JPH06501931A - 抗接着性抗体を用いるエンドトキシンショックの治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗接着性抗体を用いるエンドトキノンンヨックの治療法発明の分野 本発明は抗接着性抗体を用いる新規なエンドトキシンショックの治療法に関する 。特に本発明は抗−ＣＤ１８抗体および抗−ＩＣＡＭ−１抗体を用いるエンドト キシンショックを治療するための方法に関する。

発明の背景 細胞接着は、それを介して白血球が細胞基質、例えば内皮細胞を攻撃して循環系 から炎症部位に移動し、外部侵略者、例えばバクテリアやウィルスからホストを 適切に防御するためのプロセスである。防御システムに関する優れた報文はアイ ゼン・エイチ・ダブリユウ著ｒマイクロバイオロジー」第３版（）１−バー・ア ンド・ラウ、フィラデルフィア、ピー・ニー（１９８０）、第２９０−２９５頁 および第３８１−４１８頁）に記載されている。

接着工程に関与する内皮細胞の表面上の分子の一つは細胞間接着分子ＩＣＡＭ− １である。ロースレインら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ　、　ｌ　ｍ ｍｕｎｏｌ、　）、１３７　；　１２７０（１９８６）を参照されたい。これを 本明細書の一部とする。この分子は白血球の細胞表面上に存在するＣＤ１８群の 糖蛋白の分子に結合することにより、接着を仲介する事が知られている（サンチ ェッツーマドリットら、ジャーナル・オブ・エキスベリメンタル・メディシン（ Ｊ　、　Ｅ　ｘｐｅｒ、　Ｍｅｄ、　）、１５８：１７８５（１９８５）＋カイ ザーら、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロン−（Ｅｕｒ　Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ）１５　：　１１４２（１９８５））。この糖蛋白類は１本のα鎖と１ 本のβ鎖を有するヘテロダイマーから構成されている。各蛋白のα鎖は相互に異 なり、β鎖は高度に保護されていることがわかった（サンチェツツーマドリット ら、前掲）。糖蛋白類のβ鎖（時に”ＣＤ１８”と言う）は９５ｋｄの分子量を 有し、α鎖は１５０ｋｄから１８０ｋｄの間で変動することが判明した（スプリ ンガー、ティー、フエデレーンヨン・プロン−ディンゲス（Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ 、　）４４　：　２６６０（１９８５））。膜蛋白のαサブ・ユニットはβサブ ・ユニットによって共有されている広がった相同を共有していないが、糖蛋白の αサブ・ユニットの厳寒な分析の結果、それらの間に実質的な類似性のあること がわつかった。

ＣＤ−１８群には３種類の主要なメンバー　Ｍａｃ−１，ＬＦＡ−１およびｐ１ ５０．９５がある。Ｍａｃ　１はマクロファージ類、顆粒球類、および大顆粒状 白血球上に見いだされるヘテロダイマーである。ＬＦＡ−１は殆どの白血球上に 見いだされるヘテロダイマーである（スプリンガーら、イムツール　レブ（Ｉ　 ｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｒ、）　６８　：　１１Ｈ１９８２））。ｐ１５０．９５は Ｍａｃ−１ｉ：類似の組織分布を有し、同様に細胞接着に関与する（カイザーら 、ユーロビアン・ンヤーナル・オブ・イムノロン−１５：　１１４２（１９８５ ））。ＬＦＡ−１関連糖蛋白のαおよびβサブ・ユニット間の類似性の報告はサ ンチェソツーマドリンドら（前掲）およびサンチェッツーマドリッドら、ジャー ナル・オブ・エキスペリメンタル・メディンン　１５８　：　５８６（１９８３ ）Ｉこより行われている。

抗−ＣＤ１８抗体はウサギの出血性ショックの治療に有用であると述べられてい るベノダーら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステイゲイション（Ｊ。

Ｃ１１ｎ、Ｉｎｕｅｓｔ、）　８１：９３９（１９８８）。抗−ＣＤ１８抗体は これをウサギの好中球接着を阻止するために用いるとき、敗血症に対する感受性 を増加しないことが分かった（ミレスキーら、サーノカル・フォーラム・インフ エク７ヨン・アント・イン７・メディエータ−ｐ１０７　（１９８９））。

米国特許第４．３８８．３１８号明細書にはピリミド−ピリミジン誘導体を用い たエンドトキシンショックの治療法が開示されている。米国特許第４．４７２． ４２０号および４　４７２．４３１号明細書にはベノキサプロフエンとフエノプ ロフニシを用いたンヨ、・りの治療法が開示されている。

しかしながら、本発明前には抗−ＩＣ，−１，Ｍ−１抗体を用いたエンドトキン ン／ヨノクの治療法については知られていなかった。

したがって、本発明の目的は抗−ＣＤ１８抗体および抗−ＩＣＡ〜１−１抗体を 用いたエンドトキンンノヨノクの新規な治療法を提供することにある。

第１図の簡単な説明 第１図は敗血症（エンドトキシン）ショックにかかったウサギを生理食塩水また はモノクローナル抗−ＩＣＡＭ−１抗体Ｒ６，５で処置したときの生存率をグラ フで示したものである。

発明の説明 本発明は患者に治療上有効な量の抗−ＣＤ１．８抗体または抗−ＩＣＡＭ−１抗 体またはそれらのフラグメントを投与するエンドトキンンンヨソクの治療法に関 する。

本発明に有用な抗−ＣＤ１８抗体および抗−ＩＣＡＭ−１抗体は公知の方法、例 えばポリクローナル血清の免疫精製法により、／シブリドーマ技術により、ある いは組み替えＤＮＡ技術を用いて調製できる。コーラ−ら、ピー・エヌ・エイ・ ニス　ＵＳＡ　７７（４）：２１９７（１９８０）および米国特許第４．８１６ ．３９７号明細書参照。

好ましくは抗−ＣＤ１８抗体および抗−ＩＣＡＭ−１抗体はモノクローナル抗体 である。モノクローナル抗−ＣＤ１８抗体は以下の方法で調製できる。マウスを ’：Ｄ１８含有細胞で免疫化する。次いで、マウスを殺し、その膵臓を取り出す 。

膵臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを得る。このハイブリドーマを 培養し、その浮遊物を抗−ＣＤ１８活性に関し、エリザもしくはアール・アイ・ エイにより、またはロースレインら（前掲）に記載された凝集アッセイ法により スクリーニングする。モノクローナル抗体を所望の抗−ＣＤ１８抗体を分泌する ハイブリドーマをクローン化し、培養する。モノクローナル抗−ＩＣＡＭ−１抗 体はまずマウスをＩＣＡＳｉ−１またはＩＣＡＭ−１含有細胞で免疫化すること により、同様の方法で調製できる。

患者に抗−ＣＤ１８抗体または抗−ＩＣＡＭＩ抗体を投与するための方法として は、たとえば内皮、皮下、筋肉内、腹腔内、および静脈内投与がある。好ましく は抗−ＣＤ１８抗体または抗−ＩＣＡＭ−１抗体の投与は種々のアジュバントの 存在下に抗−Ｃｔ）１８抗体または抗−ＩＣＡＭ−１抗体皮下または筋肉的注射 を利用する。投与されるべき抗−ＣＤ１８抗体または抗−ＩＣＡＭ−１抗体の量 はショックの強さ、投与ルートなどによって変わるが、一般には０．１ｍｇ／ｋ ｇからＩＱｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上を患者に投与してもよい。抗−ＣＤ１８ 抗体または抗−ＩＣＡＭ−１抗体は適当なアジユバント、例えば無機物のゲル、 例えば水酸化アルミニウム：表面活性物質、例えばリゾレシチン；プルロニック ・ポリオール：ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョンなどと配合してもよ い。

抗−ＣＤ１８抗体または抗−ＩＣＡＭ−１抗体は本発明において完全な抗体とし て、あるいはフラグメントとして利用し得る。抗−ＣＤ１８抗体または抗−■Ｃ ＡＭ−１抗体フラグメントは少なくとも抗−ＣＤ１８抗体または抗−ＩＣＡＭ＝ １抗体の結合部位を含まなければならない。有用な抗−ＣＤ１８抗体または抗− ＩｃＡＭ−１抗体のフラグメントはＦａｂおよびＦ（ａｂ）ｚフラグメントを含 む。抗−ＣＤ１８抗体または抗−ＩＣＡＭ−１抗体は公知の方法、例えば抗体の 蛋白分解酵素による消化または組換ＤＮＡ技術により調製してもよい。

本発明を以下の実施例により説明する。

実施例Ｉ Ａ、モノクローナル抗−ＣＤ１８抗体（Ｒ１５，７）の調製モノクローナル抗− ＣＤ１８抗体、Ｒ１５，７をエンドマンら、ジャーナル・オブ・クリニカル・イ ンベスティゲイション８５：　１４９７（１９９０）に記載の方法により調製し た（これを本明細書の一部とする）。簡単に言えば、ＢＡＬＣ／Ｃマウスを犬腹 膜のマクロファージで免疫化した。免疫化したマウスからの膵臓細胞をＰ３Ｘ６ ３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを得た。

このハイブリドーマの浮遊物をＪＹ細胞および５ＫＷ３凝集阻止のためにスクリ ーニングした。次いで両アッセイに陽性のクローンをマウスＣＤ１１ａおよびヒ トＣＤ１８発現性マウス／ヒト・バイブリド細胞に対する結合のためにスクリー ニングした。一つのクローン、Ｒ１５７を選択した。Ｒ１５，７クローンに対し てブリステインープライムドＢＡＬＢ／ｃマウス中で腹水を調製し、Ｒ１５７抗 体を蛋白質Ａ上で単離した。

Ｒ１５，７はイヌＣＤ１８に対するネズミＩｇＧ、抗体である。Ｒ１５，７はイ ヌＣＤ１８に対する抗体であるが、ヒトＣＤ１８及びウサギＣＤ１８と反鎖反応 している。

Ｂ、動物の調製 体重２．５ｋｇから４．５ｋｇの白（ＮＺＷ）ウサギ（ハレ・マーランド、ヘラ イス、ＮＪ）の、右耳周縁部の静脈に静脈注射することにより１０μｇ／ｋｇの イー・コリのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を初回抗原投与した（ブライミン グ投与）。このウサギをキタミンーＨＣＩとキンラジンをそれぞれ５０ｍｇ／ｋ ｇおよび５．７ｍｇ／ｋｇ筋肉内注射することにより麻酔した。右頚動脈により 全身の血圧をモニターした。初回抗原投与後１７．５時間して以下の試験化合物 のひとつをウサギの右耳の周縁部静脈に静脈注射した。

ｉ）　滅菌生理食塩水 ｉｉ）　？ウスＩｇＧ（１ｍｇ／ｋｇ）ｉ　ｉ　１）Ｒ１５，７（１ｍｇ／ｋｇ ）試験化合物の注射後０５時間してウサギに２回目のＬＰＳ静脈注射（１００μ ｇ／ｋｇ）を行った。

初回抗原投与後；　滅菌生理食塩水、マウスＩｇＧまたはＲ１５，７注射後：２ 回目ＬＰＳ注射１時間後：　および２回目ＬＰＳ注射２時間後に、サンプル血液 をウサギから抜き取った。

Ｃ８結果 ５匹の生理食塩水処理ウサギは全て著しい好中球減少症および血小板減少症を伴 う末梢白血球減少症を発現し、４匹はひどい低血圧を経て、２回目ＬＰＳ注射後 ３０分以内（２７：３．６ｍｉ　ｎ）以内に死んだ。

マウスＩｇＧで処理した３匹のウサギは全て全身の血圧が著しく低下し、生理食 塩水処理ウサギと類似の血液学的パラメーターを示し、３匹とも２回目ＬＰＳ注 射後に死んだ（それぞれ１８．４４および１１４分）。

Ｒ１５，７で処理したウサギは全て２回目ＰＬＳ注射後２時間生き残った。平均 動脈圧は僅かに上昇した（２時間で１５．５−１９．３ｍｍＨｇ）のみであった 。

Ｒ１５７ウサギ中の末梢好中球の数は生理食塩水またはマウスＩｇＧ処理ウサギ のそれより有意に（Ｐ＜、０５）高く維持された。

実施例２ Ａ　モノクローナル抗−ＩＣＡＭ−１抗体（Ｒ６，５）の調製モノクローナル抗 −ＩＣＡＭ−１抗体Ｒ６，５はヨーロッパ特許出願第２８９゜９４９に記載の方 法により、ハイブリドーマ・セル・ラインＲ６’５０６°Ｅ９’Ｂ２（４八ＴＣ ＣＨＢ　９．５８０）から調製した。

Ｂ　動物の調製 体重２．０−４．０ｋｇの雄白ニューシーラント・ウサギ（ハゼルトン・リサー チ、デンバー、ＰＡ）に以下の成分を静脈注射した。

ｌ）　滅菌生理食塩水（０，２ｍｌ／ｋｇ）または１ｉ）Ｒ６，５（２，０ｍｇ ／ｋｇ） Ｒ６，５は滅菌生理食塩水中で用いた。０５時間後、ウサギの右耳周縁部静脈に リポポリサンカライド（ＬＰＳＸシグマ　イー・コリ　ＬＰＳ、セロタイプ０１ １１：Ｒ４，ｌｏｔ　３９Ｆ４０３０）２０μｇ／ｋｇを静注により初回抗原投 与し７た。１８時間後、ウサギにケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）／キ／ランン（６ ｍｇ／ｋｇ）およびこれに続くキンランンの定常（０，３２ｍｇ／ｋｇ／ｍ１ｎ ）筋肉的注射により麻酔した。全身の血圧をＲ２３１０ゴールド／ンユタータム 圧力変換器により右頚動脈を介してモニターした。最初に滅菌生理食塩水を投与 したウサギは、次いで右耳周縁部静脈に２回目の滅菌生理食塩水（０，２ｍｌ／ ｋｇ）の静注を行った。初回投与としてＲ６，５を投与した動物には、生理食塩 水に加えたＲ６５（２，０ｍｇ／ｋｇ）の２回目静注を行った。０．５時間後、 ウサギにさらにＬＰＳ（４００μｇ／ｋｇ）の静注を行い、２時間モニターした 。

血液サンプル１．０　ｍｌを、最初の滅菌生理食塩水またはＲ６，５の注射前。

滅菌生理食塩水またはＲ６，５の２回目静注前、ＬＰＳの２回目静注（追加）前 。

およびＬ　Ｐ　Ｓの２回目注射後３０分、１時間および２時間後に頚動脈カテー モルを介してウサギから抜き取った。

Ｃ３結果 ４匹の生理食塩水処理ウサギの内わずか１匹のみ全プロトコールを生き残った（ 図１）。全ての生理食塩水処理ウサギは最初のＰＬＳ注射後炎症（結膜分泌、鼻 漏）を起こした。２匹の生理食塩水処理ウサギが２回目ＬＰＳ注射前に死亡した 。

他の２匹のウサギはひどい低血圧症を経て、そのうちの１匹は２回目ＬＰＳ注射 後３０分以内に死んだ。

Ｒ６，５で処理した５匹のウサギは全て２回目ＬＰＳ注射まで生きのっこった。

Ｒ６，５処理ウサギにおいては最初のＬＰＳ注射後、明らかに軽微な炎症しか示 さなかった。Ｒ６，５で処理した５匹のウサギの内４匹が全プロトコールを生き 延びた。Ｒ６，５で処理したウサギの内、１匹は２回目ＬＰＳ注射後３０分で死 亡した。生き延びた４匹のＲ６，５処理ウサギの平均動脈血圧は実験終了まで僅 かに上昇したにとどまった（１６±５　ｍｍＨｇ）。

国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ（ ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、 　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　 ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＣ，ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＯ，Ｐ　Ｌ、　Ｒ○、ＳＤ、 ５Ｕ （７２）発明者　ボサンザ、ジーナス・ジェイアメリカ合衆国０６８７７コネチ カツト、リッジフィールド、ミモザ・サークル２０１番

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．患者に治療上有効な量の抗−ＩＣＡＭ−１抗体またはそのフラグメントを投 与することを特徴とするエンドトキシンショックを治療する方法。
2. ２．完全な抗−ＩＣＡＭ−１抗体を投与する請求項１に記載の方法。
3. ３．抗−ＩＣＡＭ−１抗体のフラグメントを投与する請求項１に記載の方法。
4. ４．フラグメントがＦａｂまたはＦ（ａｂ）２フラグメントである請求項３記載 の方法。
5. ５．抗−ＩＣＡＭ−１抗体またはそのフラグメントを静脈注射により投与する請 求項１記載の方法。
6. ６．抗−ＩＣＡＭ−１抗体がＲ６．５である請求項１記載の方法。