JPH0627108A - 新規標識薬物ハプテン類似体を用いるイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、下記を含んで成る標識薬物ハプテ
ン類似体を用いるイムノアッセイに向けられている。
（Ａ）アミンもしくはスルフヒドリル基を有する、イム
ノアッセイに用いられるタイプの標識、（Ｂ）ヒダント
イン核もしくはバルビツレート核より選ばれる薬物ハプ
テン核、及び（Ｃ）薬物ハプテン核の３位をカルボニル
橋を介して標識に連結する連結鎖。 【効果】 標識薬物類似体類を含む要素を用いて行われ
る競合イムノアッセイは、通常治療を目的とする薬物濃
度範囲において、反射濃度変化を十分に示す。上記標識
薬物ハプテン類似体は、加水分解に対して安定である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床化学、詳細にはイ
ムノアッセイに関する。

【０００２】

【従来の技術】天然の免疫学的反応を利用するイムノア
ッセイは、臨床化学における分析技術として広範な使用
が見い出されている。反応の特異性により、それらは、
生物学的流体中に非常に低濃度で存在する生物学的被検
体を定量する際に特に都合が良い。このような被検体と
しては、例えば、抗体類、治療薬物類、麻酔薬類、酵素
類、ホルモン類及びタンパク質類等が挙げられる。

【０００３】競合バインディングイムノアッセイでは、
免疫適格誘導体類及びリガンドの類似体類を含む標識リ
ガンドが、所定量の適当なバインディング材料（本明細
書ではレセプターと称される）を用いる反応において、
未標識リガンドと競合して存在する。未知濃度のリガン
ドは、結合もしくは未結合（すなわち、遊離）の標識リ
ガンドのどちらか一方のシグナルを測定することより求
めることができる。反応は以下のように進行する。

【０００４】リガンド＋標識リガンド＋レセプター→ リガンド−レセプター＋標識リガンド−レセプター

【０００５】伝統的な標識としては、放射性標識類、酵
素類、色素原類、蛍光団類、安定遊離基類及び酵素のコ
ファクター類、阻害剤類並びにアロステリックエフェク
ター類が挙げられる。

【０００６】前述に矛盾することなく、血清中の薬物類
（例えば、フェノバルビタール及びフェニトイン）につ
いてのイムノアッセイは、固定化抗体バインディング部
位について、患者血清中の薬物とこのような薬物ハプテ
ンの酵素標識類似体との競合に基づくことができる。

【０００７】標識薬物ハプテン類似体（以下、ＬＤＨと
称することが多い）についての特定の必要条件は、１）
少なくとも６５％のＬＤＨが過剰の固定化抗体により結
合されうること；２）固定化抗体についてのＬＤＨの親
和性が、所定量のＬＤＨと薬物との競合が治療に関連し
た薬物濃度範囲で発生するようなものであること；及び
３）保存条件下におけるその酵素標識の加水分解に対す
るＬＤＨの安定性；を含む。

【０００８】薬物ハプテン類似体に課せられる必要条件
は、１）酵素標識との結合後の固定化抗体に対する類似
体の接近しやすさ；２）薬物に対する抗体による、ＬＤ
Ｈ類似体の特異的認識能；及び３）酵素活性に悪影響を
与えない条件下、直接又は酵素もしくは類似体の活性化
後のどちらかに、酵素標識を担持する類似体が有する十
分な反応性；を含む。

【０００９】米国特許第４，７５２，５６８号明細書に
開示されたグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）及びアル
カリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）酵素標識結合フェノバ
ルビタール及びフェニトインハプテン類似体類は、所望
のフォーマットで有効な競合イムノアッセイを遂行する
のに適切な酵素標識類似体を提供した。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】標識として酵素西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いる場合に、上記
特許に開示された標識フェノバルビタール及びフェニト
イン類似体類が、競合イムノアッセイを遂行するのに不
十分であることが課題である。このような類似体とＨＲ
Ｐ間のカプリング反応は、緩慢かつ不完全であった。更
に、フェノバルビタール及びフェニトインＨＲＰ標識は
非常に弱い結合であったので、判読可能なシグナルを得
るのに非常に高濃度の標識もしくは抗体結合部位が必要
とされるであろう。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、本明細書の請
求項１に従う薬物のイムノアッセイ方法を提供する。上
記方法に有用な標識薬物ハプテン類似体類は、次式に従
うそれらの態様を含む。

【００１２】

【化３】

【００１３】上式中、Ａは、次式のヒダントイン核

【００１４】

【化４】

【００１５】もしくは次式のバルビツレート核を表し、

【００１６】

【化５】

【００１７】Ｒ¹ は、各々独立して、水素、炭素原子数
１〜１０個のアルキル、未置換もしくは置換フェニルを
表し、Ｒ² ，Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、各々独立して、Ｃ
₁ 〜Ｃ₁₀のアルキレンもしくは少なくとも１つ以上のエ
ステル基、アミド基、−Ｏ−，−Ｓ−、及び−ＮＲ─を
割り込ませたこのようなアルキレン基を表し、Ｒ³ は、
Ｃ₁ 〜Ｃ₃ のアルキレンを表し、Ｚは、−Ｏ−，−Ｓ
−、及び−ＮＲ─（ここで、Ｒは、水素もしくはＣ₁ 〜
Ｃ ₆ のアルキル、例えば、メチルプロピル及びヘキシル
を表す）を表し、ｍは、０，１もしくは２でありｎは、
０，１もしくは２でありｍ＋ｎ＞０、そしてｍ，ｎ及び
Ｒ² に含まれる原子の総数が５〜４０であり、標識は、
酵素であり、そして更に、（ｉ）少なくとも１つのＲ¹
基が置換もしくは未置換フェニルであり、（ii）Ｒ⁴ ，
Ｒ⁵ 及びＲ⁶ の１つがフェニレンであってもよく、（ii
i ）構造Ｉの角型括弧成分類が、いずれかの順序でそこ
に表示でき、そして（iv）連結基が、炭素原子数２〜１
２個の飽和もしくは不飽和モノカルボン酸の誘導体以外
のものであることを条件とする。

【００１８】本発明により提供されるイムノアッセイに
有用な薬物ハプテン類似体類は、下記を含んで成るもの
である。（ａ）活性エステル基、例えば、スクシンイミ
ドオキシカルボニル、（ｂ）ヒダントインもしくはバル
ビツレート誘導体類より選ばれる核、及び（ｃ）活性エ
ステル基をヒダントイン核もしくはバルビツレート核に
連結する連結鎖（ここで、連結鎖は、先に定義のとおり
である）。

【００１９】より詳細には、本発明に有用な好ましい新
規薬物ハプテン類似体類は、次式に従うものである。

【００２０】

【化６】

【００２１】上式中、Ａは、次式のヒダントイン核

【化７】 もしくは次式のバルビツレート核を表し、

【化８】 Ｒ¹ ，Ｒ² ，Ｒ³ ，Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ ，Ｒ⁶ ，Ｚ，ｍ及びｎ並
びにそれらに関連する条件は、先に定義のとおりであ
り、そしてＲ⁷ は、エチレンもしくはｏ−フェニレン基
である。

【００２２】ヒダントイン薬物ハプテン類似体類 新規ヒダントイン薬物ハプテン類似体類は、本発明のイ
ムノアッセイに用いられる標識類似体類を製造するのに
用いられる。ヒダントイン核と活性エステル基の間に短
い連結鎖を有するこれらのヒダントイン誘導体類の活性
エステルは、ほんの数種の固定化抗体との使用に際して
受け入れられる酵素標識を製造する場合には、ＨＲＰと
十分に反応性であった。活性エステル基とヒダントイン
核の間に８〜２０個の原子から成る長い連結基（Ｒ² に
加えて角型括弧基）を担持する誘導体類は、試験される
すべての固定化抗体により結合できる標識を提供した。
連結鎖中の各Ｚが、隣接するカルボニルとアミド基を形
成する−ＮＲ−であるような鎖は、Ｚが隣接するカルボ
ニルとエステル基を形成するため、Ｚが−ｏ−もしくは
−ｓ−であるような鎖よりも、加水分解に対して耐性で
あるので、このような鎖を含むヒダントイン誘導体類
は、特に有用である。

【００２３】ヒダントイン類似体製造例 ヒダントイン類似体類は、フェニトイン類似体類、ヒダ
ントイン化合物類の下位分類、が製造される下記製造方
法に従って製造できる。

【００２４】１．ＨＤ１：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチル｝
ヒダントインの製造。

【００２５】工程１：５，５−ジフェニル−３−〔４−
（２−ヒドロキシエチルアミノカルボニル）ブチル〕ヒ
ダントインの製造。

【００２６】パートＡ：最初に酸塩化物を製造する。３
−（４−カルボキシブチル）−５，５−ジフェニル−
２，４−イミダゾリジンジオン（３．５２ｇ，０．０１
モル）、塩化チオニル（２０mL）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（２滴）及びクロロホルム（５０mL）の混合
物を、室温で３時間攪拌した。減圧下、ロータリーエバ
ポレーターで溶剤を除去して、そしてこの生成物を次の
パートＢに直接用いた。

【００２７】パートＢ：酸塩化物をエタノールアミンと
反応させる。クロロホルム（５０mL）中の酸塩化物を、
クロロホルム１００（mL）中エタノールアミン（１．２
ｇ，０．０２モル）、及びトリエチルアミン（２．４
ｇ，０．０２４モル）の混合物に１５分間かけて滴下し
た。次いで混合物を６０℃で２時間加熱し、そして室温
で１時間攪拌した。次いでその溶液を５％塩酸（１００
mL×２）で洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１０
０mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥して濾過
し、そして溶剤をロータリーエバポレーターで除去し
た。次いで濾液を酸化アルミニウムカラムを用いるクロ
マトグラフィーにかけ、ＴＬＣ上に１つのスポットを示
す物質（３．０ｇ）を得た。この物質を次の製造方法に
直接使用した

【００２８】工程２：３−｛４−〔２−（３−カルボキ
シプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニルヒダントインの製造。クロロ
ホルム（１００mL）中工程１のヒドロキシ化合物（３．
０ｇ，０．００７５モル）、無水コハク酸（１．０ｇ，
０．０１モル）及びジメチルアミノピリジン（０．９
ｇ，０．００７５モル）を５０〜６０℃で４時間加熱
し、そして週末の間に室温まで冷却した。

【００２９】ジクロロメタン（３００mL）を添加し、そ
して混合物を５％塩酸溶液（１００mL×３）で洗浄し、
飽和塩化ナトリウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫
酸マグネシウムで乾燥して濾過し、そして溶剤を除去し
てＴＬＣ上に１つのスポットを与える物質を得た。

【００３０】工程３：ＨＤ１：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝ヒダントインの製造。

【００３１】

【化９】

【００３２】クロロホルム（８０mL）中工程２由来の酸
（３．０ｇ，０．００６モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド（１．５ｇ，０．００７モル）及
びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７ｇ，０．００
６モル）の混合物を室温で２０時間攪拌した。その混合
物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレーターで
濾液を濃縮した。次いで残渣をシリカを用いるクロマト
グラフィーにかけ、生成物を１．３ｇ得た（収率４０
％）。Ｃ₃₀Ｈ₃₂Ｎ₄ Ｏ₉ についての分析計算値：Ｃ，６
０．８；Ｈ，５．４４；Ｎ，９．４５。実験値：Ｃ，５
９．６；Ｈ，５．５１；Ｎ，８．９１。

【００３３】２．ＨＤ２：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチル｝
−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００３４】工程１：５，５−ジフェニル−３−（１−
ピペラジニルカルボニルブチル）ヒダントインの製造。

【００３５】パートＡ：最初に、３−〔４−（４−ベン
ジルオキシカルボニルピペラジニルカルボニル）ブチ
ル〕−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンを製造した。上記ＨＤ１の製造のパートＡに記載さ
れるように製造した酸塩化物（０．０１モル）を、クロ
ロホルム（５０mL）中ベンジル１−ピペラジンカルボキ
シレート（２．４ｇ，０．０１１モル）及びトリエチル
アミン（２．０ｇ，０．０２モル）の混合物に、１５分
間かけて滴下した。この混合物を室温で一晩攪拌し、そ
してジクロロメタン（３００mL）を添加した。その混合
物を５％塩酸（１００mL×２）で洗浄し、希炭酸ナトリ
ウム溶液（１００mL）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶
液（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレーターで
溶剤を除去した。次いで濾液をクロマトグラフィーにか
け、油状物４．３ｇを得た（収率７８％）。これを次の
工程に直接使用した。

【００３６】工程Ｂ：工程Ａの保護アミン（４．８ｇ，
０．００８モル）及び３０〜３５％臭化水素酢酸溶液
（２５mL）を室温で１．５時間攪拌した。次いでこの混
合物をジエチルエーテル（１Ｌ）に注ぎ入れ、そして分
離した油状物を新たなエーテル（１Ｌ×３）で摩砕し
た。その油状物を１０％水性水酸化ナトリウム溶液（pH
＝１４）に溶解し、そして水性溶液をジクロロメタン
（１００mL×４）で抽出した。合わせた有機溶液を飽和
塩化ナトリウム溶液（１５０mL）で洗浄し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下、ロータリ
ーエバポレーターで溶剤を除去した。濾液を凝固させる
と白色固体が得られた（２．６ｇ，収率７７％）。この
物質を次の工程に直接用いた。

【００３７】工程２：３−｛４−〔４−（３−カルボキ
シプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。

【００３８】クロロホルム（１５mL）中製造方法７由来
のアミン（２．１ｇ，０．００５モル）及び無水コハク
酸（０．５４ｇ，０．００５４モル）を５０〜６０℃で
３０分間加熱し、そして周囲温度で２０時間放置した。
ジクロロメタン（１５０mL）を添加し、そして混合物を
５％塩酸（１００mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナトリウ
ム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエボパレータ
ーで溶剤を除去したところ、白色固体２．５ｇ（９５
％）が得られ、これを次の工程に直接用いた。

【００３９】工程３：ＨＤ２：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４０】

【化１０】

【００４１】クロロホルム（４０mL）中工程２由来の酸
（１．５６ｇ，０．００３モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（０．６４ｇ，０．００３モ
ル）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３６ｇ，
０．００３モル）の混合物を室温で週末の間攪拌した。
その混合物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレ
ーターで濾液から溶剤を除去して生成物１．９ｇを得た
（収率１００％）。その固体をクロマトグラフィーにか
け、そして生成物画分をジクロロメタン（２００mL）に
溶解し、希炭酸ナトリウム溶液（１００mL×２）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そしてロ
ータリーエバポレーターで溶剤を除去したところ、ＴＬ
Ｃ上に１つのスポットを与える白色固体が得られた。

【００４２】３．ＨＤ３：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチル｝
−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４３】工程１：３−〔４−〔６−アミノヘキシル
アミノカルボニル）ブチル〕−５，５−ジフェニル−
２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４４】パートＡ：３−〔４−〔６−ベンジルオキ
シカルボニルアミノヘキシルアミノカルボニル）ブチ
ル〕−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。 ＨＤ１の製造で中間体として生成される酸塩化物を、Ｈ
Ｄ２の製造の工程１に記載の方法により、Ｎ−ベンジル
オキシカルボニル−１，６−ヘキサンジアミンで処理し
たところ、保護アミン７．５ｇ、収率８５％が得られ
た。

【００４５】パートＢ：パートＡの保護アミンを、ＨＤ
２の製造の工程１、パートＢの方法により臭化水素酸−
酢酸で処理したところ遊離アミンが得られ、精製するこ
となくそれを工程２に用いた。

【００４６】工程２：３−｛４−〔６−（３−カルボキ
シプロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。 この化合物を、ＨＤ２の製造の工程２と同様の方法を用
いて製造した。

【００４７】工程３：ＨＤ３：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４８】

【化１１】

【００４９】この物質を、ＨＤ２の製造の工程３の方法
を用いて製造したところ、生成物２．６ｇを得た（収率
８０％）。融点１３３〜１３４℃。Ｃ₃₄Ｈ₄₁Ｎ₅ Ｏ₈ に
ついての分析計算値：Ｃ，６３．０５；Ｈ，６．３８；
Ｎ，１０．８１。実験値：Ｃ，６２．９１；Ｈ，６．４
１；Ｎ，１０．６９。

【００５０】バルビツレート薬物類似体類 以下の製造例４〜８は、フェノバルビタールについての
バルビツレート薬物ハプテン類似体類の製造を具体的に
説明するものである。一般的には、類似体類は、（１）
バルビツレート誘導体、例えば、フェノバルビタール
を、オメガ−ハロアルカンカルボキシレートエステルと
縮合させる工程、（２）そのエステルを、対応する酸に
ケン化させる工程、（３）その酸を、対応する酸塩化物
に転化させる工程、及び（４）酸塩化物をＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドと縮合させる工程、又は更に長い連結
鎖を得るために、ブロックされたアミンもしくはヒドロ
キシ基を１つ有するジアミン、ジオールもしくはアミノ
アルコールと縮合させる工程、（５）ブロックを取り除
き、ジカルボン酸、例えばコハク酸と縮合させ、次いで
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと縮合させて、類似体を
製造する工程、により製造される。

【００５１】所望であれば、半ブロックのジアミン、ジ
オールもしくはアミノアルコールと縮合させ、次いで別
の二酸を一回もしくは２回以上繰り返し処理して、連結
鎖を更に長くできる。しかしながら、同様の製造が、よ
り長い鎖の二酸類、ジオール類、ジアミン類、アミノア
ルコール類もしくはハロアルカンカルボキシレートエス
テル類を用いることにより、より少ない工程で達成でき
る。

【００５２】４．ＰＢ１：５−エチル−５−フェニル−
１−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジント
リオンの製造。

【００５３】工程１：５−エチル−６−ヒドロキシ−３
−（４−メトキシカルボニルブチル）−５−フェニル−
２，４（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオンの製造。 ジクロロメタン（５００mL）中フェノバルビタール（４
６．５ｇ，０．２モル）及び水酸化テトラブチルアンモ
ニウム（５００mL、０．２モル、０．４Ｍ水溶液）の混
合物を製造し、そしてそれに５−ブロモ吉草酸メチル
（３９．０ｇ，０．２モル）を添加した。その反応混合
物を一晩（２０時間）激しく攪拌した。この混合物に、
飽和塩化ナトリウム溶液（１００mL）を添加し、有機層
を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン（１００mL
×２）で洗浄した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリ
ウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄ で乾燥
し、濾過し、そして溶剤を除去した。

【００５４】工程２：３−（４−カルボキシブチル）−
５−エチル−６−ヒドロキシ−５−フェニル−２，４
（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオンの製造。 ジオキサン（５００mL）中の工程１の５−エチル−６−
ヒドロキシ−３−（４−メトキシカルボニルブチル）−
５−フェニル−２，４（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオ
ンエステル（５４．０ｇ，０．１５６モル）、濃塩酸
（５５mL）及び水（５５mL）の混合物を４時間加熱還流
し、そして室温で一晩放置した。ジオキサンを減圧下で
除去し、そして飽和塩化ナトリウム溶液（２５０mL）及
びジクロロメタン（４００mL）を残渣に加えた。有機層
を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン（１５０mL
×３）で抽出した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリ
ウム溶液（２００mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄ で乾燥
し、濾過し、そして溶剤を取り除いた。残渣にジエチル
エーテルを添加し、そしてその混合物を週末の間−１６
℃の冷凍庫に置き、次いで濾過した。

【００５５】工程３：１−（４−クロロカルボニルブチ
ル）−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 製造２由来の酸（６．６ｇ，０．２モル）、塩化チオニ
ル（５０mL）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２滴）
及びクロロホルム（８０mL）の混合物を室温で１．５時
間攪拌した。減圧下ロータリーエバポレーターで溶剤を
除去し、そしてこの生成物を次の工程４に直接用いた。

【００５６】工程４：１−〔４−（４−ベンジルオキシ
カルボニル−１−ピペラジニルカルボニル）ブチル〕−
５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，
５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（７５mL）中工程３の酸塩化物（０．２モ
ル）を、クロロホルム（１００mL）中ベンジル１−ピペ
ラジンカルボキシレート（６．０ｇ，０．０３０モル）
及びトリエチルアミン（４．０ｇ，０．０４モル）の混
合物に１５分間かけて滴下した。この混合物を室温で２
０時間攪拌し、次いでジクロロメタン（３００mL）を添
加した。その混合物を１０％塩酸溶液（１００mL×３）
で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（１００mL）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして溶
剤を除去した。次いで残渣をＳｉＯ₂ でのクロマトグラ
フィーにかけて固体を得た。

【００５７】工程５：５−エチル−５−フェニル−１−
〔４−（１−ピペラジニルカルボニル）ブチル〕−２，
４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンヒド
ロブロミドの製造。 製造４由来の保護アミン（６．５ｇ，０．０１２モル）
及び３０〜３５％臭化水素酢酸溶液（３０mL）を室温で
１．５時間攪拌した。次いでその混合物を酢酸エチル
（２Ｌ）中に注ぎ入れ、１時間攪拌し、濾過し、そして
固体を酢酸エチル５００mLで洗浄した。

【００５８】工程６：１−｛４−〔４−（３−カルボキ
シプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，３
Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（１５０mL）中、工程５のアミン（４．８
ｇ，０．０１モル）、無水コハク酸（１．２ｇ，０．０
１２モル）及びトリエチルアミン（２．２ｇ，０．０２
モル）を、５０〜６０℃で３０分間加熱し、（温水）そ
して周囲温度で１６時間攪拌した。ジクロロメタン（２
００mL）を添加し、その混合物を１０％塩酸溶液（１０
０mL×３）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（１００
mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして減圧下ロータリーエバポレーターで溶剤を除
去すると、白色固体３．３ｇが得られた（収率６６
％）。この物質をＳｉＯ₂ カラムを用いるクロマトグラ
フィーにかけたところ、白色固体が得られた。

【００５９】工程７：５−エチル−５−フェニル−１−
｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチル｝
−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオ
ンの製造。

【００６０】

【化１２】

【００６１】クロロホルム（７５mL）中工程６由来の酸
（３．４ｇ，０．００７モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド（１．６ｇ，０．００８モル）及
びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．０ｇ，０．００
８モル）を室温で２０時間攪拌した。その混合物を濾過
し、そして酢酸エチル（１００mL）を添加した。その有
機溶液を水（１００mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナトリ
ウム溶液（５０mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレータ
ーで溶剤を除去した。固体部分をクロマトグラフィーに
かけたところ、白色固体が得られた。

【００６２】５．ＰＢ２：５−エチル−５−フェニル−
２−（４−スクシンイミドオキシカルボニルブチル−
２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン
の製造。

【００６３】

【化１３】

【００６４】工程２の酸と攪拌すること以外は、製造例
４、工程７の方法を用いてこの物質を製造した。その物
質をエチルエーテル／酢酸エチル（１：１）から結晶化
したところ、白色固体が得られた。

【００６５】６．ＰＢ３：５−エチル−５−フェニル−
１−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジント
リオンの製造。

【００６６】工程１：５−エチル−１−〔４−（２−ヒ
ドロキシエチルアミノカルボニル）ブチル〕−５−フェ
ニル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジント
リオンの製造。 ベンジル１−ピペラジンカルボキシレートの代わりに２
−ヒドロキシエチルアミンを用いる以外は、製造例４の
工程４に概説されたようにこの物質を製造した。

【００６７】工程２：１−｛４−〔２−（３−カルボキ
シプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（１００mL）中、工程１由来の生成物
（２．９ｇ，０．００７モル）、無水コハク酸（０．７
ｇ，０．００７モル）及びジメチルアミノピリジン
（０．９ｇ，０．００７モル）を温水（５０〜６０℃）
で３０分間加熱し、次いで室温で３日間攪拌した。ジク
ロロメタン（３００mL）を添加し、そして混合物を１０
％塩酸溶液（１００mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナトリ
ウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥し、濾過し、そして溶剤を除去したところ、油状
物が得られ、それを次の工程に直接用いた。

【００６８】工程３：ＰＢ３：５−エチル−５−フェニ
ル−１−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕
ブチル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジ
ントリオンの製造。

【００６９】

【化１４】

【００７０】本例の工程２の酸を用いて開始する、製造
例４の工程７に概略された方法を用いて、この物質を製
造した。

【００７１】７．ＰＢ４：５−エチル−５−フェニル−
１−｛４−〔３−（３−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジント
リオンの製造。

【００７２】工程１：１−〔４−（３−ベンジルオキシ
カルボニルアミノプロピルアミノカルボニル）ブチル〕
−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，３
Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 ベンジル１−ピペラジンカルボキシレートの代わりにＮ
−ベンジルオキシカルボニル−１，３−プロパンジアミ
ンを用いる以外は、製造例４の工程４に概略された方法
を用いてこの物質を製造し、そして粗物質を次の工程に
用いた。

【００７３】工程２：１−〔４−（３−アミノプロピル
アミノカルボニル）ブチル〕−５−エチル−５−フェニ
ル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリ
オンヒドロブロミドの製造。 製造例４の工程５のようにこの物質を製造した（本例の
工程１のアミドを用いて開始し、エチルエーテル中に注
ぎ入れた時に油状物が得られたことを除く）。

【００７４】工程３：１−｛４−〔３−（３−カルボキ
シプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 本例の工程２由来のアミンを用いて開始し、酸が得られ
たこと以外は、製造例４の工程６の方法により、この物
質を製造した。

【００７５】工程４：ＰＢ４：５−エチル−５−フェニ
ル−１−｛４−〔３−（３−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕
ブチル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジ
ントリオンの製造。

【００７６】

【化１５】

【００７７】本例の工程３の酸を用いて開始する以外
は、製造例４の工程７の方法を用いてこの物質を製造し
た。

【００７８】８．ＰＢ５：５−エチル−５−フェニル−
１−｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジント
リオンの製造。

【００７９】

【化１６】

【００８０】工程１では、ベンジルオキシカルボニル−
１，３−プロパンジアミンの代わりにＮ−ベンジルオキ
シカルボニル−１，６−ヘキサンジアミンを使用し、そ
してその後の製造例７の工程２，３及び４では各々反応
生成物を用いること以外は、製造例７の反応順序に従っ
てこの化合物を製造した。

【００８１】標識薬物ハプテン類似体類 本発明者らは、バルビツレート類及びヒダントイン薬物
類、特にフェノバルビタール及びフェニトインについて
の競合イムノアッセイに有用である、先に製造したバル
ビツレート及びヒダントイン類似体類の新規標識薬物ハ
プテン類似体類を製造した。標識類は、競合イムノアッ
セイで被検体もしくは被検体類似体と共に通常用いられ
る、アミンもしくはスルフヒドリル基を担持するイムノ
アッセイで常用されるもの、例えば、酵素類、可視色素
類、ロイコ色素類、蛍光色素類及び放射性物質類等であ
る。

【００８２】有用な標識は、酵素類、例えば、アルカリ
性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ
（ＧＯＤ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
である。

【００８３】標識薬物ハプテン類似体類は、下記工程を
含んで成る新規方法を用いて製造される。 １）求核基、例えばアミンもしくはスルフヒドリル基を
表面上に担持する標識を、過剰の上記バルビツレートも
しくはヒダントイン薬物ハプテン類似体と接触させる工
程。好ましくは類似体及び標識を水混和性有機溶剤、例
えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）もしくは溶剤及び水の混合物に溶解
し（緩衝化）、その後一緒に混合する工程、及び ２）未使用活性エステル及び縮合副生成物を、好ましく
は透析により取り除く工程。

【００８４】本明細書の以下に提供される例は、本発明
の新規標識類似体類の製造方法を具体的に説明するもの
である。標識類似体類は、フェニントイン及びフェノバ
ルビタール薬物ハプテン類似体類を用いて製造した。

【００８５】標識ヒダントイン類似体類 １．アミン富化ＨＲＰ標識ヒダントインＨＤ１（伸長連
結鎖、標識ＡＨＲＰ−ＨＤ１、標識Ａを含む）の製造。

【００８６】ＨＤ１を、１０ミリモル４′−ヒドロキシ
アセトアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（ＤＭＦ ４′−Ｈ
Ａ）１．４５２mLに溶解した。

【００８７】アミン富化ＨＲＰを米国特許第５４０，４
２８号明細書に記載のように製造し、またその内容は、
引用することにより本明細書に組み入れられる。簡単に
いえば、乾燥ＨＲＰを０．１モルＭＥＳ緩衝液、pH５．
５に溶解して、緩衝液１０mL中の最終濃度が２．５×１
０^-6モル（１００mg）となるようにした（ＭＥＳ＝２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）。伝統的なファ
クターＡ₄₀₃ １mg／mL＝２．２４を用いてＡ₄₀₃ 測定法
によりタンパク質濃度を求めた。ＨＲＰ溶液を、０．１
モルＭＥＳ緩衝液、pH５．５、１０mL中に溶解したＬ−
リジン一塩酸塩１．５×１０^-3モル（２７５mg）と合わ
せた。新たに調整したＭＥＳ緩衝液中１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
（ＥＤＣ、５×１０^-4モル、９６０mL）の溶液を添加し
た。容器にフタをし、そして室温で一晩混合した。その
反応生成物を再び０．０２モルＭＯＰＳ緩衝液pH７．０
（３Ｌ、１０℃）で透析した。透析緩衝液を３回変え
た。ＭＯＰＳ＝３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホ
ン酸。

【００８８】反応させる前に、アミン富化ＨＲＰの試料
を、３０，０００ＮＭＷＬ（呼称分子量制限分離）セン
トリセル（Ｃｅｎｔｒｉｃｅｌｌｓ）遠心用ウルトラフ
ィルターを用いて、ＭＯＰＳ緩衝液から０．１モルＥＰ
ＰＳ緩衝液、pH８．０に交換した。次いで、この試料を
希釈して、最終濃度１０mg／mLの溶液を得た。

【００８９】アミン富化ＨＲＰ（ＡＨＲＰ）（１mL）を
ジメチルホルムアミド中４′−ヒドロキシアセトアニリ
ドの１０ミリモル溶液（ＤＭＦ ４′−ＨＡ）５００μ
Ｌと、ボルテックスで混合しながら合わせ、次いでそれ
を４２℃の水浴中に設置した。乾燥ＤＭＦ ４′−ＨＡ
溶液１．４５２mL中にＨＤ１を２１mg溶解することによ
り調整したＨＤ１溶液（５００μＬ）を、ボルテックス
で混合しながらＡＨＲＰに滴下したので、フェニトイン
／ＨＲＰのモル比は、５０／１となった。その反応混合
物を、４２℃の水浴中で穏やかに振動させながら１時間
インキュベーションした。

【００９０】その反応混合物をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ＃
２透析管に入れ、更なるＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モ
ルＥＰＰＳ（１：１）０．５mLを用いて反応容器をすす
ぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入れた。

【００９１】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ
（１：１）、pH８．０を用いて４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）２Ｌの０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
む０．１モルＥＰＰＳ、pH８．０を用いて８℃で１５時
間 ｄ）２Ｌの０．１モルＥＰＰＳ、pH８．０を用いて８℃
で３時間、 ｅ）３Ｌの０．０４モル トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン塩酸塩（トリスＨＣｌ）／０．１５モルＮ
ａＣｌ、pH７．５を用いて８℃で３時間、そして ｆ）透析条件ｅ）を用いて３時間、もう１回繰り返す。

【００９２】透析後、０．０２％メルチオレート（ｍｅ
ｒｔｈｉｏｌａｔｅ）（商標）を防腐剤として添加し、
そしてＡＨＲＰ−ＨＤ１を冷蔵保存した。

【００９３】２．アミン富化ＨＲＰ標識ＨＤ２（アミド
結合を伴う伸長連結鎖、標識ＡＨＲＰ−ＨＤ２、標識Ｂ
を含む）の製造。

【００９４】ＨＤ２（１５．５mg）を、１０ミリモル
４′−ヒドロキシアセトアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（Ｄ
ＭＦ ４′−ＨＡ）１．０３１mLに溶解した。

【００９５】標識製造例１に記載されるように製造した
ＡＨＲＰの溶液（１０mg／mL、０．１モルＥＰＰＳ溶
液、pH８．０を１mL）を、ＤＭＦ ４′−ＨＡ ５００
μＬと、ボルテックスで混合しながら合わせ、次いでそ
れを４２℃の水浴中に設置した。上記ＨＤ２溶液（５０
０μＬ）を、ボルテックスで混合しながらＡＨＲＰに滴
下したので、モル比は５０／１となった。その反応混合
物を、４２℃の水浴中で穏やかに振動させながら１時間
インキュベーションした。

【００９６】その反応生成物をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ＃
２透析管に入れ、そして以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ
（１：１）、pH８．０を用いて４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡを含む０．１モルＥＰＰ
Ｓ、pH８．０を用いて８℃で１．５時間 ｄ）１．５Ｌの０．１モルＥＰＰＳ、pH８．０を用いて
８℃で１８時間、 ｅ）１．５Ｌの０．０４モル トリスＨＣｌ／０．１５
モルＮａＣｌ、pH７．５を用いて８℃で２時間、そして ｆ）透析条件ｅ）を用いて４時間、もう１回繰り返す。

【００９７】透析後、０．０２％メルチオレート（商
標）を防腐剤として添加した。標識ヒダントイン誘導体
を冷蔵庫に保存した。

【００９８】３．ＡＨＲＰ−ＨＤ３（アミド結合を伴う
伸長連結鎖、標識ＡＨＲＰ−ＨＤ３、標識Ｃを含む）の
製造。

【００９９】ＨＤ３（９．２mg）を、１０ミリモル４′
−ヒドロキシアセトアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（ＤＭＦ
４′−ＨＡ）１mLに溶解した。

【０１００】標識製造例１に記載されるように製造した
ＡＨＲＰの溶液を、０．１モルＥＰＰＳ緩衝液、pH８．
０で透析した。最終濃度が５．７１mg／mLとなるように
した。

【０１０１】ＡＨＲＰ（１mL）をボルテックスで混合し
ながらＤＭＦ ４′−ＨＡ ５００μＬと合わせ、次い
でそれを４２℃の水浴中に設置した。上記ＨＤ３溶液
（５００μＬ）を、ボルテックスで混合しながらＡＨＲ
Ｐに滴下したので、ＨＤ３／ＡＨＲＰのモル比は５０／
１となった。その反応混合物を４２℃の水浴中で穏やか
に振動させながら１時間インキュベーションした。その
反応混合物をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ＃２透析管に入れ、
更なるＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ（１：
１）０．５mLを用いて反応容器をすすぎ、そのすすぎ液
も一緒に透析管に入れた。

【０１０２】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ
（１：１）、pH８．０を用いて４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡを含む０．１モルＥＰＰ
Ｓ、pH８．０を用いて５℃で１５時間 ｄ）１．５Ｌの０．１モルＥＰＰＳ、pH８．０を用いて
８時間、 ｅ）２Ｌの０．０２モル３−モルホリノプロパンスルホ
ン酸（ＭＯＰＳ）、pH７．０を用いて５℃で１３時間、
そして ｆ）透析条件ｅ）を用いて２回繰り返す。

【０１０３】透析後、０．０２％メルチオレート（商
標）を防腐剤として添加し、そしてその標識生成物を冷
蔵保存した。

【０１０４】標識バルビツレート薬物ハプテン類似体類 以下の例は、標識バルビツレート薬物ハプテン類似体の
製造を具体的に説明するものである。

【０１０５】例４−アミン富化ＨＲＰ標識ＰＢ２（標識
ＡＨＲＰ−ＰＢ２、標識Ｄ）の製造。 ＰＢ２をＤＭＳＯに溶解して１０．７mg／mL溶液（１．
２５×１０^-2モル）を得た。次いでこの溶液の５００μ
Ｌを、ボルテックスで混合しながらアミン富化ＨＲＰ／
ＤＭＳＯ溶液（ＡＨＲＰ／ＤＭＦと同様に調整される）
に滴下した。フェノバルビタール／ＨＲＰのモル比は５
０／１であった。

【０１０６】２４００rpm で振動させながら室温で４時
間インキューベーションを行った。その試料をＳｐｅｃ
ｔｒａｐｏｒ＃２透析管に移し、更に透析後１mLを用い
て反応容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入
れた。標識を０．０２モルＭＯＰＳ緩衝液、pH７．０を
用いて５〜１０℃で透析した。この透析条件を、各回と
も２〜３Ｌの緩衝液を用いて３回繰り返した。透析後、
０．０２％メルチオレート（商標）を防腐剤として添加
し、そして標識を冷蔵保存した。

【０１０７】５．アミン富化ＨＲＰ−ＰＢ３（伸長連結
鎖を含むＡＨＲＰ−ＰＢ３、標識Ｅ）の製造。 アミン富化ＨＲＰを、セントリセル（Ｃｅｎｔｒｉｃｅ
ｌｌ）遠心用ウルトラフィルター（３０，０００呼称分
子量制限）を用いてＭＯＰＳ緩衝液から０．１モルＥＰ
ＰＳ緩衝液、pH８．０に交換した。次いでこの試料を
４．６mL、０．７４３mg／mLまで希釈した。

【０１０８】ＨＲＰ１mLを小バイアルに入れた（１．８
５×１０^-5モル）。１０ミリモル４′−ヒドロキシアセ
トアニリドを含むジメチルホルムアミド（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ２２、７０５〜６）（ＤＭＦ ４′−ＨＡ）５００μ
Ｌをバイアルに添加し、ボルテックスで混合し、そして
４２℃の水浴に設置した。

【０１０９】一方、ＰＢ−３を、ＤＭＦ ４′−ＨＡに
溶解して２．１２mg／mL溶液（３．７０×１０^-3モル）
を得た。この溶液５００μＬを、ボルテックスで混合し
ながらＨＲＰ／ＤＭＦ ４′−ＨＡ溶液に滴下した。フ
ェノバルビタール／ＨＲＰのモル比は、１００／１であ
った。

【０１１０】水浴中で穏やかに振動させながら４２℃で
１時間インキュベーションを行った。その試料をＳｐｅ
ｃｔｒａｐｏｒ＃２透析管に移し、更にＤＭＦ ４′−
ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ（１：１）１mLを用いて反応
容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入れた。

【０１１１】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ
（１：１）、pH８．０を用いて４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡを含む０．１モルＥＰＰ
Ｓ、pH８．０を用いて５℃で一晩 ｄ）１．５Ｌの０．１モルＥＰＰＳ、pH８．０を用いて
５℃で８時間、 ｅ）２Ｌの０．０２モルＭＯＰＳ、pH７．０を用いて５
℃で少なくとも８時間、そして ｆ）透析条件ｅ）を用いて２回繰り返す。

【０１１２】透析後、０．０２％メルチオレート（商
標）を防腐剤として添加し、そしてその標識生成物を冷
蔵保存した。

【０１１３】６．アミン富化ＨＲＰ−ＰＢ１（標識ＡＨ
ＲＰ−ＰＢ１、標識Ｆ、アミド結合を伴う伸長連結鎖を
含むフェノバルビタールハプテン類似体の活性エステ
ル）の製造。

【０１１４】製造したアミン富化ＨＲＰを、０．１モル
ＥＰＰＳ緩衝液、pH８．０に交換して１０mg／mLの溶液
（２．５×１０^-4モル）を得た。標識Ｆを、アミン富化
ＨＲＰ５mL（５０mg）を用いて製造した。磁気攪拌プレ
ートで攪拌しながら、ＤＭＳＯ ２．５mLをゆっくりと
添加した。その溶液を室温で１５分間攪拌した。

【０１１５】一方、ＰＢ１をＤＭＳＯに溶解して１４．
９mg／mL溶液を得た。この溶液２．５mLを、ＨＲＰ／Ｄ
ＭＳＯ溶液に攪拌しながらゆっくり添加した。フェノバ
ルビタール／ＨＲＰのモル比は５０／１であった。

【０１１６】２４００rpm で振動させながら室温で５時
間インキュベーションを行った。その試料をＳｐｅｃｔ
ｒａｐｏｒ＃２透析管に移し、更に透析液を用いて反応
容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入れた。
標識を０．０２モルＭＯＰＳ緩衝液、pH７．０を用いて
５〜１０℃で透析した。この透析条件を、各回とも３Ｌ
の緩衝液を用いて３回繰り返した。透析後、０．０２％
メルチオレート（商標）を防腐剤として添加し、そして
標識を冷蔵保存した。

【０１１７】免疫適格性 以下の例は、上記標識１〜６の免疫適格性を具体的に示
すものである。

【０１１８】 １．標識ＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識Ａ）の免疫適格性。 本例では、標識製造例１）由来のＡＨＲＰ−ＨＤ１（標
識Ａ）を結合する、数種の固定化抗体（ＤｉｌＡｓ₈ ，
ＤｉｌＡｓ₉ ，ＤｉｌＡｓ₁₄, ＤｉｌＡｓ₁₆及びＤｉｌ
Ａｓ₂₁）の能力を検討する。

【０１１９】（ａ）ポリマービーズ試料（各試料が、そ
れに共有結合した先に同定された型の抗体の１つを担持
する）を、米国特許第０８１，２０６号明細書に記載さ
れる方法及び材料を用いて製造した。

【０１２０】（ｂ）ＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識Ａ）を結合
する固定化抗体の能力を以下のように測定した。各種の
抗体ビーズを、各々１％ＢＳＡを含むＰＢＳで連続的に
希釈して、濃度が５００〜０．５ナノモル抗体バインデ
ィング部位となるようにした。ビーズ希釈液を、等量の
１０×１０^-11 モルの標識と混合した。１時間インキュ
ベーション後、遠心によりビーズをペレットにした。上
清のサンプル（１００μＬ）を、基質（ｏ−フェニレン
ジアミン／Ｈ₂ Ｏ₂ ）１００μＬと混合した。４５０nm
での発色速度を標準のものと比較して、溶液中に残存す
るフェニトイン−ＨＲＰ標識の量を計算した。抗体最高
濃度（２５０ナノモル バインディング部位）で試験さ
れた固定化抗体に結合した標識の量を報告する。

【０１２１】

【表１】

【０１２２】これらの結果は、これらの抗体がＡＨＲＰ
−ＨＤ１標識（標識Ａ）を確実に認識することを示して
いる。

【０１２３】 ２．ＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）の加水分解安定性。 本例は、標識とフェニトイン核の間の連結鎖にアミド結
合を有する本発明の標識フェニトイン誘導体、ＡＨＲＰ
−ＨＤ２（標識Ｂ）の加水分解安定性を具体的に説明す
るものである。

【０１２４】固定化カレスタッド（Ｋａｌｌｅｓｔａ
ｄ）抗体を担持するビーズを、米国特許第０８１，２０
６号明細書に記載されるように製造した。

【０１２５】ＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）を、pH７．３
もしくは８．５に調整した１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１
×１０^-10 モルとなるまで希釈した。その標識を室温で
６日間インキュベーションした。その標識を、２日後及
び６日後に、固定化抗体によるバインディングについ
て、以下のように試験した。

【０１２６】カレスタッド（Ｋａｌｌｅｓｔａｄ）５２
−２抗体ビーズを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで連続的に
希釈して、濃度が５００〜０．５０ナノモル抗体バイン
ディング部位となるようにした。ビーズ希釈液を、等量
の１０×１０^-11 モルの標識と混合した。１時間インキ
ュベーション後、遠心によりビーズをペレットにした。
上清のサンプル（１００μＬ）を、基質（ｏ−フェニレ
ンジアミン／Ｈ₂ Ｏ₂）１００μＬと混合した。速度を
標準のものと比較して、溶液中に残存する標識の量を計
算した。抗体最高濃度（２５０ナノモル バインディン
グ部位）で試験された固定化抗体に結合した標識の量を
報告する。

【０１２７】

【表２】

【０１２８】これらの結果は、連結鎖中にアミド結合を
含むＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）のバインディングが、
この時間内で全く分解を示さなかったことを示してい
る。これは、標識Ｂが加水分解による分解に耐性である
であろうことを示す。このような加水分解は、経過時間
に対応するアッセイ応答の変動の原因となったであろ
う。

【０１２９】３．吉草酸エステル及び伸長連結鎖を用い
て製造されたフェノバルビタール−ＨＲＰ標識の比較。 本例では、吉草酸エステル連結鎖を担持する標識（標識
Ｄ、ＡＨＲＰ−ＰＢ２）及び伸長連結鎖を担持する標識
（標識Ｆ、ＡＨＲＰ−ＰＢ１）を結合する、数種の固定
化抗体（Ｋａｌｌ １５７１及びＰｂＡｓ₉ ）の能力を
比較した。

【０１３０】固定化抗体ビーズ試料を、以下のように製
造した。ポリマービーズ（３０mg）〔ポリ（スチレン−
コ−Ｐ−ビニルベンジル２−クロロエチルスルホン）
（モル比９５：５）〕を、緩衝液（０．１モルＥＰＰ
Ｓ、pH８．５）１mLに分散し、そして抗体（Ｋａｌｌ
１５７１もしくはＰｂＡｓ₉）０．３mgを添加した。総
容量を１．５mLにした。その混合物を室温で４時間転倒
回転させた。次いで、ＢＳＡの１０％溶液０．３mLを添
加し、そして上清を取り除き、抗マウスＩｇＧを用いて
未結合抗体について分析した。表面上に結合した抗体の
量をＥＬＩＳＡを用いて計算した。そのペレットを、Ｐ
ＢＳ、pH７．２を用いて、緩衝液への再懸濁及び遠心に
より３回洗浄した。最終再分散液をＰＢＳ１．８mLで調
整し、メルチオレート（商標）を０．０２％の濃度で添
加し、そして生成物を使用するまで４℃で保存した。

【０１３１】標識を結合する固定化抗体の能力を以下の
ように測定した。各種の抗体ビーズを、各々１％ＢＳＡ
を含むＰＢＳで連続的に希釈して、濃度が２００〜０．
５０ナノモル抗体バインディング部位となるようにし
た。ビーズ希釈液を、等量の１０×１０^-11 モルのフェ
ノバルビタール−ＨＲＰ標識と混合した。１時間インキ
ュベーション後、遠心によりビーズをペレットにした。
上清のサンプル（１００μＬ）を、基質（ｏ−フェニレ
ンジアミン／Ｈ₂ Ｏ₂ ）１００μＬと混合した。４５０
nmでの発色速度を標準のものと比較して、溶液中に残存
するフェノバルビタール−ＨＲＰ標識の量を計算した。
抗体最高濃度（１００ナノモル バインディング部位）
で試験された固定化抗体に結合した標識の量を報告す
る。

【０１３２】

【表３】

【０１３３】これらの結果は、本発明により提供される
標識薬物ハプテン類似体類に用いられる伸長連結基を担
持するハプテン類を用いて製造された標識類に対して、
これらの抗体の認識が改良されることを示している。伸
長連結鎖を備えたハプテンを用いることで、これらの抗
体がフェノバルビタール酵素イムノアッセイの検出用要
素として考慮されるため、これは、重要な利点を表すも
のである。

【０１３４】イムノアッセイは、限定されたヒダントイ
ン及びバルビツレート誘導体類に付着できるいずれか適
当な標識を用いて実施できる。前記標識薬物ハプテン類
似体類を製造するのに用いられた西洋ワサビペルオキシ
ダーゼに加えて、有用な標識としては、放射性標識類、
色素類、蛍光発光剤類、別の酵素類、酵素基質類、酵素
阻害剤類、アロステリックエフェクター類、コファクタ
ー類及び別の既知酵素モジュレーター類が挙げられる。
酵素類、例えば、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ類、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びア
ミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホス
ファターゼ、並びにガラクトシダーゼは、好ましい標識
である。

【０１３５】酵素標識が用いられる場合には、酵素に対
する基質を、要素に存在させるか、又は発色液中それに
添加する。基質は、液状試料の添加前にもしくは同時に
添加してもよく、あるいはバインディング反応の完了後
に添加してもよい。標識を与えるのに適する基質を決定
することは、臨床化学業者の技術範囲内である。基質
は、酵素標識が直接作用する物質であってもよく、又は
標識の酵素反応を伴う一連の反応に関与する物質であっ
てもよい。例えば、酵素標識がペルオキシダーゼであれ
ば、基質は過酸化水素である。或る例として、グルコー
スオキシダーゼを用いる場合には、一般的には基質グル
コースを、付着量０．０１モル／ｍ² 、好ましくは０．
００１〜０．１モル／ｍ² となるように、試薬層に存在
させるか、又は発色液に添加する。アッセイに用いられ
る酵素標識の量に関連して、特定の基質の量をどのよう
に調節すればよいのかは、当業者には既知であるだろ
う。

【０１３６】特定の標識を用いる場合には、例えば、酵
素類、コファクター類、酵素基質類もしくは酵素モジュ
レーター類を用いる場合には、試薬層は、標識の反応の
結果として検出可能な種を提供する試薬を１つ以上含ん
で成る指示組成物を含有する。好ましくは、指示組成物
が、基質と酵素標識リガンド類似体の酵素反応の結果と
して比色定量的に検出可能な種を提供する、比色定量的
指示組成物である。

【０１３７】指示組成物は、酵素反応において検出可能
な色素を生成する単一化合物であってもよく、又は色素
を生成する試薬の組み合わせであってもよい。例えば、
基質としてグルコースが用いられ、そして酵素標識とし
てグルコースオキシダーゼが用いられる場合には、比色
定量的指示組成物は、反応して色素を提供するカプラー
及び酸化可能な化合物を含むことができる。あるいは、
組成物はロイコ色素及びペルオキシダーゼ、もしくはグ
ルコースオキシダーゼがグルコースをグルコン酸に転化
する場合に生成される過酸化水素の生成の結果として検
出可能な色素を生成する別の適当なペルオキシダーゼ様
化合物を含むことができる。有用なロイコ色素類は、当
該技術分野で既知であり、そして例えば、米国特許第
４，０８９，７４７号及び同第６１２，５０９号明細書
に記載されるものが挙げられる。比色定量的指示組成物
の特定の量及びその各種の成分は、当業者の技術範囲内
である。

【０１３８】イムノアッセイは、手動もしくは自動であ
ってもよい。一般的には、液体中のリガンドの量は、供
給ロール、チップパケットもしくは別の供給源より要素
を取り出し、そして展開層の一定領域を液体の試料、例
えば１〜１００μｌと物理的に接触させることによっ
て、測定される。接触させる一定領域は、一般的には約
１００mm² 以下である。

【０１３９】リガンドの量は、複合体化リガンド類似体
を直接検出するのに適した装置、又は酵素標識と基質の
酵素的反応の結果として生成される検出可能な種を検出
するのに適した装置を介して、要素を通過せしめること
により検出される。例えば、これらの種は、周知の方法
を用いて、適当な放射計、蛍光計もしくは分光光度計を
用いて検出できる。酵素反応では、得られた生成物は、
例えば、試験試料と接触させた一定領域の中心における
反射もしくは透過濃度又は蛍光を測定することにより、
測定される。測定される領域は、一般的には競合アッセ
イに関しては直径３〜５mmである。液状試料中のリガン
ドの量は、一定領域の中心で測定される標識の量に反比
例する。好ましい態様では、未複合体化リガンドから複
合体化リガンドを最大限分離するために、分離発色工程
を必要とする。一般的には、試料接触及び分離もしくは
発色液の適用後、５〜１８０秒後に標識測定が実施され
る。

【０１４０】

【具体的な態様】以下の例は、上記標識薬物ハプテン類
似体を用いた乾式イムノアッセイ要素を使用した伝統的
なイムノアッセイを具体的に説明するものである。これ
らの例は、フェニトイン及びフェノバルビタールについ
てのアッセイを行うことにより、本発明を具体的に説明
している。しかしながら、本発明が、別のバルビツレー
ト及びヒダントイン薬物誘導体類に適用されることは、
明らかであろう。

【０１４１】これらの例では、アッセイ方法を以下のプ
ロトコールに従い段階を追って実施した。１０μＬの試
料を本発明の乾式イムノアッセイ要素の表面上にスポッ
トした。次いで今しがた試料をスポットした要素を、３
７℃で５分間インキュベーションした。インキュベーシ
ョン後、その要素をインキュベーターから取り出し、そ
して酵素基質溶液１０μＬで発色させた。これらの例で
用いられたアッセイでは、標識は西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）であり、そして発色溶液に用いられた
基質は、約０．３重量％Ｈ₂ Ｏ₂ であった。また、発色
溶液は、リン酸ナトリウム緩衝液（pH６．８）０．０１
モル、４′−ヒドロキシアセトアニリド（電子転移剤）
０．００５モル、ジエチレントリアミンペンタ酢酸１０
マイクロモル及び界面活性剤を含むものであった。発色
溶液は、検出可能な種を発色させる。結合ＨＲＰ−標識
リガンドは、無色ロイコ色素の着色型への酸化を触媒す
る。このような色素は、乾式分析要素技術分野では周知
であるので、本明細書に詳細に記載するつもりはない。
本明細書に記載される例において、ロイコ色素はトリア
リールイミダゾールである。触媒反応の速度は、３７℃
で一定期間における反射濃度の変化により測定した。反
射濃度の測定方法及び手段は、分析技術分野で周知であ
る。

【０１４２】例１：フェニトインについてのイムノアッ
セイにおける標識フェニトイン類似体（ＡＨＲＰ−ＨＤ
１、標識Ａ）の使用。 下記構造を有するように、既知技術を用いて要素を製造
した。

【０１４３】 付着量 ｇ／ｍ² 展開層 固定化Ｋａｌｌｅｓｔａｄ ５２−２抗体 0.1 ポリ〔ｍ−及びｐ−ビニル−トルエン（６４：３６） 130 −コ−メタクリル酸〕（重量比９８：２（３０μｍ）） の粒子 ４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２ 0.2 −（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル） イミダゾール ロイコ色素 ポリ（メチルアクリレート−コ−ナトリウム２−ア 2.58 クリルアミド−２−メチルプロパンスルホネート− コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート） （重量比９０：４：６） Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 0.219 アミノエタンスルホン酸（pH７．０） ジメチルスルホキシド 1.8 ５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン 0.05 ゾニル（Ｚｏｎｙｌ）（商標）ＦＳＮ非イオン性界 0.054 面活性剤（ＤｕＰｏｎｔ） ゼラチン層 硬化ゼラチン 10 ４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.15 Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 0.68 アミノエタンスルホン酸（pH７．０） トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（商標）Ｘ−１００非イ 0.02 オン性界面活性剤（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ） ポリ（エチレンテレフタレート）支持体

【０１４４】フェニトイン及びＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識
Ａ）を含む一連のヒト血清ベースキャリブレーターを調
製した。凍結乾乾血清ベースキャリブレーター（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）をイオン交換水３mLでもとに戻した。フェニト
インの濃度を０．５〜１２８μｇ／mLに変化させた。最
終濃度１ナノモルとなるように標識Ａを添加した。

【０１４５】一連のフェニトイン標準（アリコート１０
μＬ）を、上記配置を有する一連の同一分析要素の展開
層上にスポットした。３７℃で５分間インキュベーショ
ン後、過酸化水素（０．０３％）、リン酸ナトリウム緩
衝液（０．０１モル、pH６．８）、４′−ヒドロキシア
セトアニリド（５ミリモル）及びジエチレントリアミン
ペンタ酢酸（１０マイクロモル）を含む発色溶液（１０
μＬ）を添加して色素生成を開始させた。約１分間経過
後、３７℃、６８０nmで、領域の中心における反射濃度
（Dr）を測定した。クラッパーウィリアムス（Ｃｌａｐ
ｐｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ）変換により、Dr値をDtに変
換した。３０秒間に亘るDtの変化を計算した。結果を以
下に示す。

【０１４６】

【表４】

【０１４７】これらの結果は、所望の動的範囲に亘って
十分な速度変化があることを示している。治療範囲は１
０〜２０μｇ／mLである。本例は、本発明により提供さ
れるイムノアッセイ方法に有用な分析要素、及び薬物フ
ェニトインを検出するための競合バインディングアッセ
イにおけるその使用を具体的に説明するものである。

【０１４８】例２：フェニトインについてのイムノアッ
セイにおける伸長連結鎖及びアミド結合を担持するＡＨ
ＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）の使用。 本例は、本発明により提供される別の分析要素及び薬物
フェニトインを検出するための競合バインディングアッ
セイにおける本発明の標識ヒダントイン誘導体としての
その使用を、具体的に説明するものである。下記構造を
有するように、既知技術を用いて要素を製造した。

【０１４９】 付着量 ｇ／ｍ² 展開層 固定化Ｋａｌｌｅｓｔａｄ ５２−２抗体 0.1 ポリ〔ｍ−及びｐ−ビニル−トルエン（６４：３６） 130 −コ−メタクリル酸〕（重量比９８：２（３０μｍ）） の粒子 ４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２ 0.2 −（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル） イミダゾール ロイコ色素 ポリ（メチルアクリレート−コ−ナトリウム２−ア 2.58 クリルアミド−２−メチルプロパンスルホネート− コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート） （重量比９０：４：６） Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 0.219 アミノエタンスルホン酸（pH７．０） ジメチルスルホキシド 1.8 ５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン 0.05 ゾニル（Ｚｏｎｙｌ）（商標）ＦＳＮ非イオン性界 0.054 面活性剤（ＤｕＰｏｎｔ） ゼラチン層 硬化ゼラチン 10 ４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.15 Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 0.68 アミノエタンスルホン酸（pH７．０） トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（商標）Ｘ−１００非イ 0.02 オン性界面活性剤（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ） ポリ（エチレンテレフタレート）支持体

【０１５０】フェニトイン及び標識Ｂ（ＡＨＲＰ−ＨＤ
２）を含む一連のヒト血清ベースキャリブレーターを調
製した。凍結血清ベースキャリブレーターに、０〜７０
μｇ／mLの濃度でフェニトインを含ませた。最終濃度１
ナノモルとなるように標識Ｂを添加した。

【０１５１】一連のフェニトイン標準（アリコート１０
μＬ）を、上記配置を有する一連の同一分析要素の展開
層上にスポットした。３７℃で５分間インキュベーショ
ン後、過酸化水素（０．０３％）、リン酸ナトリウム緩
衝液（０．０１モル、pH６．８）、４′−ヒドロキシア
セトアニリド（５ミリモル）及びジエチレントリアミン
ペンタ酢酸（１０マイクロモル）を含む発色溶液（１０
μＬ）を添加して色素生成を開始させた。約１分間経過
後、３７℃、６８０nmで、領域の中心における反射濃度
（Dr）を測定した。クラッパーウィリアムス（Ｃｌａｐ
ｐｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ）変換により、Dr値をDtに変
換した。３０秒間に亘るDtの変化を計算した。結果を以
下に示す。

【０１５２】

【表５】

【０１５３】これらの結果は、所望の動的範囲に亘って
十分な速度変化があることを示している。治療範囲は１
０〜２０μｇ／mLである。

【０１５４】例３：フェニトインについてのイムノアッ
セイにおけるアミド結合を有するヘキサンジアミンより
製造された伸長連結鎖を担持する標識フェニトイン誘導
体、ＡＨＲＰ−ＨＤ３（標識Ｃ）の使用。

【０１５５】本例は、薬物フェニトインを検出するため
の競合バインディングアッセイにおける、本発明の異な
る標識ヒダントイン誘導体を用いた例２に記載の分析要
素の使用を具体的に説明するものである。

【０１５６】フェニトイン及び標識製造例３由来の標識
Ｃを含む一連のヒト血清ベースキャリブレーターを調製
した。凍結血清ベースキャリブレーターに、０〜７０μ
ｇ／mLの濃度でフェニトインを含ませた。最終濃度１ナ
ノモルとなるように標識Ｃを添加した。

【０１５７】標識Ｂの代わりに標識Ｃを含むことを除い
て例２に記載のものと同一の一連の分析要素の展開層上
に、一連のフェニトイン標準（アリコート１０μＬ）を
スボットした。３７℃で５分間インキュベーション後、
過酸化水素（０．０３％）、リン酸ナトリウム緩衝液
（０．０１モル、pH６．８）、４′−ヒドロキシアセト
アニリド（５ミリモル）及びジエチレントリアミンペン
タ酢酸（１０マイクロモル）を含む発色溶液（１０μ
Ｌ）を添加して色素生成を開始させた。約１分間経過
後、３７℃、６８０nmで、領域の中心における反射濃度
（Dr）を測定した。クラッパーウィリアムス（Ｃｌａｐ
ｐｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ）変換により、Dr値をDtに変
換した。３０秒間に亘るDtの変化を計算した。結果を以
下に示す。

【０１５８】

【表６】

【０１５９】これらの結果は、所望の動的範囲に亘って
十分な速度変化があることを示している。

【０１６０】例４：フェノバルビタールについてのエン
ザイムイムノアッセイにおける伸長連結鎖を用いて製造
されたフェノバルビタールＨＲＰ標識の使用。

【０１６１】本例は、本発明の分析要素の製造方法及び
薬物フェノバルビタールを検出するための競合バインデ
ィングアッセイにおけるその使用を具体的に説明するも
のである。下記構造を有するように、既知技術を用いて
要素を製造した。

【０１６２】 付着量 ｇ／ｍ² 展開層 固定化Ｋａｌｌｅｓｔａｄ １５７１抗体 0.125 ポリ〔ｍ−及びｐ−ビニル−トルエン（６４：３６） 130 −コ−メタクリル酸〕（重量比９８：２（３０μｍ）） の粒子 ４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２ 0.2 −（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル） イミダゾール ロイコ色素 ポリ（メチルアクリレート−コ−ナトリウム２−ア 2.58 クリルアミド−２−メチルプロパンスルホネート− コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート） （重量比９０：４：６） Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 0.219 アミノエタンスルホン酸（pH７．０） ジメチルスルホキシド 1.8 ５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン 0.05 ゾニル（Ｚｏｎｙｌ）（商標）ＦＳＮ非イオン性界 0.054 面活性剤（ＤｕＰｏｎｔ） ゼラチン層 硬化ゼラチン 10 ４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.15 Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 0.68 アミノエタンスルホン酸（pH７．０） トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（商標）Ｘ−１００非イ 0.02 オン性界面活性剤（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ） ポリ（エチレンテレフタレート）支持体

【０１６３】フェノバルビタール及びフェノバルビター
ル−ＨＲＰ標識（標識製造６のＰＢ−３由来の標識ＡＨ
ＲＰ−ＰＢ３もしくは標識Ｅ）を含む一連のヒト血清ベ
ースキャリブレーターを調製した。フェノバルビタール
の濃度を０〜８０μｇ／mLに変化させた。最終濃度６ナ
ノモルとなるようにフェノバルビタール−ＨＲＰ標識を
添加した。

【０１６４】一連のフェノバルビタール標準（アリコー
ト１０μＬ）を一連の分析要素の展開層上にスポットし
た。３７℃で５分間インキュベーション後、過酸化水素
（０．０３％）、リン酸ナトリウム緩衝液（０．０１モ
ル、pH６．８）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５
ミリモル）及びジエチレントリアミンペンタ酢酸（１０
マイクロモル）を含む洗浄溶液（１０μＬ）を添加し
て、フェノバルビタール標準が塗布された領域の中心か
ら未結合複合体を洗い流し、そして色素生成を開始させ
た。約１分間経過後、３７℃、６８０nmで、領域の中心
における反射濃度（Dr）を測定した。クラッパーウィリ
アムス（Ｃｌａｐｐｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ）変換によ
り、Dr値をDtに変換した。３０秒間に亘るDtの変化を計
算した。結果を以下に示す。

【０１６５】

【表７】

【０１６６】これらの結果は、所望の動的範囲に亘って
十分な速度変化があることを示している。治療範囲は２
０〜４０μｇ／mLである。

【０１６７】例５：フェノバルビタールについてのエン
ザイムイムノアッセイにおけるアミド結合を有する伸長
連結鎖を用いて製造されたフェノバルビタール−ＨＲＰ
標識の使用。 本例は、本発明の分析要素の製造方法及び薬物フェノバ
ルビタールを検出するための競合バインディングアッセ
イにおけるその使用を具体的に説明するものである。下
記構造を有するように、既知技術を用いて要素を製造し
た。

【０１６８】 付着量 ｇ／ｍ² 展開層 固定化ＰｂＡｓ９抗体 0.40 ポリ〔ｍ−及びｐ−ビニル−トルエン（６４：３６） 130 −コ−メタクリル酸〕（重量比９８：２（３０μｍ）） の粒子 ４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２ 0.2 −（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル） イミダゾール ロイコ色素 ポリ（メチルアクリレート−コ−ナトリウム２−ア 2.58 クリルアミド−２−メチルプロパンスルホネート− コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート） （重量比９０：４：６） Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 0.219 アミノエタンスルホン酸（pH７．０） ジメチルスルホキシド 1.8 ５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン 0.05 ゾニル（Ｚｏｎｙｌ）（商標）ＦＳＮ非イオン性界 0.054 面活性剤（ＤｕＰｏｎｔ） ゼラチン層 硬化ゼラチン 10 ４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.15 Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２− 0.68 アミノエタンスルホン酸（pH７．０） トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（商標）Ｘ−１００非イ 0.02 オン性界面活性剤（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ） ポリ（エチレンテレフタレート）支持体

【０１６９】フェノバルビタール及びフェノバルビター
ル−ＨＲＰ標識（ＡＨＲＰ−ＰＢ−１、標識製造６由来
の標識Ｆ）を含む一連のヒト血清ベースキャリブレータ
ーを調製した。凍結血清ベースキャリブレーターに、０
〜８０μｇ／mLの濃度でフェノバルビタールを含ませ
た。最終濃度が８ナノモルとなるようにフェノバルビタ
ール−ＨＲＰ標識を添加した。

【０１７０】一連のフェノバルビタール標準（アリコー
ト１０μＬ）を一連の分析要素の展開層上にスポットし
た。３７℃で５分間インキュベーション後、過酸化水素
（０．０３％）、リン酸ナトリウム緩衝液（０．０１モ
ル、pH６．８）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５
ミリモル）及びジエチレントリアミンペンタ酢酸（１０
マイクロモル）を含む洗浄溶液（１０μＬ）を添加し
て、フェノバルビタール標準が塗布された領域の中心か
ら未結合複合体を洗い流し、そして色素生成を開始させ
た。約１分間経過後、３７℃、６８０nmで、領域の中心
における反射濃度（Dr）を測定した。クラッパーウィリ
アムス（Ｃｌａｐｐｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ）変換によ
り、Dr値をDtに変換した。３０秒間に亘るDtの変化を計
算した。結果を以下に示す。

【０１７１】

【表８】

【０１７２】これらの結果は、所望の動的範囲に亘って
十分な速度変化があることを示している。治療範囲は２
０〜４０μｇ／mLである。これらの例の前記要素におい
て、標識薬物ハプテン誘導体は試料と共に要素上にスポ
ットされる。あるいは、標識薬物ハプテン誘導体は、要
素展開層上にグラビアコーティングできる。

【０１７３】本発明の更なる具体的な態様を、請求項１
との関連で以下に列挙する。

【０１７４】２．連結鎖が、１，４−ピペラジニレン、
２，５−ジメチル−１，４−ピペラジニレン、１，３−
イミダゾリジニレン及び１，３−ヘキサヒドロジアゼピ
ニレンより選ばれる複素環式基を含む請求項１のイムノ
アッセイ方法。

【０１７５】３．標識薬物ハプテン類似体が、本明細書
に先に定義された構造Ｉに従う請求項１のイムノアッセ
イ方法。

【０１７６】４．Ｒ¹ が、各々独立して、水素、メチ
ル、プロピル、ヘキシル、デシル、未置換フェニルもし
くは炭素原子数１〜６個のアルキル、ニトロ、ハロゲ
ン、シアノ及び炭素原子数１〜６個のアルコキシで置換
されたフェニルで表され、Ｒ² ，Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ 及びＲ
⁶ が、各々独立してエチレン、ブチレン、ペンチレン、
オクチレンもしくは少なくとも１つ以上のエステル基、
アミド基、−Ｏ−，−Ｓ−もしくは−ＮＲ−を割り込ま
せたこのようなアルキレンより選ばれるアルキレンを表
し、Ｒ³ が、メチレン、エチレンもしくはトリメチレン
を表し、Ｚが、−ＮＲ−（ここで、Ｒは、水素、メチ
ル、プロピルもしくはヘキシルを表す）を表し、そして
標識が、酵素を表す、具体的な態様３のイムノアッセイ
方法。

【０１７７】５．Ｒ¹ が、各々独立してフェニルもしく
はエチルを表し、Ｒ² がテトラメチレンを表し、Ｒ³ が
エチレンを表し、Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ 及びＲ⁶ が各々独立してエ
チレンもしくはヘキシレンを表し、Ｚが−Ｏ−もしくは
−ＮＨ−であり、そして標識が酵素である、具体的な態
様４のイムノアッセイ方法。

【０１７８】６．標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）もしくはアミン富化西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（ＡＨＲＰ）であり、標識薬物ハプテン類似体が標
識フェニトインもしくはフェノバルビタール類似体であ
り、そして薬物ハプテン類似体を西洋ワサビペルオキシ
ダーゼに連結する連結基が、テトラメチレンカルボニル
イミノヘキサメチレンイミノカルボニルエチレンカルボ
ニル、テトラメチレンカルボニル−１，４−ピペラジニ
レンカルボニルエチレンカルボニル及びテトラメチレン
カルボニルイミノエチレンオキシカルボニルエチレンカ
ルボニルより選ばれる、具体的な態様５のイムノアッセ
イ。

【０１７９】７．イムノアッセイ要素で実施される先に
特許請求した方法のいずれか１つの方法。

【０１８０】８．方法が、標識薬物ハプテン類似体を含
むイムノアッセイ要素で実施される請求項１及び具体的
な態様２〜６のいずれか１つの方法。

【０１８１】９．或る層もしくは区画に抗体を含み、そ
して展開層もしくは区画に標識ヒダントイン誘導体を含
むイムノアッセイ要素で実施される請求項１及び具体的
な態様２〜６のいずれか１つの方法。

【０１８２】１０．抗体が特定の層中のビーズ上に固定
化され、そして標識薬物ハプテン類似体が抗体を含む層
の上に直接コーティングされているイムノアッセイ要素
を用いて実施される、請求項１及び具体的な態様２〜６
のいずれか１つの方法。

【０１８３】１１．請求項１及び具体的な態様２〜６の
いずれか１つに従うフェニトインもしくはフェノバルビ
タール類似体より選ばれる標識ハプテンの層、区画もし
くはコーティングを有するイムノアッセイ要素。

【０１８４】１２．薬物がフェニトインもしくはフェノ
バルビタールであるアッセイを行うための、請求項１及
び具体的な態様２〜６のいずれか１つのイムノアッセイ
方法。

【０１８５】

【発明の効果】少なくとも６５％の標識薬物ハプテン類
似体が、薬物に対する過剰の固定化抗体により結合され
うる。伸長連結鎖を担持する標識類似体類、特に連結鎖
中にアミド結合を有するものは、実際に本発明を低減す
るのに用いられるいかなるタイプの固定化抗体によって
も、同様に結合される。また、伸長連結鎖中にアミドを
有する誘導体類は、加水分解に対して非常に安定であ
る。標識薬物類似体類を含む要素を用いて行われる競合
イムノアッセイは、通常治療を目的とする薬物濃度範囲
において、反射濃度変化を十分に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スーザン ジーン ダニエルソン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14609, ロチェスター，ラクロワ コート ９ (72)発明者 バーバラ エー．ブラモンド アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，スウィート アクレス ド ライブ 14 (72)発明者 デビッド アラン ヒルボーン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14467, ヘンリエッタ，サザーランド ヒルズ サ ークル 10

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ａ．抗体−薬物免疫複合体の生成を促進
   する条件下かつ薬物に対する抗体の存在下、薬物もしく
   はそれらの誘導体を含む液状試料を、薬物もしくは薬物
   誘導体の標識類似体と接触させる工程、及び Ｂ．結合もしくは未結合標識薬物ハプテン類似体を測定
   することにより、液体中の薬物の量を測定する工程であ
   って、上記標識薬物ハプテン類似体が、 （Ａ）アミンもしくはスルフヒドリル基を有する、イム
   ノアッセイに用いられるタイプの標識、 （Ｂ）ヒダントイン核もしくはバルビツレート核より選
   ばれる薬物ハプテン核、及び （Ｃ）薬物ハプテン核の３位をカルボニル橋を介して標
   識に連結する連結鎖、を含んで成り、上記連結鎖が、
   （１）Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキレン基、（２）フェニレン基、
   及び（３）環窒素原子を介して連結基に結合した５〜７
   員複素環、から成る５〜４０個の原子を有し、上記基及
   び環が、（ａ）エステル 【化１】 （上式中、ＺはＯもしくはＳである）、（ｂ）アミド 【化２】 （ｃ）−Ｏ−，−Ｓ−、及び−ＮＲ−より選ばれるヘテ
   ロ原子（ここで、Ｒは、Ｃ₁ 〜Ｃ₆ アルキルを表す）、
   並びに（ｄ）カルボニルより選ばれる化学基を介して互
   いに結合しており、連結基が、炭素原子数２〜１２個を
   有する飽和もしくは不飽和モノカルボン酸の誘導体以外
   のものであることを条件とすることで特徴付けられる工
   程、を含んで成る薬物のイムノアッセイ方法。