JPH06500142A - 酵素洗剤組成物および酵素安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素洗剤組成物および酵素安定化方法 技術分野 本発明は、プロテアーゼおよび第二の酵素（これは他のプロテアーゼ又は非蛋白 質分解酵素であってよい）を含んでなる洗剤組成物、プロテアーゼの存在下酵素 の安定化方法およびプロテアーゼおよび第二の酵素を含んでなる酵素洗剤用添加 物に関する。

背景技術 プロテアーゼは、液体を含み、商業的洗剤中で成分として広く用いられている。

二種の異なるプロテアーゼが使用できる（ＵＳ４．５１１．４９０゜ＷＯ３８１ ０３９４６）。他のタイプの酵素（すなわち、非蛋白質分解）も又、洗剤中で使 用できる、例えばアミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ又はペルオキシダーゼ。

酵素洗剤、特に液体洗剤を製剤化する際の主な問題は、保存中の酵素の安定性を 確保する点にある。他の酵素と共にプロテアーゼを含む洗剤に対し、安定性の問 題は、悪化している。何故なら、プロテアーゼは消化しがちでありかつ他の酵素 （すなわち、他のプロテアーゼ又は非蛋白質分解酵素）を失活させるからである 。

Ｗ〆０８９１０４３６１は、プロテアーゼおよびリパーゼを含む洗剤を７字開示 しており、ここで改善されたリパーゼ安定性はリパーゼの特異的群およびプロテ アーゼの特異的群を選択することにより達成される。

発明の開示 驚くべきことに、本発明者等は、プロテアーゼを含む洗剤中の酵素の安定化が、 ペプチド又はタンパク質タイプの可逆的プロテアーゼインヒビターを導入するこ とにより改善され得ることを見出した。

従って、本発明はペプチド又は蛋白質タイプの可逆的プロテアーゼインヒビター を更に含むことを特徴とする、プロテアーゼおよび１種以上の他の酵素を含んで なる洗剤組成物を提供する。別の面において、本発明はプロテアーゼインヒビタ ーを導入することを特徴とする、プロテアーゼの存在下での酵素の安定化方法を 提供する。

更に別の面において、本発明は安定化液体又は無粉塵の粒質物の形態でプロテア ーゼおよび１種以上の酵素を含んでなる酵素洗剤添加物を提供し、これはペプチ ド又は蛋白質タイプの可逆性プロテアーゼインヒビターを更に含んでなることを 特徴とする特開昭６２−２６９６８９は、プロテアーゼインヒビターの導入によ る液体洗剤中でのプロテアーゼの安定性の改良を開示するが、ここでは他の酵素 は存在しなかった。

発明の詳細な記載 プロテアーゼ 本発明で用いられるプロテアーゼは、好ましくは微生物起源のものである。これ は、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプ シン様プロテアーゼであってよい。アルカリ性プロテアーゼの例は、ズブチリン であり、特にバシラス由来のものであり、例えばズブチリシンノボ、ズブチリシ ン　力ルスベルク、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７、およびズブチノ ン１６８（両方ともＷＯ３９１０６２７９に記載）およびＷＯ３９１０６２７９ に記載されているような変異体ズブチリンである。商業的バシラスズブチリシン の例は、アルカラーゼ（登録商標）、サビナーゼ（登録商標）およびエスペラー ゼ（登録商標）であり、これらはノボノルディスク社の製品である。トリプシン 様プロテアーゼの例は、（例えば豚又はウシ起源の）トリプシンであり、更にＷ Ｏ３９１０６２７０に記載のフサリアムブロテアーゼである。

洗剤中のプロテアーゼの量は、典型的には０．２〜４０μＭ１特に１〜２０μＭ 　（一般的に５〜１０００■／ｌ、特に２０〜５００■／ｌ）である。

他の酵素 本発明で用いられる他の酵素は、他の酵素（例えば上記のタイプ）又は非蛋白分 解酵素、例えばアミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ又はオキシドレダクターゼ例 えばペルオキシダーゼであってよい。非蛋白質分解酵素は、好ましくは微生物起 源であり、例えばバシラス、フミコラ、プソイドモナス、コプリナス又はフサリ アムの菌株から由来する。

洗剤中の他の酵素の量は、典型的には０．２〜４０μＭ、特に１〜２゜ｕＭ　（ 一般的には５〜１０００■／ｒｎｌ、特に２０〜５００■／Ｉりである。

インヒビタ一 本発明で用いられるインヒビターは、問題のプロテアーゼを可逆的に阻害するペ プチド又は蛋白質タイプの如何なるインヒビターであってよく、例えば ラコフスキー、　Ｊｒ、およびカド−、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１ ９８０）４９　：　５９３−６２６およびＳ、　Ｍａｒａｏ等、ｉｎ　Ｐｒｏｔ ｅｉｎＰｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｔｈｅ　Ｃａ５ｅ　ｏｆ　Ｓｔ ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　（１９８５ ）、１−１４頁に記載されるもの。例としては、科■（引用文献に記載）のトリ プシン　インヒビターおよび科■、■および■のズブチリシン　インヒビターで ある。更に特定の例は、ストレプトマイセス　ズブチリシン　インヒビター（Ｓ ＳＩ）　；ストレプトマイセス　アンチフィブリノリティカスからのプラスミノ ストレブチン：大麦ズブチリシン　インヒビターＣｌ−１（例えば、ウイリ１９ ８７、９９〜１０６頁に記載）；ポテト　ズブチリシン　インヒビターｌ（例え ば、クレベラント等、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、８．１９８８．１９９〜 ２０７頁に記載）；トマト　ズブチリシン　インヒビター（例えば、バシア　フ ァーバ　ズブチリシン　インヒビター（例えばスゾンソン等、Ｃａｒｌｓｂｅｒ ｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、４９．１９８４．４９３〜５０２頁に記載）および ロイペプチン　インヒビター（例えばＳ、コンドウ等、Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔ、 　２２．１９６９．５５８〜５６８頁に記載）である。

更に、インヒビターはプロテアーゼに対しより弱い結合親和性を有する科■の変 性ズブチリシンであってよい。このような変性ズブチリシンは、指示された位置 に１種以上の次のアミノ酸置換基を有することができる（インヒビターの反応部 位から番号をつけ、Ｐｌ。

Ｐ２等はＮ末端の方向にあり、そしてＰ’　１．Ｐ’　２等はインヒビター分子 のＣ末端の方向にある）： Ｐ　４　：　Ｖａｌ、　Ｐｒｏ、　Ｔｒｐ、　Ｓｅｒ、　Ｇｌｕ又はＡｒｇＰ　 ３　：　Ｔｙｒ、　Ｇｌｕ、　Ａｌａ、　Ａｒｇ、　Ｐｒｏ、　Ｓｅｒ、　Ｌｙ ｓ又はＴｒｐＰ　２　：　Ｓｅｒ、　Ｌｙｓ、　Ａｒｇ、　Ｐｒｏ、　Ｇｌｕ、 　Ｖａｌ、　Ｔｙｒ、　Ｔｒｐ又はＡｌａＰ　１　：　Ａｒｇ、　Ｔｙｒ、　Ｐ ｒｏ、　Ｔｒｐ、　Ｇｌｕ、　Ｖａｔ、　Ｓｅｒ、　Ｌｙｓ又はＡｌａＰ’　１ 　：　Ｇｉｎ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、ｌｉｅ又はＰｒｏ。

Ｐ’　２　：Ｖａｌ、　Ｇｌｕ、　Ａｒｇ、　Ｐｒｏ又はＴｒｐ。

Ｐ’　３　：Ｇｌｕ、　Ｇｌｎ、　Ａｓｎ、　Ｖａｔ、　Ｐｈｅ又はＴｙｒ。

好ましい変性インヒビターは、２３位でＡｒｇ、　Ｐｒｏ又はＧｌｕで、２２位 でＬｙｓ又はＡｒｇ　、　Ｐ　１位でＡｒｇ又はＰｒｏで置換されたＣｌ−２で ある。

変性インヒビターは公知の組換ＤＮＡ技術により生産できる。簡単には、公知の インヒビターをコードするＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ又は合成遺伝子）を変異誘発に 委ね、所望のアミノ酸置換に対し新しいコドンで置換されるべきアミノ酸に対し コドンを置換できる。これは好ましくはバクテリオファージＭ１３ベクター（例 えばＭ、Ｊ、シラーおよびＭ、スミス、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１００ 　（１９８３）　４６８〜５００）において、二重鎖標準ＤＮＡベクター（例え ば、Ｙ、モリナガ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４年、７月）６３６ 〜６３９）、においてオリゴヌクレオチド方向部位−特異性変異誘発により、又 はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、引き続き、変異体遺伝子を適当な宿 主菌株内で発現させる。適当な宿主は細菌（例えばエシエリチ力　コリーヌはバ シラス株）、真菌（例えばサツカロマイセス　セレビジア又はフィラメントウス 真菌様アスペルギルスの株）、トマト又はポテトの如き植物又は確立されたヒト 又は動物細胞系である。発現を達成させるため、変異体遺伝子はインビボで翻訳 可能な変異体インヒビターｍＲＮＡの形成するためプロモーターおよびターミネ ータ−ＤＮＡ要素と共に発現プラスミド内に挿入されねばならない。発現プラス ミドの選択は、用いられる宿主株のタイプに依存する。変異体インヒビターの発 現は細胞内又は細胞外で行なわれ得る。後者の場合、変異体インヒビターをコー ドするＤＮＡ配列は、適当なペプチド　シグナル分泌をコードすインビボ内で分 解され増殖培地への成熟変異体インヒビターの分泌を生起する。

インヒビターの量は、プロテアーゼ活性部位に対しインヒビター反応部位のモル 比０．６以上、より好ましくは０．８以上、もっとも好ましくは１以上に相当す る。割合は、一般に１０以下、通常５以下である。

インヒビターのタイプおよび量は、洗剤中央なくとも６０％（例えば少なくとも ８０％）抑制を与えるように好ましく選択されそして洗剤が、典型的には０．３ 〜１０ｇ／ｌの濃度での洗たくにおいて水で希釈される場合１０％以下の抑制を 与えるように選択される。

洗剤 本発明の洗剤は、好都合の形態、例えば粉末又は液体であってよい。本発明は、 酵素安定性の問題が公言されている液体洗剤の処決に対し特に適用可能である。

液体の洗剤は、水性、典型的には２０〜７０％の水および０〜２０％の有機溶剤 であってよい（％は重量％）。

洗剤は、界面活性剤を含んでなり、これはアニオン、非イオン、カチオン、両性 又はこれらのタイプの混合物であってよい。洗剤は通常５〜３０％のアニオン性 界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）　、α−オレ フィン　スルホネート（ＡＯＳ）　、アルコール　エトキシ　スルホネー）　（ ＡＥＳ）又は石けんを含むことができる。洗剤は又、３〜２０％のアニオン界面 活性剤、例えばノニルフェノール　エトキシレート又はアルコール　エトキシレ ートをも含有できる。

（水性洗剤溶液中で測定された）ｐＨは、通常中性又はアルカリ性、例えば７〜 １０であろう。洗剤は、１〜４０％の洗剤用ビルダー例えばゼオライト、ホスフ ェート、ホスホネート、シトレート、ＮＴＡ、　ＥＤＴＡもしくはＤＴＰＡを含 有でき、又はビルダーなしでもよい（すなわち、洗剤用ビルダーを本質的に含ま ない）。洗剤は又、他の通常の洗剤成分、例えば布帛コンディオナー、起泡増進 剤、殺菌剤、螢光増白剤および香料をも含有できる。

洗剤用添加剤 プロテアーゼ、他の酵素およびインヒビターは、別個の添加により又は本発明に より与えられる組合された添加剤を添加することにより本発明の洗剤中に含ませ ることができる。添加剤は通常０．２〜ｂ 第２の酵素を含み、そして先に記載した如きインヒビター／プロテアーゼの割合 を有する。

洗剤用添加剤は液体洗剤中液体の形態で配合され得る。液体添加剤は、２０〜９ ０％のプロピレングリコール；０．５〜３％（Ｃａとして）の可溶性カルシウム 塩二〇〜ｌＯ％のグリセロール；小量の短鎖脂肪酸および炭水化物；および１０ ０％までの水を含有することができる。

図面の簡単な記載 本発明を、次の例において添付の図面を参照しつつ更に説明する。

図１はリパーゼ、プロテアーゼおよびストレプトマイセス　ズブチリシン　イン ヒビターを含有する組成物と比較して、リパーゼとプロテアーゼのみを含有する 洗剤組成物中の室温で１３日間後のリパーゼの残存活性（％）を示すグラフであ る。

図２はリパーゼ、プロテアーゼおよびストレプトマイセス　ズブチリシン　イン ヒビターＣｌ−２を含有する組成物と比較して、リパーゼとプロテアーゼのみを 含有する洗剤組成物中の室温で１３日間後のリパーゼの残存活性（％）を示すグ ラフである；図３は、ロイペプチンと共に又はその添加なしてプロテアーゼの存 在下、室温で４３時間後のリパーゼの残存活性（％）を示すグラフ図４はストレ プトマイセスと共に又はその添加なしでプロテアーゼの存在下、室温度１０日抜 上ルラーゼの残存活性（％）を示すグラフであり： 図５は、Ｃｌ−２インヒビターと共に又はその添加なしでプロテアーゼの存在下 室温で１０日抜上ルラーゼの残存活性（％）を示すグラフである。

例１ 濃縮した液体洗剤を次の如く配合した（活性物質の重量％）ＬＡＳ（ナンナ１１ ６９／Ｉ））　５％ＡＥＳ（ベロール４５２）　５ オレイン：ココ脂肪酸　１０ ＡＥ（ドパノール２５−７）　１５ トリエタノールアミン　５ ＮａＯＨ１，１ プロピレングリコール　８ グリセロール　２ ＣａＣ１，０，０４５ クエン酸ナトリウム　０．０８９ ホネホネート（デキュスト２０６ＯＳ）　０．５ｐＨｓ、　０ 本発明に係る洗剤を、以下の組成の洗剤にストレプトマイセスズブチリシン　イ ンヒビター（ＳＳＩ、　０．０５ｍｇ／ｍｌ、　４．５　μＭ）に添加すること により調製した：ｌＯ■／ｄ（３００μＭ）フミコラ　リパーゼ（リポラーゼ） 　（Ｌｉｐｏｌａｓｅ　ＴＭ）および０．１ｍｇ／ｄ（３，６μＭ）のサビナー ゼ（登録商標）を含有する水中の５２（ｖ／ｖ）％の上記濃厚洗剤。

１０ｍｇ／ｍｊ（３００μＭ）のフミコラ　リパーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ　ＴＭ ）および０．１■／ｒｒｄ！＜３．６μＭ）のサビナーゼ（登録商標）を含有す る水中の５５（ｖ　／　ｖ　）％濃厚洗剤の組成物に、インヒビターＣ１−２（ ０，０３■／ｍｌ、３．３μＭ）を添加することにより他の洗剤を調製した。

両方の洗剤を、同じ組成であるがインヒビターを有しない対照洗剤と共に室温で １３日間保存した。リパーゼ活性を種々の時間で測定し、初期リパーゼ活性（％ ）で表わした。二つの図面で示される結果は、プロテアーゼインヒビターを添加 することによりリパーゼに対し著るしい安定化効果を実証している。

例２ プロテアーゼインヒビターの存在下、蛋白質分解の低下からのリパーゼの保護を 、０．５ｇ／ｌのプソイドモナス　セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａ ｃｉａ）リパーゼおよび５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０中の２ｇ／ ｌフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼ混合物に２０°Ｃで０．６７ｇ ／１ロイペプチンインヒビターを添加し、次いで４３時間後残存リパーゼ活性（ ％）を測定することにより決定した。図３に示される結果から、ロイペプチンイ ンヒビターの存在下、リパーゼの分解は極めて小さく、一方インヒビターが添加 されない場合リパーゼは殆ど完全に分解される。プロテアーゼ活性は希釈により 再回復され得る。４３日間保存し１００倍に希釈後、プロテアーゼ活性はリパー ゼおよびプロテアーゼを含有する調製品中、３２７Ｕ／ｙｄ　（Ｕは合成の基質 Ｎ−ｐ−トシル−Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−１）−ニトロアニリドによって 確立された任意単位である）であり、そしてロイペプチンインヒビターも含有す る相当の調製品において３６６Ｕ／ｒｎｌであった。

例３ 濃厚液体洗剤を次の如く調製した（活性物質の重量％）：ＬＡＳ（ナンサ１１６ ９Ｆ）　１０％ ＡＥＯ（ベロール１６０）　１５％ エタノール　１０％ トリエタノールアミン　５％ ０、１２ｍｇ／　ｒｎｌｌ　（３，３ｔｔ　Ｍ）フミコラセルラーゼおよび０． １８ｍｇ／ｒｎｌ（６，７μＭ）サビナーゼ（登録商標）を含有する洗剤（水中 、上記濃厚洗剤の９０％（Ｗ／Ｗ））に対し、ストレプトマイセス　ズブチリシ ン　インヒビター（ＳＳＩ、　０．０９ｍｇ／ｙｎｉ、７．７μＭ）を添加する ことにより本発明に係る洗剤を調製した。

０、１２ｍｇ／ｍ１（３，３μ’Ｍ）フミコラセルラーゼおよび０．１８ｍｇ／ 　ｒｎｌ（６，７μＭ）サビナーゼ（登録商標）を含有する洗剤（水中、上記濃 厚洗剤９０％（ｗ／ｗ）に対し、インヒビターＣｌ−２（０，０７ｍｇ／ｒｎｌ 、７．８μＭ）を添加して他の洗剤を調製した。

両方の洗剤を、インヒビターなしの対照洗剤と共に室温で１０日間保存した。残 存セルラーゼ活性を、種々の時間において測定し、初期セルラーゼ活性の％で表 わした。図４および図５に示される結果は、プロテアーゼインヒビター特にＳＳ Ｉを添加することによりセルラーゼに対する著るしい安定化効果を実証している 。

Ｆｉｇ、　３ Ｆｉｇ、　４ 残存活性（初期の％） Ｆｉｇ、　５ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．プロテアーゼおよび１種又はそれ以上の他の酵素を含んでなる洗剤組成物で あって、更にペプチド又は蛋白質タイプの可逆性プロテアーゼインヒビターを含 んでなる、前記洗剤組成物。
2. ２．プロテアーゼ活性部位に対するインヒビター活性部位のモル比が０．６以上 、好ましくは１〜１０である、請求の範囲第１項記載の組成物。
3. ３．プロテアーゼの量が０．２〜４０μＭ、好ましくは１〜２０μＭである、請 求の範囲第１〜２項のいずれかに記載の組成物。
4. ４．プロテアーゼがセリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテア ーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである、請求の範囲第１項記載の組成物。
5. ５．アルカリ性微生物プロテアーゼが、好ましくはバシラス由来のズプチリン、 最も好ましくはズブチリシンノボ、ズプチリンカルスべルク、ＢＰＮ′、ズプチ リン３０９、ズプチリンシン１４７又はズブチリシン１６８である、請求の範囲 第４項記載の組成物。
6. ６．トリプシン様プロテアーゼが、トリプシン又はフサリアム由来である、請求 の範囲第４項記載の組成物。
7. ７．インヒビターが科ＩＶのトリプシンインヒビター又は科ＩＩＩ，ＶＩ又はＶ ＩＩのズブチリシンインヒビターである、請求の範囲第１〜６項のいずれかに記 載の組成物。
8. ８．他の酵素が、好ましくは請求の範囲第４〜６項のいずれかに記載のタイプの プロテアーゼである請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の組成物。
9. ９．他の酵素が、非タンパク質分解酵素、好ましくはアミラーゼ、セルラーゼ、 リパーゼ、オキシドレダクターゼ、例えばペルオキシダーゼである請求の範囲第 １〜７項のいずれかに記載の組成物。
10. １０．酵素が微生物起源、好ましくはバシラス、フミコラ、プソイドモナス、コ プリナス又はフサリアムから由来する請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の 組成物。
11. １１．洗剤中のプロテアーゼ抑制の程度が少なくとも６０％である、請求の範囲 第１〜１０項のいずれかに記載の組成物。
12. １２．１％の洗剤水溶液中のプロテアーゼ抑制の程度が１０％以下である、請求 の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の組成物。
13. １３．請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の水性液体洗剤組成物。
14. １４．ペプチド又は蛋白質タイプのプロテアーゼインヒビターを導入することを 特徴とする、プロテアーゼの存在下での酵素の安定化方法。
15. １５．洗剤、好ましくは水性液体洗剤中で酵素を安定化させるための請求の範囲 第１４項記載の方法。
16. １６．安定化された液体又は無粉塵性の粒質物の形態でプロテアーゼおよび一種 又はそれ以上の他の酵素を含んでなる酵素洗剤用添加剤であって、更にペプチド 又は蛋白質タイプの可逆性プロテアーゼインヒビターを含んでなる、前記酵素洗 剤用添加剤。