JPH06502171A - 長期凝血時間の処置のための薬品製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 長期凝血時間の処置のための薬品製剤 本発明の分野 本発明はＥＰＩ活性をブロックする試薬及び止血のバランスに影響するであろう 製剤を製造するためのこれらの試薬の利用に関する。

発明の背景 凝血は数多くのタンパク質因子を包括する複雑な過程である。この凝血過程は外 来表層との接触を通じての内因性経路を介して、又は損傷した組織との接触を通 じての外因性経路を介して開始されつる。外因性活性化により、循環血液は組織 因子（ＴＦ）と接触する。ＴＦは凝固因子Ｖ［（ＦＶＩＩ）のための補助因子で あり、そしてＴＦ−ＦＶ１１／丁Ｆ−ＦＶＩＩａ複合体はＦＸ及びＦＩＸを活性 化する。ＦＩＸの活性化に基づき、「内因性凝血」はＴＦの活性化によっても影 響され、そして増加し続けている証拠はＴＦ−ＦＶｌｌの活性化が凝固反応の開 始に最も重要であることを示唆している（ＯｓｔｅｒｕｄとＲａｐａｐｏｒｔ、 　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７４．頁５２６０．１９７７）。外因性経路の凝固因子はＬＡ ＣＩとも呼ばれる（　ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅｔｉｃｈ、　Ｂｌｏｏｄ　６９．頁 １５０．１９８７）　ＥＰｒ　（外来性経路インヒビター）により阻害される。

ＥＰＩはＦＸａに結合し、且つ、阻害するクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型プロテア ーゼインヒビターである。

ＥＰ　［−ＦＸａ複合体はＦＶＩＩａ−ＴＦを阻害する（Ｒａｐａｐｏｒｔ、　 Ｂｌｏｏｄ　７３゜頁３５９．１９８９）。凝血反応にとってのＥＰＩの有意性 は未だ確立されておらず、なぜなら非生理学的な高濃度でしか常用の凝血アッセ イにあり、且つ、ＥＰ　［−ＦＸａがＦＩＸ　又ｉ；！ＦＸを活性化しうるＴＦ −ＦＶＩＩ反応体に加えられている複雑なアッセイにおいて測定されている。

（Ｂａｊａｊ　ら著、　Ｊ　Ｃｌ１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　７９．頁１９７４．１９ ８７　；　５ａｎｄｓｅｔら著。

Ｔｈｒｏｍｂ　Ｒｅｓ　４７．頁３８９．１９８７）。

正常な止血においては、凝固因子は互いにバランスがとられている。しかしなが ら一定の環境においては過剰な出血が観察される。

その例は、ＦＶＩＩ［又はＦＩＸの欠失により起こる血友病、血小板の数の減少 により起こる突発性血小板減少症（ＩＴＰ）である。更に、手術はしばしば過剰 な出血をもたらす。出血を阻止するのに利用さｎうる試薬の例は：ＦＩＸ、　Ｆ Ｖｌｒｌ、　ＦＶＩＩＩａ、アプロチニン及びトラネキサム酸である。

発明の開示 本発明は、ＥＰＩ活性をブロックする試薬が、出血性を引き下げることもできる ことを示す。これは驚くべきことであり、なぜならＥＰＩ自体は止血のバランス に作用することは認められていなかったからである。しかしながら、我々は以下 の新しい所見を述べる。

１　凝血アッセイにおいて、血漿ＥＰ■は組換工学により生産したＥＰ［（ｒＥ ＰＩ）よりもより活性である。

２、非常に希薄なＴＦにより誘発される凝血は血漿ＥＰ［に依存し、従ってＥＰ Ｉは止血のバランスに作用する。

３、ＥＰＩ活性をブロックする抗体（抗ＥＰＩ）は正常血漿の凝血時間を短縮す る。

４、抗ＥＰＩは血友病の血漿の凝血時間を短縮する。

これらの所見は、ＥＰＩのブロッキングが出血性を引き下げるであろうことを示 唆する。

従来、正常血漿における凝血時間を促進することは凝血開始剤（組織因子、カオ リン、他）又は活性酵素（トロンビン、ＦＸａ　、他）を加えることによっての み可能であった。我々の実験は血漿タンパク質（ＥＰ’Ｉ）をブロックすること により凝血過程を促進することも可能である証拠を提供する。

内因性凝血は通常、カオリン、リン脂質及びＣａｌ＊により凝血を開始せしめる ＡＰＴＴアッセイにおいて測定される。ＡＰＴＴアッセイを行うには高濃度のＥ ＰＩが必要とされる（Ｂｒｏｚｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９．頁７５ ３９゜１９９０）。外因性凝血は、組織因子（脳油出物）及びＣａ”＋により凝 血を開始せしめるＰＴアッセイにおいて測定する。この標準のアッセイにおいて 、希釈していない組織因子が利用され、モしてＥＰＩの添加は観察する凝血時間 にわずかにしか影響しない（例２を参照のこと）。

組織因子溶液をかなり希釈したときにはより生理学的なアッセイが達成される。

従って、凝血時間は外因性及び内因性凝血因子に依存するようになる（　Ｂｒ１ ｎｋｈｏｕｓら著、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６． 頁１３８２、１９８９）　、図１は、ｒＥＰＩの添加が、加えたＥＰＩ単位それ ぞれにつき約２秒凝血時間を長くすることを示す。驚くべきことに、ＥＰｆへの 抗体の添加は（ＩＥＰｒ単位の除去）は凝血時間を３０秒短縮する。

二の作用か本当にＥＰＩの阻害に原因するかを確認するコントロール実験を実施 した。

以下の結果が見い出せた Ａ、過剰な抗体の添加は凝血時間を更に短縮しなかった。

Ｂ、ＥＰｌ活性阻害アッセイにおける抗体の力価は、凝血時間短縮アッセイにお いて観察される力価に相当する。

Ｃ３抗体は、セファローズに結合させた高純度ｒＥＰ　ｒによりアフィニティー 哨製された。得られるＩｇＧ沈殿物は、凝血時間短縮に対して及びＥＰＩ活性に 対して、ｍｇベースで力価において１０倍の上昇を示しＤ　凝血時間を短縮する のに真に十分な量の抗体を加えたとき、この抗体を含まない血漿の添加と比べ、 ｒＥＰＩの添加は凝血時間延長により強い効果を育した（図２）。

Ｅ、　ＥＰＩ欠乏血漿を免疫吸着により正常血漿から調製した。この血漿は正常 血漿に比べて短い凝血時間を有していた。凝血分析における抗体の添加はこの欠 乏血漿の凝血時間を更に短縮しなかった。

ＥＰＩをブロックする抗体は文献に記述されている（Ｎｏｖｏｔｎｙら著。

Ｂｌｏｏｄ　７２．頁２０２０．１９８９）　、しかしながら、抗体による血漿 ＥＰＩの阻害は記述されておらず、且つ、かかる抗体が凝血、その結果として止 血のバランスに有意義な直接的効果を育しうることは考えられていなかった。

ＥＰｒを測定するため、Ｎａｖｏｔｎｙらは複雑な３段Ｉｖ凝血アッセイを利用 している。ＥＰＩサンプルをまずＴＦとインキュベートし、ＦＶＩＩａ。

ＦＸ及びＣａ　２　＋を加える。次にＦＸを加え、次いで１分後、インキュベー トしたＦＸ欠乏血漿及びウサギセファリンを加える。このアッセイにおいて、Ｅ Ｐ１はＴＦ活性を阻害し、そして抗ＥＰＩ抗体がＥＰＩの作用を阻害することが 示される。

１段階凝血アッセイにおいて、Ｃａ”＋とＴＦの混合物を血漿に加え、次いで凝 血時間を記録する。かかるアッセイにおいてＢｒｏｚｅらは（Ｂｉｏｃｈｅｍｊ ｓｔｒｙ　２９．頁７５４３．１９９０）　、明らかなるＴＦ活性においてちょ うと５０％の低下を得るために２．５μｇのＥｔＩ／ａ＋１　（５０Ｕ／ｍｌ） を加えることが必要であることを見い出している。

驚くべきことに、血漿に抗−ＥＰｒを加えることは（ＩＵのＥＰ１を除去する） 、凝血が希薄ＴＦにより直接開始されるときに、凝血時間に有意に影響すること を我々は見い出した。この凝血アッセイは生理的状態を擬態し、なぜならこれか 、正常な止血を達成せしめるのに必要とされるＦＶ）Ｉ、　ＦＶＩＨ及びＦＩＸ の全ての因子の存在に依存性である唯一のタイプの凝血アッセイであるからであ る。

更に、血漿ＥＰＩが精製されている（ＮｏｖｏｔｎＹら著、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ。

２６４、頁１８８３２．１９８９）。しかしながら、血漿ＥＰＩか凝血に対して 、少なくともＥＰ［の阻害が止血のバランスに影響するであろう程度に有意義な 効果を有していることは観察されていない。従って、ＥＰＩの生理学的重要度に 関する証拠を提供すべきことが残っていることが強調されていた（Ｂｒｏｚｅ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９．頁７５３９．１９９０）　。血漿εＰＩが 血漿の凝固時間に存意に影響するという我々の所見は、ＥＰＩが止血のバランス にとっての重要な役割を育していることの証拠を提供する。更に、我々の実験は ＥＰ［のブロッキングが出血性を引き下げることが可能である証拠を提供する。

発明の概要 第１の観点において、本発明は長期凝血時間を有する患者の処置のための薬品製 剤に関連し、ここでこの製剤は活性成分としてＥＰｒインヒビターを含む。

第２の観点において、本発明は長期凝血時間を有する患者を処置するための方法 に関連し、ここではＥＰ［インヒビターを含む製剤を患者に投与する。

第３の観点において、本発明は長期凝血時間を有する患者の処置のだめの薬品製 剤の製造のためのＥＰ［インヒビターの利用に関する。

実験の章 細胞から得た。ｒＥＰ　Ｅはヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、イオ ン交換及び逆相クロマトグラフィー（Ｎｏｒｄｆａｎｇら著、　Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔ、頁９８．１９９０）により精製した。この方法により 得られたｒＥＰ　ＩはＳＤＳ　−ＰＡＧＥの判定により純粋であった。ウサギを ０．１４゜３５日目、続いて２１日の間隔を置いて免疫した。最初の免疫はフロ イントの完全アジュバントを伴い、次の免疫はフロイントの不完全アジュバント を伴った。得られた抗血清をＥＰｆ活性アッセイにおいてＥＰＩ活性の阻害につ いて試験し、そしてこの阻害はベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）アッセイにおける ＦＶＩＩＩ阻害抗体のように定量した：等容量の希釈抗血清とＥＰＩ（Ｕ／ｍｌ ）を３７°Ｃで２時間インキュベートした。ＥＰＩ活性を測定し、そして活性を ５０９＋５阻害する抗血清の希釈率が力価を示す。このウサギ抗血清はｒＥＰＩ 及びヒト血漿ＥＰＩの両方の対する１０００〜４０００　ｒベセスダ様」単位／ ｍｌの阻害力価を有していた。５０倍以下の希釈率の非免疫ウサギに由来する血 清はＥＰＩサンプルの活性（Ｉ　Ｕ／ｍｌ＞に影響を及ぼさなかった。ＩｇＧを 険イオン交換クロマトグラフィーによって抗血清から精製した。８ｍｇのＩｇＧ ／ｍｌを有するＩｇＧ沈殿物は、ヒト血漿ＥＰＩに対して２００Ｏｒベセスダ一 様」阻害単位／［＋１１を含んでいた。

ＥＰＩ活性についてのアッセイ：ＥＰＩは５ａｎｄｓｅｎらの方法（Ｔｈｒｏｍ ｂ。

Ｒｅｓ　４７．頁３８９．１９８９）に従って改良した色素マイクロブレートア ッセイで測定した。熱処理血漿プールを標準品として利用した。この標準品はＩ Ｕ／ｍｌのＥＰＩ活性を含むように設定されている。標準品及びサンプルを、２ μｇ／ｍｌのポリブレン及び０．２％の牛血清アルブミンを含む緩衝液Ａ　（０ ，０５Ｍのトリス１０．１ＭのＮａｃｌ／　０．１ＭのＮａ−クエン酸塩１０． ０２％のＮａＮ＊／　ｐＨ８，０）に希釈した。ＦＶＩＩａ／ＴＦ／ＦＸ／Ｃａ Ｃ１ｘ　１ｍ合せ試薬を緩衝液Ａの中で調製し、そしてこれは１．６ｎｇののＦ ＶＩＩａ　（ノボ　ノルディスクＡ／Ｓ）、６０倍希釈ヒト組織因子（）Ｉｊｏ ｒｔ、　５ｃａｎｄ　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ　９．１９５７）　 、５０ｎｇ／ｍｌのＦＸ（シグマ）及び１８ｍＭのＣａＣ１，を含んでいた。ア ッセイはマイクロブレートストリップにおいて３７℃で行った。５０μｌのサン プル及び標準品をこのストリップの中に分注し、次いで各ウェルに１００μｍの 組合せ試薬を加えた。１０分のインキュベーション後、５０μｌのＦＸ（３，２ μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、そして更に１０分経過後、ＦＸａに対する色素 基質（Ｓ２２２２）２５μｍを加えた基質の添加の１０分後。反応を１．０Ｍの クエン酸、ｐＨ３，０の添加により停止させた。マイクロタイタープレートを４ ０５ｎｍで測定した。

凝血アッセイ：　ＡＣＬ凝固装置を用いて凝血活性を測定した。２０μｍの抗体 溶液又はＥＰＩ溶液を２００μｌの血漿を１５分間室温でインキュベートした。

３７°Ｃに予備加熱した後、ＡＣＬは７５μｌの血漿サンプルと、２０ｍＭのＣ ａＣ１ｇ　、　５０ａ＋ＭのＮａＣ１，１７ｍＭのイミダゾール、３３μｇ／ｍ ｌのＢＳＡ、　ｐＨ７，４中に希釈したＴＦ７５μｍとを混合する。

例１ 凝血アッセイは２０．０００倍希釈の組織因子を利用して前記の通りに実施した 。表１は１０人のドナーのサンプル、７種の血友病Ａサンプル、及び１種の血友 病Ｂサンプルに対して抗ＥＰＩを添加した効果を示す。凝血時間のかなりの短縮 が、特に血友病サンプルに関して認められた。これらのデーターは、損傷を受け た内因性凝血経路（血友病Ａ及びＢ）の場合における強力な外因性ＦＶｒｒ依存 性経路の、仮説的な高い重要性に反映する。

表１１個体血漿サンプルの凝血時間に対する抗εＰＩの効果。

例２ 凝血アッセイを種々の希釈率のＴＦを用いて、正常血漿プールにより実施した。

表２はＴＦをより希釈すると、血漿に対する抗ＥＰＩの添加の効果がより顧著と なることを示す。これは凝血時間か長いほど、抗ＥＰＩは凝血時間の短縮におい てより有効となることを示す。

表２ 凝血時間の関数としての抗ＥＰＩ又はＥＰＩの添加の効果。

例３ クエン酸塩血漿を心肺バイパス手術（ＣＰＢ）後の患者から採血した。

この手順において、この患者は大量のヘパリンにより抗凝血処置されている。手 術後、ヘパリンはプロタミンスルフェートの注射により中和される。色素ＦＸａ 阻害分析による測定により、この血漿サンプルはヘパリンを含んでいなかった。

５ａｎｄｓｅｔ　ＥＰｒアッセイにおいて、このサンプルは２Ｕ／ｍＩのεＰＩ 活性を含んでいた。表３は、抗ＥＰＩの添加の前後でのこの血漿の希釈ＴＦ凝血 時間を示す。凝血時間ＥＰ［のレベルは、なぜＣＰＢ患者が手術の最中及び後に 出血するかの原因の１つでありうる。

例４ ヘパリン結合性タンパク質（Ｉ（ＢＰ）　ＷＯ３９１０８６６６はエラスターゼ に対して高い相同性を示す好中球由来のタンパク質である。ＨＢＰはそれ自体酵 素ではないが、しかし酵素インヒビターに結合するようである。ＥＰＩアッセイ において試験したとき、ＥＰＩに対するＨＢＰの力価は１０　ｒベセスダ様ｊ単 位／ｍｇである。）ＩＢＰは関連の力価をもって、ＥＰ［によるＦＸａの阻害を ブロックもする。１５０μｇ／ｍｌの濃度において正常血漿に加えると、希釈Ｔ Ｆ誘発凝血時間は短くなる（表４）。

表４．正常血漿の凝血時間に及ぼすＨＢＰの効果。

添加ｒＥＰＩの関数としての希釈ＴＦ誘発凝血時間付゛晶郭を檄 加えたＥＰＩ（０）又はＥＰＴに対する抗体（０）ＦＩＧ、　］ 血漿及び抗ＥＰＩを伴う血漿の希釈ＩＦ誘発凝血時間ＥＰＩ　Ｕ／ｍ１ ＦＩＧ、２ 国際調査報告 １−＋−−＋＋−−＋ｎ−ｅ＋、ｅ−＋１＝ｗ−、ＰＣＴ／ＤＫ　９１１００３ １７Ｉ際調査報告 ＰＣＴ／ＤＫ　９１１００３１７ １！ □ フロントページの続き （８１）指定国　Ｅｐ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＮＬ、ＳＫＲ，ＬＫ、ＭＣ，ＭＧ 、ＭＷ、ＮＯ，ＰＬ、Ｒ○、ＳＤ、ＳＵ、ＵＳ ；ル デンマーク国、デーコー−２８００リュングビュ、リュンゲン　２０アー

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．長期凝血時間を有する患者の処置のための薬品製剤であって、この製剤が活 性成分としてＥＰＩインヒビターを含むことを特徴とする薬品製剤。
2. ２．凝血機能不全が血友病Ａ又はＢに原因する、請求項１に記載の薬品製剤。
3. ３．凝血機能不全が突発性血小板減少症（ＩＴＰ）、手術手順又はＤＩＣに原因 する、請求項１に記載の薬品製剤。
4. ４．長期凝血時間を有する患者を処置するための方法であって、治療的に有効な 量の請求項１に記載の製剤をこの患者に投与することを含んで成る方法。
5. ５．凝血機能不全が血友病Ａ又はＢに原因する、請求項４に記載の方法。
6. ６．凝血機能不全が突発性血小板減少症（ＩＴＰ）、手術手順又はＤＩＣに原因 する、請求項４に記載の方法。
7. ７．長期凝血時間を有する患者の処置のための薬品製剤の製造のためのＥｐＩイ ンヒビターの利用。