JPH0568542A - アルコール脱水素酵素およびその製造法 - Google Patents
アルコール脱水素酵素およびその製造法Info
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- JPH0568542A JPH0568542A JP3233081A JP23308191A JPH0568542A JP H0568542 A JPH0568542 A JP H0568542A JP 3233081 A JP3233081 A JP 3233081A JP 23308191 A JP23308191 A JP 23308191A JP H0568542 A JPH0568542 A JP H0568542A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 広い基質特異性を有する新規なＮＡＤ非依存
型アルコール脱水素酵素およびその製造法の提供。 【構成】 ヒドロキシメチル基を持つ化合物のヒドロキ
シメチル基のアルデヒド基への酸化を触媒する酵素分子
中に希土類元素を含むＮＡＤ非依存型アルコール脱水素
酵素、および当該酵素の産生能を有するシュードグルコ
ノバクターに属する微生物およびその変異株を培養し、
生産された酵素を単離精製することを特徴とする該酵素
の製造法。
型アルコール脱水素酵素およびその製造法の提供。 【構成】 ヒドロキシメチル基を持つ化合物のヒドロキ
シメチル基のアルデヒド基への酸化を触媒する酵素分子
中に希土類元素を含むＮＡＤ非依存型アルコール脱水素
酵素、および当該酵素の産生能を有するシュードグルコ
ノバクターに属する微生物およびその変異株を培養し、
生産された酵素を単離精製することを特徴とする該酵素
の製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、広い基質特異性を有す
る新規なＮＡＤ非依存型アルコ−ル脱水素酵素およびそ
の製造法に関する。
る新規なＮＡＤ非依存型アルコ−ル脱水素酵素およびそ
の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物由来のヒドロキシメチル基のカル
ボキシル基への酸化を触媒するＮＡＤやＮＡＤＰＨのよ
うな補酵素非依存性の脱水素酵素については、例えば、
アセトバクター属細菌［アグリカルチュラル・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、第４２巻、２３３１項（１９７８）］、グルコ
ノバクター属細菌［アグリカルチュラル・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、第４２巻、２０４５項（１９７８）］あるいは
シュ−ドモナス属細菌等のアルコール脱水素酵素［例え
ば、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．）、第２２３巻、９２１項、（１９８４）］、メタ
ノール細菌のメタノール脱水素酵素［アグリカルチュラ
ル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第５４巻、３１２３項（１９９
０）］等が知られているが、これらはいずれもその基質
特異性が限られておりメタノール、エタノール等のアル
コール類以外に作用するという報告はない。一方、Ｄ−
ソルビトール、Ｌ−ソルボース（以下、これを単にソル
ボースと称することがある）等の糖類に作用してそのヒ
ドロキシメチル基のアルデヒド基への酸化を触媒する脱
水素酵素としては、グルコノバクター属細菌のＤ−ソル
ビトール脱水素酵素［アグリカルチュラル・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、第４６巻、１３５項（１９８２）］、ソルボー
ス脱水素酵素［アグリカルチュラル・バイオロジカル・
ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、
第５５巻、３６３項、（１９９１）］、グルコ−ス脱水
素酵素［アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第４４
巻、１５０５項（１９８０）］等が知られているが、こ
れらの糖類に作用する脱水素酵素がメタノール、エタノ
ール等のアルコール類に作用するという報告はない。こ
れらはいずれもその基質特異性が限られており、汎用性
という面からは不十分である。また、従来、酵素が金属
により誘導される例はいくつか知られているが、希土類
元素により特異的に誘導合成される酵素については報告
がなかった。
ボキシル基への酸化を触媒するＮＡＤやＮＡＤＰＨのよ
うな補酵素非依存性の脱水素酵素については、例えば、
アセトバクター属細菌［アグリカルチュラル・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、第４２巻、２３３１項（１９７８）］、グルコ
ノバクター属細菌［アグリカルチュラル・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、第４２巻、２０４５項（１９７８）］あるいは
シュ−ドモナス属細菌等のアルコール脱水素酵素［例え
ば、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．）、第２２３巻、９２１項、（１９８４）］、メタ
ノール細菌のメタノール脱水素酵素［アグリカルチュラ
ル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第５４巻、３１２３項（１９９
０）］等が知られているが、これらはいずれもその基質
特異性が限られておりメタノール、エタノール等のアル
コール類以外に作用するという報告はない。一方、Ｄ−
ソルビトール、Ｌ−ソルボース（以下、これを単にソル
ボースと称することがある）等の糖類に作用してそのヒ
ドロキシメチル基のアルデヒド基への酸化を触媒する脱
水素酵素としては、グルコノバクター属細菌のＤ−ソル
ビトール脱水素酵素［アグリカルチュラル・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、第４６巻、１３５項（１９８２）］、ソルボー
ス脱水素酵素［アグリカルチュラル・バイオロジカル・
ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、
第５５巻、３６３項、（１９９１）］、グルコ−ス脱水
素酵素［アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第４４
巻、１５０５項（１９８０）］等が知られているが、こ
れらの糖類に作用する脱水素酵素がメタノール、エタノ
ール等のアルコール類に作用するという報告はない。こ
れらはいずれもその基質特異性が限られており、汎用性
という面からは不十分である。また、従来、酵素が金属
により誘導される例はいくつか知られているが、希土類
元素により特異的に誘導合成される酵素については報告
がなかった。
【０００３】一方、本発明者らは、ライヒシュタイン法
［ヘルベチカ・キミカ・アクタ（Helvetica Chimica Ac
ta）、第１７巻、３１１項、１９３４参照］に替わる工
業的に有利なＬ−アスコルビン酸生産法について種々検
討を行い、既にシュードグルコノバクター・サッカロケ
トゲネスと名付けた土壌分離細菌がＬ−ソルボースから
著量の２−ケト−Ｌ−グロン酸（以下、２ＫＧＡと称す
ることもある）を生成することを見いだしている（特開
昭６２−２２８２８７号参照）。さらに、この方法の改
良研究中に、図らずも、希土類元素を培地中に添加して
本菌を培養すると、Ｌ−ソルボースからの２ーケトーＬ
−グロン酸生成収率が著しく改善されることを見いだし
ている（特開昭６４−８５０８８号参照）。
［ヘルベチカ・キミカ・アクタ（Helvetica Chimica Ac
ta）、第１７巻、３１１項、１９３４参照］に替わる工
業的に有利なＬ−アスコルビン酸生産法について種々検
討を行い、既にシュードグルコノバクター・サッカロケ
トゲネスと名付けた土壌分離細菌がＬ−ソルボースから
著量の２−ケト−Ｌ−グロン酸（以下、２ＫＧＡと称す
ることもある）を生成することを見いだしている（特開
昭６２−２２８２８７号参照）。さらに、この方法の改
良研究中に、図らずも、希土類元素を培地中に添加して
本菌を培養すると、Ｌ−ソルボースからの２ーケトーＬ
−グロン酸生成収率が著しく改善されることを見いだし
ている（特開昭６４−８５０８８号参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記のごとく、従来酵
素が金属元素によって誘導生産される例は種々知られて
いるが、希土類元素については全く報告がなかった。か
くして、本発明の目的は、工業的に有用な広い基質特異
性を有する、希土類元素により誘導される新規なアルコ
−ル脱水素酵素およびその製造法を提供することにあ
る。
素が金属元素によって誘導生産される例は種々知られて
いるが、希土類元素については全く報告がなかった。か
くして、本発明の目的は、工業的に有用な広い基質特異
性を有する、希土類元素により誘導される新規なアルコ
−ル脱水素酵素およびその製造法を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成すべく希土類元素の培地中への添加について鋭意研
究を重ねた結果、上記シュードグルコノバクター・サッ
カロケトゲネスが新規なアルコール脱水素酵素を生産す
ること、該酵素が本菌株による２ＫＧＡ発酵の中心的な
働きをすること、および本菌株を培養するに当たり、培
地中に希土類元素を存在せしめることにより当該酵素が
著しく誘導生産されることを見いだし、さらに検討を重
ねて本発明を完成した。すなわち、本発明は、 （１）ヒドロキシメチル基を持つ化合物のヒドロキシメ
チル基のアルデヒド基への酸化を触媒する酵素分子中に
希土類元素を含むＮＡＤ非依存型アルコール脱水素酵
素、 （２）下記の理化学的性質を有する上記（１）記載のア
ルコール脱水素酵素、 至適ｐＨ ３.５〜６.５ 至適温度 ４０〜５０℃ 等電点 ４.２±０.５ 分子構造 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで６４０００±５０
００の分子量のポリペプチドまたはこのポリペプチド２
分子よりなる２量体 （３）シュードグルコノバクター（Pseudogluconobacte
r）に属する微生物が生産する上記（１）記載のアルコ
ール脱水素酵素、 （４）希土類元素によって誘導生産される上記（２）記
載のアルコール脱水素酵素、 （５）ヒドロキシメチル基を持つ化合物のヒドロキシメ
チル基のアルデヒド基への酸化を触媒する酵素分子中に
希土類元素を含むＮＡＤ非依存型アルコール脱水素酵素
産生能を有するシュードグルコノバクターに属する微生
物およびその変異株を培養し、生産された該アルコール
脱水素酵素を単離精製することを特徴とする上記（１）
記載のアルコール脱水素酵素の製造法、および （６）培地中に希土類元素を存在させることを特徴とす
る上記（５）記載の製造法を提供するものである。
達成すべく希土類元素の培地中への添加について鋭意研
究を重ねた結果、上記シュードグルコノバクター・サッ
カロケトゲネスが新規なアルコール脱水素酵素を生産す
ること、該酵素が本菌株による２ＫＧＡ発酵の中心的な
働きをすること、および本菌株を培養するに当たり、培
地中に希土類元素を存在せしめることにより当該酵素が
著しく誘導生産されることを見いだし、さらに検討を重
ねて本発明を完成した。すなわち、本発明は、 （１）ヒドロキシメチル基を持つ化合物のヒドロキシメ
チル基のアルデヒド基への酸化を触媒する酵素分子中に
希土類元素を含むＮＡＤ非依存型アルコール脱水素酵
素、 （２）下記の理化学的性質を有する上記（１）記載のア
ルコール脱水素酵素、 至適ｐＨ ３.５〜６.５ 至適温度 ４０〜５０℃ 等電点 ４.２±０.５ 分子構造 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで６４０００±５０
００の分子量のポリペプチドまたはこのポリペプチド２
分子よりなる２量体 （３）シュードグルコノバクター（Pseudogluconobacte
r）に属する微生物が生産する上記（１）記載のアルコ
ール脱水素酵素、 （４）希土類元素によって誘導生産される上記（２）記
載のアルコール脱水素酵素、 （５）ヒドロキシメチル基を持つ化合物のヒドロキシメ
チル基のアルデヒド基への酸化を触媒する酵素分子中に
希土類元素を含むＮＡＤ非依存型アルコール脱水素酵素
産生能を有するシュードグルコノバクターに属する微生
物およびその変異株を培養し、生産された該アルコール
脱水素酵素を単離精製することを特徴とする上記（１）
記載のアルコール脱水素酵素の製造法、および （６）培地中に希土類元素を存在させることを特徴とす
る上記（５）記載の製造法を提供するものである。
【０００６】本発明のアルコール脱水素酵素の基質とな
るヒドロキシメチル基を持つ化合物としては、Ｌ−ソル
ボース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、スクロー
ス、α−メチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−
β−Ｄ−グルコシド、マルトトリオース、グリセルアル
デヒド、キシロース、デンプンのような単糖類、少糖
類、多糖類を含む種々の糖、Ｄ−ソルビトール、キシリ
トール、Ｄ−マンニトール、マルチトール、ガラクチト
ールのような糖アルコール、メタノール、エタノール、
プロパノールのようなアルコール、エチレングリコール
のようなグリコール類、Ｄ−グルコン酸、２−ケト−Ｄ
−グルコン酸（以下、２ＫＧＬと称す）、２−ケト−Ｌ
−グロン酸（以下、２ＫＧＡと称す）、５−ケト−Ｄ−
グルコン酸（以下、５ＫＧＬと称す）、Ｄ−グルクロン
酸、Ｄ−グルロン酸のような糖酸およびこれらの塩、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒド
ロキシメチル）ニトロメタン、レチノール、３−デヒド
ロレチノール等が挙げられる。
るヒドロキシメチル基を持つ化合物としては、Ｌ−ソル
ボース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、スクロー
ス、α−メチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−
β−Ｄ−グルコシド、マルトトリオース、グリセルアル
デヒド、キシロース、デンプンのような単糖類、少糖
類、多糖類を含む種々の糖、Ｄ−ソルビトール、キシリ
トール、Ｄ−マンニトール、マルチトール、ガラクチト
ールのような糖アルコール、メタノール、エタノール、
プロパノールのようなアルコール、エチレングリコール
のようなグリコール類、Ｄ−グルコン酸、２−ケト−Ｄ
−グルコン酸（以下、２ＫＧＬと称す）、２−ケト−Ｌ
−グロン酸（以下、２ＫＧＡと称す）、５−ケト−Ｄ−
グルコン酸（以下、５ＫＧＬと称す）、Ｄ−グルクロン
酸、Ｄ−グルロン酸のような糖酸およびこれらの塩、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒド
ロキシメチル）ニトロメタン、レチノール、３−デヒド
ロレチノール等が挙げられる。
【０００７】該アルコール脱水素酵素は、ＮＡＤのみな
らずＮＡＤＰに対しても非依存性であり、２,６−ジク
ロロフェノールインドフェノール（以下、ＤＣＩＰと略
す）、フェリシアン化カリウム、フェナジンメタサルフ
ェート、ウルスターズブルー、テトラゾリウム塩のよう
な電子受容体の存在下、上記のような基質のヒドロキシ
メチル基のアルデヒド基への酸化を触媒する。酸素を直
接の電子受容体とすることはできない。
らずＮＡＤＰに対しても非依存性であり、２,６−ジク
ロロフェノールインドフェノール（以下、ＤＣＩＰと略
す）、フェリシアン化カリウム、フェナジンメタサルフ
ェート、ウルスターズブルー、テトラゾリウム塩のよう
な電子受容体の存在下、上記のような基質のヒドロキシ
メチル基のアルデヒド基への酸化を触媒する。酸素を直
接の電子受容体とすることはできない。
【０００８】本発明のアルコール脱水素酵素の至適ｐＨ
は、基質および含まれる希土類元素等によっても多少か
わるが、通常、約３.５〜６.５の範囲にある。とりわ
け、Ｌａで誘導した酵素の場合は下記実施例で示される
ように、４.０〜５.５、Ｃｅで誘導した酵素の場合は
４.０〜６.０の範囲にある。酵素は一般に、温度が高い
方が反応自体は速くなる一方、酵素の失活も著しくなる
が、下記実施例２の１）に記載の測定条件下では、本発
明の酵素の至適温度は４０〜５０℃の範囲にある。ま
た、由来する菌株によっても多少変わるが、通常、等電
点は４.２±０.５の範囲である。該酵素は、分子量６４
０００±５０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）のポリペ
プチドであり、このポリペプチド２分子が２量体を形成
していてもよい。
は、基質および含まれる希土類元素等によっても多少か
わるが、通常、約３.５〜６.５の範囲にある。とりわ
け、Ｌａで誘導した酵素の場合は下記実施例で示される
ように、４.０〜５.５、Ｃｅで誘導した酵素の場合は
４.０〜６.０の範囲にある。酵素は一般に、温度が高い
方が反応自体は速くなる一方、酵素の失活も著しくなる
が、下記実施例２の１）に記載の測定条件下では、本発
明の酵素の至適温度は４０〜５０℃の範囲にある。ま
た、由来する菌株によっても多少変わるが、通常、等電
点は４.２±０.５の範囲である。該酵素は、分子量６４
０００±５０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）のポリペ
プチドであり、このポリペプチド２分子が２量体を形成
していてもよい。
【０００９】該酵素は、種々の金属イオンによりその活
性が阻害される。例えば、Ｚｎ2+、Ｈｇ2+が強い阻害効
果を有し、Ｃｕ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｍｎ2+も阻害効果
を有する。また、アンチマイシンＡやロテノンも該酵素
の活性を阻害する。
性が阻害される。例えば、Ｚｎ2+、Ｈｇ2+が強い阻害効
果を有し、Ｃｕ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｍｎ2+も阻害効果
を有する。また、アンチマイシンＡやロテノンも該酵素
の活性を阻害する。
【００１０】該酵素分子が含む希土類元素としては、ス
カンジウム（Ｓｃ）、イットリウム（Ｙ）、ランタン
（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジウム（Ｐ
ｒ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウ
ロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム
（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈ
ｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、
ルテチウム（Ｌｕ）等が挙げられる。
カンジウム（Ｓｃ）、イットリウム（Ｙ）、ランタン
（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジウム（Ｐ
ｒ）、ネオジウム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウ
ロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム
（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈ
ｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、
ルテチウム（Ｌｕ）等が挙げられる。
【００１１】本発明のアルコール脱水素酵素は当該酵素
の産生能を有するシュードグルコノバクター属に属する
微生物から、上記のごとき種々の希土類元素により誘導
生産される。ここに、誘導生産とは、希土類元素を培地
中に添加して酵素生産菌を培養した場合に蛋白質の生
産、すなわち、該酵素の生産が行われることを意味す
る。とりわけ、ランタンおよびセリウムで誘導した場合
が最も比活性が高い。
の産生能を有するシュードグルコノバクター属に属する
微生物から、上記のごとき種々の希土類元素により誘導
生産される。ここに、誘導生産とは、希土類元素を培地
中に添加して酵素生産菌を培養した場合に蛋白質の生
産、すなわち、該酵素の生産が行われることを意味す
る。とりわけ、ランタンおよびセリウムで誘導した場合
が最も比活性が高い。
【００１２】本発明のアルコール脱水素酵素を製造する
には、該酵素産生能を有するシュードグルコノバクター
属に属する微生物を培養する。該酵素は菌体内で生産、
蓄積されるので、培養終了後、集菌し、細胞を破砕しそ
の無細胞抽出液、好ましくは、細胞質画分から分離精製
することにより製造することが出来る。
には、該酵素産生能を有するシュードグルコノバクター
属に属する微生物を培養する。該酵素は菌体内で生産、
蓄積されるので、培養終了後、集菌し、細胞を破砕しそ
の無細胞抽出液、好ましくは、細胞質画分から分離精製
することにより製造することが出来る。
【００１３】用いる微生物は、該酵素産生能を有するシ
ュードグルコノバクター属に属する微生物および通常の
変異誘発操作、例えば、ニトロソグアニジン等の変異剤
処理、紫外線照射処理等あるいは遺伝子組換え等により
得られるこれらの変異株であり、例えばヨーロッパ特許
公開第２２１,７０７号に記載されている下記の菌株が
挙げられる。 シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス Ｋ５
９１ｓ株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０，ＩＦＯ１４４６
４ シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス １２
−５株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９，ＩＦＯ１４４６５ シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス Ｔ
Ｈ１４−８６株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２８，ＩＦＯ１
４４６６ シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス １
２−１５株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２，ＩＦＯ１４４
８２ シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス １
２−４株：ＦＥＲＭＢＰ−１１３１，ＩＦＯ１４４８３ シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス ２
２−３株：ＦＥＲＭＢＰ−１１３３，ＩＦＯ１１４８４
ュードグルコノバクター属に属する微生物および通常の
変異誘発操作、例えば、ニトロソグアニジン等の変異剤
処理、紫外線照射処理等あるいは遺伝子組換え等により
得られるこれらの変異株であり、例えばヨーロッパ特許
公開第２２１,７０７号に記載されている下記の菌株が
挙げられる。 シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス Ｋ５
９１ｓ株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０，ＩＦＯ１４４６
４ シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス １２
−５株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９，ＩＦＯ１４４６５ シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス Ｔ
Ｈ１４−８６株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２８，ＩＦＯ１
４４６６ シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス １
２−１５株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２，ＩＦＯ１４４
８２ シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス １
２−４株：ＦＥＲＭＢＰ−１１３１，ＩＦＯ１４４８３ シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス ２
２−３株：ＦＥＲＭＢＰ−１１３３，ＩＦＯ１１４８４
【００１４】該微生物は好気的条件下、該菌株が利用し
うる栄養源、すなわち炭素源（グルコース、蔗糖、スタ
ーチ等の炭水化物またはペプトン、イーストエキス等の
有機物）、窒素源（アンモニウム塩類、尿素やコーンス
ティープリカー、ヘプトン等の無機、有機の窒素含有
物）、無機塩類（カリウム、ナトリウム、カルシウム、
マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、銅、リン酸、
チオ硫酸等の塩類）、および微量栄養素（ＣｏＡ、パン
トテン酸、ビオチン、チアミン、リボフラビン、ＦＭＮ
等のビタミン・補酵素類またはＬ−システイン、Ｌ−グ
ルタミン酸等のアミノ酸またはそれらを含む天然物を含
む液体培地中で培養することが出来る。培養はｐＨ４〜
９、好ましくは、ｐＨ６〜８で行うことが出来る。培養
時間は使用する微生物および培地の組成等によって種々
異なるが、好ましくは、１０〜１００時間である。培養
を行うのに好適な温度範囲は、１０〜４０℃、好ましく
は、２５〜３５℃である。
うる栄養源、すなわち炭素源（グルコース、蔗糖、スタ
ーチ等の炭水化物またはペプトン、イーストエキス等の
有機物）、窒素源（アンモニウム塩類、尿素やコーンス
ティープリカー、ヘプトン等の無機、有機の窒素含有
物）、無機塩類（カリウム、ナトリウム、カルシウム、
マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、銅、リン酸、
チオ硫酸等の塩類）、および微量栄養素（ＣｏＡ、パン
トテン酸、ビオチン、チアミン、リボフラビン、ＦＭＮ
等のビタミン・補酵素類またはＬ−システイン、Ｌ−グ
ルタミン酸等のアミノ酸またはそれらを含む天然物を含
む液体培地中で培養することが出来る。培養はｐＨ４〜
９、好ましくは、ｐＨ６〜８で行うことが出来る。培養
時間は使用する微生物および培地の組成等によって種々
異なるが、好ましくは、１０〜１００時間である。培養
を行うのに好適な温度範囲は、１０〜４０℃、好ましく
は、２５〜３５℃である。
【００１５】培地には上記の希土類元素を添加する。希
土類元素は、金属末または金属粉として添加してもよい
し、炭酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、酸化物あるいは
シュウ酸塩として用いてもよい。それらはそれぞれ単独
で用いてもよいし、２種類以上の希土類元素を同時に用
いることもできる。また、諸元素の分離精製過程で得ら
れる粗製物等も用いることができる。培地に添加される
希土類元素の量は、用いる微生物の生育を著しく抑制し
ない範囲で選択すればよく、通常、０.０００００１〜
１.０重量％、好ましくは、０.０００１〜０.１重量％
である。培地への添加法としては、あらかじめ培地に添
加しておくのもよいが、培養途中に間欠的に添加して
も、また連続的に添加してもよい。なお、カルシウムや
ストロンチウムのようなアルカリ金属を培地に添加して
も該酵素は誘導されないことが確認された。
土類元素は、金属末または金属粉として添加してもよい
し、炭酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、酸化物あるいは
シュウ酸塩として用いてもよい。それらはそれぞれ単独
で用いてもよいし、２種類以上の希土類元素を同時に用
いることもできる。また、諸元素の分離精製過程で得ら
れる粗製物等も用いることができる。培地に添加される
希土類元素の量は、用いる微生物の生育を著しく抑制し
ない範囲で選択すればよく、通常、０.０００００１〜
１.０重量％、好ましくは、０.０００１〜０.１重量％
である。培地への添加法としては、あらかじめ培地に添
加しておくのもよいが、培養途中に間欠的に添加して
も、また連続的に添加してもよい。なお、カルシウムや
ストロンチウムのようなアルカリ金属を培地に添加して
も該酵素は誘導されないことが確認された。
【００１６】培養終了後、アルコール脱水素酵素を分離
精製するには、通常の酵素精製に用いられる方法、例え
ば硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、透析、
アフィニティークロマトグラフィー等が用いられる。
精製するには、通常の酵素精製に用いられる方法、例え
ば硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、透析、
アフィニティークロマトグラフィー等が用いられる。
【００１７】本発明の新規アルコ−ル脱水素酵素は、ア
スコルビン酸製造中間体として重要な２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸製造に際し、Ｌ−ソルボ−スからＬ−ソルボソン
への酸化を触媒するのみならず、その広い基質特異性を
生かし、各種のヒドロキシメチル基を有する化合物の立
体特異的な酸化に適用出来得るものである。例えば、各
種の糖アルコ−ル、糖類、グリコ−ル類、アルコ−ル類
に作用させることにより新規な化合物を生み出すことが
できる。
スコルビン酸製造中間体として重要な２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸製造に際し、Ｌ−ソルボ−スからＬ−ソルボソン
への酸化を触媒するのみならず、その広い基質特異性を
生かし、各種のヒドロキシメチル基を有する化合物の立
体特異的な酸化に適用出来得るものである。例えば、各
種の糖アルコ−ル、糖類、グリコ−ル類、アルコ−ル類
に作用させることにより新規な化合物を生み出すことが
できる。
【００１８】
【実施例】つぎに、実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。 実施例１ アルコール脱水素酵素の調製 （１）シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス
の培養 シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス Ｋ５
９１ｓ（ＩＦＯ１４４６４，ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３
０）の寒天斜面培養物をソルビトール２.５％、イース
トエキス１.０％、ペプトン１.０％から成る種培地２０
ミリリットルを含む２００ミリリットル容の三角フラス
コに１白金耳植菌し３０℃、２日間、回転振とう機上で
培養した。得られた種培養物を、上記の種培地５００ミ
リリットルを含む坂口フラスコに全量接種し、２８℃、
２日間、往復振とう機上で培養した。得られた培養物５
００ミリリットルを、イーストエキス１％、ペプトン１
％塩化ランタン０.００１％、アクトコール０.０２％か
ら成る培地３０リットルを含む５０リットルの醗酵槽に
接種し、３０℃、通気１５リットル／分、撹拌２５０ｒ
ｐｍの条件で３日間培養した。培養液を８０００ｒｐ
ｍ、２０分間遠心し、菌体を得た。得られた菌体は０.
８５％の生理食塩水で２回洗浄した。この様にして、３
０リットルの培養液から湿菌体約１００ｇを得た。
く説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。 実施例１ アルコール脱水素酵素の調製 （１）シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス
の培養 シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス Ｋ５
９１ｓ（ＩＦＯ１４４６４，ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３
０）の寒天斜面培養物をソルビトール２.５％、イース
トエキス１.０％、ペプトン１.０％から成る種培地２０
ミリリットルを含む２００ミリリットル容の三角フラス
コに１白金耳植菌し３０℃、２日間、回転振とう機上で
培養した。得られた種培養物を、上記の種培地５００ミ
リリットルを含む坂口フラスコに全量接種し、２８℃、
２日間、往復振とう機上で培養した。得られた培養物５
００ミリリットルを、イーストエキス１％、ペプトン１
％塩化ランタン０.００１％、アクトコール０.０２％か
ら成る培地３０リットルを含む５０リットルの醗酵槽に
接種し、３０℃、通気１５リットル／分、撹拌２５０ｒ
ｐｍの条件で３日間培養した。培養液を８０００ｒｐ
ｍ、２０分間遠心し、菌体を得た。得られた菌体は０.
８５％の生理食塩水で２回洗浄した。この様にして、３
０リットルの培養液から湿菌体約１００ｇを得た。
【００１９】（２）細胞質画分の調製 上記の工程で得られたシュードグルコノバクター・サッ
カロケトゲネスの湿菌体１００ｇを、１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６.７）３００ミリリットルに懸濁し、懸濁
液を５０ミリリットルずつ超音波破砕機で１.５Ａ、２
００Ｗ、３０分間処理し菌体を破砕した。３０００ｒｐ
ｍ、１０分間遠心し、生菌体を除去した後３５０００ｒ
ｐｍ、９０分間遠心した。得られた遠心上清２５０ミリ
リットルを細胞質画分として集めた。
カロケトゲネスの湿菌体１００ｇを、１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６.７）３００ミリリットルに懸濁し、懸濁
液を５０ミリリットルずつ超音波破砕機で１.５Ａ、２
００Ｗ、３０分間処理し菌体を破砕した。３０００ｒｐ
ｍ、１０分間遠心し、生菌体を除去した後３５０００ｒ
ｐｍ、９０分間遠心した。得られた遠心上清２５０ミリ
リットルを細胞質画分として集めた。
【００２０】（３）ＤＥＡＥトヨパールカラムクロマト
グラフィー 上記の工程で得られた細胞質画分１００ミリリットル
を、１００ｍＭグリセロール、１０ｍＭリン酸緩衝液
（以後、これを単に緩衝液と称することもある）で平衡
化したＤＥＡＥトヨパールカラム（３.０φｘ３０ｃ
ｍ）にかけた。本酵素は、０.３Ｍまでの塩化ナトリウ
ムの直線勾配により溶出された。
グラフィー 上記の工程で得られた細胞質画分１００ミリリットル
を、１００ｍＭグリセロール、１０ｍＭリン酸緩衝液
（以後、これを単に緩衝液と称することもある）で平衡
化したＤＥＡＥトヨパールカラム（３.０φｘ３０ｃ
ｍ）にかけた。本酵素は、０.３Ｍまでの塩化ナトリウ
ムの直線勾配により溶出された。
【００２１】（４）ブチルトヨパールカラムクロマトグ
ラフィー 上記の工程で得られた酵素画分１００ミリリットルに硫
安６３.５ｇを加え溶解させた。４℃で２時間静置した
後、１５０００ｒｐｍ，２０分間遠心し、得られた沈澱
物に２０ミリリットルの１.５Ｍ硫安を含む緩衝液を加
え溶解させた。１００００ｒｐｍ、２０分間遠心し不溶
物を除いた。得られた遠心上清２０ミリリットルを、
１.５Ｍ硫安を含む緩衝液で平衡化させたブチルトヨパ
ールカラム（３．０φｘ１５ｃｍ）にかけた。本酵素は
０Ｍまでの硫安の直線勾配により溶出された。
ラフィー 上記の工程で得られた酵素画分１００ミリリットルに硫
安６３.５ｇを加え溶解させた。４℃で２時間静置した
後、１５０００ｒｐｍ，２０分間遠心し、得られた沈澱
物に２０ミリリットルの１.５Ｍ硫安を含む緩衝液を加
え溶解させた。１００００ｒｐｍ、２０分間遠心し不溶
物を除いた。得られた遠心上清２０ミリリットルを、
１.５Ｍ硫安を含む緩衝液で平衡化させたブチルトヨパ
ールカラム（３．０φｘ１５ｃｍ）にかけた。本酵素は
０Ｍまでの硫安の直線勾配により溶出された。
【００２２】（５）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー 上記の工程で得られた酵素画分５０ミリリットルに硫安
３１.２ｇを加え溶解させた。４℃で２時間静置した
後、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、得られた沈澱
物に５ミリリットルの緩衝液を加え溶解させ、２００ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液で平衡化したゲル濾過カ
ラム（３.０φｘ１００ｃｍ）にかけた。活性画分を４
℃で貯蔵した。得られた酵素の比活性は約５０ｕ／ｍｇ
蛋白であった。なお蛋白量は、ＢＣＡ総蛋白定量キット
（ピアス社）を用い、牛血清グロブリンで作成した標準
曲線を用いて算出した。
３１.２ｇを加え溶解させた。４℃で２時間静置した
後、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、得られた沈澱
物に５ミリリットルの緩衝液を加え溶解させ、２００ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液で平衡化したゲル濾過カ
ラム（３.０φｘ１００ｃｍ）にかけた。活性画分を４
℃で貯蔵した。得られた酵素の比活性は約５０ｕ／ｍｇ
蛋白であった。なお蛋白量は、ＢＣＡ総蛋白定量キット
（ピアス社）を用い、牛血清グロブリンで作成した標準
曲線を用いて算出した。
【００２３】（６）単離された酵素の純度 精製酵素の純度を調べるために、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動、およびアガロース等電点電気泳動
を行った。いずれの場合でも酵素は単−バンドを示し、
さらにアガロース等電点電気泳動を行ったものについ
て、ゲルを１００ｍＭエタノール、１０ｍＭフェリシア
ン化カリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.
０）に室温で５分間浸した後、水洗し、反応停止液（Ｆ
ｅ2(ＳＯ4)3５ｇ、８５％リン酸 ９５ミリリットルを蒸
留水で１リットルにしたもの）中で発色させてこのタン
パク質が酵素活性を有することを確認した。本酵素は、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、６４０
００±５０００の分子量を示し、Ｇ−３０００ＳＷＸＬ
カラム（東ソー（株））を用いたゲル濾過ＨＰＬＣで
は、１２５０００±１５０００の分子量を示したことか
ら、通常の条件下では、分子量６４０００±５０００の
単一サブユニットから成るダイマーであると思われる。
アミドゲル電気泳動、およびアガロース等電点電気泳動
を行った。いずれの場合でも酵素は単−バンドを示し、
さらにアガロース等電点電気泳動を行ったものについ
て、ゲルを１００ｍＭエタノール、１０ｍＭフェリシア
ン化カリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.
０）に室温で５分間浸した後、水洗し、反応停止液（Ｆ
ｅ2(ＳＯ4)3５ｇ、８５％リン酸 ９５ミリリットルを蒸
留水で１リットルにしたもの）中で発色させてこのタン
パク質が酵素活性を有することを確認した。本酵素は、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、６４０
００±５０００の分子量を示し、Ｇ−３０００ＳＷＸＬ
カラム（東ソー（株））を用いたゲル濾過ＨＰＬＣで
は、１２５０００±１５０００の分子量を示したことか
ら、通常の条件下では、分子量６４０００±５０００の
単一サブユニットから成るダイマーであると思われる。
【００２４】（７）反応生成物の確認 １００マイクロリットルのマッキルベーンバッファー
（ｐＨ５.０）、５マイクロリットルの０.１Ｍフェリシ
アン化カリウム、２０マイクロリットルの蒸留水から成
る基本反応液に５マイクロリットルの０.２Ｍソルボー
スと５マイクロリットルの酵素液を加え３０℃で２４時
間反応させた。反応生成物を薄層クロマトグラフィーお
よび高速液体クロマトグラフィーで分析した結果、反応
生成物は標品のＬ−ソルボソンに一致した。同じく基本
反応液に０.２Ｍエタノールと５マイクロリットルの酵
素液を加え３０℃で２４時間反応させ、反応生成物を高
速液体クロマトグラフィーで分析した結果、反応生成物
は標品のアセトアルデヒドに一致した。
（ｐＨ５.０）、５マイクロリットルの０.１Ｍフェリシ
アン化カリウム、２０マイクロリットルの蒸留水から成
る基本反応液に５マイクロリットルの０.２Ｍソルボー
スと５マイクロリットルの酵素液を加え３０℃で２４時
間反応させた。反応生成物を薄層クロマトグラフィーお
よび高速液体クロマトグラフィーで分析した結果、反応
生成物は標品のＬ−ソルボソンに一致した。同じく基本
反応液に０.２Ｍエタノールと５マイクロリットルの酵
素液を加え３０℃で２４時間反応させ、反応生成物を高
速液体クロマトグラフィーで分析した結果、反応生成物
は標品のアセトアルデヒドに一致した。
【００２５】実施例２ １）酵素活性測定法 本実施例では、酵素活性は基質の存在下に３０℃で１分
間に２μＭのフェリシアン化カリウムを還元するに要す
る酵素量を１単位として表示する。基本となる反応液組
成は以下に示す通りである。 基本反応液組成： マッキルベーンバッファー（ｐＨ５.０） ０.５ミリ
リットル 基質水溶液、 ０.２５ミ
リリットル １００ｍＭフェリシアン化カリウム水溶液 ０.２ミリ
リットル この基本反応液を３０℃で５分間予熱した後、０.０５
ミリリットルの適当に希釈した酵素液を加え、反応を開
始させ、１０分後に０.５ミリリットルの反応停止液
［Ｆｅ2(ＳＯ4)3 ５ｇ、ＳＤＳ ３ｇ、８５％リン酸
９５ミリリットルを蒸留水に溶かして１リットルにした
もの］を加え反応を止め、暗所に室温で３０分間放置し
た後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照とし
ては基質溶液の代わりに同量の蒸留水を用いた。
間に２μＭのフェリシアン化カリウムを還元するに要す
る酵素量を１単位として表示する。基本となる反応液組
成は以下に示す通りである。 基本反応液組成： マッキルベーンバッファー（ｐＨ５.０） ０.５ミリ
リットル 基質水溶液、 ０.２５ミ
リリットル １００ｍＭフェリシアン化カリウム水溶液 ０.２ミリ
リットル この基本反応液を３０℃で５分間予熱した後、０.０５
ミリリットルの適当に希釈した酵素液を加え、反応を開
始させ、１０分後に０.５ミリリットルの反応停止液
［Ｆｅ2(ＳＯ4)3 ５ｇ、ＳＤＳ ３ｇ、８５％リン酸
９５ミリリットルを蒸留水に溶かして１リットルにした
もの］を加え反応を止め、暗所に室温で３０分間放置し
た後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照とし
ては基質溶液の代わりに同量の蒸留水を用いた。
【００２６】２）比活性および基質特異性 １）に示した活性測定法に従って、ランタンで誘導した
実施例１のアルコール脱水素酵素における、種々の基質
を用いた場合のエタノール基質に対する比活性を調べ
た。結果を表１に示す。
実施例１のアルコール脱水素酵素における、種々の基質
を用いた場合のエタノール基質に対する比活性を調べ
た。結果を表１に示す。
【表１】
【００２７】３）至適ＰＨ １）に示した活性測定法に従って、該酵素活性に及ぼす
ｐＨの影響を調べた。至適ｐＨは図１に示すように４.
５〜５.５付近である。
ｐＨの影響を調べた。至適ｐＨは図１に示すように４.
５〜５.５付近である。
【００２８】４）ＰＨ安定性 １）に示した活性測定法に従って、マッキルベーンバッ
ファーを用いて、種々のｐＨにおける残存活性を調べ
た。安定ｐＨ域は図２に示すように、およそ４.５〜９
である。
ファーを用いて、種々のｐＨにおける残存活性を調べ
た。安定ｐＨ域は図２に示すように、およそ４.５〜９
である。
【００２９】５）至適温度 １）に示した活性測定法に従って、該酵素活性に及ぼす
温度の影響を調べた。１）に記載の測定条件下では、図
３に示すように至適温度は４５℃付近である。
温度の影響を調べた。１）に記載の測定条件下では、図
３に示すように至適温度は４５℃付近である。
【００３０】６）熱安定性 種々の温度で、１時間熱処理した後の残存活性を調べ
た。結果を図４に示した。この結果より、５０℃、１時
間の熱処理後の残存活性は約７割であった。
た。結果を図４に示した。この結果より、５０℃、１時
間の熱処理後の残存活性は約７割であった。
【００３１】７）金属イオンの影響 １）に示した活性測定法に従って、該酵素活性に及ぼす
種々の金属イオンの影響を調べ、その結果を表２に示し
た。この結果よりＺｎ2+、Ｈｇ2+が強い阻害効果を、ま
たＣｕ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｍｎ2+も反応を阻害するこ
とがわかった。
種々の金属イオンの影響を調べ、その結果を表２に示し
た。この結果よりＺｎ2+、Ｈｇ2+が強い阻害効果を、ま
たＣｕ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、Ｍｎ2+も反応を阻害するこ
とがわかった。
【表２】
【００３２】８）阻害剤の影響 １）に示した方法に従って、該酵素活性に及ぼす各種阻
害剤の影響を調べた。結果を表３に示す。本酵素につい
ては、アンチマイシンＡに非常に強い阻害活性が、また
ロテノンにも強い阻害効果が認められた。
害剤の影響を調べた。結果を表３に示す。本酵素につい
ては、アンチマイシンＡに非常に強い阻害活性が、また
ロテノンにも強い阻害効果が認められた。
【表３】
【００３３】９）ミカエリス定数（Ｋｍ） １）に示した方法に従って、種々の基質濃度における活
性を測定した。本測定条件下では基質濃度範囲によって
は必ずしもミカエリス式に従うとはいえないが、図５に
示すように１００ｍＭから１Ｍの濃度範囲で測定すると
ミカエリス定数は２２５ｍＭであった。
性を測定した。本測定条件下では基質濃度範囲によって
は必ずしもミカエリス式に従うとはいえないが、図５に
示すように１００ｍＭから１Ｍの濃度範囲で測定すると
ミカエリス定数は２２５ｍＭであった。
【００３４】実施例３ 実施例１で用いた塩化ランタンの代わりに塩化セリウム
を用いて同じくアルコール脱水素酵素の精製を行った。
得られた酵素の比活性は約２０単位／ｍｇ蛋白であっ
た。
を用いて同じくアルコール脱水素酵素の精製を行った。
得られた酵素の比活性は約２０単位／ｍｇ蛋白であっ
た。
【００３５】実施例４ 実施例１で用いた塩化ランタンの代わりに塩化ネオジム
を用いて同じくアルコール脱水素酵素の精製をおこなっ
た。得られた酵素の比活性は約４単位／ｍｇ蛋白であっ
た。
を用いて同じくアルコール脱水素酵素の精製をおこなっ
た。得られた酵素の比活性は約４単位／ｍｇ蛋白であっ
た。
【００３６】実施例５ シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス Ｋ５
９１ｓ（ＩＦＯ１４４６４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３
０）の寒天斜面培養物を、イーストエキス１.０％、ペ
プトン１.０％から成る種培地２０ミリリットルを含む
２００ミリリットル容の三角フラスコに１白金耳植菌し
３０℃、２日間、回転振とう機上で培養した。得られた
種培養物を、上述の種培地２００ミリリットルを含む１
リットル容の三角フラスコに全量接種し３０℃、２日
間、回転振とう機上で培養した。イーストエキス１.０
％、ペプトン１.０％から成る培地２００ミリリットル
を含む１リットル容の三角フラスコに、この培養物５ミ
リリットルを加え３０℃、２日間培養した。この条件で
希土類元素化合物として、各々０.００１％のイットリ
ウム、ランタン、セリウム、ネオジム、サマリウム、ユ
ーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウ
ム、ホルミウム、エルビウム、イッテルビウムの塩化物
またはプラセオジム、スカンジウムの酸化物を加えて同
じく３０℃、２日間培養した。得られた培養液から遠心
分離で菌体を集め、生理食塩水２００ミリリットルに懸
濁し再び遠心分離によって集菌し、得られた菌体を５ミ
リリットルの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐ
Ｈ６.７）、１００ｍＭ ＮａＣｌから成る希釈用バッフ
ァーに懸濁した。この菌体懸濁液を超音波破砕機で完全
に破砕した後、低速遠心分離で菌体残査を除きこれを粗
抽出液とした。この粗抽出液のアルコール脱水素酵素活
性を表４に示す。
９１ｓ（ＩＦＯ１４４６４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３
０）の寒天斜面培養物を、イーストエキス１.０％、ペ
プトン１.０％から成る種培地２０ミリリットルを含む
２００ミリリットル容の三角フラスコに１白金耳植菌し
３０℃、２日間、回転振とう機上で培養した。得られた
種培養物を、上述の種培地２００ミリリットルを含む１
リットル容の三角フラスコに全量接種し３０℃、２日
間、回転振とう機上で培養した。イーストエキス１.０
％、ペプトン１.０％から成る培地２００ミリリットル
を含む１リットル容の三角フラスコに、この培養物５ミ
リリットルを加え３０℃、２日間培養した。この条件で
希土類元素化合物として、各々０.００１％のイットリ
ウム、ランタン、セリウム、ネオジム、サマリウム、ユ
ーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウ
ム、ホルミウム、エルビウム、イッテルビウムの塩化物
またはプラセオジム、スカンジウムの酸化物を加えて同
じく３０℃、２日間培養した。得られた培養液から遠心
分離で菌体を集め、生理食塩水２００ミリリットルに懸
濁し再び遠心分離によって集菌し、得られた菌体を５ミ
リリットルの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐ
Ｈ６.７）、１００ｍＭ ＮａＣｌから成る希釈用バッフ
ァーに懸濁した。この菌体懸濁液を超音波破砕機で完全
に破砕した後、低速遠心分離で菌体残査を除きこれを粗
抽出液とした。この粗抽出液のアルコール脱水素酵素活
性を表４に示す。
【００３７】
【表４】
【００３８】実施例６ 実施例５で得られた粗抽出液をアガロース等電点電気泳
動を行ったところ希土類化合物を加えて培養した菌体か
ら得られた粗抽出液では、対照として同時に泳動した実
施例２で得られた精製アルコール脱水素酵素に対応する
蛋白バンドが認められ、さらに同様に泳動を行ったゲル
についてエタノールを基質として活性染色を行ったとこ
ろ、精製アルコール脱水素酵素に対応する位置に活性が
認められた。
動を行ったところ希土類化合物を加えて培養した菌体か
ら得られた粗抽出液では、対照として同時に泳動した実
施例２で得られた精製アルコール脱水素酵素に対応する
蛋白バンドが認められ、さらに同様に泳動を行ったゲル
についてエタノールを基質として活性染色を行ったとこ
ろ、精製アルコール脱水素酵素に対応する位置に活性が
認められた。
【００３９】実施例７ イーストエキス１.０％、ペプトン１.０％から成る培地
２００ミリリットルを含む１リットル容の三角フラスコ
に、各々、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲ
ネス Ｋ５９１ｓ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０、ＩＦ
Ｏ１４４６４）、シュードグルコノバクター・サッカロ
ケトゲネス １２−５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９、
ＩＦＯ１４４６５）、シュードグルコノバクター・サッ
カロケトゲネス ＴＨ１４−８６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１１２８、ＩＦＯ１４４６６）、シュードグルコノバク
ター・サッカロケトゲネス １２−１５株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１１３２、ＩＦＯ１４４８２）、シュードグルコ
ノバクター・サッカロケトゲネス １２−４株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１１３１、ＩＦＯ１４４８３）、シュードグ
ルコノバクター・サッカロケトゲネス ２２−３株（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１１３３、ＩＦＯ１１４８４）の寒天培
養物１白金耳を植菌し、３０℃、３日間、回転振とう培
養を行いこの培養液を集菌洗浄して得られた菌体から、
実施例５と同じく粗抽出液を調製した。上記の培地に塩
化ランタンを０.００１％加えた培地を用いて同じ実験
を行い粗抽出液を調製した。これらの粗抽出液のアルコ
ール脱水素酵素活性を測定したところ、用いたすべての
菌株について塩化ランタン添加培養のもののみに活性が
検出された。
２００ミリリットルを含む１リットル容の三角フラスコ
に、各々、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲ
ネス Ｋ５９１ｓ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０、ＩＦ
Ｏ１４４６４）、シュードグルコノバクター・サッカロ
ケトゲネス １２−５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９、
ＩＦＯ１４４６５）、シュードグルコノバクター・サッ
カロケトゲネス ＴＨ１４−８６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１１２８、ＩＦＯ１４４６６）、シュードグルコノバク
ター・サッカロケトゲネス １２−１５株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１１３２、ＩＦＯ１４４８２）、シュードグルコ
ノバクター・サッカロケトゲネス １２−４株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１１３１、ＩＦＯ１４４８３）、シュードグ
ルコノバクター・サッカロケトゲネス ２２−３株（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１１３３、ＩＦＯ１１４８４）の寒天培
養物１白金耳を植菌し、３０℃、３日間、回転振とう培
養を行いこの培養液を集菌洗浄して得られた菌体から、
実施例５と同じく粗抽出液を調製した。上記の培地に塩
化ランタンを０.００１％加えた培地を用いて同じ実験
を行い粗抽出液を調製した。これらの粗抽出液のアルコ
ール脱水素酵素活性を測定したところ、用いたすべての
菌株について塩化ランタン添加培養のもののみに活性が
検出された。
【００４０】実施例８ 実施例２で得られた精製アルコール脱水素酵素を抗原と
して、ウサギから抗血清を調製した。この抗血清を用い
てオクタロニーの免疫二重拡散法により調べた結果、実
施例５および実施例７で得られた希土類元素添加培養菌
体の粗抽出液中には、シュードグルコノバクター・サッ
カロケトゲネス Ｋ５９１ｓ株のアルコール脱水素酵素
と、血清学的に同じか非常に類似した蛋白が存在するこ
とが示された。
して、ウサギから抗血清を調製した。この抗血清を用い
てオクタロニーの免疫二重拡散法により調べた結果、実
施例５および実施例７で得られた希土類元素添加培養菌
体の粗抽出液中には、シュードグルコノバクター・サッ
カロケトゲネス Ｋ５９１ｓ株のアルコール脱水素酵素
と、血清学的に同じか非常に類似した蛋白が存在するこ
とが示された。
【００４１】実施例９ 実施例２で得られたＬａ−ＡＤＨ４４ｍｇについて湿式
灰化法により灰化し原子吸光法によりＬａ濃度を定量し
たところ、０.２３％（Ｗ／Ｗ）含まれることが示され
た。
灰化法により灰化し原子吸光法によりＬａ濃度を定量し
たところ、０.２３％（Ｗ／Ｗ）含まれることが示され
た。
【００４２】
【発明の効果】本発明によれば、広い基質特異性を有す
る新規なＮＡＤ非依存型アルコール脱水素酵素およびそ
の製造法が提供される。
る新規なＮＡＤ非依存型アルコール脱水素酵素およびそ
の製造法が提供される。
【図１】 本発明の酵素の活性に対するｐＨの及ぼす影
響を示す。
響を示す。
【図２】 本発明の酵素のｐＨ安定性を示す。
【図３】 本発明の酵素の活性に対する温度の及ぼす影
響を示す。
響を示す。
【図４】 本発明の酵素の熱安定性を示す。
【図５】 本発明の酵素のヘイン・ウルフ・プロット
（Hane-Woolfplot）を示す。
（Hane-Woolfplot）を示す。
Claims (6)
- 【請求項１】 ヒドロキシメチル基を持つ化合物のヒド
ロキシメチル基のアルデヒド基への酸化を触媒する酵素
分子中に希土類元素を含むＮＡＤ非依存型アルコール脱
水素酵素。 - 【請求項２】 下記の理化学的性質を有する請求項１記
載のアルコール脱水素酵素。 至適ｐＨ ３.５〜６.５ 至適温度 ４０〜５０℃ 等電点 ４.２±０.５ 分子構造 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで６４０００±５０
００の分子量のポリペプチドまたはこのポリペプチド２
分子よりなる２量体 - 【請求項３】 シュードグルコノバクター（Pseudogluc
onobacter）属に属する微生物が生産する請求項１記載
のアルコール脱水素酵素。 - 【請求項４】 希土類元素によって誘導生産される請求
項２記載のアルコール脱水素酵素。 - 【請求項５】 ヒドロキシメチル基を持つ化合物のヒド
ロキシメチル基のアルデヒド基への酸化を触媒する酵素
分子中に希土類元素を含むＮＡＤ非依存型アルコール脱
水素酵素産生能を有するシュードグルコノバクター属に
属する微生物またはその変異株を培養し、生産された該
アルコール脱水素酵素を単離精製することを特徴とする
請求項１記載のアルコール脱水素酵素の製造法。 - 【請求項６】 培地中に希土類元素を存在させることを
特徴とする請求項５記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3233081A JP3056295B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | アルコール脱水素酵素およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3233081A JP3056295B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | アルコール脱水素酵素およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0568542A true JPH0568542A (ja) | 1993-03-23 |
| JP3056295B2 JP3056295B2 (ja) | 2000-06-26 |
Family
ID=16949505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3233081A Expired - Fee Related JP3056295B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | アルコール脱水素酵素およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3056295B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5434061A (en) * | 1992-11-27 | 1995-07-18 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production of saccharide carboxylic acids |
| WO2008139844A1 (ja) | 2007-05-08 | 2008-11-20 | Ensuiko Sugar Refining Co., Ltd. | グルクロン酸発酵によるグルクロン酸の製造方法 |
| WO2013183610A1 (ja) * | 2012-06-04 | 2013-12-12 | 塩水港精糖株式会社 | Ｄ－グルカル酸生産菌およびｄ－グルカル酸の製造方法 |
| US9463141B2 (en) | 2005-05-30 | 2016-10-11 | Elchanan Vaserman | Inflatable container for feeding babies |
-
1991
- 1991-09-12 JP JP3233081A patent/JP3056295B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5629411A (en) * | 1992-11-27 | 1997-05-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Saccharide carboxylic acids of glycosides |
| US5635611A (en) * | 1992-11-27 | 1997-06-03 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production of saccharide carboxylic acids |
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| US5434061A (en) * | 1992-11-27 | 1995-07-18 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production of saccharide carboxylic acids |
| US9463141B2 (en) | 2005-05-30 | 2016-10-11 | Elchanan Vaserman | Inflatable container for feeding babies |
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| US8530186B2 (en) | 2007-05-08 | 2013-09-10 | Ensuiko Sugar Refining Co., Ltd. | Method for producing glucuronic acid by glucuronic acid fermentation |
| WO2013183610A1 (ja) * | 2012-06-04 | 2013-12-12 | 塩水港精糖株式会社 | Ｄ－グルカル酸生産菌およびｄ－グルカル酸の製造方法 |
| EP2857496A4 (en) * | 2012-06-04 | 2015-12-30 | Ensuiko Sugar Refining | BACTERIUM PRODUCING D-GLUCARIC ACID, AND PROCESS FOR PRODUCING D-GLUCARIC ACID |
| JPWO2013183610A1 (ja) * | 2012-06-04 | 2016-02-01 | 塩水港精糖株式会社 | Ｄ−グルカル酸生産菌およびｄ−グルカル酸の製造方法 |
| CN105026548A (zh) * | 2012-06-04 | 2015-11-04 | 盐水港精糖株式会社 | D-葡萄糖二酸生产菌及d-葡萄糖二酸的制造方法 |
| AU2013272645B2 (en) * | 2012-06-04 | 2019-03-28 | Ensuiko Sugar Refining Co., Ltd. | D-glucaric acid-producing bacterium, and method for manufacturing D-glucaric acid |
| CN105026548B (zh) * | 2012-06-04 | 2019-06-18 | 盐水港精糖株式会社 | D-葡萄糖二酸生产菌及d-葡萄糖二酸的制造方法 |
| US10975396B2 (en) | 2012-06-04 | 2021-04-13 | Ensuiko Sugar Refining Co., Ltd. | D-glucaric acid producing bacterium, and method for manufacturing D-glucaric acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3056295B2 (ja) | 2000-06-26 |
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