた。更に上述に示した方
法で、ドットハイブリダイゼーションを行った。この結
果10−6コピー/ゲノムDNAまでドットが検出され
た。pHPV18、pHPV31、pHPV33、pH
PV52b、pHPV58についても同様のモデル実験
を行ったが、同じ結果を得た。すなわち、pBU−1、
pBU−2の混合プローブを用いれば、PCR後のドッ
トハイブリダイゼーションにより、細胞当り10−6コ
ピーのHPV DNAの検出が可能であることが確認さ
れた。
ライマーを用いたドットハイブリダイゼーションによる
タイピング pBU−1、pBU−2混合プローブにより型に関係な
く検出してきた試料をタイピングするため、配列表の配
列番号32〜35に示した型特異的オリゴヌクレオチド
プローブを用いた。上述のpHPV DNA8種類各1
ngを鋳型として、(1−2)で示した方法でプライマ
ー対pU−1M及びpU−2RによりPCRを行った。
この反応液及び(1−5)で調製した健常子宮頸部組織
DNA各1μlをナイロンメンブランにスポットした。
同じメンブランを4枚準備し、配列表の配列番号32〜
35に示すプローブpSB−16、pSB−18、pS
B−31、pSB−33を、順に各メンブランと別々に
ハイブリダイズさせた。この結果、順にpHPV16、
pHPV18、pHPV31、pHPV33由来増幅断
片をスポットした箇所にのみ強いドットが現れ、他の箇
所には全くハイブリダイゼーションは認められなかっ
た。これらより、配列表の配列番号32〜35の型特異
的オリゴヌクレオチドプローブ群は、配列表の配列番号
29〜31のユニバーサルプローブでの検出後のタイピ
ングに有効であることが確認された。
(1次PCR)後、更に内側のプライマー対により再び
PCRを行い(2次PCR)、感度よく目的DNAを検
出する方法、すなわち二重PCR法が知られている。二
重PCR法によるHPVの検出を行うために、(1−
2)で示したプラスミド pHPV6、pHPV11、
pHPV16、pHPV18、pHPV31、pHPV
33、pHPV52b、pHPV58それぞれ1ngを
プライマーp16−1及びpU−2Rを1次PCR用プ
ライマーとして用いて(1−2)に示した方法で30サ
イクルPCRを行った。次に、1次PCRの反応液0.
5μlを新しい0.5ml用チューブ(バイオビック
社)により、(1−2)と同様にプライマーpU−1
M、pU−2Rを用いて、15サイクル2次PCRを行
った。その結果、pHPV16、18、31、33、5
2b及び58からそれぞれ増幅DNAが認められた。更
に、それぞれのウイルス型は(1−3)と同様に制限酵
素、AvaII、RsaI、Bgl II及びAccI
の切断パターンにより同定できた。また、2次PCRに
おいて、プライマーとしてpU−31B及びpU−2R
を用い、(1−4)と同様に15サイクル2次PCRを
行った結果、pHPV6及びpHPV11のみに増幅が
認められ、更に、RsaIの切断パターンによりHPV
6とHPV11が識別できた。また、p16−1のかわ
りにpU−Oを用いた場合、その検出感度は10倍に上
昇した。
DMAの検出 39例の子宮頸がん摘出組織約100mgより(1−
5)の方法により、ゲノムDNAを約100μg得た。
これらのゲノムDNA1gを94℃、10分間熱変性さ
せた後、ジーン アンプ キット中の10μlの×10
バッファー、16μlの1.25mM dNTP混合
液、0.5μlの5ユニット/μlタックポリメラー
ゼ、及びセンスプライマーpU−1M 1μl、アンチ
センスプライマーpU−2R 1μlを加え、滅菌水を
加えて100μlの液を調製した。(1−2)の方法に
よりPCRとその後のアガロースゲル電気泳動、制限酵
素によるタイピングを行った。
り、全体で33例(84.6%)にHPV DNAを検
出した。
HPV18、HPV18+HPV33、HPV18+H
PV58)であり、4試料中からHPV16、HPV1
8、HPV31、HPV33、HPV52b、HPV5
8以外の悪性型HPVが検出された。
5例中より、全体で13例(52.0%)HPVDNA
を検出することができた。
HPV58、HPV16+HPV31)であり、1試料
中からHPV16、HPV18、HPV31、HPV3
3、HPV52b、HPV58以外の悪性型HPVが検
出された。
成 試料中のHPVを増幅、検出するためのキットを作成し
た(表6及び表7)。1次PCR増幅用プライマーとし
てpU−O及びpU−2Rが各20μM溶液となるよう
にTEバッファーに溶解し、1次PCRプライマー液
(A剤)とした。同様に、プライマーpU−1M及びp
U−2Rを含む2次PCR悪性型HPVプライマー液
(B剤)、プライマーpU−31B及びpU−2Rを含
む2次PCR良性型HPVプライマー液(C剤)を作成
した。DNA検出用プローブとして、pBU−1及びp
BU−2が各10μM溶液となるようにTEバッファー
に溶解し、悪性型HPV検出用プローブ液(D剤)とし
た。同様に、プローブpBU−3を含む良性型HPV検
出用プローブ液(E剤)、pSB−16を含む悪性型H
PV16型特異的プローブ液(F剤)、pSB−18を
含む悪性型HPV18型特異的プローブ液(G剤)、p
SB−31を含む悪性型HPV31型特異的プローブ液
(H剤)、pSB−33を含む悪性型HPV33型特異
的プローブ液(I剤)を作成した。また、増幅断片を制
限酵素の切断パターンによりHPVのタイピングを行う
ために、タイピング用制限酵素AvaII液(J剤)、
RsaI液(K剤)、BglII液(L剤)、AccI
液(M剤)、AvaI液(N剤)を作成した。本キット
を用いて、実施例1、2と同様にHPVを増幅・検出す
ることができた。
り、良性型及び/又は悪性型HPVに共通な遺伝子領域
が見出され、この領域の遺伝子配列を検出することによ
り、試料中の良性型及び/又は悪性型HPVの簡便かつ
高感度な検出方法が提供された。また、各HPV型に特
異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションや制限
酵素処理によって、各HPVのタイピングを簡便に行う
ことが可能となった。
Claims (2)
- 【請求項1】 良性型及び/又は悪性型ヒトパピローマ
ウイルスの検出方法において、該ヒトパピローマウイル
スのDNA配列を、配列表の配列番号26及び/又は配
列番号27で示される塩基配列のプライマーと、配列表
の配列番号28で示される塩基配列のプライマーの組合
せを用いて検出することを特徴とするヒトパピローマウ
イルスの検出方法。 - 【請求項2】 請求項1記載の方法を用いてヒトパピロ
ーマウイルスの検出を行うための検出キットであって、
配列表の配列番号26及び/又は配列番号27で示され
る塩基配列のプライマーと、配列表の配列番号28で示
される塩基配列のプライマーの組合せを含有しているこ
とを特徴とするヒトパピローマウイルスの検出キット。
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---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (3)
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---|---|---|---|
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JP2-217067 | 1990-08-20 | ||
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IT1316070B1 (it) * | 2000-05-05 | 2003-03-28 | Bioanalisi Ct Sud Snc Di Perse | Metodo e mezzi per l'identificazione di virus hpv |
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-
1991
- 1991-08-19 JP JP3230839A patent/JP2785164B2/ja not_active Expired - Fee Related
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