JPH0570498A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクローナル抗体の
抗原認識領域、特にそのＣＤＲを解明し、血清診断や臨
床応用等において有用な、ヒトＧＭＰ−１４０を特異的
に認識することのできるアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、及び塩基配列を提供する。 【構成】 ヒトのＧＭＰ−１４０を特異的に認識するこ
とができるポリペプチド、及びそれをコードする塩基配
列。配列表により特定した大別して２種類のポリペプチ
ドがある。 【効果】 ヒトＧＭＰ−１４０を認識するモノクローナ
ル抗体の抗原認識部位が特定され、該認識部位を含有す
るポリペプチドの遺伝子工学的製造手段が提供された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトのＧＭＰ−１４０を
特異的に認識することができるアミノ酸配列を有するポ
リペプチド及びそれをコードするＤＮＡ塩基配列に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】現在、ＧＭＰ−１４０に対するモノクロ
ーナル抗体は、血小板の活性化、血管内皮細胞の活性
化、炎症の発生機序などの基礎研究への利用の他に、血
清診断、標識化抗体による血栓炎症の画像診断、及び抗
血栓、抗炎症効果を有する抗体の生体への投与など臨床
応用も試みられている。ＧＭＰ−１４０に対するモノク
ローナル抗体はマクエバー（Ｒ．Ｐ．McEver）ら〔ジャ
ーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Bi
ol. Chem. ）第２５９巻、第９７９９頁（１９８４）〕
がＳ１２というクローンを、また、フューリエ（Ｂ．Fu
rie ）ら〔ジャーナル オブ バイオロジカルケミスト
リー、第２５９巻、第９１２１頁（１９８４）〕がＫＣ
４というクローンを発表して以来、種々のモノクローナ
ル抗体が開発されてきた。本発明者らは、特願平１−２
８７８６１号明細書に記載のようにＧＭＰ−１４０測定
に適した抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロナール抗体（Ｐ
Ｌ７−６、ＷＧＡ−１）産生株を樹立し、これらは微工
研菌寄第１１０７２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１０７２）及
び微工研菌寄第１１０７３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１０７
３）として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、該ＰＬ
７−６を始めとし、現在までＧＭＰ−１４０に対するモ
ノクローナル抗体を構成する軽鎖と重鎖、更には抗原を
特異的に認識し結合する機能を有する可変領域のアミノ
酸配列及び遺伝子構造については全く知られていない。
また、モノクローナル抗体産生細胞株は、一般に継代と
共にその抗体産生能の低下することが知られており、こ
の問題を解決するために抗体産生細胞の細胞クローニン
グや抗体遺伝子をクローニング後、遺伝子導入すること
によって大量発現させることなどが行われている。更に
最近ではマウス由来の可変領域及びヒトの定常部領域か
らなるキメラ抗体、二種の異った抗原特異性を有する双
特異キメラ抗体、一本鎖抗体、及び抗体活性をもつ単一
ＣＤＲ（相補性決定領域）に相当するオリゴペプチド等
の開発がなされている。このように、遺伝子工学的手法
による抗体の産生更に、改良抗体の開発において、その
遺伝子の分離更にアミノ酸配列を含めた構造の解明は必
須である。特に、抗体の特異性が可変領域の中でもＣＤ
Ｒという特定の領域に限定されることは当分野ではよく
知られていることで、例えば抗体の親和性を改良する目
的でＣＤＲのアミノ酸を置換することが広く行われてお
り、ＣＤＲのＤＮＡ塩基、アミノ酸配列の解明は特に重
要である。すなわち、本発明の目的は、抗ヒトＧＭＰ−
１４０モノクローナル抗体の抗原認識領域、特にそのＣ
ＤＲを解明し、血清診断や臨床応用等において有用な、
ヒトＧＭＰ−１４０を特異的に認識することのできるア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、及び塩基配列を提供
することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はヒトのＧＭＰ−１４０を特異的に認
識することができるポリペプチドに関し、下記一般式
（１）及び（２）から選択される。また、本発明の第２
の発明は第１の発明のポリペプチドをコードする塩基配
列に関する。 ＦＲ₁ −ＣＤＲ１Ｌ−ＦＲ₂ −ＣＤＲ２Ｌ−ＦＲ₃ −ＣＤＲ３Ｌ−ＦＲ₄ ・・・（１） （上式中ＦＲ₁ は２３〜２８個の、ＦＲ₂ は１４〜１６
個の、ＦＲ₃ は３０〜３４個の、ＦＲ₄ は９〜１１個の
それぞれ天然に存在するアミノ酸を含んで成るポリペプ
チド残基であり、ＣＤＲ１Ｌは配列表の配列番号１で、
ＣＤＲ２Ｌは配列表の配列番号２で、ＣＤＲ３Ｌは配列
表の配列番号３でそれぞれ表され、ここでアミノ酸Ｃｙ
ｓは酸化状態においてＳ−Ｓ架橋を形成していることが
ある）、 ＦＲ₅ −ＣＤＲ１Ｈ−ＦＲ₆ −ＣＤＲ２Ｈ−ＦＲ₇ −ＣＤＲ３Ｈ−ＦＲ₈ ・・・（２） （上式中ＦＲ₅ は２９〜３６個の、ＦＲ₆ は１０〜１６
個の、ＦＲ₇ は３２〜３５個の、ＦＲ₈ は１２〜１４個
のそれぞれ天然に存在するアミノ酸を含んで成るポリペ
プチド残基であり、ＣＤＲ１Ｈは配列表の配列番号４
で、ＣＤＲ２Ｈは配列表の配列番号５で、ＣＤＲ３Ｈは
配列表の配列番号６でそれぞれ表され、ここでアミノ酸
Ｃｙｓは酸化状態においてＳ−Ｓ架橋を形成しているこ
とがある）

【０００５】上記各式中ＦＲはフレームワーク領域を示
し、各ＦＲは天然に存在するアミノ酸及び修飾されたア
ミノ酸で構成されていればよいが、中でも最も好ましい
のはＦＲ₁ が一般式（３）： Ａ−Ｂ ・・・ （３） （上式中、Ａは水素、アシル基、又はＧｌｙ残基であ
り、Ｂは配列表の配列番号７で示されるものである）の
ポリペプチド残基、ＦＲ₂ が配列表の配列番号８で示さ
れるポリペプチド残基、ＦＲ₃ が配列表の配列番号９で
示されるポリペプチド残基、ＦＲ₄ が配列表の配列番号
１０で示されるポリペプチド残基、ＦＲ₅ が一般式
（４）： Ｃ−Ｄ ・・・ （４） （上式中、ＣはＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｐｙｒ、水素、アシル
化Ｇｌｕ又はアシル化Ｇｌｎであり、Ｄは配列表の配列
番号１１で示されるものである）のポリペプチド残基、
ＦＲ₆ が配列表の配列番号１２で示されるポリペプチド
残基、ＦＲ₇ が配列表の配列番号１３で示されるポリペ
プチド残基、ＦＲ₈ が配列表の配列番号１４で示される
ポリペプチド残基であり、ここでアミノ酸Ｃｙｓは酸化
状態においてＳ−Ｓ架橋を形成していることがある。

【０００６】本発明者らは、上記の点にかんがみ、鋭意
研究した結果、抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクローナル抗
体ＰＬ７−６のＣＤＲを含む可変領域をコードするｃＤ
ＮＡを分離し、該ＤＮＡ塩基配列を解明し、特にＣＤＲ
領域のアミノ酸配列を特定することで本発明を完成し
た。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
使用する抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクローナル抗体産生
細胞としては前記特願平１−２８７８６１号明細書記載
のハイブリドーマＰＬ７−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１１０７
３）がある。該細胞を培養し、細胞中より、ＲＮＡを調
製し、例えばオリゴテックス^TM−ｄＴ３０を用い、ｍＲ
ＮＡを精製することにより、抗体産生細胞のｍＲＮＡを
調製することができ、次に該ｍＲＮＡを逆転写すること
によって、ｃＤＮＡを調製することができる。ｃＤＮＡ
を合成する際に、例えばＷ．アルテンブルガー（Ｗ．Al
tenburger ）らの報告〔ヌクレイック アシツズ リサ
ーチ（ Nucleic Acids Research ）、第９巻、第９７１
〜９８１頁（１９８１）〕のＤＮＡ配列より軽鎖定常領
域側スペシフィックプライマー、例えば配列表の配列番
号１５のプライマー（Ｃ−１）を構築し、該プライマー
を用いｃＤＮＡ合成を行うことにより、効率よく抗体軽
鎖のｃＤＮＡを調製することができる。また、例えば
Ｄ．Ｌ．ロバート（Ｄ．Ｌ．Robert）らの報告〔ジーン
（ Gene ）、第８２巻、第３７１〜３７７頁（１９８
９）〕に記載されている配列表の配列番号１６に示す重
鎖定常領域側スペシフィックプライマー（Ｃ−３）を合
成し、該プライマーを用いｃＤＮＡ合成を行うことによ
り、効率よく、抗体重鎖のｃＤＮＡを調製することがで
きる。次にｃＤＮＡのクローニングを行えばよいが、ｃ
ＤＮＡのクローニングには、例えばＳ．サイキ（Ｓ．Sa
iki ）らのＰＣＲ〔サイエンス（ Science )、第２３０
巻、第１３５０〜１３５４頁（１９８５）〕を応用する
のが最も簡便である。ＰＣＲには例えば前記のプライマ
ーのＣ−１、及び前出ジーンに記載の配列表の配列番号
１７に示す軽鎖可変領域側ミックスプライマー（ＶＬ）
を合成して用い、目的のＤＮＡを増幅すればよい。また
必要に応じ、増幅ＤＮＡを２ｎｄＰＣＲを行えば、効率
良く微量のＤＮＡも増幅することができる。例えば前出
ジーンに記載の配列表の配列番号１８に示す軽鎖定常領
域側スペシフィックプライマー（Ｃ−２）を新たに合成
し、ミックスプライマーＶＬと２ｎｄＰＣＲを行うこと
により、目的の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを得る
ことができる。このとき、例えば前記アンテンブルガー
らの報告のＤＮＡ配列より、配列表の配列番号１９のプ
ローブ（ＬＰ）を構築し、合成プローブを用い、増幅Ｄ
ＮＡのサザンハイブリダイゼーションを行えば、目的Ｄ
ＮＡの増幅を確認することができる。抗体重鎖可変領域
をコードするＤＮＡは、ＰＣＲ用プライマーとして、例
えば前出ジーンに記載の配列表の配列番号２０に示す重
鎖可変領域側ミックスプライマー（ＶＨ）を合成し、前
出の定常領域側スペシフィックプライマー（Ｃ−３）と
ＰＣＲを行うことにより増幅でき、増幅ＤＮＡは、セル
（ Cell ）、第１８巻、第５５９〜５６８頁（１９７
９）、ヌクレイック アシッズ リサーチ、第９巻、第
１３６５〜１３８１頁（１９８１）、ネーチャー（ Nat
ure ）、第２８３巻、第７８６〜７８９頁（１９８０）
にそれぞれ記載のＤＮＡ配列より構築した配列表の配列
番号２１のプローブ（ＨＰ）により確認することができ
る。増幅されたＤＮＡは、例えばアガロースゲル電気泳
動後、ゲルから切り出し、精製後、ＤＮＡブランティン
グキット（宝酒造社）を用いて末端を平滑化し、例えば
ｐＵＣベクターのＨinc IIサイトにサブクローニング
し、ジデオキシ法によりシークエンシングすることによ
り、その塩基配列を決定することができる。前記一般式
（１）で表されるポリペプチドの１例のモノクローナル
抗体ＰＬ７−６軽鎖可変領域のアミノ酸配列及びその塩
基配列の１例を配列表の配列番号２２に示し、前記一般
式（２）で表されるポリペプチドの１例の該抗体重鎖可
変領域のアミノ酸配列及びその塩基配列の１例を配列表
の配列番号２３に示す。なお、本発明のポリペプチドを
コードする塩基配列とは、本発明のポリペプチドをコー
ドする塩基配列であればどのような塩基配列でもよい。
配列表の配列番号２２のＡｓｐ¹ −Ｃｙｓ²³は一般式
（１）のＦＲ₁ の一例、Ｌｙｓ²⁴−Ａｌａ⁴⁰はＣＤＲ１
Ｌ、Ｔｒｐ⁴¹−Ｖａｌ⁵⁴はＦＲ₂ の一例、Ｔｙｒ⁵⁵−Ｓ
ｅｒ⁶²はＣＤＲ２Ｌ、Ｇｌｙ⁶³−Ｃｙｓ⁹⁴はＦＲ₃ の一
例、Ｇｌｎ⁹⁵−Ｐｈｅ¹⁰⁴ はＣＤＲ３Ｌであり、Ｇｌｙ
¹⁰⁵ −Ｌｙｓ¹⁰³ がＦＲ₄ の一例である。また、配列表
の配列番号２３のＧｌｕ¹ −Ｐｈｅ²⁹は一般式（２）の
ＦＲ₅ の一例、Ｔｈｒ³⁰−Ｖａｌ³⁷はＣＤＲ１Ｈ、Ｌｙ
ｓ³⁸−Ｉｌｅ⁴⁸はＦＲ₆ の一例、Ｇｌｙ⁴⁹−Ｌｙｓ⁶³は
ＣＤＲ２Ｈ、Ｐｈｅ⁶⁴−Ｓｅｒ⁹⁸はＦＲ₇ の一例、Ｇｌ
ｙ⁹⁹−Ａｌａ¹⁰⁵ はＣＤＲ３Ｈ、Ｔｙｒ¹⁰⁶ −Ａｌａ
¹¹⁷ はＦＲ₈ の一例である。本発明者らは、特願平１−
２８７８６１号明細書に記載の方法でＰＬ７−６モノク
ローナル抗体を精製し、次にその軽鎖及び重鎖のＮ末端
アミノ酸配列を決定した。その配列を配列表の配列番号
２４、２５に示す。すなわち配列表の配列番号２４は軽
鎖可変領域のＮ末端アミノ酸配列、配列表の配列番号２
５は重鎖可変領域のＮ末端アミノ酸配列を示し、配列表
の配列番号２４は、配列表の配列番号２２の相当部位
に、配列表の配列番号２５は配列表の配列番号２３の相
当部位に一致する。

【０００８】本発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、あるいは例えば位置指定突然変異導入法等で改変し
た変異体ＤＮＡは遺伝子工学的な手法により、ベクター
例えばｐＳＶ２型ベクターに組込み、発現細胞例えばＳ
Ｐ２１０細胞を形質転換し、該ポリペプチド及びポリペ
プチド誘導体を得ることができる。また、同様な手法で
全遺伝子を決定し、本発明のポリペプチドを含む抗体を
生産することもできる。

【０００９】また、本発明に係るポリペプチドの誘導体
とは、例えば、ヒトＧＭＰ−１４０分子への認識特異性
を保有している断片、例えば一価のＦａｂ断片及び二価
の（Ｆａｂ′）₂ 断片、マウス−ヒトキメラモノクロー
ナル抗体、双特異性キメラ抗体、一本鎖抗体、酵素、蛍
光マーカー、金属キレート、細胞増殖抑制物質又は細胞
胞毒性物質、アビジン、ビオチン、抗血小板薬、血栓溶
解剤等との接合体、並びに放射能ラベル化抗体等であ
り、これらは、それぞれ公知の方法で調製し、目的に応
じ使用することができる。

【００１０】

【実施例】以下、本発明を実施例により、更に具体的に
説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもの
ではない。

【００１１】実施例１ ＰＬ７−６ハイブリドーマ細胞
からのｍＲＮＡ分画の単離、精製 培養したハイブリドーマ細胞（ＦＥＲＭ Ｐ−１１０７
３）からグアニジン−塩化セシウム法により全ＲＮＡを
調製し、オリゴテックス^TM−ｄＴ３０（宝酒造社）を用
いてｍＲＮＡを精製した。ＰＬ７−６ハイブリドーマ細
胞５×１０⁷ 個より全ＲＮＡ １２７μｇを得、精製後
約２３μｇのｍＲＮＡを得た。

【００１２】実施例２ ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成 上記ポリ（Ａ）−ｍＲＮＡ約２μｇより、アルシャム社
製ｃＤＮＡ合成キット（コード番号ＲＰＮ−１２５６）
を使って軽鎖定常領域側スペシフィックプライマーＣ−
１、又は重鎖定常領域側スペシフィックプライマーＣ−
３を用いて、逆転写し、ｃＤＮＡファーストストランド
を合成した。

【００１３】実施例３ ＰＣＲ法によるＰＬ７−６モノ
クローナル抗体軽鎖可変領域ｃＤＮＡのクローニング （１）ＰＣＲ法によるｃＤＮＡの増幅 上記合成したｃＤＮＡ １μｌ（約０．１μｇ）を０．
５ml用チューブに取り、ジーンアンプ^TMキット（宝酒造
社）中、１０μｌの１０倍濃縮増幅用緩衝液〔１００mM
トリス−ＨＣｌ： pH ８．３、５００mM ＫＣｌ、１５
mM ＭｇＣｌ₂ 、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン〕、１
６μｌの１．２５mM ｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ）、０．１μｇ（２０pmol）の
可変領域側ミックスプライマーＶＬ、０．１μｇ（２０
pmol）の定常領域側スペシフィックプライマーＣ−１、
０．５μｌの５ユニット／μｌアンプリタック^TM（宝酒
造社）を加え、滅菌水を加えて、１００μｌとし、１０
０μｌのミネラルオイル（シグマ社）を重層した後、自
動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社）によ
り増幅を行った。反応条件は、９４℃で３０秒間（熱変
性）→５５℃で２分間（アニーリング）→７２℃で１分
間（合成反応）のサイクルを２５サイクル行った。次に
上記反応液２μｌを０．５ml用チューブに取り、ジーン
アンプ^TMキット中、５μｌの１０倍濃縮増幅用緩衝液、
１６μｌの１．２５mM ｄＮＴＰ混合液、０．１μｇ
（２０pmol）の可変領域側ミックスプライマーＶＬ、
０．１μｇ（２０pmol）の定常領域側スペシフィックプ
ライマーＣ−２、０．５μｌの５ユニット／μｌのアン
プリタック^TMを加え、滅菌水を加えて１００μｌとし、
１００μｌのミネラルオイルを重層した後、上記と同一
の反応条件にて、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラ
ーにより増幅を行った。 （２）サザンハイブリダイゼーションによる軽鎖可変領
域ｃＤＮＡ増幅の確認 上記反応液を１０μｌ取り、１％アガロースゲル（宝酒
造社）にて電気泳動を行い、ナイロンメンブラン ハイ
ボンド（ Hybond ）−Ｎ（アマシャム社）を用いてサザ
ンハイブリダイゼーションを行った。プローブはプロー
ブＬＰ１０pmolをメガラベルキット（宝酒造社）を用い
〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰで末端標識したものを用いた。この
サザンハイブリダイゼーションの結果、ＰＬ７−６モノ
クローナル抗体、軽鎖可変領域ｃＤＮＡ約３８０ｂｐの
断片が増幅されていることが確認できた。 （３）サブクローニング及び配列決定 上記ＰＬ７−６モノクローナル抗体、軽鎖可変領域ｃＤ
ＮＡ断片をアガロースゲルから切り出し、精製した後、
ＤＮＡブランティングキット（宝酒造社）を用いて、末
端を平滑化し、ｐＵＣ１８ベクターのＨinc IIサイトに
サブクローニングし、ジデオキシ法によりシークエンシ
ングし、モノクローナル抗体ＰＬ７−６軽鎖可変領域ｃ
ＤＮＡの配列表の配列番号２２で示した３３９ｂｐの塩
基配列を決定した。

【００１４】実施例４ ＰＣＲ法によるＰＬ７−６モノ
クローナル抗体重鎖可変領域ｃＤＮＡのクローニング （１）ＰＣＲ法によるｃＤＮＡの増幅 上記合成したｃＤＮＡ １μｌ（約０．１μｇ）を０．
５ml用チューブに取り、ジーンアンプ^TMキット中、１０
μｌの１０倍濃縮増幅用緩衝液、１６μｌの１．２５mM
ｄＮＴＰ混合液、０．１μｇ（２０pmol）の可変領域
側ミックスプライマーＶＨ、０．１μｇ（２０pmol）の
定常領域側スペシフィックプライマーＣ−３、０．５μ
ｌの５ユニット／μｌアンプリタック^TMを加え、滅菌水
を加えて１００μｌとし、１００μｌのミネラルオイル
を重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー
により増幅を行った。 反応条件は、９４℃で３０秒間（熱変性）→５５℃で２
分間（アニーリング）→７２℃で１分間（合成反応）の
サイクルを２５サイクル行った。 （２）サザンハイブリダイゼーションによる重鎖可変領
域ｃＤＮＡ増幅の確認 上記反応液を１０μｌ取り、１％アガロースゲル（宝酒
造社）にて電気泳動を行い、ナイロンメンブラン ハイ
ボンド（ Hybond ）−Ｎ（アマシャム社）を用いてサザ
ンハイブリダイゼーションを行った。プローブはプロー
ブＨＰ１０pmolをメガラベルキット（宝酒造社）を用い
〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰで末端標識したものを用いた。この
サザンハイブリダイゼーションの結果、ＰＬ７−６モノ
クローナル抗体、重鎖可変領域ｃＤＮＡ約３９０ｂｐの
断片が増幅されていることが確認できた。 （３）サブクローニング及び配列決定 上記ＰＬ７−６モノクローナル抗体、重鎖可変領域ｃＤ
ＮＡ断片をアガロースゲルから切り出し、精製した後、
ＤＮＡブランティングキット（宝酒造社）を用いて、末
端を平滑化し、ｐＵＣ１８ベクターのＨinc IIサントに
サブクローニングし、ジデオキシ法によりシークエンシ
ングし、モノクローナル抗体ＰＬ７−６重鎖可変領域ｃ
ＤＮＡの配列表の配列番号２３で示した３５１ｂｐの塩
基配列を決定した。

【００１５】実施例５ ＰＬ７−６モノクローナル抗体
軽鎖可変領域Ｎ末端アミノ酸配列決定 （１）ＰＬ７−６モノクローナル抗体軽鎖及び重鎖の分
割、精製 メソッズ イン エンザイモロジー（ Methods in Enzy
mology )、第２５巻、第１８５頁（１９７２）に記載の
方法により、ＰＬ７−６モノクローナル抗体約４mgを塩
酸グアニジン存在下、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）に
より還元し、続いて、ヨードアセトアミドにより、遊離
のチオール基をカルボキシアミドメチル化することによ
り、保護し、軽鎖及び重鎖の分割を行った。次に、反応
液をセファデックスＧ−１００（ファルマシア社）ゲル
ろ過カラムクロマトグラフィーにかけ、１Ｍプロピオン
酸で溶出した。ＳＤＳ電気泳動により溶出画分をチェッ
クし、軽鎖及び重鎖の単一バンドを示す画分より、軽鎖
及び重鎖それぞれ約１mgを回収、精製した。 （２）軽鎖Ｎ末端アミノ酸配列決定 上記ＳＤＳ電気泳動において軽鎖単一バンドを示す画分
を０．１Ｍ酢酸で透析した後、濃縮し、ＳＤＳ電気泳動
を行い、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にウエス
タンブロッティングし、プロテインシークエンサー（ア
プライドバイオシステムズ社、モデル４７７Ａ）によ
り、配列表の配列番号２４に示す軽鎖可変領域Ｎ末端ア
ミノ酸配列を決定した。このアミノ酸配列は、配列表の
配列番号２２に示すＰＣＲ法により決定したｃＤＮＡ配
列に基づくアミノ酸配列によく一致した。

【００１６】実施例６ ＰＬ７−６モノクローナル抗体
重鎖可変領域Ｎ末端アミノ酸配列決定 （１）ＰＬ７−６モノクローナル抗体軽鎖及び重鎖の分
割、精製 上記実施例５−（１）の方法により、ＰＬ７−６モノク
ローナル抗体重鎖約１mgを得た。 （２）重鎖Ｎ末端アミノ酸配列決定 上記実施例５−（２）の方法により、配列表の配列番号
２５に示す重鎖可変領域Ｎ末端アミノ酸配列を決定し
た。このアミノ酸配列は配列表の配列番号２３に示すＰ
ＣＲ法により決定したｃＤＮＡ配列に基づくアミノ酸配
列によく一致した。

【００１７】

【発明の効果】本発明により、ヒトＧＭＰ−１４０を認
識するモノクローナル抗体の抗原認識部位が特定され、
該認識部位を含有するポリペプチドの遺伝子工学的製造
手段が提供された。

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lsy Asn Tyr 1 5 10 15 Leu Ala 配列番号：2 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 配列番号：3 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe 1 5 10 配列番号：4 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val 1 5 配列番号：5 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Gly Tyr Ile Asn Pro Gly Thr Ala Tyr Thr Glu His Asn Glu Lys 1 5 10 15 配列番号：6 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Gly Asn Pro Ala Trp Phe Ala 1 5 配列番号：7 配列の長さ：23 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Asp Ile Val Leu Ala Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Val 1 5 10 15 Gly Gln Lys Val Thr Met Ser Cys 20 配列番号：8 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Val 1 5 10 配列番号：9 配列の長さ：32 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 20 25 30 Phe Cys 配列番号：10 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 配列番号：11 配列の長さ：28 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Thr Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Asn Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 20 25 配列番号：12 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu GluTrp Ile 1 5 10 配列番号：13 配列の長さ：35 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 1 5 10 15 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 20 25 30 Tyr Tyr Cys Ala Ser 35 配列番号：14 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 配列の特徴：1-20 primer 配列： CCAGATGTTA ACTGCTCACT 20 配列番号：16 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 配列の特徴：1-14 primer 配列： GGCCAGTGGA TAGA 14 配列番号：17 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴：1-26 primer 配列： GAYATYGTSC TBACHCARTC NCCAGC 26 配列番号：18 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 配列の特徴：1-14 primer 配列： TGGTGGGAAG ATGG 14 配列番号：19 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴：1-20 probe 配列： TACAGTTGGT GCAGCATCAG 20 配列番号：20 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴：1-29 primer 配列： GARGTVCAGC TVCAGCARTC NGGMGCMGA 29 配列番号：21 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴：1-22 probe 配列： CHGATGGGGS TGTYGTTTTG GC 22 配列番号：22 配列の長さ：339 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴： 1-339 E CDS（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクローナル
抗体） 配列： GAT ATT GTC CTT GCT CAA TCA CCA GCC TCC CTG GCT ATG TCA GTA 45 Asp Ile Val Leu Ala Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Val 5 10 15 GGA CAG AAG GTC ACT ATG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGC CTT TTA 90 Gly Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu 20 25 30 AAT AGT AGC AAT CAA AAG AAC TAT TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAA 135 Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40 45 CCA GGA CAG TCT CCT AAA CTT CTG GTA TAC TTT GCA TCC ACT AGG 180 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg 50 55 60 GAA TCT GGG GTC CCT GAT CGC TTC ATA GGC AGT GGA TCT GGG ACA 225 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr 65 70 75 GAT TTC ACT CTT ACC GTC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTA GCA 270 Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala 80 85 90 GAT TAC TTC TGT CAG CAA CAT TAT AGC ACT CCT CGG ACG TTC GGT 315 Asp Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly 95 100 105 GGA GGC ACC AAG CTG GAG ATC AAA 339 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 110 配列番号：23 配列の長さ：351 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴：1-351 E CDS（抗ヒトＧＭＰ−１４０モ
ノクローナル抗体） 配列： GAG GTC CAG CTC CAG CAG TCC GGA GCC GAA CTG ACA AAA CCT GGG 45 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Thr Lys Pro Gly 1 5 10 15 GCC TCA GTG AAT ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT ACT 90 Ala Ser Var Asn Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 AGC TAC TGG ATG CAC TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTG 135 Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 35 40 45 GAA TGG ATT GGA TAC ATT AAT CCT GGC ACT GCT TAT ACT GAG CAC 180 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Gly Thr Ala Tyr Thr Glu His 50 55 60 AAT CAG AAG TTC AAG GAC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAC AAG TCC 225 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 65 70 75 TCC AGC ACA GCC TAC ATG CAA CTG AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC 270 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90 TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGT GGT AAC CCC GCC TGG TTT GCT 315 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asn Pro Ala Trp Phe Ala 95 100 105 TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 351 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115 配列番号：24 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｎ末端フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Asp Ile Val Xaa Xaa Gln Ser Pro Xaa Ser Leu Ala Met Ser Val 5 10 15 Gly Gln Lys Val Thr Met 20 配列番号：25 配列の長さ：27 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｎ末端フラグメント（抗ヒトＧＭＰ−１４０モノクロー
ナル抗体） 配列： Xaa Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Thr Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Xaa Met Ser Xaa Lys Ala Ser Gly Tyr 20 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（１）及び一般式（２）より
   選択され、ヒトのＧＭＰ−１４０を特異的に認識するこ
   とができるものであることを特徴とするポリペプチド。 ＦＲ₁ −ＣＤＲ１Ｌ−ＦＲ₂ −ＣＤＲ２Ｌ−ＦＲ₃ −ＣＤＲ３Ｌ−ＦＲ₄ ・・・（１） （上式中ＦＲ₁ は２３〜２８個の、ＦＲ₂ は１４〜１６
   個の、ＦＲ₃ は３０〜３４個の、ＦＲ₄ は９〜１１個の
   それぞれ天然に存在するアミノ酸を含んで成るポリペプ
   チド残基であり、ＣＤＲ１Ｌは配列表の配列番号１で、
   ＣＤＲ２Ｌは配列表の配列番号２で、ＣＤＲ３Ｌは配列
   表の配列番号３でそれぞれ表され、ここでアミノ酸Ｃｙ
   ｓは酸化状態においてＳ−Ｓ架橋を形成していることが
   ある）、 ＦＲ₅ −ＣＤＲ１Ｈ−ＦＲ₆ −ＣＤＲ２Ｈ−ＦＲ₇ −ＣＤＲ３Ｈ−ＦＲ₈ ・・・（２） （上式中ＦＲ₅ は２９〜３６個の、ＦＲ₆ は１０〜１６
   個の、ＦＲ₇ は３２〜３５個の、ＦＲ₈ は１２〜１４個
   のそれぞれ天然に存在するアミノ酸を含んで成るポリペ
   プチド残基であり、ＣＤＲ１Ｈは配列表の配列番号４
   で、ＣＤＲ２Ｈは配列表の配列番号５で、ＣＤＲ３Ｈは
   配列表の配列番号６でそれぞれ表され、ここでアミノ酸
   Ｃｙｓは酸化状態においてＳ−Ｓ架橋を形成しているこ
   とがある）
2. 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   る塩基配列。