JP2533700B2

JP2533700B2 - 配列特異的ｒｎａ加水分解酵素

Info

Publication number: JP2533700B2
Application number: JP3158313A
Authority: JP
Inventors: 茂則金谷; 知恵子中井; 栄子大塚
Original assignee: TANPAKU KOGAKU KENKYUSHO KK
Current assignee: TANPAKU KOGAKU KENKYUSHO KK
Priority date: 1991-06-28
Filing date: 1991-06-28
Publication date: 1996-09-11
Anticipated expiration: 2011-09-11
Also published as: JPH053786A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リボヌクレアーゼＨと
オリゴデオキシリボヌクレオチドとが共有結合したハイ
ブリッドリボヌクレアーゼＨに関する。更に本発明は、
該ハイブリッドリボヌクレアーゼＨを製造するのに有用
な変異型リボヌクレアーゼＨ、該変異型リボヌクレアー
ゼＨをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベク
ター、および該発現ベクターで形質転換された宿主細胞
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＲＮＡを、in vitroに於いて配列特異
的に切断することは、ＲＮＡの一次構造を決定したり、
ＲＮＡを切り貼りする上で極めて重要である。しかしな
がら、現在その目的を達成するための手段としては、イ
ノウエら(Ｉnoue,Ｈ．)(フェブスターズ、２１５、３２
７−３３０[１９８７])及びシバハラら(Ｓhibahara,
Ｓ．)(ヌクレイックアシドリサーチ、１５、４４０
３−４４１５[１９８７])によって開発された方法が存
在するに過ぎない。この方法はリボヌクレアーゼＨが、
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的に
加水分解するという性質を利用して、まず、２'−Ｏ−
メチルリボヌクレオチドを含むキメラオリゴヌクレオチ
ドとＲＮＡとのハイブリッドを作り、ついで大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨを作用させることにより、ハイブリッド
が形成された領域でＲＮＡを切断するというものであ
る。しかし、この方法に於いては、ＲＮＡを効率よく切
断するには、その１．５当量以上のキメラオリゴヌクレ
オチドが必要であり、キメラオリゴヌクレオチドを合成
するための試薬は大変高価であるので、かねてよりコス
ト上の問題が指摘されていた。さらに、リボヌクレアー
ゼＨを作用させる前にハイブリッド形成のためのアニー
リングをおこなわなければならないために、操作性にお
いても煩雑であり、その改良が望まれていた。

【０００３】一方、アンチセンスオリゴヌクレオチドが
動物細胞において特定の遺伝子発現を阻害するのは、メ
ッセンジャーＲＮＡ又はその前駆体が、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドとハイブリッドを形成する領域で、内
在性のリボヌクレアーゼＨ(ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッ
ドのＲＮＡ鎖のみを切断する酵素)によって切断される
ためであることがミンシャル(Ｍinshull,Ｊ.)とハント
(Ｈunt,Ｔ.)によって見出されて以来(ヌクレイックア
シドリサーチ、１４、６４３３−６４５１[１９８
６])、in vivoに於けるＲＮＡの高選択的切断法の開発
は、著しく重視されるようになった。これは、かかる高
選択的切断法により、各種細胞の望ましくない形質の発
現を阻止することが可能となり、特に医薬および農業分
野での画期的な応用が期待されるからである。

【０００４】しかしながら、上記のアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド自体を用いてin vivoに於ける蛋白合成を
阻害しようという試みは、標的となるメッセンジャーＲ
ＮＡ分子の切断効率が低いため、成功しなかった。切断
効率の低い理由は、主として、アンチセンスオリゴヌク
レオチドとメッセンジャーＲＮＡがハイブリッドを形成
する細胞内区画に、リボヌクレアーゼＨが十分量存在し
ない結果、リボヌクレアーゼＨによりハイブリッドが認
識されて切断される前に、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドが細胞内ヌクレアーゼによって分解されてしまうた
めであると考えられている。そこでアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの細胞内安定性を向上させるために、ホス
フォトリエステル、ホスフォロアミダイト、ホスホロチ
オエイト、あるいはメチルホスフォネートのような修飾
リン酸エステル結合を有するオリゴヌクレオチドの合成
法がこれまで開発されてきた(総説:Ｍiller,Ｐ．Ｓ．バ
イオテクノロジー、９、３５８−３６２[１９９１])。
しかし、これらのオリゴヌクレオチド誘導体は、確か
に、細胞内ヌクレアーゼによる分解を受けにくくなった
ものの、これらとハイブリッドしたＲＮＡはＲＮaseＨ
による分解も同時に受けにくくなってしまうため、アン
チセンスとしての効率はそれほど改善されなかった。

【０００５】一方、メッセンジャーＲＮＡがこれらのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成す
る細胞内区画にリボヌクレアーゼＨが十分量存在しない
ために、その切断効率が悪いという問題点を解決する方
法もこれまでいくつか報告されている。一つは、ツッカ
ーマン(Ｚuckermann,Ｒ．Ｎ．)とシュルツ(Ｓchultz,
Ｐ．Ｇ．)により開発された方法で(プロシーディング
ナショナルサイエンスオブアカデミー、８６、１７
６６−１７７０[１９８９])、スタフィロコッカルヌ
クレアーゼとオリゴデオキシリボヌクレオチド(２２me
r)を共有結合により連結したハイブリッドヌクレアーゼ
を利用するものである。このハイブリッドヌクレアーゼ
においては、塩基配列認識をオリゴヌクレオチド部分
が、触媒活性をヌクレアーゼ部分が、それぞれ司ってい
る。しかし、このハイブリッドヌクレアーゼは、確かに
ＲＮＡを配列特異的に切断するものの、切断効率が悪く
(最大５０％)、操作が煩雑であり、切断物が３'−リン
酸を形成するため再ライゲーションしにくく、酵素とし
てのターンオーバー(繰返し作用すること)がほとんどな
く、更に自己消化する等、多くの問題を抱えており、こ
れらの問題を解決することが強く望まれている。もう１
つは、チェック(Ｃeck,Ｔ．Ｒ．)により発見されたリボ
ザイムの利用である(マニュアルレビューオブバ
イオケミストリー、５９、５４３[１９９０])。しか
し、リボザイムというＲＮＡ分子は、確かに別のＲＮＡ
分子を配列特異的に切断するものの、触媒活性が極めて
低いという致命的な欠点がある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、高選択性
と高触媒活性をあわせ持つ、配列特異的ＲＮＡ加水分解
酵素の開発を目的として鋭意検討を重ねた結果、リボヌ
クレアーゼＨの分子表面に存在し、酵素活性に直接関与
していないアミノ酸残基のいずれかをシステイン残基に
変換し、そのシステイン残基のチオール基を介してオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドと共有結合せしめることに
より得られるハイブリッドリボヌクレアーゼＨが所期の
目的を達成し得るものであることを見い出し、本発明を
完成するに至った。

【０００７】従って本発明の第一の目的は、酵素活性に
影響を与えることなく分子表面に１個のシステイン残基
を有する様に改変された変異型リボヌクレアーゼＨとオ
リゴデオキシリボヌクレオチドとが結合したハイブリッ
ドリボヌクレアーゼＨであって、該システイン残基中の
チオール基がオリゴデオキシリボヌクレオチドとの共有
結合に関与していることを特徴とするハイブリッドリボ
ヌクレアーゼＨを提供するものである。

【０００８】本明細書に於いてリボヌクレアーゼＨの分
子表面とは、水溶液中において、水分子と接触すること
のできる領域を意味する。後述する様に、本発明者ら
は、大腸菌リボヌクレアーゼＨの分子表面に存在する１
３１、１３５、１３８または１４２位のアミノ酸をシス
テイン残基に変換し、そのチオール基を介してこの酵素
をオリゴデオキシリボヌクレオチドと結合させたが、い
ずれの場合も酵素活性の低下はほとんど観察されなかっ
た。このことから明らかな様にシステイン残基に変換す
べきアミノ酸残基の位置は、上記のものに限定されるも
のではなく、リボヌクレアーゼＨの分子表面に存在する
アミノ酸残基であって、酵素活性に直接関与していない
アミノ酸残基であればいかなるものであってもよい。ち
なみに、大腸菌リボヌクレアーゼＨの活性中心は、１０
位と７０位のアスパラギン酸、および４８位のグルタミ
ン酸で構成されており、三次構造上これらの残基の近傍
に位置する、１２４位のヒスチジン、１６位、４４位、
４５位、１３０位のアスパラギン、４３位のスレオニ
ン、７２位のグルタミン等も触媒活性や基質結合に関与
することが知られている。

【０００９】変異型リボヌクレアーゼＨとは、天然のリ
ボヌクレアーゼＨの分子表面に存在するアミノ酸残基が
システイン残基に変換されたもの、およびこの変換に加
えて分子表面以外の場所に存在するシステイン残基が他
のアミノ酸残基に変換されたものをいう。尚、リボヌク
レアーゼＨは大腸菌由来のものを使用するのが便利であ
るが、アミノ酸配列上大腸菌リボヌクレアーゼＨとの相
同性が高く(３０％以上)、大腸菌リボヌクレアーゼＨと
類似の三次構造並びに活性中心を有する他の生物由来の
リボヌクレアーゼＨも、天然型、変異型を問わずすべて
使用することができる。

【００１０】本発明で使用するオリゴデオキシリボヌク
レオチドは、リボヌクレアーゼＨと結合させるために、
その５'末端が化学修飾されている。化学修飾は特定の
ものに限られないが、５'末端にスペーサーを結合さ
せ、そのスペーサーの先端にマレイミド基を有するもの
が都合がよい。末端にマレイミド基を有し、オリゴデオ
キシリボヌクレオチドの５'末端に結合させることがで
きるスペーサーの一例を下に挙げる。

【化１】このスペーサーは、まずアミノモディファイヤーII（Ｃ
ＬＯＮＴＥＣＨ社）をＤＮＡ合成機によりオリゴデオキ
シリボヌクレオチドの５'末端に付加した後、ＥＭＣＳ
（Ｄojindo Ｌaboratory）と反応させることにより、オ
リゴデオキシリボヌクレオチドの５'末端に結合させる
ことができる。他のスペーサーの例としてはオリゴデオ
キシリボヌクレオチドの３'末端にチオール基を導入す
る方法がツッカーマン（Ｚuckerman,Ｒ.Ｎ.）とシュル
ツ（Ｓchultz,Ｐ.Ｇ.）により報告されている（サイエ
ンス、２３８、１４０１〜１４０３(１９８７)）。この
場合、生じる（ヌクレオチド）−（スペーサー）−（チ
オール基）の化学式は、

【化２】となり、これをチオール基を有する酵素（Ｅnz−ＳＨ）
と反応させることにより、

【化３】部分がＳ−Ｅnz部分と置きかわり、結果的にオリゴヌク
レオチドがＳ−Ｓ結合を介して酵素に共有結合すること
になる。

【００１１】オリゴデオキシリボヌクレオチドは、４量
体以上であること、および分解しようとするＲＮＡの切
断部位のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
(３０量体以下)を含んでいれば、いかなる長さおよび配
列のものであってもよい。しかし、１０個前後のヌクレ
オチド数であることが好ましい。尚、オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドは、ＲＮＡとの相補的結合の特異性を増
強したり、細胞内での安定性を増すための修飾が加えら
れていてもよい。例えばＤＮＡの一部を２’−Ｏ−メチ
ルＲＮＡで置きかえたキメラヌクレオチドや、リン酸結
合をチオリン酸結合やリン酸トリエステル結合等で置き
かえたオリゴヌクレオチドも本発明のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドとして使用し得る。本明細書に於いて
は、この様な修飾を施されたものも、単にオリゴデオキ
シリボヌクレオチドと呼称する。

【００１２】本発明に係るハイブリッドリボヌクレアー
ゼＨは、後述する方法で製造された変異型リボヌクレア
ーゼと、５'末端を化学修飾したオリゴデオキシリボヌ
クレオチドとを反応させ、その生成物を、例えば陽イオ
ン交換カラムを用いたＨＰＬＣで分離することにより調
製することができる。この様にして得られたハイブリッ
ドリボヌクレアーゼＨは、塩基配列認識をオリゴデオキ
シリボヌクレオチド部分が、そして触媒活性を変異型リ
ボヌクレアーゼＨ部分がそれぞれ担当し、効率のよい酵
素活性を発揮する。

【００１３】分子表面に１個のシステイン残基を有する
様に改変された変異型リボヌクレアーゼは、組換ＤＮＡ
技術を使って常法により、例えば後記実施例に示した方
法により製造することができる。即ち、分子表面の１個
のアミノ酸残基がシステイン残基に変換されたリボヌク
レアーゼＨをコードしているＤＮＡをＧene Ａmp Ｋit
（タカラ酒造）を用いてＰＣＲ法により調製する。ＰＣ
Ｒを用いた部位変異導入は、ヒグチ（Ｒ.Ｈiguchi）の
方法で行った（ＰＣＲＰrotocols(Ｉnnis,Ｍ.Ａ.et a
l.eds.)，pp１７７，Ａcademic Ｐress Ｉnc.(１９９
０)）。この様にして得たＤＮＡを例えばバクテリオフ
ァージλのＰ_LおよびＰ_R両プロモータを有する発現ベク
ターに挿入し、このベクターを大腸菌宿主に導入し、宿
主を培養することにより目的の変異型リボヌクレアーゼ
を製造することができる。変異型リボヌクレアーゼＨを
コードしているＤＮＡ、該ＤＮＡを挿入した発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、および
生産される変異型リボヌクレアーゼＨは全て新規であ
り、これらは全て本発明を構成する。従って、本発明の
別の目的は、大腸菌リボヌクレアーゼＨの１３１、１３
５、１３８、または１４２位のアミノ酸残基がシステイ
ン残基で置換されている変異型リボヌクレアーゼＨ、お
よび該変異型リボヌクレアーゼＨをコードしているＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含有しており、該ＤＮＡを発現し得る発
現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形
質転換体を提供するものである。

【００１４】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００１５】実施例 (１) pＪＡＬ１３１Ｃ、pＪＡＬ１３５Ｃ、pＪＡＬ
１３８Ｃ、pＪＡＬ１４２Ｃの作製大腸菌リボヌクレアーゼＨ(以下リボヌクレアーゼＨと
略す)にＤＮＡ鎖を導入する方法として、マレイミド体
による化学修飾を利用することとした。まず、リボヌク
レアーゼＨの活性中心(Ａsp１０、Ｇlu４８、Ａsp７０)
から比較的近く、残基が外側を向いているグルタミン酸
１３１、グルタミン酸１３５、アルギニン１３８、メチ
オニン１４２を選び、それぞれをシステインに変換する
こととした。また、この変換には他のシステインへの化
学修飾をさけるため、天然型リボヌクレアーゼＨの３つ
の遊離のシステイン(１３、６３、１３３位)を、それぞ
れアラニンに変換したシステイン不含の変異型リボヌク
レアーゼＨの構造遺伝子を含有しているプラスミドpＣ
Ａ６００(金谷ら、バイオケミカルジャーナル、２７
１、５９−６６、１９９０年)を鋳型として、ＰＣＲ法
を用いて行った。ＰＣＲ用プライマーとして、図１に示
すように、５'−プライマー、３'−プライマー及び変異
用プライマーを合成した。グルタミン酸１３５からシス
テインへの変換(図２参照)は、ＳphＩサイトを含む５'
−プライマーと、プライマーＮＯ．２、ＳalＩを含む
３'−プライマーとプライマーＮＯ．１をそれぞれプラ
スミドpＣＡ６００と混合し、市販のＧene Ａmp Ｋit
(タカラ酒造)の説明書に従ってＤＮＡの増幅を行った。
これにより、ＳphＩ−ＸhoＩで規定される４００bp、Ｘ
hoＩ−ＳalＩで規定される１００bpのＤＮＡ鎖が得られ
た。これらの末端には、それぞれクランプが残っている
ので、ＳphＩ−ＸhoＩ断片及びＸhoＩ−ＳalＩ断片を得
るため、それぞれの増幅させたＤＮＡ断片にＳphＩ、Ｘ
hoＩ及びＸhoＩ、ＳalＩを添加し、３７℃で１時間消化
した。このそれぞれの消化物を１．５％アガロースゲル
電気泳動にかけて、４００bpのＳphＩ−ＸhoＩ断片及び
１００bpのＸhoＩ−ＳalＩ断片を切り出し抽出した。一
方、プラスミドpＪＬＡ５０４(***:Ｍedac社より購入)
についても、ＳphＩ及びＳalＩを添加して３７℃、１時
間消化した後、０．７％アガロースゲル電気泳動にか
け、４．９kbのＳphＩ−ＳalＩ断片を切り出し抽出し
た。以上のようにして得られた４００bpＳphＩ−ＸhoＩ
０．１μg、１００bpＸhoＩ−ＳalＩ断片０．０５μg及
び４．９kbＳphＩ−ＳalＩ断片０．１μgを混合し、Ｄ
ＮＡライゲーションキット(宝酒造)を用いて、添付の説
明書に正確に従って、プラスミドを環化した。この環化
したプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、形質
転換体pＪＡＬ１３５Ｃを得た。また、pＪＡＬ１４２Ｃ
についても上記と同様に行い、pＪＡＬ１３１Ｃ、１３
８Ｃに関しては、ＸhoＩのかわりにＳstＩを用いて同様
に行った。このようにして得たプラスミドの詳細な制限
酵素切断地図を図３および図４に示した(pＪＡＬ１３１
Ｃ(図３)、pＪＡＬ１３５Ｃ(図４)、pＪＡＬ１３８Ｃ
(図３)、pＪＡＬ１４２Ｃ(図４)それぞれ参照)。形質転
換体エシェリシア．コリ(Ｅ．coli)ＨＢ１０１／pＪＡ
Ｌ１３１Ｃ、pＪＡＬ１３５Ｃ、pＪＡＬ１３８Ｃ、pＪ
ＡＬ１４２Ｃは工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。エシェリシア．コリ(Ｅ．coli)ＨＢ１０１／pＪＡＬ１
３１Ｃ；受託番号：微工研菌寄第１２３１２号，受託日：平成３
年６月１７日エシェリシア．コリ(Ｅ．coli)ＨＢ１０１／pＪＡＬ１
３５Ｃ；受託番号：微工研菌寄第１２３１３号，受託日：平成３
年６月１７日エシェリシア．コリ(Ｅ．coli)ＨＢ１０１／pＪＡＬ１
３８Ｃ；受託番号：微工研菌寄第１２３１４号，受託日：平成３
年６月１７日エシェリシア．コリ(Ｅ．coli)ＨＢ１０１／pＪＡＬ１
４２Ｃ；受託番号：微工研菌寄第１２３１５号，受託日：平成３
年６月１７日

【００１６】(２) 形質転換体の培養とリボヌクレアー
ゼＨ含有菌体の調製 (１)に記載のプラスミドpＪＡＬ１３１Ｃ、１３５Ｃ、
１３８Ｃ、１４２Ｃで形質転換した大腸菌Ｋ−１２株Ｈ
Ｂ１０１を、８０μg／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培
地中、３０℃で振盪培養した。培養液の濁度がクレット
値で１００前後まで生育した時点で培養温度を４２℃に
上げ、更に４時間振盪を続けた後、集菌した。得られた
菌体を−２０℃で凍結保存した。

【００１７】(３) 形質転換体からのリボヌクレアーゼ
Ｈの抽出及び精製上記(２)で得た２００mlの培養液から集めたＨＢ１０１
／pＪＡＬ１３１Ｃ及びpＪＡＬ１３５Ｃ、pＪＡＬ１３
８Ｃ、pＪＡＬ１４２Ｃそれぞれの菌体１．０gを、１m
ＭＥＤＴＡを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(p
Ｈ７．５)３０mlに懸濁した後、氷中で超音波処理によ
り菌体を破砕した。１５,０００rpmで３０分間、４℃で
遠心して得た遠心上清(粗抽出液)を、ＴＥ(pＨ７．５)
５ｌに対して４℃で透析した。同緩衝液で平衡化したＤ
Ｅ−５２カラム(４ml)およびＰ−１１カラム(２ml)にこ
の順序で通した。この条件下、Ｃ１３１、Ｃ１３５、Ｃ
１３８、Ｃ１４２いずれの変異型リボヌクレアーゼＨ
も、ＤＥ−５２カラムを素通りし、Ｐ−１１カラムに吸
着する。ＴＥ(pＨ７．５)４ml、次いで０．１ＭＮaＣ
lを含むＴＥ(pＨ７．５)４mlを流した後、ＮaＣl濃度を
０．５Ｍまで直線的に上昇させることによりＰ−１１カ
ラムから各変異型リボヌクレアーゼＨを溶出させた。こ
れらの変異型リボヌクレアーゼＨを含むＰ−１１溶出画
分それぞれを約２mlに濃縮した後、さらに０．１ＭＮa
Ｃlを含む１０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５．５)で
平衡化したセファクリルＳ−３００(スーパーファイン)
カラム(φ１．６×９０cm)にかけることにより、各変異
型リボヌクレアーゼＨを精製した。精製標品は１５％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与え、逆相ＨＰＬＣでも
単一ピークを示した。精製収量は約３０mg／ｌ培養液で
あった。精製標品の同定は、アクロモバクタープロテア
ーゼＩにより消化して得られるペプチドフラグメントを
逆相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメントピークの
溶出位置を確認するとともに、１３１、１３５、１３
８、１４２位のアミノ酸を含むそれぞれのペプチドを、
分取後Ｎ末端アミノ酸配列分析により行った。

【００１８】(４) ５'末端にマレイミド基を有するノ
ナデオキシリボヌクレオチドＮＥＭ−d９mer)の合成上記(３)で示した変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｃ１３
１、Ｃ１３５、Ｃ１３８又はＣ１４２)にＤＮＡ鎖を導
入するために、ＳＨ基との反応性に富むマレイミド基を
持つノナデオキシリボヌクレオチド誘導体を合成した。
反応式を「化４」に示す。

【化４】まず、５'−ＧＴＣＡＴＣＴＣＣ−３'の配列の９量体の
ＤＮＡをＤＮＡ合成機(Ａpplied Ｂiosystems ３８０
Ａ)でマニュアルどおりに合成し、その最終段階でアミ
ノモディファイヤーＩＩ(ＣＬＯＮＴＥＣＨ社、Ｎ−フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ'−ジメトキシ
トリチル−Ｏ²−シアノエチルジイソプロピルアミノ−
フォスフィニル−３−アミノ−１,２−プロパンジオー
ル)２０μmolを添加してマレイミド基導入に必要なアミ
ノ基を付加させた。次にこの反応物をアンモニア水で担
体から切り離し、５０℃、６時間放置して脱保護し、そ
の後逆相ＨＰＬＣで単離し、８０％酢酸２mlで２０分間
処理し、ジメトキシトリチル基を脱離させた。このよう
にして完全に脱保護された生成物は逆相ＨＰＬＣとイオ
ン交換カラムクロマトグラフィーで精製した。以下の反
応の反応式は「化４」に示したが、この反応生成物(「化
４」の(１)、参照)にマレイミド基を導入するため、ＥＭ
ＣＳ(Ｄojndo Ｌaboratories,Ｎ−(ε−マレイミドカ
プロイルオキシ)スクシンイミド)を、０．１Ｍ炭酸ナト
リウム、２mＭＥＤＴＡ(pＨ７．５)を含むＤＭＦ中で
１時間反応させた。その後セファデックスＧ−５０のゲ
ルろ過にかけて精製し、このノナデオキシリボヌクレオ
チド誘導体(「化４」の(２)参照)が逆相ＨＰＬＣで単一で
あることを確認した。本化合物の収量は２．４ＯＤ単位
であった。

【００１９】(５) リボヌクレアーゼＨへのＤＮＡ鎖の
導入 (３)で得られたシステイン残基を１つ持つ変異型リボヌ
クレアーゼＨと(４)に示したノナデオキシリボヌクレオ
チド誘導体(ＮＥＭ−d９)を、チオール基とマレイミド
基間で連結させるために、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
Ｈ７．０)中、リボヌクレアーゼＨ（５．４nmol）とＮ
ＥＭ−d９（２７nmol）(モル比１:５)を、室温で１時間
反応させる。反応式は「化５」に示した。

【化５】この反応溶液を陽イオン交換カラムＥＳ−５０２Ｃ(ア
サヒカセイ)にアプライしピークを分取した。図５は陽
イオン交換カラムでの溶出パターンを示しているが、Ａ
はＮＥＭ−d９，１μg、Ｂは変異リボヌクレアーゼＨ
(Ｃ１３５)５μg、ＣはＮＥＭ−d９−，１μgとＣ１３
５，５μgを含む反応溶液１００μlをＨＰＬＣにアプラ
イしたパターンである。Ｃで得られたピークを１５％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、図６のレーン４に示
すように分子量２１０００の位置に単一なバンドが見ら
れた。この核酸誘導体が導入されたリボヌクレアーゼＨ
(Ｃ１３５)をd９−Ｃ１３５と名づけた。本酵素の模式
図を図７に示す。d９−Ｃ１３５による基質の認識及び
その分解のモデルを図８に示したが、d９−Ｃ１３５に
おいて核酸部分がＲＮＡの配列認識を、酵素部分が触媒
反応をそれぞれ司る。他の変異リボヌクレアーゼＨ(Ｃ
１３１又はＣ１３８)に関しても同様の方法でd９−Ｃ１
３１、d９−Ｃ１３８を得た。d９−Ｃ１３８は未精製で
ある。

【００２０】(６) 各変異リボヌクレアーゼＨの酵素活
性の比較活性はトリチウム標識したＭ１３ＤＮＡ／ＲＮＡハイブ
リッドを基質として用い、３７℃、１分間に１μmolの
酸可溶性画分を生じる酵素量を１単位と定義した。タン
パク量は変異リボヌクレアーゼＨと天然型リボヌクレア
ーゼＨとが、同じ吸光係数を持つという仮定のもとにＡ
０．１％₂₈₀＝２を用いて２８０nmにおける吸光度を測
定することにより求めた。またノナデオキシリボヌクレ
オチドを導入した変異リボヌクレアーゼＨについては、
核酸とタンパク質が１対１で結合したときの吸光係数を
計算により求めたところ、２８０nmにおける分子吸光係
数が８.７×１０⁴となったので、これを用いて２８０nm
における吸光度より求めて表１に示した。表１には参考
として、各変異リボヌクレアーゼＨのＮＥＭで修飾した
時の活性も付記した。

【表１】比活性(Ｕ／mg) 酵素名非修飾 (％) 修飾ＮＥＭ (％) ＮＥＭ−d９(％) 天然型３５.９(１００) ＜０.０３ − − − Ｃ１３１２３.２( ６４) ７.７ (３３) ０.１ (０.４３) Ｃ１３５３６.５(１００) １６.９ (７２.８) ０.７８(２.１) Ｃ１３８８.６( ２４) ２.４ (２７.９) − Ｃ１４２３４.２( ９５) １２.７ (３７.１) ０.１１(０.３２) − 未定

【００２１】それぞれの酵素は、天然型に対して約２５
％〜１００％の活性を保持しており、ＮＥＭ修飾時にも
約３０％〜７０％の活性をそれぞれの未修飾酵素に対し
て保持していた。またＮＥＭ−d９で修飾した時には未
修飾時に対して数％に活性は低下していた。この場合、
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを基質として用いているの
で、ＮＥＭ−d９で修飾した酵素においてはオリゴヌク
レオチド部分が酵素活性を阻害していると考えられた。

【００２２】(７) 相補的ＲＮＡ鎖の切断様式本発明におけるハイブリッド酵素の機能を調べるために
相補的なＲＮＡ鎖、ノナリボヌクレオチド(５'−ＧＧＡ
ＧＡＵＧＡＣ−３')の加水分解反応を行った。方法とし
ては金谷らによりすでに特許出願している方法(特願平
０１−３２０２３１)に従った。基質としては、ノナデ
オキシリボヌクレオチド(５'−ＧＵＣＡＴＣＴＣＣ−
３')と上記ノナリボヌクレオチドのノナヌクレオチドデ
ュープレックス及びノナリボヌクレオチドを用いた。ノ
ナヌクレオチドデュープレックスとノナリボヌクレオチ
ドそれぞれの溶液９μlに酵素溶液１μlを加えて３０℃
で１．５時間保温し、９０℃２分間処理することにより
反応を停止した。その後反応溶液２μlを７Ｍ尿素入り
２０％ポリアクリルアミドゲルにアプライし、約２時間
泳動した。ゲル上の放射能はイメージングプレートを利
用し、Ｆujix ＢＡ１００バイオイメージングアナライ
ザーにより分析した。電気泳動のパターンは図９に示し
た。図９の１〜４レーンの酵素及び基質を以下の表２に
示す。

【表２】レーン酵素(量) 基質１ − d−r９mer ２Ｃ１３５ (０．０３０pmol) d−r９mer ３ d９−Ｃ１３５(０．０１９pmol) d−r９mer ４ d９−Ｃ１３５(０．０１９pmol) r９mer リボヌクレアーゼＨはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの
ＲＮＡ鎖を切断するが、d９−Ｃ１３５ではＲＮＡ鎖の
みを切断しており、しかも、Ｃ１３５ではノナヌクレオ
チドデュープレックスを５番目と６番目及び６番目と７
番目の残基の間で切断するが、d９−Ｃ１３５では５番
目と６番目の残基の間のみである。すなわちd９−Ｃ１
３５ではＲＮＡ鎖を選択的にある一点で切断することが
わかった。切断の様式については図１０にまとめた。ま
た、反応溶液中の基質量は１０pmolでそれに対して酵素
量は約０．０２pmolと約５００倍の基質を切断している
ので、本酵素がターンオーバーしていることがわかる。
また、d９−Ｃ１３５以外の他の酵素についても同様の
結果が得られた。

【００２３】(８) Ｈybrid酵素の酵素反応速度論パラ
メーター上記(７)で示したように本発明によるハイブリッド酵素
は、ＲＮＡ鎖のみをある特定の部位で切断することが解
明されたので、それぞれに関して酵素反応速度パラメー
ターを決定することとした。方法としては、すでに特許
出願している方法(特願平０１−３２０２３１)に従っ
た。未修飾の酵素については、(７)で示したノナヌクレ
オチドデュープレックス溶液を使用し、ハイブリッド酵
素についてはノナリボヌクレオチド溶液を基質溶液とし
て用いた。結果を表３に示した。

【表３】酵素 km(μＭ) kcat(min^-1) kcat／km 基質 (min^-1,μＭ^-1) 天然型０．４４１４１３２０ d−r９mer Ｃ１３１１．３０９５７３ d−r９mer Ｃ１３５１．４３１３１９２ d−r９mer Ｃ１４２１．８２１２５６９ d−r９mer d９−Ｃ１３１０．４３２３．３５４ r９mer d９−Ｃ１３５０．２０１６．３８２ r９merd９−Ｃ１４２０．５６２１．７３９ r９mer ハイブリッド酵素はどれも未修飾のものに対して、kmが
１／３〜１／７倍、kcatが１／４〜１／８倍となってい
た。すなわち、これらの酵素は触媒活性は低下している
が、基質との親和性は増大している。一般に酵素の触媒
能はkcat／kmで比較されるが、ハイブリッド酵素は未修
飾酵素の６〜８割を保持しており、十分な触媒能を持つ
ものと考えられる。以上、本発明におけるハイブリッド
リボヌクレアーゼＨは、ＲＮＡを配列特異的に切断し、
しかも高い、触媒活性を保持している。また反応物が
５'−リン酸基を持つため、再ライゲーションに適して
いること、および酵素としてのターンオーバーがあるこ
となどの利点もかねそなえている。

【図面の簡単な説明】

【図１】部位特異的変異導入に用いたオリゴヌクレオ
チドの配列を示す模式図である。

【図２】プラスミドpＪＡＬ１３５Ｃの構築図であ
る。

【図３】 pＪＡＬ１３１ＣもしくはpＪＡＬ１３８Ｃの
制限酵素切断地図である。

【図４】 pＪＡＬ１３５ＣもしくはpＪＡＬ１４２Ｃの
制限酵素切断地図である。

【図５】ＨＰＬＣにかけた時のＥＳ５０２Ｃ陽イオン
カラムからの溶出パターンを示すグラフであり、ＡはＮ
ＥＭ−d９（１μg）、ＢはＣ１３５（５μg）、ＣはＮ
ＥＭ−d９（１μg）とＣ１３５（５μg）の反応溶液１
００μlをそれぞれＨＰＬＣにアプライした時の結果で
ある。

【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色したゲルの
写真の模写図で、１はマーカー、２はＣ１３５（１μ
g）、３は０.２μgのＮＥＭ−d９と１μgのＣ１３５を
反応させた反応液１０μl、４はＥＳ５０２Ｃで得られ
た図７Ｃのピーク部分である。

【図７】 d９−Ｃ１３５の構造の模式図である。

【図８】 d９−Ｃ１３５の基質認識及びその分解の模
式図である。白ぬきの帯はＤＮＡ、黒ぬりの帯はＲＮ
Ａ、Ｃys¹³⁵とＤＮＡをつないでいる実線はリンカー部
分を示している。また３つの黒ぬきの残基Ａsp¹⁰、Ｇlu
⁴⁸、Ａsp⁷⁰はリボヌクレアーゼＨの活性中心である。

【図９】Ｃ１３５及びd９−Ｃ１３５により加水分解
されたノナヌクレオチドデュープレックス又はノナリボ
ヌクレオチドの分解物をＵrea存在下２０％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥに電気泳動し、イメージングプレートにより放射
能を検出したゲルの写真の模写図である。

【図１０】非修飾型と修飾型(ＮＥＭ−d９が導入され
たもの)の切断様式を示した模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】酵素活性に影響を与えることなく分子表
面に１個のシステイン残基を有する様に改変された大腸
菌由来変異型リボヌクレアーゼＨとオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドとが結合したハイブリッドリボヌクレアー
ゼＨであって、該システイン残基中のチオール基がオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドとの共有結合に関与してい
ることを特徴とするハイブリッドリボヌクレアーゼＨ。
【請求項２】変異型リボヌクレアーゼＨが、分子表面
に位置する１３１、１３５、１３８または１４２位のア
ミノ酸がシステインで置換されているものである請求項
１に記載のハイブリッドリボヌクレアーゼＨ。
【請求項３】オリゴデオキシリボヌクレオチドにスペ
ーサーを介して導入されたマレイミド基とシステイン残
基中のチオール基とが共有結合している請求項２に記載
のハイブリッドリボヌクレアーゼＨ。
【請求項４】スペーサーが式:−(ＣＨ₂)₅−ＣＯ−Ｎ
ＨＣＨ₂ＣＨ₂−ＣＨ(ＣＨ₂ＯＨ)−で示されるものであ
る請求項３に記載のハイブリッドリボヌクレアーゼＨ。
【請求項５】分子表面に１個のシステイン残基を有す
る大腸菌由来変異型リボヌクレアーゼＨ。
【請求項６】天然の大腸菌由来リボヌクレアーゼＨの
１３位、６３位および１３３位のシステイン残基が他の
アミノ酸残基で置換されており、分子表面に位置する１
３１、１３５、１３８または１４２位のアミノ酸がシス
テインで置換されている請求項５に記載の大腸菌由来変
異型リボヌクレアーゼＨ。
【請求項７】大腸菌由来リボヌクレアーゼＨの１３
位、６３位および１３３位のシステイン残基が他のアミ
ノ酸残基で置換されており、かつ、１３１、１３５、１
３８または１４２位のアミノ酸残基がシステイン残基で
置換されている大腸菌由来変異型リボヌクレアーゼＨを
コードしているＤＮＡ。
【請求項８】請求項７に記載のＤＮＡを含有してお
り、該ＤＮＡを発現し得る発現ベクター。
【請求項９】プラスミドpＢＲ３２２由来の複製起
源、熱感受性リプレッサーcＩ^ts857の遺伝子、バクテリ
オファージラムダのＰ_L、Ｐ_R両プロモーター、及び該Ｐ
_L、Ｐ_R両プロモーターの支配下にある変異型リボヌクレ
アーゼＨをコードしているＤＮＡを含有している、請求
項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】プラスミドpＪＡＬ１３１Ｃ、pＪＡＬ
１３５Ｃ、pＪＡＬ１３８ＣまたはpＪＡＬ１４２Ｃであ
る請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】選択マーカーとしてアンピシリン耐性
遺伝子を含有している請求項８〜１０のいずれかに記載
の発現ベクター。
【請求項１２】請求項８〜１１のいずれかに記載の発
現ベクターで大腸菌宿主を形質転換することにより得ら
れる形質転換体。
【請求項１３】宿主が大腸菌Ｋ−１２株ＨＢ１０１で
ある請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】大腸菌ＨＢ１０１／pＪＡＬ１３１
Ｃ、ＨＢ１０１／pＪＡＬ１３５Ｃ、ＨＢ１０１／pＪＡ
Ｌ１３８Ｃ、またはＨＢ１０１／pＪＡＬ１４２Ｃであ
る請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】酵素活性に影響を与えることなく分子
表面に１個のシステイン残基を有する様に改変された大
腸菌由来変異型リボヌクレアーゼＨとオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドとが結合したハイブリッドリボヌクレア
ーゼＨであって、該システイン残基中のチオール基がオ
リゴデオキシリボヌクレオチドとの共有結合に関与して
いることを特徴とするハイブリッドリボヌクレアーゼＨ
を使ってインビトロまたはインビボに於いて一本鎖ＲＮ
Ａを選択特異的に切断する方法。