JPH06135993A - 止血作用および生体防御作用を有するペプチド - Google Patents
止血作用および生体防御作用を有するペプチドInfo
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- JPH06135993A JPH06135993A JP4287360A JP28736092A JPH06135993A JP H06135993 A JPH06135993 A JP H06135993A JP 4287360 A JP4287360 A JP 4287360A JP 28736092 A JP28736092 A JP 28736092A JP H06135993 A JPH06135993 A JP H06135993A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】ＳＦＬＬＲまたはＳＦＬＬＲＮＰまたはＳＦＬ
ＬＲＮＰＮＤで表されるペプチド及び該ペプチドを含有
する治療剤。 【効果】上記ペプチドは血管内皮細胞からの接着分子を
誘導し、プラスミンを阻害せずに血管内皮細胞と白血球
の相互作用によって白血球の活性化を引き起こし、細菌
の排除効果を有し、細菌の感染を防御する作用と共にＰ
ＡＩ（ｔＰＡ阻害因子）産生をもたらし、抗出血作用を
持つ。また９以下のアミノ酸残基で構成され、血小板ト
ロンビン受容体のＮ末端の１４アミノ酸残基に比べて小
さいため、合成が容易で収率が良く、コスト面からも安
価に製造できる利点がある。
ＬＲＮＰＮＤで表されるペプチド及び該ペプチドを含有
する治療剤。 【効果】上記ペプチドは血管内皮細胞からの接着分子を
誘導し、プラスミンを阻害せずに血管内皮細胞と白血球
の相互作用によって白血球の活性化を引き起こし、細菌
の排除効果を有し、細菌の感染を防御する作用と共にＰ
ＡＩ（ｔＰＡ阻害因子）産生をもたらし、抗出血作用を
持つ。また９以下のアミノ酸残基で構成され、血小板ト
ロンビン受容体のＮ末端の１４アミノ酸残基に比べて小
さいため、合成が容易で収率が良く、コスト面からも安
価に製造できる利点がある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トロンビン受容体異常
症に対する出血性疾患の治療および白血球活性化による
感染症疾患の治療に有効なペプチドおよび該ペプチドを
有効成分とする薬剤に関する。
症に対する出血性疾患の治療および白血球活性化による
感染症疾患の治療に有効なペプチドおよび該ペプチドを
有効成分とする薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】外傷あるいは外科手術時の出血に際して
は生理的に止血が起こるが、異常に出血し、止まらない
場合がある。そのような場合に止血機能を促進する薬剤
として、ビタミンＫ依存性の血液凝固因子の産生を促進
するためのビタミンＫ製剤（フィトナジオン、メナキノ
ン、メナジオン）がある。また、止血剤としてはトロン
ビンも代表的薬剤であり、および繊維素（フィブリン）
溶解酵素プラスミンの阻害薬も挙げられ［奥田拓道、高
田明和、前田浩編：病気を理解するための生理学・生化
学、２２５−２４７、１９８８年、金芳堂（東京）］、
例えばトラネキサム酸がしばしば用いられている。さら
に、血小板トロンビン受容体のＮ末端の１４アミノ酸残
基を含むオリゴペプチド（ＳＦＬＬＲＮＰＮＰＮＤＫＹ
ＥＰＦ）にはトロンビンと同様の血小板凝集作用、即ち
止血作用があることが報告されている［Ｔ．−Ｋ．Ｈ．
Ｖｕ，Ｄ．Ｔ．Ｈｕｎｇ，Ｖ．Ｉ．Ｗｈｅａｔｏｎ，ａ
ｎｄＳ．Ｒ．Ｃｏｕｇｈｌｉｎ：Ｃｅｌｌ，６４，１０
５７−１０６８，１９９１］。
は生理的に止血が起こるが、異常に出血し、止まらない
場合がある。そのような場合に止血機能を促進する薬剤
として、ビタミンＫ依存性の血液凝固因子の産生を促進
するためのビタミンＫ製剤（フィトナジオン、メナキノ
ン、メナジオン）がある。また、止血剤としてはトロン
ビンも代表的薬剤であり、および繊維素（フィブリン）
溶解酵素プラスミンの阻害薬も挙げられ［奥田拓道、高
田明和、前田浩編：病気を理解するための生理学・生化
学、２２５−２４７、１９８８年、金芳堂（東京）］、
例えばトラネキサム酸がしばしば用いられている。さら
に、血小板トロンビン受容体のＮ末端の１４アミノ酸残
基を含むオリゴペプチド（ＳＦＬＬＲＮＰＮＰＮＤＫＹ
ＥＰＦ）にはトロンビンと同様の血小板凝集作用、即ち
止血作用があることが報告されている［Ｔ．−Ｋ．Ｈ．
Ｖｕ，Ｄ．Ｔ．Ｈｕｎｇ，Ｖ．Ｉ．Ｗｈｅａｔｏｎ，ａ
ｎｄＳ．Ｒ．Ｃｏｕｇｈｌｉｎ：Ｃｅｌｌ，６４，１０
５７−１０６８，１９９１］。
【０００３】なおトロンビンの止血作用の機序は、一般
に血小板凝集作用とフィブリン生成作用によるとされて
いる。また、ビタミンＫ製剤の止血作用の機序は、肝臓
におけるプロトロンビン、III 因子、IX因子、Ｘ因子な
どの血液凝固因子の産生を促進することによって血液凝
固を起こすためとされている［奥田拓道、高田明和、前
田浩編：病気を理解するための生理学・生化学、２２５
−２４７、１９８８年、金芳堂（東京）］。
に血小板凝集作用とフィブリン生成作用によるとされて
いる。また、ビタミンＫ製剤の止血作用の機序は、肝臓
におけるプロトロンビン、III 因子、IX因子、Ｘ因子な
どの血液凝固因子の産生を促進することによって血液凝
固を起こすためとされている［奥田拓道、高田明和、前
田浩編：病気を理解するための生理学・生化学、２２５
−２４７、１９８８年、金芳堂（東京）］。
【０００４】しかしながら、血小板、血管組織における
トロンビン受容体がトロンビン結合能を失ったトロンビ
ン受容体異常症においては血小板凝集能の低下および血
管への血小板の付着効果の低下が起こり、出血が続くこ
とにより貧血症などの出血性疾患を引き起こし、死に至
る危険性がある。ビタミンＫ製剤は、血中におけるトロ
ンビンの生産を増加させる薬剤であるため、トロンビン
受容体異常症に起因する出血性疾患に効果が少ない。
トロンビン受容体がトロンビン結合能を失ったトロンビ
ン受容体異常症においては血小板凝集能の低下および血
管への血小板の付着効果の低下が起こり、出血が続くこ
とにより貧血症などの出血性疾患を引き起こし、死に至
る危険性がある。ビタミンＫ製剤は、血中におけるトロ
ンビンの生産を増加させる薬剤であるため、トロンビン
受容体異常症に起因する出血性疾患に効果が少ない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、トロンビン
製剤、ビタミンＫ製剤、およびプラスミン阻害剤などの
既存の止血剤では十分に治療できない出血性疾患、例え
ば、血小板、血管組織におけるトロンビン受容体異常症
における血小板凝集能の低下および血管への血小板の付
着効果の低下による出血疾患を治療し、また、外科手術
時の異常出血の治療および白血球活性化による細菌感染
症を治療するためのペプチド及びこれを含有する薬剤の
提供を目的とする。
製剤、ビタミンＫ製剤、およびプラスミン阻害剤などの
既存の止血剤では十分に治療できない出血性疾患、例え
ば、血小板、血管組織におけるトロンビン受容体異常症
における血小板凝集能の低下および血管への血小板の付
着効果の低下による出血疾患を治療し、また、外科手術
時の異常出血の治療および白血球活性化による細菌感染
症を治療するためのペプチド及びこれを含有する薬剤の
提供を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らはペプチド、
ＳＦＬＬＲ(Ser-Phe-Leu-Leu-Arg) 、ＳＦＬＬＲＮＰ(S
er-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro) 、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤ(S
er-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp) を合成して調
べ、下記の性質を有することを見出した。
ＳＦＬＬＲ(Ser-Phe-Leu-Leu-Arg) 、ＳＦＬＬＲＮＰ(S
er-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro) 、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤ(S
er-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp) を合成して調
べ、下記の性質を有することを見出した。
【０００７】トロンビンと類似する作用： １）トロンビンと同様に血管内皮細胞からの、白血球、
単球の接着に関与するＥＬＡＭ−１等の接着分子を誘導
する。
単球の接着に関与するＥＬＡＭ−１等の接着分子を誘導
する。
【０００８】２）血管内皮細胞に対してトロンビンと同
様に作用して、ＰＡＩ［組織プラスミノーゲン活性化因
子（ｔＰＡ）を阻害する蛋白質］の産生を促進すること
により、出血の原因を遮断する。
様に作用して、ＰＡＩ［組織プラスミノーゲン活性化因
子（ｔＰＡ）を阻害する蛋白質］の産生を促進すること
により、出血の原因を遮断する。
【０００９】３）但し、フィブリン溶解蛋白質分解酵素
であるプラスミンを直接阻害する能力はもっていない
（即ち、抗プラスミン作用を持たない）。
であるプラスミンを直接阻害する能力はもっていない
（即ち、抗プラスミン作用を持たない）。
【００１０】トロンビンと異なる作用： ４）フィブリノーゲンをフィブリンに変換して凝固塊を
形成する作用を有しない。
形成する作用を有しない。
【００１１】５）プロテインＣを活性化しないため、凝
固系を阻害する作用を持たない。
固系を阻害する作用を持たない。
【００１２】なお、１４アミノ酸残基ペプチドでは、こ
れまで血管内皮細胞に作用して接着分子の発現やＰＡＩ
の生産亢進作用は見つかっていないため、これらは本発
明のペプチドの新規な性質である。
れまで血管内皮細胞に作用して接着分子の発現やＰＡＩ
の生産亢進作用は見つかっていないため、これらは本発
明のペプチドの新規な性質である。
【００１３】上記のペプチドは、血小板トロンビン受容
体のＮ末端の１４アミノ酸残基オリゴペプチド（ＳＦＬ
ＬＲＮＰＮＰＮＤＫＹＥＰＦ）のＣ末端のアミノ酸残基
を５〜９個削除したものである。なお、その際５個以下
の削除で生じるペプチドには好ましい生物学的活性は存
在せず、本発明のように短いペプチドにして初めて上記
性質が得られたことは予期に反することであった。
体のＮ末端の１４アミノ酸残基オリゴペプチド（ＳＦＬ
ＬＲＮＰＮＰＮＤＫＹＥＰＦ）のＣ末端のアミノ酸残基
を５〜９個削除したものである。なお、その際５個以下
の削除で生じるペプチドには好ましい生物学的活性は存
在せず、本発明のように短いペプチドにして初めて上記
性質が得られたことは予期に反することであった。
【００１４】また、上記ペプチドは共通の骨格ＳＦＬＬ
Ｒが各性質に寄与すると考えられる。したがって、３つ
のうち最も長いペプチドＳＦＬＬＲＮＰＮＤの、Ｃ末端
から１番目のＤ(Asp) から４番目のＮ(Asn) までの任意
のアミノ酸が削除され、または親水性もしくは疎水性、
酸性もしくは塩基性または分子構造の点で性質の類似す
る別のアミノ酸または修飾アミノ酸に置換されたペプチ
ドも、一般に同様の作用を有すると考えらる。そのよう
なペプチドも上記活性が保持される限り本発明の範囲内
である。類似のアミノ酸置換の例としては、アスパラギ
ン(Asn) とグルタミン（Gln)の交換、またはアスパラギ
ン酸(Asp) とグルタミン酸(Glu) の交換などである。ア
ミノ酸残基の修飾の例としては、メチル基またはナフチ
ル基で修飾されたアミノ酸が考えられる。
Ｒが各性質に寄与すると考えられる。したがって、３つ
のうち最も長いペプチドＳＦＬＬＲＮＰＮＤの、Ｃ末端
から１番目のＤ(Asp) から４番目のＮ(Asn) までの任意
のアミノ酸が削除され、または親水性もしくは疎水性、
酸性もしくは塩基性または分子構造の点で性質の類似す
る別のアミノ酸または修飾アミノ酸に置換されたペプチ
ドも、一般に同様の作用を有すると考えらる。そのよう
なペプチドも上記活性が保持される限り本発明の範囲内
である。類似のアミノ酸置換の例としては、アスパラギ
ン(Asn) とグルタミン（Gln)の交換、またはアスパラギ
ン酸(Asp) とグルタミン酸(Glu) の交換などである。ア
ミノ酸残基の修飾の例としては、メチル基またはナフチ
ル基で修飾されたアミノ酸が考えられる。
【００１５】本発明のペプチドは、市販の公知の方法で
容易に合成することができる。一例を述べれば、アプラ
イドバイオシステムズ(Applied Biosystems)社モデル43
0Aペプチド合成装置を使用し、保護アミノ酸を用いて固
相合成を行う。次に、ＨＥ法により樹脂からペプチドを
切り出すと同時に保護基を除去する。そして、イオン交
換および／またはゲル濾過等によるクロマトグラフィ
ー、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等
により目的のペプチドを分離、精製することができる。
本発明のペプチドは９以下のアミノ酸残基で構成され、
血小板トロンビン受容体のＮ末端の１４アミノ酸残基に
比べて小さいため、合成が容易で収率が良く、コスト面
からも安価に製造できる利点がある。
容易に合成することができる。一例を述べれば、アプラ
イドバイオシステムズ(Applied Biosystems)社モデル43
0Aペプチド合成装置を使用し、保護アミノ酸を用いて固
相合成を行う。次に、ＨＥ法により樹脂からペプチドを
切り出すと同時に保護基を除去する。そして、イオン交
換および／またはゲル濾過等によるクロマトグラフィ
ー、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等
により目的のペプチドを分離、精製することができる。
本発明のペプチドは９以下のアミノ酸残基で構成され、
血小板トロンビン受容体のＮ末端の１４アミノ酸残基に
比べて小さいため、合成が容易で収率が良く、コスト面
からも安価に製造できる利点がある。
【００１６】本発明は、上記ペプチドを単独でまたは他
の薬剤と共に有効成分として含有する治療剤にも関す
る。本発明の治療剤は種々の出血性疾患の治療に使用す
ることができる。
の薬剤と共に有効成分として含有する治療剤にも関す
る。本発明の治療剤は種々の出血性疾患の治療に使用す
ることができる。
【００１７】とりわけ、本発明の主眼は、ｔＰＡ阻害蛋
白質（ＰＡＩ）の産生を促進して種々の疾患を治療する
ための薬剤である。ＰＡＩ産生促進剤は、外科手術時に
組織からｔＰＡが遊離して引き起こされる異常出血の治
療や、トロンビン受容体異常における出血性疾患の治療
剤に使用される。トロンビン受容体異常症においてはト
ロンビン存在下においても刺激が伝達されず、トロンビ
ン刺激による血管内皮細胞でのＰＡＩ産生が起こらない
ため、本発明の治療剤が有効である。
白質（ＰＡＩ）の産生を促進して種々の疾患を治療する
ための薬剤である。ＰＡＩ産生促進剤は、外科手術時に
組織からｔＰＡが遊離して引き起こされる異常出血の治
療や、トロンビン受容体異常における出血性疾患の治療
剤に使用される。トロンビン受容体異常症においてはト
ロンビン存在下においても刺激が伝達されず、トロンビ
ン刺激による血管内皮細胞でのＰＡＩ産生が起こらない
ため、本発明の治療剤が有効である。
【００１８】さらに、本発明の治療剤は、トロンビンと
同様に、血管内皮細胞から白血球、単球の接着に係わる
ＥＬＡＭ−１等の接着分子を誘導して、血管内皮細胞と
白血球の相互作用を可能にし、白血球の活性化を引き起
こすことができる。この活性化による細菌の感染防御な
いし排除効果のため、本発明の治療剤は細菌感染などで
生じる出血性疾患および細菌感染症の治療にも顕著な効
果を奏する。
同様に、血管内皮細胞から白血球、単球の接着に係わる
ＥＬＡＭ−１等の接着分子を誘導して、血管内皮細胞と
白血球の相互作用を可能にし、白血球の活性化を引き起
こすことができる。この活性化による細菌の感染防御な
いし排除効果のため、本発明の治療剤は細菌感染などで
生じる出血性疾患および細菌感染症の治療にも顕著な効
果を奏する。
【００１９】さらにまた、本発明の治療剤は、トロンビ
ンその他の止血剤と同様に外科手術時の異常出血の治療
にも顕著な効果を奏する。また、トロンビンと併用すれ
ば異なる止血機序の組み合わせによる優れた止血効果が
期待できる。
ンその他の止血剤と同様に外科手術時の異常出血の治療
にも顕著な効果を奏する。また、トロンビンと併用すれ
ば異なる止血機序の組み合わせによる優れた止血効果が
期待できる。
【００２０】本発明の治療剤は、例えばＤＤＳ（ドラッ
グデリバリーシステム）を有する点滴剤または注射剤と
して、有効成分のペプチドを成人１日当たり２−１００
mg、１日１回ないし数回に分けて投与するために、単味
でまたは薬学的に受容可能な担体または助剤とともに製
剤される。
グデリバリーシステム）を有する点滴剤または注射剤と
して、有効成分のペプチドを成人１日当たり２−１００
mg、１日１回ないし数回に分けて投与するために、単味
でまたは薬学的に受容可能な担体または助剤とともに製
剤される。
【００２１】ここで使用される「薬学的に受容可能な担
体」とは、使用するペプチドの所望の生物学的活性を維
持し、そして不都合な毒性を持たない担体である。例と
しては、水、エタノール、エチレングリコール、ポリエ
チレングリコール等が挙げられる。
体」とは、使用するペプチドの所望の生物学的活性を維
持し、そして不都合な毒性を持たない担体である。例と
しては、水、エタノール、エチレングリコール、ポリエ
チレングリコール等が挙げられる。
【００２２】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに説明する
が、これらは例示的に示されるものであり、本発明の範
囲はこれらのみに限定されるものではない。
が、これらは例示的に示されるものであり、本発明の範
囲はこれらのみに限定されるものではない。
【００２３】実施例１ ペプチドＳＦＬＬＲＮＰＮＤの
合成 このペプチドは、アプライドバイオシステムズ(Applied
Biosystems)社モデル430Aペプチド合成装置を使用し、
Boc 法を用いて合成し精製された。
合成 このペプチドは、アプライドバイオシステムズ(Applied
Biosystems)社モデル430Aペプチド合成装置を使用し、
Boc 法を用いて合成し精製された。
【００２４】その分析特性は、以下のとおりである。
【００２５】性状：白色粉末 アミノ酸分析：６Ｎ塩酸、１１０℃、２２時間 Ａｓｐ( ３) 2.92，Ｓｅｒ( １) 0.86，Ｐｒｏ( １) 1.
00，Ｌｅｕ( ２) 2.01, Ｐｈｅ( １) 0.97，ＮＨ3(２)
2.10，Ａｒｇ( １) 0.98 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析 カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ａ−３０２，４．６ｍｍ
Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ 溶離液：０．１％ ＴＦＡ グラディエント：ＣＨ3ＣＮ １０％−６０％（２５
分） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ． 検出：２２０ｎｍ 純度：９８％ ＨＰＬＣの結果を図１に示す。
00，Ｌｅｕ( ２) 2.01, Ｐｈｅ( １) 0.97，ＮＨ3(２)
2.10，Ａｒｇ( １) 0.98 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析 カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ａ−３０２，４．６ｍｍ
Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ 溶離液：０．１％ ＴＦＡ グラディエント：ＣＨ3ＣＮ １０％−６０％（２５
分） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ． 検出：２２０ｎｍ 純度：９８％ ＨＰＬＣの結果を図１に示す。
【００２６】赤外吸収スペクトル分析 ＫＢｒ法を用いて分析した結果を図２に示す。
【００２７】実施例２ ペプチドＳＦＬＬＲＮＰの合成 このペプチドは実施例１と同じ方法により合成、精製そ
して分析された。
して分析された。
【００２８】その分析特性は、以下のとおりである。
【００２９】性状：白色粉末 アミノ酸分析：６Ｎ塩酸、１１０℃、２２時間 Ａｓｐ( １) 0.98，Ｓｅｒ( １) 0.86，Ｐｒｏ( １) 1.
00，Ｌｅｕ( ２) 2.01, Ｐｈｅ( １) 0.98，ＮＨ3( 1)
1.19，Ａｒｇ( １) 0.98 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析 カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ａ−３０２，４．６ｍｍ
Ｉ．Ｄ．＊１５０ｍｍ 溶離液：０．１％ ＴＦＡ グラディエント：ＣＨ3ＣＮ １０％−６０％（２５
分） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ． 検出：２２０ｎｍ 純度：９７％ ＨＰＬＣの結果を図３に示す。
00，Ｌｅｕ( ２) 2.01, Ｐｈｅ( １) 0.98，ＮＨ3( 1)
1.19，Ａｒｇ( １) 0.98 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析 カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ａ−３０２，４．６ｍｍ
Ｉ．Ｄ．＊１５０ｍｍ 溶離液：０．１％ ＴＦＡ グラディエント：ＣＨ3ＣＮ １０％−６０％（２５
分） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ． 検出：２２０ｎｍ 純度：９７％ ＨＰＬＣの結果を図３に示す。
【００３０】赤外吸収スペクトル分析 ＫＢｒ法を用いて分析した結果を図４に示す。
【００３１】実施例３ ペプチドＳＦＬＬＲの合成 このペプチドは実施例１と同じ方法により合成、精製そ
して分析された。
して分析された。
【００３２】その分析特性は、以下のとおりである。
【００３３】性状：白色粉末 アミノ酸分析：６Ｎ塩酸、１１０℃、２２時間 Ｓｅｒ( １) 0.88，Ｌｅｕ( ２) 2.06，Ｐｈｅ( １) 1.
00，Ａｒｇ( １) 1.00液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）分析 カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ａ−３０２，４．６ｍｍ
Ｉ．Ｄ．＊１５０ｍｍ 溶離液：０．１％ ＴＦＡ グラディエント：ＣＨ3ＣＮ １０％−６０％（２５
分） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ． 検出：２２０ｎｍ 純度：９７％ ＨＰＬＣの結果を図５に示す。
00，Ａｒｇ( １) 1.00液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）分析 カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ａ−３０２，４．６ｍｍ
Ｉ．Ｄ．＊１５０ｍｍ 溶離液：０．１％ ＴＦＡ グラディエント：ＣＨ3ＣＮ １０％−６０％（２５
分） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ． 検出：２２０ｎｍ 純度：９７％ ＨＰＬＣの結果を図５に示す。
【００３４】赤外吸収スペクトル分析 ＫＢｒ法を用いて分析した結果を図６に示す。
【００３５】実施例４ 血管内皮細胞のＰＡＩ産生に及
ぼす作用 （１）細胞培養および培地 ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびＥＧＭ−Ｕ
Ｖ培地は倉敷紡績（株）より購入した。３代目のＨＵＶ
ＥＣをコラーゲンコートした２４ウエルのプレートに
３．２×１０3 細胞ずつ接種し、５％ＣＯ2 存在下で３
７℃においてコンフルエントになるまで約１週間培養し
た。その間、２日または３日おきに培地交換を行った。
ぼす作用 （１）細胞培養および培地 ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびＥＧＭ−Ｕ
Ｖ培地は倉敷紡績（株）より購入した。３代目のＨＵＶ
ＥＣをコラーゲンコートした２４ウエルのプレートに
３．２×１０3 細胞ずつ接種し、５％ＣＯ2 存在下で３
７℃においてコンフルエントになるまで約１週間培養し
た。その間、２日または３日おきに培地交換を行った。
【００３６】（２）ｔＰＡおよびＰＡＩの測定 コンフルエントに培養したＨＵＶＥＣの培養液を交換
し、上記の合成ペプチド１６０μＭを加えて、５％ＣＯ
2 存在下３７℃で２４時間培養した。その後、培養上清
中のｔＰＡおよびＰＡＩの量をバイオプール(Biopool)
社製の Imulyse（商標名）PAI ELISA KIT を用いて測定
した。その結果を表１に示す。
し、上記の合成ペプチド１６０μＭを加えて、５％ＣＯ
2 存在下３７℃で２４時間培養した。その後、培養上清
中のｔＰＡおよびＰＡＩの量をバイオプール(Biopool)
社製の Imulyse（商標名）PAI ELISA KIT を用いて測定
した。その結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】このように、合成ペプチドＳＦＬＬＲＮＰ
ＮＤは、トロンビンと同じ作用を持つ１４残基のペプチ
ドＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＰＥＦと同様に、ＨＵＶＥＣ
におけるＰＡＩ放出量を顕著に増加させた。
ＮＤは、トロンビンと同じ作用を持つ１４残基のペプチ
ドＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＰＥＦと同様に、ＨＵＶＥＣ
におけるＰＡＩ放出量を顕著に増加させた。
【００３９】実施例５ 血管内皮細胞上の接着分子の測
定 血管内皮細胞上の接着分子の発現を、Ｃｅｌｌ ＥＬＩ
ＳＡ法により測定した。即ち、コンフルエントに培養し
たヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ（倉敷紡績（株）よ
り購入）の培養液を交換し、上記の合成ペプチド１６０
μＭを加え、５％ＣＯ2 存在下３７℃で６時間培養し
た。培養上清を取り除き、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢ
Ｓ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，８．
１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4 ，１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ）で
３回洗浄した後、２％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで
２０分間固定し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間ブロ
ッキングした。次に、抗ＥＬＡＭ−１マウスモノクロー
ナル抗体（一次抗体）０．５μｇ／ｍｌを加えて１時間
インキュベートし、ＰＢＳ洗浄後、ビオチン化抗マウス
ＩｇＧ抗体（二次抗体）を加えて３０分間、さらにＰＢ
Ｓ洗浄後、アビジンＤＨおよびビオチン化したペルオキ
シダーゼを加えて１時間インキュベートした。ＰＢＳ洗
浄後、ペルオキシダーゼの基質であるＡＢＴＳ［２，２
−アジノビス（３−エチルベンズチゾリンスルホン
酸）］を加えて発色反応させ、２０分後の吸光度（ＯＤ
405 ）を測定した。同時に一次抗体を加えないで、二次
抗体以降の反応を同じようにした場合の吸光度を測定し
て非特異的な結合による吸光度とし、サンプルの吸光度
から差し引いた値を求め、真の吸光度とした。その結果
を表２に示す。
定 血管内皮細胞上の接着分子の発現を、Ｃｅｌｌ ＥＬＩ
ＳＡ法により測定した。即ち、コンフルエントに培養し
たヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ（倉敷紡績（株）よ
り購入）の培養液を交換し、上記の合成ペプチド１６０
μＭを加え、５％ＣＯ2 存在下３７℃で６時間培養し
た。培養上清を取り除き、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢ
Ｓ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，８．
１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4 ，１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ）で
３回洗浄した後、２％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで
２０分間固定し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間ブロ
ッキングした。次に、抗ＥＬＡＭ−１マウスモノクロー
ナル抗体（一次抗体）０．５μｇ／ｍｌを加えて１時間
インキュベートし、ＰＢＳ洗浄後、ビオチン化抗マウス
ＩｇＧ抗体（二次抗体）を加えて３０分間、さらにＰＢ
Ｓ洗浄後、アビジンＤＨおよびビオチン化したペルオキ
シダーゼを加えて１時間インキュベートした。ＰＢＳ洗
浄後、ペルオキシダーゼの基質であるＡＢＴＳ［２，２
−アジノビス（３−エチルベンズチゾリンスルホン
酸）］を加えて発色反応させ、２０分後の吸光度（ＯＤ
405 ）を測定した。同時に一次抗体を加えないで、二次
抗体以降の反応を同じようにした場合の吸光度を測定し
て非特異的な結合による吸光度とし、サンプルの吸光度
から差し引いた値を求め、真の吸光度とした。その結果
を表２に示す。
【００４０】
【表２】 合成ペプチドによる接着分子の発現 -------------------------------------------------------------- ペプチド 吸光度（４０５ｎｍ） コントロール＊ ０．０２２±０．０１２ ＳＦＬＬＲ ０．０５０±０．００３ ＳＦＬＬＲＮＰ ０．０７０±０．００６ ＳＦＬＬＲＮＰＮＤ ０．１３４±０．０１２ ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ ０．０６７±０．０２９ -------------------------------------------------------------- ＊コントロールは、反応系にペプチドを加えなかった場合を示す。
【００４１】このように、合成ペプチドＳＦＬＬＲ、Ｓ
ＦＬＬＲＮＰ、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤは、１４残基のペプ
チドＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦと同様に、ＨＵＶＥ
Ｃ上での接着分子（ＥＬＡＭ−１）の発現を有意に増加
させることが証明された。
ＦＬＬＲＮＰ、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤは、１４残基のペプ
チドＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦと同様に、ＨＵＶＥ
Ｃ上での接着分子（ＥＬＡＭ−１）の発現を有意に増加
させることが証明された。
【００４２】
【発明の効果】本発明のペプチドは血管内皮細胞からの
接着分子を誘導し、プラスミンを阻害せずに血管内皮細
胞と白血球の相互作用によって白血球の活性化を引き起
こし、細菌の排除効果を有し、細菌の感染を防御する作
用と共にＰＡＩ（ｔＰＡ阻害因子）産生をもたらし、抗
出血作用を持つ。また本発明のペプチドは９以下のアミ
ノ酸残基で構成され、血小板トロンビン受容体のＮ末端
の１４アミノ酸残基に比べて小さいため、合成が容易で
収率が良く、コスト面からも安価に製造できる利点があ
る。
接着分子を誘導し、プラスミンを阻害せずに血管内皮細
胞と白血球の相互作用によって白血球の活性化を引き起
こし、細菌の排除効果を有し、細菌の感染を防御する作
用と共にＰＡＩ（ｔＰＡ阻害因子）産生をもたらし、抗
出血作用を持つ。また本発明のペプチドは９以下のアミ
ノ酸残基で構成され、血小板トロンビン受容体のＮ末端
の１４アミノ酸残基に比べて小さいため、合成が容易で
収率が良く、コスト面からも安価に製造できる利点があ
る。
【００４３】
配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Phe Leu Leu Arg ５ １ ５ 配列番号：２ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro ７ １ ５ 配列番号：３ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp ９ １ ５
【図１】図１は、実施例１のペプチドＳＦＬＬＲＮＰＮ
Ｄの合成におけるＨＰＬＣの結果である。
Ｄの合成におけるＨＰＬＣの結果である。
【図２】図２は、実施例１のペプチドＳＦＬＬＲＮＰＮ
ＤのＫＢｒ法を用いた分析結果である。
ＤのＫＢｒ法を用いた分析結果である。
【図３】図３は、実施例２のペプチドＳＦＬＬＲＮＰの
合成におけるＨＰＬＣの結果である。
合成におけるＨＰＬＣの結果である。
【図４】図４は、実施例２のペプチドＳＦＬＬＲＮＰの
ＫＢｒ法を用いた分析結果である。
ＫＢｒ法を用いた分析結果である。
【図５】図５は、実施例３のペプチドＳＦＬＬＲの合成
におけるＨＰＬＣの結果である。
におけるＨＰＬＣの結果である。
【図６】図６は、実施例３のペプチドＳＦＬＬＲのＫＢ
ｒ法を用いた分析結果である。
ｒ法を用いた分析結果である。
Claims (5)
- 【請求項１】式：ＳＦＬＬＲ(Ser-Phe-Leu-Leu-Arg) で
表されるペプチド。 - 【請求項２】式：ＳＦＬＬＲＮＰ(Ser-Phe-Leu-Leu-Arg
-Asn-Pro) で表されるペプチド。 - 【請求項３】式：ＳＦＬＬＲＮＰＮＤ(Ser-Phe-Leu-Leu
-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp) で表されるペプチド。 - 【請求項４】式：ＳＦＬＬＲＮＰＮＤ(Ser-Phe-Leu-Leu
-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp) で表されるペプチドの、Ｃ末端
から１番目のＤ(Asp) から４番目のＮ(Asn) までの任意
のアミノ酸が削除されまたは性質の類似する別のアミノ
酸に置換されたペプチド。 - 【請求項５】請求項１ないし４のいずれか１項に記載の
ペプチドを有効成分として含む、出血性疾患を治療する
ための医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4287360A JPH06135993A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | 止血作用および生体防御作用を有するペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4287360A JPH06135993A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | 止血作用および生体防御作用を有するペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06135993A true JPH06135993A (ja) | 1994-05-17 |
Family
ID=17716362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4287360A Pending JPH06135993A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | 止血作用および生体防御作用を有するペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06135993A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009039971A3 (en) * | 2007-09-11 | 2009-07-23 | Mondobiotech Lab Ag | Use of the peptide sfllr-oh and muramyl dipeptide as therapeutic agents |
-
1992
- 1992-10-26 JP JP4287360A patent/JPH06135993A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009039971A3 (en) * | 2007-09-11 | 2009-07-23 | Mondobiotech Lab Ag | Use of the peptide sfllr-oh and muramyl dipeptide as therapeutic agents |
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