JPH06135993A - 止血作用および生体防御作用を有するペプチド - Google Patents
止血作用および生体防御作用を有するペプチドInfo
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- JPH06135993A JPH06135993A JP4287360A JP28736092A JPH06135993A JP H06135993 A JPH06135993 A JP H06135993A JP 4287360 A JP4287360 A JP 4287360A JP 28736092 A JP28736092 A JP 28736092A JP H06135993 A JPH06135993 A JP H06135993A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】SFLLRまたはSFLLRNPまたはSFL
LRNPNDで表されるペプチド及び該ペプチドを含有
する治療剤。 【効果】上記ペプチドは血管内皮細胞からの接着分子を
誘導し、プラスミンを阻害せずに血管内皮細胞と白血球
の相互作用によって白血球の活性化を引き起こし、細菌
の排除効果を有し、細菌の感染を防御する作用と共にP
AI(tPA阻害因子)産生をもたらし、抗出血作用を
持つ。また9以下のアミノ酸残基で構成され、血小板ト
ロンビン受容体のN末端の14アミノ酸残基に比べて小
さいため、合成が容易で収率が良く、コスト面からも安
価に製造できる利点がある。
LRNPNDで表されるペプチド及び該ペプチドを含有
する治療剤。 【効果】上記ペプチドは血管内皮細胞からの接着分子を
誘導し、プラスミンを阻害せずに血管内皮細胞と白血球
の相互作用によって白血球の活性化を引き起こし、細菌
の排除効果を有し、細菌の感染を防御する作用と共にP
AI(tPA阻害因子)産生をもたらし、抗出血作用を
持つ。また9以下のアミノ酸残基で構成され、血小板ト
ロンビン受容体のN末端の14アミノ酸残基に比べて小
さいため、合成が容易で収率が良く、コスト面からも安
価に製造できる利点がある。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、トロンビン受容体異常
症に対する出血性疾患の治療および白血球活性化による
感染症疾患の治療に有効なペプチドおよび該ペプチドを
有効成分とする薬剤に関する。
症に対する出血性疾患の治療および白血球活性化による
感染症疾患の治療に有効なペプチドおよび該ペプチドを
有効成分とする薬剤に関する。
【0002】
【従来の技術】外傷あるいは外科手術時の出血に際して
は生理的に止血が起こるが、異常に出血し、止まらない
場合がある。そのような場合に止血機能を促進する薬剤
として、ビタミンK依存性の血液凝固因子の産生を促進
するためのビタミンK製剤(フィトナジオン、メナキノ
ン、メナジオン)がある。また、止血剤としてはトロン
ビンも代表的薬剤であり、および繊維素(フィブリン)
溶解酵素プラスミンの阻害薬も挙げられ[奥田拓道、高
田明和、前田浩編:病気を理解するための生理学・生化
学、225−247、1988年、金芳堂(東京)]、
例えばトラネキサム酸がしばしば用いられている。さら
に、血小板トロンビン受容体のN末端の14アミノ酸残
基を含むオリゴペプチド(SFLLRNPNPNDKY
EPF)にはトロンビンと同様の血小板凝集作用、即ち
止血作用があることが報告されている[T.−K.H.
Vu,D.T.Hung,V.I.Wheaton,a
ndS.R.Coughlin:Cell,64,10
57−1068,1991]。
は生理的に止血が起こるが、異常に出血し、止まらない
場合がある。そのような場合に止血機能を促進する薬剤
として、ビタミンK依存性の血液凝固因子の産生を促進
するためのビタミンK製剤(フィトナジオン、メナキノ
ン、メナジオン)がある。また、止血剤としてはトロン
ビンも代表的薬剤であり、および繊維素(フィブリン)
溶解酵素プラスミンの阻害薬も挙げられ[奥田拓道、高
田明和、前田浩編:病気を理解するための生理学・生化
学、225−247、1988年、金芳堂(東京)]、
例えばトラネキサム酸がしばしば用いられている。さら
に、血小板トロンビン受容体のN末端の14アミノ酸残
基を含むオリゴペプチド(SFLLRNPNPNDKY
EPF)にはトロンビンと同様の血小板凝集作用、即ち
止血作用があることが報告されている[T.−K.H.
Vu,D.T.Hung,V.I.Wheaton,a
ndS.R.Coughlin:Cell,64,10
57−1068,1991]。
【0003】なおトロンビンの止血作用の機序は、一般
に血小板凝集作用とフィブリン生成作用によるとされて
いる。また、ビタミンK製剤の止血作用の機序は、肝臓
におけるプロトロンビン、III 因子、IX因子、X因子な
どの血液凝固因子の産生を促進することによって血液凝
固を起こすためとされている[奥田拓道、高田明和、前
田浩編:病気を理解するための生理学・生化学、225
−247、1988年、金芳堂(東京)]。
に血小板凝集作用とフィブリン生成作用によるとされて
いる。また、ビタミンK製剤の止血作用の機序は、肝臓
におけるプロトロンビン、III 因子、IX因子、X因子な
どの血液凝固因子の産生を促進することによって血液凝
固を起こすためとされている[奥田拓道、高田明和、前
田浩編:病気を理解するための生理学・生化学、225
−247、1988年、金芳堂(東京)]。
【0004】しかしながら、血小板、血管組織における
トロンビン受容体がトロンビン結合能を失ったトロンビ
ン受容体異常症においては血小板凝集能の低下および血
管への血小板の付着効果の低下が起こり、出血が続くこ
とにより貧血症などの出血性疾患を引き起こし、死に至
る危険性がある。ビタミンK製剤は、血中におけるトロ
ンビンの生産を増加させる薬剤であるため、トロンビン
受容体異常症に起因する出血性疾患に効果が少ない。
トロンビン受容体がトロンビン結合能を失ったトロンビ
ン受容体異常症においては血小板凝集能の低下および血
管への血小板の付着効果の低下が起こり、出血が続くこ
とにより貧血症などの出血性疾患を引き起こし、死に至
る危険性がある。ビタミンK製剤は、血中におけるトロ
ンビンの生産を増加させる薬剤であるため、トロンビン
受容体異常症に起因する出血性疾患に効果が少ない。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、トロンビン
製剤、ビタミンK製剤、およびプラスミン阻害剤などの
既存の止血剤では十分に治療できない出血性疾患、例え
ば、血小板、血管組織におけるトロンビン受容体異常症
における血小板凝集能の低下および血管への血小板の付
着効果の低下による出血疾患を治療し、また、外科手術
時の異常出血の治療および白血球活性化による細菌感染
症を治療するためのペプチド及びこれを含有する薬剤の
提供を目的とする。
製剤、ビタミンK製剤、およびプラスミン阻害剤などの
既存の止血剤では十分に治療できない出血性疾患、例え
ば、血小板、血管組織におけるトロンビン受容体異常症
における血小板凝集能の低下および血管への血小板の付
着効果の低下による出血疾患を治療し、また、外科手術
時の異常出血の治療および白血球活性化による細菌感染
症を治療するためのペプチド及びこれを含有する薬剤の
提供を目的とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者らはペプチド、
SFLLR(Ser-Phe-Leu-Leu-Arg) 、SFLLRNP(S
er-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro) 、SFLLRNPND(S
er-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp) を合成して調
べ、下記の性質を有することを見出した。
SFLLR(Ser-Phe-Leu-Leu-Arg) 、SFLLRNP(S
er-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro) 、SFLLRNPND(S
er-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp) を合成して調
べ、下記の性質を有することを見出した。
【0007】トロンビンと類似する作用: 1)トロンビンと同様に血管内皮細胞からの、白血球、
単球の接着に関与するELAM−1等の接着分子を誘導
する。
単球の接着に関与するELAM−1等の接着分子を誘導
する。
【0008】2)血管内皮細胞に対してトロンビンと同
様に作用して、PAI[組織プラスミノーゲン活性化因
子(tPA)を阻害する蛋白質]の産生を促進すること
により、出血の原因を遮断する。
様に作用して、PAI[組織プラスミノーゲン活性化因
子(tPA)を阻害する蛋白質]の産生を促進すること
により、出血の原因を遮断する。
【0009】3)但し、フィブリン溶解蛋白質分解酵素
であるプラスミンを直接阻害する能力はもっていない
(即ち、抗プラスミン作用を持たない)。
であるプラスミンを直接阻害する能力はもっていない
(即ち、抗プラスミン作用を持たない)。
【0010】トロンビンと異なる作用: 4)フィブリノーゲンをフィブリンに変換して凝固塊を
形成する作用を有しない。
形成する作用を有しない。
【0011】5)プロテインCを活性化しないため、凝
固系を阻害する作用を持たない。
固系を阻害する作用を持たない。
【0012】なお、14アミノ酸残基ペプチドでは、こ
れまで血管内皮細胞に作用して接着分子の発現やPAI
の生産亢進作用は見つかっていないため、これらは本発
明のペプチドの新規な性質である。
れまで血管内皮細胞に作用して接着分子の発現やPAI
の生産亢進作用は見つかっていないため、これらは本発
明のペプチドの新規な性質である。
【0013】上記のペプチドは、血小板トロンビン受容
体のN末端の14アミノ酸残基オリゴペプチド(SFL
LRNPNPNDKYEPF)のC末端のアミノ酸残基
を5〜9個削除したものである。なお、その際5個以下
の削除で生じるペプチドには好ましい生物学的活性は存
在せず、本発明のように短いペプチドにして初めて上記
性質が得られたことは予期に反することであった。
体のN末端の14アミノ酸残基オリゴペプチド(SFL
LRNPNPNDKYEPF)のC末端のアミノ酸残基
を5〜9個削除したものである。なお、その際5個以下
の削除で生じるペプチドには好ましい生物学的活性は存
在せず、本発明のように短いペプチドにして初めて上記
性質が得られたことは予期に反することであった。
【0014】また、上記ペプチドは共通の骨格SFLL
Rが各性質に寄与すると考えられる。したがって、3つ
のうち最も長いペプチドSFLLRNPNDの、C末端
から1番目のD(Asp) から4番目のN(Asn) までの任意
のアミノ酸が削除され、または親水性もしくは疎水性、
酸性もしくは塩基性または分子構造の点で性質の類似す
る別のアミノ酸または修飾アミノ酸に置換されたペプチ
ドも、一般に同様の作用を有すると考えらる。そのよう
なペプチドも上記活性が保持される限り本発明の範囲内
である。類似のアミノ酸置換の例としては、アスパラギ
ン(Asn) とグルタミン(Gln)の交換、またはアスパラギ
ン酸(Asp) とグルタミン酸(Glu) の交換などである。ア
ミノ酸残基の修飾の例としては、メチル基またはナフチ
ル基で修飾されたアミノ酸が考えられる。
Rが各性質に寄与すると考えられる。したがって、3つ
のうち最も長いペプチドSFLLRNPNDの、C末端
から1番目のD(Asp) から4番目のN(Asn) までの任意
のアミノ酸が削除され、または親水性もしくは疎水性、
酸性もしくは塩基性または分子構造の点で性質の類似す
る別のアミノ酸または修飾アミノ酸に置換されたペプチ
ドも、一般に同様の作用を有すると考えらる。そのよう
なペプチドも上記活性が保持される限り本発明の範囲内
である。類似のアミノ酸置換の例としては、アスパラギ
ン(Asn) とグルタミン(Gln)の交換、またはアスパラギ
ン酸(Asp) とグルタミン酸(Glu) の交換などである。ア
ミノ酸残基の修飾の例としては、メチル基またはナフチ
ル基で修飾されたアミノ酸が考えられる。
【0015】本発明のペプチドは、市販の公知の方法で
容易に合成することができる。一例を述べれば、アプラ
イドバイオシステムズ(Applied Biosystems)社モデル43
0Aペプチド合成装置を使用し、保護アミノ酸を用いて固
相合成を行う。次に、HE法により樹脂からペプチドを
切り出すと同時に保護基を除去する。そして、イオン交
換および/またはゲル濾過等によるクロマトグラフィ
ー、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等
により目的のペプチドを分離、精製することができる。
本発明のペプチドは9以下のアミノ酸残基で構成され、
血小板トロンビン受容体のN末端の14アミノ酸残基に
比べて小さいため、合成が容易で収率が良く、コスト面
からも安価に製造できる利点がある。
容易に合成することができる。一例を述べれば、アプラ
イドバイオシステムズ(Applied Biosystems)社モデル43
0Aペプチド合成装置を使用し、保護アミノ酸を用いて固
相合成を行う。次に、HE法により樹脂からペプチドを
切り出すと同時に保護基を除去する。そして、イオン交
換および/またはゲル濾過等によるクロマトグラフィ
ー、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等
により目的のペプチドを分離、精製することができる。
本発明のペプチドは9以下のアミノ酸残基で構成され、
血小板トロンビン受容体のN末端の14アミノ酸残基に
比べて小さいため、合成が容易で収率が良く、コスト面
からも安価に製造できる利点がある。
【0016】本発明は、上記ペプチドを単独でまたは他
の薬剤と共に有効成分として含有する治療剤にも関す
る。本発明の治療剤は種々の出血性疾患の治療に使用す
ることができる。
の薬剤と共に有効成分として含有する治療剤にも関す
る。本発明の治療剤は種々の出血性疾患の治療に使用す
ることができる。
【0017】とりわけ、本発明の主眼は、tPA阻害蛋
白質(PAI)の産生を促進して種々の疾患を治療する
ための薬剤である。PAI産生促進剤は、外科手術時に
組織からtPAが遊離して引き起こされる異常出血の治
療や、トロンビン受容体異常における出血性疾患の治療
剤に使用される。トロンビン受容体異常症においてはト
ロンビン存在下においても刺激が伝達されず、トロンビ
ン刺激による血管内皮細胞でのPAI産生が起こらない
ため、本発明の治療剤が有効である。
白質(PAI)の産生を促進して種々の疾患を治療する
ための薬剤である。PAI産生促進剤は、外科手術時に
組織からtPAが遊離して引き起こされる異常出血の治
療や、トロンビン受容体異常における出血性疾患の治療
剤に使用される。トロンビン受容体異常症においてはト
ロンビン存在下においても刺激が伝達されず、トロンビ
ン刺激による血管内皮細胞でのPAI産生が起こらない
ため、本発明の治療剤が有効である。
【0018】さらに、本発明の治療剤は、トロンビンと
同様に、血管内皮細胞から白血球、単球の接着に係わる
ELAM−1等の接着分子を誘導して、血管内皮細胞と
白血球の相互作用を可能にし、白血球の活性化を引き起
こすことができる。この活性化による細菌の感染防御な
いし排除効果のため、本発明の治療剤は細菌感染などで
生じる出血性疾患および細菌感染症の治療にも顕著な効
果を奏する。
同様に、血管内皮細胞から白血球、単球の接着に係わる
ELAM−1等の接着分子を誘導して、血管内皮細胞と
白血球の相互作用を可能にし、白血球の活性化を引き起
こすことができる。この活性化による細菌の感染防御な
いし排除効果のため、本発明の治療剤は細菌感染などで
生じる出血性疾患および細菌感染症の治療にも顕著な効
果を奏する。
【0019】さらにまた、本発明の治療剤は、トロンビ
ンその他の止血剤と同様に外科手術時の異常出血の治療
にも顕著な効果を奏する。また、トロンビンと併用すれ
ば異なる止血機序の組み合わせによる優れた止血効果が
期待できる。
ンその他の止血剤と同様に外科手術時の異常出血の治療
にも顕著な効果を奏する。また、トロンビンと併用すれ
ば異なる止血機序の組み合わせによる優れた止血効果が
期待できる。
【0020】本発明の治療剤は、例えばDDS(ドラッ
グデリバリーシステム)を有する点滴剤または注射剤と
して、有効成分のペプチドを成人1日当たり2−100
mg、1日1回ないし数回に分けて投与するために、単味
でまたは薬学的に受容可能な担体または助剤とともに製
剤される。
グデリバリーシステム)を有する点滴剤または注射剤と
して、有効成分のペプチドを成人1日当たり2−100
mg、1日1回ないし数回に分けて投与するために、単味
でまたは薬学的に受容可能な担体または助剤とともに製
剤される。
【0021】ここで使用される「薬学的に受容可能な担
体」とは、使用するペプチドの所望の生物学的活性を維
持し、そして不都合な毒性を持たない担体である。例と
しては、水、エタノール、エチレングリコール、ポリエ
チレングリコール等が挙げられる。
体」とは、使用するペプチドの所望の生物学的活性を維
持し、そして不都合な毒性を持たない担体である。例と
しては、水、エタノール、エチレングリコール、ポリエ
チレングリコール等が挙げられる。
【0022】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに説明する
が、これらは例示的に示されるものであり、本発明の範
囲はこれらのみに限定されるものではない。
が、これらは例示的に示されるものであり、本発明の範
囲はこれらのみに限定されるものではない。
【0023】実施例1 ペプチドSFLLRNPNDの
合成 このペプチドは、アプライドバイオシステムズ(Applied
Biosystems)社モデル430Aペプチド合成装置を使用し、
Boc 法を用いて合成し精製された。
合成 このペプチドは、アプライドバイオシステムズ(Applied
Biosystems)社モデル430Aペプチド合成装置を使用し、
Boc 法を用いて合成し精製された。
【0024】その分析特性は、以下のとおりである。
【0025】性状:白色粉末 アミノ酸分析:6N塩酸、110℃、22時間 Asp( 3) 2.92,Ser( 1) 0.86,Pro( 1) 1.
00,Leu( 2) 2.01, Phe( 1) 0.97,NH3(2)
2.10,Arg( 1) 0.98 液体クロマトグラフィー(HPLC)分析 カラム:YMC Pack A−302,4.6mm
I.D.×150mm 溶離液:0.1% TFA グラディエント:CH3CN 10%−60%(25
分) 流速:1ml/min. 検出:220nm 純度:98% HPLCの結果を図1に示す。
00,Leu( 2) 2.01, Phe( 1) 0.97,NH3(2)
2.10,Arg( 1) 0.98 液体クロマトグラフィー(HPLC)分析 カラム:YMC Pack A−302,4.6mm
I.D.×150mm 溶離液:0.1% TFA グラディエント:CH3CN 10%−60%(25
分) 流速:1ml/min. 検出:220nm 純度:98% HPLCの結果を図1に示す。
【0026】赤外吸収スペクトル分析 KBr法を用いて分析した結果を図2に示す。
【0027】実施例2 ペプチドSFLLRNPの合成 このペプチドは実施例1と同じ方法により合成、精製そ
して分析された。
して分析された。
【0028】その分析特性は、以下のとおりである。
【0029】性状:白色粉末 アミノ酸分析:6N塩酸、110℃、22時間 Asp( 1) 0.98,Ser( 1) 0.86,Pro( 1) 1.
00,Leu( 2) 2.01, Phe( 1) 0.98,NH3( 1)
1.19,Arg( 1) 0.98 液体クロマトグラフィー(HPLC)分析 カラム:YMC Pack A−302,4.6mm
I.D.*150mm 溶離液:0.1% TFA グラディエント:CH3CN 10%−60%(25
分) 流速:1ml/min. 検出:220nm 純度:97% HPLCの結果を図3に示す。
00,Leu( 2) 2.01, Phe( 1) 0.98,NH3( 1)
1.19,Arg( 1) 0.98 液体クロマトグラフィー(HPLC)分析 カラム:YMC Pack A−302,4.6mm
I.D.*150mm 溶離液:0.1% TFA グラディエント:CH3CN 10%−60%(25
分) 流速:1ml/min. 検出:220nm 純度:97% HPLCの結果を図3に示す。
【0030】赤外吸収スペクトル分析 KBr法を用いて分析した結果を図4に示す。
【0031】実施例3 ペプチドSFLLRの合成 このペプチドは実施例1と同じ方法により合成、精製そ
して分析された。
して分析された。
【0032】その分析特性は、以下のとおりである。
【0033】性状:白色粉末 アミノ酸分析:6N塩酸、110℃、22時間 Ser( 1) 0.88,Leu( 2) 2.06,Phe( 1) 1.
00,Arg( 1) 1.00液体クロマトグラフィー(HPL
C)分析 カラム:YMC Pack A−302,4.6mm
I.D.*150mm 溶離液:0.1% TFA グラディエント:CH3CN 10%−60%(25
分) 流速:1ml/min. 検出:220nm 純度:97% HPLCの結果を図5に示す。
00,Arg( 1) 1.00液体クロマトグラフィー(HPL
C)分析 カラム:YMC Pack A−302,4.6mm
I.D.*150mm 溶離液:0.1% TFA グラディエント:CH3CN 10%−60%(25
分) 流速:1ml/min. 検出:220nm 純度:97% HPLCの結果を図5に示す。
【0034】赤外吸収スペクトル分析 KBr法を用いて分析した結果を図6に示す。
【0035】実施例4 血管内皮細胞のPAI産生に及
ぼす作用 (1)細胞培養および培地 ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)およびEGM−U
V培地は倉敷紡績(株)より購入した。3代目のHUV
ECをコラーゲンコートした24ウエルのプレートに
3.2×103 細胞ずつ接種し、5%CO2 存在下で3
7℃においてコンフルエントになるまで約1週間培養し
た。その間、2日または3日おきに培地交換を行った。
ぼす作用 (1)細胞培養および培地 ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)およびEGM−U
V培地は倉敷紡績(株)より購入した。3代目のHUV
ECをコラーゲンコートした24ウエルのプレートに
3.2×103 細胞ずつ接種し、5%CO2 存在下で3
7℃においてコンフルエントになるまで約1週間培養し
た。その間、2日または3日おきに培地交換を行った。
【0036】(2)tPAおよびPAIの測定 コンフルエントに培養したHUVECの培養液を交換
し、上記の合成ペプチド160μMを加えて、5%CO
2 存在下37℃で24時間培養した。その後、培養上清
中のtPAおよびPAIの量をバイオプール(Biopool)
社製の Imulyse(商標名)PAI ELISA KIT を用いて測定
した。その結果を表1に示す。
し、上記の合成ペプチド160μMを加えて、5%CO
2 存在下37℃で24時間培養した。その後、培養上清
中のtPAおよびPAIの量をバイオプール(Biopool)
社製の Imulyse(商標名)PAI ELISA KIT を用いて測定
した。その結果を表1に示す。
【0037】
【表1】
【0038】このように、合成ペプチドSFLLRNP
NDは、トロンビンと同じ作用を持つ14残基のペプチ
ドSFLLRNPNDKYPEFと同様に、HUVEC
におけるPAI放出量を顕著に増加させた。
NDは、トロンビンと同じ作用を持つ14残基のペプチ
ドSFLLRNPNDKYPEFと同様に、HUVEC
におけるPAI放出量を顕著に増加させた。
【0039】実施例5 血管内皮細胞上の接着分子の測
定 血管内皮細胞上の接着分子の発現を、Cell ELI
SA法により測定した。即ち、コンフルエントに培養し
たヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC(倉敷紡績(株)よ
り購入)の培養液を交換し、上記の合成ペプチド160
μMを加え、5%CO2 存在下37℃で6時間培養し
た。培養上清を取り除き、リン酸緩衝生理食塩液(PB
S,2.7mM KCl,137mM NaCl,8.
1mM Na2HPO4 ,1.5mM KH2PO4 )で
3回洗浄した後、2%ホルムアルデヒドを含むPBSで
20分間固定し、2%BSAを含むPBSで1時間ブロ
ッキングした。次に、抗ELAM−1マウスモノクロー
ナル抗体(一次抗体)0.5μg/mlを加えて1時間
インキュベートし、PBS洗浄後、ビオチン化抗マウス
IgG抗体(二次抗体)を加えて30分間、さらにPB
S洗浄後、アビジンDHおよびビオチン化したペルオキ
シダーゼを加えて1時間インキュベートした。PBS洗
浄後、ペルオキシダーゼの基質であるABTS[2,2
−アジノビス(3−エチルベンズチゾリンスルホン
酸)]を加えて発色反応させ、20分後の吸光度(OD
405 )を測定した。同時に一次抗体を加えないで、二次
抗体以降の反応を同じようにした場合の吸光度を測定し
て非特異的な結合による吸光度とし、サンプルの吸光度
から差し引いた値を求め、真の吸光度とした。その結果
を表2に示す。
定 血管内皮細胞上の接着分子の発現を、Cell ELI
SA法により測定した。即ち、コンフルエントに培養し
たヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC(倉敷紡績(株)よ
り購入)の培養液を交換し、上記の合成ペプチド160
μMを加え、5%CO2 存在下37℃で6時間培養し
た。培養上清を取り除き、リン酸緩衝生理食塩液(PB
S,2.7mM KCl,137mM NaCl,8.
1mM Na2HPO4 ,1.5mM KH2PO4 )で
3回洗浄した後、2%ホルムアルデヒドを含むPBSで
20分間固定し、2%BSAを含むPBSで1時間ブロ
ッキングした。次に、抗ELAM−1マウスモノクロー
ナル抗体(一次抗体)0.5μg/mlを加えて1時間
インキュベートし、PBS洗浄後、ビオチン化抗マウス
IgG抗体(二次抗体)を加えて30分間、さらにPB
S洗浄後、アビジンDHおよびビオチン化したペルオキ
シダーゼを加えて1時間インキュベートした。PBS洗
浄後、ペルオキシダーゼの基質であるABTS[2,2
−アジノビス(3−エチルベンズチゾリンスルホン
酸)]を加えて発色反応させ、20分後の吸光度(OD
405 )を測定した。同時に一次抗体を加えないで、二次
抗体以降の反応を同じようにした場合の吸光度を測定し
て非特異的な結合による吸光度とし、サンプルの吸光度
から差し引いた値を求め、真の吸光度とした。その結果
を表2に示す。
【0040】
【表2】 合成ペプチドによる接着分子の発現 -------------------------------------------------------------- ペプチド 吸光度(405nm) コントロール* 0.022±0.012 SFLLR 0.050±0.003 SFLLRNP 0.070±0.006 SFLLRNPND 0.134±0.012 SFLLRNPNDKYEPF 0.067±0.029 -------------------------------------------------------------- *コントロールは、反応系にペプチドを加えなかった場合を示す。
【0041】このように、合成ペプチドSFLLR、S
FLLRNP、SFLLRNPNDは、14残基のペプ
チドSFLLRNPNDKYEPFと同様に、HUVE
C上での接着分子(ELAM−1)の発現を有意に増加
させることが証明された。
FLLRNP、SFLLRNPNDは、14残基のペプ
チドSFLLRNPNDKYEPFと同様に、HUVE
C上での接着分子(ELAM−1)の発現を有意に増加
させることが証明された。
【0042】
【発明の効果】本発明のペプチドは血管内皮細胞からの
接着分子を誘導し、プラスミンを阻害せずに血管内皮細
胞と白血球の相互作用によって白血球の活性化を引き起
こし、細菌の排除効果を有し、細菌の感染を防御する作
用と共にPAI(tPA阻害因子)産生をもたらし、抗
出血作用を持つ。また本発明のペプチドは9以下のアミ
ノ酸残基で構成され、血小板トロンビン受容体のN末端
の14アミノ酸残基に比べて小さいため、合成が容易で
収率が良く、コスト面からも安価に製造できる利点があ
る。
接着分子を誘導し、プラスミンを阻害せずに血管内皮細
胞と白血球の相互作用によって白血球の活性化を引き起
こし、細菌の排除効果を有し、細菌の感染を防御する作
用と共にPAI(tPA阻害因子)産生をもたらし、抗
出血作用を持つ。また本発明のペプチドは9以下のアミ
ノ酸残基で構成され、血小板トロンビン受容体のN末端
の14アミノ酸残基に比べて小さいため、合成が容易で
収率が良く、コスト面からも安価に製造できる利点があ
る。
【0043】
配列番号:1 配列の長さ:5 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ser Phe Leu Leu Arg 5 1 5 配列番号:2 配列の長さ:7 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro 7 1 5 配列番号:3 配列の長さ:9 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp 9 1 5
【図1】図1は、実施例1のペプチドSFLLRNPN
Dの合成におけるHPLCの結果である。
Dの合成におけるHPLCの結果である。
【図2】図2は、実施例1のペプチドSFLLRNPN
DのKBr法を用いた分析結果である。
DのKBr法を用いた分析結果である。
【図3】図3は、実施例2のペプチドSFLLRNPの
合成におけるHPLCの結果である。
合成におけるHPLCの結果である。
【図4】図4は、実施例2のペプチドSFLLRNPの
KBr法を用いた分析結果である。
KBr法を用いた分析結果である。
【図5】図5は、実施例3のペプチドSFLLRの合成
におけるHPLCの結果である。
におけるHPLCの結果である。
【図6】図6は、実施例3のペプチドSFLLRのKB
r法を用いた分析結果である。
r法を用いた分析結果である。
Claims (5)
- 【請求項1】式:SFLLR(Ser-Phe-Leu-Leu-Arg) で
表されるペプチド。 - 【請求項2】式:SFLLRNP(Ser-Phe-Leu-Leu-Arg
-Asn-Pro) で表されるペプチド。 - 【請求項3】式:SFLLRNPND(Ser-Phe-Leu-Leu
-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp) で表されるペプチド。 - 【請求項4】式:SFLLRNPND(Ser-Phe-Leu-Leu
-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp) で表されるペプチドの、C末端
から1番目のD(Asp) から4番目のN(Asn) までの任意
のアミノ酸が削除されまたは性質の類似する別のアミノ
酸に置換されたペプチド。 - 【請求項5】請求項1ないし4のいずれか1項に記載の
ペプチドを有効成分として含む、出血性疾患を治療する
ための医薬組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4287360A JPH06135993A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | 止血作用および生体防御作用を有するペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4287360A JPH06135993A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | 止血作用および生体防御作用を有するペプチド |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06135993A true JPH06135993A (ja) | 1994-05-17 |
Family
ID=17716362
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4287360A Pending JPH06135993A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | 止血作用および生体防御作用を有するペプチド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH06135993A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009039971A3 (en) * | 2007-09-11 | 2009-07-23 | Mondobiotech Lab Ag | Use of the peptide sfllr-oh and muramyl dipeptide as therapeutic agents |
-
1992
- 1992-10-26 JP JP4287360A patent/JPH06135993A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009039971A3 (en) * | 2007-09-11 | 2009-07-23 | Mondobiotech Lab Ag | Use of the peptide sfllr-oh and muramyl dipeptide as therapeutic agents |
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