CN114736289B - 一种带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法。本发明先合成C‑端酰肼化的片段1和带有硫酸化修饰酪氨酸的片段2，再利用自然化学连接反应与伴随的新戊基脱除反应得到全长线性多肽，最后除去体系中杂质并滴加到重折叠反应体系中，进行氧化、重折叠反应，生成三对二硫键，得到目标产物。本发明将硫酸化酪氨酸这一翻译后修饰通过固相多肽合成法引入到多肽树脂上，使其稳定存在于固相树脂上，避免了副反应发生，并且实现了可分离纯化；将自然化学连接与新戊基在水溶液中的自动脱除相结合，缩短了反应时间；将线性多肽的自然化学连接与重折叠反应结合为中间无需分离纯化的一锅法反应，大大提高了合成产率，具有良好的应用前景。

Description

一种带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法
技术领域
本发明涉及多肽硫酸化修饰固相合成制备技术领域，具体涉及一种带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法。
背景技术
水蛭素(Hirudin)是一种从水蛭唾液中发现的蛋白。水蛭素的氨基酸序列约含65个氨基酸残基，它的氨基端(N端)含有六个半胱氨酸，通过三对二硫键形成球形紧密的稳定结构，而其暴露在外的羧基端(C端)序列与动物体内纤维蛋白原在氨基酸序列上具有同源性。动物体内的凝血酶会对纤维蛋白原有特异性识别并切割，使原本水溶性较好的纤维蛋白原形成不溶于水的纤维蛋白单体，通过上述作用机制起到阻塞血管、防止过度出血的作用。而“水蛭素与凝血酶”比“纤维蛋白原与凝血酶”具有更强的相互作用，可以直接抑制凝血酶的活性，是目前已知最有效的自然凝血酶抑制剂。因为水蛭素具有抗凝活性，人们考虑在临床上将其用作抗凝血剂，通过相关评估，认为水蛭素有作为抗血栓药物的潜在价值，并通过质粒表达方法获得重组水蛭素对其进行了一定的临床研究(Nowak,G.,K.,Thromb.Haemostasis,2007,98,116–119.)。
Ki可以表示酶动力学中的抑制常数，反映了抑制剂对酶的抑制强度，这个值越小，说明抑制强度越强。据报道，自然水蛭素对凝血酶的Ki值约为25fM(Stone,S.R.,Hofsteenge,J.,Biochemistry.,1986,25,4622-4628)，而通过大肠杆菌或酵母菌表达的重组水蛭素对凝血酶的Ki值约为300fM(Liu,C.C.,Schultz,P.G.,Nat.Biotechnol.,2006,24,1436-40.)，这说明通过质粒表达方法获得的重组水蛭素的抗凝活性比自然水蛭素低。自然水蛭素与重组水蛭素的活性差异是由于自然水蛭素中含有一个硫酸化修饰的酪氨酸(Tyr)，它可以使水蛭素的C末端带负电荷，增强水蛭素的C端与凝血酶的相互作用，从而提高水蛭素的抗凝活性。由于酪氨酸的硫酸化修饰是一种尽在高等真核生物中发现的翻译后修饰(post-translational modification,PTM)，通过大肠杆菌或酵母菌表达的重组水蛭素不会经历这一个重要的翻译后修饰，因此使重组水蛭素的抗凝活性显著降低。
蛋白质的翻译后修饰(PTM)是丰富生物体基因组结构多样性的一种常见机制。两种常见的PTM包括丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的O-糖基化修饰(R.J.Payne,C.H.Wong,Chem.Commun.,2010,46,21–43)与上述提到的酪氨酸(Tyr)的硫酸化修饰(C.Seibert,T.P.Sakmar,Pept.Sci.,2008,90,459–477)。这两种修饰分别通过糖基转移酶和酪氨酸蛋白磺基转移酶(TPSTs)在高尔基体重执行。据估计，在真核生物表达的蛋白质中，超过50％的是O-糖基化修饰的，超过1％的是进行了酪氨酸硫酸化修饰的。这两种PTM参与了许多生物学过程，包括分子识别、细胞分化、免疫调节和蛋白质折叠等，这引起了人们对糖基化和硫酸化蛋白质发展的各类疾病治疗药物产生了浓厚兴趣。尽管这些修饰很重要，但获得纯化的O-糖基化修饰蛋白和Tyr硫酸化修饰蛋白是极具挑战性的。因为PTM过程具有非模板化性质，它由转移酶的相对活性决定，根据相对活性的变化导致生物体表达出糖型(带O-糖基化修饰的)和磺型(带Tyr硫酸化修饰的)的各类蛋白质混合物，这样的混合物通常是无法通过色谱分离技术进行分离的。
为获得均一化的糖蛋白(O-糖基化修饰的蛋白)和硫酸化修饰蛋白，目前主要的可行途径是化学合成的方法。通过化学合成方法获得均一化糖蛋白的技术已经逐步成熟，而应用该技术合成均一化硫酸化修饰蛋白的技术也正在逐步发展当中。
目前发现的不同种水蛭素在氨基酸序列上有些许差异，认为水蛭素经过通过突变发展出若干种变体。其中，一种欧洲药用水蛭素HIRV1以未经修饰的形式作为抗凝血剂进入了临床研究中，并发现其展示出对人凝血酶活性具有一定的抑制作用(C.C.Liu,E.Brustad,W.Liu,P.G.Schultz,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,10648–10649.)。我们认为，如果能获得酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素HIRV1，且通过优化合成过程，提高硫酸化修饰水蛭素HIRV1在化学合成过程中的合成产率，将对水蛭素HIRV1临床研究中抗凝活性的提升以及临床研究成本的降低产生重大影响。因此，有必要开发一种合成与纯化便捷、可模块化合成、产率可观的合成方法，来高效制备均一化的带有硫酸化修饰的水蛭素HIRV1。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种带硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素的化学合成方法。
本发明方法制备得到的分段模块化的带硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素在经过自然化学连接与蛋白重折叠后，是可分离的且最终是均一化的。
本发明方法是经过优化的，是可以通过将自然化学连接与蛋白重折叠进行顺序的一锅反应达到提高合成产率的目的的。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法，包括如下步骤：
(1)根据水蛭素的氨基酸序列从任意半胱氨酸划分为片段1和片段2(片段2的N端为半胱氨酸)；使用C端为酰肼(-NHNH2)末端的树脂，简称酰肼树脂，采用Fmoc固相多肽合成法，根据片段1的序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，洗涤，干燥，获得片段1；
(2)使用C端为酰胺(-CONH2)末端的树脂，简称酰胺树脂，采用Fmoc固相多肽合成法，根据片段2的序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，洗涤，干燥，获得片段2；其中：
所述水蛭素的靠近C端的酪氨酸是硫酸化修饰的酪氨酸，使用侧链硫酸根保护基为新戊基(Neopentyl,nP)的Fmoc硫酸化修饰酪氨酸，简称Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH进行合成；
(3)取步骤(1)制备得到的片段1的线性多肽树脂，加入切割试剂，使多肽链从酰肼树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到C端为酰肼(-NHNH2)的片段1粗品；
(4)取步骤(2)制备得到的片段2的线性多肽树脂，加入切割试剂，使多肽链从酰胺树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到片段2粗品；进一步分离纯化，冻干，得到C端为酰胺(-CONH2)的片段2；
(5)取步骤(3)制备得到的C端为酰肼的片段1粗品，溶解，加入乙酰丙酮，摇匀，再加入4-巯基苯基乙酸(MPAA)，第一步反应，加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)，第二步反应，离心，过滤，进一步分离纯化，冻干，得到C端为MPAA的片段1；
(6)取步骤(4)制备得到的C端为酰胺(-CONH2)的片段2和步骤(5)制备得到的得到C端为MPAA的片段1，分别溶解，混合，进行自然化学连接(Native chemical ligation，简称NCL)反应，得到靠近C端的酪氨酸硫酸化修饰且新戊基已脱除的水蛭素线性多肽的粗品溶液，简称溶液M；
(7)取步骤(6)制备得到的溶液M，加入超滤管，离心过滤同时置换溶液体系，得到不含4-巯基苯基乙酸与三(2-羧乙基)膦的靠近C端的酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素线性多肽的粗品溶液，简称溶液N；其中：
所述的置换溶液体系为5.5～6.5mol/L盐酸胍，0.15～0.25mol/L磷酸二氢钠(PBS)，溶液的pH值为6.0±0.5；
(8)取步骤(7)制备得到的溶液N，缓慢滴加到重折叠反应体系中，反应，离心，过滤，进一步分离纯化，得到靠近C端的酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素；其中：
所述的重折叠反应体系为0.15～0.25mol/L Tris，3.5～4.5mol/L氯化钠，3.5～4.5mmol/L L-半胱氨酸，1.5～2.5mmol/L L-胱氨酸，溶液的pH值为8.5±0.5。
所述的化学合成方法中，所述的水蛭素的氨基酸序列如VVYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNK27CILGSD33G34 EKNQCVTGEGTPKPQSHND53G54 DFEEIPEEY63LQ，亦如SEQ ID NO.1所示，或如SEQ ID NO.1经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留相同生物学活性所得到的氨基酸序列所示。其中，上标表示该氨基酸在序列中的位置序号。
所述的化学合成方法中，所述的水蛭素的氨基酸序列中含有的天冬氨酸(Asp)-甘氨酸(Gly)氨基酸位点，使用侧链羧基和氨基的保护基分别为OtBu(叔丁酯，R2)和Dmb(2,4-二甲氧基苄基，R5)的Fmoc天冬氨酸-甘氨酸二肽，简称Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH进行合成。比如，当所述水蛭素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示时，第33位与第34位、第53位与第54位氨基酸位点的天冬氨酸(Asp)-甘氨酸(Gly)为具有特殊性的序列，逐步合成易出现异构现象导致最终纯化时无法获得均一化的多肽产物。使用上述二肽进行合成可以解决相关问题。其中，OtBu保护基与Dmb保护基可以通过三氟乙酸进行脱除。
所述的化学合成方法中，所述的半胱氨酸优选为水蛭素N端起第四、第五或第六个半胱氨酸；进一步优选为N端起第五个半胱氨酸。
所述的化学合成方法中，所述的酰肼树脂优选为2-Chlorotrityl Chloride树脂(简称2-Cl树脂)经5％(v/v)水合肼/DMF处理30min后得到获得的酰肼树脂。
所述的化学合成方法中，所述的酰胺树脂优选为Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂。
所述的化学合成方法中，所述的Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的结构式如下所示：
所述的Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的用量，若考虑成本，优选按Fmoc氨基树脂：Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH＝1：1.5的摩尔比计算；若不考虑成本，优选按Fmoc氨基树脂：Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH＝1：4的摩尔比计算；总的来说，所述的Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的用量按树脂：Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH＝1：1.5～4的摩尔比计算。
所述的Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH与Fmoc氨基树脂的偶联时间优选为6～12h；更优选为12h；
所述的Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的结构式如下所示：
所述的Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的用量，若考虑成本，优选按Fmoc氨基树脂：Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH＝1：1.5的摩尔比计算；若不考虑成本，优选按Fmoc氨基树脂：Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH＝1：4的摩尔比计算；总的来说，所述的Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的用量按树脂：Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH＝1：1.5～4的摩尔比计算。
所述的Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH与Fmoc氨基树脂的偶联时间优选为4～8h；更优选为8h。
除Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH与Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH以外的Fmoc保护氨基酸为无侧链的Fmoc氨基酸，或侧链的保护基团R1，R2，R3或R4能用三氟乙酸进行脱除的Fmoc氨基酸进行合成；其中：R1表示叔丁基(tBu)，R2表示叔丁酯(OtBu)，R3表示三苯甲基(Trt)，R4表示叔丁氧羰基(Boc)，用量优选按Fmoc氨基树脂：Fmoc保护氨基酸＝1：4的摩尔比计算。
除Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH与Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH以外的Fmoc保护氨基酸与Fmoc氨基树脂的偶联时间优选为2～4h；更优选为2h。
步骤(1)与步骤(2)中所述的从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸的具体操作为：在偶联体系作用下先将第1位氨基酸和脱除Fmoc后的酰肼或酰胺树脂反应生成氨基酸-氨基树脂，再逐一偶联其它Fmoc保护氨基酸，获得线性多肽树脂。
所述的偶联体系中的缩合剂优选为“HOBT+DIC”或“TBTU+DIEA”。特别的，所述的Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH、的偶联体系中缩合剂优选为“HOB T+DIC”。
所述的偶联体系中的Fmoc脱保护试剂优选为20％哌啶/DMF。
所述的偶联体系中的脱保护反应时间优选为5～10min。
所述的树脂的负载量优选为0.3～0.5mmoL/g。
步骤(3)与步骤(4)中所述的切割的试剂优选为三氟乙酸(TFA)、水和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DODT)按95：2.5：2.5的体积比混合得到的溶液。
步骤(3)与步骤(4)中所述的切割的时间优选为2～4h。
步骤(3)与步骤(4)中所述的萃取的萃取剂优选为冰***。
步骤(3)与步骤(4)中所述的萃取的次数优选为两次。
步骤(4)中所述的分离纯化优选通过反向液相色谱实现。
所述的反向液相色谱的流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈/水混合液。
步骤(5)中所述的溶解片段1粗品的溶液优选为5.5～6.5mol/L盐酸胍，0.15～0.25mol/L磷酸二氢钠(PBS)，溶液的pH值为3.0±0.5；进一步优选为6mol/L盐酸胍，0.2mol/L磷酸二氢钠(PBS)，溶液的pH值为3.0。
步骤(5)中所述的乙酰丙酮的用量，优选按片段1粗品：乙酰丙酮＝1:2.5的摩尔比计算。
步骤(5)中所述的摇匀时间优选为3分钟。
步骤(5)中所述的4-巯基苯基乙酸的用量，优选按片段1粗品：4-巯基苯基乙酸＝1:15的摩尔比计算。
步骤(5)中所述的第一步反应的条件为温度20～30℃(室温)，反应时间优选为12小时。
步骤(5)中所述的三(2-羧乙基)膦的用量，优选按片段1粗品：MPAA＝1:10的摩尔比计算。
步骤(5)中所述的第二步反应的条件为温度20～30℃(室温)，反应时间优选为20分钟。
步骤(5)中所述的分离纯化优选通过反向液相色谱实现。
所述的反向液相色谱的流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈/水混合液。
步骤(6)中所述的溶解片段1和片段2的溶液为5.5～6.5mol/L盐酸胍，0.15～0.25mol/L磷酸二氢钠(PBS)，0.15～0.25mol/L 4-巯基苯基乙酸，38～42mmol/L三(2-羧乙基)膦，溶液的pH值为6.5±0.5；进一步优选为6mol/L盐酸胍，0.2mol/L磷酸二氢钠(PBS)，0.2mol/L 4-巯基苯基乙酸，40mmol/L三(2-羧乙基)膦，溶液的pH值为6.5。
步骤(6)中所述的片段1的用量优选按1.5～2倍的片段2的当量计算。
步骤(6)中所述的自然化学连接反应的条件为温度37±0.5℃，反应时间优选为8～12小时。
步骤(6)中所述的自然化学连接反应由于在水溶液体系下进行，将同时伴随着新戊基的自动脱除。
步骤(7)中所述的超滤管使用的是分子量3K的超滤管，超滤的作用有：一是除去体系中所有分子量小于3000的分子；二是置换溶液体系。
步骤(7)中所述的置换溶液体系优选为6mol/L盐酸胍，0.2mol/L磷酸二氢钠(PBS)，溶液的pH值为6.0。
步骤(7)中所述的超滤并置换溶液体系的操作优选为重复五次。
步骤(8)中所述的重折叠体系优选为0.2mol/L Tris，4mol/L氯化钠，4mmol/L L-半胱氨酸，2mmol/L L-胱氨酸，溶液的pH值为8.5。
步骤(8)中所述的重折叠反应体系的体积优选按每0.25～0.4mg线性多肽溶于1mL反应溶液计算。
步骤(8)中所述的缓慢滴加的时长优选为15～30分钟，更优选为30分钟。
步骤(8)中所述的反应的条件为温度20～30℃(室温)，反应时间优选为4～12小时。
步骤(8)中所述的分离纯化优选通过反向液相色谱实现。
所述的反向液相色谱的流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈/水混合液。
一种带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素，通过上述合成方法得到。
上述带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素在制备抗凝血药物和/或医用材料中的应用。
本发明的原理如下：采用Fmoc固相多肽合成法，根据水蛭素的氨基酸序列，将序列模块化地分为两个肽段，多肽片段1为水蛭素的第1～27位氨基酸，以酰肼树脂为载体，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，得到水蛭素HIRV1多肽片段1的酰肼树脂；多肽片段2为水蛭素HIRV1的第28～65位氨基酸，以MBHA树脂为载体，在需引入修饰的位点(第63位酪氨酸)使用Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH，在需要避免异构化的位点(第33位天冬氨酸与第34位甘氨酸、第53位天冬氨酸与第54位甘氨酸)使用Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，得到水蛭素HIRV2多肽片段2的氨基树脂；其中，nP保护基的脱除方式有别于其余氨基酸的侧链保护基团；nP保护基将在NCL的水溶液反应体系下自动脱除，得到第63位酪氨酸硫酸化修饰且nP保护基已脱除的全长水蛭素线性多肽的粗品溶液；进行超滤离心，置换溶液，除去会影响重折叠反应的MPAA与TCEP；超滤、置换溶液后的全长水蛭素线性多肽的粗品溶液无需分离纯化，就可以缓慢滴加到大体积的重折叠反应体系中，使酪氨酸硫酸化修饰的全长水蛭素线性多肽的六个半胱氨酸位点(第6位、第14位、第16位、第22位、第28位、第39位)的六个自由巯基氧化形成三对二硫键(第6位与第14位为一对，第16位与第28位为一对，第22位与第39位为一对)，得到折叠后的酪氨酸硫酸化修饰的全长水蛭素蛋白。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明方法提出了在多肽树脂上引入硫酸化修饰酪氨酸Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的合成手段，并提供相应实例。该合成路线中仅需要通过技术已经成熟的Fmoc氨基酸固相合成方法，就可以在目标位置引入硫酸化修饰的酪氨酸，由于Fmoc氨基酸固相多肽合成方法的成熟，避免了合成过程中容易出现的副反应。
本发明方法中在多肽固相合成中引入侧链硫酸根保护基团为nP的氨基酸Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH，在NCL反应过程中，nP保护基在水溶液中自动脱除，无需增加额外的保护基脱除反应，缩短了合成的时间，提高了合成的效率。
本发明方法中在获得水蛭素的C端酰肼的多肽片段1粗品后，通过反应体系pH 3的硫酯化反应，将C端酰肼转化为MPAA并分离、纯化、冻干，使MPAA末端的HIRV1多肽片段1以冻干形式稳定存在，避免了MPAA在pH＞7时容易发生的水解反应。
本发明方法的研究前期，在步骤(6)的NCL反应进行后，会通过流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈/水混合液的反向液相色谱对步骤(6)获得的粗品溶液进行第一次分离纯化，冻干，获得第63位酪氨酸硫酸化修饰且nP保护基已脱除的全长水蛭素线性多肽的纯品，然后将纯品冻干粉末溶解于重折叠反应体系中进行氧化、重折叠，重折叠反应体系与上述体系的成分、浓度均相同，最后再次通过上述相同流动相的反相液相色谱方法进行分离纯化，冻干，获得第63位酪氨酸硫酸化修饰的全长水蛭素蛋白，蛋白合成产率为4％。本发明方法中创新以NCL反应与重折叠反应一锅法的方式。将水蛭素的C端为MPAA的多肽片段1与带有硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素的N端为半胱氨酸的多肽片段2，进行NCL反应，通过超滤离心、置换溶液体系的方法，除去易影响重折叠反应的小分子MPAA与TCEP后，将粗品溶液直接缓慢滴加至重折叠反应体系中，反应，实现水蛭素全长线性多肽折叠成水蛭素蛋白的转化，节省了此前NCL反应后的液相纯化步骤，将两次分离纯化减少至一次，在不影响产物纯度的前提下，极大缩短了合成时间和成本，且提高了合成产率，最终将蛋白合成产率提高到了21％。
通过本发明方法来制备带有硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素蛋白，解决了通过大肠杆菌或酵母菌表达重组水蛭素无法进行翻译后修饰过程的问题，运用Fmoc固相多肽合成，将硫酸化修饰酪氨酸引入到多肽中，通过NCL反应与重折叠反应的顺序一锅法提高水蛭素蛋白的合成产率。
通过本发明方法得到的带硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素蛋白有望表现出与自然水蛭素相当的抗凝活性，有助于研究水蛭素对于抗血栓或心血管疾病的生理生化作用，同时为水蛭素在临床研究与疾病防治方面奠定良好基础。
附图说明
图1为实施例1制备带硫酸化修饰且含新戊基保护酪氨酸的水蛭素HIRV1多肽片段2(F2nP)纯品时的反向高效液相色谱与ESI-MS的表征图。
图2为实施例1制备水蛭素HIRV1多肽片段1-MPAA(F1)纯品的反向高效液相色谱与ESI-MS的表征图。
图3为实施例1在制备HIRV1(63OSO3)的过程中，对反应原料片段1(F1)、带新戊基保护的片段2(F2nP)、NCL反应初始时(NCL-0h)、NCL反应结束时(NCL-12h)、重折叠反应开始时(Fold-0h)、重折叠反应结束时(Fold-12h)、反应最终产物HIRV1(63OSO3)(FoldP)的情况进行监测的反向高效液相色谱与重要出峰位置物质的ESI-MS的表征图。
图4为实施例1制备的HIRV1(63OSO3)抑制凝血酶切割纤维蛋白原的活性实验的结果图；其中，(A)为对照组1样品，(B)为对照组2样品，(C)为实验组样品。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH，其结构式如下所示，参考文献“Simpson L.S,Zhu J.Z,Widlanski T.S,et al.,Chemistry Biology,2009,16(2):153-161.”、“Simpson L.S,Widlanski T.S.,Journal of the American Chemical Society,2006,128(5):1605-1610.”、“Schlienger N,Peyrottes S,Kassem T,et al.,Journal ofMedicinal Chemistry,2000,43(23):4570-4574.”记载的方法制备得到：
下述实施例中使用的Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH，其结构式如下所示：
其余Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Val-OH。
下述实施例中HPLC，其仪器为安捷伦1260，色谱柱为Phenomenex C18柱，流动相为水和乙腈(含0.1％(v/v)TFA)。
下述实施例中合成的水蛭素HIRV1多肽片段1序列如下，多肽片段1的C端已酰肼化：
NH2-Val1-Val-Y(R1)-Thr(R1)-Asp(R2)-Cys(R3)-Thr(R1)-Glu(R2)-Ser(R1)-Gly-Gln(R3)-Asn(R3)-Leu-Cys(R3)-Leu-Cys(R3)-Glu(R2)-Gly-Ser(R1)-Asn(R3)-Val-Cys(R3)-Gly-Gln(R3)-Gly-Asn(R3)-Lys27(R4)-NHNH2
下述实施例中合成的带有硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素HIRV1多肽片段2序列如下，多肽片段2的N端为半胱氨酸，C端为酰胺末端：
NH2-Cys28(R3)-Ile-Leu-Gly-Ser(R1)-Asp33(R2)-Gly34(R5)-Glu(R2)-Lys(R4)-Asn(R3)-Gln(R3)-Cys(R3)-Val-Thr(R1)-Gly-Glu(R2)-Gly-Thr(R1)-Pro-Lys(R4)-Pro-Gln(R3)-Ser(R1)-His(R3)-Asn(R3)-Asp53(R2)-Gly54(R5)-Asp(R2)-Phe-Glu(R2)-Glu(R2)-Ile-Pro-Glu(R2)-Glu(R2)-Tys63(R6)-Leu-Gln(R3)-CONH2
下述实施例中用到的试剂名称及缩写：
DMF：N，N-二甲基甲酰胺；
DCM：二氯甲烷；
MeOH：甲醇；
HOBT：1-羟基苯并***；
DIC：N，N-二异丙基碳二亚胺；
TBTU：苯并***四甲基四氟硼酸；
DIEA：N，N-二异丙基乙胺；
NMM：N-甲基吗啉；
TFA：三氟乙酸；
DODT：1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸；
MeCN：乙腈；
TCEP：三(2-羧乙基)膦(TCEP)；
MPAA：4-巯基苯基乙酸；
PBS：磷酸二氢钠；
实施例1：带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素HIRV1的连接与重折叠一锅法合成方法：
(1)Fmoc-Lys(Boc)-NHNH2树脂的制备：取1g 2-Chlorotrityl Chloride树脂(简称2-Cl树脂)于多肽合成管中，负载量为0.3-0.5mmol/g，加入15mL DMF室温震荡溶胀两次，每次30min，排干，往树脂加入15mL 5％水合肼/DMF，在室温下震荡反应30min，再用DMF洗涤两次后，第二次加入15mL 5％水合肼/DMF，室温下震荡反应30min，再用DMF洗涤两次后，第三次加入15mL 5％水合肼/DMF，室温下震荡反应30min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到C端为酰肼末端的树脂(简称酰肼树脂)，往树脂加入15mL 5％MeOH/DMF，室温下震荡反应10min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，封闭未被酰肼化的树脂位点，称取Fmoc-Lys(Boc)-OH(1mmol)、TBTU(0.98mmol)以及DIEA(2mmol)，将Fmoc-Lys(Boc)-OH(第27位氨基酸)与TBTU用少量DMF溶解，加入DIEA，室温震荡反应活化羧基3min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应2h，采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂，取树脂通过紫外检测其树脂负载量，最终得到约负载量为0.42mmol/g的Fmoc-Lys(Boc)-NHNH2树脂。
(2)水蛭素HIRV1多肽片段1-NHNH2树脂的制备：取得到的Fmoc-Lys(Boc)-NHNH2树脂加入15mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，排干，之后往树脂里加入10mL 20％乙酸酐/DMF，室温震荡反应20min从而封闭未耦合上氨基酸的树脂的氨基，阻止其下一步反应，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，往树脂加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-Asn(Trt)-OH(4×0.42mmol),TBTU(3.9×0.42mmol)以及DIEA(8×0.42mmol)，将Fmoc氨基酸与TBTU用少量DMF溶解，加入DIEA，室温震荡反应活化羧基3min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应2h，可用茚三酮试剂监测反应，用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，重复以上实验操作(氨基酸含量以树脂的4倍摩尔当量计算，震荡反应为2h)，按照水蛭素HIRV1多肽片段1序列从C端到N端进行耦合。合成完毕后采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂2.7g。由于树脂质量增加，此时树脂的负载量约为0.15mmol/g。
(3)Fmoc-Gln(Trt)-MBHA树脂的制备：取1g Rink Amide MBHA树脂于多肽合成管中，负载量为0.3-0.5mmol/g，加入15mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，排干，往树脂加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到氨基脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-Gln(Trt)-OH(1mmol)、TBTU(0.98mmol)以及DIEA(2mmol)，将Fmoc-Gln(Trt)-OH与TBTU用少量DMF溶解，加入DIEA，室温震荡反应活化羧基3min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应2h，采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂，取树脂通过紫外检测其树脂负载量，最终得到约负载量为0.47mmol/g的Fmoc-Gln(Trt)-MBHA树脂。
(4)带硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素HIRV2多肽片段2-MBHA树脂的制备：取得到的Fmoc-Gln(Trt)-MBHA树脂加入15mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，排干，之后往树脂里加入10mL 20％乙酸酐/DMF，室温震荡反应20min从而封闭未耦合上氨基酸的树脂的氨基，阻止其下一步反应，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，往树脂加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-Leu-OH(4×0.47mmol),TBTU(3.9×0.47mmol)以及DIEA(8×0.47mmol)，将Fmoc氨基酸与TBTU用少量DMF溶解，加入DIEA，室温震荡反应活化羧基3min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应2h，可用茚三酮试剂监测反应，用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，重复以上实验操作(氨基酸含量以树脂的4倍摩尔当量计算，震荡反应为2h)，按照水蛭素HIRV1多肽片段2序列从C端到N端进行耦合。其中，第33位与第34位、第53位与第54位的天冬氨酸-甘氨酸序列需使用Fmoc-二肽Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH进行耦合；第63位硫酸化修饰酪氨酸需使用Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH进行耦合。合成完毕后采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂3.3g。由于树脂质量增加，此时树脂的负载量约为0.10mmol/g。
(5)水蛭素HIRV1多肽片段1-NHNH2粗品的制备：取200mg步骤(2)得到的树脂，加入10mL切割试剂(TFA：DODT：H2O＝体积比95：2.5：2.5)，震荡反应2～4h，过滤得到黄色透明液体，液体旋蒸仪旋干后，加入约20mL冰***萃取两次，离心后收集沉淀，将样品冻干，得到约30mg水蛭素HIRV1多肽片段1-NHNH2粗品。
(6)带硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素HIRV2多肽片段2纯品的制备：取200mg步骤(4)得到的树脂，加入10mL切割试剂(TFA：DODT：H2O＝体积比95：2.5：2.5)，震荡反应2h，过滤得到黄色透明液体，液体旋蒸仪旋干后，加入约20mL冰***萃取两次，离心后收集沉淀，将样品用20％ACN/H2O溶解，通过流动相为含0.1％TFA的ACN/H2O混合液的反向液相色谱进行分离纯化，将纯化后的样品冻干，得到约20mg带硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素HIRV2多肽片段2纯品；
(7)水蛭素HIRV1多肽片段1-MPAA纯品的制备：取步骤(5)获得的水蛭素HIRV1多肽片段1-NHNH2粗品，用含6mol/L盐酸胍、0.2mol/L PBS、pH 3.0的缓冲盐溶液溶解，加入2.5倍多肽粗品当量的乙酰丙酮，震荡3分钟摇匀，再加入15倍多肽粗品当量的MPAA，反应12h，再加入10倍多肽粗品当量的TCEP，反应20分钟，离心，过滤，通过流动相为含0.1％TFA的ACN/H2O混合液的反向液相色谱进行分离纯化，将纯化后的样品冻干，得到约10mg的水蛭素HIRV1多肽片段1-MPAA纯品。
(8)带硫酸化修饰酪氨酸的全长水蛭素HIRV1线性多肽粗品的制备：配置4mL含6mol/L盐酸胍、0.2mol/L PBS、0.2mol/L MPAA、40mmol/L TCEP、pH 6.5的缓冲盐溶液，取步骤(6)带硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素HIRV2多肽片段2纯品5.24mg，加入275μL上述缓冲盐溶液溶解，取步骤(7)水蛭素HIRV1多肽片段1-MPAA纯品5.92mg(为带硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素HIRV2多肽片段2纯品的1.67倍当量)，加入300μL上述缓冲盐溶液溶解，将275μL带硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素HIRV2多肽片段2纯品溶液加入300μL水蛭素HIRV1多肽片段1-MPAA纯品中混合，进行自然化学连接(Native chemical ligation，简称NCL)反应12h，同时在缓冲盐溶液中，伴随着硫酸根保护基新戊基(nP)的自动脱除，得到第63位酪氨酸硫酸化修饰且nP保护基已脱除的全长水蛭素HIRV1线性多肽的粗品溶液。
(9)带硫酸化修饰酪氨酸的全长水蛭素HIRV1线性多肽粗品的一锅法重折叠：取步骤(8)得到的第63位酪氨酸硫酸化修饰且nP保护基已脱除的全长水蛭素HIRV1线性多肽的粗品溶液，按体积平分为两份加入分子量为3K的超滤管中，离心超滤，使用6mol/L盐酸胍、0.2mol/L PBS、pH 6.0的缓冲盐溶液进行溶液置换，除去MPAA、TCEP这样影响重折叠反应的小分子，得到约250μL不含MPAA与TCEP的第63位酪氨酸硫酸化修饰的全长水蛭素HIRV1线性多肽的粗品溶液，缓慢滴加到约20mL的0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷、4mol/L氯化钠、4mmol/L L-半胱氨酸、2mmol/L L-胱氨酸、pH 8.5的重折叠反应体系中，进行多肽的氧化、重折叠反应12h，离心，过滤，通过流动相为含0.1％TFA的ACN/H2O混合液的反向液相色谱进行分离纯化，将纯化后的样品冻干，得到约1.81mg(分离产率约21％)的第63位酪氨酸硫酸化修饰的全长水蛭素HIRV1蛋白，简称HIRV1(63OSO3)。
步骤(6)获得的带硫酸化修饰酪氨酸的水蛭素HIRV2多肽片段2纯品的反向高效液相色谱与ESI-MS的表征，结果如图1所示。
步骤(7)获得的水蛭素HIRV1多肽片段1-MPAA纯品的反向高效液相色谱与ESI-MS的表征，结果如图2所示。
步骤(8)与步骤(9)在制备HIRV1(63OSO3)的过程中，对NCL反应初始时(NCL-0h)、NCL反应过程中(NCL-2h)、NCL反应结束时(NCL-12h)、重折叠反应开始时(Fold-0h)、重折叠反应结束时(Fold-12h)的情况进行监测，上述时间点的反向高效液相色谱与重要出峰位置物质的ESI-MS的表征，结果如图3所示。
对步骤(9)制备得到的HIRV1(63OSO3)进行生物活性分析，结果如图4所示。从中可以看出，本发明制备的HIRV1(63OSO3)能明显抑制凝血酶对纤维蛋白原的水解。
分析过程如下：
1)配制溶液X：50mM Tris，0.1M NaCl，0.1％(w/v)PEG，pH 7.8；
2)室温下(25℃)，将凝血酶(5nM)与HIRV1(63OSO3)(10nM)加入溶液X(1mL)中，溶解，振荡均匀，置于37℃下孵育30min，冷却至室温(25℃)，将纤维蛋白原(5μM)加入该样品中，振荡均匀，作为实验组；观察实验组样品的浑浊度；
室温下(25℃)，将纤维蛋白原(5μM)加入溶液X(1mL)中，振荡均匀，作为对照组1；观察对照组1样品的浑浊度；
室温下(25℃)，将凝血酶(5nM)加入溶液X(1mL)中，溶解，振荡均匀，置于37℃下孵育30min，冷却至室温(25℃)，将纤维蛋白原(5μM)加入该样品中，振荡均匀，作为对照组2；观察对照组2样品的浑浊度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 水蛭素HIRV1氨基酸序列
<400> 1
Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys
1 5 10 15
Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser
20 25 30
Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro
35 40 45
Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu
50 55 60
Gln
65

Claims (7)

1.一种带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）根据水蛭素的氨基酸序列从半胱氨酸划分为片段1和片段2；使用C端为酰肼末端的树脂，简称酰肼树脂，采用Fmoc固相多肽合成法，根据片段1的序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，洗涤，干燥，获得片段1；
（2）使用C端为酰胺末端的树脂，简称酰胺树脂，采用Fmoc固相多肽合成法，根据片段2的序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，洗涤，干燥，获得片段2；其中：
所述片段1的序列如下：
Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys；
所述片段2的序列如下：
Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln；
所述水蛭素的靠近C端的酪氨酸是硫酸化修饰的酪氨酸，使用侧链硫酸根保护基为新戊基的Fmoc硫酸化修饰酪氨酸，简称Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH进行合成；
所述水蛭素的氨基酸序列中含有的天冬氨酸-甘氨酸氨基酸位点，使用侧链羧基和氨基的保护基分别为OtBu和Dmb的Fmoc天冬氨酸-甘氨酸二肽，简称Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH进行合成；
（3）取步骤（1）制备得到的片段1的线性多肽树脂，加入切割试剂，使多肽链从酰肼树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到C端为酰肼的片段1粗品；
（4）取步骤（2）制备得到的片段2的线性多肽树脂，加入切割试剂，使多肽链从酰胺树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到片段2粗品；进一步分离纯化，冻干，得到C端为酰胺的片段2；
（5）取步骤（3）制备得到的C端为酰肼的片段1粗品，溶解，加入乙酰丙酮，摇匀，再加入4-巯基苯基乙酸，第一步反应，加入三（2-羧乙基）膦，第二步反应，离心，过滤，进一步分离纯化，冻干，得到C端为MPAA的片段1；
（6）取步骤（4）制备得到的C端为酰胺的片段2和步骤（5）制备得到的得到C端为MPAA的片段1，分别溶解，混合，进行自然化学连接反应，得到靠近C端的酪氨酸硫酸化修饰且新戊基已脱除的水蛭素线性多肽的粗品溶液，简称溶液M；
（7）取步骤（6）制备得到的溶液M，加入超滤管，离心过滤同时置换溶液体系，得到不含4-巯基苯基乙酸与三（2-羧乙基）膦的靠近C端的酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素线性多肽的粗品溶液，简称溶液N；其中：
所述的置换溶液体系使用的缓冲盐溶液为5.5～6.5mol/L盐酸胍，0.15～0.25mol/L磷酸二氢钠，溶液的pH值为6.0±0.5；
（8）取步骤（7）制备得到的溶液N，缓慢滴加到重折叠反应体系中，反应，离心，过滤，进一步分离纯化，得到靠近C端的酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素；其中：
所述的重折叠反应体系为0.15～0.25mol/L Tris，3.5～4.5mol/L氯化钠，3.5～4.5mmol/L L-半胱氨酸，1.5～2.5mmol/L L-胱氨酸，溶液的pH值为8.5±0.5。
2.根据权利要求1所述的带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法，其特征在于：
所述水蛭素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法，其特征在于：
步骤（5）中溶解片段1粗品的溶液为5.5～6.5mol/L盐酸胍，0.15～0.25mol/L磷酸二氢钠，溶液的pH值为3.0±0.5；
步骤（6）中溶解片段1和片段2的溶液为5.5～6.5mol/L盐酸胍，0.15～0.25mol/L磷酸二氢钠，0.15～0.25mol/L 4-巯基苯基乙酸，38～42mmol/L三（2-羧乙基）膦，溶液的pH值为6.5±0.5；
步骤（8）中所述的重折叠反应体系的体积按每0.25～0.4mg线性多肽溶于1mL反应溶液计算。
4.根据权利要求1或2所述的带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法，其特征在于：
步骤（5）中溶解片段1粗品的溶液为6mol/L盐酸胍，0.2mol/L磷酸二氢钠，溶液的pH值为3.0；
步骤（6）中溶解片段1和片段2的溶液为6mol/L盐酸胍，0.2mol/L磷酸二氢钠，0.2mol/L4-巯基苯基乙酸，40mmol/L 三（2-羧乙基）膦，溶液的pH值为6.5；
步骤（5）中所述的乙酰丙酮的用量按片段1粗品：乙酰丙酮=1:2.5的摩尔比计算；
步骤（5）中所述的4-巯基苯基乙酸的用量按片段1粗品：4-巯基苯基乙酸=1:15的摩尔比计算；
步骤（5）中所述的三（2-羧乙基）膦的用量按片段1粗品：三（2-羧乙基）膦=1:10的摩尔比计算；
步骤（6）中所述的片段1的用量按1.5～2倍的片段2的当量计算；
步骤（7）中所述的超滤管使用的是分子量3K的超滤管；
步骤（7）中所述的置换溶液体系使用的缓冲盐溶液为6mol/L盐酸胍，0.2mol/L磷酸二氢钠，溶液的pH值为6.0；
步骤（8）中所述的重折叠反应体系为0.2mol/L Tris，4mol/L氯化钠，4mmol/L L-半胱氨酸，2mmol/L L-胱氨酸，溶液的pH值为8.5。
5.根据权利要求4所述的带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法，其特征在于：
步骤（5）中所述的第一步反应的条件为温度20～30℃，反应时间为12小时；
步骤（5）中所述的第二步反应的条件为温度20～30℃，反应时间为20分钟；
步骤（6）中所述的自然化学连接反应的条件为温度37±0.5℃，反应时间为8～12小时；
步骤（8）中所述的缓慢滴加的时长为15～30分钟；
步骤（8）中所述的反应的条件为温度20～30℃，反应时间为4～12小时。
6.根据权利要求2所述的带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法，其特征在于：
所述的酰肼树脂为2-Chlorotrityl Chloride树脂经5%水合肼/ DMF处理30min后得到获得的酰肼树脂；
所述的酰胺树脂为Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂；
所述的Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的结构式如下所示：
所述的Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的用量按树脂：Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH= 1：1.5～4的摩尔比计算；
所述的Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH与Fmoc氨基树脂的偶联时间为6～12 h；
所述的Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的结构式如下所示：
所述的Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的用量按树脂：Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH=1：1.5～4的摩尔比计算；
所述的Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH与Fmoc氨基树脂的偶联时间为4～8 h；
除Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH与Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH以外的Fmoc保护氨基酸为无侧链的Fmoc氨基酸，或侧链的保护基团R1，R2，R3或R4能用三氟乙酸进行脱除的Fmoc氨基酸进行合成；其中：R1表示叔丁基，R2表示叔丁酯，R3表示三苯甲基，R4表示叔丁氧羰基，用量按Fmoc氨基树脂：Fmoc保护氨基酸=1：4的摩尔比计算；
除Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH与Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH以外的Fmoc保护氨基酸与Fmoc氨基树脂的偶联时间为2～4h；
步骤（1）与步骤（2）中所述的从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸的具体操作为：在偶联体系作用下先将第1位氨基酸和脱除Fmoc的酰肼或酰胺树脂反应生成氨基酸-氨基树脂，再逐一偶联其它Fmoc保护氨基酸，获得线性多肽树脂；
所述的偶联体系中的缩合剂为HOBT和DIC，或TBTU和DIEA；
所述的偶联体系中的Fmoc脱保护试剂为20%哌啶/DMF；
所述的偶联体系中的脱保护反应时间为5～10min；
所述的树脂的负载量为0.3～0.5mmoL/g。
7.根据权利要求1或2所述的带有酪氨酸硫酸化修饰的水蛭素的化学合成方法，其特征在于：
步骤（3）与步骤（4）中所述的切割试剂为三氟乙酸、水和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸按95：2.5：2.5的体积比混合得到的溶液；
步骤（3）与步骤（4）中切割的时间为2～4 h；
步骤（3）与步骤（4）中所述的萃取的萃取剂为冰***。
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