JPH05507518A - 蛍光ジゴキシン試薬用のフタロシアナトポリエチレングリコールおよびフタロシアナトサッカリド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光ジゴキノン試薬用のフタロシアナトポリエチレングリコールおよびフタロシ アナトサツカリド 発明の分野 本発明はイムノアッセイ用、さらにはイン・ビボの画像形成およびイン・ビボの 腫瘍治療用の蛍光プローブに用いるマーカー成分として有用な蛍光染料に関する 。

発明の背景 本発明中で引用する出版物および他の文献が参考によりここに一体化され、以下 の明細書中で何回力弓１用し、請求の範囲の直前の添付参考文献に各々集めであ る。

少量の物質の検出は検出可能に標識されたマーカー成分を用いることにより達成 することができる。蛍光染料はこのようなマーカー成分の標識として用いること かできる。だんだん減少する濃度の物質または環境を正確に測定するには、より 高い蛍光測定感度を有する蛍光染料が必要である。蛍光検定において、その測定 感度は、通常、蛍光標識から得られるシグナルをバックグラウンドシグナルで割 った比率により限定される。したがって、高感度の蛍光標識を得るには、得られ るバックグラウンドシグナルの大きさを最小限にし、蛍光標識からのシグナルを 最大限にすることが必要である。

蛍光検定は、しばしば、生物学的物質中に現存する物質を測定するのに用いられ る。血清または細胞抽出物のような生物学的物質は、蛍光を示す種々の成分を含 有し、蛍光標識からのシグナルの測定を干渉しつるかなりのバックグラウンドま たは環境蛍光を付与するかもしれない。

バックグラウンド蛍光からの干渉を減少させる１つの方法は、蛍光標識として、 試料中でバンクグラウンド蛍光を生じさせる物質よりもより大きな発光波長を有 する染料を用いることである。生物学的物質中、バックグラウンド蛍光を構成す る大部分の物質は、約３００〜約６５０ｎｍの範囲で発光する。例えば、ヒト血 清中、約７２５ｎｍの波長で、バックグラウンド蛍光は通常用いられる装置の検 出レベル以下にある。バックグラウンド蛍光からの干渉を減少させる発光波長を 有する蛍光染料は、シアニン、ポルフィリンおよびアザポルフィリンを包含する 。

しかし、蛍光検定にて、このような標識の使用は、溶媒感受性の問題（ジメチル ホルムアミドとの比較において水性検定溶液中の蛍光強度の有意な減少）および 生物学的物質に対する非特異的結合により制限される。

感度に影響を与える他の特性は、蛍光標識の吸光係数の大きさおよび量子収量お よびその減衰時間を包含する。発蛍光団は特有の蛍光（または“自然”）寿命、 すなわち、いずれの不活性化因子もない状態で蛍光強度がその初期値の約３７％ （１／ｅ）に減少する時間を有する。減衰時間は、現実の状況下で、３７％（１ ／ｅ）のレベルまでの蛍光の減少が実際に観察される時間である。減衰時間は外 部因子により影響されるかもしれない、すなわち、長期の自然寿命を有する発蛍 光団が短期の観察減衰時間を有するかもしれない。短くなった減衰時間は、発蛍 光団の励起状態の不活性化を示し、結果的に量子収量（吸光量当たりに発光され る蛍光量）を減少させ、潜在的にそこにあるよりも少ないシグナルの観察をもた らす（発蛍光団は蛍光発光によるよりもむしろ熱としてエネルギーを喪失する） 。

長期減衰時間を有する発蛍光団の使用は、遷移状態検定のような技法において特 に重要であり、発光が約１０〜約２０ナノ秒の時間にわたって測定される発蛍光 団についての要望がある。したがって、このような時間にわたって不活性化を受 けない発蛍光団についての要望がある。

発蛍光団の場合、自然寿命および吸光係数がアンチパティツク的に変化すること が判明した。さらには、長期蛍光寿命を有する発蛍光団はより不活性化しやすそ うである。したがって、増加した減衰時間を有する、すなわち、その自然寿命に 等しい減衰時間を有する発蛍光団が、より高い量子収量を提供し、かくして、よ り高感度を提供する。

本発明は、検出可能な標識として有用なマーカー成分に関する。これらのマーカ ー成分は、診断試薬における検出可能な標識として用いることができ、特に、蛍 光イムノアｙでイおよび他のイムノアクセイのような検定において有用である。

本発明によれば、２つの可溶化ポリオキシヒドロカルビル基にカップリングした 発蛍光団からなり、水溶液中、血清成分の存在下、血清がない場合と実質的に同 じ強度の平行および垂直な成分を有する遷移状態の蛍光発光により特徴付けられ る検出可能に標識されたマーカー成分が提供される。

本発明は、２つの可溶化ポリオキ／ヒドロカルビル基にカップリングした発光性 の実質的に平面の分子構造を含む発蛍光団基からなり、その１つが該平面分子構 造のいずれかの側面に位置する、検出可能に標識されたマーカー成分に関する。

一つの態様において、本発明は、中心原子に配位結合した実質的に平面の大環状 多座配位子からなる発蛍光団基と、２つの可溶化ポリオキシヒドロカルビル基と からなり、その１つが多座配位子の平面のいずれかの側面にて中心原子に連結し た検出可能に標識されたマーカー成分に関する。

一つの好ましい態様において、本発明は、大環状配位子のいずれかの側面にて中 心原子に配位結合する２つのアクンヤル配位子との配位結合能を有する中心原子 に配位結合した、実質的に平面の多座配位大環状配位子を含む発蛍光団基からな るマーカー成分に関する。

ベーター・アレニウス（Ｐｅｔｅｒ　Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ）の一般譲渡され、継 続中の米国特許出願“蛍光マーカー成分および蛍光プローブ、出願番号第０７１ ５２４゜２１２号は、少な（とも１つの可溶化ポリオキシヒドロカルビル基に連 結した発蛍光団基からなり、溶媒感受性を減少させ、ヒト血清アルブミン（“Ｈ ５Ａ”）への結合を減少させたマーカー成分を開示している。ヒト血清を有する 試料で用いた場合、驚くべきことに、開示されている該マーカー成分は、有利な 特性を示すが、あるものはＨ５Ａではない血清成分に対して非特異的結合を示し た。加えて、あるマーカー成分は、低レベルの溶媒感受性を示し、それはいくら か消光および凝集の特性があることを意味する。これらのマーカー成分のいくつ かは、ケルおよびＴＬＣ上を移動せず、分子サイジング・ゲル濾過カラムのクロ マトグラフィーに付した場合、空隙容量（分子量４０．０００）で溶出した。

意外にも、２つの可溶化ポリオキシヒドロカルビル基を有し、その１つが多座配 位子の平面のいずれかの側面に位置する大環状多座配位子からなる本発明のマー カー成分が、血清成分に対する検出可能な非特異的結合を示さず、検出可能な溶 媒感受性を示さないことが見いだされた。さらに、これらのマーカー成分は、そ の自然（蛍光）寿命に等しい減衰時間の増加を示す。

本発明のマーカー成分は、特に、水溶液中の分析対象を検出するための検定で用 いる検出可能な標識として適当である。これらのマーカー成分は蛍光プローブに おける取り込み用の蛍光標識として有用である。これらのマーカー成分のいくつ かは、燐光標識として有用である。また、これらの成分はイン・ビポ画像形成で 用いる薬剤用の標識として、またイン・ビボ腫瘍治療で用いる薬剤用の標識とし ても有用である。

したがって、一般に、その波長が約２００ないし約１０００ナノメーターの範囲 内、好ましくは、約６００ないし８００ナノメーターの範囲内にある光での励起 にて蛍光を効果的に発する発蛍光団が好ましい。

適当な発蛍光団は、バックグラウンド蛍光を最小にするために（試料中に存在す る蛋白質のような）他の溶液成分の励起および発光最大値から区別できる波長に て吸光しおよび／または発光するものを包含する。

これらのマーカー成分は、生物学的流体の試料を用いる検定において特に有用で あるため、その使用には、他の試料成分の雰囲気蛍光からの干渉を減少させる少 なくとも約５００ナノメーターの励起および／または発光波長を有する発蛍光団 が好ましい。血清のようない（つかの試料は、５００　ｎｍ未満の励起波長を用 いる場合、フラビン、フラボ蛋白質、ＮＡＤＨなどからのかなりの干渉バックグ ラウンド蛍光を示す。

蛍光偏光イムノアッセイのようなある種の適用では、好ましい発蛍光団はまた、 高度の蛍光偏光、好ましくは、観察される偏光についての理論的最大値の約１０ ％以上を示す。蛍光遷移状態検定のようなある種の適用では、好ましい発蛍光団 はまた、約１ナノ秒ないし約５０ナノ秒の範囲、好ましくは、約５ないし約２０ ナノ秒の範囲の測定蛍光減衰時間によって特徴付けられる。燐光標識のような他 の適用では、さらに長い減衰時間を有する発蛍光団を用いてもよい。

かくして、効果的に蛍光を生じる発蛍光団、すなわち、適当な波長での高吸光性 および高蛍光量子収量によって特徴付けられる発蛍光団が好ましい。ある種の適 用では、好ましい発蛍光団は、少なくとも２ナノ秒のオーダーの測定蛍光減衰時 間を有し、高度の蛍光偏光を示す。

好ましい可溶化ポリオキシヒドロカルビル基は、ゲルコール、シュークロース、 マリトトリオースなどの水溶性炭水化物ニゲルコン酸およびマンニトールおよび オリゴサツカリドのような水溶性炭水化物誘導体：およびポリビニルピロリドン 、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリアクリル酸、ポリ アクリルアミドのような水溶性ポリマー、プルロニック（Ｐ　１ｕｒｏｎｉｃ） 　（プロピレンオキシドコポリマー、ＢＡＳＦより入手可能）およびテトロニッ ク（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ）（ＢＡＳＦ）ポリオール界面活性剤のようなエチレンオ キシドコポリマー；および水溶性ポリオキシアルキレンポリマー、特に、ポリ（ エチレングリコール）（“ＰＥＧ”）およびポリ（エチレングリコール）メチル エーテル、ポリ（エチレングリコール）ケイ素由来エーテル等のようなポリ（エ チレングリコール）誘導体を含むポリエーテルを包含する。

１つの態様において、本発明は、２つアクシャル配位子との配位結合能を有する 中心原子に配位結合した実質的に平面状の多座配位大環状配位子からなる発蛍光 団基と、アクンヤル配位子として中心原子に付着する２つのポリオキシヒドロカ ルビル基とからなるマーカー成分に関する。蛍光イムノアッセイにおけるマーカ ー成分として用いる場合、適当な中心原子は２つアクシャル配位子と配位結合し うるちのであり、三重項状態に変移することにより広大な蛍光消光を引き起こす に十分高い原子番号のものではない。中心原子として好ましい因子は、ケイ素、 ゲルマニウム、リンおよび錫を包含し、ケイ素およびゲルマニウムが特に好まし い。

これらのマーカー成分は、分析対象、抗原、抗体または池の分子を標識するため の標識として用いてもよい。これらのマーカー成分は、所望により、マーカー成 分を分析対象、抗原、抗体または他の分子に連結させるリンカ−アームを含むよ うに官能化してもよい。この目的に適した種々のリンカ−アームが記載されてい る（文献１）。常法に従って、マーカー成分を分析対象、抗原、抗体または他の 分子に連結する。

蛮勇 本明細書中に用いる以下の用語は、特に断らない限り、以下の意味を有する：「 分析対象」なる語は、化合物または検定で測定すべき化合物をいい、レセプター が天然に存在し、または調製できる、七ノーまたはポリエピトープ、抗原または ハブテンであるいずれの化合物でもよ（、少な（とも１つの通常のエピトープ基 またはレセプターを占める単一または複数の化合物でもよい。

「アクシャル配位子」なる語は、大環状配位子と中心原子を一緒にして、配位錯 体を形成する置換基をいう。該アクシャル配位子は、大環状配位子によって示さ れる面に対して垂直にある。

「蛍光プローブ」なる語は、関心のある物質の存在を測定しおよび／または定量 するための蛍光イムノアッセイのような検定で用いる分析対象、抗原、ハプテン 、抗体または他の分子に結合し、または直接またはリンカ−アームを介してそれ に配位する発蛍光団基からなるマーカー成分をいう。

「溶媒感受性」なる語は、用いる溶媒系に応じた分子の蛍光挙動の変化をいい、 最も顕著には（ＤＭＦのような）有機溶媒と比較した水溶液における蛍光挙動の 差異をいう。ＤＭＦのような有機溶媒中で高蛍光強度を示す多くの発蛍光団は、 水溶液中にて実質的に減少した蛍光強度を示す。

蛍光強度は試料濃度および励起放射の強度に関係する。特定の染料の蛍光強度は 、その特徴的な光吸収率（吸光係数）および蛍光量子効率、ならびに環境因子に 関係付けることができる。

「特異的結合対」なる語は、２つの異なる分子（または組成物）をいい、該分子 のうちの１つは表面上または窪み中に、他の分子または他の分子を含めた分子複 合体の特定の空間的および極性的組織を特異的に認識し、それに結合する領域を 有する。

「結合パートナ−」なる語は、特定の分子または分子複合体を特異的に認識でき 、または特定の分子または分子複合体によって認識される分子または分子複合体 をいう。

「結合」なる語は、結合相互作用が分子とその特定の結合パートナ−の間に形成 されている状態をいう。

「ンンハティヅク」なる語は、一方が増加すると、他方も増加するが、それらは 相互に比例する割合で増加しないような関係にある２つの変数をいう。

「アンチパティツク」なる語は、一方が増加すると、他方は減少するが、それら は相互に反比例にある割合で変化しないような関係にある２つの変化をいう。

「減衰時間」なる語は、励起分子の濃度が、その初期濃度からその１／ｅの値ま で減少するのに経過する時間である。

図面の簡単な記載 図ＩＡ、ＩＢおよびＩＣは、実施例３に従って製造したマーカー成分についての 遷移状態の蛍光発光を示す。

図２Ａおよび２Ｂは、実施例５に従って製造したマーカー成分についての遷移状 態の蛍光発光を示す。

図３Ａおよび３Ｂは、実施例５に従って製造したマーカー成分の可視光線および 近赤外線吸光度を示す。

図４Ａおよび４Ｂは、ジヒドロキシケイ素フタロシアニンとＰＥＧの間の反応の 第１段階（「アーリ・ブル一段階」）の生成物の遷移状態の蛍光発光を示す。

図５Ａおよび５Ｂは、ジヒドロキシケイ素フタロンアニンとＰＥＧの間の反応の 後の段階（「ブルー・グリーン生成」）の生成物の状態を示す。

図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、実施例１０に従って製造したスルホン化ケイ素フタ ロシアニンの遷移状態の蛍光発光を示す。

図７Ａおよび７Ｂは、実施例１０に従って製造したスルホン化ケイ素フタロシア ニンの可視光線および近赤外線吸光度を示す。

図８は、大環状環について常法に従って番号付けしたテトラベンシトリアザポル フィリン基を示す。

適当な発蛍光団基は、発光性の実質的に平面の分子構造からなる。発蛍光団基は 、その発光性の実質的に平面の分子構造が、２つのアクシャル配位子と配位結合 でき、その１つが大環状配位子のいずれかの側面にある（すなわち、トランス配 向を有する）中心原子に配位結合する実質的に平面の大環状多座配位子からなる ことが好ましい。

好ましい中心原子は、いずれかの側面上、トランスまたはアクシャル配向で、平 面状大環状配位子に垂直に、２個の配位子を含有する八面体配位錯体を形成しつ る。ある種の用途に蛍光マーカー成分として用いる場合、該中心原子は、蛍光が 三重項状態への変移により大きく喪失されるような高すぎる原子番号（約３０ま たはそれ以下）とすべきでない。イン・ビポの腫瘍治療のような使用の場合、ま たは分離型検定または燐光標識では、より高い原子量の原子を用いてもよい。

好ましい多座配位子は、π−電子で理系と結合する含窒素天理を包含する。これ らの大通は、所望により置換されていてもよく、架橋炭素または窒素上での置換 を包含する。適当な大通は、ポルフィリン、アザポルフィリン、コリン、サラフ ィリン、ポルフィセン誘導体等のπ−電子環系に結合する大通を包含する。それ らが前記の特性の多くを組み込んでいる事実を考慮すると、特に好ましい一連の 大通は、ポルフィリン誘導体およびアザポルフィリン誘導体（少なくとも、１個 の架橋炭素が窒素原子によって置き換えられているポルフィリン誘導体）からな る。アザポルフィリン誘導体は、モノ−、ジーおよびトリアザポルフィリンおよ びボルフィラノンを包含する。これらの天理は、所望により、縮合芳香族環を有 していてもよい。これらのアザポルフィリン誘導体は、フタロシアニン、ベンシ トリアザポルフィリンおよびナフタロシアニンおよびそれらの誘導体を包含する 。これらの化合物の多くの製造法および蛍光特性は知られており、商業上入手可 能である（文献２．３．４．５）。

蛍光偏光検定のようなある種の適用では、高度の偏光を示すアザポルフィリン誘 導体、すなわち、強く偏光を発するものが好ましい。これらの適用では、低度の 対称性を有する、好ましくは、Ｄ４ｈよりも低い対称性を有する天理が好ましい 。

１つの好ましい基は、少なくとも１個の縮合芳香族環を有する天理を包含する。

か（して、好ましい天理は、対称性の減少をもたらす位置に縮合芳香族環を有す るアザポルフィリン誘導体を包含する。好ましい一連のアザポルフィリン誘導体 は、Ｄ４ｈ対称性よりも低い対称性を有する、モノアザポルフィリン、ジアザポ ルフィリンおよびトリアザポルフィリンを包含する。

Ｂ　好ましい可溶化ポリオキシヒドロカルビル基好ましい可溶化ポリオキシヒド ロカルビル基は、グルコース、シュークロース、マルトトリオースなどの水溶性 炭水化物ニゲルコン酸およびマンニトールおよびオリゴサツカリドのような水溶 性炭水化物誘導体：ボリンンのようなポリペプチドおよび天然の蛋白質：ポリビ ニルピロリドン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリア クリル酸、ポリアクリルアミドのような水溶性ポリマー、プルロニックｆ″（ポ リエーテル）およびテトロニック”（ＢＡＳＦ）ポリオール界面活性剤のような エチレンオキシドコポリマー、特に、ポリ（エチレングリコール）を含めた池の ポリオキシアルキレンのようなポリエーテル、または他の水溶性混合オキシアル キレンポリマーなどを包含する。

特に好ましい一連の可溶化ポリオキシヒドロカルビル基は、ポリ（エチレングリ コール）（ＰＥＧ）およびポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルのよ うなポリ（エチレングリコール）誘導体を包含する。池の適当なＰＥＧ誘導体は 、ＰＥＧ〜由来エーテル（実施例９参＠）を包含する。これらのポリマーの多（ は、種々の分子量にて商業上入手可能である。他は、有利には、アミノ−ＰＥＧ をハロアルキルシリルまたはシラン基にカップリングすることによるような、商 業上入手可能な物質から製造される。発蛍光団基に連結させると、これらのポリ オキシヒドロカルビル基は、測定蛍光減衰時間の改善、蛍光強度の改善と共に、 水溶液中の溶解度の特に有利な性質を与える。さらには、得られたマーカー成分 は水溶性であり、非特異結合の減少、特に、分子の水への溶解度を増大させるた めにスルホネートのような基で官能化したある種の発蛍光団、特に、ポルフィリ ンまたはフタロシアニン染料で、従前に問題となっていた血清アルブミンへの結 合を減少を示す。発蛍光団またはマーカー成分の非特異結合は、結果としてイム ノアッセイに正確性を付与する。ＰＥＧに連結した発蛍光団からなるこれらのマ ーカー成分もまた、消光の減少と共に、水溶液中の蛍光強度の改善を示す。

適当なＰＥＧは、約２００ないし約２０，０００またはそれ以上の分子量で変化 してもよい。特定の分子量の選択は、選択する特定の発蛍光団およびその分子量 および疎水性の程度、ならびに発蛍光団−ＰＥＧ複合体を用いるべき特定の適用 に依存する。

Ｃ４好ましいマーカー成分の吸光および偏光挙動溶媒感受性およびＨＳＡおよび 血清成分への非特異結合の欠如を、吸光スペクトルおよび遷移状態の蛍光発光に より証明した。

２つのＰＥＧ基にカンプリングした中心原子（例えば、ケイ素）を含有するこれ らのマーカー成分は、遷移状態の蛍光を測定することにより感受的に特徴付ける ことができる。このような測定において、励起パルスの偏光の方向に平行にまた は垂直に偏光させた２つの成分の強度を、マーカー成分の減衰時間の約３倍に等 しい時間にわたってモニター観察する。このような曲線は、吸光係数、量子収量 、減衰時間および偏光状態を反映し、マーカー成分の化学的および物理的条件に 対する感受的指示を供給する。

例えば、励起状態が不活性化され、または三重項状態に変わった場合、強度はす べて低下し、減衰時間は短くなる。分子の回転ブラウン運動が粘度の増加により 、または大分子に結合することにより変化すると、垂直成分に対する平行成分の 強度の割合は増加する。

本発明によれば、いくらかのマーカー成分は、約５％以内の実験エラーで、ＳＡ Ｐ　（食塩水アジドホスファート、水性中性緩衝液）中と同一のＤＭＦ　（有機 溶媒）中の強度、減衰時間を示す。これらの特性は、ある程度は、他のマーカー 成分調製物により分けられる。本発明のマーカー成分の特有かつ重要な特性は、 血清中の成分に対して非感受性（および該成分への結合の欠如）であり、それは 蛍光性の偏光成分の強度、減衰時間または相対的大きさに対して、血清のいずれ の測定効果もないことにより証明される。この特性は、生物学的物質を用いる検 定のような用途に有用であるマーカー成分にとっては重要である。

図３Ａおよび３Ｂは、ヒドロキシケイ素フタロシアニンと平均分子量３５０のＰ ＥＧモノメチルエーテルの生成物（実施例５参照）についての可視および近赤外 線領域の吸光スペクトルを示す。これらの図は、吸光最大値の位置および高さが 、有機溶媒であるＤＭＦ　（図３Ａ）と、水性緩衝溶液であるＳＡＰ　（食塩水 アジドホスファート）（図３Ｂ）中でほとんど同じであることを示す。対照的に 、可溶化ポリオキシヒドロカルビルアクンヤル配位子で置換されていないケイ素 フタロンアニンはこれらの溶媒のいずれにもほとんど溶解せず、ＤＭＦ中でほん のわずかな低吸光レベルを示し、ＳＡＰ中で実質的に全く示さなかった。図２Ａ および２Ｂは、図３Ａおよび３Ｂで用いたと同じＰＥＧ−置換ケイ素フタロシア ニンについての遷移状態の蛍光発光を示す。これらの図は、発光が、ヒト血清（ １００μｌ）をＳ　Ａ　Ｐ中の試料（全容量３．１．ｍｌ）に添加することによ って、実質的に影響されなかったことを示す。ＰＥＧ配位子でなく、スルホナー トでのフタロンアニン天理の誘導によって可溶化されたケイ素フタロンアニンは 、血清を加えた場合に、蛍光強度および偏光の両方にて変化を示す。これらの変 化はヒドロキシ基をＰＥＧアクンヤル配位子で置き換えることによって排除され る。

図ＩＡ、ＩＢおよびＩＣは、フタロシアニン大環がスルホン化されているＰＥＧ −置換ケイ素フタロンアニンについての遷移状態の蛍光発光を示す。このＰＥＧ −ケイ素フタロンアニン誘導体は、緩衝液単独（ＳＡＰ−図ＩＡ）ではそうでは ないが、ＨＳＡ　（５％Ｈ５Ａ１００μＩ−図ＩＢ）、およびＨ５Ａ＋血清（５ ％ＨＳ　Ａ、　１００μｍと血清１００μｌ−図ＩＣ）の存在下で同じ遷移状態 発光を示した。これらの図は、天理のスルホン化が、マーカー成分のＨＳＡまた は血清成分への非特異的結合を妨げるアクシャルポリオキシヒドロカルビル可溶 化基の能力に影響を与えなかったことを証明している。

図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、実施例１０に従って製造し、中心ケイ素原子に連結 したいずれの可溶化ポリオキシヒドロカルビル基も有しない、スルホン化ケイ素 フタロシアニンについての遷移状態の蛍光発光を示す。図６Ａは、ＤＭＦ中のス ルホン化フタロシアニンの遷移状態の蛍光を示し、励起フラッシュの偏光につい て平行または垂直のいずれかに偏光させた２つの成分を示す。図６Ｂは、ＳＡＰ 中の図６Ａと同じ物質の同一濃度での遷移状態の蛍光を示す。図６Ａと６Ｂの比 較は、該物質が溶媒感受性であり、その蛍光がＳＡＰ中で消光した約４０％であ ることを示す。図６０は、ヒト血清１００μｌが加えられた６Ｂの溶液の試料３ ｍｌの遷移状態蛍光を示す。図６Ｂと６Ｃの比較は、血清の溶液への添加が蛍光 の増加を引き起こし、平行および垂直成分が実質的に等しい強度でないようなこ の染料の発光の偏光を誘発したことを示す。このことは、スルホン化ケイ素フタ ロシアニンの血清成分への実質的な結合を示す。さらに、血清の添加後の強度の 変化は血清成分に対する結合を示唆している。

図７Ａおよび７Ｂは、実施例１０に従って製造したスルホン化ケイ素フタロシア ニンの可視および近赤外線吸光度を示す。図７Ａは、ＤＭＦ中のスルホン化ケイ 素フタロンアニンの吸光スペクトルを示す。最大値の波長および吸光度は、各々 、６７３ｎｍ　（０，６３４）６０３ｎｍ　（０，１０７）である。図７Ｂは、 図７Ａと同じ濃度での、ＳＡＰ中のスルホン化ケイ素フタロンアニンの吸光スペ クトルを示す。最大値の波長および吸光度は、各々、６７８ｎｍ　（０，５０９ ）および６０６ｎｍ　（０，０９２）である。

ＩＴ、好ましいマーカー成分の製造 本発明の好ましいマーカー成分の−の製造方法によれば、アクンヤル配位子とし てのヒドロキシまたはハライド基を有する適当な発蛍光団を、反応形の可溶化ポ リオキシヒドロカルビル基と、一般反応式：％式％ ［式中、Ｍｃ＋は六環配位子、ＣＡは中心原子、Ｘは置き換えられる配位子およ びＳＭは可溶化基を意味する］ に従う配位子変換反応にて反応させる。この反応はニートでまたは、所望により 、溶媒中で実施してもよい。適当な溶媒は、キノリン、ＴＨＦＳＤＭＦ、イミダ ゾールなどを包含する。適当な反応温度、大環状の出発物質および可溶化基の性 質に依存して変化する。該反応は、一般に、約２分ないし約２４時間にて完了す る。

該反応混合物は、有利には、還流下、または砂浴のような手段により加熱するこ とができる。都合のよくは、該反応を常圧にて実施してもよい。

この反応は、アクシャル配位子として配位する１のポリオキシヒドロカルビル基 と、同時に２工程にて起こると考えられる。

図４．Ａ、４Ｂ、５Ａおよび５Ｃは、ポリオキシヒドロカルビル基と六環配位子 に配位した中心原子との反応が、段階的に進行することを明らかにしている。こ れらの図はＰＥＧとジヒドロキシケイ素フタロノアニン（ＰｃＳｉ（ＯＨ）２） の反応の生成物を示している。図４Ａおよび４Ｂは、最初の段階（「初期ブル一 段階」）で、発蛍光団基（ＳｉＰｃ）は、ＤＭＦおよびＳＡＰ　（水性食塩水ア ジドホスファート緩衝液）の両方に溶解性とするが、著しく溶媒に対して感受的 であり、約８５％が消光した（縦軸のスケールの違いに留意）ことを証明する。

図５Ａおよび５Ｂは、該反応の後の段階（「ブルー・グリーン生成」）の生成物 が、対照的に、全体として、溶媒に対して非感受的であり、各溶媒中にて同一の 発光強度および減衰時間を示したことを証明する。

ＩＩ！　利用性 本発明のマーカー成分は、蛍光イムノアッセイにおける、さらにはイン・ビボ画 像形成およびイン・ビポ腫瘍治療における蛍光プローブ用の蛍光標識として有用 である。

これらのマーカー成分は、有利には、蛍光偏光イムノアッセイを含めた通常の蛍 光イムノアッセイにおける蛍光標識として用いることができる。そのように使用 する場合、これらのマーカー成分は特異的結合対の１のメンバー（「標識化結合 パートナ−」）またはかかるメンバーのアナログに連結しうる。該マーカー成分 はそれに直接付着または結合し、またはリンカ−アームを介して付着または結合 しつる。

これらの標識化結合パートナ−は、分析対象または分析対象結合パートナ−につ いての競合が関与する検定のような、種々の様式を有する検定にて有用であり、 ホモジーナスまたはへテロジ−ナス検定にて用いることができる。

水溶液中の凝集からの有利な解放ならびに血清成分および他の生物学的マクロ分 子への非特異的結合の欠如と組み合わせた（検出可能な凝集を示さない）溶媒感 受性の欠如を考慮すると、これらのマーカーは、特に、血清のような生物学的流 体を含有する試料中の分析対象を検出する検定に用いるのに適している。かくし て、これらのマーカー成分は、血清成分による非特異的結合が、その正確性およ び精密性の両方に影響する検定の感度を厳格に解決する、溶液中の分析対象を検 出する蛍光プローブ用の標識として用いることができる。

別法として、これらのマーカー成分は、イン・ビポの画像形成についての薬剤と して用いることもできる。画像形成剤として用いる場合、これらのマーカー成分 を特異的結合対の１のメンバーに結合させて標識化結合パートナ−を得る。該標 識化結合パートナ−を動物に導入する。特異的結合対の他のメンノく−が存在す ると、該標識化結合パートナ−はそれに結合し、マーカー成分によって生じるシ グナルを測定し、その位置を同定することができる。

また、これらのマーカー成分を、イン・ビポの腫瘍治療に用いることができる。

例えば、光力学治療は、光増感剤としてのマーカー成分の使用を包含する。該マ ーカー成分（蛍光標識）は、腫瘍細胞の成分を特異的に認識し、それに結合しう る結合パートナ−に結合する。光による励起後における結合したマーカー成分複 合体からの局在蛍光発光は、腫瘍細胞に対して選択的な障害および／または破壊 を引き起こす。

本発明を理解するのを助力するに、一連の実験の結果を記載する以下の実施例を 挙げる。本発明に関する以下の実施例は、もちろん、本発明を制限するものと解 釈されるべきでなく、当業者の範囲内にあるであろう、公知でないあるいは後で 展開される本発明のかかる変形は、本明細書中て記載し、後に特許請求するよう に、本発明の範囲内にあるものと考えられる。

ジヒドロキシ−ケイ素フタロシアニン（Ｐｃ−５ｉ（ＯＨ）ｚ）の製造ジクロロ ケイ素フタロシアニン（２５９ｍｇ）（アルド１ハツチ・ケミカル・コーポレイ ション（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　＃　２８．　７７６− ８）を、濃水酸化アンモニウムｌＱｍｌとピリジン１０ｍ１の混合物中、撹拌し ながら約１４時間還流した。ラバーバルーンで還流コンデンサーの頂部をシール し、アンモニア気体の漏れを最小限とした。

反応混合物を冷却し、水で４０ｍ１に希釈して遠心分離に付した。沈殿物を水４ ０ｍ１中に再懸濁させることにより洗浄し、再度遠心分離に付した。第３の洗浄 水中の染料を沈殿させるために、少量のギ酸アンモニウムを加えて凝集を促進さ せた。洗浄した湿性残渣を真空下にて乾燥させた。

実施例２ ジヒドロキシケイ素フタロシアニンのスルホン化２回の異なる割合で合計８００ μｍのクロロスルホン酸をジヒドロキシケイ素フタロンアニン２３ｍｇに加えた 。温度を１１０−１１５℃に維持しながら、この混合物を一定にて３時間撹拌し た。この時点で反応混合物を冷却し、少しずつ注意して水中に加えた。得られた 染料溶液を塩化ナトリウム固体で飽和させ、塩析した染料を遠心分離により取り 出した。得られた沈殿物を真空下にて乾燥させ、スルホン化ＰｃＰｃ−３ｉ（Ｏ Ｈｈ１６を得た。

実施例３ スルホン化Ｐｃ　Ｓｉ（ＯＨ）ｚ２ｍｇおよびポリエチレングリコール（平均分 子量３００）３００μｌの混合物を、約１８５−２００℃の温度で３０分間保持 した。加熱により、この反応混合物は速やかに暗緑色となり、その３０分後に冷 却し、分光および溶液特性の決定用に直接用いた。

適当なレベルの蛍光強度を付与する少量の反応混合物（約１滴）をＤＭＦ中に希 釈し、この溶液５μＩを蛍光キュベツト中のＳＡＰ２ｍｌに加えた。遷移状態の 蛍光を、無発光フィルターを用い６９４ｎｍの励起波長で測定した。ＳＡＰの初 期トレースの後、５％Ｈ８Ａ１００μｌを加え、蛍光を再度測定した。これに、 つづいてヒト血清１００μｍを加え、最終の蛍光測定を行った。図ＩＡ（ＳＡＰ ）、ＩＢ　（ＳＡＰ＋Ｈ３Ａ）およびＩＣ（ＳＡＰ＋ＩＳＡ十血清）は、蛍光強 度、減衰時間または偏光における有意な差異が、得られた曲線で観察されなかっ たことを証明する。この結果は得られたスルホン化Ｐｃ−ＰＥＧ化合物が血清成 分に対して検出可能な結合を示さないことを意味する。

少量（＜１ｍｇ）のＰｃ５ｉ（ＯＨ）ｚを、１２Ｘ７５ｍｍの試験管中、約３０ ０μｌのＰＥ０３００　（アルドリッチ＃２０２３７−１）と混合した。この混 合物を手で振盪させて濁った青色懸濁液を得、ついで１８５℃の砂浴中に１分間 置き、ついで取り出して冷却した。該懸濁液はいくらか透明であり、なお青色で あった。

初期の試料を取り出した（アーク・ブル一段階）。ついで、加熱をさらに１０分 間、１８３−１８５℃にて続け、その時点で該混合物はほとんど透明であって、 青−緑色を有した（ブルー・グリーン生成）。２つの段階の試料（各々１０μｌ ずつ）を、各々、ＤＭＦｌｍｌで希釈し、ついでこれらの溶液６０μＩを蛍光測 定用の３ｍ１部のＤＭＦまたはＳＡＰのいずれかに加えた。結果を図４Ａおよび ４Ｂ（アーク・ブル一段階）および５Ａおよび５Ｂ（ブルー・グリーン生成）に 示す。アーク・ブル一段階では、ＳＡＰ中の蛍光シグナルはＤＭＦ中の蛍光シグ ナルのわずか１／６にすぎないが、ブルー・グリーン生成では、この２種の溶媒 における遷移蛍光の全時間は実質的に同一であった。

これらの結果は、アーク・ブル一段階にて、ケイ素フタロシアニン分子の中心の Ｓｉ基が１個のＰＥ０分子とのみ結合し、その平面状染料分子は１個面にて保護 されていない状態のままであるが、ブルー・グリーン段階にて、Ｓｉ基は２個の ＰＥ０分子と結合し、したがって染料構造は溶媒効果から十分に保護されるとす る考えと協調している。このような構造は、適宜、ＰｃＳ　ｉ（Ｐ　Ｅ　Ｇ）！ で表わし１２Ｘ７５ｍｍの試験管中、Ｐｃ５ｉ（ＯＨ）ｚｏ、８ｍｇを、撹拌ミ キサーでＰＥＧ−Ｍｅ、　３５０　（アルドリッチ＃２０２Ｏ２４７−９）１お よびキノリン（アルドリッチ＃２４１．１５７−１）１００μｌと混合した。こ の混合物を、１８０℃の砂洛中に置き、１時間にわたって２２０℃に加熱し、２ ２０℃にてさらに３０分間加熱した。この時点で、この溶液は透明な、深緑色で あった。

試料（１００μｌ）を５ＡＰ２００μｍで希釈し、１０．０００ｇで４０分間遠 心分離に付した。認識しうる沈殿物は検出せず、上澄液６０μＩをＤＭＦまたは ＳＡＰ３ｍｌ中に希釈した。２種の溶媒中の吸光度スキャンは、その吸光度で最 大値がわずか７Ｂｍ離れるだけでほとんど同一であることを示した。

図３Ａおよび３ＢはＤＭＦおよびＳＡＰの可視光線および近赤外線吸光度を示す 。

これらの測定は、この反応にて形成された物質がＰａ５ｔ（ＰＥＧ）ｚに相当す るという見解を支持する。長期加熱により生じる明白な緑色は、有意には、図３ Ａおよび３Ｂに示されているスペクトル領域ではなく、単にずっと低い波長（３ ３０−４００ｎｍ）での吸光が一因であり、それは単に眼が青と赤の混合を緑と して認識することにある。実施例４に示すように、縮合反応はいずれの触媒が不 在下であっても非常に迅速に進行し、おそらく溶液が顕著な緑色を示すずっと以 前に完了している。この例は、Ｐｃ環上にいずれの官能基も存在せず、ただ１つ の活性基（−ＯＨ）がＰＥＧの各分子に存在する点で重要なことである。反応混 合物中の大モル過剰のＰＥＧに関連して考えられるこれらの状況は、６８０ｎｍ 領域にて吸光する生成物としてＰｃＳｉ（ＰＥＧ−Ｍｅ）ｚの形成を強く支持し ている。

イにおいて優勢な濃度の血清によって影響されなかったことを示す。

吸光度の測定用に実施例５にて用いたＰｃＳｉ（ＰＥＧ−Ｍｅ）ｚのＤＭＦ溶液 を、この実験用にさらに希釈した（３μｌ＋３ｍ１ｓＡＰ）。

この溶液の遷移状態の蛍光をヒト血清１００μｌを加えまたは加えることなく測 定した（総容量を３．１ｍｌとした）。結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。蛍光強 度、偏光および減衰時間は２つの試料でほとんど同じであり、それはＳＡＰ中の 血清の結合がないことを示す。しかし、疎水的相互作用を強調するために溶媒を 非常に非−チャオトロビック（ｎｏｎ−ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）とすると、その 場合には結合が観察された。水溶液中、ＰＥＧ配位子のないスルホン化ケイ素フ タロシアニンの試料は、血清が加えられると、蛍光強度および偏光の両方にて変 化を示すで２．５００ないし４０にダルトンのフラクション範囲を有するＰ−３ ０バイオゲル（Ｂ　ｉｏｇｅｌ）ぐバイオ・ラッド・ラボラドリース（Ｂｉｏ　 Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））のカラムをＳ　Ａ　Ｐにて製造した。カ ラム容量は５．１ｍｌであり、長さが１７．５ｃｍであった。空隙容量はブルー デキストランでは１．５ｍｌであることがわかり、１００μｌを用いた場合に０ ．６１ｍ１にて通過した。実施例３で用いたスルホン化Ｐｃ−５ｉ（ＰＥＧ）２ １００μＩを該カラムに用いた場合、ブレイクスルーは３．４８ｍ、Ｉを越えて おり、実際には、該物質は０．７７ｍ１に含まれた。

染料のブレイクスルーは該空隙容量の２．３倍までなかったため、該染料は肉眼 て識別できる濃度でさえ凝集（すなわち、着色）しなかったことを示す。

修飾したドルセット（Ｄｏｒｓｅｔｔ）緩衝液（０，１４Ｍ　ＮａＣ１，０，０ ０２５ＭＫＣｌ、０．００１５Ｍ　ＫＨ２ＰＯ，，０，０１０Ｍ　Ｎａ２８ＰＯ ４，０，００１ＭＮａＮ３および０．０５％ツイーン（Ｔｖｅｅｎ）　２０含有 の水溶液）４９５μＩに、スルホン化ＰｃＳｉぐＰＥＧ）２（実施例３にて使用 ）５μｍを加えた。３０．０００ダルトン以上の分子を保持するフィルター（ミ リボール・コーホ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣａｒｐ）　、ウルトラフリー（Ｕｌｔ ｒａｆｒｅｅ）　Ｍｃ、３０．０００　ＮＭＷＬ）に、緩衝させたＰｃ５ｉ（Ｐ ＥＧ）２溶液４２０μＩを加えた。このフィルターアセンブリーを７０００ｇで ４０分間遠心分離に付した。

７００ｎｍでの励起化でデジタル式の光量子計数蛍光ポーラロメーターにて行っ た安定状態の蛍光測定は、５９％の染料が濾液中に回収されることを示した。同 じ構成で試験した３つの他の緩衝液では、該染料のほんの少量のフラクションだ けが濾液中に通った。これらの結果は、おそらく、フィルター表面の吸光による ものであり、それは、修飾ドルセント緩衝液の場合、ツイーン２０の含有によっ て妨げられたためてあった。

クロロプロピルジメチルクロロシランをベトラーチ・システムズ（ｐ　ｅｔｒａ ｒｃｈＳ　ｙｓｔｅｍｓ）より購入した。

ジヒドロキシケイ素フタロシアニン（０１６ミリモル）、イミダゾール（０，７ ミリモル）および乾燥ＤＭＦ　（１ｍｌ）をフラスコ中に入れ、クロロプロピル ジメチルクロロ７ラン（０，７ミリモル）を滴下し、大気中の湿気を排除するこ とに気を付けながら、２０℃にて撹拌した。２０℃での撹拌を２０時間続けた。

この時点で、溶媒を減圧下で除去し、生成物をシリカゲルクロマトグラフィーカ ラムに加えた。ＣＨ２Ｃｌ２−ヘキサン（１１）で溶出し、単一の着色フラクシ ョン、５ｉＰｃ［０３ｉ（ＣＨ＊）ｚＣＨｚＣＨｚＣＨ２Ｃ１］ｚ　（化合物■ ）を得た。

ＮＭＲスペクトルをゼネラル−ｘレフトリック（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒ ｉｃ）のＱＥ−３００スペクトロメーターにて記録した。ＮＭＲ（ＣＤＣ１３） ：δ９．６５（ｍ、芳香族、４１）、δ８．４５（ｍ、芳香族、４Ｈ）　、６２ ．１　ｃｔ、　ＣＬ−ｃｌ、　２Ｈ）　、δ−０，８５（ｍ、　ＣＨ２，２Ｈ） 　、δ−２，０９（ｍ、ｃＨ２−Ｓｉ、２Ｂ）　、δ−２，８５（ｓ、　ＣＨｓ 、　６０）。

Ａ、化合物Ｉ（０，０１ミリモル）を、アミン−末端ポリエチレングリコール７ ＭＷ２Ｏ００（０，２ミリモル）、ヨウ化ナトリウム（０，０１ミリモル）およ びＤＭＦ　（１ｍｌ）と−緒にフラスコに入れ、この混合物を９０℃にて１５時 間加熱撹拌した。

減圧下で溶媒を除去して粘性のブルー液を得、それをクロマトグラフィーにより 精製した。この生成物、Ｓ　ｉＰ　ｃ［ｏ　Ｓ　ｉ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ Ｈ２ＮＨ−Ｐ　Ｅ　Ｇ］２は高水溶性であり、水溶液中で強力な蛍光を示した。

生物学的緩衝液中、溶液としてのこの物質の蛍光は、ヒト血清アルブミンの添加 （最終濃度；３重量容量％まで）によって影響されなかった。

Ｂ、化合物ｒ（０，０１ミリモル）を、アミン−末端ポリエチレングリコール。

ＭＷ６００　（０，２ミリモル）、ヨウ化ナトリウム（０，０１ミリモル）およ びＤＭＦ　（１ｍｌ）と−緒にフラスコに入れ、この混合物を９０℃にて１５時 間加熱撹拌した。

減圧下にて溶媒を除去し、粘性のブルー液を得、それをクロマトグラフィーによ り精製した。

還流コンデンサー、乾燥管および撹拌棒を備えたフラスコ中のジクロロケイ素フ タロシアニン０９１ｇに、クロロスルホン酸８．６ｍｌを加えた。該混合物を撹 拌しなから１００−１１５℃に加熱した。３．５時間後、該混合物を一夜放置し て冷却した。塩化スルホニルへの変換は、塩化チオニル６ｍｌを添加し、ついで 得られた混合物を１，５時間還流することにより行った。該混合物を冷却し、ゆ っくりと水中に加えた。水性懸濁液を濾過し、固体を十分に水で洗浄し、最後に 真空下、Ｐ２Ｏ５を用いて乾燥させ、乾燥固体として上記生成物１．４１　ｇを 得た。

実施例１１ マグ不シウムテトラベンゾトリアザボルフィリン（ＭｇＴＢＴＡＰ）マグネシウ ム２７−フエニルチトラベンゾトリアザポルフイリン（Ｍｇ　２７−ＰｈＴＢＴ 、ＡＰ） マグネシウム２７−（ｐ−メチルフェニル）テトラベンシトリアザポルフィリン （Ｍｇ　２７−０−ＭｅＰｈＴＢＴＡＰ）マグネシウムテトラベンゾトリアザポ ルフィリンの合成は、最初、１９３９年にリンステッド（Ｌ　１ｎｓｔｅａｄ） によって報告された（参考文献６）。この染料は、エーテル中、１．２−ジシア ノベンゼンをＭｅＭｇＩと１＝１の等量で処理することにより製造した。エーテ ルを除去した後、その中間体を２００℃に加熱し、ＭｇＴＢＴＡＰを得た。Ｍｇ ＴＢＴＡＰの収量を増加させるのに、加熱過程の間に、該反応混合物中、１．２ ．３．４−テトラヒドロナフタレンのような高沸騰溶媒の存在が必須であること が判明した。そこで、本発明者らは、この方法を修飾した。

Ａ　マグネシウムテトラベンゾトリアザポルフィリン（ＭｇＴＢＴＡＰ）３Ｍ　 ＭｅＭｇｌ　２７ｍ１の溶液を、１．２−ジシアノベンゼン１０．５ｇとエーテ ル２５０ｍ１の撹拌混合物に加えた。この液体は直ちに明褐色に変色した。５分 以内に、暗褐色塊が分離するようになり、エーテルが緩やかに沸騰を始めた。

冷却することなく反応を進行させ、反応器を開放状態に保持してエーテルを蒸発 させた。１／２時間後、該反応を終え、エーテルの残りを熱水浴にて除去した。

この乾燥残渣に、１．２．３．４−テトラヒドロナフタレン２０ｍ１を加えた。

混合物を１９０℃に予め加熱した油浴中に入れた。５分後、その温度は２００’ Ｃに達した。水を滴下し、白色発煙の放出が生じた。合計２０ｍ１の水を２０分 間にわたって加えた。加熱を２００℃にて１／２時間続けた。室温に冷却後、暗 色固体を粉砕し、ＥｔＯＨと１ｌｌＨｃ１　（９：　１）の混合物で、その抽出 液がもはや黄褐色でないまで、繰り返して抽出した。残渣をアセトンで洗浄し、 真空デシケータ−中にて一夜乾燥させた。収量は４．３５　ｇであった。

Ｂ、マグネシウム２７−フエニルチトラベンゾトリアザボルフイリン（Ｍｇ　２ ７−ＰｈＴＢＴＡＰ） 前記と同様の方法にて、２７−ＰｈＴＢＴＡＰを製造した。１．２−ジンアノベ ンゼン４．８４　ｇとＩＭ塩化ベンンルマグネシウム４０ｍ１より、粗製生成物 ７、５３　ｇヲ得た。この合成にて、かなりの量のマグネシウム２７−フエニル チトラベンズジアザボルフイリン（Ｍｇ　２７−ＰｈＲＢＤＡＰ）が、副生生物 として形成された。加えて、マグネシウムフタロンアニン（ＭｇＰｃ）もいくら か形成された。粗製Ｍｇ　２７−ＰｈＴＢＴＡＰは、レゾノフ（Ｌｅｚｎｏｆｆ ）により記載されている方法［考文献７コに従って、Ｓｉｎ、カラム上にて精製 することができる。

Ｃ，マグネシウム２７−（ｐ−メチルフェニル）テトラベンシトリアザポルフィ リン（Ｍｇ　２７−ｐ−ＭｅＰｈＴＢＴＡＰ）ＭｇＴＢＴＡＰの合成に関するリ ンステッド法またはその修飾法に従うと、はんの微量の２７−ｐ−ＭｅＰｈＴＢ ＴＡＰが形成されただけであった。主たる生成物はＭｇＰｃであった。そこで、 該方法をさらに修飾した。

窒素導入管、乾燥管および滴下漏斗を備えた三ツロ丸底フラスコに、１．２−ジ シアノベンゼン２１．５ｇおよびＴＨＦ１４０ｍｌを入れた。窒素雰囲気下、す べての固体が溶解するまで、この混合物を２．３分撹拌した。０．７７Ｍ塩化ｐ −メチルベンジルマグネシウム２１６ｍ１の溶液を２時間にわたって滴下した。

２．３滴のグリニヤール試薬を添加した後、この液体は明黄色となり、ついで黄 緑色に変わった。さらにグリニヤール試薬を添加すると、その色相は桃紫色に変 わり、最終的に暗紫色になった。さらに１／２時間室温にて撹拌した後、減圧下 にて溶媒を除去した。この残渣に、１．２．３．４−テトラヒドロナフタレン８ ７ｍ１を加えた。ついで、該混合物を予備加熱した油浴（２０５℃）に入れた。

２０５℃にて１時間経過後、１０−２０分間隔で水を滴下した。合計１６ｍ１の 水を広範な３時間の加熱しながら加えた。該混合物を冷却し、ついで減圧下にて 乾燥させて残りの水を除去した。ついで、残渣を２００ｍ１のヘキサン中で撹拌 した。沈澱物を濾過により収集し、濾液がもはや褐色でなくなるまでヘキサンで 繰り返し洗浄した。風乾後、その固体を１．２Ｍ　ＭＣ１４００ｍ１中にて撹拌 して濾過した。該沈澱物を水で十分に洗浄し、真空デシケータ−中にて一夜乾燥 させて暗色粉末固体を得た。収量は２４ｇであった。この固体は、ＴＬＣによっ て、５種の化合物、おそらく、Ｍｇ−２７−ｐ−ＭＭｇ−２７−ｐ−、対応する ジアザおよびモノアザ化合物、プロフィリンおよびＭｇＰｃを含むことがわかっ た。Ｍｇ２７−ｐ−ＭｅＭｇ２７−ｐ−が優勢的な生成物であった。該生成物を 単離し、ヘキサン１５６０ｍＬ　ＴＨＦ６４２ｍｌおよびアセトン３１２ｍ１の 混合物で溶出するシリカゲルカラムを通して精製した。合計２０個のフラクショ ンを収集した。フラクション５−１０は、はとんどトリアザ−化合物染料を含有 し、いくらかジアザ−およびモノアザ−化合物を含有した。溶媒を除去し、暗色 固体５．２ｇを得た。さらにこの固体を、ヘキサン、ＴＨＦおよびアセトンの割 合が８＝２＝１である混合溶媒２３６０ｍ１で溶出するＳ　ｉ　０２カラムを介 して精製した。合計４２個のフラクションを収集した。これらのフラクションか ら、なかば純粋なＭｇ　２７−ｐ−ＭｅＰｈＴＢＴＡＰを得た。アセトンから再 結晶し、純粋なＭｇ２７−ｐ−ＭｅＭｇ２７−ｐ−を得た。収量は１．１２ｇで あった。

２７−フエニルチトラベンゾトリアザポルフイリン（２７−ＰｈＴＢＴＡＰ）２ ７−（ｐ−メチルフェニル）テトラベンシトリアザポルフィリン（２７−ｐ−Ｍ ｅＰｈＴＢＴＡＰ） リンステッド法に従って、粗製ＭｇＴＢＴＡＰ０．３５ｇを、室温にて濃硫酸２ ０ｍ１と一緒に撹拌した。１／２時間後、この黄−褐色液体を注意して少しずつ 氷水中に加え、該混合物を遠心分離に付した。緑色沈澱物を収集し、水で繰り返 し洗浄して遠心分離に付した。ついで、残渣を真空デシケータ−中にて一夜乾燥 させ、暗青色固体を得た。収量は０．２４ｇであった。

ＤＭＦ１２ｍｌ中、２７−ｐ−ＭｅＰｈＴＢＴＡＰｏ、２３ｇの溶液に、濃塩酸 １．２ｍｌを撹拌しながら加えた。１７２時間後、ピリジン１．２７ｍ１を加え 、鎖酸を中和した。混合物を水７５ｍ１中に注ぎ、ついでフリーザーにて１／２ 時間保持した。沈澱物を収集し、水で洗浄し、ついで真空デシケータ−中にて一 夜乾燥させて暗色固体を得た。該固体を、アセトン２０ｍ１とＭｅＯＨ３０ｍｌ の混合物より再結晶に付して精製した。収量は０．２０ｇであった。

０．２７−フエニルチトラベンゾトリアザボルフイリン（２７−ＰｈＴＢＴＡＰ ）Ｍｇ　２７−ｐ−ＭｅＰｈＴＢＴＡＰの脱金属化（ｄｅｍｅｔａｌａｔｉｏｎ ）　ニ）ｌ、Ｎテ（７）前記と同様の方法をＭｇ　２７−ＰｈＴＢＴＡＰに用い 、金属不含の２７−ＰｈＴＢＴＡ（ＳｉＣ１□２７−ＰｈＴＢＴ、ＡＰ）ケイ素 ２７−（ｐ−メチルフェニル）テトラベンシトリアザポルフィリンジクロリド（ ＳｉＣ１２２７−ｐ−ＭｅＰｈＴＢＴＡＰ）乾燥管およびコンデンサーを備えた ２５ｍ１の丸底フラスコに、Ｔ　Ｂ　Ｔ　Ａ　Ｐ１５１ｒｎｇを入れた。ＴＨＦ １５ｍｌを加えた。窒素雰囲気下、該混合物を撹拌し、ｉ、５Ｍリチウムジイソ プロピルアミド２．５ｍｌを加えた。該混合物は直ちに紫色となった。２０分後 、５ｉＣＬ２．５ｍｌを加え、ついで該混合物を加熱還流した。１時間後、溶媒 および過剰の５ｉＣ１４を、減圧下で除去した。この乾燥残渣をＴＨＦＩＱｍｌ で抽出した。このＴＨＦ抽出液を蒸発乾固し、洗浄液がほとんど透明となるまで 、残渣を水で繰り返し洗浄した。残渣を乾燥させて暗色固体５５ｍｇを得た。吸 収スペクトルは、　ｍａｘ６４８．６６９および６９３を示した。ＮＨ４ＯＨの 付加で、　ｗａｘは６４７．１および６６８．８にシフトした。ＴＨＦ抽出液よ り残された原残渣をＤＭＦ８ｘ６ｍｌで抽出した。−ｍａｘ６４７．１．６７０ ．５および６９２．２含有のフラクションを合した。溶媒を除去し、暗色固体３ ８ｍｇを得た。該固体をＤＭＦに再度溶かし、ＮＨ４ＯＨで処理した。そのＷａ Ｘは６４７１および６６８．８にシフトした。溶媒およびＮＨ２ＯＨを除去した 後、暗色固体３５ｍｇを回収した。該ＤＭＦ抽出液より残された残渣をさらに熱 ＤＭＦ１２ｘ２ｍｌで抽出した。吸収スペクトルは−ｍａｘ６７０．５および６ ９３．９を示した。ＮＨ４ＯＨの付加で、　ｗａｘは６４７．ｉおよび６６８． ８にシフトした。ＤＭＦを除去し、暗色固体ＩＱｍｇを得た。合した収量は９０ ｍｇであった。プロトン化した形態の染料は−ｍａｘ６７０．５および６９３． ９を有すると考えられる。脱プロトン化すると、その−ｍａｘは６４７．１およ び６６８．８にソフトした。その後、本発明者らは、５ｉＣ１４の除去が完全で ない場合、脱金属化が起こり得ることを見いだした。反応混合物の後処理中の脱 金属化を防ぐには、Ｓ　ｉＣ１４の除去後でいずれの水との接触前にも、少量の 、例えば、使用する５ｉＣＬ１モル当たり約０．４モルのピリジンを加える。

Ｂ、ケイ素２７−フエニルチトラベンゾトリアザポルフイリンジクロリド（Ｓｉ Ｃ１２２７−ＰｈＴＢＴＡＰ）および ケイ素２７−（ｐ−メチルフェニル）テトラベンシトリアザポルフィリンジクロ リド（ＳｊＣｂ　２７−ｐ−ＭｅＰｈＴＢＴ、ＡＰ）前記と同じ方法にて、これ らの２種のジクロロケイ素トリアザ化合物は、ＴＨＦ中、リチウムジイソプロピ ルアミドおよび５ｉＣＬを用い、その各々の金属不含形より製造した。

実施例１４ テトラベンシトリアザポルフィリンスルホニルクロリド［ＴＢＴＡＰ（Ｓｏ：Ｃ １）ｘ］ ２７−（ｐ−メチルフェニル）テトラベンシトリアザポルフィリンスルホニルク ロリド　［２７−ｐ−ＭｅＰｈＴＢＴＡＰ（ＳＯｚＣｌ）］２７−フエニルチト ラベンゾトリアザボルフイリンスルホニルクロリド［２７−ＰｈＴＢＴＡＰ（Ｓ Ｏ２Ｃ１）］Ａ、テトラベンシトリアザポルフィリンスルホニルクロリド［ＴＢ ＴＡＰ（ＳＯ２Ｃ１）ｘ］ コンデンサーおよび乾燥管を備えた２５ｍ１の丸底フラスコに、ＭｇＴＢＴＡＰ ｏ、４０１ｇおよびＣＩＣｌ５ＯｓＨ１０を入れた。混合物を撹拌し、８０−９ ０℃にて加熱した。３時間後、ＳＯＣ１２５ｍｌを加えた。加熱および撹拌を３ 時間継続した。室温に冷却した後、該混合物を少しずつ水中に加えた。この緑色 混合物を遠心分離に付し、残渣を飽和ＮａＣ１で繰り返し洗浄して濾過した。沈 澱物を最終的に氷水で洗浄し、真空デシケータ−中にて乾燥させて暗色固体を得 た。収量は領１６８ｇであった。

８．２７−（ｐ−メチルフェニル）テトラベンシトリアザポルフィリンスルホニ ルクロリド　Ｃ２７Ｄ−ＭｅＰｈＴＢＴＡＰ（ＳＯ２Ｃ１）コ２７−ｐ−メチル フェニル環を選択的にスルホン化するのに、前記の方法を修飾した。コンデンサ ーおよび乾燥管を備えた２５ｍ１の丸底フラスコに、Ｍｇ２７−ｐ−ＭｅＰｈＴ ＢＴ−ｐ−，２６５ｇ、ＣＩＣｌ５ＯｓＨ６および５ＯＣ１□１．５を入れた。

混合物を４２−４６℃にて一夜（１６時間）ｆｆ拌し、ついで前記の方法に従っ て後処理した。収量は０．２９６ｇであった。

Ｃ９２７−フエニルチトラベンゾトリアザポルフイリンスルホニルクロリド［２ ７−ＰｈＴＢＴＡＰ（ＳＯ２Ｃ１）］前記の修飾法に従って、Ｍｇ−２７−Ｐｈ ＴＢＴＡＰをスルホン化し、対応するＭｇ　２７　ＰｈＴＢＴＡＰ（ＳＯ２Ｃ１ ）を得た。

実施例１５ ケイ素テトラベンゾトリアザポルフイリンジヒドロキシド［５ｊ（ＯＨ）ＪＢＴ Ａ］’〕 Ｐｃ５ｊＣ１２をＰｃ５ｉ（ＯＨｈに変換するジョイナ−法（Ｊ　ｏｙｎｅｒ’ 　ｓ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に従った「参考文献７Ｌ コンデンサーおよびバルーンを備えた２５ｍ１の丸底フラスコに、ＳｉＣＬ２Ｔ ＢＴＡＰ３３ｍｇ、ＮＨｒＯＨ３ｍｌおよびピリジン３ｍ、ｌを入れた。混合物 を一夜加熱還流した。冷却後、該混合物を減圧下にて蒸発乾固させた。残渣を少 量の水中にて撹拌し、混合物を遠心分離に付した。最終残渣を乾燥させて暗色固 体を得た。収量は３２ｒｎｇであった。

実施例１６ ケイ素テトラベンシトリアザポルフィリンビス−フェニルポリエチレングリコ微 量の５ｉＣ１□ＴＢＴＡＰを、ヒドロキシフェニルポリエチレングリコール（Ｆ ｗ＝２０００）１５０ｍｇおよびキノリン２０μｌと混合した。混合物を１９５ ℃の砂浴中にて５分間加熱した。冷却後、混合物をＤＭＦ中に希釈した。

該ＤＭＦ溶液をさらにＨ２Ｏ中に希釈した。水溶液を遠心分離に付した。緑色上 澄液を得た。蛍光放出の強度はＤＭＦ中よりも水性緩衝液中のほうがいくらか大 きいが、この化合物の吸収スペクトルは、ＤＭＦまたは水性緩衝液にてほとんど 同様であった。

実施例１７ ジヒドロキケイ素フタロシアニンの低温スルホン化ＰｃＰｃ−５ｔ（ＯＨ）ｚ７ ４１をＣｌ５０３Ｈ１４，８ｍｌに加え、溶かすのに７０℃にて２．３分間撹拌 した。１０ｍ１の５ＯＣＩ２を加え、混合物を撹拌し、８０℃で６．５時間維持 した。ついで、反応混合物を一１５℃に冷却し、予め冷却した水浴に加えた。発 生熱を吸収するのに、約６００ｍ１のばらばらにバックしたアイスキューブが必 要であった。染料の懸濁液を約１１０００Ｘで遠心分離に付し、沈澱物を少量の ＮａＣ１含有のＨ，Ｏ中に懸濁させ、バラフナ−（Ｂ　ｕｃｈｎｅｒ）漏斗にて 濾過し、そのままでＨ２Ｏで洗浄した。生成物を真空下で乾燥させた。

実施例１８ スルホン化フタロシアニンのβ−アラニン誘誘導体β−アラシン５１４ｍｇよび ＮａｔＣ○３−Ｈ２Ｏ７５０ｍｇをＨ２Ｏ６ｍ　ｌに溶かした。撹拌しながら、 スルホン化Ｐｃ５ｉ（ＯＨ）ｚ　（実施例１７にて製造）１０３ｍｇを加えた。

混合物を撹拌し、７０−８０℃にて２５時間維持し、ついで室温にて一夜撹拌し た。反応混合物を希ＨＣＩで酸性化して遠心分離に付した。沈澱物をＮａＣ１溶 液中にて撹拌し、再度遠心分離に付した。その沈澱物をメタノールに溶かし、真 空下にて乾燥させた。この乾燥物質をＭｅＯＨに再度溶かして濾過した。濾液を ンリカ（シリカゲル６０−ＥＭプロダクツ（ＥＭＰｒｏｄｕｃｔｓ））　５　ｇ と混合し、真空下で乾燥させた。固体をシリカゲルカラムに加え、排出液が透明 となるまでＣＨ２Ｃｌ□で展開し、ついで染料をＭｅＯＨ勾配／ＣＨ２Ｃｌ□で 溶出した。フラクションをＴＬＣで試験し、主成分の含量により分類し、プール し、真空下で乾燥させた。この勧賞をざらに分取用ＴＬＣ（シリカゲル、ＣＨ２ Ｃｌ、およびＭｅＯＨ（６：　１））に付して精製した。

実施例１９ フタロシアニンのジゴキシン複合体（Ｐｃ−ＤＩＧ）スルホン化フタロシアニン （実施例１８にて製造）のβ−アラニン誘導体３．４μｇをＤＭＦ　４００μｍ に溶かした。この溶液に、ピリジン１００μｍ、ＨＯＢＴ　（５７ｍｇ／ＤＭＦ ｍｌ）２２μｌおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ ジイミド（ＥＤＡＣ）（２７ｍｇ／ＤＭＦｍｌ）１５０μＩを加えた。得られた 溶液を、ＤＭＦ１００μＩ中、３−アミノジゴジン（３−ａ＋１ｉｎｏ　ｄｉｇ ｏｘｉｇｉｎ）　３　、８　ｍ　ｇの溶液に加え：得られた混合物を室温にて− 夜保持した。このジゴキシン複合体をＴＬＣ（＃５７３７−７、ＥＭプロダクツ ）により精製し、ＣＨ２Ｃｌ□およびＭｅＯＨ（６：　１）で、後でＣＨ２Ｃｌ □およびＭｅＯＨ（６：　５）で展開した。主要バンド（Ｒｆ−０，５）をＭｅ ＯＨで抽出し、真空下で乾燥させた。

ＣＨｚＣ１２２ｍｌに溶かしたアミン末端ＰＥＧ３３６ｍｇの混合物に、３−（ ４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１８６ｍ ｇを加えた。得られた混合物を室温にて一夜保持した。溶媒を減圧下にて蒸発さ せた。

Ｐｃ−Ｄ　Ｉ　Ｇ　（１ｍｇ）を、２５０ｍｇのＰＥＧフェノール７５０と混合 し、１８８−１８９℃で５分間加熱した。冷却後、イムノアッセイにおける使用 用に溶融物をＤＭＦに溶かした。遷移状態の偏光蛍光によりモニター観察される 、抗−ジゴキシンに対する結合活性の試験にて、微量の該複合体を、ヒト血清５ ０μｌおよび抗体調製物２ｍｌ含有のＳＡＰ２ｍｌに溶かした。偏光における０ 　０５６の変化が抗体不含の対照との比較において得られた。

遷移状態の蛍光発光を以下のとおり測定した・整調できる染料レーザーを用い、 試料を光パルスて励起させた。該レーザーは、５Ｑｋｗの最大パルス出力を発生 する窒素レーザーと、５に、ｗの最大パルス出力を発生する染料レーザーモジュ ールとからなる。該染料レーザーは、実験に要する波長範囲についての適当なレ ーザー染料を用いることによって、およびｎｍでスケールされたマイクロメータ ーの調整による回折格子の配向こより堅調可能であった。合計のパルス時間は約 ６００ｐｓてあった。少しの部分（ビームの１０％以下）を高速ノ１ンママツ（ Ｈａｉｍａｍａｔｓｕ）フォトダイオードにスプリット・オフし、パルス時間を 測定し、パルス出力の読みを得た。蛍光シグナルを励起方向に対して９０°でモ ニター観察した。フィルターを用い、混乱試料のレーザーパルス光の大部分を除 去した。

レンズを用い、蛍光シグナルをＰＭＴ光電陰極に集めた。レーザー偏光に対して 平行および垂直な配向用の２つの位置を有する回転偏光子をＰＭＴの直前に置い た。該ＰＭＴは、４００ｎｍから８５０ｎｍまでの感度を有するハンママツ（Ｈ ａ龍ａｉ＋ａｔｓｕ）のゲートによる制御可能な（ｇｅｔｅａｂｌｅ）マイクロ チャネルプレートＰＭＴであった。

テクトロニクス（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ）　７９１２のプログラム可能なディジタ イザ−を用い、各光パルス後の蛍光シグナルを捕獲した。レーザーパルス、偏光 子の位置およびディジタイザ−をコンピューターにより制御した。

遷移状態の蛍光発光を測定するのに、使用者は実験に要するパルス数をセットし 、実験を開始する。ついで、コンピューターがフォトダイオードによってパルス が検知されるレーザーを作動させる。パルスシェーバ−を用いてＱ、５ｎｓパル スを１００ｎｓに拡張する。レーザーパルスが反応セルを通過すると、ＰＭＴは ２ｎｓ以内にゲートを制御した。これはその感度を１０．０００倍に増大させた 。フォトダイオードからのゲートはまたディジタイザ−ゲートを活性化し、つい でＰＭＴによって生成される次の２０ｎｓの電流を捕獲した。

実際問題として、励起源に対して平行な偏光子で情報を得、ついで、偏光子を再 度配向させて、励起源の偏光の方向に対して垂直なデータを得た。選択されたパ ルス数のデータは、両方の偏光子の配向の平均であり、モニター上に表示された 。ついで、データを蓄積し、プリントし、解析して蛍光減衰時間、偏光の減衰お よび総合強度を決定することができる。蛍光染料のない溶液からデータを収集し てブランク値を得、それを染料の蛍光減衰曲線から減することができる。

参考文献 １、クリツカ・ジェイ・ジェイ（Ｋｒｉｃｋａ、　Ｊ、　Ｊ、）　；配位子−結 合剤検定；標識および分析的方法（Ｌｉｇａｎｄ　−Ｂｉｎｄｅｒ　Ａｓ５ａｙ ｓ　：　Ｌａｂｅｌｓ　ａｎｄ　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳ　ｔｒａｔａｇｉｅｓ ’）　：　１５　５１頁：マルセル・デツカ−、インク（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋ ｋｅｒ。

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６　パレット・ビー・エイ、リンステ、ンド・アール・ビーおよびツエイ・ジー ・エイ・ビー（Ｂａｒｒｅｔｔ、　Ｐ、　Ａ、　、Ｌｉｎ５ｔｅａｄ、　Ｒ，Ｐ およびＴｕｅｙ、　Ｇ、　Ａ、　Ｐ、）　、ジャーナル・オフ・ケミカル・ソサ イエテイ−（Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、）　（ロンドン）、１８０９−１８２０　 （１９３９）。

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Ｃ，Ｃおよび〜ｆｃＫｅｎｏｖｎ）　、ジャーナル・オフ・オーガニ・ツク・ケ ミストリー（Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、）５５　：　２１８６−２１９０　（１９ ９０）。

８　ジョイナ−・アール・ディーおよびケニー・エム・イー（Ｊ　ｏｙｎｅｒ、 　Ｒ，Ｄ。

およびＫｅｎｎｅｙ、　Ｍ、　Ｅ、　）　、イノルガニツク・ケミストリー（Ｉ 　ｎｏｔｇ、　Ｃｈｅｗ、　）　１２３６−２３８　（１９６２）。

時間（ｎ秒） ｌｚ＝２：ｌンＬ　−平行　−−一　垂直時間（ｎ秒） ／ニンヱｌ　−エラ　−、−１１ 時間（ｎ秒） 〆；欠１１ｆ−−エ？”ｒ−＝−＊＊ 時間（ｎ秒） ｌｒり町　−平行　−一　垂直 ａ′ｌ ＪＭ メ：丈Ｊ’、ａ　− ｆｖβ 、　Ａ−１イｇ−２５ｄζ４ ７４≧Ｊシ乙 −平行　−ｍ−垂直　メ；ニアｉＡ− 一　平行　−ｍ−垂直 −’Ｆｒ　’　６１Ｋ　−（ンｊ次 メ；二こｌｆＡ＋　−平行　−−一！直／；工ｒＪ）−−平行　−・−垂直 ＳＡＰ＋１００ｍ１ヒト血清中のスルホン化ｐｃ−５１ｘｔ時間（０秒） ７乙２ンこシどｆ　ＤＭＦ中 要　約　書 凝集および血清結合のない蛍光染料を提供する。これらの染料は蛍光イムノアッ セイ、イン・ビボの画像形成およびイン・ビホの腫瘍治療のような使用に適して いる。

国際調査報告 ＠発明者　シュ、マオーリン　アメ シリカ合衆国カリフォルニア州９２７０８、ファウンテイン・ノ（レゾベンウッ ド・サークル　１８２ｏｏ番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．２つの可溶化ポリオキシヒドロカルピル基にカップリングした発光性の実質 的に平面状の分子構造を含む発蛍光団からなり、その１つが該平面状分子構造の いずれかの側面上に位置することを特徴とする検出可能に標識されたマーカー成 分。 ２．発光性の実質的に平面状の分子構造か中心原子に配位結合した大環状多座配 位子からなる請求項１記載のマーカー成分。 ３．２つの可溶化ポリオキシヒドロカルピル基の１つが大環状配位子の平面のい ずれかの側面上にて中心原子に連結している請求項２記載のマーカー成分。 ４．２つのポリオキシヒドロカルビル基か中心原子に配位結合するアクシャル配 位子からなる請求項３記載のマーカー成分。 ５．ポリオキシヒドロカルビル基がポリエーテル、ポリオール、水溶性炭水化物 、水溶性炭水化物誘導体および水溶性ポリマーより選択される請求項４記載のマ ーカー成分。 ６．中心原子が八面体配位錯体形成能を有する請求項４記載のマーカー成分。 ７、大環状配位子が結合π−電子系を有する請求項６記載のマーカー成分。 ８、大環状配位子が含窒素大環である請求項７記載のマーカー成分。 ９．大環状配位子がポルフィリン誘導体または窒素により置き換えられた１個以 上の架橋炭素を有するポルフィリン誘導体、コリン誘導体、サッフィリン誘導体 またはポルフィセン誘導体より選択される請求項８記載のマーカー成分。 １０．中心原子がケイ素、ゲルマニウム、リンおよびスズより選択される請求項 ９記載のマーカー成分。 １１．大環が、１〜４個の架橋炭素が窒素により置き換えられているポルフィリ ン誘導体からなる請求項１０記載のマーカー成分。 １２．ポリオキシヒドロカルビル基がポリエチレングリコールまたはポリエチレ ングリコール誘導体からなる請求項１１記載のマーカー成分。 １３．ポリオキシヒドロカルビル基が約２００〜約２０，０００の分子量を有す る請求項１２記載のマーカー成分。 １４．大環がテトラベンゾトリアザポルフィリン誘導体からなる請求項１３記載 のマーカー成分。 １５．大環がテトラベンゾトリアザポルフィリン、２７−フェニルテトラベンゾ トリアザポルフィリン．および２７−（ｐ−メチルフェニル）テトラベンゾトリ アザポルフィリンから選択される請求項１４記載のマーカー成分。 １６．中心原子がケイ素である請求項１４または１５記載のいずれかのマーカー 成分。 １７．大環状配位子が吸光の偏光に対して平行な発光の偏光を強化するように低 度の対称性を有する請求項１１記載のマーカー成分。 １８．中心原子がケイ素またはゲルマニウムである請求項１７記載のマーカー成 分。 １９．大環状配位子がＤ４ｈよりも低い対称性を有する請求項１８記載のマーカ ー成分。 ２０．大環状配位子が少なくとも１つの縮合芳香族環を有する請求項１９記載の マーカー成分。 ２１．大環状配位子が、１〜３個の架橋炭素原子が窒素により置き換えられてい るポルフィリン誘導体からなる請求項１９記載のマーカー成分。 ２２．大環状配位子がフタロシアニン誘導体からなる請求項２０記載のマーカー 成分。 ２３．大環がテトラベンゾトリアザポルフィリン誘導体からなる請求項２０記載 のマーカー成分。 ２４．中心原子がケイ素からなる請求項７、９、１７、２０、２１または２３記 載のいずれかのマーカー成分。 ２５．中心原子がゲルマニウムからなる請求項７、９、１７、２０、２１または ２３記載のいずれかのマーカー成分。 ２６．ポリオキシヒドロカルビル基がポリエチレングリコールまたはポリエチレ ングリコール誘導体からなる請求項２４記載のマーカー成分。 ２７．ポリオキシヒドロカルビル基がポリエチレングリコールまたはポリエチレ ングリコール誘導体からなる請求項２５記載のマーカー成分。 ２８．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項１記載のマーカー成分か らなることを特徴とする蛍光プローブ。 ２９．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項２記載のマーカー成分か らなることを特徴とする蛍光プローブ。 ３０．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項３記載のマーカー成分か らなることを特徴とする蛍光プローブ。 ３１．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項４記載のマーカー成分か らなることを特徴とする蛍光プローブ。 ３２．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項６記載のマーカー成分か らなることを特徴とする蛍光プローブ。 ３３．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項８記載のマーカー成分か らなることを特徴とする蛍光プローブ。 ３４．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項９記載のマーカー成分か らなることを特徴とする蛍光プローブ。 ３５．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項１２記載のマーカー成分 からなることを特徴とする蛍光プローブ。 ３６．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項１４記載のマーカー成分 からなることを特徴とする蛍光プローブ。 ３７．特異的結合対のメンバーかジゴキシン誘導体からなる請求項３６記載の蛍 光プローブ。 ３８．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項２４記載のマーカー成分 からなることを特徴とする蛍光プローブ。 ３９．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項２５記載のマーカー成分 からなることを特徴とする蛍光プローブ。 ４０．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項２６記載のマーカー成分 からなることを特徴とする蛍光プローブ。 ４１．特異的結合対の１つのメンバーに連結した請求項２７記載のマーカー成分 からなることを特徴とする蛍光プローブ。 ４２．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項２８ 記載の蛍光プローブ。 ４３．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項２９ 記載の蛍光プローブ。 ４４．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項３０ 記載の蛍光プローブ。 ４５．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項３１ 記載の蛍光プローブ。 ４６．特異的結合対のメンパーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項３２ 記載の蛍光プローブ。 ４７．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項３３ 記載の蛍光プローブ。 ４８．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項３４ 記載の蛍光プローブ。 ４９．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項３５ 記載の蛍光プローブ。 ５０．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項３６ 記載の蛍光プローブ。 ５１．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項３８ 記載の蛍光プローブ。 ５２．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項３９ 記載の蛍光プローブ。 ５３．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項４０ 記載の蛍光プローブ。 ５４．特異的待合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項４１ 記載の蛍光プローブ。 ５５．２つの可溶化ポリオキシヒドロカルビル基にカップリングした発蛍光団基 からなるマーカー成分であって、水溶液中、血清成分の存在下、血清がないのと 実質的に同じ強度の平行および垂直成分を有する遷移状態の蛍光発光によって特 徴付けられる検出可能に標識されたマーカー成分。 ５６．発蛍光団基かテトラベンゾトリアザポルフィリン誘導体からなる請求項５ ５記載のマーカー成分。 ５７．発蛍光団基がフクロシアニン誘導体からなる請求項５５記載のマーカー成 分。 ５８．特異的待合対の１つのメンバーに連結した請求項５５記載のマーカー成分 からなることを特徴とする蛍光プローブ。 ５９．特異的結合対のメンバーがプローブに特異的結合対を形成させることがで きる少なくとも１個の立体的に寛容なマーカー成分付着部位を有する請求項５８ 記載の蛍光プローブ。 ６０．実施例２１のフクロシアニンジゴキシンＰＥＧ複合体からなることを特徴 とする蛍光プローブ。