JPH06245774A - コンドロイチナーゼ遺伝子 - Google Patents
コンドロイチナーゼ遺伝子Info
- Publication number
- JPH06245774A JPH06245774A JP5035810A JP3581093A JPH06245774A JP H06245774 A JPH06245774 A JP H06245774A JP 5035810 A JP5035810 A JP 5035810A JP 3581093 A JP3581093 A JP 3581093A JP H06245774 A JPH06245774 A JP H06245774A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aaa
- leu
- ser
- tta
- aat
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
- C12Y402/02004—Chondroitin ABC lyase (4.2.2.4), i.e. chondroitinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
造を明らかにして、これを遺伝子工学的手法によって、
純粋な形で安価かつ大量に提供する手法を確立するこ
と。 【構成】 特定のアミノ酸配列を有するコンドロイチナ
ーゼ、当該アミノ酸配列をコードするコンドロイチナー
ゼ遺伝子、当該コンドロイチナーゼ遺伝子を組み込んだ
組み換えDNA 、並びに当該組み換えDNA で形質
転換したことを特徴とする形質転換体。
Description
コードする遺伝子、より具体的にはプロテウス ブルガ
リス コンドロイチナーゼABCをコードする遺伝子、
当該遺伝子を組み込んだ組み替えDNA、当該組み替え
DNAで形質転換を行った形質転換体、並びに当該形質
転換体により生産されるコンドロイチナーゼに関する。
である、コンドロイチン硫酸A、同B、同C、及びヒア
ルロン酸を不飽和二糖に分解する活性を有する酵素であ
る。かかるコンドロイチナーゼは、上記基質の用途に応
じた低分子化や種々の研究用試薬として用いられてい
る。
微生物においてその存在が知られている。例えば、プロ
テウス属、フラボバクテリウム属、バクテロイデス属、
アルスロバクター属、シュウドモナス属、コリネバクテ
リウム属、ビブリオ属、マイクロコッカス属、アエロモ
ナス属、ベネキア属、ストレプトコッカス属、バチルス
属等においてコンドロイチナーゼの存在が確認されてい
る。ただし、これらのコンドロイチナーゼは、各々の微
生物によって基質特異性や阻害物質が微妙に異なってい
る。
古くからコンドロイチナーゼの存在が確認されており
(ジャーナル オブ バイオケミストリー,243,1523(19
68) 、ジャーナル オブ ジェネラル マイクロバイオ
ロジー,80,515(1974) 、バイオケミカルジャーナル,14
5,397(1975)) 、発明者等も「ジャーナル オブ バイ
オケミストリー,50,1057(1986)」でプロテウス ブルガ
リスにおけるコンドロイチナーゼの存在を明らかにして
いる。このコンドロイチナーゼは、「コンドロイチナー
ゼABC」とよばれるコンドロイチン硫酸A、同B、及
び同Cをすべて分解する能力を有するコンドロイチナー
ゼの範疇に属する酵素であることはすでに明らかにされ
ている。そしてさらに、当該コンドロイチナーゼの単離
・精製が試みられているが、多数の報告における分子量
は統一されておらず、確立した見解を得るには至ってい
ない。
は、コンドロイチナーゼABCを有するプロテウス属細
菌の中でも代表的なプロテウス ブルガリスのコンドロ
イチナーゼABCをコードする遺伝子の構造を明らかに
して、これを遺伝子工学的手法によって、純粋な形で安
価かつ大量に提供する手法を確立することである。
決のために鋭意検討を重ねた結果、上記プロテウスブル
ガリスのコンドロイチナーゼABCの遺伝子を単離して
その塩基配列を解析するに至った。すなわち本発明は、
以下の技術的思想をその要旨とするものである。
ドするコンドロイチナーゼ遺伝子。 (2) 配列番号2記載のアミノ酸配列をコードするコンド
ロイチナーゼ遺伝子。 (3) 配列番号3記載の塩基配列を有するコンドロイチナ
ーゼ遺伝子。 (4) 配列番号4記載の塩基配列を有するコンドロイチナ
ーゼ遺伝子。 (5) 前記(1)〜(2) のいずれかの項に記載されたコンド
ロイチナーゼ遺伝子を組み込んだ組み換えDNA。
転換したことを特徴とする形質転換体。 (7) 前記(6) に記載した形質転換体を培養し、当該培養
物からコンドロイチナーゼを採取することを特徴とする
コンドロイチナーゼの製造方法。 (8) 配列番号1記載のアミノ酸配列を有するコンドロイ
チナーゼ。
るコンドロイチナーゼ。 以下、本発明について詳細に説明する。本発明コンドロ
イチナーゼ遺伝子は、通常公知の方法を用いて単離する
ことができる。すなわち、プロテウス ブルガリスの菌
体より直接全DNAを常法により抽出し、これを適切な
ベクターに導入する。次に、かかる導入ベクターを当該
ベクターの種類に対応した宿主に導入して、プロテウス
ブルガリスの全DNAについての遺伝子ライブラリー
を調製する。そして当該遺伝子ライブラリーから本発明
コンドロイチナーゼ遺伝子を含むクローンを選択する。
かかる選択手段としては、例えばコンドロイチナーゼタ
ンパク質の部分アミノ酸配列より、その塩基配列を推定
して調製した合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて
選択する方法( 特願平4-253016号公報) を例示すること
ができる。さらには、後述する手法により本発明にかか
るコンドロイチナーゼ遺伝子の塩基配列が判明した場合
には、当該塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いたPCR 法(Saiki,R.et al.,Am.J.Hum.Gene
t.,37,172(1985)) に従って、遺伝子を増幅させること
により上記クローニングをすることもできる。
遺伝子の塩基配列の決定は、通常公知の方法、例えばマ
キサム- ギルバート法(Maxam-Gilbert.,Meth.Enzym.,6
5,499(1980)) や、M13 ファージを用いるジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法(Messing J.and Vieire,19,269(198
2)) 等により実行することができる。なお、既存の各種
の制限酵素を用いて、本発明遺伝子の制限酵素地図を作
成することもできる。
を有する本発明遺伝子を再度プロテウス ブルガリスか
ら調製することも可能であるが、これを直接DNA合成
装置で化学合成することも可能である。次にコンドロイ
チナーゼ遺伝子を組み込んだ、組み込み用ベクターを構
築する。
は、当該コンドロイチナーゼ遺伝子の導入を企図する宿
主の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、
宿主として大腸菌を用いる場合には、pBR322やpUC18 等
のColE1 系のもの;pACYC177やpACYC188等のp15A系のも
の;更にミニF等のF因子系のもの;pSC101等のR因子
系の各種ベクターを、また上記ベクターの他、EMBL3,4
やλgt10,11 等のファージベクターや、pKY2662,pCOS1-
10,HormerIII等のコスミド等をも組み込み用ベクターと
して用いることができる。また、酵母を宿主として用い
る場合には、2μm DNA由来のYEp 系やars を用いた
YRp 系、ars 若しくは2μm 系にセントロメア配列を付
加したYCp 系、染色体への組み込み型であるYIp系のベ
クター等を組み込み用ベクターとして用いることができ
る。さらに、枯草菌を宿主として用いる場合には、pUB1
10やpHY300PLK 等の大腸菌とのシャトルベクターを組み
込み用ベクターとして用いることができる。
菌では、コンドロイチナーゼの構造遺伝子の上流にプロ
モーター配列、SD配列等が位置するようにベクターを
設計する必要がある。真核生物用のベクターを基本ベク
ターとして採用する場合には、上記と同様に、プロモー
ター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位等
が含まれるようにベクターを設計する必要がある。
既に備えた発現用ベクターは既に市販されている。例え
ば昆虫細胞における発現を企図する場合には、例えばバ
キュロウイルスの発現系においては、大腸菌とのシャト
ルベクターであるpAc373,pAcYM1 若しくはその誘導体等
を発現用ベクターとして用いることができる。
ずしも直接発現系に限定されるものではなく、例えば融
合蛋白発現系をを企図したベクターを設計することがで
きる。かくして得られた発現ベクターの宿主細胞への導
入、及びこれによる形質転換の方法は、通常一般に用い
られる方法を採ることができる。例えば、宿主として大
腸菌を用いる場合には、宿主細胞の対数増殖期にある細
胞を集め、CaCl2 処理して自然にDNAを取り込みやす
い状態にして、かかる処理細胞に上記ベクターを取り込
ませる方法等を採用することができる。なおかかる方法
において、形質転換率の向上のためにMgCl2 やRbClを更
に共存させて、形質転換・形質導入を行うこともでき
る。
常法に従い培養することにより、所望のコンドロイチナ
ーゼが生産・蓄積される。当該培養に用いられる培地
は、通常の細胞培養に慣用される各種の培地のいずれを
も用いることができる。例えば、L培地、E培地、M9
培地等、又は当該培地に通常知られている各種の炭素
源、窒素源、無機塩、ビタミン類等を添加した上記の培
地、例えばM9最小培地等を用いて培養するのが好まし
い。また、当該培地には培養における適切な時期に、イ
ンドールアクリル酸等のトリプトファン・プロモーター
の働きを強めるための薬剤を添加することもできる。
ドロイチナーゼの単離・精製は常法に従い実行可能であ
る。特に、コンドロイチナーゼを宿主から抽出する場合
は、例えば浸透圧ショック法等の温和な条件を採用する
のが、その高次構造保持の面からより好ましい。上記単
離・精製は、例えば当該ポリペプチドの物理・化学的性
質を利用した各種の処理操作法に従い実施できる(例え
ば「生化学データーブックII」pp1175-1259 、第1版・
第1刷、1980年6月23日、株式会社東京化学同人発行を
参照のこと)。当該方法としては、例えば具体的には通
常の蛋白沈澱剤による処理、限外ろ過、分子篩クロマト
グラフィー(ゲルろ過)、液体クロマトグラフィー、遠
心分離、電気泳動、アフニィティクロマトグラフィー、
透析法、又はこれらの組合せ等を採用できる。
8)の菌体2gを5mlの50 mM Tris(pH 8.0)-50 mM EDTA
に懸濁してこれを -20℃で凍結した。これを融解後、
0.25 M Tris(pH 8.0)中に、10mg/ml の濃度でリゾチー
ムを含む溶液 0.5mlを添加し、これを45分間氷上に放置
した。ついで、6mlの 0.5% SDS, 50mM Tris(pH 8.0),
0.4 M EDTA を添加後、50℃で1時間処理を行った。当
該処理後、6mlの水飽和フェノールを添加し、これを攪
拌後遠心分離に処し、水層を集めた。この水層に 0.1倍
量の3M酢酸ナトリウムを加えた後、2倍量のエタノー
ルを加えて糸状に現れるDNAをガラス棒で回収した。
回収したDNAは、乾燥後TE(10 mM Tris(pH 8.0),1 mM
EDTA)緩衝液に溶解した。 (2) ファージ ライブラリーの調製 上記(1)で得たプロテウス ブルガリスの Genomic DN
A(200μg/ml)に 10μlのHバッファー(宝酒造社
製)及び制限酵素Sau 3AI(宝酒造社製)を0.1 ユニッ
ト添加して全量を 100μlにした。これを37℃で5分間
反応させた後、75℃、15分処理を行って反応を停止し
た。更に、この溶液をエタノール沈澱に供した。このエ
タノール沈澱により得られたDNAをλファージ EMBL3
キット(ストラタジーン社製)に挿入した。なお、こ
の挿入方法は当該キットの解説書に従った。ついで、挿
入済みのDNA溶液を、ギガパックゴールド(ストラタ
ジーン社製)を用いたインビトロ パッケージングに供
して、所望のDNAライブラリーを調製した。なお、こ
の調製方法は解説書に従った。 (3) 合成DNAプローブの作製 精製コンドロイチナーゼの部分アミノ酸配列をアミノ酸
シーケンサー(ABI社製)により決定し(配列番号
5)、このアミノ酸配列をもとにして、配列番号6、配
列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10に示さ
れた塩基配列を有する合成DNAプローブを等しい割合
で含む、ミックスプローブを調製した。なお、各々のD
NAプローブはDNA合成装置(ABI社製)で合成し
た。
10×T4ポリヌクレオチドバッファー(東洋紡社製)、9.
25 MBqのγ32P-ATP(アマーシャム社製)を8μl、およ
びT4ポリヌクレオチドキナーゼを3μl 加え、滅菌水
で全量を50μlに調製した。ついで、この系に於て、37
℃で1時間リン酸化反応を行った。当該反応後、バイオ
スピンカラム(バイオラッド社製)に供して5'-末端が
アイソトープラベルされたオリゴヌクレオチドプローブ
を得た。 (4) スクリーニング インビトロ パッケージングキット(ストラタジーン社
製)の使用書に記載された方法で、(2)で得られた組換
えλファージを大腸菌 P2392に感染させ、NZYプレート
上に溶菌プラーク数が約20,000−30,000個になるように
塗布した。このNZYプレートを37℃で一晩培養した後、
4℃下で1時間放置した。その後、当該プレートの表面
に 4.5×9cmのナイロンメンブラン(アマーシャム社
製)を密着させて、λファージを当該フィルター上に移
し、このフィルターを変成溶液(0.5 M NaOH, 1.5 M Na
Cl)に2分間、次いで中和溶液(0.5 M Tris(pH 8.0),
1.5M NaCl)に2分、更に 0.3 M NaCl, 0.03 M クエン
酸三ナトリウム(2×SSC)(pH 7.4)及び2mM EDTA で
リンス後、これを1時間風乾した。ついで、これをトラ
ンスイルミネーター上で紫外線固定した。
2mlになるように、ラピッド ハイブリダイゼーション
バッファー(アマーシャム社製)を加え、60℃下で30分
間処理した。これに次いで、(3)で作製したアイソトー
プラベルを施した合成ミックスプローブを当該ナイロン
メンブラン一枚当り、50万cpm となるように添加して、
60℃、2時間処理した。
ローンを得た。 (5) 制限酵素地図の作製 制限酵素地図の作製は、以下の制限酵素を用いて行っ
た。なお、各々の酵素反応は宝酒造社の使用法に従っ
た。Eco RI,Bam HI,Eco RV,Cla I, XbaI,Hind III, Pma CI その結果を図1に示す。
ジから、上記制限酵素地図で示した遺伝子(EcoRV-Eco
RI 断片)を切り出したものを、シャロミド9-36(日本
ジーン社製)に挿入し(pSOS10)、かかるプラスミドに
よって大腸菌DH1を形質転換した(E. coliDH1/pSOS
10 )。この形質転換体は工業技術院微生物工業研究所
に微工研菌寄第13057号(FERM P-13057)として寄託さ
れている。 (6) 塩基配列の決定 上記E. coli DH1/pSOS 10 から、通常公知の方法に従
ってプラスミド pSOS 10を分離して、当該プラスミド p
SOS 10(1μg)を、BamHI 及びEco RI で消化し、この
制限断片にアガロースゲル電気泳動を施し、約5Kbp の
断片を回収した。当該断片を制限酵素Sau 3AI 0.1 ユニ
ットで部分消化した。ついで、制限酵素Sau 3AI で完全
分解したpBluescript SK+0.5μgを CIP(ベーリンガー
マンハイム山之内社製)処理し脱リン酸化したものと、
上記部分分解したBam HI-EcoRI 断片と連結した。この
様々なSau 3AI 断片を含む組換えプラスミドを用いて大
腸菌JM109 を形質転換し、ミックスプローブと結合する
断片を含む組換えプラスミドを選んで、塩基配列を Tth
DNA シーケンス キット(東洋紡社製)を用いたジ
デオキシ転写終結法でコンドロイチナーゼをコードする
遺伝子の塩基配列を決定した(配列番号11)。
ロイチナーゼをコードする遺伝子には、潜在的な -35領
域(ヌクレオチド番号 134-139)、-10領域(ヌクレオ
チド番号 170-175)、SD配列(ヌクレオチド番号 210
-214)が存在する。ヌクレオチド番号 3288 に終止コド
ンが存在する。更に、ヌクレオチド番号 3298-3329に典
型的なρ非依存型転写終結配列が存在する。
にシグナルペプチド配列が存在する。当該遺伝子の配列
番号3(コンドロイチナーゼ前駆体)・配列番号4(コ
ンドロイチナーゼ成熟体)に具体的な塩基配列を示す。
そして、さらに当該塩基配列から推定されるアミノ酸配
列を配列番号1(コンドロイチナーゼ前駆体)・配列番
号2(コンドロイチナーゼ成熟体)に示す。まとめたも
のを配列番号11に示す。 (7) 上記コンドロイチナーゼ遺伝子領域を含むSalI-Ec
oRI断片を組換えλファージから単離し、pSTV29( 宝酒
造社製) のマルチクローニングサイト上のSal I-EcoR
I断片と置換した(pCHS6) 。このpCHS6 で大腸菌XL1-Bl
ue( ストラタジーン社製) を形質転換した。次いで、こ
の大腸菌(E.coli XL1-Blue/pCHS6) 25μg/mlの濃度
のクロラムフェニコールを含むLB培地(1%ペプトン,
0.5%酵母エキス、1%NaCl(pH7.5))で一晩培養した。
これを集菌洗浄後、ChSase誘導培地(0.7%K2HPO4, 0.3
%KH2PO4, 0.01%MgCl2, 0.1%(NH4)2SO4, 0.1mg/mlニ
コチン酸,0.1%酵母エキス,0.3%コンドロイチン硫酸C,
0.01%グルコース, 25μg/mlクロラムフェニコール)
にA610=0.05になるように植菌して3日間培養した。培
養後、遠心分離により培養液と菌体に分け、培養液は溶
液中のコンドロイチン硫酸Cの分解検定に、菌体は超音
波菌体破砕装置で破砕後、菌体抽出液中のコンドロイチ
ナーゼ活性の測定にそれぞれ供した。その結果を表1に
示す。なお、コントロールとして同様の操作をE.coli X
L1-Blue/pSTV29でも行った。
XL1-Blue/pCHS6)はコンドロイチナーゼ活性を有す
る。当該組換え菌体(E.coli XL1-Blue/pCHS6)は、平
成5年2月3日に工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第4170号(FERM BP-4170)号として寄託されてい
る。
Cを有するプロテウス属細菌の中でも代表的なプロテウ
ス ブルガリスのコンドロイチナーゼABCをコードす
る遺伝子の構造が明らかされ、これを遺伝子工学的手法
によって、純粋な形で安価かつ大量に提供する手法が確
立される。
地図。 〔配列表〕 配列番号:1 コンドロイチナーゼ前駆体 配列の長さ:1053 配列の型:アミノ酸 トポロジー:不明 配列の種類:ペプチド 配列の起源:プロテウス ブルガリス(Proteus vulgar
is IFO 3988) 配列 Met Pro Ile Phe Arg Phe Thr Ala Leu Ala Met Thr Leu Gly Leu Leu 16 Ser Ala Pro Tyr Asn Ala Met Ala Ala Thr Ser Asn Pro Ala Phe Asp 32 Pro Lys Asn Leu Met Gln Ser Glu Ile Tyr His Phe Ala Gln Asn Asn 48 Pro Leu Ala Asp Phe Ser Ser Asp Lys Asn Ser Ile Leu Thr Leu Ser 64 Asp Lys Arg Ser Ile Met Gly Asn Gln Ser Leu Leu Trp Lys Trp Lys 80 Gly Gly Ser Ser Phe Thr Leu His Lys Lys Leu Ile Val Pro Thr Asp 96 Lys Glu Ala Ser Lys Ala Trp Gly Arg Ser Ser Thr Pro Val Phe Ser 112 Phe Trp Leu Tyr Asn Glu Lys Pro Ile Asp Gly Tyr Pro Thr Ile Asp 128 Phe Gly Glu Lys Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ala Gln Ala Gly Phe Lys 144 Val Lys Leu Asp Phe Thr Gly Trp Arg Ala Val Gly Val Ser Leu Asn 160 Asn Asp Leu Glu Asn Arg Glu Met Thr Leu Asn Ala Thr Asn Thr Ser 176 Ser Asp Gly Thr Gln Asp Ser Ile Gly Arg Ser Leu Gly Ala Lys Val 192 Asp Ser Ile Arg Phe Lys Ala Pro Ser Asn Val Ser Gln Gly Glu Ile 208 Tyr Ile Asp Arg Ile Met Phe Ser Val Asp Asp Ala Arg Tyr Gln Trp 224 Ser Asp Tyr Gln Val Lys Thr Arg Leu Ser Glu Pro Glu Ile Gln Phe 240 His Asn Val Lys Pro Gln Leu Pro Val Thr Pro Glu Asn Leu Ala Ala 256 Ile Asp Leu Ile Arg Gln Arg Leu Ile Asn Glu Phe Val Gly Gly Glu 272 Lys Glu Thr Asn Leu Ala Leu Glu Glu Asn Ile Ser Lys Leu Lys Ser 288 Asp Phe Asp Ala Leu Asn Ile His Thr Leu Ala Asn Gly Gly Thr Gln 304 Gly Arg His Leu Ile Thr Asp Lys Gln Ile Ile Ile Tyr Gln Pro Glu 320 Asn Leu Asn Ser Gln Asp Lys Gln Leu Phe Asp Asn Tyr Val Ile Leu 336 Gly Asn Tyr Thr Thr Leu Met Phe Asn Ile Ser Arg Ala Tyr Val Leu 352 Glu Lys Asp Pro Thr Gln Lys Ala Gln Leu Lys Gln Met Tyr Leu Leu 368 Val Thr Lys His Leu Leu Asp Gln Gly Phe Val Lys Gly Ser Ala Leu 384 Val Thr Thr His His Trp Gly Tyr Ser Ser Arg Trp Trp Tyr Ile Ser 400 Thr Leu Leu Met Ser Asp Ala Leu Lys Glu Ala Asn Leu Gln Thr Gln 416 Val Tyr Asp Ser Leu Leu Trp Tyr Ser Arg Glu Phe Lys Ser Ser Phe 464 Asp Met Lys Val Ser Ala Asp Ser Ser Asp Leu Asp Tyr Phe Asn Thr 480 Leu Ser Arg Gln His Leu Ala Leu Leu Leu Leu Glu Pro Asp Asp Gln 496 Lys Arg Ile Asn Leu Val Asn Thr Phe Ser His Tyr Ile Thr Gly Ala 512 Leu Thr Gln Val Pro Pro Gly Gly Lys Asp Gly Leu Arg Leu Met Val 528 Gln His Gly Asp Met Lys Ala Thr Ile Arg Val Thr Leu Ser Gln Pro 544 Leu Lys Met Pro Leu Ser Leu Phe Ile Tyr Tyr Ala Ile His His Phe 560 Gln Leu Gly Glu Ser Gly Trp Asn Asn Leu Lys Lys Ala Met Val Ser 576 Ala Trp Ile Tyr Ser Asn Pro Glu Val Gly Leu Pro Leu Ala Gly Arg 592 His Pro Phe Asn Ser Pro Ser Leu Lys Ser Val Ala Gln Gly Tyr Tyr 608 Trp Leu Ala Met Ser Ala Lys Ser Ser Pro Asp Lys Thr Leu Ala Ser 624 Ile Tyr Leu Ala Ile Ser Asp Lys Thr Gln Asn Glu Ser Thr Ala Ile 640 Phe Gly Glu Thr Ile Thr Pro Ala Ser Leu Pro Gln Gly Phe Tyr Ala 656 Phe Asn Gly Gly Ala Phe Gly Ile His Arg Trp Gln Asp Lys Met Val 672 Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Thr Asn Val Trp Ser Ser Glu Ile Tyr Asn 688 Lys Asp Asn Arg Tyr Gly Arg Tyr Gln Ser His Gly Val Gly Gln Ile 704 Val Ser Asn Gly Ser Gln Leu Ser Gln Gly Tyr Gln Gln Glu Gly Trp 720 Asp Trp Asn Arg Met Gln Gly Ala Thr Thr Ile His Leu Pro Leu Lys 736 Asp Leu Asp Ser Pro Lys Pro His Thr Leu Met Gln Arg Gly Glu Arg 752 Gly Phe Ser Gly Thr Ser Ser Leu Glu Gly Gln Tyr Gly Met Met Ala 768 Phe Asp Leu Ile Tyr Pro Ala Asn Leu Glu Arg Phe Asp Pro Asn Phe 784 Thr Ala Lys Lys Ser Val Leu Ala Ala Asp Asn His Leu Ile Phe Ile 800 Gly Ser Asn Ile Asn Ser Ser Asp Lys Asn Lys Asn Val Glu Thr Thr 816 Leu Phe Gln His Ala Ile Thr Pro Thr Leu Asn Thr Leu Trp Ile Asn 832 Gly Gln Lys Ile Glu Asn Met Pro Tyr Gln Thr Thr Leu Gln Gln Gly 848 Asp Trp Leu Ile Asp Ser Asn Gly Asn Gly Tyr Leu Ile Thr Gln Ala 864 Glu Lys Val Asn Val Ser Arg Gln His Gln Val Ser Ala Glu Asn Lys 880 Asn Arg Gln Pro Thr Glu Gly Asn Phe Ser Ser Ala Trp Ile Asp His 896 Arg Thr Arg Pro Lys Asp Ala Ser Tyr Glu Tyr Met Val Phe Leu Asp 912 Ala Thr Pro Glu Lys Met Gly Glu Met Ala Gln Lys Phe Arg Glu Asn 928 Asn Gly Leu Tyr Gln Val Leu Arg Lys Asp Lys Asp Val His Ile Ile 944 Leu Asp Lys Leu Ser Asn Val Thr Gly Tyr Ala Phe Tyr Gln Pro Ala 960 Ser Ile Glu Asp Lys Trp Ile Lys Lys Val Asn Lys Pro Ala Ile Val 976 Met Thr His Arg Gln Lys Asp Thr Leu Ile Val Ser Ala Val Thr Pro 992 Asp Leu Asn Met Thr Arg Gln Lys Ala Ala Thr Pro Val Thr Ile Asn 1008 Val Thr Ile Asn Gly Lys Trp Gln Ser Ala Asp Lys Asn Ser Glu Val 1024 Lys Tyr Gln Val Ser Gly Asp Asn Thr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Tyr 1040 Phe Gly Ile Pro Gln Glu Ile Lys Leu Ser Pro Leu Pro 1053 配列番号:2 配列の長さ:997 配列の型:アミノ酸 トポロジー:不明 配列の種類:ペプチド 配列の起源:プロテウス ブルガリス(Proteus vulgar
is IFO 3988) 配列 Ala Thr Ser Asn Pro Ala Phe Asp Pro Lys Asn Leu Met Gln Ser Glu 16 Ile Tyr His Phe Ala Gln Asn Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Ser Asp 32 Lys Asn Ser Ile Leu Thr Leu Ser Asp Lys Arg Ser Ile Met Gly Asn 48 Gln Ser Leu Leu Trp Lys Trp Lys Gly Gly Ser Ser Phe Thr Leu His 64 Lys Lys Leu Ile Val Pro Thr Asp Lys Glu Ala Ser Lys Ala Trp Gly 80 Arg Ser Ser Thr Pro Val Phe Ser Phe Trp Leu Tyr Asn Glu Lys Pro 96 Ile Asp Gly Tyr Pro Thr Ile Asp Phe Gly Glu Lys Leu Ile Ser Thr 112 Ser Glu Ala Gln Ala Gly Phe Lys Val Lys Leu Asp Phe Thr Gly Trp 128 Arg Ala Val Gly Val Ser Leu Asn Asn Asp Leu Glu Asn Arg Glu Met 144 Thr Leu Asn Ala Thr Asn Thr Ser Ser Asp Gly Thr Gln Asp Ser Ile 160 Gly Arg Ser Leu Gly Ala Lys Val Asp Ser Ile Arg Phe Lys Ala Pro 176 Ser Asn Val Ser Gln Gly Glu Ile Tyr Ile Asp Arg Ile Met Phe Ser 192 Val Asp Asp Ala Arg Tyr Gln Trp Ser Asp Tyr Gln Val Lys Thr Arg 208 Leu Ser Glu Pro Glu Ile Gln Phe His Asn Val Lys Pro Gln Leu Pro 224 Val Thr Pro Glu Asn Leu Ala Ala Ile Asp Leu Ile Arg Gln Arg Leu 240 Ile Asn Glu Phe Val Gly Gly Glu Lys Glu Thr Asn Leu Ala Leu Glu 256 Glu Asn Ile Ser Lys Leu Lys Ser Asp Phe Asp Ala Leu Asn Ile His 272 Thr Leu Ala Asn Gly Gly Thr Gln Gly Arg His Leu Ile Thr Asp Lys 288 Gln Ile Ile Ile Tyr Gln Pro Glu Asn Leu Asn Ser Gln Asp Lys Gln 304 Leu Phe Asp Asn Tyr Val Ile Leu Gly Asn Tyr Thr Thr Leu Met Phe 320 Asn Ile Ser Arg Ala Tyr Val Leu Glu Lys Asp Pro Thr Gln Lys Ala 336 Gln Leu Lys Gln Met Tyr Leu Leu Val Thr Lys His Leu Leu Asp Gln 352 Gly Phe Val Lys Gly Ser Ala Leu Val Thr Thr His His Trp Gly Tyr 368 Ser Ser Arg Trp Trp Tyr Ile Ser Thr Leu Leu Met Ser Asp Ala Leu 384 Lys Glu Ala Asn Leu Gln Thr Gln Val Tyr Asp Ser Leu Leu Trp Tyr 400 Ser Arg Glu Phe Lys Ser Ser Phe Asp Met Lys Val Ser Ala Asp Ser 416 Ser Asp Leu Asp Tyr Phe Asn Thr Leu Ser Arg Gln His Leu Ala Leu 432 Leu Leu Leu Glu Pro Asp Asp Gln Lys Arg Ile Asn Leu Val Asn Thr 448 Phe Ser His Tyr Ile Thr Gly Ala Leu Thr Gln Val Pro Pro Gly Gly 464 Lys Asp Gly Leu Arg Leu Met Val Gln His Gly Asp Met Lys Ala Thr 480 Ile Arg Val Thr Leu Ser Gln Pro Leu Lys Met Pro Leu Ser Leu Phe 496 Ile Tyr Tyr Ala Ile His His Phe Gln Leu Gly Glu Ser Gly Trp Asn 512 Asn Leu Lys Lys Ala Met Val Ser Ala Trp Ile Tyr Ser Asn Pro Glu 528 Val Gly Leu Pro Leu Ala Gly Arg His Pro Phe Asn Ser Pro Ser Leu 544 Lys Ser Val Ala Gln Gly Tyr Tyr Trp Leu Ala Met Ser Ala Lys Ser 560 Ser Pro Asp Lys Thr Leu Ala Ser Ile Tyr Leu Ala Ile Ser Asp Lys 576 Thr Gln Asn Glu Ser Thr Ala Ile Phe Gly Glu Thr Ile Thr Pro Ala 592 Ser Leu Pro Gln Gly Phe Tyr Ala Phe Asn Gly Gly Ala Phe Gly Ile 608 His Arg Trp Gln Asp Lys Met Val Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Thr Asn 624 Val Trp Ser Ser Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Asn Arg Tyr Gly Arg Tyr 640 Gln Ser His Gly Val Gly Gln Ile Val Ser Asn Gly Ser Gln Leu Ser 656 Gln Gly Tyr Gln Gln Glu Gly Trp Asp Trp Asn Arg Met Gln Gly Ala 672 Thr Thr Ile His Leu Pro Leu Lys Asp Leu Asp Ser Pro Lys Pro His 688 Thr Leu Met Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Ser Gly Thr Ser Ser Leu 704 Glu Gly Gln Tyr Gly Met Met Ala Phe Asp Leu Ile Tyr Pro Ala Asn 720 Leu Glu Arg Phe Asp Pro Asn Phe Thr Ala Lys Lys Ser Val Leu Ala 736 Ala Asp Asn His Leu Ile Phe Ile Gly Ser Asn Ile Asn Ser Ser Asp 752 Lys Asn Lys Asn Val Glu Thr Thr Leu Phe Gln His Ala Ile Thr Pro 768 Thr Leu Asn Thr Leu Trp Ile Asn Gly Gln Lys Ile Glu Asn Met Pro 784 Tyr Gln Thr Thr Leu Gln Gln Gly Asp Trp Leu Ile Asp Ser Asn Gly 800 Asn Gly Tyr Leu Ile Thr Gln Ala Glu Lys Val Asn Val Ser Arg Gln 816 His Gln Val Ser Ala Glu Asn Lys Asn Arg Gln Pro Thr Glu Gly Asn 832 Phe Ser Ser Ala Trp Ile Asp His Arg Thr Arg Pro Lys Asp Ala Ser 848 Tyr Glu Tyr Met Val Phe Leu Asp Ala Thr Pro Glu Lys Met Gly Glu 864 Met Ala Gln Lys Phe Arg Glu Asn Asn Gly Leu Tyr Gln Val Leu Arg 880 Lys Asp Lys Asp Val His Ile Ile Leu Asp Lys Leu Ser Asn Val Thr 896 Gly Tyr Ala Phe Tyr Gln Pro Ala Ser Ile Glu Asp Lys Trp Ile Lys 912 Lys Val Asn Lys Pro Ala Ile Val Met Thr His Arg Gln Lys Asp Thr 928 Leu Ile Val Ser Ala Val Thr Pro Asp Leu Asn Met Thr Arg Gln Lys 944 Ala Ala Thr Pro Val Thr Ile Asn Val Thr Ile Asn Gly Lys Trp Gln 960 Ser Ala Asp Lys Asn Ser Glu Val Lys Tyr Gln Val Ser Gly Asp Asn 976 Thr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Gly Ile Pro Gln Glu Ile Lys 992 Leu Ser Pro Leu Pro 997 配列番号:3 配列の長さ:3066 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:不明 配列の種類:Genomic DNA 配列の起源:プロテウス ブルガリス(Proteus vulgar
is IFO 3988) 配列 ATG CCG ATA TTT CGT TTT ACT GCA CTT GCA ATG ACA TTG GGG CTA TTA 48 TCA GCG CCT TAT AAC GCG ATG GCA GCC ACC AGC AAT CCT GCA TTT GAT 96 CCT AAA AAT CTG ATG CAG TCA GAA ATT TAC CAT TTT GCA CAA AAT AAC 144 CCA TTA GCA GAC TTC TCA TCA GAT AAA AAC TCA ATA CTA ACG TTA TCT 192 GAT AAA CGT AGC ATT ATG GGA AAC CAA TCT CTT TTA TGG AAA TGG AAA 240 GGT GGT AGT AGC TTT ACT TTA CAT AAA AAA CTG ATT GTC CCC ACC GAT 288 AAA GAA GCA TCT AAA GCA TGG GGA CGC TCA TCT ACC CCC GTT TTC TCA 336 TTT TGG CTT TAC AAT GAA AAA CCG ATT GAT GGT TAT CCT ACT ATC GAT 384 TTC GGA GAA AAA CTC ATT TCA ACC AGT GAG GCT CAG GCA GGC TTT AAA 432 GTA AAA TTA GAT TTC ACT GGC TGG CGT GCT GTG GGA GTC TCT TTA AAT 480 AAC GAT CTT GAA AAT CGA GAG ATG ACC TTA AAT GCA ACC AAT ACC TCC 528 TCT GAT GGT ACT CAA GAC AGC ATT GGG CGT TCT TTA GGT GCT AAA GTC 576 GAT AGT ATT CGT TTT AAA GCG CCT TCT AAT GTG AGT CAG GGT GAA ATC 624 TAT ATC GAC CGT ATT ATG TTT TCT GTC GAT GAT GCT CGC TAC CAA TGG 672 TCT GAT TAT CAA GTA AAA ACT CGC TTA TCA GAA CCT GAA ATT CAA TTT 720 CAC AAC GTA AAG CCA CAA CTA CCT GTA ACA CCT GAA AAT TTA GCG GCC 768 ATT GAT CTT ATT CGC CAA CGT CTA ATT AAT GAA TTT GTC GGA GGT GAA 816 AAA GAG ACA AAC CTC GCA TTA GAA GAG AAT ATC AGC AAA TTA AAA AGT 864 GAT TTC GAT GCT CTT AAT ATT CAC ACT TTA GCA AAT GGT GGA ACG CAA 912 GGC AGA CAT CTG ATC ACT GAT AAA CAA ATC ATT ATT TAT CAA CCA GAG 960 AAT CTT AAC TCC CAA GAT AAA CAA CTA TTT GAT AAT TAT GTT ATT TTA 1008 GGT AAT TAC ACG ACA TTA ATG TTT AAT ATT AGC CGT GCT TAT GTG CTG 1056 GAA AAA GAT CCC ACA CAA AAG GCG CAA CTA AAG CAG ATG TAC TTA TTA 1104 GTG ACA AAG CAT TTA TTA GAT CAA GGC TTT GTT AAA GGG AGT GCT TTA 1152 GTG ACA ACC CAT CAC TGG GGA TAC AGT TCT CGT TGG TGG TAT ATT TCC 1200 ACG TTA TTA ATG TCT GAT GCA CTA AAA GAA GCG AAC CTA CAA ACT CAA 1248 GTT TAT GAT TCA TTA CTG TGG TAT TCA CGT GAG TTT AAA AGT AGT TTT 1296 GAT ATG AAA GTA AGT GCT GAT AGC TCT GAT CTA GAT TAT TTC AAT ACC 1344 TTA TCT CGC CAA CAT TTA GCC TTA TTA TTA CTA GAG CCT GAT GAT CAA 1392 AAG CGT ATC AAC TTA GTT AAT ACT TTC AGC CAT TAT ATC ACT GGC GCA 1440 TTA ACG CAA GTG CCA CCG GGT GGT AAA GAT GGT TTA CGC CTG ATG GTA 1488 CAG CAT GGC GAC ATG AAG GCA ACT ATC CGG GTT ACT CTT TCC CAG CCT 1536 TTA AAA ATG CCT CTC AGC TTA TTT ATT TAT TAC GCG ATA CAC CAT TTC 1584 CAG TTG GGT GAA AGT GGT TGG AAT AAC CTG AAA AAA GCG ATG GTT TCA 1632 GCG TGG ATC TAC AGT AAT CCA GAA GTT GGA TTA CCG CTT GCA GGA AGA 1680 CAC CCT TTT AAC TCA CCT TCG TTA AAA TCA GTC GCT CAA GGC TAT TAC 1728 TGG CTT GCC ATG TCT GCA AAA TCA TCG CCT GAT AAA ACA CTT GCA TCT 1776 ATT TAT CTT GCG ATT AGT GAT AAA ACA CAA AAT GAA TCA ACT GCT ATT 1824 TTT GGA GAA ACT ATT ACA CCA GCG TCT TTA CCT CAA GGT TTC TAT GCC 1872 TTT AAT GGC GGT GCT TTT GGT ATT CAT CGT TGG CAA GAT AAA ATG GTG 1920 ACA CTG AAA GCT TAT AAC ACC AAT GTT TGG TCA TCT GAA ATT TAT AAC 1968 AAA GAT AAC CGT TAT GGC CGT TAC CAA AGT CAT GGT GTC GGT CAA ATA 2016 GTG AGT AAT GGC TCG CAG CTT TCA CAG GGC TAT CAG CAA GAA GGT TGG 2064 GAT TGG AAT AGA ATG CAA GGG GCA ACC ACT ATT CAC CTT CCT CTT AAA 2112 GAC TTA GAC AGT CCT AAA CCT CAT ACC TTA ATG CAA CGT GGA GAG CGT 2160 GGA TTT AGC GGA ACA TCA TCC CTT GAA GGT CAA TAT GGC ATG ATG GCA 2208 TTC GAT CTT ATT TAT CCC GCC AAT CTT GAG CGT TTT GAT CCT AAT TTC 2256 ACT GCG AAA AAG AGT GTA TTA GCC GCT GAT AAT CAC TTA ATT TTT ATT 2304 GGT AGC AAT ATA AAT AGT AGT GAT AAA AAT AAA AAT GTT GAA ACG ACC 2352 TTA TTC CAA CAT GCC ATT ACT CCA ACA TTA AAT ACC CTT TGG ATT AAT 2400 GGA CAA AAG ATA GAA AAC ATG CCT TAT CAA ACA ACA CTT CAA CAA GGT 2448 GAT TGG TTA ATT GAT AGC AAT GGC AAT GGT TAC TTA ATT ACT CAA GCA 2496 GAA AAA GTA AAT GTA AGT CGC CAA CAT CAG GTT TCA GCG GAA AAT AAA 2544 AAT CGC CAA CCG ACA GAA GGA AAC TTT AGC TCG GCA TGG ATC GAT CAC 2592 AGG ACT CGC CCC AAA GAT GCC AGT TAT GAG TAT ATG GTC TTT TTA GAT 2640 GCG ACA CCT GAA AAA ATG GGA GAG ATG GCA CAA AAA TTC CGT GAA AAT 2688 AAT GGG TTA TAT CAG GTT CTT CGT AAG GAT AAA GAC GTT CAT ATT ATT 2736 CTC GAT AAA CTC AGC AAT GTA ACG GGA TAT GCC TTT TAT CAG CCA GCA 2784 TCA ATT GAA GAC AAA TGG ATC AAA AAG GTT AAT AAA CCT GCA ATT GTG 2832 ATG ACT CAT CGA CAA AAA GAC ACT CTT ATT GTC AGT GCA GTT ACA CCT 2880 GAT TTA AAT ATG ACT CGC CAA AAA GCA GCA ACT CCT GTC ACC ATC AAT 2928 GTC ACG ATT AAT GGC AAA TGG CAA TCT GCT GAT AAA AAT AGT GAA GTG 2976 AAA TAT CAG GTT TCT GGT GAT AAC ACT GAA CTG ACG TTT ACG AGT TAC 3024 TTT GGT ATT CCA CAA GAA ATC AAA CTC TCG CCA CTC CCT TGA 3066 配列番号:4 配列の長さ:2994 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:不明 配列の種類:Genomic DNA 配列の起源:プロテウス ブルガリス(Proteus vulgar
is IFO 3988) 配列 GCC ACC AGC AAT CCT GCA TTT GAT CCT AAA AAT CTG ATG CAG TCA GAA 48 ATT TAC CAT TTT GCA CAA AAT AAC CCA TTA GCA GAC TTC TCA TCA GAT 96 AAA AAC TCA ATA CTA ACG TTA TCT GAT AAA CGT AGC ATT ATG GGA AAC 144 CAA TCT CTT TTA TGG AAA TGG AAA GGT GGT AGT AGC TTT ACT TTA CAT 192 AAA AAA CTG ATT GTC CCC ACC GAT AAA GAA GCA TCT AAA GCA TGG GGA 240 CGC TCA TCT ACC CCC GTT TTC TCA TTT TGG CTT TAC AAT GAA AAA CCG 288 ATT GAT GGT TAT CCT ACT ATC GAT TTC GGA GAA AAA CTC ATT TCA ACC 336 AGT GAG GCT CAG GCA GGC TTT AAA GTA AAA TTA GAT TTC ACT GGC TGG 384 CGT GCT GTG GGA GTC TCT TTA AAT AAC GAT CTT GAA AAT CGA GAG ATG 432 ACC TTA AAT GCA ACC AAT ACC TCC TCT GAT GGT ACT CAA GAC AGC ATT 480 GGG CGT TCT TTA GGT GCT AAA GTC GAT AGT ATT CGT TTT AAA GCG CCT 528 TCT AAT GTG AGT CAG GGT GAA ATC TAT ATC GAC CGT ATT ATG TTT TCT 576 GTC GAT GAT GCT CGC TAC CAA TGG TCT GAT TAT CAA GTA AAA ACT CGC 624 TTA TCA GAA CCT GAA ATT CAA TTT CAC AAC GTA AAG CCA CAA CTA CCT 672 GTA ACA CCT GAA AAT TTA GCG GCC ATT GAT CTT ATT CGC CAA CGT CTA 720 ATT AAT GAA TTT GTC GGA GGT GAA AAA GAG ACA AAC CTC GCA TTA GAA 768 GAG AAT ATC AGC AAA TTA AAA AGT GAT TTC GAT GCT CTT AAT ATT CAC 816 ACT TTA GCA AAT GGT GGA ACG CAA GGC AGA CAT CTG ATC ACT GAT AAA 864 CAA ATC ATT ATT TAT CAA CCA GAG AAT CTT AAC TCC CAA GAT AAA CAA 912 CTA TTT GAT AAT TAT GTT ATT TTA GGT AAT TAC ACG ACA TTA ATG TTT 960 AAT ATT AGC CGT GCT TAT GTG CTG GAA AAA GAT CCC ACA CAA AAG GCG 1008 CAA CTA AAG CAG ATG TAC TTA TTA GTG ACA AAG CAT TTA TTA GAT CAA 1056 GGC TTT GTT AAA GGG AGT GCT TTA GTG ACA ACC CAT CAC TGG GGA TAC 1104 AGT TCT CGT TGG TGG TAT ATT TCC ACG TTA TTA ATG TCT GAT GCA CTA 1152 AAA GAA GCG AAC CTA CAA ACT CAA GTT TAT GAT TCA TTA CTG TGG TAT 1200 TCA CGT GAG TTT AAA AGT AGT TTT GAT ATG AAA GTA AGT GCT GAT AGC 1248 TCT GAT CTA GAT TAT TTC AAT ACC TTA TCT CGC CAA CAT TTA GCC TTA 1296 TTA TTA CTA GAG CCT GAT GAT CAA AAG CGT ATC AAC TTA GTT AAT ACT 1344 TTC AGC CAT TAT ATC ACT GGC GCA TTA ACG CAA GTG CCA CCG GGT GGT 1392 AAA GAT GGT TTA CGC CTG ATG GTA CAG CAT GGC GAC ATG AAG GCA ACT 1440 ATC CGG GTT ACT CTT TCC CAG CCT TTA AAA ATG CCT CTC AGC TTA TTT 1488 ATT TAT TAC GCG ATA CAC CAT TTC CAG TTG GGT GAA AGT GGT TGG AAT 1536 AAC CTG AAA AAA GCG ATG GTT TCA GCG TGG ATC TAC AGT AAT CCA GAA 1584 GTT GGA TTA CCG CTT GCA GGA AGA CAC CCT TTT AAC TCA CCT TCG TTA 1632 AAA TCA GTC GCT CAA GGC TAT TAC TGG CTT GCC ATG TCT GCA AAA TCA 1680 TCG CCT GAT AAA ACA CTT GCA TCT ATT TAT CTT GCG ATT AGT GAT AAA 1728 ACA CAA AAT GAA TCA ACT GCT ATT TTT GGA GAA ACT ATT ACA CCA GCG 1776 TCT TTA CCT CAA GGT TTC TAT GCC TTT AAT GGC GGT GCT TTT GGT ATT 1824 CAT CGT TGG CAA GAT AAA ATG GTG ACA CTG AAA GCT TAT AAC ACC AAT 1872 GTT TGG TCA TCT GAA ATT TAT AAC AAA GAT AAC CGT TAT GGC CGT TAC 1920 CAA AGT CAT GGT GTC GGT CAA ATA GTG AGT AAT GGC TCG CAG CTT TCA 1968 CAG GGC TAT CAG CAA GAA GGT TGG GAT TGG AAT AGA ATG CAA GGG GCA 2016 ACC ACT ATT CAC CTT CCT CTT AAA GAC TTA GAC AGT CCT AAA CCT CAT 2064 ACC TTA ATG CAA CGT GGA GAG CGT GGA TTT AGC GGA ACA TCA TCC CTT 2112 GAA GGT CAA TAT GGC ATG ATG GCA TTC GAT CTT ATT TAT CCC GCC AAT 2160 CTT GAG CGT TTT GAT CCT AAT TTC ACT GCG AAA AAG AGT GTA TTA GCC 2208 GCT GAT AAT CAC TTA ATT TTT ATT GGT AGC AAT ATA AAT AGT AGT GAT 2256 AAA AAT AAA AAT GTT GAA ACG ACC TTA TTC CAA CAT GCC ATT ACT CCA 2304 ACA TTA AAT ACC CTT TGG ATT AAT GGA CAA AAG ATA GAA AAC ATG CCT 2352 TAT CAA ACA ACA CTT CAA CAA GGT GAT TGG TTA ATT GAT AGC AAT GGC 2400 AAT GGT TAC TTA ATT ACT CAA GCA GAA AAA GTA AAT GTA AGT CGC CAA 2448 CAT CAG GTT TCA GCG GAA AAT AAA AAT CGC CAA CCG ACA GAA GGA AAC 2496 TTT AGC TCG GCA TGG ATC GAT CAC AGG ACT CGC CCC AAA GAT GCC AGT 2544 TAT GAG TAT ATG GTC TTT TTA GAT GCG ACA CCT GAA AAA ATG GGA GAG 2592 ATG GCA CAA AAA TTC CGT GAA AAT AAT GGG TTA TAT CAG GTT CTT CGT 2640 AAG GAT AAA GAC GTT CAT ATT ATT CTC GAT AAA CTC AGC AAT GTA ACG 2688 GGA TAT GCC TTT TAT CAG CCA GCA TCA ATT GAA GAC AAA TGG ATC AAA 2736 AAG GTT AAT AAA CCT GCA ATT GTG ATG ACT CAT CGA CAA AAA GAC ACT 2784 CTT ATT GTC AGT GCA GTT ACA CCT GAT TTA AAT ATG ACT CGC CAA AAA 2832 GCA GCA ACT CCT GTC ACC ATC AAT GTC ACG ATT AAT GGC AAA TGG CAA 2880 TCT GCT GAT AAA AAT AGT GAA GTG AAA TAT CAG GTT TCT GGT GAT AAC 2928 ACT GAA CTG ACG TTT ACG AGT TAC TTT GGT ATT CCA CAA GAA ATC AAA 2976 CTC TCG CCA CTC CCT TGA 2994 配列番号:5 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列の起源:プロテウス ブルガリス(Proteus vulgar
is IFO 3988) 配列 GCC ACC UCC AAC CCC GC 配列番号:6 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列 GCU AUC UCU AAU CCU GC 配列番号:7 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列 GCA ACA UCA AAU CCA GC 配列番号:8 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列 GCG ACG UCG AAU CCU GC 配列番号:9 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列 GCU ACU AGU AAU CCU GC 配列番号:10 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列 GCU ACU UCC AAU CCU GC 配列番号:11 配列の長さ:3487 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:不明 配列の種類:Genomic DNA 配列の起源:プロテウス ブルガリス(Proteus vulgar
is IFO 3988) 配列 ATCAATCAAC GCCACAGCCT TACCTATTTT AATACAGGGG GAAGTACCTT TGATATTAAA -165 GGAAATACCG TTGGTGGTGA CATTATTAGT GCGGAATTAG GTGCAAATCT CGATATCACT -105 CAATCATTAA ATTTAGGCAC AACGATGGGC TATCAGCGTT ATGACAAATT TAATGAAGGA -45 CGCATTGGTT TCACTGTTAG CCAGCGTTTC TAAGGAGAAA AATA -1 ATG CCG ATA TTT CGT TTT ACT GCA CTT GCA ATG ACA TTG GGG CTA TTA 48 TCA GCG CCT TAT AAC GCG ATG GCA GCC ACC AGC AAT CCT GCA TTT GAT 96 CCT AAA AAT CTG ATG CAG TCA GAA ATT TAC CAT TTT GCA CAA AAT AAC 144 CCA TTA GCA GAC TTC TCA TCA GAT AAA AAC TCA ATA CTA ACG TTA TCT 192 GAT AAA CGT AGC ATT ATG GGA AAC CAA TCT CTT TTA TGG AAA TGG AAA 240 GGT GGT AGT AGC TTT ACT TTA CAT AAA AAA CTG ATT GTC CCC ACC GAT 288 AAA GAA GCA TCT AAA GCA TGG GGA CGC TCA TCT ACC CCC GTT TTC TCA 336 TTT TGG CTT TAC AAT GAA AAA CCG ATT GAT GGT TAT CCT ACT ATC GAT 384 TTC GGA GAA AAA CTC ATT TCA ACC AGT GAG GCT CAG GCA GGC TTT AAA 432 GTA AAA TTA GAT TTC ACT GGC TGG CGT GCT GTG GGA GTC TCT TTA AAT 480 AAC GAT CTT GAA AAT CGA GAG ATG ACC TTA AAT GCA ACC AAT ACC TCC 528 TCT GAT GGT ACT CAA GAC AGC ATT GGG CGT TCT TTA GGT GCT AAA GTC 576 GAT AGT ATT CGT TTT AAA GCG CCT TCT AAT GTG AGT CAG GGT GAA ATC 624 TAT ATC GAC CGT ATT ATG TTT TCT GTC GAT GAT GCT CGC TAC CAA TGG 672 TCT GAT TAT CAA GTA AAA ACT CGC TTA TCA GAA CCT GAA ATT CAA TTT 720 CAC AAC GTA AAG CCA CAA CTA CCT GTA ACA CCT GAA AAT TTA GCG GCC 768 ATT GAT CTT ATT CGC CAA CGT CTA ATT AAT GAA TTT GTC GGA GGT GAA 816 AAA GAG ACA AAC CTC GCA TTA GAA GAG AAT ATC AGC AAA TTA AAA AGT 864 GAT TTC GAT GCT CTT AAT ATT CAC ACT TTA GCA AAT GGT GGA ACG CAA 912 GGC AGA CAT CTG ATC ACT GAT AAA CAA ATC ATT ATT TAT CAA CCA GAG 960 AAT CTT AAC TCC CAA GAT AAA CAA CTA TTT GAT AAT TAT GTT ATT TTA 1008 GGT AAT TAC ACG ACA TTA ATG TTT AAT ATT AGC CGT GCT TAT GTG CTG 1056 GAA AAA GAT CCC ACA CAA AAG GCG CAA CTA AAG CAG ATG TAC TTA TTA 1104 GTG ACA AAG CAT TTA TTA GAT CAA GGC TTT GTT AAA GGG AGT GCT TTA 1152 GTG ACA ACC CAT CAC TGG GGA TAC AGT TCT CGT TGG TGG TAT ATT TCC 1200 ACG TTA TTA ATG TCT GAT GCA CTA AAA GAA GCG AAC CTA CAA ACT CAA 1248 GTT TAT GAT TCA TTA CTG TGG TAT TCA CGT GAG TTT AAA AGT AGT TTT 1296 GAT ATG AAA GTA AGT GCT GAT AGC TCT GAT CTA GAT TAT TTC AAT ACC 1344 TTA TCT CGC CAA CAT TTA GCC TTA TTA TTA CTA GAG CCT GAT GAT CAA 1392 AAG CGT ATC AAC TTA GTT AAT ACT TTC AGC CAT TAT ATC ACT GGC GCA 1440 TTA ACG CAA GTG CCA CCG GGT GGT AAA GAT GGT TTA CGC CTG ATG GTA 1488 CAG CAT GGC GAC ATG AAG GCA ACT ATC CGG GTT ACT CTT TCC CAG CCT 1536 TTA AAA ATG CCT CTC AGC TTA TTT ATT TAT TAC GCG ATA CAC CAT TTC 1584 CAG TTG GGT GAA AGT GGT TGG AAT AAC CTG AAA AAA GCG ATG GTT TCA 1632 GCG TGG ATC TAC AGT AAT CCA GAA GTT GGA TTA CCG CTT GCA GGA AGA 1680 CAC CCT TTT AAC TCA CCT TCG TTA AAA TCA GTC GCT CAA GGC TAT TAC 1728 TGG CTT GCC ATG TCT GCA AAA TCA TCG CCT GAT AAA ACA CTT GCA TCT 1776 ATT TAT CTT GCG ATT AGT GAT AAA ACA CAA AAT GAA TCA ACT GCT ATT 1824 TTT GGA GAA ACT ATT ACA CCA GCG TCT TTA CCT CAA GGT TTC TAT GCC 1872 TTT AAT GGC GGT GCT TTT GGT ATT CAT CGT TGG CAA GAT AAA ATG GTG 1920 ACA CTG AAA GCT TAT AAC ACC AAT GTT TGG TCA TCT GAA ATT TAT AAC 1968 AAA GAT AAC CGT TAT GGC CGT TAC CAA AGT CAT GGT GTC GGT CAA ATA 2016 GTG AGT AAT GGC TCG CAG CTT TCA CAG GGC TAT CAG CAA GAA GGT TGG 2064 GAT TGG AAT AGA ATG CAA GGG GCA ACC ACT ATT CAC CTT CCT CTT AAA 2112 GAC TTA GAC AGT CCT AAA CCT CAT ACC TTA ATG CAA CGT GGA GAG CGT 2160 GGA TTT AGC GGA ACA TCA TCC CTT GAA GGT CAA TAT GGC ATG ATG GCA 2208 TTC GAT CTT ATT TAT CCC GCC AAT CTT GAG CGT TTT GAT CCT AAT TTC 2256 ACT GCG AAA AAG AGT GTA TTA GCC GCT GAT AAT CAC TTA ATT TTT ATT 2304 GGT AGC AAT ATA AAT AGT AGT GAT AAA AAT AAA AAT GTT GAA ACG ACC 2352 TTA TTC CAA CAT GCC ATT ACT CCA ACA TTA AAT ACC CTT TGG ATT AAT 2400 GGA CAA AAG ATA GAA AAC ATG CCT TAT CAA ACA ACA CTT CAA CAA GGT 2448 GAT TGG TTA ATT GAT AGC AAT GGC AAT GGT TAC TTA ATT ACT CAA GCA 2496 GAA AAA GTA AAT GTA AGT CGC CAA CAT CAG GTT TCA GCG GAA AAT AAA 2544 AAT CGC CAA CCG ACA GAA GGA AAC TTT AGC TCG GCA TGG ATC GAT CAC 2592 AGG ACT CGC CCC AAA GAT GCC AGT TAT GAG TAT ATG GTC TTT TTA GAT 2640 GCG ACA CCT GAA AAA ATG GGA GAG ATG GCA CAA AAA TTC CGT GAA AAT 2688 AAT GGG TTA TAT CAG GTT CTT CGT AAG GAT AAA GAC GTT CAT ATT ATT 2736 CTC GAT AAA CTC AGC AAT GTA ACG GGA TAT GCC TTT TAT CAG CCA GCA 2784 TCA ATT GAA GAC AAA TGG ATC AAA AAG GTT AAT AAA CCT GCA ATT GTG 2832 ATG ACT CAT CGA CAA AAA GAC ACT CTT ATT GTC AGT GCA GTT ACA CCT 2880 GAT TTA AAT ATG ACT CGC CAA AAA GCA GCA ACT CCT GTC ACC ATC AAT 2928 GTC ACG ATT AAT GGC AAA TGG CAA TCT GCT GAT AAA AAT AGT GAA GTG 2976 AAA TAT CAG GTT TCT GGT GAT AAC ACT GAA CTG ACG TTT ACG AGT TAC 3024 TTT GGT ATT CCA CAA GAA ATC AAA CTC TCG CCA CTC CCT TGA 3066 TTTAATCAAA AGGAACGCTC TTGCGTTCCT TTTTTATTTG CAGGAAATCT GATTATGCTA 3126 ATAAAAAACC CTTTAGCCCA CGCGGTTACA TTAAGCCTCT GTTTATCATT ACCCGCACAA 3186 GCATTACCCA CTCTGTCTCA TGAAGCTTTC GGCGTATTTA TCTTTTGAAG GTGAATTACC 3246 CAATACCTTA CCACTTC 3263
コードする遺伝子、より具体的にはプロテウス ブルガ
リス コンドロイチナーゼABCをコードする遺伝子、
当該遺伝子を組み込んだ組み替えDNA、当該組み替え
DNAで形質転換を行った形質転換体、並びに当該形質
転換体により生産されるコンドロイチナーゼに関する。
である、コンドロイチン硫酸A、同B、同C、及びヒア
ルロン酸を不飽和二糖に分解する活性を有する酵素であ
る。かかるコンドロイチナーゼは、上記基質の用途に応
じた低分子化や種々の研究用試薬として用いられてい
る。
微生物においてその存在が知られている。例えば、プロ
テウス属、フラボバクテリウム属、バクテロイデス属、
アルスロバクター属、シュウドモナス属、コリネバクテ
リウム属、ビブリオ属、マイクロコッカス属、アエロモ
ナス属、ベネキア属、ストレプトコッカス属、バチルス
属等においてコンドロイチナーゼの存在が確認されてい
る。ただし、これらのコンドロイチナーゼは、各々の微
生物によって基質特異性や阻害物質が微妙に異なってい
る。
古くからコンドロイチナーゼの存在が確認されており
(ジャーナル オブ バイオケミストリー,243,1523(19
68) 、ジャーナル オブ ジェネラル マイクロバイオ
ロジー,80,515(1974) 、バイオケミカルジャーナル,14
5,397(1975)) 、発明者等も「ジャーナル オブ バイ
オケミストリー,50,1057(1986)」でプロテウス ブルガ
リスにおけるコンドロイチナーゼの存在を明らかにして
いる。このコンドロイチナーゼは、「コンドロイチナー
ゼABC」とよばれるコンドロイチン硫酸A、同B、及
び同Cをすべて分解する能力を有するコンドロイチナー
ゼの範疇に属する酵素であることはすでに明らかにされ
ている。そしてさらに、当該コンドロイチナーゼの単離
・精製が試みられているが、多数の報告における分子量
は統一されておらず、確立した見解を得るには至ってい
ない。
は、コンドロイチナーゼABCを有するプロテウス属細
菌の中でも代表的なプロテウス ブルガリスのコンドロ
イチナーゼABCをコードする遺伝子の構造を明らかに
して、これを遺伝子工学的手法によって、純粋な形で安
価かつ大量に提供する手法を確立することである。
決のために鋭意検討を重ねた結果、上記プロテウスブル
ガリスのコンドロイチナーゼABCの遺伝子を単離して
その塩基配列を解析するに至った。すなわち本発明は、
以下の技術的思想をその要旨とするものである。
ドするコンドロイチナーゼ遺伝子。 (2) 配列番号2記載のアミノ酸配列をコードするコンド
ロイチナーゼ遺伝子。 (3) 配列番号3記載の塩基配列を有するコンドロイチナ
ーゼ遺伝子。 (4) 配列番号4記載の塩基配列を有するコンドロイチナ
ーゼ遺伝子。 (5) 前記(1)〜(2) のいずれかの項に記載されたコンド
ロイチナーゼ遺伝子を組み込んだ組み換えDNA。
転換したことを特徴とする形質転換体。 (7) 前記(6) に記載した形質転換体を培養し、当該培養
物からコンドロイチナーゼを採取することを特徴とする
コンドロイチナーゼの製造方法。 (8) 配列番号1記載のアミノ酸配列を有するコンドロイ
チナーゼ。
るコンドロイチナーゼ。 以下、本発明について詳細に説明する。本発明コンドロ
イチナーゼ遺伝子は、通常公知の方法を用いて単離する
ことができる。すなわち、プロテウス ブルガリスの菌
体より直接全DNAを常法により抽出し、これを適切な
ベクターに導入する。次に、かかる導入ベクターを当該
ベクターの種類に対応した宿主に導入して、プロテウス
ブルガリスの全DNAについての遺伝子ライブラリー
を調製する。そして当該遺伝子ライブラリーから本発明
コンドロイチナーゼ遺伝子を含むクローンを選択する。
かかる選択手段としては、例えばコンドロイチナーゼタ
ンパク質の部分アミノ酸配列より、その塩基配列を推定
して調製した合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて
選択する方法( 特願平4-253016号公報) を例示すること
ができる。さらには、後述する手法により本発明にかか
るコンドロイチナーゼ遺伝子の塩基配列が判明した場合
には、当該塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いたPCR 法(Saiki,R.et al.,Am.J.Hum.Gene
t.,37,172(1985)) に従って、遺伝子を増幅させること
により上記クローニングをすることもできる。
遺伝子の塩基配列の決定は、通常公知の方法、例えばマ
キサム- ギルバート法(Maxam-Gilbert.,Meth.Enzym.,6
5,499(1980)) や、M13 ファージを用いるジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法(Messing J.and Vieire,19,269(198
2)) 等により実行することができる。なお、既存の各種
の制限酵素を用いて、本発明遺伝子の制限酵素地図を作
成することもできる。
を有する本発明遺伝子を再度プロテウス ブルガリスか
ら調製することも可能であるが、これを直接DNA合成
装置で化学合成することも可能である。次にコンドロイ
チナーゼ遺伝子を組み込んだ、組み込み用ベクターを構
築する。
は、当該コンドロイチナーゼ遺伝子の導入を企図する宿
主の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、
宿主として大腸菌を用いる場合には、pBR322やpUC18 等
のColE1 系のもの;pACYC177やpACYC188等のp15A系のも
の;更にミニF等のF因子系のもの;pSC101等のR因子
系の各種ベクターを、また上記ベクターの他、EMBL3,4
やλgt10,11 等のファージベクターや、pKY2662,pCOS1-
10,HormerIII等のコスミド等をも組み込み用ベクターと
して用いることができる。また、酵母を宿主として用い
る場合には、2μm DNA由来のYEp 系やars を用いた
YRp 系、ars 若しくは2μm 系にセントロメア配列を付
加したYCp 系、染色体への組み込み型であるYIp系のベ
クター等を組み込み用ベクターとして用いることができ
る。さらに、枯草菌を宿主として用いる場合には、pUB1
10やpHY300PLK 等の大腸菌とのシャトルベクターを組み
込み用ベクターとして用いることができる。
菌では、コンドロイチナーゼの構造遺伝子の上流にプロ
モーター配列、SD配列等が位置するようにベクターを
設計する必要がある。真核生物用のベクターを基本ベク
ターとして採用する場合には、上記と同様に、プロモー
ター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位等
が含まれるようにベクターを設計する必要がある。
既に備えた発現用ベクターは既に市販されている。例え
ば昆虫細胞における発現を企図する場合には、例えばバ
キュロウイルスの発現系においては、大腸菌とのシャト
ルベクターであるpAc373,pAcYM1 若しくはその誘導体等
を発現用ベクターとして用いることができる。
ずしも直接発現系に限定されるものではなく、例えば融
合蛋白発現系をを企図したベクターを設計することがで
きる。かくして得られた発現ベクターの宿主細胞への導
入、及びこれによる形質転換の方法は、通常一般に用い
られる方法を採ることができる。例えば、宿主として大
腸菌を用いる場合には、宿主細胞の対数増殖期にある細
胞を集め、CaCl2 処理して自然にDNAを取り込みやす
い状態にして、かかる処理細胞に上記ベクターを取り込
ませる方法等を採用することができる。なおかかる方法
において、形質転換率の向上のためにMgCl2 やRbClを更
に共存させて、形質転換・形質導入を行うこともでき
る。
常法に従い培養することにより、所望のコンドロイチナ
ーゼが生産・蓄積される。当該培養に用いられる培地
は、通常の細胞培養に慣用される各種の培地のいずれを
も用いることができる。例えば、L培地、E培地、M9
培地等、又は当該培地に通常知られている各種の炭素
源、窒素源、無機塩、ビタミン類等を添加した上記の培
地、例えばM9最小培地等を用いて培養するのが好まし
い。また、当該培地には培養における適切な時期に、イ
ンドールアクリル酸等のトリプトファン・プロモーター
の働きを強めるための薬剤を添加することもできる。
ドロイチナーゼの単離・精製は常法に従い実行可能であ
る。特に、コンドロイチナーゼを宿主から抽出する場合
は、例えば浸透圧ショック法等の温和な条件を採用する
のが、その高次構造保持の面からより好ましい。上記単
離・精製は、例えば当該ポリペプチドの物理・化学的性
質を利用した各種の処理操作法に従い実施できる(例え
ば「生化学データーブックII」pp1175-1259 、第1版・
第1刷、1980年6月23日、株式会社東京化学同人発行を
参照のこと)。当該方法としては、例えば具体的には通
常の蛋白沈澱剤による処理、限外ろ過、分子篩クロマト
グラフィー(ゲルろ過)、液体クロマトグラフィー、遠
心分離、電気泳動、アフニィティクロマトグラフィー、
透析法、又はこれらの組合せ等を採用できる。
8)の菌体2gを5mlの50 mM Tris(pH 8.0)-50 mM EDTA
に懸濁してこれを -20℃で凍結した。これを融解後、
0.25 M Tris(pH 8.0)中に、10mg/ml の濃度でリゾチー
ムを含む溶液 0.5mlを添加し、これを45分間氷上に放置
した。ついで、6mlの 0.5% SDS, 50mM Tris(pH 8.0),
0.4 M EDTA を添加後、50℃で1時間処理を行った。当
該処理後、6mlの水飽和フェノールを添加し、これを攪
拌後遠心分離に処し、水層を集めた。この水層に 0.1倍
量の3M酢酸ナトリウムを加えた後、2倍量のエタノー
ルを加えて糸状に現れるDNAをガラス棒で回収した。
回収したDNAは、乾燥後TE(10 mM Tris(pH 8.0),1 mM
EDTA)緩衝液に溶解した。 (2) ファージ ライブラリーの調製 上記(1)で得たプロテウス ブルガリスの Genomic DN
A(200μg/ml)に 10μlのHバッファー(宝酒造社
製)及び制限酵素Sau 3AI(宝酒造社製)を0.1 ユニッ
ト添加して全量を 100μlにした。これを37℃で5分間
反応させた後、75℃、15分処理を行って反応を停止し
た。更に、この溶液をエタノール沈澱に供した。このエ
タノール沈澱により得られたDNAをλファージ EMBL3
キット(ストラタジーン社製)に挿入した。なお、こ
の挿入方法は当該キットの解説書に従った。ついで、挿
入済みのDNA溶液を、ギガパックゴールド(ストラタ
ジーン社製)を用いたインビトロ パッケージングに供
して、所望のDNAライブラリーを調製した。なお、こ
の調製方法は解説書に従った。 (3) 合成DNAプローブの作製 精製コンドロイチナーゼの部分アミノ酸配列をアミノ酸
シーケンサー(ABI社製)により決定し(配列番号
5)、このアミノ酸配列をもとにして、配列番号6、配
列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10に示さ
れた塩基配列を有する合成DNAプローブを等しい割合
で含む、ミックスプローブを調製した。なお、各々のD
NAプローブはDNA合成装置(ABI社製)で合成し
た。
10×T4ポリヌクレオチドバッファー(東洋紡社製)、9.
25 MBqのγ32P-ATP(アマーシャム社製)を8μl、およ
びT4ポリヌクレオチドキナーゼを3μl 加え、滅菌水
で全量を50μlに調製した。ついで、この系に於て、37
℃で1時間リン酸化反応を行った。当該反応後、バイオ
スピンカラム(バイオラッド社製)に供して5'-末端が
アイソトープラベルされたオリゴヌクレオチドプローブ
を得た。 (4) スクリーニング インビトロ パッケージングキット(ストラタジーン社
製)の使用書に記載された方法で、(2)で得られた組換
えλファージを大腸菌 P2392に感染させ、NZYプレート
上に溶菌プラーク数が約20,000−30,000個になるように
塗布した。このNZYプレートを37℃で一晩培養した後、
4℃下で1時間放置した。その後、当該プレートの表面
に 4.5×9cmのナイロンメンブラン(アマーシャム社
製)を密着させて、λファージを当該フィルター上に移
し、このフィルターを変成溶液(0.5 M NaOH, 1.5 M Na
Cl)に2分間、次いで中和溶液(0.5 M Tris(pH 8.0),
1.5M NaCl)に2分、更に 0.3 M NaCl, 0.03 M クエン
酸三ナトリウム(2×SSC)(pH 7.4)及び2mM EDTA で
リンス後、これを1時間風乾した。ついで、これをトラ
ンスイルミネーター上で紫外線固定した。
2mlになるように、ラピッド ハイブリダイゼーション
バッファー(アマーシャム社製)を加え、60℃下で30分
間処理した。これに次いで、(3)で作製したアイソトー
プラベルを施した合成ミックスプローブを当該ナイロン
メンブラン一枚当り、50万cpm となるように添加して、
60℃、2時間処理した。
ローンを得た。 (5) 制限酵素地図の作製 制限酵素地図の作製は、以下の制限酵素を用いて行っ
た。なお、各々の酵素反応は宝酒造社の使用法に従っ
た。Eco RI,Bam HI,Eco RV,Cla I, XbaI,Hind III, Pma CI その結果を図1に示す。
ジから、上記制限酵素地図で示した遺伝子(EcoRV-Eco
RI 断片)を切り出したものを、シャロミド9-36(日本
ジーン社製)に挿入し(pSOS10)、かかるプラスミドに
よって大腸菌DH1を形質転換した(E. coliDH1/pSOS
10 )。この形質転換体は工業技術院微生物工業研究所
に微工研菌寄第13057号(FERM P-13057)として寄託さ
れている。 (6) 塩基配列の決定 上記E. coli DH1/pSOS 10 から、通常公知の方法に従
ってプラスミド pSOS 10を分離して、当該プラスミド p
SOS 10(1μg)を、BamHI 及びEco RI で消化し、この
制限断片にアガロースゲル電気泳動を施し、約5Kbp の
断片を回収した。当該断片を制限酵素Sau 3AI 0.1 ユニ
ットで部分消化した。ついで、制限酵素Sau 3AI で完全
分解したpBluescript SK+0.5μgを CIP(ベーリンガー
マンハイム山之内社製)処理し脱リン酸化したものと、
上記部分分解したBam HI-EcoRI 断片と連結した。この
様々なSau 3AI 断片を含む組換えプラスミドを用いて大
腸菌JM109 を形質転換し、ミックスプローブと結合する
断片を含む組換えプラスミドを選んで、塩基配列を Tth
DNA シーケンス キット(東洋紡社製)を用いたジ
デオキシ転写終結法でコンドロイチナーゼをコードする
遺伝子の塩基配列を決定した(配列番号11)。
ロイチナーゼをコードする遺伝子には、潜在的な -35領
域(ヌクレオチド番号 134-139)、-10領域(ヌクレオ
チド番号 170-175)、SD配列(ヌクレオチド番号 210
-214)が存在する。ヌクレオチド番号 3288 に終止コド
ンが存在する。更に、ヌクレオチド番号 3298-3329に典
型的なρ非依存型転写終結配列が存在する。
にシグナルペプチド配列が存在する。当該遺伝子の配列
番号3(コンドロイチナーゼ前駆体)・配列番号4(コ
ンドロイチナーゼ成熟体)に具体的な塩基配列を示す。
そして、さらに当該塩基配列から推定されるアミノ酸配
列を配列番号1(コンドロイチナーゼ前駆体)・配列番
号2(コンドロイチナーゼ成熟体)に示す。まとめたも
のを配列番号11に示す。 (7) 上記コンドロイチナーゼ遺伝子領域を含むSalI-Ec
oRI断片を組換えλファージから単離し、pSTV29( 宝酒
造社製) のマルチクローニングサイト上のSal I-EcoR
I断片と置換した(pCHS6) 。このpCHS6 で大腸菌XL1-Bl
ue( ストラタジーン社製) を形質転換した。次いで、こ
の大腸菌(E.coli XL1-Blue/pCHS6) 25μg/mlの濃度
のクロラムフェニコールを含むLB培地(1%ペプトン,
0.5%酵母エキス、1%NaCl(pH7.5))で一晩培養した。
これを集菌洗浄後、ChSase誘導培地(0.7%K2HPO4, 0.3
%KH2PO4, 0.01%MgCl2, 0.1%(NH4)2SO4, 0.1mg/mlニ
コチン酸,0.1%酵母エキス,0.3%コンドロイチン硫酸C,
0.01%グルコース, 25μg/mlクロラムフェニコール)
にA610=0.05になるように植菌して3日間培養した。培
養後、遠心分離により培養液と菌体に分け、培養液は溶
液中のコンドロイチン硫酸Cの分解検定に、菌体は超音
波菌体破砕装置で破砕後、菌体抽出液中のコンドロイチ
ナーゼ活性の測定にそれぞれ供した。その結果を表1に
示す。なお、コントロールとして同様の操作をE.coli X
L1-Blue/pSTV29でも行った。
XL1-Blue/pCHS6)はコンドロイチナーゼ活性を有す
る。当該組換え菌体(E.coli XL1-Blue/pCHS6)は、平
成5年2月3日に工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第4170号(FERM BP-4170)号として寄託されてい
る。
Cを有するプロテウス属細菌の中でも代表的なプロテウ
ス ブルガリスのコンドロイチナーゼABCをコードす
る遺伝子の構造が明らかされ、これを遺伝子工学的手法
によって、純粋な形で安価かつ大量に提供する手法が確
立される。
is IFO 3988) 配列 Met Pro Ile Phe Arg Phe Thr Ala Leu Ala Met Thr Leu Gly Leu Leu 16 Ser Ala Pro Tyr Asn Ala Met Ala Ala Thr Ser Asn Pro Ala Phe Asp 32 Pro Lys Asn Leu Met Gln Ser Glu Ile Tyr His Phe Ala Gln Asn Asn 48 Pro Leu Ala Asp Phe Ser Ser Asp Lys Asn Ser Ile Leu Thr Leu Ser 64 Asp Lys Arg Ser Ile Met Gly Asn Gln Ser Leu Leu Trp Lys Trp Lys 80 Gly Gly Ser Ser Phe Thr Leu His Lys Lys Leu Ile Val Pro Thr Asp 96 Lys Glu Ala Ser Lys Ala Trp Gly Arg Ser Ser Thr Pro Val Phe Ser 112 Phe Trp Leu Tyr Asn Glu Lys Pro Ile Asp Gly Tyr Pro Thr Ile Asp 128 Phe Gly Glu Lys Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ala Gln Ala Gly Phe Lys 144 Val Lys Leu Asp Phe Thr Gly Trp Arg Ala Val Gly Val Ser Leu Asn 160 Asn Asp Leu Glu Asn Arg Glu Met Thr Leu Asn Ala Thr Asn Thr Ser 176 Ser Asp Gly Thr Gln Asp Ser Ile Gly Arg Ser Leu Gly Ala Lys Val 192 Asp Ser Ile Arg Phe Lys Ala Pro Ser Asn Val Ser Gln Gly Glu Ile 208 Tyr Ile Asp Arg Ile Met Phe Ser Val Asp Asp Ala Arg Tyr Gln Trp 224 Ser Asp Tyr Gln Val Lys Thr Arg Leu Ser Glu Pro Glu Ile Gln Phe 240 His Asn Val Lys Pro Gln Leu Pro Val Thr Pro Glu Asn Leu Ala Ala 256 Ile Asp Leu Ile Arg Gln Arg Leu Ile Asn Glu Phe Val Gly Gly Glu 272 Lys Glu Thr Asn Leu Ala Leu Glu Glu Asn Ile Ser Lys Leu Lys Ser 288 Asp Phe Asp Ala Leu Asn Ile His Thr Leu Ala Asn Gly Gly Thr Gln 304 Gly Arg His Leu Ile Thr Asp Lys Gln Ile Ile Ile Tyr Gln Pro Glu 320 Asn Leu Asn Ser Gln Asp Lys Gln Leu Phe Asp Asn Tyr Val Ile Leu 336 Gly Asn Tyr Thr Thr Leu Met Phe Asn Ile Ser Arg Ala Tyr Val Leu 352 Glu Lys Asp Pro Thr Gln Lys Ala Gln Leu Lys Gln Met Tyr Leu Leu 368 Val Thr Lys His Leu Leu Asp Gln Gly Phe Val Lys Gly Ser Ala Leu 384 Val Thr Thr His His Trp Gly Tyr Ser Ser Arg Trp Trp Tyr Ile Ser 400 Thr Leu Leu Met Ser Asp Ala Leu Lys Glu Ala Asn Leu Gln Thr Gln 416 Val Tyr Asp Ser Leu Leu Trp Tyr Ser Arg Glu Phe Lys Ser Ser Phe 464 Asp Met Lys Val Ser Ala Asp Ser Ser Asp Leu Asp Tyr Phe Asn Thr 480 Leu Ser Arg Gln His Leu Ala Leu Leu Leu Leu Glu Pro Asp Asp Gln 496 Lys Arg Ile Asn Leu Val Asn Thr Phe Ser His Tyr Ile Thr Gly Ala 512 Leu Thr Gln Val Pro Pro Gly Gly Lys Asp Gly Leu Arg Leu Met Val 528 Gln His Gly Asp Met Lys Ala Thr Ile Arg Val Thr Leu Ser Gln Pro 544 Leu Lys Met Pro Leu Ser Leu Phe Ile Tyr Tyr Ala Ile His His Phe 560 Gln Leu Gly Glu Ser Gly Trp Asn Asn Leu Lys Lys Ala Met Val Ser 576 Ala Trp Ile Tyr Ser Asn Pro Glu Val Gly Leu Pro Leu Ala Gly Arg 592 His Pro Phe Asn Ser Pro Ser Leu Lys Ser Val Ala Gln Gly Tyr Tyr 608 Trp Leu Ala Met Ser Ala Lys Ser Ser Pro Asp Lys Thr Leu Ala Ser 624 Ile Tyr Leu Ala Ile Ser Asp Lys Thr Gln Asn Glu Ser Thr Ala Ile 640 Phe Gly Glu Thr Ile Thr Pro Ala Ser Leu Pro Gln Gly Phe Tyr Ala 656 Phe Asn Gly Gly Ala Phe Gly Ile His Arg Trp Gln Asp Lys Met Val 672 Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Thr Asn Val Trp Ser Ser Glu Ile Tyr Asn 688 Lys Asp Asn Arg Tyr Gly Arg Tyr Gln Ser His Gly Val Gly Gln Ile 704 Val Ser Asn Gly Ser Gln Leu Ser Gln Gly Tyr Gln Gln Glu Gly Trp 720 Asp Trp Asn Arg Met Gln Gly Ala Thr Thr Ile His Leu Pro Leu Lys 736 Asp Leu Asp Ser Pro Lys Pro His Thr Leu Met Gln Arg Gly Glu Arg 752 Gly Phe Ser Gly Thr Ser Ser Leu Glu Gly Gln Tyr Gly Met Met Ala 768 Phe Asp Leu Ile Tyr Pro Ala Asn Leu Glu Arg Phe Asp Pro Asn Phe 784 Thr Ala Lys Lys Ser Val Leu Ala Ala Asp Asn His Leu Ile Phe Ile 800 Gly Ser Asn Ile Asn Ser Ser Asp Lys Asn Lys Asn Val Glu Thr Thr 816 Leu Phe Gln His Ala Ile Thr Pro Thr Leu Asn Thr Leu Trp Ile Asn 832 Gly Gln Lys Ile Glu Asn Met Pro Tyr Gln Thr Thr Leu Gln Gln Gly 848 Asp Trp Leu Ile Asp Ser Asn Gly Asn Gly Tyr Leu Ile Thr Gln Ala 864 Glu Lys Val Asn Val Ser Arg Gln His Gln Val Ser Ala Glu Asn Lys 880 Asn Arg Gln Pro Thr Glu Gly Asn Phe Ser Ser Ala Trp Ile Asp His 896 Arg Thr Arg Pro Lys Asp Ala Ser Tyr Glu Tyr Met Val Phe Leu Asp 912 Ala Thr Pro Glu Lys Met Gly Glu Met Ala Gln Lys Phe Arg Glu Asn 928 Asn Gly Leu Tyr Gln Val Leu Arg Lys Asp Lys Asp Val His Ile Ile 944 Leu Asp Lys Leu Ser Asn Val Thr Gly Tyr Ala Phe Tyr Gln Pro Ala 960 Ser Ile Glu Asp Lys Trp Ile Lys Lys Val Asn Lys Pro Ala Ile Val 976 Met Thr His Arg Gln Lys Asp Thr Leu Ile Val Ser Ala Val Thr Pro 992 Asp Leu Asn Met Thr Arg Gln Lys Ala Ala Thr Pro Val Thr Ile Asn 1008 Val Thr Ile Asn Gly Lys Trp Gln Ser Ala Asp Lys Asn Ser Glu Val 1024 Lys Tyr Gln Val Ser Gly Asp Asn Thr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Tyr 1040 Phe Gly Ile Pro Gln Glu Ile Lys Leu Ser Pro Leu Pro 1053
is IFO 3988) 配列 Ala Thr Ser Asn Pro Ala Phe Asp Pro Lys Asn Leu Met Gln Ser Glu 16 Ile Tyr His Phe Ala Gln Asn Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Ser Asp 32 Lys Asn Ser Ile Leu Thr Leu Ser Asp Lys Arg Ser Ile Met Gly Asn 48 Gln Ser Leu Leu Trp Lys Trp Lys Gly Gly Ser Ser Phe Thr Leu His 64 Lys Lys Leu Ile Val Pro Thr Asp Lys Glu Ala Ser Lys Ala Trp Gly 80 Arg Ser Ser Thr Pro Val Phe Ser Phe Trp Leu Tyr Asn Glu Lys Pro 96 Ile Asp Gly Tyr Pro Thr Ile Asp Phe Gly Glu Lys Leu Ile Ser Thr 112 Ser Glu Ala Gln Ala Gly Phe Lys Val Lys Leu Asp Phe Thr Gly Trp 128 Arg Ala Val Gly Val Ser Leu Asn Asn Asp Leu Glu Asn Arg Glu Met 144 Thr Leu Asn Ala Thr Asn Thr Ser Ser Asp Gly Thr Gln Asp Ser Ile 160 Gly Arg Ser Leu Gly Ala Lys Val Asp Ser Ile Arg Phe Lys Ala Pro 176 Ser Asn Val Ser Gln Gly Glu Ile Tyr Ile Asp Arg Ile Met Phe Ser 192 Val Asp Asp Ala Arg Tyr Gln Trp Ser Asp Tyr Gln Val Lys Thr Arg 208 Leu Ser Glu Pro Glu Ile Gln Phe His Asn Val Lys Pro Gln Leu Pro 224 Val Thr Pro Glu Asn Leu Ala Ala Ile Asp Leu Ile Arg Gln Arg Leu 240 Ile Asn Glu Phe Val Gly Gly Glu Lys Glu Thr Asn Leu Ala Leu Glu 256 Glu Asn Ile Ser Lys Leu Lys Ser Asp Phe Asp Ala Leu Asn Ile His 272 Thr Leu Ala Asn Gly Gly Thr Gln Gly Arg His Leu Ile Thr Asp Lys 288 Gln Ile Ile Ile Tyr Gln Pro Glu Asn Leu Asn Ser Gln Asp Lys Gln 304 Leu Phe Asp Asn Tyr Val Ile Leu Gly Asn Tyr Thr Thr Leu Met Phe 320 Asn Ile Ser Arg Ala Tyr Val Leu Glu Lys Asp Pro Thr Gln Lys Ala 336 Gln Leu Lys Gln Met Tyr Leu Leu Val Thr Lys His Leu Leu Asp Gln 352 Gly Phe Val Lys Gly Ser Ala Leu Val Thr Thr His His Trp Gly Tyr 368 Ser Ser Arg Trp Trp Tyr Ile Ser Thr Leu Leu Met Ser Asp Ala Leu 384 Lys Glu Ala Asn Leu Gln Thr Gln Val Tyr Asp Ser Leu Leu Trp Tyr 400 Ser Arg Glu Phe Lys Ser Ser Phe Asp Met Lys Val Ser Ala Asp Ser 416 Ser Asp Leu Asp Tyr Phe Asn Thr Leu Ser Arg Gln His Leu Ala Leu 432 Leu Leu Leu Glu Pro Asp Asp Gln Lys Arg Ile Asn Leu Val Asn Thr 448 Phe Ser His Tyr Ile Thr Gly Ala Leu Thr Gln Val Pro Pro Gly Gly 464 Lys Asp Gly Leu Arg Leu Met Val Gln His Gly Asp Met Lys Ala Thr 480 Ile Arg Val Thr Leu Ser Gln Pro Leu Lys Met Pro Leu Ser Leu Phe 496 Ile Tyr Tyr Ala Ile His His Phe Gln Leu Gly Glu Ser Gly Trp Asn 512 Asn Leu Lys Lys Ala Met Val Ser Ala Trp Ile Tyr Ser Asn Pro Glu 528 Val Gly Leu Pro Leu Ala Gly Arg His Pro Phe Asn Ser Pro Ser Leu 544 Lys Ser Val Ala Gln Gly Tyr Tyr Trp Leu Ala Met Ser Ala Lys Ser 560 Ser Pro Asp Lys Thr Leu Ala Ser Ile Tyr Leu Ala Ile Ser Asp Lys 576 Thr Gln Asn Glu Ser Thr Ala Ile Phe Gly Glu Thr Ile Thr Pro Ala 592 Ser Leu Pro Gln Gly Phe Tyr Ala Phe Asn Gly Gly Ala Phe Gly Ile 608 His Arg Trp Gln Asp Lys Met Val Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Thr Asn 624 Val Trp Ser Ser Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Asn Arg Tyr Gly Arg Tyr 640 Gln Ser His Gly Val Gly Gln Ile Val Ser Asn Gly Ser Gln Leu Ser 656 Gln Gly Tyr Gln Gln Glu Gly Trp Asp Trp Asn Arg Met Gln Gly Ala 672 Thr Thr Ile His Leu Pro Leu Lys Asp Leu Asp Ser Pro Lys Pro His 688 Thr Leu Met Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Ser Gly Thr Ser Ser Leu 704 Glu Gly Gln Tyr Gly Met Met Ala Phe Asp Leu Ile Tyr Pro Ala Asn 720 Leu Glu Arg Phe Asp Pro Asn Phe Thr Ala Lys Lys Ser Val Leu Ala 736 Ala Asp Asn His Leu Ile Phe Ile Gly Ser Asn Ile Asn Ser Ser Asp 752 Lys Asn Lys Asn Val Glu Thr Thr Leu Phe Gln His Ala Ile Thr Pro 768 Thr Leu Asn Thr Leu Trp Ile Asn Gly Gln Lys Ile Glu Asn Met Pro 784 Tyr Gln Thr Thr Leu Gln Gln Gly Asp Trp Leu Ile Asp Ser Asn Gly 800 Asn Gly Tyr Leu Ile Thr Gln Ala Glu Lys Val Asn Val Ser Arg Gln 816 His Gln Val Ser Ala Glu Asn Lys Asn Arg Gln Pro Thr Glu Gly Asn 832 Phe Ser Ser Ala Trp Ile Asp His Arg Thr Arg Pro Lys Asp Ala Ser 848 Tyr Glu Tyr Met Val Phe Leu Asp Ala Thr Pro Glu Lys Met Gly Glu 864 Met Ala Gln Lys Phe Arg Glu Asn Asn Gly Leu Tyr Gln Val Leu Arg 880 Lys Asp Lys Asp Val His Ile Ile Leu Asp Lys Leu Ser Asn Val Thr 896 Gly Tyr Ala Phe Tyr Gln Pro Ala Ser Ile Glu Asp Lys Trp Ile Lys 912 Lys Val Asn Lys Pro Ala Ile Val Met Thr His Arg Gln Lys Asp Thr 928 Leu Ile Val Ser Ala Val Thr Pro Asp Leu Asn Met Thr Arg Gln Lys 944 Ala Ala Thr Pro Val Thr Ile Asn Val Thr Ile Asn Gly Lys Trp Gln 960 Ser Ala Asp Lys Asn Ser Glu Val Lys Tyr Gln Val Ser Gly Asp Asn 976 Thr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Gly Ile Pro Gln Glu Ile Lys 992 Leu Ser Pro Leu Pro 997
is IFO 3988) 配列 ATG CCG ATA TTT CGT TTT ACT GCA CTT GCA ATG ACA TTG GGG CTA TTA 48 TCA GCG CCT TAT AAC GCG ATG GCA GCC ACC AGC AAT CCT GCA TTT GAT 96 CCT AAA AAT CTG ATG CAG TCA GAA ATT TAC CAT TTT GCA CAA AAT AAC 144 CCA TTA GCA GAC TTC TCA TCA GAT AAA AAC TCA ATA CTA ACG TTA TCT 192 GAT AAA CGT AGC ATT ATG GGA AAC CAA TCT CTT TTA TGG AAA TGG AAA 240 GGT GGT AGT AGC TTT ACT TTA CAT AAA AAA CTG ATT GTC CCC ACC GAT 288 AAA GAA GCA TCT AAA GCA TGG GGA CGC TCA TCT ACC CCC GTT TTC TCA 336 TTT TGG CTT TAC AAT GAA AAA CCG ATT GAT GGT TAT CCT ACT ATC GAT 384 TTC GGA GAA AAA CTC ATT TCA ACC AGT GAG GCT CAG GCA GGC TTT AAA 432 GTA AAA TTA GAT TTC ACT GGC TGG CGT GCT GTG GGA GTC TCT TTA AAT 480 AAC GAT CTT GAA AAT CGA GAG ATG ACC TTA AAT GCA ACC AAT ACC TCC 528 TCT GAT GGT ACT CAA GAC AGC ATT GGG CGT TCT TTA GGT GCT AAA GTC 576 GAT AGT ATT CGT TTT AAA GCG CCT TCT AAT GTG AGT CAG GGT GAA ATC 624 TAT ATC GAC CGT ATT ATG TTT TCT GTC GAT GAT GCT CGC TAC CAA TGG 672 TCT GAT TAT CAA GTA AAA ACT CGC TTA TCA GAA CCT GAA ATT CAA TTT 720 CAC AAC GTA AAG CCA CAA CTA CCT GTA ACA CCT GAA AAT TTA GCG GCC 768 ATT GAT CTT ATT CGC CAA CGT CTA ATT AAT GAA TTT GTC GGA GGT GAA 816 AAA GAG ACA AAC CTC GCA TTA GAA GAG AAT ATC AGC AAA TTA AAA AGT 864 GAT TTC GAT GCT CTT AAT ATT CAC ACT TTA GCA AAT GGT GGA ACG CAA 912 GGC AGA CAT CTG ATC ACT GAT AAA CAA ATC ATT ATT TAT CAA CCA GAG 960 AAT CTT AAC TCC CAA GAT AAA CAA CTA TTT GAT AAT TAT GTT ATT TTA 1008 GGT AAT TAC ACG ACA TTA ATG TTT AAT ATT AGC CGT GCT TAT GTG CTG 1056 GAA AAA GAT CCC ACA CAA AAG GCG CAA CTA AAG CAG ATG TAC TTA TTA 1104 GTG ACA AAG CAT TTA TTA GAT CAA GGC TTT GTT AAA GGG AGT GCT TTA 1152 GTG ACA ACC CAT CAC TGG GGA TAC AGT TCT CGT TGG TGG TAT ATT TCC 1200 ACG TTA TTA ATG TCT GAT GCA CTA AAA GAA GCG AAC CTA CAA ACT CAA 1248 GTT TAT GAT TCA TTA CTG TGG TAT TCA CGT GAG TTT AAA AGT AGT TTT 1296 GAT ATG AAA GTA AGT GCT GAT AGC TCT GAT CTA GAT TAT TTC AAT ACC 1344 TTA TCT CGC CAA CAT TTA GCC TTA TTA TTA CTA GAG CCT GAT GAT CAA 1392 AAG CGT ATC AAC TTA GTT AAT ACT TTC AGC CAT TAT ATC ACT GGC GCA 1440 TTA ACG CAA GTG CCA CCG GGT GGT AAA GAT GGT TTA CGC CTG ATG GTA 1488 CAG CAT GGC GAC ATG AAG GCA ACT ATC CGG GTT ACT CTT TCC CAG CCT 1536 TTA AAA ATG CCT CTC AGC TTA TTT ATT TAT TAC GCG ATA CAC CAT TTC 1584 CAG TTG GGT GAA AGT GGT TGG AAT AAC CTG AAA AAA GCG ATG GTT TCA 1632 GCG TGG ATC TAC AGT AAT CCA GAA GTT GGA TTA CCG CTT GCA GGA AGA 1680 CAC CCT TTT AAC TCA CCT TCG TTA AAA TCA GTC GCT CAA GGC TAT TAC 1728 TGG CTT GCC ATG TCT GCA AAA TCA TCG CCT GAT AAA ACA CTT GCA TCT 1776 ATT TAT CTT GCG ATT AGT GAT AAA ACA CAA AAT GAA TCA ACT GCT ATT 1824 TTT GGA GAA ACT ATT ACA CCA GCG TCT TTA CCT CAA GGT TTC TAT GCC 1872 TTT AAT GGC GGT GCT TTT GGT ATT CAT CGT TGG CAA GAT AAA ATG GTG 1920 ACA CTG AAA GCT TAT AAC ACC AAT GTT TGG TCA TCT GAA ATT TAT AAC 1968 AAA GAT AAC CGT TAT GGC CGT TAC CAA AGT CAT GGT GTC GGT CAA ATA 2016 GTG AGT AAT GGC TCG CAG CTT TCA CAG GGC TAT CAG CAA GAA GGT TGG 2064 GAT TGG AAT AGA ATG CAA GGG GCA ACC ACT ATT CAC CTT CCT CTT AAA 2112 GAC TTA GAC AGT CCT AAA CCT CAT ACC TTA ATG CAA CGT GGA GAG CGT 2160 GGA TTT AGC GGA ACA TCA TCC CTT GAA GGT CAA TAT GGC ATG ATG GCA 2208 TTC GAT CTT ATT TAT CCC GCC AAT CTT GAG CGT TTT GAT CCT AAT TTC 2256 ACT GCG AAA AAG AGT GTA TTA GCC GCT GAT AAT CAC TTA ATT TTT ATT 2304 GGT AGC AAT ATA AAT AGT AGT GAT AAA AAT AAA AAT GTT GAA ACG ACC 2352 TTA TTC CAA CAT GCC ATT ACT CCA ACA TTA AAT ACC CTT TGG ATT AAT 2400 GGA CAA AAG ATA GAA AAC ATG CCT TAT CAA ACA ACA CTT CAA CAA GGT 2448 GAT TGG TTA ATT GAT AGC AAT GGC AAT GGT TAC TTA ATT ACT CAA GCA 2496 GAA AAA GTA AAT GTA AGT CGC CAA CAT CAG GTT TCA GCG GAA AAT AAA 2544 AAT CGC CAA CCG ACA GAA GGA AAC TTT AGC TCG GCA TGG ATC GAT CAC 2592 AGG ACT CGC CCC AAA GAT GCC AGT TAT GAG TAT ATG GTC TTT TTA GAT 2640 GCG ACA CCT GAA AAA ATG GGA GAG ATG GCA CAA AAA TTC CGT GAA AAT 2688 AAT GGG TTA TAT CAG GTT CTT CGT AAG GAT AAA GAC GTT CAT ATT ATT 2736 CTC GAT AAA CTC AGC AAT GTA ACG GGA TAT GCC TTT TAT CAG CCA GCA 2784 TCA ATT GAA GAC AAA TGG ATC AAA AAG GTT AAT AAA CCT GCA ATT GTG 2832 ATG ACT CAT CGA CAA AAA GAC ACT CTT ATT GTC AGT GCA GTT ACA CCT 2880 GAT TTA AAT ATG ACT CGC CAA AAA GCA GCA ACT CCT GTC ACC ATC AAT 2928 GTC ACG ATT AAT GGC AAA TGG CAA TCT GCT GAT AAA AAT AGT GAA GTG 2976 AAA TAT CAG GTT TCT GGT GAT AAC ACT GAA CTG ACG TTT ACG AGT TAC 3024 TTT GGT ATT CCA CAA GAA ATC AAA CTC TCG CCA CTC CCT TGA 3066
is IFO 3988) 配列 GCC ACC AGC AAT CCT GCA TTT GAT CCT AAA AAT CTG ATG CAG TCA GAA 48 ATT TAC CAT TTT GCA CAA AAT AAC CCA TTA GCA GAC TTC TCA TCA GAT 96 AAA AAC TCA ATA CTA ACG TTA TCT GAT AAA CGT AGC ATT ATG GGA AAC 144 CAA TCT CTT TTA TGG AAA TGG AAA GGT GGT AGT AGC TTT ACT TTA CAT 192 AAA AAA CTG ATT GTC CCC ACC GAT AAA GAA GCA TCT AAA GCA TGG GGA 240 CGC TCA TCT ACC CCC GTT TTC TCA TTT TGG CTT TAC AAT GAA AAA CCG 288 ATT GAT GGT TAT CCT ACT ATC GAT TTC GGA GAA AAA CTC ATT TCA ACC 336 AGT GAG GCT CAG GCA GGC TTT AAA GTA AAA TTA GAT TTC ACT GGC TGG 384 CGT GCT GTG GGA GTC TCT TTA AAT AAC GAT CTT GAA AAT CGA GAG ATG 432 ACC TTA AAT GCA ACC AAT ACC TCC TCT GAT GGT ACT CAA GAC AGC ATT 480 GGG CGT TCT TTA GGT GCT AAA GTC GAT AGT ATT CGT TTT AAA GCG CCT 528 TCT AAT GTG AGT CAG GGT GAA ATC TAT ATC GAC CGT ATT ATG TTT TCT 576 GTC GAT GAT GCT CGC TAC CAA TGG TCT GAT TAT CAA GTA AAA ACT CGC 624 TTA TCA GAA CCT GAA ATT CAA TTT CAC AAC GTA AAG CCA CAA CTA CCT 672 GTA ACA CCT GAA AAT TTA GCG GCC ATT GAT CTT ATT CGC CAA CGT CTA 720 ATT AAT GAA TTT GTC GGA GGT GAA AAA GAG ACA AAC CTC GCA TTA GAA 768 GAG AAT ATC AGC AAA TTA AAA AGT GAT TTC GAT GCT CTT AAT ATT CAC 816 ACT TTA GCA AAT GGT GGA ACG CAA GGC AGA CAT CTG ATC ACT GAT AAA 864 CAA ATC ATT ATT TAT CAA CCA GAG AAT CTT AAC TCC CAA GAT AAA CAA 912 CTA TTT GAT AAT TAT GTT ATT TTA GGT AAT TAC ACG ACA TTA ATG TTT 960 AAT ATT AGC CGT GCT TAT GTG CTG GAA AAA GAT CCC ACA CAA AAG GCG 1008 CAA CTA AAG CAG ATG TAC TTA TTA GTG ACA AAG CAT TTA TTA GAT CAA 1056 GGC TTT GTT AAA GGG AGT GCT TTA GTG ACA ACC CAT CAC TGG GGA TAC 1104 AGT TCT CGT TGG TGG TAT ATT TCC ACG TTA TTA ATG TCT GAT GCA CTA 1152 AAA GAA GCG AAC CTA CAA ACT CAA GTT TAT GAT TCA TTA CTG TGG TAT 1200 TCA CGT GAG TTT AAA AGT AGT TTT GAT ATG AAA GTA AGT GCT GAT AGC 1248 TCT GAT CTA GAT TAT TTC AAT ACC TTA TCT CGC CAA CAT TTA GCC TTA 1296 TTA TTA CTA GAG CCT GAT GAT CAA AAG CGT ATC AAC TTA GTT AAT ACT 1344 TTC AGC CAT TAT ATC ACT GGC GCA TTA ACG CAA GTG CCA CCG GGT GGT 1392 AAA GAT GGT TTA CGC CTG ATG GTA CAG CAT GGC GAC ATG AAG GCA ACT 1440 ATC CGG GTT ACT CTT TCC CAG CCT TTA AAA ATG CCT CTC AGC TTA TTT 1488 ATT TAT TAC GCG ATA CAC CAT TTC CAG TTG GGT GAA AGT GGT TGG AAT 1536 AAC CTG AAA AAA GCG ATG GTT TCA GCG TGG ATC TAC AGT AAT CCA GAA 1584 GTT GGA TTA CCG CTT GCA GGA AGA CAC CCT TTT AAC TCA CCT TCG TTA 1632 AAA TCA GTC GCT CAA GGC TAT TAC TGG CTT GCC ATG TCT GCA AAA TCA 1680 TCG CCT GAT AAA ACA CTT GCA TCT ATT TAT CTT GCG ATT AGT GAT AAA 1728 ACA CAA AAT GAA TCA ACT GCT ATT TTT GGA GAA ACT ATT ACA CCA GCG 1776 TCT TTA CCT CAA GGT TTC TAT GCC TTT AAT GGC GGT GCT TTT GGT ATT 1824 CAT CGT TGG CAA GAT AAA ATG GTG ACA CTG AAA GCT TAT AAC ACC AAT 1872 GTT TGG TCA TCT GAA ATT TAT AAC AAA GAT AAC CGT TAT GGC CGT TAC 1920 CAA AGT CAT GGT GTC GGT CAA ATA GTG AGT AAT GGC TCG CAG CTT TCA 1968 CAG GGC TAT CAG CAA GAA GGT TGG GAT TGG AAT AGA ATG CAA GGG GCA 2016 ACC ACT ATT CAC CTT CCT CTT AAA GAC TTA GAC AGT CCT AAA CCT CAT 2064 ACC TTA ATG CAA CGT GGA GAG CGT GGA TTT AGC GGA ACA TCA TCC CTT 2112 GAA GGT CAA TAT GGC ATG ATG GCA TTC GAT CTT ATT TAT CCC GCC AAT 2160 CTT GAG CGT TTT GAT CCT AAT TTC ACT GCG AAA AAG AGT GTA TTA GCC 2208 GCT GAT AAT CAC TTA ATT TTT ATT GGT AGC AAT ATA AAT AGT AGT GAT 2256 AAA AAT AAA AAT GTT GAA ACG ACC TTA TTC CAA CAT GCC ATT ACT CCA 2304 ACA TTA AAT ACC CTT TGG ATT AAT GGA CAA AAG ATA GAA AAC ATG CCT 2352 TAT CAA ACA ACA CTT CAA CAA GGT GAT TGG TTA ATT GAT AGC AAT GGC 2400 AAT GGT TAC TTA ATT ACT CAA GCA GAA AAA GTA AAT GTA AGT CGC CAA 2448 CAT CAG GTT TCA GCG GAA AAT AAA AAT CGC CAA CCG ACA GAA GGA AAC 2496 TTT AGC TCG GCA TGG ATC GAT CAC AGG ACT CGC CCC AAA GAT GCC AGT 2544 TAT GAG TAT ATG GTC TTT TTA GAT GCG ACA CCT GAA AAA ATG GGA GAG 2592 ATG GCA CAA AAA TTC CGT GAA AAT AAT GGG TTA TAT CAG GTT CTT CGT 2640 AAG GAT AAA GAC GTT CAT ATT ATT CTC GAT AAA CTC AGC AAT GTA ACG 2688 GGA TAT GCC TTT TAT CAG CCA GCA TCA ATT GAA GAC AAA TGG ATC AAA 2736 AAG GTT AAT AAA CCT GCA ATT GTG ATG ACT CAT CGA CAA AAA GAC ACT 2784 CTT ATT GTC AGT GCA GTT ACA CCT GAT TTA AAT ATG ACT CGC CAA AAA 2832 GCA GCA ACT CCT GTC ACC ATC AAT GTC ACG ATT AAT GGC AAA TGG CAA 2880 TCT GCT GAT AAA AAT AGT GAA GTG AAA TAT CAG GTT TCT GGT GAT AAC 2928 ACT GAA CTG ACG TTT ACG AGT TAC TTT GGT ATT CCA CAA GAA ATC AAA 2976 CTC TCG CCA CTC CCT TGA 2994
is IFO 3988) 配列 GCC ACC UCC AAC CCC GC
is IFO 3988) 配列 ATCAATCAAC GCCACAGCCT TACCTATTTT AATACAGGGG GAAGTACCTT TGATATTAAA -165 GGAAATACCG TTGGTGGTGA CATTATTAGT GCGGAATTAG GTGCAAATCT CGATATCACT -105 CAATCATTAA ATTTAGGCAC AACGATGGGC TATCAGCGTT ATGACAAATT TAATGAAGGA -45 CGCATTGGTT TCACTGTTAG CCAGCGTTTC TAAGGAGAAA AATA -1 ATG CCG ATA TTT CGT TTT ACT GCA CTT GCA ATG ACA TTG GGG CTA TTA 48 TCA GCG CCT TAT AAC GCG ATG GCA GCC ACC AGC AAT CCT GCA TTT GAT 96 CCT AAA AAT CTG ATG CAG TCA GAA ATT TAC CAT TTT GCA CAA AAT AAC 144 CCA TTA GCA GAC TTC TCA TCA GAT AAA AAC TCA ATA CTA ACG TTA TCT 192 GAT AAA CGT AGC ATT ATG GGA AAC CAA TCT CTT TTA TGG AAA TGG AAA 240 GGT GGT AGT AGC TTT ACT TTA CAT AAA AAA CTG ATT GTC CCC ACC GAT 288 AAA GAA GCA TCT AAA GCA TGG GGA CGC TCA TCT ACC CCC GTT TTC TCA 336 TTT TGG CTT TAC AAT GAA AAA CCG ATT GAT GGT TAT CCT ACT ATC GAT 384 TTC GGA GAA AAA CTC ATT TCA ACC AGT GAG GCT CAG GCA GGC TTT AAA 432 GTA AAA TTA GAT TTC ACT GGC TGG CGT GCT GTG GGA GTC TCT TTA AAT 480 AAC GAT CTT GAA AAT CGA GAG ATG ACC TTA AAT GCA ACC AAT ACC TCC 528 TCT GAT GGT ACT CAA GAC AGC ATT GGG CGT TCT TTA GGT GCT AAA GTC 576 GAT AGT ATT CGT TTT AAA GCG CCT TCT AAT GTG AGT CAG GGT GAA ATC 624 TAT ATC GAC CGT ATT ATG TTT TCT GTC GAT GAT GCT CGC TAC CAA TGG 672 TCT GAT TAT CAA GTA AAA ACT CGC TTA TCA GAA CCT GAA ATT CAA TTT 720 CAC AAC GTA AAG CCA CAA CTA CCT GTA ACA CCT GAA AAT TTA GCG GCC 768 ATT GAT CTT ATT CGC CAA CGT CTA ATT AAT GAA TTT GTC GGA GGT GAA 816 AAA GAG ACA AAC CTC GCA TTA GAA GAG AAT ATC AGC AAA TTA AAA AGT 864 GAT TTC GAT GCT CTT AAT ATT CAC ACT TTA GCA AAT GGT GGA ACG CAA 912 GGC AGA CAT CTG ATC ACT GAT AAA CAA ATC ATT ATT TAT CAA CCA GAG 960 AAT CTT AAC TCC CAA GAT AAA CAA CTA TTT GAT AAT TAT GTT ATT TTA 1008 GGT AAT TAC ACG ACA TTA ATG TTT AAT ATT AGC CGT GCT TAT GTG CTG 1056 GAA AAA GAT CCC ACA CAA AAG GCG CAA CTA AAG CAG ATG TAC TTA TTA 1104 GTG ACA AAG CAT TTA TTA GAT CAA GGC TTT GTT AAA GGG AGT GCT TTA 1152 GTG ACA ACC CAT CAC TGG GGA TAC AGT TCT CGT TGG TGG TAT ATT TCC 1200 ACG TTA TTA ATG TCT GAT GCA CTA AAA GAA GCG AAC CTA CAA ACT CAA 1248 GTT TAT GAT TCA TTA CTG TGG TAT TCA CGT GAG TTT AAA AGT AGT TTT 1296 GAT ATG AAA GTA AGT GCT GAT AGC TCT GAT CTA GAT TAT TTC AAT ACC 1344 TTA TCT CGC CAA CAT TTA GCC TTA TTA TTA CTA GAG CCT GAT GAT CAA 1392 AAG CGT ATC AAC TTA GTT AAT ACT TTC AGC CAT TAT ATC ACT GGC GCA 1440 TTA ACG CAA GTG CCA CCG GGT GGT AAA GAT GGT TTA CGC CTG ATG GTA 1488 CAG CAT GGC GAC ATG AAG GCA ACT ATC CGG GTT ACT CTT TCC CAG CCT 1536 TTA AAA ATG CCT CTC AGC TTA TTT ATT TAT TAC GCG ATA CAC CAT TTC 1584 CAG TTG GGT GAA AGT GGT TGG AAT AAC CTG AAA AAA GCG ATG GTT TCA 1632 GCG TGG ATC TAC AGT AAT CCA GAA GTT GGA TTA CCG CTT GCA GGA AGA 1680 CAC CCT TTT AAC TCA CCT TCG TTA AAA TCA GTC GCT CAA GGC TAT TAC 1728 TGG CTT GCC ATG TCT GCA AAA TCA TCG CCT GAT AAA ACA CTT GCA TCT 1776 ATT TAT CTT GCG ATT AGT GAT AAA ACA CAA AAT GAA TCA ACT GCT ATT 1824 TTT GGA GAA ACT ATT ACA CCA GCG TCT TTA CCT CAA GGT TTC TAT GCC 1872 TTT AAT GGC GGT GCT TTT GGT ATT CAT CGT TGG CAA GAT AAA ATG GTG 1920 ACA CTG AAA GCT TAT AAC ACC AAT GTT TGG TCA TCT GAA ATT TAT AAC 1968 AAA GAT AAC CGT TAT GGC CGT TAC CAA AGT CAT GGT GTC GGT CAA ATA 2016 GTG AGT AAT GGC TCG CAG CTT TCA CAG GGC TAT CAG CAA GAA GGT TGG 2064 GAT TGG AAT AGA ATG CAA GGG GCA ACC ACT ATT CAC CTT CCT CTT AAA 2112 GAC TTA GAC AGT CCT AAA CCT CAT ACC TTA ATG CAA CGT GGA GAG CGT 2160 GGA TTT AGC GGA ACA TCA TCC CTT GAA GGT CAA TAT GGC ATG ATG GCA 2208 TTC GAT CTT ATT TAT CCC GCC AAT CTT GAG CGT TTT GAT CCT AAT TTC 2256 ACT GCG AAA AAG AGT GTA TTA GCC GCT GAT AAT CAC TTA ATT TTT ATT 2304 GGT AGC AAT ATA AAT AGT AGT GAT AAA AAT AAA AAT GTT GAA ACG ACC 2352 TTA TTC CAA CAT GCC ATT ACT CCA ACA TTA AAT ACC CTT TGG ATT AAT 2400 GGA CAA AAG ATA GAA AAC ATG CCT TAT CAA ACA ACA CTT CAA CAA GGT 2448 GAT TGG TTA ATT GAT AGC AAT GGC AAT GGT TAC TTA ATT ACT CAA GCA 2496 GAA AAA GTA AAT GTA AGT CGC CAA CAT CAG GTT TCA GCG GAA AAT AAA 2544 AAT CGC CAA CCG ACA GAA GGA AAC TTT AGC TCG GCA TGG ATC GAT CAC 2592 AGG ACT CGC CCC AAA GAT GCC AGT TAT GAG TAT ATG GTC TTT TTA GAT 2640 GCG ACA CCT GAA AAA ATG GGA GAG ATG GCA CAA AAA TTC CGT GAA AAT 2688 AAT GGG TTA TAT CAG GTT CTT CGT AAG GAT AAA GAC GTT CAT ATT ATT 2736 CTC GAT AAA CTC AGC AAT GTA ACG GGA TAT GCC TTT TAT CAG CCA GCA 2784 TCA ATT GAA GAC AAA TGG ATC AAA AAG GTT AAT AAA CCT GCA ATT GTG 2832 ATG ACT CAT CGA CAA AAA GAC ACT CTT ATT GTC AGT GCA GTT ACA CCT 2880 GAT TTA AAT ATG ACT CGC CAA AAA GCA GCA ACT CCT GTC ACC ATC AAT 2928 GTC ACG ATT AAT GGC AAA TGG CAA TCT GCT GAT AAA AAT AGT GAA GTG 2976 AAA TAT CAG GTT TCT GGT GAT AAC ACT GAA CTG ACG TTT ACG AGT TAC 3024 TTT GGT ATT CCA CAA GAA ATC AAA CTC TCG CCA CTC CCT TGA 3066 TTTAATCAAA AGGAACGCTC TTGCGTTCCT TTTTTATTTG CAGGAAATCT GATTATGCTA 3126 ATAAAAAACC CTTTAGCCCA CGCGGTTACA TTAAGCCTCT GTTTATCATT ACCCGCACAA 3186 GCATTACCCA CTCTGTCTCA TGAAGCTTTC GGCGTATTTA TCTTTTGAAG GTGAATTACC 3246 CAATACCTTA CCACTTC 3263
地図。
Claims (9)
- 【請求項1】 配列番号1記載のアミノ酸配列をコード
するコンドロイチナーゼ遺伝子。 - 【請求項2】 配列番号2記載のアミノ酸配列をコード
するコンドロイチナーゼ遺伝子。 - 【請求項3】 配列番号3記載の塩基配列を有するコン
ドロイチナーゼ遺伝子。 - 【請求項4】 配列番号4記載の塩基配列を有するコン
ドロイチナーゼ遺伝子。 - 【請求項5】 請求項1乃至請求項4のいずれかの項に
記載されたコンドロイチナーゼ遺伝子を組み込んだ組み
換えDNA。 - 【請求項6】 請求項5記載の組み換えDNAで形質転
換したことを特徴とする形質転換体。 - 【請求項7】 請求項6に記載した形質転換体を培養
し、当該培養物からコンドロイチナーゼを採取すること
を特徴とするコンドロイチナーゼの製造方法。 - 【請求項8】 配列番号1記載のアミノ酸配列を有する
コンドロイチナーゼ。 - 【請求項9】 配列番号2記載のアミノ酸配列を有する
コンドロイチナーゼ。
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP03581093A JP3419811B2 (ja) | 1993-02-24 | 1993-02-24 | コンドロイチナーゼ遺伝子 |
DE69434206T DE69434206T2 (de) | 1993-02-24 | 1994-02-23 | Gen für Chondroitinase ABC und dessen Verwendungen |
EP94250046A EP0613949B1 (en) | 1993-02-24 | 1994-02-23 | Gene encoding chondroitinase ABC and uses therefor |
US08/488,960 US7008783B1 (en) | 1992-09-22 | 1995-06-07 | Gene encoding chondroitinase ABC and uses therefor |
US11/313,169 US20060154337A1 (en) | 1993-02-24 | 2005-12-20 | Gene encoding chondroitinase ABC and uses therefor |
US12/613,119 USRE43166E1 (en) | 1992-09-22 | 2009-11-05 | Gene encoding chondroitinase ABC and uses therefor |
US12/712,960 US20110027860A1 (en) | 1993-02-24 | 2010-02-25 | Gene encoding chondroitinase abc and uses therefor |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP03581093A JP3419811B2 (ja) | 1993-02-24 | 1993-02-24 | コンドロイチナーゼ遺伝子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06245774A true JPH06245774A (ja) | 1994-09-06 |
JP3419811B2 JP3419811B2 (ja) | 2003-06-23 |
Family
ID=12452291
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP03581093A Expired - Lifetime JP3419811B2 (ja) | 1992-09-22 | 1993-02-24 | コンドロイチナーゼ遺伝子 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20060154337A1 (ja) |
EP (1) | EP0613949B1 (ja) |
JP (1) | JP3419811B2 (ja) |
DE (1) | DE69434206T2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100804584B1 (ko) * | 2005-03-17 | 2008-02-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 글리코자미노글리칸 분해효소들의 정제방법 |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU697156B2 (en) * | 1993-04-23 | 1998-10-01 | American Cyanamid Company | Cloning and expression of the chondroitinase I and II genes from (p. vulgaris) |
US5525500A (en) * | 1994-04-22 | 1996-06-11 | American Cyanamid Company | Chromatographic process for the copurification of chondroitinase I and II proteins from Proteus vulgaris |
US5741692A (en) * | 1994-04-22 | 1998-04-21 | American Cyanamid Company | Protein vulgaris chondroitinase II |
US5498536A (en) * | 1994-04-22 | 1996-03-12 | American Cyanamid Company | Chondroitinase II from Proteus vulgaris |
US5888798A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-30 | American Cyanamid Company | Chondroitinase I and chondroitinase II producing mutants of P. vulgaris |
AU6033496A (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-30 | American Cyanamid Company | Chondroitinase production in recombinant proteus vulgaris st rains |
US6200564B1 (en) | 1997-04-11 | 2001-03-13 | J. Thomas Lamont | Pharmaceutical compositions containing chondroitinase and uses therefor |
US6063378A (en) * | 1997-08-22 | 2000-05-16 | Seikagaku Corporation | Therapeutic agent for herniated intervertebral disc |
EP1425390B1 (en) | 2001-08-13 | 2012-02-01 | University of Florida Research Foundation, Inc. | Materials and methods to promote repair of nerve tissue |
EP1532241B1 (en) | 2002-06-03 | 2010-09-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Rationally designed polysaccharide lyases derived from chondroitinase b |
CA2558984A1 (en) | 2004-03-10 | 2005-09-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Recombinant chondroitinase abc i and uses thereof |
GB0712302D0 (en) * | 2007-06-22 | 2007-08-01 | Cambridge Entpr Ltd | Chrondroitinase polypeptides |
US20090286289A1 (en) * | 2008-03-10 | 2009-11-19 | Pang Danny Z | Production of Hyaluronate Unsaturated Disaccharides and its Application |
CN103103173B (zh) * | 2011-11-11 | 2015-02-25 | 清华大学 | 硫酸软骨素酶b融合蛋白、其编码基因以及其构建方法 |
WO2015048523A2 (en) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Ohio State Innovation Foundation | Mutant chondroitinase abc i compositions and methods of their use |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4696816A (en) * | 1985-11-07 | 1987-09-29 | Brown Mark D | Method for treating intervertebral disc displacement with enzymes |
JP2726275B2 (ja) * | 1988-08-24 | 1998-03-11 | 生化学工業株式会社 | グリコサミノグリカン分解酵素の精製法 |
ZA912770B (en) * | 1990-04-16 | 1992-01-29 | Bethesda Eye Inst | Enzymatic disinsertion of vitreous body |
US5496718A (en) * | 1992-06-26 | 1996-03-05 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Chondroitinase ABC isolated from proteus vulgaris ATCC 6896 |
-
1993
- 1993-02-24 JP JP03581093A patent/JP3419811B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-02-23 DE DE69434206T patent/DE69434206T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-02-23 EP EP94250046A patent/EP0613949B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-12-20 US US11/313,169 patent/US20060154337A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-02-25 US US12/712,960 patent/US20110027860A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100804584B1 (ko) * | 2005-03-17 | 2008-02-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 글리코자미노글리칸 분해효소들의 정제방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20060154337A1 (en) | 2006-07-13 |
DE69434206T2 (de) | 2005-12-08 |
JP3419811B2 (ja) | 2003-06-23 |
EP0613949A2 (en) | 1994-09-07 |
EP0613949A3 (en) | 1994-09-28 |
EP0613949B1 (en) | 2004-12-29 |
US20110027860A1 (en) | 2011-02-03 |
DE69434206D1 (de) | 2005-02-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3419811B2 (ja) | コンドロイチナーゼ遺伝子 | |
JPH11243977A (ja) | 1,3−β−グルカンシンターゼのエキノカンジン結合領域 | |
EP0877084B1 (en) | Thermostable diaphorase gene | |
WO1996040882A1 (en) | Artificial restriction endonuclease | |
JPH0698769A (ja) | コンドロイチナーゼ及びその遺伝子 | |
JP4052605B2 (ja) | α−1,3/4−フコシダーゼ遺伝子 | |
JPH05115281A (ja) | 新規なザルコシン・オキシダーゼm、その遺伝子、新規な組み換え体dna及びザルコシン・オキシダーゼmの製造法 | |
EP0726313B1 (en) | DNA coding for mammalian L-asparaginase | |
JP2729045B2 (ja) | サルコシンオキシダーゼおよびその製造法 | |
JPH05304964A (ja) | Dnaポリメラーゼ遺伝子 | |
JP3829950B2 (ja) | 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ | |
JPH0889255A (ja) | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子、新規な組み換え体dna及びクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法 | |
JP3197355B2 (ja) | アスパラギニルエンドペプチダーゼ遺伝子 | |
JP2593481B2 (ja) | サルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するdnaおよびその用途 | |
JP2533700B2 (ja) | 配列特異的rna加水分解酵素 | |
JP3173619B2 (ja) | ピログルタミルアミノペプチダーゼの製造法 | |
JP3018092B2 (ja) | 放線菌由来のサルコシンオキシダーゼの遺伝子およびその用途 | |
JP2001502180A (ja) | Streptococcus pneumoniae由来の新規ペニシリン結合タンパク質 | |
JP2003274952A (ja) | 新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素、それをコードする遺伝子、ならびに該酵素の製造方法 | |
JPH07327684A (ja) | Dnaポリメラーゼ遺伝子 | |
JP4066203B2 (ja) | 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ | |
JP2000245471A (ja) | ギ酸脱水素酵素遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いたギ酸脱水素酵素の製造方法 | |
JPH0638769A (ja) | プロリンイミノペプチダーゼの遺伝情報を有するdna断片およびその用途 | |
JPH1189574A (ja) | β−N−アセチルガラクトサミニダーゼ遺伝子 | |
JPH07298887A (ja) | 酵素をコードするdnaとそれを含む組換えdna並びに形質転換体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090418 Year of fee payment: 6 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090418 Year of fee payment: 6 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090418 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120418 Year of fee payment: 9 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130418 Year of fee payment: 10 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |