JP2533700B2 - 配列特異的rna加水分解酵素 - Google Patents
配列特異的rna加水分解酵素Info
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- JP2533700B2 JP2533700B2 JP3158313A JP15831391A JP2533700B2 JP 2533700 B2 JP2533700 B2 JP 2533700B2 JP 3158313 A JP3158313 A JP 3158313A JP 15831391 A JP15831391 A JP 15831391A JP 2533700 B2 JP2533700 B2 JP 2533700B2
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- Japan
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- ribonuclease
- escherichia coli
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、リボヌクレアーゼHと
オリゴデオキシリボヌクレオチドとが共有結合したハイ
ブリッドリボヌクレアーゼHに関する。更に本発明は、
該ハイブリッドリボヌクレアーゼHを製造するのに有用
な変異型リボヌクレアーゼH、該変異型リボヌクレアー
ゼHをコードするDNA、該DNAを含有する発現ベク
ター、および該発現ベクターで形質転換された宿主細胞
に関する。
オリゴデオキシリボヌクレオチドとが共有結合したハイ
ブリッドリボヌクレアーゼHに関する。更に本発明は、
該ハイブリッドリボヌクレアーゼHを製造するのに有用
な変異型リボヌクレアーゼH、該変異型リボヌクレアー
ゼHをコードするDNA、該DNAを含有する発現ベク
ター、および該発現ベクターで形質転換された宿主細胞
に関する。
【0002】
【従来の技術】RNAを、in vitroに於いて配列特異
的に切断することは、RNAの一次構造を決定したり、
RNAを切り貼りする上で極めて重要である。しかしな
がら、現在その目的を達成するための手段としては、イ
ノウエら(Inoue,H.)(フェブスターズ、215、32
7−330[1987])及びシバハラら(Shibahara,
S.)(ヌクレイック アシド リサーチ、15、440
3−4415[1987])によって開発された方法が存
在するに過ぎない。この方法はリボヌクレアーゼHが、
DNA/RNAハイブリッドのRNA鎖のみを特異的に
加水分解するという性質を利用して、まず、2'−O−
メチルリボヌクレオチドを含むキメラオリゴヌクレオチ
ドとRNAとのハイブリッドを作り、ついで大腸菌リボ
ヌクレアーゼHを作用させることにより、ハイブリッド
が形成された領域でRNAを切断するというものであ
る。しかし、この方法に於いては、RNAを効率よく切
断するには、その1.5当量以上のキメラオリゴヌクレ
オチドが必要であり、キメラオリゴヌクレオチドを合成
するための試薬は大変高価であるので、かねてよりコス
ト上の問題が指摘されていた。さらに、リボヌクレアー
ゼHを作用させる前にハイブリッド形成のためのアニー
リングをおこなわなければならないために、操作性にお
いても煩雑であり、その改良が望まれていた。
的に切断することは、RNAの一次構造を決定したり、
RNAを切り貼りする上で極めて重要である。しかしな
がら、現在その目的を達成するための手段としては、イ
ノウエら(Inoue,H.)(フェブスターズ、215、32
7−330[1987])及びシバハラら(Shibahara,
S.)(ヌクレイック アシド リサーチ、15、440
3−4415[1987])によって開発された方法が存
在するに過ぎない。この方法はリボヌクレアーゼHが、
DNA/RNAハイブリッドのRNA鎖のみを特異的に
加水分解するという性質を利用して、まず、2'−O−
メチルリボヌクレオチドを含むキメラオリゴヌクレオチ
ドとRNAとのハイブリッドを作り、ついで大腸菌リボ
ヌクレアーゼHを作用させることにより、ハイブリッド
が形成された領域でRNAを切断するというものであ
る。しかし、この方法に於いては、RNAを効率よく切
断するには、その1.5当量以上のキメラオリゴヌクレ
オチドが必要であり、キメラオリゴヌクレオチドを合成
するための試薬は大変高価であるので、かねてよりコス
ト上の問題が指摘されていた。さらに、リボヌクレアー
ゼHを作用させる前にハイブリッド形成のためのアニー
リングをおこなわなければならないために、操作性にお
いても煩雑であり、その改良が望まれていた。
【0003】一方、アンチセンスオリゴヌクレオチドが
動物細胞において特定の遺伝子発現を阻害するのは、メ
ッセンジャーRNA又はその前駆体が、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドとハイブリッドを形成する領域で、内
在性のリボヌクレアーゼH(RNA−DNAハイブリッ
ドのRNA鎖のみを切断する酵素)によって切断される
ためであることがミンシャル(Minshull,J.)とハント
(Hunt,T.)によって見出されて以来(ヌクレイック ア
シド リサーチ、14、6433−6451[198
6])、in vivoに於けるRNAの高選択的切断法の開発
は、著しく重視されるようになった。これは、かかる高
選択的切断法により、各種細胞の望ましくない形質の発
現を阻止することが可能となり、特に医薬および農業分
野での画期的な応用が期待されるからである。
動物細胞において特定の遺伝子発現を阻害するのは、メ
ッセンジャーRNA又はその前駆体が、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドとハイブリッドを形成する領域で、内
在性のリボヌクレアーゼH(RNA−DNAハイブリッ
ドのRNA鎖のみを切断する酵素)によって切断される
ためであることがミンシャル(Minshull,J.)とハント
(Hunt,T.)によって見出されて以来(ヌクレイック ア
シド リサーチ、14、6433−6451[198
6])、in vivoに於けるRNAの高選択的切断法の開発
は、著しく重視されるようになった。これは、かかる高
選択的切断法により、各種細胞の望ましくない形質の発
現を阻止することが可能となり、特に医薬および農業分
野での画期的な応用が期待されるからである。
【0004】しかしながら、上記のアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド自体を用いてin vivoに於ける蛋白合成を
阻害しようという試みは、標的となるメッセンジャーR
NA分子の切断効率が低いため、成功しなかった。切断
効率の低い理由は、主として、アンチセンスオリゴヌク
レオチドとメッセンジャーRNAがハイブリッドを形成
する細胞内区画に、リボヌクレアーゼHが十分量存在し
ない結果、リボヌクレアーゼHによりハイブリッドが認
識されて切断される前に、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドが細胞内ヌクレアーゼによって分解されてしまうた
めであると考えられている。そこでアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの細胞内安定性を向上させるために、ホス
フォトリエステル、ホスフォロアミダイト、ホスホロチ
オエイト、あるいはメチルホスフォネートのような修飾
リン酸エステル結合を有するオリゴヌクレオチドの合成
法がこれまで開発されてきた(総説:Miller,P.S.バ
イオテクノロジー、9、358−362[1991])。
しかし、これらのオリゴヌクレオチド誘導体は、確か
に、細胞内ヌクレアーゼによる分解を受けにくくなった
ものの、これらとハイブリッドしたRNAはRNaseH
による分解も同時に受けにくくなってしまうため、アン
チセンスとしての効率はそれほど改善されなかった。
ヌクレオチド自体を用いてin vivoに於ける蛋白合成を
阻害しようという試みは、標的となるメッセンジャーR
NA分子の切断効率が低いため、成功しなかった。切断
効率の低い理由は、主として、アンチセンスオリゴヌク
レオチドとメッセンジャーRNAがハイブリッドを形成
する細胞内区画に、リボヌクレアーゼHが十分量存在し
ない結果、リボヌクレアーゼHによりハイブリッドが認
識されて切断される前に、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドが細胞内ヌクレアーゼによって分解されてしまうた
めであると考えられている。そこでアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの細胞内安定性を向上させるために、ホス
フォトリエステル、ホスフォロアミダイト、ホスホロチ
オエイト、あるいはメチルホスフォネートのような修飾
リン酸エステル結合を有するオリゴヌクレオチドの合成
法がこれまで開発されてきた(総説:Miller,P.S.バ
イオテクノロジー、9、358−362[1991])。
しかし、これらのオリゴヌクレオチド誘導体は、確か
に、細胞内ヌクレアーゼによる分解を受けにくくなった
ものの、これらとハイブリッドしたRNAはRNaseH
による分解も同時に受けにくくなってしまうため、アン
チセンスとしての効率はそれほど改善されなかった。
【0005】一方、メッセンジャーRNAがこれらのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成す
る細胞内区画にリボヌクレアーゼHが十分量存在しない
ために、その切断効率が悪いという問題点を解決する方
法もこれまでいくつか報告されている。一つは、ツッカ
ーマン(Zuckermann,R.N.)とシュルツ(Schultz,
P.G.)により開発された方法で(プロシーディング
ナショナル サイエンスオブ アカデミー、86、17
66−1770[1989])、スタフィロコッカル ヌ
クレアーゼとオリゴデオキシリボヌクレオチド(22me
r)を共有結合により連結したハイブリッドヌクレアーゼ
を利用するものである。このハイブリッドヌクレアーゼ
においては、塩基配列認識をオリゴヌクレオチド部分
が、触媒活性をヌクレアーゼ部分が、それぞれ司ってい
る。しかし、このハイブリッドヌクレアーゼは、確かに
RNAを配列特異的に切断するものの、切断効率が悪く
(最大50%)、操作が煩雑であり、切断物が3'−リン
酸を形成するため再ライゲーションしにくく、酵素とし
てのターンオーバー(繰返し作用すること)がほとんどな
く、更に自己消化する等、多くの問題を抱えており、こ
れらの問題を解決することが強く望まれている。もう1
つは、チェック(Ceck,T.R.)により発見されたリボ
ザイムの利用である(マニュアル レビュー オブ バ
イオケミストリー、59、543[1990])。しか
し、リボザイムというRNA分子は、確かに別のRNA
分子を配列特異的に切断するものの、触媒活性が極めて
低いという致命的な欠点がある。
ンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成す
る細胞内区画にリボヌクレアーゼHが十分量存在しない
ために、その切断効率が悪いという問題点を解決する方
法もこれまでいくつか報告されている。一つは、ツッカ
ーマン(Zuckermann,R.N.)とシュルツ(Schultz,
P.G.)により開発された方法で(プロシーディング
ナショナル サイエンスオブ アカデミー、86、17
66−1770[1989])、スタフィロコッカル ヌ
クレアーゼとオリゴデオキシリボヌクレオチド(22me
r)を共有結合により連結したハイブリッドヌクレアーゼ
を利用するものである。このハイブリッドヌクレアーゼ
においては、塩基配列認識をオリゴヌクレオチド部分
が、触媒活性をヌクレアーゼ部分が、それぞれ司ってい
る。しかし、このハイブリッドヌクレアーゼは、確かに
RNAを配列特異的に切断するものの、切断効率が悪く
(最大50%)、操作が煩雑であり、切断物が3'−リン
酸を形成するため再ライゲーションしにくく、酵素とし
てのターンオーバー(繰返し作用すること)がほとんどな
く、更に自己消化する等、多くの問題を抱えており、こ
れらの問題を解決することが強く望まれている。もう1
つは、チェック(Ceck,T.R.)により発見されたリボ
ザイムの利用である(マニュアル レビュー オブ バ
イオケミストリー、59、543[1990])。しか
し、リボザイムというRNA分子は、確かに別のRNA
分子を配列特異的に切断するものの、触媒活性が極めて
低いという致命的な欠点がある。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、高選択性
と高触媒活性をあわせ持つ、配列特異的RNA加水分解
酵素の開発を目的として鋭意検討を重ねた結果、リボヌ
クレアーゼHの分子表面に存在し、酵素活性に直接関与
していないアミノ酸残基のいずれかをシステイン残基に
変換し、そのシステイン残基のチオール基を介してオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドと共有結合せしめることに
より得られるハイブリッドリボヌクレアーゼHが所期の
目的を達成し得るものであることを見い出し、本発明を
完成するに至った。
と高触媒活性をあわせ持つ、配列特異的RNA加水分解
酵素の開発を目的として鋭意検討を重ねた結果、リボヌ
クレアーゼHの分子表面に存在し、酵素活性に直接関与
していないアミノ酸残基のいずれかをシステイン残基に
変換し、そのシステイン残基のチオール基を介してオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドと共有結合せしめることに
より得られるハイブリッドリボヌクレアーゼHが所期の
目的を達成し得るものであることを見い出し、本発明を
完成するに至った。
【0007】従って本発明の第一の目的は、酵素活性に
影響を与えることなく分子表面に1個のシステイン残基
を有する様に改変された変異型リボヌクレアーゼHとオ
リゴデオキシリボヌクレオチドとが結合したハイブリッ
ドリボヌクレアーゼHであって、該システイン残基中の
チオール基がオリゴデオキシリボヌクレオチドとの共有
結合に関与していることを特徴とするハイブリッドリボ
ヌクレアーゼHを提供するものである。
影響を与えることなく分子表面に1個のシステイン残基
を有する様に改変された変異型リボヌクレアーゼHとオ
リゴデオキシリボヌクレオチドとが結合したハイブリッ
ドリボヌクレアーゼHであって、該システイン残基中の
チオール基がオリゴデオキシリボヌクレオチドとの共有
結合に関与していることを特徴とするハイブリッドリボ
ヌクレアーゼHを提供するものである。
【0008】本明細書に於いてリボヌクレアーゼHの分
子表面とは、水溶液中において、水分子と接触すること
のできる領域を意味する。後述する様に、本発明者ら
は、大腸菌リボヌクレアーゼHの分子表面に存在する1
31、135、138または142位のアミノ酸をシス
テイン残基に変換し、そのチオール基を介してこの酵素
をオリゴデオキシリボヌクレオチドと結合させたが、い
ずれの場合も酵素活性の低下はほとんど観察されなかっ
た。このことから明らかな様にシステイン残基に変換す
べきアミノ酸残基の位置は、上記のものに限定されるも
のではなく、リボヌクレアーゼHの分子表面に存在する
アミノ酸残基であって、酵素活性に直接関与していない
アミノ酸残基であればいかなるものであってもよい。ち
なみに、大腸菌リボヌクレアーゼHの活性中心は、10
位と70位のアスパラギン酸、および48位のグルタミ
ン酸で構成されており、三次構造上これらの残基の近傍
に位置する、124位のヒスチジン、16位、44位、
45位、130位のアスパラギン、43位のスレオニ
ン、72位のグルタミン等も触媒活性や基質結合に関与
することが知られている。
子表面とは、水溶液中において、水分子と接触すること
のできる領域を意味する。後述する様に、本発明者ら
は、大腸菌リボヌクレアーゼHの分子表面に存在する1
31、135、138または142位のアミノ酸をシス
テイン残基に変換し、そのチオール基を介してこの酵素
をオリゴデオキシリボヌクレオチドと結合させたが、い
ずれの場合も酵素活性の低下はほとんど観察されなかっ
た。このことから明らかな様にシステイン残基に変換す
べきアミノ酸残基の位置は、上記のものに限定されるも
のではなく、リボヌクレアーゼHの分子表面に存在する
アミノ酸残基であって、酵素活性に直接関与していない
アミノ酸残基であればいかなるものであってもよい。ち
なみに、大腸菌リボヌクレアーゼHの活性中心は、10
位と70位のアスパラギン酸、および48位のグルタミ
ン酸で構成されており、三次構造上これらの残基の近傍
に位置する、124位のヒスチジン、16位、44位、
45位、130位のアスパラギン、43位のスレオニ
ン、72位のグルタミン等も触媒活性や基質結合に関与
することが知られている。
【0009】変異型リボヌクレアーゼHとは、天然のリ
ボヌクレアーゼHの分子表面に存在するアミノ酸残基が
システイン残基に変換されたもの、およびこの変換に加
えて分子表面以外の場所に存在するシステイン残基が他
のアミノ酸残基に変換されたものをいう。尚、リボヌク
レアーゼHは大腸菌由来のものを使用するのが便利であ
るが、アミノ酸配列上大腸菌リボヌクレアーゼHとの相
同性が高く(30%以上)、大腸菌リボヌクレアーゼHと
類似の三次構造並びに活性中心を有する他の生物由来の
リボヌクレアーゼHも、天然型、変異型を問わずすべて
使用することができる。
ボヌクレアーゼHの分子表面に存在するアミノ酸残基が
システイン残基に変換されたもの、およびこの変換に加
えて分子表面以外の場所に存在するシステイン残基が他
のアミノ酸残基に変換されたものをいう。尚、リボヌク
レアーゼHは大腸菌由来のものを使用するのが便利であ
るが、アミノ酸配列上大腸菌リボヌクレアーゼHとの相
同性が高く(30%以上)、大腸菌リボヌクレアーゼHと
類似の三次構造並びに活性中心を有する他の生物由来の
リボヌクレアーゼHも、天然型、変異型を問わずすべて
使用することができる。
【0010】本発明で使用するオリゴデオキシリボヌク
レオチドは、リボヌクレアーゼHと結合させるために、
その5'末端が化学修飾されている。化学修飾は特定の
ものに限られないが、5'末端にスペーサーを結合さ
せ、そのスペーサーの先端にマレイミド基を有するもの
が都合がよい。末端にマレイミド基を有し、オリゴデオ
キシリボヌクレオチドの5'末端に結合させることがで
きるスペーサーの一例を下に挙げる。
レオチドは、リボヌクレアーゼHと結合させるために、
その5'末端が化学修飾されている。化学修飾は特定の
ものに限られないが、5'末端にスペーサーを結合さ
せ、そのスペーサーの先端にマレイミド基を有するもの
が都合がよい。末端にマレイミド基を有し、オリゴデオ
キシリボヌクレオチドの5'末端に結合させることがで
きるスペーサーの一例を下に挙げる。
【化1】 このスペーサーは、まずアミノモディファイヤーII(C
LONTECH社)をDNA合成機によりオリゴデオキ
シリボヌクレオチドの5'末端に付加した後、EMCS
(Dojindo Laboratory)と反応させることにより、オ
リゴデオキシリボヌクレオチドの5'末端に結合させる
ことができる。他のスペーサーの例としてはオリゴデオ
キシリボヌクレオチドの3'末端にチオール基を導入す
る方法がツッカーマン(Zuckerman,R.N.)とシュル
ツ(Schultz,P.G.)により報告されている(サイエ
ンス、238、1401〜1403(1987))。この
場合、生じる(ヌクレオチド)−(スペーサー)−(チ
オール基)の化学式は、
LONTECH社)をDNA合成機によりオリゴデオキ
シリボヌクレオチドの5'末端に付加した後、EMCS
(Dojindo Laboratory)と反応させることにより、オ
リゴデオキシリボヌクレオチドの5'末端に結合させる
ことができる。他のスペーサーの例としてはオリゴデオ
キシリボヌクレオチドの3'末端にチオール基を導入す
る方法がツッカーマン(Zuckerman,R.N.)とシュル
ツ(Schultz,P.G.)により報告されている(サイエ
ンス、238、1401〜1403(1987))。この
場合、生じる(ヌクレオチド)−(スペーサー)−(チ
オール基)の化学式は、
【化2】 となり、これをチオール基を有する酵素(Enz−SH)
と反応させることにより、
と反応させることにより、
【化3】 部分がS−Enz部分と置きかわり、結果的にオリゴヌク
レオチドがS−S結合を介して酵素に共有結合すること
になる。
レオチドがS−S結合を介して酵素に共有結合すること
になる。
【0011】オリゴデオキシリボヌクレオチドは、4量
体以上であること、および分解しようとするRNAの切
断部位のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
(30量体以下)を含んでいれば、いかなる長さおよび配
列のものであってもよい。しかし、10個前後のヌクレ
オチド数であることが好ましい。尚、オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドは、RNAとの相補的結合の特異性を増
強したり、細胞内での安定性を増すための修飾が加えら
れていてもよい。例えばDNAの一部を2’−O−メチ
ルRNAで置きかえたキメラヌクレオチドや、リン酸結
合をチオリン酸結合やリン酸トリエステル結合等で置き
かえたオリゴヌクレオチドも本発明のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドとして使用し得る。本明細書に於いて
は、この様な修飾を施されたものも、単にオリゴデオキ
シリボヌクレオチドと呼称する。
体以上であること、および分解しようとするRNAの切
断部位のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
(30量体以下)を含んでいれば、いかなる長さおよび配
列のものであってもよい。しかし、10個前後のヌクレ
オチド数であることが好ましい。尚、オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドは、RNAとの相補的結合の特異性を増
強したり、細胞内での安定性を増すための修飾が加えら
れていてもよい。例えばDNAの一部を2’−O−メチ
ルRNAで置きかえたキメラヌクレオチドや、リン酸結
合をチオリン酸結合やリン酸トリエステル結合等で置き
かえたオリゴヌクレオチドも本発明のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドとして使用し得る。本明細書に於いて
は、この様な修飾を施されたものも、単にオリゴデオキ
シリボヌクレオチドと呼称する。
【0012】本発明に係るハイブリッドリボヌクレアー
ゼHは、後述する方法で製造された変異型リボヌクレア
ーゼと、5'末端を化学修飾したオリゴデオキシリボヌ
クレオチドとを反応させ、その生成物を、例えば陽イオ
ン交換カラムを用いたHPLCで分離することにより調
製することができる。この様にして得られたハイブリッ
ドリボヌクレアーゼHは、塩基配列認識をオリゴデオキ
シリボヌクレオチド部分が、そして触媒活性を変異型リ
ボヌクレアーゼH部分がそれぞれ担当し、効率のよい酵
素活性を発揮する。
ゼHは、後述する方法で製造された変異型リボヌクレア
ーゼと、5'末端を化学修飾したオリゴデオキシリボヌ
クレオチドとを反応させ、その生成物を、例えば陽イオ
ン交換カラムを用いたHPLCで分離することにより調
製することができる。この様にして得られたハイブリッ
ドリボヌクレアーゼHは、塩基配列認識をオリゴデオキ
シリボヌクレオチド部分が、そして触媒活性を変異型リ
ボヌクレアーゼH部分がそれぞれ担当し、効率のよい酵
素活性を発揮する。
【0013】分子表面に1個のシステイン残基を有する
様に改変された変異型リボヌクレアーゼは、組換DNA
技術を使って常法により、例えば後記実施例に示した方
法により製造することができる。即ち、分子表面の1個
のアミノ酸残基がシステイン残基に変換されたリボヌク
レアーゼHをコードしているDNAをGene Amp Kit
(タカラ酒造)を用いてPCR法により調製する。PC
Rを用いた部位変異導入は、ヒグチ(R.Higuchi)の
方法で行った(PCR Protocols(Innis,M.A.et a
l.eds.),pp177,Academic Press Inc.(199
0))。この様にして得たDNAを例えばバクテリオフ
ァージλのPLおよびPR両プロモータを有する発現ベク
ターに挿入し、このベクターを大腸菌宿主に導入し、宿
主を培養することにより目的の変異型リボヌクレアーゼ
を製造することができる。変異型リボヌクレアーゼHを
コードしているDNA、該DNAを挿入した発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、および
生産される変異型リボヌクレアーゼHは全て新規であ
り、これらは全て本発明を構成する。従って、本発明の
別の目的は、大腸菌リボヌクレアーゼHの131、13
5、138、または142位のアミノ酸残基がシステイ
ン残基で置換されている変異型リボヌクレアーゼH、お
よび該変異型リボヌクレアーゼHをコードしているDN
A、該DNAを含有しており、該DNAを発現し得る発
現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形
質転換体を提供するものである。
様に改変された変異型リボヌクレアーゼは、組換DNA
技術を使って常法により、例えば後記実施例に示した方
法により製造することができる。即ち、分子表面の1個
のアミノ酸残基がシステイン残基に変換されたリボヌク
レアーゼHをコードしているDNAをGene Amp Kit
(タカラ酒造)を用いてPCR法により調製する。PC
Rを用いた部位変異導入は、ヒグチ(R.Higuchi)の
方法で行った(PCR Protocols(Innis,M.A.et a
l.eds.),pp177,Academic Press Inc.(199
0))。この様にして得たDNAを例えばバクテリオフ
ァージλのPLおよびPR両プロモータを有する発現ベク
ターに挿入し、このベクターを大腸菌宿主に導入し、宿
主を培養することにより目的の変異型リボヌクレアーゼ
を製造することができる。変異型リボヌクレアーゼHを
コードしているDNA、該DNAを挿入した発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、および
生産される変異型リボヌクレアーゼHは全て新規であ
り、これらは全て本発明を構成する。従って、本発明の
別の目的は、大腸菌リボヌクレアーゼHの131、13
5、138、または142位のアミノ酸残基がシステイ
ン残基で置換されている変異型リボヌクレアーゼH、お
よび該変異型リボヌクレアーゼHをコードしているDN
A、該DNAを含有しており、該DNAを発現し得る発
現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形
質転換体を提供するものである。
【0014】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0015】実施例 (1) pJAL131C、pJAL135C、pJAL
138C、pJAL142Cの作製 大腸菌リボヌクレアーゼH(以下リボヌクレアーゼHと
略す)にDNA鎖を導入する方法として、マレイミド体
による化学修飾を利用することとした。まず、リボヌク
レアーゼHの活性中心(Asp10、Glu48、Asp70)
から比較的近く、残基が外側を向いているグルタミン酸
131、グルタミン酸135、アルギニン138、メチ
オニン142を選び、それぞれをシステインに変換する
こととした。また、この変換には他のシステインへの化
学修飾をさけるため、天然型リボヌクレアーゼHの3つ
の遊離のシステイン(13、63、133位)を、それぞ
れアラニンに変換したシステイン不含の変異型リボヌク
レアーゼHの構造遺伝子を含有しているプラスミドpC
A600(金谷ら、バイオケミカルジャーナル、27
1、59−66、1990年)を鋳型として、PCR法
を用いて行った。PCR用プライマーとして、図1に示
すように、5'−プライマー、3'−プライマー及び変異
用プライマーを合成した。グルタミン酸135からシス
テインへの変換(図2参照)は、SphIサイトを含む5'
−プライマーと、プライマーNO.2、SalIを含む
3'−プライマーとプライマーNO.1をそれぞれプラ
スミドpCA600と混合し、市販のGene Amp Kit
(タカラ酒造)の説明書に従ってDNAの増幅を行った。
これにより、SphI−XhoIで規定される400bp、X
hoI−SalIで規定される100bpのDNA鎖が得られ
た。これらの末端には、それぞれクランプが残っている
ので、SphI−XhoI断片及びXhoI−SalI断片を得
るため、それぞれの増幅させたDNA断片にSphI、X
hoI及びXhoI、SalIを添加し、37℃で1時間消化
した。このそれぞれの消化物を1.5%アガロースゲル
電気泳動にかけて、400bpのSphI−XhoI断片及び
100bpのXhoI−SalI断片を切り出し抽出した。一
方、プラスミドpJLA504(***:Medac社より購入)
についても、SphI及びSalIを添加して37℃、1時
間消化した後、0.7%アガロースゲル電気泳動にか
け、4.9kbのSphI−SalI断片を切り出し抽出し
た。以上のようにして得られた400bpSphI−XhoI
0.1μg、100bpXhoI−SalI断片0.05μg及
び4.9kbSphI−SalI断片0.1μgを混合し、D
NAライゲーションキット(宝酒造)を用いて、添付の説
明書に正確に従って、プラスミドを環化した。この環化
したプラスミドで大腸菌HB101を形質転換し、形質
転換体pJAL135Cを得た。また、pJAL142C
についても上記と同様に行い、pJAL131C、13
8Cに関しては、XhoIのかわりにSstIを用いて同様
に行った。このようにして得たプラスミドの詳細な制限
酵素切断地図を図3および図4に示した(pJAL131
C(図3)、pJAL135C(図4)、pJAL138C
(図3)、pJAL142C(図4)それぞれ参照)。形質転
換体エシェリシア.コリ(E.coli)HB101/pJA
L131C、pJAL135C、pJAL138C、pJ
AL142Cは工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。 エシェリシア.コリ(E.coli)HB101/pJAL1
31C; 受託番号:微工研菌寄第12312号,受託日:平成3
年6月17日 エシェリシア.コリ(E.coli)HB101/pJAL1
35C; 受託番号:微工研菌寄第12313号,受託日:平成3
年6月17日 エシェリシア.コリ(E.coli)HB101/pJAL1
38C; 受託番号:微工研菌寄第12314号,受託日:平成3
年6月17日 エシェリシア.コリ(E.coli)HB101/pJAL1
42C; 受託番号:微工研菌寄第12315号,受託日:平成3
年6月17日
138C、pJAL142Cの作製 大腸菌リボヌクレアーゼH(以下リボヌクレアーゼHと
略す)にDNA鎖を導入する方法として、マレイミド体
による化学修飾を利用することとした。まず、リボヌク
レアーゼHの活性中心(Asp10、Glu48、Asp70)
から比較的近く、残基が外側を向いているグルタミン酸
131、グルタミン酸135、アルギニン138、メチ
オニン142を選び、それぞれをシステインに変換する
こととした。また、この変換には他のシステインへの化
学修飾をさけるため、天然型リボヌクレアーゼHの3つ
の遊離のシステイン(13、63、133位)を、それぞ
れアラニンに変換したシステイン不含の変異型リボヌク
レアーゼHの構造遺伝子を含有しているプラスミドpC
A600(金谷ら、バイオケミカルジャーナル、27
1、59−66、1990年)を鋳型として、PCR法
を用いて行った。PCR用プライマーとして、図1に示
すように、5'−プライマー、3'−プライマー及び変異
用プライマーを合成した。グルタミン酸135からシス
テインへの変換(図2参照)は、SphIサイトを含む5'
−プライマーと、プライマーNO.2、SalIを含む
3'−プライマーとプライマーNO.1をそれぞれプラ
スミドpCA600と混合し、市販のGene Amp Kit
(タカラ酒造)の説明書に従ってDNAの増幅を行った。
これにより、SphI−XhoIで規定される400bp、X
hoI−SalIで規定される100bpのDNA鎖が得られ
た。これらの末端には、それぞれクランプが残っている
ので、SphI−XhoI断片及びXhoI−SalI断片を得
るため、それぞれの増幅させたDNA断片にSphI、X
hoI及びXhoI、SalIを添加し、37℃で1時間消化
した。このそれぞれの消化物を1.5%アガロースゲル
電気泳動にかけて、400bpのSphI−XhoI断片及び
100bpのXhoI−SalI断片を切り出し抽出した。一
方、プラスミドpJLA504(***:Medac社より購入)
についても、SphI及びSalIを添加して37℃、1時
間消化した後、0.7%アガロースゲル電気泳動にか
け、4.9kbのSphI−SalI断片を切り出し抽出し
た。以上のようにして得られた400bpSphI−XhoI
0.1μg、100bpXhoI−SalI断片0.05μg及
び4.9kbSphI−SalI断片0.1μgを混合し、D
NAライゲーションキット(宝酒造)を用いて、添付の説
明書に正確に従って、プラスミドを環化した。この環化
したプラスミドで大腸菌HB101を形質転換し、形質
転換体pJAL135Cを得た。また、pJAL142C
についても上記と同様に行い、pJAL131C、13
8Cに関しては、XhoIのかわりにSstIを用いて同様
に行った。このようにして得たプラスミドの詳細な制限
酵素切断地図を図3および図4に示した(pJAL131
C(図3)、pJAL135C(図4)、pJAL138C
(図3)、pJAL142C(図4)それぞれ参照)。形質転
換体エシェリシア.コリ(E.coli)HB101/pJA
L131C、pJAL135C、pJAL138C、pJ
AL142Cは工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。 エシェリシア.コリ(E.coli)HB101/pJAL1
31C; 受託番号:微工研菌寄第12312号,受託日:平成3
年6月17日 エシェリシア.コリ(E.coli)HB101/pJAL1
35C; 受託番号:微工研菌寄第12313号,受託日:平成3
年6月17日 エシェリシア.コリ(E.coli)HB101/pJAL1
38C; 受託番号:微工研菌寄第12314号,受託日:平成3
年6月17日 エシェリシア.コリ(E.coli)HB101/pJAL1
42C; 受託番号:微工研菌寄第12315号,受託日:平成3
年6月17日
【0016】(2) 形質転換体の培養とリボヌクレアー
ゼH含有菌体の調製 (1)に記載のプラスミドpJAL131C、135C、
138C、142Cで形質転換した大腸菌K−12株H
B101を、80μg/lのアンピシリンを含むLB培
地中、30℃で振盪培養した。培養液の濁度がクレット
値で100前後まで生育した時点で培養温度を42℃に
上げ、更に4時間振盪を続けた後、集菌した。得られた
菌体を−20℃で凍結保存した。
ゼH含有菌体の調製 (1)に記載のプラスミドpJAL131C、135C、
138C、142Cで形質転換した大腸菌K−12株H
B101を、80μg/lのアンピシリンを含むLB培
地中、30℃で振盪培養した。培養液の濁度がクレット
値で100前後まで生育した時点で培養温度を42℃に
上げ、更に4時間振盪を続けた後、集菌した。得られた
菌体を−20℃で凍結保存した。
【0017】(3) 形質転換体からのリボヌクレアーゼ
Hの抽出及び精製 上記(2)で得た200mlの培養液から集めたHB101
/pJAL131C及びpJAL135C、pJAL13
8C、pJAL142Cそれぞれの菌体1.0gを、1m
M EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液(TE)(p
H7.5)30mlに懸濁した後、氷中で超音波処理によ
り菌体を破砕した。15,000rpmで30分間、4℃で
遠心して得た遠心上清(粗抽出液)を、TE(pH7.5)
5lに対して4℃で透析した。同緩衝液で平衡化したD
E−52カラム(4ml)およびP−11カラム(2ml)にこ
の順序で通した。この条件下、C131、C135、C
138、C142いずれの変異型リボヌクレアーゼH
も、DE−52カラムを素通りし、P−11カラムに吸
着する。TE(pH7.5)4ml、次いで0.1M NaC
lを含むTE(pH7.5)4mlを流した後、NaCl濃度を
0.5Mまで直線的に上昇させることによりP−11カ
ラムから各変異型リボヌクレアーゼHを溶出させた。こ
れらの変異型リボヌクレアーゼHを含むP−11溶出画
分それぞれを約2mlに濃縮した後、さらに0.1MNa
Clを含む10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)で
平衡化したセファクリルS−300(スーパーファイン)
カラム(φ1.6×90cm)にかけることにより、各変異
型リボヌクレアーゼHを精製した。精製標品は15%S
DS−PAGEで単一バンドを与え、逆相HPLCでも
単一ピークを示した。精製収量は約30mg/l培養液で
あった。精製標品の同定は、アクロモバクタープロテア
ーゼIにより消化して得られるペプチドフラグメントを
逆相HPLCでマッピングして各フラグメントピークの
溶出位置を確認するとともに、131、135、13
8、142位のアミノ酸を含むそれぞれのペプチドを、
分取後N末端アミノ酸配列分析により行った。
Hの抽出及び精製 上記(2)で得た200mlの培養液から集めたHB101
/pJAL131C及びpJAL135C、pJAL13
8C、pJAL142Cそれぞれの菌体1.0gを、1m
M EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液(TE)(p
H7.5)30mlに懸濁した後、氷中で超音波処理によ
り菌体を破砕した。15,000rpmで30分間、4℃で
遠心して得た遠心上清(粗抽出液)を、TE(pH7.5)
5lに対して4℃で透析した。同緩衝液で平衡化したD
E−52カラム(4ml)およびP−11カラム(2ml)にこ
の順序で通した。この条件下、C131、C135、C
138、C142いずれの変異型リボヌクレアーゼH
も、DE−52カラムを素通りし、P−11カラムに吸
着する。TE(pH7.5)4ml、次いで0.1M NaC
lを含むTE(pH7.5)4mlを流した後、NaCl濃度を
0.5Mまで直線的に上昇させることによりP−11カ
ラムから各変異型リボヌクレアーゼHを溶出させた。こ
れらの変異型リボヌクレアーゼHを含むP−11溶出画
分それぞれを約2mlに濃縮した後、さらに0.1MNa
Clを含む10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)で
平衡化したセファクリルS−300(スーパーファイン)
カラム(φ1.6×90cm)にかけることにより、各変異
型リボヌクレアーゼHを精製した。精製標品は15%S
DS−PAGEで単一バンドを与え、逆相HPLCでも
単一ピークを示した。精製収量は約30mg/l培養液で
あった。精製標品の同定は、アクロモバクタープロテア
ーゼIにより消化して得られるペプチドフラグメントを
逆相HPLCでマッピングして各フラグメントピークの
溶出位置を確認するとともに、131、135、13
8、142位のアミノ酸を含むそれぞれのペプチドを、
分取後N末端アミノ酸配列分析により行った。
【0018】(4) 5'末端にマレイミド基を有するノ
ナデオキシリボヌクレオチドNEM−d9mer)の合成 上記(3)で示した変異型リボヌクレアーゼH(C13
1、C135、C138又はC142)にDNA鎖を導
入するために、SH基との反応性に富むマレイミド基を
持つノナデオキシリボヌクレオチド誘導体を合成した。
反応式を「化4」に示す。
ナデオキシリボヌクレオチドNEM−d9mer)の合成 上記(3)で示した変異型リボヌクレアーゼH(C13
1、C135、C138又はC142)にDNA鎖を導
入するために、SH基との反応性に富むマレイミド基を
持つノナデオキシリボヌクレオチド誘導体を合成した。
反応式を「化4」に示す。
【化4】 まず、5'−GTCATCTCC−3'の配列の9量体の
DNAをDNA合成機(Applied Biosystems 380
A)でマニュアルどおりに合成し、その最終段階でアミ
ノモディファイヤーII(CLONTECH社、N−フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル−O'−ジメトキシ
トリチル−O2−シアノエチルジイソプロピルアミノ−
フォスフィニル−3−アミノ−1,2−プロパンジオー
ル)20μmolを添加してマレイミド基導入に必要なアミ
ノ基を付加させた。次にこの反応物をアンモニア水で担
体から切り離し、50℃、6時間放置して脱保護し、そ
の後逆相HPLCで単離し、80%酢酸2mlで20分間
処理し、ジメトキシトリチル基を脱離させた。このよう
にして完全に脱保護された生成物は逆相HPLCとイオ
ン交換カラムクロマトグラフィーで精製した。以下の反
応の反応式は「化4」に示したが、この反応生成物(「化
4」の(1)、参照)にマレイミド基を導入するため、EM
CS(Dojndo Laboratories,N−(ε−マレイミドカ
プロイルオキシ)スクシンイミド)を、0.1M炭酸ナト
リウム、2mM EDTA(pH7.5)を含むDMF中で
1時間反応させた。その後セファデックスG−50のゲ
ルろ過にかけて精製し、このノナデオキシリボヌクレオ
チド誘導体(「化4」の(2)参照)が逆相HPLCで単一で
あることを確認した。本化合物の収量は2.4OD単位
であった。
DNAをDNA合成機(Applied Biosystems 380
A)でマニュアルどおりに合成し、その最終段階でアミ
ノモディファイヤーII(CLONTECH社、N−フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル−O'−ジメトキシ
トリチル−O2−シアノエチルジイソプロピルアミノ−
フォスフィニル−3−アミノ−1,2−プロパンジオー
ル)20μmolを添加してマレイミド基導入に必要なアミ
ノ基を付加させた。次にこの反応物をアンモニア水で担
体から切り離し、50℃、6時間放置して脱保護し、そ
の後逆相HPLCで単離し、80%酢酸2mlで20分間
処理し、ジメトキシトリチル基を脱離させた。このよう
にして完全に脱保護された生成物は逆相HPLCとイオ
ン交換カラムクロマトグラフィーで精製した。以下の反
応の反応式は「化4」に示したが、この反応生成物(「化
4」の(1)、参照)にマレイミド基を導入するため、EM
CS(Dojndo Laboratories,N−(ε−マレイミドカ
プロイルオキシ)スクシンイミド)を、0.1M炭酸ナト
リウム、2mM EDTA(pH7.5)を含むDMF中で
1時間反応させた。その後セファデックスG−50のゲ
ルろ過にかけて精製し、このノナデオキシリボヌクレオ
チド誘導体(「化4」の(2)参照)が逆相HPLCで単一で
あることを確認した。本化合物の収量は2.4OD単位
であった。
【0019】(5) リボヌクレアーゼHへのDNA鎖の
導入 (3)で得られたシステイン残基を1つ持つ変異型リボヌ
クレアーゼHと(4)に示したノナデオキシリボヌクレオ
チド誘導体(NEM−d9)を、チオール基とマレイミド
基間で連結させるために、0.1Mトリス塩酸緩衝液(p
H7.0)中、リボヌクレアーゼH(5.4nmol)とN
EM−d9(27nmol)(モル比1:5)を、室温で1時間
反応させる。反応式は「化5」に示した。
導入 (3)で得られたシステイン残基を1つ持つ変異型リボヌ
クレアーゼHと(4)に示したノナデオキシリボヌクレオ
チド誘導体(NEM−d9)を、チオール基とマレイミド
基間で連結させるために、0.1Mトリス塩酸緩衝液(p
H7.0)中、リボヌクレアーゼH(5.4nmol)とN
EM−d9(27nmol)(モル比1:5)を、室温で1時間
反応させる。反応式は「化5」に示した。
【化5】 この反応溶液を陽イオン交換カラムES−502C(ア
サヒカセイ)にアプライしピークを分取した。図5は陽
イオン交換カラムでの溶出パターンを示しているが、A
はNEM−d9,1μg、Bは変異リボヌクレアーゼH
(C135)5μg、CはNEM−d9−,1μgとC13
5,5μgを含む反応溶液100μlをHPLCにアプラ
イしたパターンである。Cで得られたピークを15%S
DS−PAGEで分析したところ、図6のレーン4に示
すように分子量21000の位置に単一なバンドが見ら
れた。この核酸誘導体が導入されたリボヌクレアーゼH
(C135)をd9−C135と名づけた。本酵素の模式
図を図7に示す。d9−C135による基質の認識及び
その分解のモデルを図8に示したが、d9−C135に
おいて核酸部分がRNAの配列認識を、酵素部分が触媒
反応をそれぞれ司る。他の変異リボヌクレアーゼH(C
131又はC138)に関しても同様の方法でd9−C1
31、d9−C138を得た。d9−C138は未精製で
ある。
サヒカセイ)にアプライしピークを分取した。図5は陽
イオン交換カラムでの溶出パターンを示しているが、A
はNEM−d9,1μg、Bは変異リボヌクレアーゼH
(C135)5μg、CはNEM−d9−,1μgとC13
5,5μgを含む反応溶液100μlをHPLCにアプラ
イしたパターンである。Cで得られたピークを15%S
DS−PAGEで分析したところ、図6のレーン4に示
すように分子量21000の位置に単一なバンドが見ら
れた。この核酸誘導体が導入されたリボヌクレアーゼH
(C135)をd9−C135と名づけた。本酵素の模式
図を図7に示す。d9−C135による基質の認識及び
その分解のモデルを図8に示したが、d9−C135に
おいて核酸部分がRNAの配列認識を、酵素部分が触媒
反応をそれぞれ司る。他の変異リボヌクレアーゼH(C
131又はC138)に関しても同様の方法でd9−C1
31、d9−C138を得た。d9−C138は未精製で
ある。
【0020】(6) 各変異リボヌクレアーゼHの酵素活
性の比較 活性はトリチウム標識したM13DNA/RNAハイブ
リッドを基質として用い、37℃、1分間に1μmolの
酸可溶性画分を生じる酵素量を1単位と定義した。タン
パク量は変異リボヌクレアーゼHと天然型リボヌクレア
ーゼHとが、同じ吸光係数を持つという仮定のもとにA
0.1%280=2を用いて280nmにおける吸光度を測
定することにより求めた。またノナデオキシリボヌクレ
オチドを導入した変異リボヌクレアーゼHについては、
核酸とタンパク質が1対1で結合したときの吸光係数を
計算により求めたところ、280nmにおける分子吸光係
数が8.7×104となったので、これを用いて280nm
における吸光度より求めて表1に示した。表1には参考
として、各変異リボヌクレアーゼHのNEMで修飾した
時の活性も付記した。
性の比較 活性はトリチウム標識したM13DNA/RNAハイブ
リッドを基質として用い、37℃、1分間に1μmolの
酸可溶性画分を生じる酵素量を1単位と定義した。タン
パク量は変異リボヌクレアーゼHと天然型リボヌクレア
ーゼHとが、同じ吸光係数を持つという仮定のもとにA
0.1%280=2を用いて280nmにおける吸光度を測
定することにより求めた。またノナデオキシリボヌクレ
オチドを導入した変異リボヌクレアーゼHについては、
核酸とタンパク質が1対1で結合したときの吸光係数を
計算により求めたところ、280nmにおける分子吸光係
数が8.7×104となったので、これを用いて280nm
における吸光度より求めて表1に示した。表1には参考
として、各変異リボヌクレアーゼHのNEMで修飾した
時の活性も付記した。
【表1】 比活性(U/mg) 酵素名 非修飾 (%) 修 飾 NEM (%) NEM−d9(%) 天然型 35.9(100) <0.03 − − − C131 23.2( 64) 7.7 (33) 0.1 (0.43) C135 36.5(100) 16.9 (72.8) 0.78(2.1) C138 8.6( 24) 2.4 (27.9) − C142 34.2( 95) 12.7 (37.1) 0.11(0.32) − 未定
【0021】それぞれの酵素は、天然型に対して約25
%〜100%の活性を保持しており、NEM修飾時にも
約30%〜70%の活性をそれぞれの未修飾酵素に対し
て保持していた。またNEM−d9で修飾した時には未
修飾時に対して数%に活性は低下していた。この場合、
DNA/RNAハイブリッドを基質として用いているの
で、NEM−d9で修飾した酵素においてはオリゴヌク
レオチド部分が酵素活性を阻害していると考えられた。
%〜100%の活性を保持しており、NEM修飾時にも
約30%〜70%の活性をそれぞれの未修飾酵素に対し
て保持していた。またNEM−d9で修飾した時には未
修飾時に対して数%に活性は低下していた。この場合、
DNA/RNAハイブリッドを基質として用いているの
で、NEM−d9で修飾した酵素においてはオリゴヌク
レオチド部分が酵素活性を阻害していると考えられた。
【0022】(7) 相補的RNA鎖の切断様式 本発明におけるハイブリッド酵素の機能を調べるために
相補的なRNA鎖、ノナリボヌクレオチド(5'−GGA
GAUGAC−3')の加水分解反応を行った。方法とし
ては金谷らによりすでに特許出願している方法(特願平
01−320231)に従った。基質としては、ノナデ
オキシリボヌクレオチド(5'−GUCATCTCC−
3')と上記ノナリボヌクレオチドのノナヌクレオチドデ
ュープレックス及びノナリボヌクレオチドを用いた。ノ
ナヌクレオチドデュープレックスとノナリボヌクレオチ
ドそれぞれの溶液9μlに酵素溶液1μlを加えて30℃
で1.5時間保温し、90℃2分間処理することにより
反応を停止した。その後反応溶液2μlを7M尿素入り
20%ポリアクリルアミドゲルにアプライし、約2時間
泳動した。ゲル上の放射能はイメージングプレートを利
用し、Fujix BA100バイオイメージングアナライ
ザーにより分析した。電気泳動のパターンは図9に示し
た。図9の1〜4レーンの酵素及び基質を以下の表2に
示す。
相補的なRNA鎖、ノナリボヌクレオチド(5'−GGA
GAUGAC−3')の加水分解反応を行った。方法とし
ては金谷らによりすでに特許出願している方法(特願平
01−320231)に従った。基質としては、ノナデ
オキシリボヌクレオチド(5'−GUCATCTCC−
3')と上記ノナリボヌクレオチドのノナヌクレオチドデ
ュープレックス及びノナリボヌクレオチドを用いた。ノ
ナヌクレオチドデュープレックスとノナリボヌクレオチ
ドそれぞれの溶液9μlに酵素溶液1μlを加えて30℃
で1.5時間保温し、90℃2分間処理することにより
反応を停止した。その後反応溶液2μlを7M尿素入り
20%ポリアクリルアミドゲルにアプライし、約2時間
泳動した。ゲル上の放射能はイメージングプレートを利
用し、Fujix BA100バイオイメージングアナライ
ザーにより分析した。電気泳動のパターンは図9に示し
た。図9の1〜4レーンの酵素及び基質を以下の表2に
示す。
【表2】 レーン 酵素(量) 基質 1 − d−r9mer 2 C135 (0.030pmol) d−r9mer 3 d9−C135(0.019pmol) d−r9mer 4 d9−C135(0.019pmol) r9mer リボヌクレアーゼHはDNA/RNAハイブリッドの
RNA鎖を切断するが、d9−C135ではRNA鎖の
みを切断しており、しかも、C135ではノナヌクレオ
チドデュープレックスを5番目と6番目及び6番目と7
番目の残基の間で切断するが、d9−C135では5番
目と6番目の残基の間のみである。すなわちd9−C1
35ではRNA鎖を選択的にある一点で切断することが
わかった。切断の様式については図10にまとめた。ま
た、反応溶液中の基質量は10pmolでそれに対して酵素
量は約0.02pmolと約500倍の基質を切断している
ので、本酵素がターンオーバーしていることがわかる。
また、d9−C135以外の他の酵素についても同様の
結果が得られた。
RNA鎖を切断するが、d9−C135ではRNA鎖の
みを切断しており、しかも、C135ではノナヌクレオ
チドデュープレックスを5番目と6番目及び6番目と7
番目の残基の間で切断するが、d9−C135では5番
目と6番目の残基の間のみである。すなわちd9−C1
35ではRNA鎖を選択的にある一点で切断することが
わかった。切断の様式については図10にまとめた。ま
た、反応溶液中の基質量は10pmolでそれに対して酵素
量は約0.02pmolと約500倍の基質を切断している
ので、本酵素がターンオーバーしていることがわかる。
また、d9−C135以外の他の酵素についても同様の
結果が得られた。
【0023】(8) Hybrid酵素の酵素反応速度論パラ
メーター 上記(7)で示したように本発明によるハイブリッド酵素
は、RNA鎖のみをある特定の部位で切断することが解
明されたので、それぞれに関して酵素反応速度パラメー
ターを決定することとした。方法としては、すでに特許
出願している方法(特願平01−320231)に従っ
た。未修飾の酵素については、(7)で示したノナヌクレ
オチドデュープレックス溶液を使用し、ハイブリッド酵
素についてはノナリボヌクレオチド溶液を基質溶液とし
て用いた。結果を表3に示した。
メーター 上記(7)で示したように本発明によるハイブリッド酵素
は、RNA鎖のみをある特定の部位で切断することが解
明されたので、それぞれに関して酵素反応速度パラメー
ターを決定することとした。方法としては、すでに特許
出願している方法(特願平01−320231)に従っ
た。未修飾の酵素については、(7)で示したノナヌクレ
オチドデュープレックス溶液を使用し、ハイブリッド酵
素についてはノナリボヌクレオチド溶液を基質溶液とし
て用いた。結果を表3に示した。
【表3】 酵素 km(μM) kcat(min-1) kcat/km 基質 (min-1,μM-1) 天然型 0.44 141 320 d−r9mer C131 1.30 95 73 d−r9mer C135 1.43 131 92 d−r9mer C142 1.82 125 69 d−r9mer d9−C131 0.43 23.3 54 r9mer d9−C135 0.20 16.3 82 r9merd9−C142 0.56 21.7 39 r9mer ハイブリッド酵素はどれも未修飾のものに対して、kmが
1/3〜1/7倍、kcatが1/4〜1/8倍となってい
た。すなわち、これらの酵素は触媒活性は低下している
が、基質との親和性は増大している。一般に酵素の触媒
能はkcat/kmで比較されるが、ハイブリッド酵素は未修
飾酵素の6〜8割を保持しており、十分な触媒能を持つ
ものと考えられる。以上、本発明におけるハイブリッド
リボヌクレアーゼHは、RNAを配列特異的に切断し、
しかも高い、触媒活性を保持している。また反応物が
5'−リン酸基を持つため、再ライゲーションに適して
いること、および酵素としてのターンオーバーがあるこ
となどの利点もかねそなえている。
1/3〜1/7倍、kcatが1/4〜1/8倍となってい
た。すなわち、これらの酵素は触媒活性は低下している
が、基質との親和性は増大している。一般に酵素の触媒
能はkcat/kmで比較されるが、ハイブリッド酵素は未修
飾酵素の6〜8割を保持しており、十分な触媒能を持つ
ものと考えられる。以上、本発明におけるハイブリッド
リボヌクレアーゼHは、RNAを配列特異的に切断し、
しかも高い、触媒活性を保持している。また反応物が
5'−リン酸基を持つため、再ライゲーションに適して
いること、および酵素としてのターンオーバーがあるこ
となどの利点もかねそなえている。
【図1】 部位特異的変異導入に用いたオリゴヌクレオ
チドの配列を示す模式図である。
チドの配列を示す模式図である。
【図2】 プラスミドpJAL135Cの構築図であ
る。
る。
【図3】 pJAL131CもしくはpJAL138Cの
制限酵素切断地図である。
制限酵素切断地図である。
【図4】 pJAL135CもしくはpJAL142Cの
制限酵素切断地図である。
制限酵素切断地図である。
【図5】 HPLCにかけた時のES502C陽イオン
カラムからの溶出パターンを示すグラフであり、AはN
EM−d9(1μg)、BはC135(5μg)、CはN
EM−d9(1μg)とC135(5μg)の反応溶液1
00μlをそれぞれHPLCにアプライした時の結果で
ある。
カラムからの溶出パターンを示すグラフであり、AはN
EM−d9(1μg)、BはC135(5μg)、CはN
EM−d9(1μg)とC135(5μg)の反応溶液1
00μlをそれぞれHPLCにアプライした時の結果で
ある。
【図6】 SDS−PAGE後のCBB染色したゲルの
写真の模写図で、1はマーカー、2はC135(1μ
g)、3は0.2μgのNEM−d9と1μgのC135を
反応させた反応液10μl、4はES502Cで得られ
た図7Cのピーク部分である。
写真の模写図で、1はマーカー、2はC135(1μ
g)、3は0.2μgのNEM−d9と1μgのC135を
反応させた反応液10μl、4はES502Cで得られ
た図7Cのピーク部分である。
【図7】 d9−C135の構造の模式図である。
【図8】 d9−C135の基質認識及びその分解の模
式図である。白ぬきの帯はDNA、黒ぬりの帯はRN
A、Cys135とDNAをつないでいる実線はリンカー部
分を示している。また3つの黒ぬきの残基Asp10、Glu
48、Asp70はリボヌクレアーゼHの活性中心である。
式図である。白ぬきの帯はDNA、黒ぬりの帯はRN
A、Cys135とDNAをつないでいる実線はリンカー部
分を示している。また3つの黒ぬきの残基Asp10、Glu
48、Asp70はリボヌクレアーゼHの活性中心である。
【図9】 C135及びd9−C135により加水分解
されたノナヌクレオチドデュープレックス又はノナリボ
ヌクレオチドの分解物をUrea存在下20%SDS−P
AGEに電気泳動し、イメージングプレートにより放射
能を検出したゲルの写真の模写図である。
されたノナヌクレオチドデュープレックス又はノナリボ
ヌクレオチドの分解物をUrea存在下20%SDS−P
AGEに電気泳動し、イメージングプレートにより放射
能を検出したゲルの写真の模写図である。
【図10】 非修飾型と修飾型(NEM−d9が導入され
たもの)の切断様式を示した模式図である。
たもの)の切断様式を示した模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:19) C12R 1:19) (C12N 15/09 9162−4B C12N 15/00 A C12R 1:19) C12R 1:19)
Claims (15)
- 【請求項1】 酵素活性に影響を与えることなく分子表
面に1個のシステイン残基を有する様に改変された大腸
菌由来変異型リボヌクレアーゼHとオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドとが結合したハイブリッドリボヌクレアー
ゼHであって、該システイン残基中のチオール基がオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドとの共有結合に関与してい
ることを特徴とするハイブリッドリボヌクレアーゼH。 - 【請求項2】 変異型リボヌクレアーゼHが、分子表面
に位置する131、135、138または142位のア
ミノ酸がシステインで置換されているものである請求項
1に記載のハイブリッドリボヌクレアーゼH。 - 【請求項3】 オリゴデオキシリボヌクレオチドにスペ
ーサーを介して導入されたマレイミド基とシステイン残
基中のチオール基とが共有結合している請求項2に記載
のハイブリッドリボヌクレアーゼH。 - 【請求項4】 スペーサーが式:−(CH2)5−CO−N
HCH2CH2−CH(CH2OH)−で示されるものであ
る請求項3に記載のハイブリッドリボヌクレアーゼH。 - 【請求項5】 分子表面に1個のシステイン残基を有す
る大腸菌由来変異型リボヌクレアーゼH。 - 【請求項6】 天然の大腸菌由来リボヌクレアーゼHの
13位、63位および133位のシステイン残基が他の
アミノ酸残基で置換されており、分子表面に位置する1
31、135、138または142位のアミノ酸がシス
テインで置換されている請求項5に記載の大腸菌由来変
異型リボヌクレアーゼH。 - 【請求項7】 大腸菌由来リボヌクレアーゼHの13
位、63位および133位のシステイン残基が他のアミ
ノ酸残基で置換されており、かつ、131、135、1
38または142位のアミノ酸残基がシステイン残基で
置換されている大腸菌由来変異型リボヌクレアーゼHを
コードしているDNA。 - 【請求項8】 請求項7に記載のDNAを含有してお
り、該DNAを発現し得る発現ベクター。 - 【請求項9】 プラスミドpBR322由来の複製起
源、熱感受性リプレッサーcIts857の遺伝子、バクテリ
オファージラムダのPL、PR両プロモーター、及び該P
L、PR両プロモーターの支配下にある変異型リボヌクレ
アーゼHをコードしているDNAを含有している、請求
項8に記載の発現ベクター。 - 【請求項10】 プラスミドpJAL131C、pJAL
135C、pJAL138CまたはpJAL142Cであ
る請求項9に記載の発現ベクター。 - 【請求項11】 選択マーカーとしてアンピシリン耐性
遺伝子を含有している請求項8〜10のいずれかに記載
の発現ベクター。 - 【請求項12】 請求項8〜11のいずれかに記載の発
現ベクターで大腸菌宿主を形質転換することにより得ら
れる形質転換体。 - 【請求項13】 宿主が大腸菌K−12株HB101で
ある請求項12に記載の形質転換体。 - 【請求項14】 大腸菌HB101/pJAL131
C、HB101/pJAL135C、HB101/pJA
L138C、またはHB101/pJAL142Cであ
る請求項13に記載の形質転換体。 - 【請求項15】 酵素活性に影響を与えることなく分子
表面に1個のシステイン残基を有する様に改変された大
腸菌由来変異型リボヌクレアーゼHとオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドとが結合したハイブリッドリボヌクレア
ーゼHであって、該システイン残基中のチオール基がオ
リゴデオキシリボヌクレオチドとの共有結合に関与して
いることを特徴とするハイブリッドリボヌクレアーゼH
を使ってインビトロまたはインビボに於いて一本鎖RN
Aを選択特異的に切断する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3158313A JP2533700B2 (ja) | 1991-06-28 | 1991-06-28 | 配列特異的rna加水分解酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3158313A JP2533700B2 (ja) | 1991-06-28 | 1991-06-28 | 配列特異的rna加水分解酵素 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH053786A JPH053786A (ja) | 1993-01-14 |
JP2533700B2 true JP2533700B2 (ja) | 1996-09-11 |
Family
ID=15668907
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3158313A Expired - Lifetime JP2533700B2 (ja) | 1991-06-28 | 1991-06-28 | 配列特異的rna加水分解酵素 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2533700B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116445453B (zh) * | 2023-03-02 | 2023-11-14 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种高效热稳定的核糖核酸酶SiRe_0917及其编码基因和应用 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03180179A (ja) * | 1989-12-08 | 1991-08-06 | Tanpaku Kogaku Kenkyusho:Kk | 人工ジスルフィド結合を持つ大腸菌リボヌクレアーゼh |
-
1991
- 1991-06-28 JP JP3158313A patent/JP2533700B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH053786A (ja) | 1993-01-14 |
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