HU215587B - Eljárás alfa- és béta-interferonokkal szemben nagy affinitással rendelkező vízoldható polipeptidek, az azokat kódoló DNS-szekvenciák, a polipeptideket kifejezni képes sejtek és a polipeptideket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás a- és b-interferőnnal szemben nagyaffinitással rendelkező vízőldható pőlipeptidek előállításáraönmagűkban vagy egy másődik pő ipeptiddel képezett hibridekfőrmájában. A találmány értelmében az adőtt pőlipeptidet vagy hibridetkifejezni képes sejteket alkalmas közegen tenyésztik, majd akifejezett terméket elkülönítik. A fenti pőlipeptideket és hibrideketkódőló DNS-szekvenciák, a fenti pőlipeptideket és hibrideket kifejezősejtek és a fenti pőlipeptideket és hibrideket tartalmazó gyógyászatikészítmények előállítá a, tővábbá interferőn receptőr elleniantitestek előállítása és kiműtatása is a találmány tárgyát képezi. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás új vízoldható polipeptidek, az azokat kódoló DNS-szekvenciák, a polipeptideket kifejezni képes sejtek, valamint a polipeptideket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására. A találmány tárgya továbbá eljárás interferon receptor elleni antitestek előállítására, és az ilyen antitestek jelenlétének diagnosztikai kimutatására.

Az a- és β-interferon a különböző biológiai tulajdonságokkal rendelkező kiválasztott fehéijék egyik csoportját képezi, és gerincesek sejtjeiben vírusellenes és burjánzásellenes állapotot hoz létre. [I. Gresser és M. G. Tovay: Biochem. Biophys. Acta 516, 23 (1978)].

Az α-interferon jelentős hatást fejt ki az immunrendszerre, a sejtrendszerre és a humorális rendszerre, és elsősorban a B-sejtek poliklónos aktiválásában [M. Peters: J. Immunoi. 137, 3153 (1986)], a T-sejtek funkcióinak gátlásában [J. Knop és társai: J. Immunoi. 133, 2412 (1984)] és a hisztokompatibilitás-antigének kifejezésének módosításában [M. Fellous és társai: Eur. J. Immunoi. 9, 446 (1979)] vesz részt. Mindezek a folyamatok szerepet játszanak az autoimmunitás kialakulásában.

Bár az interferont a szervezet hasznos tényezőjének tekintik, abnormális termelése oki szerepet játszhat egyes betegségek körfolyamatában, és különböző úgynevezett autoimmun-betegséggel kapcsolatos. Magas interferonszint észlelhető például a lupus erythematosusban, reumás artritiszben, Behcet-szindrómában, cukorbetegségben, többszörös szklerózisban, csontvelőapláziában és a súlyos immunhiányos betegségben szenvedő betegek szérumában és szöveteiben. Közvetlen összefüggés áll fenn a túlzott interferonszint és a rossz prognózisú AIDS-betegség kifejlődése között [E. Buimovivi-Klein és társai: AIDS Rés. 2, 99 (1986)].

Ismeretes, hogy az emberi lupus erythematosus állatmodelljeként szolgáló spontán betegségben szenvedő speciális egértörzshöz (NZB) tartozó egereknek avagy β-interferont beadva súlyosbodik a betegség előrehaladása [H. Heremans és társai: Infect. Immun. 21, 925 (1978), C. Adam és társai: Clin. Exp. Immunoi. 40, 373 (1980)].

Fiatal egerekben nagy mennyiségű interferon beadása növekedésgátló szindrómát, májnekrózist és pusztulást idéz elő [I. Gresser és társai: Natúré 258, 76 (1973)]. Hasonlóképpen, ha nőstény egereket neonatális életszakaszukban bizonyos vírusokkal (pl. Pichinda limfocita choriomeningitis vírussal vagy reovírussal) fertőznek meg, nagy mennyiségű endogén interferon termelődik, ami ugyanazt a halálos szindrómát okozza. Az ilyen vírusokkal születéskor megfertőzött fiatal egerek azonban a- vagy β-interferon beadásával megvédhetők a fenti szindrómától [Y. Riviere és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 2135 (1977), Y. Riviere és társai: J. Exp. Med. 152, 633 (1980), T. Clark és társai: J. Virol. 59, 728 (1986)]. Ez a kísérlet meggyőzően bizonyítja az interferonnak a fenti betegség körfolyamatában kifejtett káros szerepét.

Ismert az is, hogy mind az NK-sejtek aktiválását, mind a hisztokompatibilitás-antigének kifejezésének módosulását - amelyek döntő szerepet játszanak az átültetett csontvelő kilökődésében - az a- vagy a β-interferon szabályozza [C. Chien és társai: Science 246, 66 (1989)]. Afifi és társai [J. Immunoi. 134, 3739 (1985)] kimutatták, hogy ha FI egereket vagy allogén egereket rágcsáló eredetű anti-α- vagy β-interferon-szérummal kezelnek, lehetővé válik a parentális vagy allogén csontvelő átültetése és elszaporodása. Ez a tény azt igazolja, hogy az a- vagy β-interferon-termelés FI hibrid egereken a csontvelő-átültetéssel szembeni ellenállás kialakulásának egyik kulcsfontosságú eleme.

Ismeretes, hogy az interferonok és altípusaik biológiai hatásai azáltal lépnek fel, hogy az interferonok egy specifikus, a sejtfelülethez nagy affinitást mutató receptorral lépnek kölcsönhatásba [M. Aquet és K. E. Mogensen: Academic Press, London, (1983)].

Jelenleg az autoimmun-betegségek és az azokkal kapcsolatos más betegségek (pl. sclerosis multiplex) kezelésére nem áll rendelkezésre megfelelő terápia. Az autoimmun-betegségek ismert kezelési eljárásai nem kielégítőek, és toxikus hatásokkal járnak. A „kilökődésellenes” terápiában használt kezelések gátolják ugyan a betegség tüneteit, az okokat azonban nem szüntetik meg, és ugyanakkor nagyon toxikusak. Nagy szükség van tehát olyan gyógyszerekre, amelyek az autoimmun-betegségek kezelésében és a szervkilökődések megakadályozásában kellően hatásosak, ugyanakkor azonban csak kevéssé toxikusak.

Nagyon célszerű lenne az a- vagy β-interferon hatását antagonista anyag injektálásával blokkolni, mert ez mind az autoimmun típusú betegségek kezelésében, mind az átültetett szövetek kilökődésének megakadályozásában gyógyászatilag kedvező lenne. Az idegen immunglobulinok injektálásán alapuló, már hatékonynak bizonyult megoldások azonban a humán gyógyászat gyakorlatában nem jöhetnek számításba.

A Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 25-39 (1983) közlemény olyan monoklónos antitestet ismertet, amely egy humán α-interferon fajtát a terminális karboxilcsoportjánál képes blokkolni. Minthogy a receptorhoz kötődésben az α-interferon-molekula N-terminális része vesz részt, ez az antitest a sejtfelületi receptorhoz kötött állapotban is képes felismerni az a-interferon terminális karboxilcsoportját. Ez az antitest azonban nem ismeri fel magát a humán α-interferon receptort, és ez az antitest sem az α-interferon receptor oldható formáival, sem a receptor ellen ható monoklónos antitestekkel nem rokon. Az idézett közleményben leírt antitest alkalmas azonban az α-interferon receptor oldható formáinak kimutatására, mert képes az oldható receptorhoz kötött interferonhoz kapcsolódni. Az így kialakult oldható interferon receptor /interferon/anti-interferon monoklónos antitest komplex az anti-interferon monoklónos antitest Fc-fragmenséhez kapcsolódni képes A-fehérje/Sepharose-gyöngyökkel kicsapható, és a csapadékból kimutatható az oldható interferon receptor.

Találmányunk azon az új megközelítésen alapul, hogy az a- vagy β-interferon hatásának blokkolására antagonistaként az α-interferon specifikus receptorának oldható formáit használjuk. A természetes receptor génsebészeti eljárásokkal előállított ilyen oldható formái

HU 215 587 Β megtartják a keringő vagy helyi endogén a-interferont megkötő képességüket, ugyanakkor azonban nem tartalmazzák azt a molekularészt, ami a természetes receptort a sejtfelülethez rögzíti. Ezért az α-interferon specifikus receptorának oldható formái szabadon keringhetnek a szervezetben, és specifitásuk révén csak az avagy β-interferonhoz kötődnek.

Az α-interferon specifikus receptorának oldható formái - az antitestekhez hasonlóan - képesek az avagy β-interferonnak a szervezetben kifejtett hatásait blokkolni.

A találmány értelmében az α-interferon specifikus receptorának ilyen oldható formáit állítjuk elő, amelyeket a továbbiakban vízoldható polipeptideknek nevezünk.

A találmány tárgya tehát eljárás vízoldható polipeptidek, éspedig

a) az 1. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú polipeptid és annak delécióval és/vagy helyettesítéssel kialakított származékai,

b) az 1. ábrán bemutatott nukleinsav-szekvencia által kódolt polipeptidek, és

c) a 2. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú polipeptid delécióval és/vagy helyettesítéssel kialakított származékai előállítására önmagukban vagy egy másik polipeptiddel képezett hibridek formájában.

A találmány értelmében úgy járunk el, hogy az adott polipeptidet vagy hibridet kifejezni képes sejteket alkalmas közegen tenyésztjük, majd a kifejezett terméket elkülönítjük.

A találmány szerinti eljárással előállítható vízoldható polipeptidek a- és β-interferonnal szemben nagy affinitást mutatnak, ami azt jelenti, hogy a komplex disszociációs állandója 10 ⁹ M-nél kisebb.

A „vízoldható” kifejezés azt jelenti, hogy a polipeptid képes a szervezetben (például az emberi testben) keringeni, majd egy sejthez kötődni.

A leírásban a „hibrid” megjelölésen egy, a fentiekben meghatározott vízoldható polipeptid (természetes receptor „oldható” része, módosított teljes receptor vagy például helyettesítéssel módosított természetes receptor „oldható” része) és egy másik polipeptid (például egy immunoglobulin vagy immunoglobulin-ffagmens) fúziós vagy konjugációs termékét értjük.

Egyszerűsítés céljából a továbbiakban az „a- és βinterferon receptor” kifejezés helyett az „interferon receptor” kifejezést is használjuk.

A találmány szerint előállítható vízoldható polipeptidek egyik előnyös képviselője az 1. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú vegyület, ami az a- vagy β-interferon természetes natív receptorának extracelluláris oldható része.

Az ebből a polipeptidből delécióval és/vagy helyettesítéssel kialakított származékok is megtartják a fenti interferonokkal szembeni nagy affinitást. Az 1. ábrán feltüntetett polipeptid deléciókkal és/vagy helyettesítésekkel kialakított származékainak előállítása is a találmány tárgyát képezi.

A deléciókkal kapcsolatban megjegyezzük, hogy az 1. ábrán feltüntetett polipeptidben lévő egy vagy több aminosav az a- és β-interferonnal szemben mutatott affinitás kedvezőtlen változása nélkül deletálható.

A deléciók a teljes és natív receptorra is vonatkozhatnak, különösen az oldható rész szintjén. Ily módon például a sejtmembránhoz való kötődés képessége elveszthető, és ezáltal a deletált termék a keringés számára rendelkezésre áll.

Ha a natív és teljes interferon receptornak a 2. ábrán feltüntetett szekvenciájából indulunk ki, a szekvencia transzmembrán és citoplazmikus szakaszai elhagyhatók.

A transzmembrán tartománynak megfelelő 437-457. maradék és a citoplazmikus tartománynak megfelelő 458—557. maradék deletálása például oldható (keringésre képes) formák képződéséhez vezet.

A teljes Ct- és β-interferon receptort kódoló aminosavak és nukleotidok teljes szekvenciáját a 2. ábrán mutatjuk be.

Amennyiben a deléciókat a transzmembrán és citoplazmikus (vagy celluláris és intracelluláris) szakaszokon végezzük el, kiküszöbölhetjük a potenciálisan immun epitópokat. A deletált transzmembrán tartományú natív a- és β-interferon receptorok egyik előnye, hogy a rekombináns gazdasejtek szövettenyészetének felülúszójában képesek kiválasztódni.

Miként már említettük, az 1. és 2. ábrán feltüntetett aminosav-szekvenciájú polipeptidekből delécióval származtatható vízoldható polipeptidek is a találmány szerint előállítható vegyületek közé tartoznak.

A helyettesítéses variánsok előállítása szintén a találmány tárgyát képezi. Ezeknél az interferon szekvenciájában lévő egy vagy több aminosav eltávolítható vagy más aminosavakkal helyettesíthető oly módon, hogy az aminosav össz-száma változatlan marad.

A helyettesítések előnyösen az interferon receptor oldható részére vonatkoznak. Ha a receptor oldható részének funkciójában vagy immunológiai azonosságában számottevő változást kívánunk előidézni, olyan nem konzervatív helyettesítéseket és aminosav-maradékokat vagy szekvenciákat választunk ki, amelyek a polipeptidben eredetileg jelenlévő csoportoktól abban különböznek, ami a polipeptid háromdimenziós szerkezetének a helyettesítés közelében való megtartása, valamint a molekula vagy az oldallánc túlnyomó része konjugációjának vagy hidrofobicitásának megmaradása szempontjából a legnagyobb jelentőséggel bír.

A receptor tulajdonságait módosító helyettesítések közül különösen jelentősek az alábbiak:

- valamely aminosav-maradéknak (pl. szeril vagy treonil) hidrofób maradékkal (pl. leucil, izoleucil, fenilalanil, alanil vagy valil) történő helyettesítése,

- ciszteinil-maradéknak bármely más maradékkal történő helyettesítése,

- elektropozitív oldalláncot tartalmazó maradéknak (pl. lizil, arginil vagy hisztidinil) elektronegatív maradékkal (pl. glutamil vagy aszpartil) történő helyettesítése,

- nagy térkitöltésű láncot tartalmazó maradéknak (pl. fenilalanil) ilyen részt nem tartalmazó maradékkal történő helyettesítése.

A helyettesítéses variánsok szintén a teljes interferon receptor szerkezetére vonatkozhatnak, és előnyösen

HU 215 587 Β a transzmembrán tartományt érintik. Az ezen a szinten végzett helyettesítések csökkentik a polipeptidnek a lipidsejtekkel vagy membránokkal szembeni affinitását, és igy az a- és β-interferon receptorának oldható formáit eredményezik.

A transzmembrán szakasz például egy attól eltérő olyan aminosav-szekvenciával (így homopolinukleotid DNS-szekvenciával vagy 5-50 azonos aminosavat például szerint, lizint, arginint, glutamint és aszparaginsavat - vagy más hidrofil aminosavakat tartalmazó bármely szekvenciával) helyettesíthető, ami lehetővé teszi, hogy az oldható receptor a rekombináns gazdasejtek tenyésztésekor a táptalajba választódjon ki.

Az 1. és 2. ábrán bemutatott polipeptidekből helyettesítéssel származtatható vízoldható polipeptidek előállítása is a találmány tárgyát képezi.

A fentiekből megállapítható, hogy a találmány szerint előállított polipeptidekben helyettesítések vagy deléciók, valamint az ilyen módosítások kombinációi egyaránt előfordulhatnak.

Általánosságban megállapítható, hogy a helyettesítéssel és/vagy delécióval kapott variánsoknak nincs funkcionális transzmembrán szakasza, és előnyösen intracelluláris (citoplazmás) része sincs.

Megjegyezzük, hogy a találmány szerint előállított vízoldható polipeptidekből kémiai módosításokkal más variánsok is kialakíthatók. Az ilyen módosítások célja elsősorban az a- és β-interferon receptor jellemző tulajdonságainak javítása. A kémiailag módosított polipeptidek például hidrofil polimereket tartalmazhatnak [ilyen például a szabad aminocsoportot hordozó aminosav-maradékokra (így a lizinre) vagy a szulfhidrilcsoportokra ojtott poli(etilén-glikol)]. A kémiai módosításokkal növelhető a polipeptidek felezési ideje a plazmában, fokozható a polipeptidek oldhatósága és/vagy csökkenthető a polipeptidek immunogén jellege. Ezeket a módosításokat önmagukban ismert módszerekkel - például a 4179337 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módon - végezhetjük el.

A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben meghatározott polipeptidek hibridizált (vagy emellett konjugált) módosulatainak előállítása is.

A konjugációban (hibridizációban) részt vevő második polipeptid például egy immunokompetens polipeptid lehet. Ilyen polipeptidek például azok, amelyek a hibridizált polipeptiddel kezelt állatban immunválaszokat váltanak ki, vagy amelyek az oldható interferon receptornak meg nem felelő polipeptidrésszel szembeni bármely antitesthez kapcsolódni képesek.

A receptornak meg nem felelő epitópok általában olyan antigéneket tartalmaznak, amelyeket a szervezetben már meglévő antitestek fel tudnak ismemi. Ilyenek például a baktériumok polipeptid-fragmensei, így a βgalaktozidáz.

Az immunkonjugációt például in vitro körülmények között keresztkötések kialakításával vagy egy immunogén polipeptidet kódoló DNS-sel transzformált rekombináns sejt tenyészetének felhasználásával végezhetjük el.

Előnyös megoldás szerint az immunogén ágenst polipeptid-kötéssel illesztjük be vagy kapcsoljuk hozzá az oldható receptorhoz vagy az oldható receptorból leszármaztató fragmenshez úgy, hogy az oldható receptornak megfelelő epitópokat és legalább egy, az oldható receptortól idegen epitópot tartalmazó polipeptidláncot kapjunk. Ezeket az epitópokat a polipeptidláncnak a receptorral vagy a receptor fragmensével kompatíbilis bármely más lókuszába beiktathatjuk.

Ezek a hibridek különösen előnyösen hasznosíthatók interferonreceptor-ellenes antitestek kialakítására melegvérűek szervezetében. Az így termelt antitestek például diagnosztikai szerekként használhatók az interferon receptorok biológiai mintákban való jelenlétének kimutatására, vagy a natív receptor vagy az interferon oldható receptorának tisztítására alkalmazhatók.

A konjugált polipeptidek egy másik csoportját alkotják azok az esetenként immunogén hibridek, amelyek a találmány szerint előállított polipeptid C-terminális régiójával konjugált másik vízoldható polipeptiden kívül még egy homopolimert (például pentahisztidint) is tartalmaznak. Ezek a hibridek hordozón rögzített kelátképző szerek (például cinkionok) segítségével könnyen elkülöníthetők a hibridek mellett szennyező anyagokat is tartalmazó keverékekből. A hordozóhoz kötött kelátképző szer segítségével adszorbeált hibridek egyszerűen leoldhatók a hordozóról, majd az így tisztított hibridekből kívánt esetben például enzimes hasítással felszabadítható az oldható interferon receptor.

A hibridek egy további csoportját képezik azok, amelyekkel javítható az oldható receptor kiválasztása. Ezekben a hibridekben az oldható receptor szignál polipeptidjét egy heterológ szignál polipeptid helyettesíti. Ha a gazdasejt ezt a hibridet felismeri, akkor azt fel is használja, és a receptor kiválasztódik.

A szignál polipeptideket a felhasznált gazdasejt jellemzőinek megfelelően választjuk meg. A szignál polipeptid például baktérium-, élesztő-, gomba-, növény-, emlős- vagy víruseredetű szekvencia lehet.

A hibridek előnyös csoportját képezik azok, amelyekben a hibridképző második polipeptid speciális szerkezete révén lelassítja a hibrid lebomlását az emberi szervezetben. Az ilyen második polipeptidek igen előnyös képviselői a receptor oldható részénél hosszabb (célszerűen több mint 20 órával hosszabb) felezési idejű plazmafehéqék, amelyek a találmány szerint előállított oldható polipeptidekkel hibridizálva meghosszabbítják az oldható polipeptidek hatásának időtartamát. Ilyen plazmafehéqe például a szérum albumin és az apolipofehéijék. A plazmafehérjék különösen előnyös képviselői az immunoglobulinok, elsősorban a G típusú, kiemelkedően előnyösen a G1 típusú immunoglobulinok.

A fenti hibridek az azokkal kezelt állati vagy emberi szervezetben előnyösen nem immunogének, és a plazmafehétjék saját biológiai aktiválásuk révén a betegekben káros mellékhatásokat nem idéznek elő.

A találmány szerint előállított vízoldható polipeptideket előnyösen a konstans tartomány szintjén konjugáljuk immunoglobulinokkal. Előnyösen G típusú, célszerűen G1 típusú immunoglobulint használunk.

HU 215 587 Β

Az immunoglobulinok és néhány variánsuk ismert, ezek sok képviselőjét rekombináns sejttenyészetekkel állítják elő [Kohler és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2197 (1980), Morrison és társai: Ann. Rév. Immunoi. 2, 239 (1984)].

Az a- és β-interferon natív receptora extracelluláris részének aktivitásával rendelkező polipeptidek C-terminális végükön a könnyű lánc vagy nehéz lánc konstans tartománya N-terminális végződésével lehetnek konjugálva.

Ily módon a variábilis tartomány helyettesíthető, és legalább a nehéz lánc konstans tartományának CH2 és CH3 átmeneti tartománya funkcionálisan aktív formában megtartható.

Erre a célra a megfelelő DNS-szekvencia kialakítható, és a rekombináns sejttenyészetekben kifejezhető.

Az immunoglobulinok és az a- és β-interferon oldható receptoránál a plazmában hosszabb felezési időt mutató más polipeptidek ugyanígy konjugálhatók a fenti receptorral és variánsaival.

Az interferon receptor extracelluláris része legfeljebb 427-436 aminosavat tartalmaz, a kezdeti metionintól kiindulva (lásd az 1. ábrát).

A rögzítési tartományt magában foglaló sejttartományt tartalmazó szekvenciákat általában az immunoglobulinok szekvenciájával konjugáljuk.

A konjugáció pontos helye nem döntő jelentőségű tényező. A fentiekben megjelölt kötődési helyek csupán tájékoztató jellegűek, és az a- és β-interferon oldható receptora kiválasztódási vagy rögzítési jellemzőinek optimalizálása céljából a konjugáció számára az oldható interferon más szomszédos helyei is választhatók. Az optimális hely szokásos kísérletek segítéségével határozható meg.

Általában azt találtuk, hogy a hibridek kifejeződnek a sejtben, a rekombináns gazdasejtek szekréciójának mértéke azonban bizonyos fokig változó. Az alábbi táblázatban különböző kapott immunoglobulin-interferonreceptor-fuziókat mutatunk be.

a) RC1

b) (RC1)2

c) (RCh)2

d) (RC12)2(RCh)2, ahol „R” az a- és β-interferon oldható receptornak a rögzítés helyét tartalmazó extracelluláris szakaszának egy részét jelenti, míg Cl és Ch rendre a humán immunoglobulin könnyű láncának és nehéz láncának konstans tartományát jelenti. A fenti szerkezetek csupán a fő szerkezeti jellemzőket mutatják be, és például a közös (J) tartományt vagy az immunoglobulinok más szakaszait vagy a diszulfidhidakat nem mutatják. Ha a megkötési aktivitáshoz ilyen szakaszokra szükség van, úgy ezeknek olyan helyzetben kell jelen lenniük, amelyet az a- és β-interferon oldható receptorokban, az aés β-interferon immunoreceptorokban vagy az immunoglobulinban a természetben elfoglalnak.

Ezek a példák a különböző ligandum/receptor-helyeket tartalmazó bifunkcionális hetero-antitestek olyan képviselői, ahol a VhCh immunoglobulin egy előre meghatározott antigénhez képes kapcsolódni. Más osztályokba tartozó immunoglobulinok nehéz láncainak felhasználása esetén komplexebb szerkezetek keletkeznek (pl. IgM, IgG2, 3,4, IgA, IgE, IgD, előnyösen IgGl).

Előnyös hibridek keletkeznek olyan oldható a- és β-interferon receptor N-terminálisának fúziójával, amely az a- és β-interferon liganduma számára kötődési helyet az immunoglobulin Gl-t befolyásoló funkciókat tartalmazó antitest Fc C-terminális részében tartalmaz. A példákban ilyen hibrideket is bemutatunk.

Az ilyen hibridek jellemzően az oldható a- vagy β-interferon receptor első 436 vagy 427 aminosavját tartalmazzák C-terminális végével a K-lánc vagy a Gl-lánc konstans tartományához kapcsolva. Az 1. ábrán bemutatott oldható a- vagy β-interferon receptort kódoló DNS-t a PCR-reakció [Polymerase Chain Reaction, lásd R. K. Saiki és társai: Science 239, 487-491 (1988)] és megfelelő restrikciós enzimekkel való emésztések kombinálásával szintetizálhatjuk, a példákban részletesen leírtak szerint.

Az (a/b) IFN-receptor cDNS-énak szekvenciájában az 5’ végződéstől lefelé előre meghatározott helyeken komplementer oligonukleotidokat alkalmazunk, a 2. ábrán bemutatott szekvenciának megfelelően.

A PCR-reakció templátjaként teljes cDNS-t [Uzé és társai: Cell 60(2), 225-234 (1990)] vagy egy lambda bakteriofágot tartalmazó plazmidot alkalmazunk. Kereskedelmi forgalomban beszerezhető cDNS-könyvtárt is felhasználhatunk. A cDNS-ffagmens továbbá teljes RNS-ből vagy jól ismert módszerekkel előállított polis+RNS-ből közvetlenül is szintetizálható [lásd O. Ohara és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5673-5677 (1989), J. Delort és társai: Nucl. Acid Rés. 17, 6439—6448 (1989)]. A cDNS- vagy RNS-könyvtár emberi sejtekből (pl. Daudi, Namalwa) vagy szervekből (pl. emberi lép) is kialakítható lényegében azonos eredménnyel.

Noha az interferon receptor egyedi polipeptidnek tűnik, szekvenciájának mégis létezhetnek bizonyos allélikus változatai.

A DNS-fragmenst egy immunoglobulin (ha a humán gyógyászatban felhasználható terméket kívánunk kialakítani, előnyösen egy humán immunoglobulin) könnyű vagy nehéz láncának konstans tartományát kódoló DNS-be illesztjük be.

Az immunoglobulinokat kódoló DNS-ek ismertek, és a kereskedelemben beszerezhetők vagy szintetizálhatok [lásd például Adams és társai: Biochemistry 19, 2711-2719 (1980), Gough és társai: Biochemistry 19, 2702-2710 (1980), Dolby és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6027-6031 (1980), Rice és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7862-7865 (1982), Falkner és társai: Natúré 298, 286-288 (1982), Morrison és társai: Ann. Rév. Immunoi. 2, 239-256 (1984)].

A hibrideket kódoló DNS-eket előnyösen a gazdasejtekbe transzfektáljuk kifejezésük céljából.

Ha a gazdasejt már transzfekció előtt nehéz immunoglobulin-láncokat termel, úgy a bifunkcionális hetero-antitestek termelése céljából elegendő az oldható a- és β-interferon receptorok könnyű láncait tartalmazó hibridet transzfektálni. Hasonlóan, ha a gazdasejt már

HU 215 587 Β könnyű láncokat kifejez, úgy az oldható a- és β-interferon receptorok nehéz láncait tartalmazó hibridet kódoló DNS transzfektálható a bifunkcionális antitest termelése céljából. Az a- és β-interferon kötődési helyét magában foglaló egy vagy több láncot és változtatható tartományokat magában foglaló egy vagy több láncot tartalmazó bifunkcionális immunoglobulinok kettősen specifikusak, éspedig a- és β-interferonnal, valamint egy előre meghatározott antigénnel szemben. Ezeket a fentiekben ismertetett eljárásokkal vagy in vitro módszerekkel állíthatjuk elő. Az utóbbi esetben például a hibrid F(ab)2 fragmenseit ismert módszerekkel (lásd például a 4444878 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) alakítjuk ki.

Bifunkcionális antitestek alternatív módszerrel oly módon állíthatók elő, hogy a kívánt antigénnel szemben specifikus antitesteket kiválasztó B-sejteket vagy hibridómákat fuzionálunk immunoglobulin/oldható aés β-interferon receptor-hibridet termelő sejtekkel (pl. mielómákkal). A bifunkcionális antitestek az ilyen hibridómák tenyészetének felülúszójából nyerhetők ki.

A találmány továbbá a fentiekben ismertetett vízoldható polipeptideket vagy azok második polipeptiddel képezett hibridjeit kódoló DNS-szekvenciák előállítására vonatkozik. Ezeket a DNS-szekvenciákat úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő DNS-ffagmenseket és/vagy nukleinsavakat ismert géntechnológiai módszerekkel a helyes sorrendben összekapcsoljuk egymással, és a kapott terméket PCR-el (polimeráz láncreakció) megsokszorozzuk.

Az emlős a- és β-interferonokkal szemben nagy affinitást mutató polipeptidek példáiként a prímátok oldható a- és β-interferon receptorait, továbbá a humán, patkány-, egér-, kutya-, macska-, szarvasmarha-, ló- és sertés-eredetű oldható a- és β-interferon receptorokat említjük meg. Az ilyen polipeptideket kódoló DNS-szekvenciák számos területen alkalmazhatók. Közelebbről ezek a szekvenciák vagy szekvenciarészek, valamint szintetikus vagy félszintetikus másolataik más cDNS-könyvtárak vagy humán vagy állati genomkönyvtárak szűrésére alkalmazhatók, az oldható a- és β-interferon receptorokhoz hasonló más DNS-szekvenciák hibridizáció útján történő szelektálására. Az ilyen DNS-ek, fragmenseik, valamint szintetikus vagy félszintetikus másolataik az oldható aés β-interferon receptorok variánsait képezik, és kiindulási anyagokként használhatók más variánsok mutáció útján történő előállításához. Ezek a mutációk vagy nem képesek megváltoztatni a mutált kodonok által kódolt aminosavak szekvenciáját, vagy megváltoztatják az aminosavakat. Mindkét típusú mutáció előnyösen hasznosítható az oldható a- és β-interferon receptorok termelése vagy felhasználása szempontjából. Ezek a mutációk például nagyobb termelékenységet, egyszerűbb tisztítást vagy nagyobb kötőkapacitást eredményeznek.

Egy alkalmas DNS-szekvencia példájaként a 2. ábrán bemutatott 1-1343. nukleotidból álló szekvenciát említjük meg.

A természetes a- és β-interferon receptor oldható formáinak variánsait kódoló DNS-t előnyösen olyan formában alkalmazzuk, amely lehetővé teszi annak kifejeződését egy transzkripciós egységben, a tervezett gazdasejttel kompatíbilis emlősök, mikroorganizmusok vagy vírusok transzkripciójára és transzlációjára szolgáló vezérlőelemek vezérlése alatt. A megfelelő sejtek transzformálása, transzfektálása vagy infektálása után ezek a vektorok lehetővé teszik a rekombináns polipeptid kifejeződését. A természetes a- és β-interferon receptor oldható variánsai megfelelő promotorok vezérlése mellett kifejezhetők emlősök, élesztők vagy baktériumok sejtjeiben vagy más sejtekben. Baktérium-, gomba-, élesztővagy emlős-gazdasejtek klónozására és kifejezésére felhasznált vektorokat Pouwels és társai írtak le [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985], a szakkönyv releváns részeire referenciaként hivatkozunk. A kifejező vektor adott esetben, azonban nem szükségszerűen tartalmazhat egy replikációs helyet, valamint egy vagy több, a transzformált sejtek között választást lehetővé tevő szelekciós marker-szekvenciát is.

A fent ismertetett polipeptideket kódoló DNS-be variációk is illeszthetők be, ezek azonban nem változtathatják meg a leolvasási keretet, és nem hozhatnak létre a kifejezés szempontjából káros szekunderszerkezeteket termelő komplementer szekvenciákat.

A természetes interferon receptor oldható variánsainak minősülő polipeptidek kötési aktivitása lényegében megegyezik a természetes receptoréval, azonban - miként már közöltük - a természetes receptorétól eltérő (például javított) jellemzőkkel rendelkező variánsok is kialakíthatók.

Bár a mutációs hely rögzített, maga a mutáció nem az. így például az adott helyen lejátszódó mutáció teljesítményének optimalizálása céljából a kodon vagy a célzott tartomány véletlenszerűen mutálható, és a kapott polipeptid-variánsok a szekunder jellemzők optimális kombinációjára szűrhetők. A helyettesítéses mutációknak a DNS adott helyeire történő beillesztésére szolgáló módszerek jól ismertek, ilyen például az M13-rendszer. A humán receptort kódoló DNS bármely ismert eljárással előállítható, szekvenciáját a 2. ábra mutatja be.

A fentiekben ismertetett polipeptid szekvenciák klónozására általában prokariótákat alkalmazhatunk. Különösen hasznosnak bizonyult az E. coli 294 (ATCC 31446) törzs, azonban más törzseket, így az E. coli X 1776 (ATCC 31537) törzset is felhasználhatjuk.

Miként már közöltük, az a- és β-interferon receptor oldható variánsai és azok hibridjei baktériumok, élesztők vagy emlősök sejtjeiben vagy más típusú sejtekben fejezhetők ki megfelelő promotor vezérlése mellett. A találmány tárgyát képezi továbbá az ilyen polipeptideket kifejező sejtek előállítása. Ezeket a sejteket úgy állítjuk elő, hogy a gazdasejtet az adott polipeptidet kódoló DNS-szekvenciával transzfektáljuk.

A rekombináns fehérjék kifejezésére prokariótarendszerek - például E. coli - alkalmazhatók. Az E. coli tipikusan a pBR322 (ATCC 37017) egy származékának felhasználásával transzformálható, ez egy E. coli-törzsből leszármaztatható plazmid [Bolivár és társai: Gene 2, 95 (1977)]. A pBR322 ampicillin- és tetraciklin-rezisz6

HU 215 587 Β tencia-géneket tartalmaz, és egyúttal a transzformált sejtek azonosításának egyszerű eszköze. A pBR322-plazmidnak vagy más mikrobaplazmidoknak a rekombináns DNS-szerkezetben általánosan használt kifejeződést vezérlő szekvenciákat is kell tartalmazniuk, vagy ezeket úgy kell módosítani, hogy tartalmazzanak ilyen vezérlő szekvenciákat.

A fenti vezérlőelemek példáiként a következőket soroljuk fel: laktóz (lac) promotor (ATCC 37121) [J. Mól. Appl. Génét. 1, 139-147 (1989)], β-laktamáz promotor [Chang és társai: Natúré 275, 615 (1987)], triptofán promotor [Miozzari: J. Bact. 133, 1457-1466 (1978)], továbbá hibrid promotorok, például tac (ATCC 37138) [H. de Boer és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)]. Ide tartoznak még a kereskedelmi forgalomban lévő vektorok, így a lambda fág promotort és hőre labilis c 1857-represszort tartalmazó trc vagy a pPLlambda promotort tartalmazó pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország). A vezérlőelemek köre azonban nem korlátozódik a példaként fent felsoroltakra.

Más funkcionális promotorok is alkalmasaknak bizonyultak. A DNS-szekvenciák általánosan ismertek, így ezek megfelelő kötőelemek vagy adapterek felhasználásával konjugálhatók az a- és β-interferon receptor oldható variánsait kódoló DNS-sel. A bakteriális rendszerek promotorai ezenkívül egy úgynevezett ShineDalgamo (SD) szekvenciát is tartalmaznak, az antigént lefelé kódoló DNS-hez operatívan kapcsolva.

A megfelelő gazdatörzs transzformálása és a transzformáit gazdatörzs megfelelő tenyészetsűrűségig történő tenyésztése után a kiválasztott promotort alkalmas módon (például a hőmérséklet megnövelésével vagy kémiai indukcióval) de-represszáljuk, és a mikroorganizmusokat tovább tenyésztjük. Ezután a mikroorganizmusokat - rendszerint centrifugálással - összegyűjtjük, kémiai vagy fizikai úton lizáljuk, és az extraktumot továbbtisztításra elkülönítjük.

A mikroorganizmusokat maximális növekedést biztosító körülmények között levegőztetve, erős keverés közben fermentáljuk egy például 10 literes fermentorban. Előnyösen habzásgátlót használunk. A törzstenyészetet Mott és társai által leírt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 88 (1985)] szuperindukciós táptalajon 30 °Con tenyésztjük. A₆₀₀ = 5 - 6 abszorpciónak megfelelő tenyészetsűrűség elérésekor a hőmérsékletet 42 °C-ra növelve de-represszáljuk a promotort, majd 2-20 (előnyösen 3-6) órával a hőmérsékletváltoztatás után összegyűjtjük a sejteket. A mikroorganizmus-masszát először szűréssel vagy más módon tömörítjük, majd 10 000 g gyorsuláson 4 °C-on 10 percig centrifúgáljuk, végül a kapott pelletet gyorsan megszilárdítjuk. A baktériumtenyészetben termelődött rekombináns fehérjéket a pelletet extrakciójával, majd az extraktum egy vagy több lépésben végzett betöményítésével, sómentesítésével vagy ioncserés vagy kizárásos kromatografálásával különítjük el.

Az a- és β-interferon receptor oldható variánsainak kifejezésére felhasznált mikroorganizmusokat bármely alkalmas módszerrel (például ciklikus fagyasztással-felengedtetéssel, mechanikai feltöréssel vagy vegyszeres úton) lizálhatjuk. Az a- és β-interferon receptor oldható variánsai bizonyos mértékig aggregációra hajlamosak. Az aggregátumképződés csökkentésére az extrakciót és a tisztítást detergens (például Tween 80 vagy Triton XI00) jelenlétében végezhetjük.

Olyan vízoldható polipeptidek esetén, amelyek DNS-szekvenciája nem metioninnal kezdődik, az iniciáló szignál felfelé egy további metionin aminosav belépését eredményezi, és ez képezi a termék N-terminális részét. Noha ezek a további N-terminális metionint tartalmazó termékek is felhasználhatók a találmány szerinti eljárásokban, előnyösebb ezt a metionint előzetesen eltávolítanunk. Az N-terminális metionin eltávolítására szolgáló standard in vivő és ex vitro módszerek jól ismertek.

A korábbiakban meghatározott polipeptidek vagy hibridek kifejezésére élesztőrendszerek, így előnyösen Saccharomyces-típusok (köztük a könnyen hozzáférhető S. cerevisiae) is felhasználhatók.

Az alkalmas élesztővektorok általában a következő elemeket tartalmazzák: replikációs origó, az élesztő és E. coli transzformálását lehetővé tevő szelekciós marker [például az E. coli ampicillin-rezisztencia-gén és a S. cerevisiae trpl génje, ami egy triptofán jelenlétében növekedésre képtelen élesztőmutáns (ATCC 44076) szelekciós markerje], és egy az élesztőben szuperexpresszált génből kapott promotor a gén felfelé való transzkripciójának indukálására. Élesztő-gazdaszervezetek számára alkalmas promotorok például a következők: a 3-foszfoglicerát-kináz vagy más glikolízis enzimek promotorja, a savas foszfatáz promotorja (például PH05), és az α-típusú kapcsolófaktorok promotorja. Élesztő-gazdaszervezetek számára alkalmas promotorok továbbá a promotor régiók, így a 2-alkohol-dehidrogenáz [Russel és társai: J. Bioi. Chem. 258, 2674 (1982)]. A promotor és a felfelé irányulva kifejezendő struktúrgén közé egy szignálpeptid (például egy heterológ élesztőfehérje kiválasztását lehetővé tevő faktor szignálpeptidje) is beiktatható [lásd Bittér és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5330 (1984)]. Az élesztő transzformálásának módszerei szakember számára jól ismertek. Egy jellemző módszert Hinnen és társai ismertettek [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)], amellyel trp+ transzformánsok szelektálhatok egy 0,67% nitrogéntartalmú élesztőbázist, 0,5% kazaminosavat, 2% glükózt és 10 pg/ml uracilt tartalmazó szelekciós táptalajon. A PH05-promotort magában foglaló vektorokat tartalmazó transzformált gazdatörzsek kezdetben dús táptalajban képezett előtenyészet formájában tenyészthetők, majd a táptalaj szervetlen foszfátkoncentrációjának csökkentésével de-represszálhatók. A törzset szokásos módszerekkel tenyésztjük.

A rekombináns polipeptidet oly módon nyerjük ki, hogy a glükozidáz enzimes emésztéssel és ezt követő, detergenssel végzett kezeléssel vagy mechanikai úton (pl. préseléssel) lizált sejtpelletet extraháljuk, majd egy vagy több lépésben betöményítjük, sómentesítjük, ioncserélésnek vagy kizárásos kromatografálásnak vetjük alá. Ha a polipeptid a periplazmatikus térbe választódik

HU 215 587 Β ki, a sejteket a membrán külső rétegét károsító és a rekombináns polipeptid felszabadulását lehetővé tevő vegyszerrel (pl. EDTA-val) kezeljük, és ezután nyeljük ki a polipeptidet. Ha a polipeptid a táptalajba választódik ki, azt közvetlenül kinyerhetjük.

A korábbiakban meghatározott polipeptidek vagy hibridek emlőssejtekben is kifejezhetők alkalmas promotorok vezérlése alatt. Emlős a- és β-interferon receptor oldható variánsainak termelésére sejtmentes rendszereket is felhasználhatunk, a találmány szerint kialakított DNS-ekből leszármaztatható RNS-ek alkalmazása mellett.

Az emlős gazdasejtekben történő kifejezést vezérlő promotorok különböző forrásokból nyerhetők. Ilyenek például a vírus (így polioma, majom SV40-vírus, adenovírus, retrovírus hepatitis B citomegalovírus) genomokból származó promotorok, egyes emlős promotorok (például a humán β-globin gén DNS-áz I-ére érzékeny helyeket tartalmazó promotor), és egyes rovarvírus-promotorok (így a baculovírus-rendszer poliéder promotor). Állati sejtekben való kifejezésre előnyösen használható az adenovírus-2 kései fő promotoqából leszármaztatható vezérlőtartomány.

Az SV40 korai és kései tartományait előnyösen az SV40-vírusból különítjük el, a vírus replikációs origóját tartalmazó restrikciós fragmens formájában [lásd Fiers és társai: Nature272, 113 (1978)].

A humán citomegalovírus korai közvetlen tartományát Hind IIIE restrikciós fragmens formájában izoláljuk [Greenaway P. J. és társai: Gene 18, 356-360 (1982)]. Az adenovírus-2 kései promotoiját a 8-17. térképegységeket tartalmazó Hind III restrikciós fragmens alakjában izoláljuk [S. Hu és J. L. Manley: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 820-824 (1981)]. Szülőtípusú sejteredetű eukarióta promotorok is hasznosaknak bizonyultak.

Eukarióta-kifejező vektorokban a transzkripciót úgy növeljük, hogy a promotoron kívül aktivátorokat tartalmazó szekvenciákat is beiktatunk. Az aktivátorok DNS-elemek, amelyek azonos oldalon hatnak, néhányszor tíz-háromszáz bázispárt tartalmaznak, és fokozzák a promotor transzkripciót iniciáló képességét. Számos aktivátorról (globin, elasztáz, albumin, inzulin stb.) ismert, hogy emlősgénekre hat. Rendszerint azonban eukarióta sejteket fertőző vírusok aktivátorait használjuk, amelyek közül példaként a következőket soroljuk fel: a replikációs origó kései oldalának SV40 aktivátora (100-270 bázispár), a citomegalovírus korai közvetlen promotorjának aktivátora, a replikációs origó kései oldala poliomájának aktivátora, a replikációs origó kései oldala poliomájának aktivátora és az adenovírus aktivátora. Az eukarióta sejtekben (élesztők, gombák, rovarok, növények, állatok, ember) használt kifejező vektorok továbbá a mRNS kifejezésének befolyásolására képes faktorok transzkripciójának hasításához és lezárásához szükséges szekvenciákat is tartalmazhatnak. A kifejező vektorok szelekciós gént tartalmaznak.

Az emlőssejtek szelekciós markeljei közül példaként a dihidrofolát reduktázt (DHFR), a timidin-kinázt és a neomicint említjük meg. Ha ilyen szelekciós markereket transzfektálunk emlős gazdasejtbe, a szelekciós nyomás hatásának kitett transzformált sejt túlélésre képessé válik. Rendszerint kétféle típusú szelekciós rendszer használatos. Az egyik típus olyan mutáns sejtvonalakat alkalmaz, amelyek növekedése attól függ, hogy a táptalaj tartalmaz-e egyes meghatározott anyagokat vagy sem. Ilyenek például a CHO DHFR-sejtek vagy a rágcsálóeredetű LTK-sejtek, amelyek timidin vagy hipoxantin hozzáadása nélkül nem képesek növekedni. Ha ezekbe a sejtekbe transzfektálással funkcionális DHFR- vagy TK-gént építünk be, a sejtek túlélőképessé válnak, míg a DHFR- vagy TK-génnek nem transzformáit sejtek változatlanul nem növekednek a timidinnel vagy hipoxantinnal ki nem egészített táptalajon.

A másik megoldás a domináns szelekció, ami nem igényel mutáns sejteket. Ekkor például a sejtbe a sejtet egy toxikus anyaggal szemben rezisztenssé tevő gént transzfektálunk, majd azt kifejezzük [lásd Southern és Berg: J. Molec. Appl. Génét. 1, 327 (1982), Mulligan és Berg: Science 20, 1422 (1980), Sugden és társai: Mól. Cell. Bioi. 5, 410-413 (1985)].

A sejt bizonyos kromoszómatartományainak növelését vagy replikációját amplifikációnak (sokszorozás) nevezzük, és ezt egy szelekciós ágens [például a DHFR-t inaktiváló metotrexát (MTX)] felhasználásával hozzuk létre. Az MTX mennyiségének növekedésével nő a DHFR-gén amplifikációja vagy másolatszáma, ami a DHFR-termelés növekedését eredményezi. Az amplifikáció foka a táptalaj MTX-koncentrációjának növekedésével nő. A kívánt gén amplifikációját a kívánt gén és a kromoszómában kointegrált DHFR-gén ko-transzfekciójával éljük el. A kívánt gén és a DHFRgén ko-amplifíkációja után a kívánt fehéijét kódoló gén több kívánt fehérjét fejez ki.

A korábbiakban meghatározott oldható interferon receptor-variánsok kifejezésére a találmány szerint gazdasejtként előnyösen emlőssejteket, köztük majomvesesejteket (COS-7, ATCC CRL 1651) és kínaihörcsögsejteket [CHO-, DHFR-, Urlaub és Chasin: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)] használunk.

Az emlőssejtek transzformálására szolgáló módszerek jól ismertek. Egy előnyös módszert, amelynek során a DNS-t kalcium-foszfáttal csapják ki, Graham F. és van dér Eb ismertetett [Virology 52, 456-457 (1973)]. Egy másik módszer szerint elektroportálást végeznek [G. Chu és társai: Nucl. Acid. Rés. 15, 1311-1326 (1987)]. Más transzfekciós módszereket is alkalmazhatunk, például a magba való befecskendezést vagy a protoplasztokkal végzett fúziót.

A kívánt vezérlő és kódoló szekvenciákat tartalmazó kifejező vektorokat jól ismert standard módszerekkel alakítjuk ki [lásd például Maniatis T. és társai: Molecular Cloning, 133-134 (Cold Spring Harbor, 1982), továbbá Ausubel és társai (szerk.): Current Protocols in Molecular Biology (kiadó: Greene Publishing Associates és Wiley Interscience, 1987)]. A DNS plazmidjait vagy fragmenseit elkülönítjük, hasítjuk, méret szerint osztályozzuk, majd a kívánt formára hasítjuk.

HU 215 587 Β

A helyes plazmidszekvenciákat ligációs keverékekkel E. coli HB101 vagy E. coli K12 194 (ATCC 31446) törzsben való transzformáció után meghatározzuk. Az ampicillinnel szemben rezisztens transzformánsokat kiválasztjuk. A plazmidokat elkülönítjük a transzformánsokból, és jól ismert módon restrikciós enzimekkel való kezeléssel vagy szekvenciameghatározással elemezzük [lásd Messing és társai: Nucl. Acid. Rés. 9, 309 (1981) és Maxam és társai: Methods in Enzymology 65, 499 (1980)].

A gazdasejteket általában kifejező vektorokkal transzformáljuk, majd olyan alkalmas táptalajban tenyésztjük, amely a promotor kifejezését indukáló anyagokat, a transzformánsok szelektálására szolgáló komponenseket vagy a gének amplifikációját elvégző anyagokat tartalmaz. A kiválasztott kifejező tenyészethez alkalmazandó fermentációs körülmények (pl. hőmérséklet, pH) szakember számára jól ismertek.

A találmány szerint előállított polipeptideket rekombináns gazdasejtek felülúszóiból izoláljuk és tisztítjuk. A felülúszókat rendszerint ultraszűréssel töményítjük be, majd ioncserés kromatográfiával vagy immunoaffinitással tisztítjuk a várt polipeptidek adszorbeálása és azt követő eluálása céljából. Az antigén aggregátumok képzésére erősen hajlamos. Ezért a tisztítási műveleteket előnyösen detergens (pl. Tween 80, Triton X100 vagy CHAPS) jelenlétében végezzük. A végterméket fehérjékkel (pl. albuminnal) stabilizáljuk. Adott esetben ezek a fehérjék detergenst tartalmazhatnak.

Megjegyezzük, hogy a kifejezés vezérlésére szolgáló összes vektor vagy szekvencia és az összes gazdasejt nem működik egyformán minden kifejező rendszerben. A megfelelő vektorok, kifejezést vezérlő szekvenciák és gazdasejtek kiválasztása a jelen találmány oltalmi körén belül a szakember köteles tudásához tartozik. Az alkalmas egysejtű gazdaszervezetek megválasztásakor például a következő tulajdonságokat kell figyelembe venni: a kiválasztott vektorral való összeférhetőség, a találmány szerint előállított DNSszekvenciák által kódolt termék toxicitása, a szekréciós jellemzők, a fehéijehajtogató jellemzők megfelelősége, a fermentációs követelmények, a találmány szerint előállított DNS-szekvenciákkal való kifejezés után nyert rekombináns termékek tisztíthatóságának egyszerűsége.

A fenti paraméterek figyelembevételével szakember könnyen kiválaszthatja azokat a vektorrendszer /kifejezést vezérlő rendszer/ gazdasejt-kombinációkat, amelyek a találmány szerint előállított DNS-szekvenciákat állati sejtek (pl. CHO- vagy COS-7-sejtek) nagyléptékű fermentációja vagy tenyésztése során kifejezik.

Miként már közöltük, a találmány szerint előállított polipeptidek immunomodulátorokként (elsősorban immunoszupresszánsokként) hasznosíthatók, és a gyógyászatban például autoimmun-betegségek kezelésére, valamint az átültetések kilökődésének megakadályozására alkalmasak. Ezekre a célokra a találmány szerint előállított polipeptideket előnyösen gyógyászati készítmények formájában alkalmazzuk.

A találmány tárgya tehát továbbá eljárás gyógyászati készítmény előállítására oly módon, hogy egy a találmány szerint előállított vízoldható polipeptidet gyógyászatilag alkalmazható hordozóanyagok, hígítószerek és/vagy egyéb segédanyagok felhasználásával, szokásos gyógyszertechnológiai műveletekkel gyógyászati készítménnyé alakítunk.

A gyógyászati készítmények például szilárd, félszilárd és folyékony kompozíciók, így tabletták, pilulák, porok vagy injekciós vagy infúziós oldatok lehetnek. Az előnyös kikészítési forma az adagolás módjától és a terápiás felhasználástól függ. A találmány szerint előállított gyógyászati készítményeket más gyógyászatiig jelentős polipeptidek alkalmazásához hasonlóan használhatjuk fel, és a készítmények formája is a más polipeptideket tartalmazó készítményekhez hasonló. így a polipeptidet például liofilizált alakban tárolhatjuk, amiből a felhasználásra kész gyógyszert közvetlenül a felhasználás előtt alakítjuk ki steril víz hozzáadásával, majd ezt szokásos módon, így parenterálisan (például szubkután, intravénás, intramuszkuláris vagy intralezionális úton) adjuk be. A hatóanyagok hatásos dózisa napi 1-5 mg/testtömeg kg nagyságrendű lehet, de megjegyezzük, hogy ennél kisebb vagy a felső határt kétszeresen meghaladó dózisok is káros következmények nélkül beadhatók.

A találmány szerint előállított gyógyászati készítményeket károsan abnormális a- és β-interferon-termelésben szenvedő betegeknek például a következő betegségek kezelése céljából adhatjuk be: lupus erythematosus, Bechet-szindróma, apláziás anémia, diabetes mellitus, sclerosis multiplex, reumatoid arthritis, súlyos immunhiányos betegségek, AIDS. A találmány szerint előállított gyógyászati készítmények továbbá az immunaktivitást módosító tulajdonságaik (pl. NK-sejtek aktiválása vagy hisztokompatíbilis antigének kifejezése) révén olyan betegek kezelésére is alkalmasak, akiknél fennáll az átültetett szervek vagy szövetek kilökődésének veszélye.

A találmány szerint előállított gyógyászati készítmények hatóanyagai természetük és hatásmechanizmusuk révén mentesek a korábban ismert hatóanyagok (például a kémiai immunoszupresszánsok, így a glükokortikoidok) általános toxicitásától, ezért a jelenlegi klinikai gyakorlatban használatos gyógyszerekhez képest jelentős előrelépést jelentenek. A jelenleg használatos gyógyszerek közül példaként az immunrendszer összes elemének sejtosztódását és citokinszintézisét gátló immunoszupresszorokat és származékaikat (így az adrenális kortikoszteroidokat), továbbá a ciklosporin nevű gyűrűs undekapeptidet említjük meg [az utóbbi szelektíven gátolja az immunrendszer aktiválódását, ami ugyan nyilvánvaló haladást jelent, de emellett számos nem immunológiai toxikus hatása is van, lásd: N. Engl. J. Med. 321 (25), 1725-1738 (1989)].

A találmány szerint előállított polipeptidek az a- és β-interferontól eltérő agonisták vagy antagonisták működésének szabályozására is felhasználhatók.

HU 215 587 Β

A találmány szerint előállított polipeptidek tisztított állapotban arra is felhasználhatók, hogy meghatározzuk az oldható a- és β-interferon receptorok kötődési helyének tercier szerkezetét. A tercier szerkezet ismerete előfeltétele az olyan molekuláris modell kialakításának, amiből a gyógyászatban immunoszupresszorként felhasználható antagonisták vagy vírusellenes vagy tumorellenes szerként alkalmazható agonisták szintézisében hasznosítható szerkezeti következtetések vonhatók le.

A találmány szerint előállított polipeptideket diagnosztikai célokra is felhasználhatjuk.

A diagnosztikai célú felhasználások egyik példája az interferon receptor elleni antitestek kialakítása oly módon, hogy melegvérű állatoknak a találmány szerint előállított polipeptidet és egy gyógyászatilag alkalmazható szubsztrátumot adunk be, majd az immunreakció lezajlása után az állatokat kivéreztetjük, és a vérből elkülönítjük az antitesteket. Ezeket a műveleteket szokásos immunbiológiai módszerekkel végezzük. Az így kialakított antitesteket például különféle diagnosztikai mérésekhez vagy farmakológiai modellvizsgálatokhoz használhatjuk fel.

A diagnosztikai célú felhasználások másik példája az a- és β-interferon receptor elleni antitestek jelenlétének kimutatása biológiai mintákban. Az antitesteket önmagában ismert immunbiológiai módszerrel mutatjuk ki, amelynek lényege, hogy a vizsgálandó biológiai mintát az antitesttel komplexet képező anyaggal hozzuk érintkezésbe a komplex kialakulását lehetővé tevő körülmények között, majd kimutatjuk a komplex jelenlétét. A találmány értelmében az antitesttel komplexet képező anyagokként a találmány szerint előállított polipeptideket használjuk.

Megjegyezzük, hogy ha kifejezetten mást nem közöltünk, a „találmány szerint előállított (vízoldható) polipeptid” megjelölésen a leírás bevezető részében felsorolt polipeptidek szabad és második polipeptiddel hibridizált formáit egyaránt értjük.

Találmányunk további részleteit a következő példákban ismertetjük anélkül, hogy az oltalmi kört a példákra korlátoznánk.

/. példa

Emlőssejtek által kiválasztott natív a- és ^-interferonok vízoldható receptorának és variánsainak kifejezésére szolgáló vektorok felépítése

1. szekció

Natív interferon receptor kifejezésére szolgáló plazmidok felépítése

Teljes cDNS-t tartalmazó és a natív a- és β-interferonok receptorát kódoló DNS-fregmenseket PCRreakció felhasználásával szintetizálunk. Templátként a 2. ábrán bemutatott a- és β-interferonok receptora cDNSének teljes hosszát tartalmazó lambda ZAP-bakterofágot alkalmazunk és a reakció primerjeként specifikus oligonukleotidok szolgálnak. Közelebbről, a lambda ZAP-bakterofágot egy szintetikus oligonukleotid-párral inkubáljuk, amely a cDNS 5’ végén levő antiszemszállal komplementer, az oligo 0:5’ -CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCG GCTCCCAG-3’ szekvenciájú oligonukleotidból és a cDNS 3’ végén levő kódoló szállal komplementer, az oligo-1:3 ’-C AAAAAGTCGTCCTCAATGTG ACCATGGCC-5’ szekvenciájú oligonukleotidból áll.

Az oligonukleotidokat oly módon építjük fel, hogy a PCR-reakció befejeződése után a kapott DNSfragmensek kettős szála a Pstl-enzim számára az 5’ végződésen és a Kpnl számára a 3’ végződésen restrikciós helyet tartalmaz.

A PCR-reakciót 100 pl reakciótérfogatban PCRpufferben végezzük el, amely 1-1 mM mennyiségben primereket, 100 pg lambda ZAP-bakterofágot és 1 egység Taq-polimerázt tartalmaz. A reakciókörülmények az alábbiak: 25 ciklus; egy ciklus 95 °C-on egy órán át végzett inkubálásból (denaturálás), 37-40 °C-on 3 percen át történő kezelésből (hibridizáció), majd 72 °C-on 4 percen át történő melegítésből (polimerizáció) áll. Az utolsó ciklus után a reakciót 72 °C-on 10 percen át folytatjuk, és a mintákat 4 °C-on tároljuk. A reakciótermékeket kloroformmal extraháljuk, majd etanolos kicsapás után a termékeket egymás után Kpnl-el és Pstl-el emésztjük. Az 1,7 kb fragmenst (1. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézis után összegyűjtjük és a pSVAdpAl kifejező vektorhoz kapcsoljuk.

A pSVAdpAl kifejező vektort a következőképpen építjük fel:

Az SV40-szekvenciákat a pSV2DHFR-plazmidból kapjuk [Subrami és társai: Molec. Cell. Bioi. 1, 854-864 (1981)]. Ezek a replikációs eredetet, az aktivátort, a korai és kései promotorokat (Pvull-HindlII fragmensek) és a hasítóhelyei (donor és akceptor) által körülvett antigén intronját, valamint a korai tartomány poliadenilezési helyét (Bgl II-Eco Rl-fragmens) tartalmazzák.

A 2-adeno kései fő promotor tartományát a pAdD26SVpA-plazmidból (EcoRi-Pstl-fragmens) kapjuk [Kaufman és Shimke: P. A.: J. Mól. Bioi. 159, 601-621 (1982)]. Ez a promotort, a tripartita vezetőt [Zain és társai: Cell. 16, 851 (1979)] és egy hibrid hasítóhelyet tartalmaz, amely a 2-adeno-donor hasítóhelyéből és az immunoglobulin változtatható tartománya akceptorhasító helyéből áll.

A többszörös klónozóhely a pUC18-plazmidban találttal azonos. Ez a Pstl, Sál I, Acc I, Hinc II, Xba I, Bam Hí, Xma I, Sma I, Kpnl, Sacl, Bán II, EcoRI számára restrikciós helyeket tartalmaz.

A plazmid az E. coli replikációs eredetét és az ampicillinrezisztens gént tartalmazza és a pML-plazmidból származtatták le [Lusky és Botchan: Natúré 293, 79-81 (1981)].

A pSVAdl-plazmidot egymás után Kpnl-el és Pstlel emésztjük, majd foszfatázzal kezeljük és a plazmid fő részét tartalmazó fragmenst (2. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk. A 2. fragmenst az 1. fragmenshez kapcsoljuk és a

HU 215 587 Β kapcsolt keveréket kompetens E. coli HB 101-sejtekbe transzfektáljuk. A transzformált tenyészetet ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó Petri-csészékbe öntjük és az ampicilinrezisztens telepeket szelektáljuk. Ezekből a transzformánsokból a DNS-plazmidot elkészítjük és analizáljuk; az elemzés során a megfelelő inzert jelenlétét restrikciós enzimekkel vizsgáljuk és a szekvencia helyességének megerősítése céljából az 5’ és 3’ végződéseken az inzert kapcsolódásait szekvencia-analízissel határozzuk meg.

A natív sejtreceptor emlőssejtekben történő kifejezéséhez a pSVAdIFRpA-plazmidot alkalmazzuk.

2. szekció

Az a- és ^-interferon receptorok kiválasztott variánsainak kifejezésére szolgáló plazmidokfelépítése

A különböző karboxi-terminálisokat tartalmazó re5 ceptor különböző delécióit tartalmazó és a receptor kiválasztott formáit kódoló DNS-fragmenseket PCR-reakció felhasználásával szintetizálunk. Közelebbről, a receptor teljes cDNS-ét tartalmazó lambda ZAP-bakterofágot primerként szolgáló különböző szintetikus oligonukleotid10 párokkal inkubálunk, amelyek az 5’ végen levő antiszemszállal komplementer, az

5’ végoligo: 5’-CCGGCTGCAGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3’ szekvenciájú oligonukleotidot és a cDNS különböző helyein levő kódolószállal komplementer, valamely

3’ végoligo 1: 3’-CGTCCTTTATGGAGATTTACTCCATGGCC-5’ 3’ vég oligo 2: 3’-TCACTGCGACATACACTCACTCCATGGCC-5’ 3’ vég oligo 3: 3’-GTCAGACCTTTGTGCGGAACTCCATGGCC-5’ 3’ vég oligo 4: 3’-GTCACACAGAAAGGAGTTTACTCCATGGCC-5’ 3’ vég oligo 5: 3’-CTCTGATGAATAACAGATACTCCATGGCC-5’ szekvenciájú oligonukleotidok közül egyet tartalmaznak.

Az oligonukleotidokat oly módon építjük fel, hogy a PCR-reakció befejeződése után a kapott kettős szálú DNS-fragmensek a Pstl-enzim számára az 5’ végződésen és a Kpnl számára a 3’ végződésen restrikciós helyet tartalmaznak.

A PCR-reakciót 100 μΐ reakciótérfogatban PCR-pufferben végezzük el, amely 1-1 μΜ mennyiségben primereket, 100 pg lambda ZAP-bakterofágot és 1 egység Taq-polimerázt tartalmaz. A reakciókörülmények az alábbiak: 25 ciklus; minden ciklus 95 °C-on egy percen át végzett inkubálásból (denaturálás), 37-40 °C-on percen át végzett kezelésből (hibridizálás) és 72 °C-on percen át végzett melegítésből (polimerizáció) áll. Az utolsó ciklus után a reakciót 72 °C-on 10 percen át folytatjuk, majd a mintákat 4 °C-on tároljuk. A reakciótermékeket kloroformmal extraháljuk, majd etanolos kicsapás után a termékeket egymás után Kpnl-el és Pstl-el emésztjük. A kívánt fragmenseket alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézis után összegyűjtjük. Az összegyűjtött fragmensek hossza hozzávetőlegesen a következő:

1. reakció (5’ vég oligo fragmens 3

2. reakció (5’ vég oligo fragmens 4

3. reakció (5’ vég oligo + 3’ vég oligo 3): 1,1 kb fragmens 5

4. reakció (5’ vég oligo + 3’ vég oligo 4): 0,9 kb fragmens 6

5. reakció (5’ vég oligo + 3’ vég oligo 5): 0,6 kb fragmens 7

A 3-7-ből származó DNS-fragmenseket külön-külön kapcsoljuk a pSVAdpAl kifejező vektorhoz.

A pSVAdl-plazmidot egymás után Kpnl-el és Pstlel emésztjük, majd foszfatázzal kezeljük és a plazmid

3’ vég oligo 1): 1,3 kb

3’ vég oligo 2): 1,3 kb fő részét tartalmazó fragmenst (2. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk. A 2. fragmenst külön-külön kapcsoljuk a 3-7. fragmensekhez és a kapcsolt keveréket kompetens E. coli HB 101-sejtekbe transzfektáljuk. A transzformált tenyészeteket ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó

Petri-csészékbe öntjük és a rezisztens telepeket szelektáljuk. Ezekből a transzformánsokból a DNSplazmidot elkészítjük és analizáljuk; az elemzés során a megfelelő inzert jelenlétét restrikciós enzimekkel vizsgáljuk és a szekvencia helyességének megerősítése céljából az 5’ és 3’ végződéseken az inzert kapcsolódásait szekvencia-analízissel határozzuk meg.

A plazmidok elnevezése: pSVAdsIFlpA, pSVAdsIFR2pA, pSVAdsIFR3pA, pSVAdsIFR4pA, pSVAdsIFR5pA. Ezeket a plazmidokat használjuk fel az oldható receptornak és fragmenseinek emlőssejtekben történő kifejezésére.

2. példa

CHO-sejtekben történő kifejezés 45 Miután az oldható receptor átmeneti kifejezését teszteltük, az oldható receptort folyamatosan kifejező stabil sejtvonalat felépítjük. Ennek elvégzéséhez gazdasejtként dihidro-folátreduktáz-deficiens vonalat alkalmazunk, éspedig a CHO DUK-X-vonalat hasz50 náljuk [F. Kao és társai: PNAS USA, 64, 1284-1291 (1969); Chasin L. és Urlaub G.: Proc. Natl. Acad. Sci, 77, 4216-4280 (1980)]. E rendszer felhasználásával az oldható a- és β-interferon receptort az egér-DHFR-gént tartalmazó pSV2DHFR-vektorral ko-transzfektáljuk [Subrami és társai: Molec. Cell. Bioi. 1, 854-864 (1981)]. E ko-transzfekció elvégzése előtt az összes plazmidot egy restrikciós enzimmel végzett restrikcióval linearizáljuk, és transzfekció előtt minden plazmidot a pSV2DHFR-plazmiddal külön60 külön összekeverünk oly módon, hogy az SV2DHFR11

HU 215 587 Β és IFR-plazmid aránya 1:10 legyen. Ezáltal az IFR-gének kópiáinak egy transzfektánsra eső számát maximalizáljuk. A plazmidok a sejtben polimerek képződése mellett kapcsolódnak, amelyek a gazdasejt kromoszómájában rekombináció segítségével integrálhatók [Haynes és Weismann; Nucl. Acids. Rés. 11, 687-706 (1983); Scahill S. J. és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4654-4658 (1983)]. A patkányés egér-DHFT-t egy α-táptalajban kifejező transzfektánsokat szelektáljuk; az α-táptalaj nukleozidmentes közeg. Ezután a DHFR-t magas szinten kifejező sejtek szelektálása céljából methotrexátot adunk hozzá (MTX; a DHFR-hez kapcsolódó toxikus folát analóg). Az MTX-el szembeni rezisztencia a DHFR magas fokú kifejezésének következménye és gyakran a DHFR-gén amplifikációjának eredménye, amely hosszú kromoszóma-szegmenseket - úgynevezett „amplifikált egységeket” - tartalmazhat [Kaufman és Sharp: Molec. Cell. Bioi. I, 1069-1076 (1981)]. Ily módon a DHFRszekvenciák és oldható a- és β-interferon receptorok ko-integrációja az oldható a- és β-interferon receptorok génjeinek amplifikációját teszi lehetővé.

A stabilan transzfektált sejtvonalakat 10% magzati borjúszérummal kiegészített szelektív táptalajban [DMEM/HAM FI2 1:1, Gibco] történő klónozással izoláljuk. Ezután a kiónokat a legoldhatóbb a- és β-ϊηterferon receptorokat kifejező klón megtalálása céljából oly módon screeneljük, hogy a kondicionált táptalajt ³⁵C-ciszteinnel történő jelzés után in vivő immunokicsapásnak vetjük alá. Közelebbről, pSVAdIFRpA vagy pSVAdsIFRlpA vagy pSVAdsIFR2pA vagy pSVAdsIFR3pA vagy pSVAdpA vagy pSV2DHFR plazmiddal transzfektált körülbelül 10⁷ CHO-sejtet 5 órán át 37 °C-on 4 ml RPMI cys-táptalajban (Gibco) 100 mCi/ml ³⁵S-ciszteinnel (Amersham) inkubálunk. A sejtek jelzése után 1 ml szűrt kondicionált táptalajt 0,5 mM fenil-metil-szulfonil-fluoriddal beállítunk és a későbbiekben ismertetésre kerülő módon immunolecsapásnak vetünk alá. A csapadékot elektroforézissel reduktív körülmények között 7,5%-os PAGE-gélen [U. K. Laemmli: Natúré 227, 680-685 (1980)] frakcionáljuk.

3. példa

Az oldható a- és ^-interferon receptorok tisztítása

A pSVAdsIFR3pA-szerkezetű, a rekombináns oldható a- és β-interferon receptorokat kifejező CHO-sejtek kiónját szelektáljuk és 1% magzati boíjúszérummal (FCS), 1 g/1 glükózzal és antibiotikumokkal [pl. sztreptomicinnal és penicilinnel (100 g/ml)] és 0,5 mM MTX-szel kiegészített DMEM/HAM F12 (1:1) táptalajban 4 üvegben (Becton és Dickinson) 8 napon át tenyésztjük. A felülúszót összegyűjtjük, 0,2 pm maxi csészén (Gelman Sciences) átszűqük és a kiválasztott fehérjét FPLC mono Q anioncserélő oszlopon (Pharmacia) betöményítjük. Az oszlopot 100 mM Hepest (pH 7), 10% glicerint, 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMFS) és 400 gátlási egység aprotinin kallikreint/ml tartalmazó pufferrel öblítjük, majd nem folyamatos gradiens szerint nátrium-kloriddal (0,2 M-től 1,0 M-ig) eluáljuk. Az oldható receptor az interferon megkötésére képes és ezután a receptor tisztaságának nyomonkövetésére a ¹²⁵jóddal jelzett interferon megkötését használjuk.

A receptort tartalmazó anyagot dializált mono Q oszlopon eluáljuk és Micro-Prodicon típusú készülékben betöményítjük. A 10 000 daltonnál nagyobb molekulatömegű fehérjéket visszatartó membránt használunk. A betöményített anyagot 7,5% poliakril-amidot és 0,1% SDS-t tartalmazó 3 mm-es gélen csapjuk le. Egyidejűleg ugyanezen gél másik oldalán egy mintát (kb. 10 pg) lecsapunk. Elektroforézis után a gél ezen részét elektromos úton polividinil-bifluorid-membránra (Millipore) visszük át, majd ¹²⁵jóddal jelzett rekombináns humán α-8-interferonnal hibridizáljuk. Ily módon az oldható receptor helyzetét elektroforézis után azonosíthatjuk. A gélnek az oldható receptort tartalmazó részét kivágjuk, molekuláris ultraszűréssel betöményítjük és az SDS eltávolítása céljából dializáljuk.

4. példa

Az a- és ^-interferonok oldható receptorai variánsainak kifejezésére szolgáló, humán kappa immunoglobulin konstans tartományához és humán gl immunoglobulin konstans tartományához fuzionált plazmidok felépítése

A könnyű lánc fúziói

Az a- és β-interferonok oldható receptorai kifejezésére szolgáló olyan plazmidokat építünk fel, amelyek a kappa immunoglobulin konstans tartományához fuzionált különböző hosszúságú extracelluláris tartományokat tartalmaznak. Ezen plazmidok elnevezése a továbbiakban: pSVAdsIFRIK, pSVAdsIFR2K és pSVAdsIFR3K.

A pSVAdsIFRIK-plazmid a metionin iniciációs kodonjától a lizin 436 kodon után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a kappa immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán kappa immunoglobulin treonin 109 kodonjánál kezdődik [Kábát és társai: Hieter P. A. és társai: Cell 22, 197-207(1980)].

Hasonlóképpen, a pSVAdsIFR2K-plazmid a metionin iniciációs kodonjától a glutamát 427 kodon után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a kappa immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán kappa immunoglobulin treonin 109 kodonjánál kezdődik [Kábát és társai; Hieter P. A. és társai: Cell 22, 197-207 (1980)].

Ezeket a plazmidokat a következőképpen építjük fel.

A kappa immunoglobulin DNS-fragmensét humán lép cDNS-könyvtárból szintetizáljuk (Clontech Laboratories, Inc.). A kívánt cDNS szintetizálása céljából a PCR-reakcióhoz primerként oligonukleotidokat alkalmazunk, amelyek a publikált DNS-szekvencia alapján az előre meghatározott tartományokkal komplementer szekvenciákat tartalmaznak [Hieter P. A. és társai: Cell 22, 197-207 (1980)]. Az oligonukleotid 5’ végződésének szekvenciája a következő:

’ - ACTGTGGCTGCACC ATCTGTCTTCA- 3 ’

HU 215 587 Β míg a 3’ végződés szekvenciája az alábbi:

3’ -CCCTCTCACAATCTCCCTCCATGGCCAG-5 ’ A PCR-reakciót az 1. példában leírt módon végezzük el azzal a változtatással, hogy templátként 1 μg plazmidot alkalmazunk, és a reakció után az elegyet a két szál végének helyreállítása céljából 4 trifoszfát-nukleozid jelenlétében Klenow-polimerázzal kezeljük.

A DNS-t a Kpnl restrikciós enzimmel emésztjük, és a kívánt fragmenst alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk.

Az oldható a- és β-interferon receptorok fragmen5 seit kódoló DNS-fragmenseket azonos módon szintetizáljuk. Az 5’ oligonukleotid 5’ végződése az 1. példában leírttal azonos, azaz ’ -CCGGCTGC AGGGATCTGCGGCGGCTCCCAG-3 ’ míg az oligonukleotid 3’ végződése az alábbi:

3’-CTCTTTTGTTTTGGTCCTTTATGGAGATTT-5’ oligo 1 3’-TCGTCACAAAAATCACAGCGACATACACTC-5’ oligo 2 3’-CCACGAGGTTTTGTCAGACCTTTGTGCGGA-5’ oligo 3

A PCR-reakciókat az 1. példában leírt módon végezzük el azzal a változtatással, hogy az utolsó reakcióciklus után a reakciótermékeket a két szál végének helyreállítása céljából Klenow-polimerázzal kezeljük, majd az IFR1-, IFR2- és IFR3-fragmensek kialakítása céljából PstL restrikciós enzimmel kezeljük.

A pSVAdAl kifejező vektort egymás után Kpnl és Pstl, majd foszfatáz segítségével emésztjük, és a plazmid legnagyobb részét tartalmazó P-fragmenst alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk.

Három komponenst tartalmazó reakcióban a Pffagmenst az immunoglobulin-fragmenshez és a sIFRlfragmenshez kapcsoljuk. Hasonlóképpen a P-fragmenst az immunoglobulin-fragmenshez és az sIFR2-fragmenshez kapcsoljuk, és végül a P-fragmenst az immunoglobulin-fragmenshez és az sIFR3-fragmenshez kapcsoljuk.

Minden ligációs keveréket külön-külön kompetens E. coli HB101-baktériumba transzformálunk, a transzformáit tenyészeteket ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó Petri-csészékbe öntjük és az ampicillinrezisztens telepeket szelektáljuk. A plazmidokat a transzformánsokból izoláljuk és analizáljuk; az analízis során az inzertet restrikciós enzimekkel határozzuk meg, vagy az inzert-összeillesztés DNS-szekvenciájának megerősítéséhez szekvencia-meghatározást végzünk. Az a- és βinterferonok oldható receptora fúziójának kifejezéséhez ezeket a plazmidokat alkalmazzuk.

A nehéz lánc fúziói

Az oldható a- és β-interferon receptorok kifejezésére szolgáló, a gl immunoglobulin konstans tartományához fuzionált különböző hosszúságú extracelluláris tartományokat tartalmazó plazmidokat építünk fel. Ezen plazmidokat a továbbiakban a következőképpen nevezzük: pSVAdsIFRlgl, pSVAdsIFR2gl és pSVAdsIFR3gl.

A pSVAdsIFRlgl-plazmid a metionin iniciációs kodonjától a lizin 436 kodonja után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a gl immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán gl immunoglobulin alanin 113 kodonjánál kezdődik [Kábát és társai; Ellison J. W. és társai: Nucl. Acids Rés. 10, 4071-4079 (1982)].

Hasonlóképpen a pSVAdsIFR2gl-plazmid a metionin iniciációs kodonjától a glutamát 427 kodonja után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a gl immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán gl immunoglobulin alanin 113 kodonjánál kezdődik [Kábát és társai; Ellison J. W. és társai: Nucl. Acids Rés. 10, 4071-4079(1982)].

A pSVAdsIFR3gl-plazmid a metionin iniciációs kodonjától a prolin 360 kodonja után levő fúziós pontig terjedő N-terminális részt tartalmaz, amelyet azonnal a gl immunoglobulin konstans tartománya követ, amely a humán gl immunoglobulin alanin 113 kodonjánál kezdődik [Kábát és társai; Ellison J. W. és társai: Nucl. Acids Rés. 10, 4071-4079 (1982)].

Ezeket a plazmidokat a következőképpen építjük fel:

A gl immunoglobulint kódoló szekvenciát humán lép cDNS-könyvtárból szintetizáljuk (Clontech Laboratories Inc.). A kívánt cDNS szintetizálása céljából a PCR-reakcióhoz primerként oligonukleotideket alkalmazunk, amelyek a publikált DNS-szekvencia alapján [Ellison és társai: Nucl. Acids Rés. 10,4071-4079 (1982)] előre meghatározott tartományokkal komplementer szekvenciát tartalmaznak.

Az oligonukleotid 5’ végének szekvenciája a következő:

5’ -GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCC-3’ míg a 3’ vég szekvenciája az alábbi:

’ -GACAGAGGCCCATTTACTCACCATGGC CAG-5’

A PCR-reakciót a továbbiakban ismertetésre kerülő módon végezzük el.

Az s IFR1-, sIFR2- és sIFR3-ffagmens a fentiekben leírtakkal azonos és a kifejező vektorokat a korábbiakban, a könnyű lánc fúziója kapcsán leírtak szerint építjük fel.

5. példa

Az oldható a- és β-interferon receptorok E. coliban történő kifejezésére szolgáló vektorok felépítése

Az sIFR E. coliban történő kifejezésére a pHR148 kifejező vektort alkalmazzuk. A pHR148-vektort Rink és társai írták le [Nucl. Acid. Rés. 12, 6369-6387 (1984)]. A HR148-plazmidot egymás után Ncol restrikciós enzimekkel, majd a két szál végének

HU 215 587 Β helyreállítása céljából 4 trifoszfát nukleozidok jelenlétében Klenow-polimerázzal és Kpnl-lel emésztjük. A foszfatázzal végzett kezelés után a plazmid legnagyobb részét tartalmazó DNS-fragmenst (1. fragmens) alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk.

Az a- és β-interferonok érett oldható receptorát kódoló DNS-fragmenst (azaz amely nem tartalmaz peptidszignált) PCR-reakcióval templátként a teljes cDNS-t tartalmazó plazmid [UZÉ és társai: Cell 60 (2), 225-234 (1990)] és primerként egy oligonukleotid-pár felhasználásával szintetizáljuk.

Az oligonukleotid 5’ végének (az interferon N-terminális tartományából származtatható le) szekvenciája a következő:

’ -GGTGGAAAAAATCTAAAATCTCCTCAA AAAG-3’ (oligo 1) míg az oligonukleotid 3’ végének (az interferon transzmembrán régióját éppen megelőző tartományból származtatható le) szekvenciája az alábbi:

’ -TC ACTGCGACATACACTCATCCCATGG CC-5’ (oligo 2).

Az oligonukleotidokat oly módon választjuk meg, hogy PCR-fúzió után a szintetizált fragmens a 3’ végződésen egy Kpnl restrikciós enzim helyet és az 5’ végződésen egy „tompa” véget tartalmazzon.

A PCR-reakciót az 1. példában leírtak szerint végezzük el azzal a változtatással, hogy a reakció után a termékeket a két szál végének helyreállítása céljából Klenow-polimerázzal, majd Kpnl-enzimmel kezeljük. Az 1,3 kb fragmenst alacsony olvadáspontú agarózon végzett elektroforézissel izoláljuk és az 1. fragmenshez ligáljuk.

Egy második DNS-fragmenst hasonlóképpen szintetizálunk azzal a változtatással, hogy az 5’ vég oligonukleotidot az ’ - GG A AA A AATCTA A AATCTCCTC AAA A AG-3’ szekvenciával helyettesítjük.

A ligációs termékeket E. coli HBlOl-törzsbe transzformáljuk és a transzformált tenyészeteket ampicillintartalmú táptalajt tartalmazó Petri-csészébe öntjük. Az ampicillinrezisztens telepeket szelektáljuk, a plazmidokat a transzformánsokról izoláljuk és analizáljuk; az elemzés során restrikciós enzimekkel emésztjük és az inzert fúziós pontja szekvenciájának megerősítése céljából szekvenciameghatározást végzünk el.

Az oldható receptor E. coliban történő kifejezéséhez a ptrpIFRl és ptrpIFR2 elnevezésű plazmidokat alkalmazzuk. A rekombináns fehérje kifejezése céljából a transzformánsokat 1,0 abszorpciós (A650) érték eléréséhez 20-50 ml tenyészőközegben M9 táptalajba [Rink és társai: Nucl. Acid. Rés. 12, 6369-6387 (1984)] helyezzük. Ezután a sejteket centrifugáljuk, mossuk, az oldható interferon-receptort a feltört sejtekről extraháljuk és tisztítjuk. Az oldható a- és β-interferon receptort Western biot vagy dót biot analízissel, a továbbiakban ismertetésre kerülő módon határozzuk meg.

6. példa

Humán interferon oldható receptorának meghatározására szolgáló módszerek

Az oldható receptor meghatározásának módszerei a receptor azon képességén alapulnak, hogy humán a-interferonhoz specifikus módon kötődni képes.

a) Immunokicsapás

A humán a- és β-interferonok oldható receptorának meghatározása azon alapul, hogy az oldható receptor és ¹²⁵jóddal jelzett humán α-8-interferon között komplex képződik, amely ¹²⁵I-IFN-nek az α-2-interferon terminális aminorésze ellen irányított monoklonális antitesthez történő kapcsolódását gátolja [H. Amheiter és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 2539 (1983)]. Miután az interferon receptorához kötődött, a molekula terminális aminorésze az antitest számára nem hozzáférhető [H. Amheiter és társai (1983)]. A szabadon maradó ¹²⁵I-IFN-t az anti-IFN-antitesttel komplexbe visszük, majd A-sepharose fehérje (Pharmacia) hozzáadásával kicsapjuk. Az anti-IFN-antitestet az A-fehérjével a gyártó instrukciói szerint konjugáljuk.

A meghatározandó oldható receptorok 50 μΐ borátpufferrel (pH 8,3; 0,1 M H₃BO₃, 0,025 M Na₂B₄O₇, 0,075 M NaCl, 0,1% NP40) képezett sorozathígításait 81 Bq per ffnol fajlagos aktivitású ¹²⁵jóddal jelzett a-2interferon konstans mennyiségével (75 pmol) összekeverjük [K. E. Mogensen és G. Uze: Methods in Enzymol. 119C, 267 (1986)] és egy órán át 4 °C-on inkubáljuk. Konstans mennyiségű A-anti-IFN-fehérjét 50 μΐ térfogatban felvesszük, amelyhez 50 μΐ borát-puffert (pH 8,3; 0,2 M H₃BO₃, 0,05 M Na₂B₄O₇, 0,15 M NaCl, 0,1% NP40) adunk. Az elegyet egy órán át 4 °Con keverjük, majd Eppendorf-féle mikrocentrifúgában 10,000 g mellett egy percen át centrifugáljuk és a felülúszót elöntjük. A csapadékot borátpufferrel (pH 8,3; 0,1 M H₃BO₃, 0,025 M Na₂B₄O₇, 1 M NaCl, 0,5% NP40) hatszor, 40 mM HEPES-sel (pH 8) és 2% glicerinnel kétszer, 40 mM HEPES-sel (pH 8) és 1 M karbamiddal egyszer, végül 40 mM HEPES-sel (pH 8) kétszer mossuk. A csapadékban levő immunkomplex radioaktivitásának megszámlálása - az interferon-antiinterferon komplexképződés gátlási görbéjével összehasonlítva - az ily módon tesztelt minta oldható a- és β-interferon receptor tartalmának meghatározását teszi lehetővé.

b) Humán a- és ^-interferonok oldható receptorának meghatározása a jelzett interferon sejtreceptorához történő kötődésének gátlása útján

Az a- és β-interferonok oldható receptorainak sorozathígításait 30 percen át 4 °C-on ^l25jóddal (fajlagos radioaktivitás 25 Bq per fmol) jelzett rekombináns humán α-8-interferon változó koncentrációjú mennyiségeivel (0,50, 100, 125, 500,1000 és 2000 NE /ml) inkubáljuk. Ezután különböző ¹²⁵I-IFN oldható receptorkeverékekhez 10⁷ sejt/ml végső koncentrációban Daudi humán limfoidsejteket adunk, és 2 órán át 4 °C-on inkubáljuk. A sejteket centrifugáljuk (800 g mellett, 10 percen át), majd a felülúszót elöntjük. Ezután 0,5% magzati borjúszérumot (Flow Laboratories) tartalmazó RPMI 1640 táptalajjal háromszor mossuk és a sejtekhez

HU 215 587 Β kötött radioaktivitást LKB 1270 típusú gamma-számlálóval történő számlálással meghatározzuk.

Az a- és β-interferonok oldható receptorának mennyiségét az interferon sejtreceptorához történő specifikus kötődésének gátlási görbéjéből határozzuk meg. A fajlagos megkötés a ¹²⁵I-IFN önmagában és 100szoros nem jelzett interferon-fölösleg jelenlétében felvett megkötési görbéi közötti különbség.

c) a- és ^-interferonok oldható receptorának meghatározása „ Western biot” módszerrel

Az a-interferon receptor jelenlétére vizsgálandó mintát a 30,000 daltonnál nagyobb molekulatömegű fehérjéket visszatartó Amicon Centricon 30 típusú membrán felhasználásával betöményítjük. A mintákat 60 mM trisz-HCl-pufferben (pH 6,8; 1,25% SDS, 1 mM PMFS és 400 gátlási egység kallikrein/ml aprotinin/ felvesszük, és 0,1% SDS-t tartalmazó 7,5% poliakrilamid gélen lecsapjuk. Standard körülmények között végzett elektroforézis után a mintákat „félszilárd” típusú elektrotranszfer-készülékben (Nova Biot) 200 mA mellett egy óra alatt 39 mM glicint, 48 mM trisz-bázist (pH 8,3) és 18% metanolt tartalmazó pufferben polivinidil-bifluorid-membránra (Millipora) visszük át. Az átvitel után a membránt 20 mM trisz-bázist, 0,2% Tween 20-t (pH 7,8) és 10% lefölözött tejet tartalmazó pufferrel (Regilait, Franciaország) keverés közben 25 °C-on 4 órán át keverjük. Ezután 10 ¹⁰ M ¹²⁵I-a-8-interferonnal (fajlagos aktivitás 50 Bq per fentamól) 2 órán át 25 °C-on keverés közben a fenti pufferben hibridizáljuk. A membránt ugyanezen puffer aliquot részeivel ötször mossuk, majd levegőn szárítjuk és röntgensugárzásra érzékeny filmnek tesszük ki.

A rekombináns humán a-8-(a-8)-interferont '^jóddal jelezzük, a korábbiakban leírt klóramin-módszer [K. E. Mogensen és G. Uze: Methods in Enzym. 119C, 267 (1986)] módosításával. Ez 25 Bq per fmol vagy 6 Bq per nemzetközi interferonegység fajlagos radioaktivitásnak felel meg.

d) Humán a- és ^-interferonok oldható receptorának meghatározása „ dót biot” módszerrel

A meghatározandó oldható receptorok preparátumainak sorozathígításait 50 μΐ, 39 mM glicint és 48 mM trisz-bázist (pH 8,3) tartalmazó pufferben végezzük el és polivinidil-bifluorid-membránnal (Millipore) töltött „Bio-Biot” típusú készülék (Biorad) mélyedéseiben ülepedni hagyjuk.

A membránt 4 órán át 25 °C-on keverés közben 20 mM trisz-bázist, 0,2% Tween 20-t (pH 7,8) és 10% fölözött tejet tartalmazó pufferrel (Regilait, Franciaország) kezeljük. Ezután ugyanebben a pufferben ^,25I-IFN α-8-cal 10-¹⁰ M (fajlagos aktivitás 25 Bq per fmol) mellett 25 °C-on 2 órán át keverés közben hibridizáljuk, majd keverés közben a fenti puffer aliquot részeivel ötször mossuk és röntgensugárzásra érzékeny filmnek tesszük ki. Az autoradiograf analízise és standard görbével történő összehasonlítás segítségével a membránhoz kötődő ¹²⁵I-IFN mennyisége meghatározható és ebből a vizsgált mintában az oldható receptor koncentrációja megállapítható.

A rekombináns humán a-8-(a-8)-interferon '^jóddal történő jelzését a klóramin T-módszer [K. E. Mogensen és G. Uze: Methods in Enzymol. 119C. 267 (1986)] módosításával végezzük el. Ez 25 Bq per fmol vagy 6 Bq per nemzetközi interferonegység fajlagos radioaktivitásnak felel meg.

7. példa

Gyógyászati készítmény

Alábbi összetételű injekciós készítményt állítunk elő:

Komponens Mennyiség

3. példa szerinti termék 100 mg

Injekciós készítményekben felhasználható excipiens 2 ml

Claims (10)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás vízoldható polipeptidek, éspedig

   a) az 1. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú polipeptid és annak delécióval és/vagy helyettesítéssel kialakított származékai,

   b) az 1. ábrán bemutatott nukleinsav-szekvencia által kódolt polipeptidek, és

   c) a 2. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú polipeptid-delécióval és/vagy helyettesítéssel kialakított származékai előállítására önmagukban vagy egy második polipeptiddel képezett hibridek formájában, azzal jellemezve, hogy az adott polipeptidet vagy hibridet kifejezni képes sejteket alkalmas közegen tenyésztjük, majd a kifejezett terméket elkülönítjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az 1. igénypontban meghatározott valamely vízoldható polipeptid előállítására olyan plazmafehérjével mint második polipeptiddel képezett hibrid formájában, amelynek plazmában való felezési ideje nagyobb az első polipeptidénél, azzal jellemezve, hogy az adott hibridet kifejezni képes sejteket alkalmas közegen tenyésztjük, majd a kifejezett terméket elkülönítjük.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás második polipeptidként egy immunoglobulinnal képezett hibridek előállítására, azzal jellemezve, hogy az adott hibridet kifejezni képes sejteket alkalmas közegen tenyésztjük, majd a kifejezett terméket elkülönítjük.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás második polipeptidként egy G típusú, előnyösen G1 típusú immunoglobulinnal képezett hibridek előállítására, azzal jellemezve, hogy az adott hibridet kifejezni képes sejteket alkalmas közegen tenyésztjük, majd a kifejezett terméket elkülönítjük.
5. 5. Eljárás az 1-4. igénypontok bármelyikében meghatározott polipeptidek és hibridek kódolására alkalmas DNS-szekvenciák előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-fragmenseket és/vagy nukleinsavakat ismert géntechnológiai módszerekkel a helyes sorrendben összekapcsoljuk, majd a kapott terméket polimeráz láncreakcióval (PCR) sokszorozzuk.
6. 6. Eljárás az 1 -4. igénypontok bármelyikében meghatározott polipeptidek és hibridek termelésére alkalmas sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy sejtet

   HU 215 587 Β egy, az 5. igénypontban meghatározott DNS-szekvenciával transzferálunk.
7. 7. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1 -4. igénypontok bármelyike szerint előállított polipeptidet vagy hibridet gyógyászatilag alkalmazható hordozó-, hígító- és/vagy más segédanyagok felhasználásával, ismert gyógyszertechnológiai műveletekkel gyógyászati készítménnyé alakítunk.
8. 8. Eljárás interferon receptor elleni antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy melegvérű állatoknak az 1-4. igénypontok bármelyike szerint előállított polipeptidet vagy hiridet és gyógyászatilag alkalmazható szubsztrátumot adunk be, majd az immunreakció lezajlása után az állatot kivéreztetjük, és a vérből elkülönítjük az antitesteket.
9. 9. Eljárás a- és β-interferon receptor elleni antites5 tek jelenlétének kimutatására biológiai mintákban, amelynek során a biológiai mintát az antitesttel immunológiai komplexet képező anyaggal hozzuk érintkezésbe a komplex kialakulását lehetővé tevő körülmények között, majd a képződött immunológiai komplexet
10. 10 kimutatjuk, azzal jellemezve, hogy komplexképzőként az 1-4. igénypontok bármelyike szerint előállított polipeptidet vagy hibridet használjuk.