JPH05500011A - クロストリジウム・ディフィシレのトキシンｂに特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢに特異的なモノクローナル抗体 発明の背景 クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｒｆｉｃｉｌ ｅ）は、抗生物質関連の偽膜性腸炎に罹患した患者の主要な疾患病因（９５％） であり、腸炎を伴わない抗生物質関連性下痢の患者にもある程度（２０％）関与 している［バートレット（ＢａｒｔｌｅＬＬ、　Ｊ、　）のＧａ５ｔｒｏｅｎｔ ｅｒｏ１．８ニア８３−８０１（１９７９）］。さらに、慢性炎症性腸疾患の患 者の１９％は、その糞便中にＣ，ディフィシレ毒素が存在し、その疾患の重篤度 と毒素の存在とは正の相関関係にある［Ｔｒｎｋａ、　Ｙ、らのＧａｓｔｒｏｅ ｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　８０：６９３−６９６（１’９８１月。

Ｃ，ディフィシレから産生される毒素としてはトキシンＡおよびトキシンＢの２ つの毒素がある［サリバン（Ｓｕｌ　１ｉｖａｎ、　Ｎ、　Ｍ、　）　Ｉｎｆｅ ｃｔ。

Ｉｎ＋ｕｎ、　３３：１０３２−１０４０（１９８２）］。トキシンＡ１即ちエ ンテロトキシンは、疾患に伴う腸管透過性の増大に関与する［Ｔｒｉａｄａｆ　 １ｌｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｇ。

らのＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　９３：２７３−２７９（１９８７）コ 。トキシンＢ、即ちサイトトキシン（細胞毒）は、培養細胞に細胞毒性効果を引 き起こす作用がトキシンＡと比較して１０００倍強力である［Ｒｏｔｈｍａｎ、 　Ｓ、　Ｗ、　、ｌ　ｎ４ｅｃｔ、ｌｕ＋ｕｎ、４６：３２４−３３１（１９８ ４）；　５ｕｌｌｉｖａｎ、Ｎ、Ｍ、＋　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、３３：１ ０３２−１０４０（１９８２）］。

トキシンＡは分子量が３００，０ＯＯｋＤａよりも大きく、トキシンＢはそれよ りも若干小さい［Ｌｙｅｒｌｙ、　Ｄ、　Ｈ，らのＩｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、 　５４ニア０−７６（１９８６）］。さらに、片方の毒素に対して調製した抗血 清は他方の毒素とは交叉反応しない。従って、これら２つの毒素は別個の生物学 的および血清学的活性を有している。

特異的な抗生物質療法は存在するが、疾患に関与する毒素を迅速かつ正確に診断 する検定法は存在していない。迅速なラテ、、クス試験が開発されたが、それは 、臨床的に確定された疾患とは弱＜（６７％）しか関係しない分子量４３．００ ０のＣ，デイフイシレ関連タンパク質を検出するものである［Ｌｙｅｒｌｙ、　 Ｄ、■、らのＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

２６：３９７−４００（１９８８）］　［Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｌ、　Ｒ，の＾ ―、　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｐａｔｈ、　８７：２９８−２X９（１ ９８７）］。インビトロ細胞の細胞毒性検定は広く受け入れられているＣ、ディ フィシレ関連疾患のための診断法である。しかし、この試験は４８時間の作動時 間が必要であり、組織培養に熟達した技術を要する。毒素特異的なポリクローナ ル基礎ＥＩＡの挙動は期待できない。その理由は、毒素特異的な力価が比較的低 く、またポリクローナル抗血清の非特異的な反応性のレベルが高いことによる［ Ｗａｌｔｅｒ、　Ｒ，Ｃ，らのＤｉａｇｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｎｆｅｃｔ 、Ｄｉｓ、５：６ｌ−６９（１９８６月。

それらの疾患検出における利用可能性にも拘わらず、毒素特異的なハイブリドー マの生成は困難であることが判明した。Ｌｙｅｒｌｙら［前掲］は、トキシンＡ 特異的なモノクローナル抗体の調製を報告している。また、Ｗｉｌｋｉｎｓらの １９８９年１１月７日発行の米国特許第４．８７９．２１８号にも、トキシンＡ 特異的モノクローナル抗体の調製が記載されている。この特許にはさらに、トキ シンＡおよびトキシンＢ抗体をともに含有するポリクローナル血清から作成され るモノ特異的トキシンＢ抗体の調製が記載されている。

Ｃ，ディフィシレのトキシンＡとの交叉反応性を有しないトキシンＢモノクロー ナル抗体に対する要求は依然として存在する。

本発明の要約 本発明は、抗体、特にクロストリジウム・デイフイシレのトキシンＢに特異的な モノクローナル抗体に関する。本抗体は、Ｃ，デイフィシレ由来のトキシンＡに 対し、反応性を示さない。本発明抗体は、クロストリジウムの検出および処置の 方法に有用テアル。

図面の説明 第１Ａ図および１８図は、ゲル浸透および陰イオン交換クロマトグラフィーによ るトキシンＢの精製を示している。Ａ）５−３００カラムに画分化された濃縮Ｃ ，デイフイシレ１．０４６３の細胞培養上清である。Ｂ）ＤＥＡＥカラムから溶 出された５−３００カラム由来のサイトトキシン豊富な画分プールである。

好ましい態様の説明 Ｃ，ディフイシレによって引き起こされる全腸炎の検出および処置のための組成 物および方法Ｃ、ディフィシレのトキシンＢに特異的なモノクローナル抗体を得 る。この抗体は、Ｃ，デイフイシレの検出のための検定法および全腸炎の処置の ための治療法に使用される。

本発明のモノクローナル抗体はＣ，デイフイシレのトキシンＢに特異的である。

この抗体は２５０ｋＤａのタンパク質および毒素産生性Ｃ，ディフィシレの上清 と反応し、非毒素産生性Ｃ，デイフイシレ株とは反応しない。このモノクローナ ル抗体は、Ｃ，ソルデリイ（Ｃ，５ｏｒｄｅＩ　ｌ１ｉ）、Ｃ、パイファーメン タンス（Ｃ，ｂＨｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｃ。

バーフリンジエンス（Ｃ，ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ）由来の濃縮上清、またはＣ， デイフィシレ由来の精製トキシンＡとは反応しない。このことは、トキシンＢに 対して生じさせたポリクローナル抗血清を利用する、従来証明されていた結果と は、全く対照的である。トキシンＢに対して生じさせたポリクローナル抗血清は Ｃ，ソルデリイ、Ｃ，ノイイファーメンタンスおよび非毒素産生株２０３７由来 の上清と強く反応した。

当業界で一般に知られているように、抗体は、抗体生成を銹発するのに使用する 抗原以外のものと反応する場合、交叉反応するとみなされる。本発明に係るトキ シンＢに対する抗体は、トキシンＡと交叉反応しない。

本発明の抗体は、ウサギなどの動物を不活性トキシンＢ抗原で免疫することによ り、調製する。トキシンＢ豊富な画分を回収するための特定の方法は、以下の実 験の部で説明する。

毒素を精製した後、トキシンＢは種々の方法により不活化することができる。例 えば、その毒素は、ＳＤＳを利用、あるいはホルムアルデヒドを利用することに より不活化することができる。これらの方法はともに、以下の実験の部でより詳 細に説明している。不活化した毒素を利用して動物を免疫すれば、モノクローナ ル抗体を調製することができる。

本発明のモノクローナル抗体がトキシンＡと交叉反応しないことは特に重要であ る。本発明の特定のプロトコールによって何故トキシンＢに特異的なモノクロー ナル抗体が調製できるのかを考えると、単なる予想であるが、それはその実験系 のひとつの局面に特有のものなのかもしれない。例えば、実験の部で説明する精 製方法によれば、高度に精製されたトキシンＢが得られるが、これはモノクロー ナル抗体を調製するための他の方法に利用することができる。あるいは、本出願 によって提供される不活化手段では、細胞毒性作用の弱い不活化トキシンＢを得 ることができるので、刺激されたＢ細胞が抗体を産生できたのかもしれない。モ ノクローナル抗体の調製についての一般的な説明を行うのは、本発明の高度に精 製された不活化トキシンＢがモノクローナル抗体を産生できるという認識からで ある。

種々の方法の殆どのものは、モノクローナル抗体を調製するための免疫学領域に おいて周知である。免疫学の一般原理についての標準的な参照すべき研究には、 １ｌｌｅ：ｎ、　Ｊ、　［１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：　１４胞−非細胞区別の科学 （Ｔｈｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｒ　Ｃｅ１ｌＪｏｎｃｅｌｌ　Ｄｉｓｃｒｉｍｉ ｎａｔｉｏｎ）、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、ニューヨーク（１９ ｇ２）］、Ｋｅｎｎｅｔｔ、　Ｒ，ら［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ、）Ｉｙｂｒｉｄｏｍａ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ。

プレノー・プレス、ニューヨーク（１９８Ｇ）］、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ａ、ビ ｒｏｎｏｃｌ。

ｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、”　Ｉｎ：　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻（Ｂｕｒｄｏｎ、　Ｒ，ら編）、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。

アムステルダム（１９８４月、およびＥｉｓｅｎ、Ｈ，Ｎ、［ｆｎ：　ｉｌｉｃ ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　３版（Ｄａｖｉｓ、　Ｂ、　Ｄ、ら、　Ｈａｒｐｅｒ　 ＆　Ｒｏｗ、フィラデルフィア（１９８Ｇ）月らの研究などがある。

本発明のモノクローナル抗体は、組換え釣手法または他の手法によって［ヒト化 （ｈｕｓａｎｉｚｅｄ月（即ち、ヒトにおいて非−免疫原性に）することができ る。ヒト化抗体は、例えば抗体の免疫原性部分を非−免疫原性の対応部分と置換 することによって製造することができる（即ち、キメラ抗体）［ロビンソン（Ｒ ｏｂｉｎｓｏ口、　Ｒ，Ｒ，）らの国際公開ＰＣ丁／ＵＳ８６１０２２６９　； アキラ（＾ｋｉｒａ、　Ｌ　）らの欧州特許出願第１８４．１８７号；タニグチ （Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｍ、　）らの欧州特許出願第１７１．４９６号；モリ ソン（輩ｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ、　Ｌ、　）らの欧州特許出願第１７３．４９４ 号；ニューベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、’　Ｓ、　）らのＰＣＴ出願 １０８６１０１５３３　；キャビン（Ｃａｂｉ　ｆｌｙ、　Ｓ、　）らの欧州特 許出願１２５．０２３号；ビター（Ｂｅｔｔｅｒ、　Ｍ、　）らの５ｃｉｅｎｃ ｅ　２４０：１０４１−１０４３（１９８８）　；ルー（Ｌｉｕ、＾、Ｙ、）ら のＰｒｏｃ、　ｌ１ａｔ１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８ ４F 「ヒト化」キメラ抗体についての一般的説明は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ＋　Ｓ、　Ｌ 、　［５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２−１２０７（１９８５）］およびＯｉ 、　Ｖ、　Ｔ、ら［ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４（１９１１１６） ］によってなされている。

あるいは、適当な「ヒト化」抗体はＣＤＲまたはＣＥＡ置換にょっ抗体は、ある 分子と特異的に反応することによりその分子が抗体と結合できる場合に、分子と 「結合できる」と言われる。上記の特異的な反応は、抗原が高い選択性で対応す る抗体と反応し、池の抗原によって誘起され得る他の多くの抗体とは反応しない ことを示す意味である。

本明細書で使用している「抗体（Ａｂ月または「モノクローナル抗体（Ｍａｂ月 なる用語は、ハプテンと結合することのできる無傷の分子およびそのフラグメン ト（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）、フラグメントなど）を包含する意であ る。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｒフラグメントは、無傷の抗体のＦｃフラグメン トを欠いており、より迅速に循環系から消失し、無傷抗体の非特異的な組織結合 性がより小さいものであり得る［ＷａｈｌらのＪ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、　２４： ３１６−３２５（１９８３月。本発明抗体のＦａｂおよびＦ　（ａｂ’　）＊お よび他のフラグメントは無傷抗体と同様に、本発明の方法に従って結腸腺癌の検 出および処置に使用できることは理解されよう。このようなフラグメントは通常 、タンパク質分解的開裂によって生成され、例えばパパインによりＦａｂフラグ メントが、ペプシンによりＦ（ａｂ’）ｔフラグメントが得られる。また、ハプ テン結合性フラグメントは組換えＤＮＡ技法を適用し、または化学合成によって 製造することもできる。

モノクローナル抗体はハイブリドーマ技法を用いて調製される［コＩ　ｉｎｇら 、　Ｉｎ：　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　＾ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ−Ｃｅ ｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、ｘルセビ乙　ニューヨーク、　５６３−６８１（ １９８１）］。一般には、このような操作は、動物を不活性な精製トキシンＢで 免疫することを包含する。

このような動物の肺細胞を抽出し、適当な骨髄腫セルラインと融合する。本発明 では、適当なあらゆる骨髄腫セルラインを使用することができる。しかし、アメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクシコン［ロックビル、メリーラントコから 入手できる親骨髄腫セルライン（ＳＰ、Ｏ）を使用するのが好ましい。融合した 後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地中で選択的に維持させ、次いでワ ンズ［Ｗａｎｄｓ、　Ｊ、　Ｒ，］らのＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　８ ０：２２５−２３２（１９８１）に記載されているようにして限界希釈によりク ローンする［これを引用によって本明細書に包含させる］。次に、この選択によ り得られたハイブリドーマ細胞を検定し、トキシンＢに特異的な抗体を分泌する クローンを同定する。好ましいハイブリドーマセルラインは５Ａ８および５Ａ２ である。

上記の方法を適用すれば、トキシンＢに特異的な抗体を産生できる別のセルライ ンをさらに得ることが可能である。

また、別の抗体は、抗−イディオタイプ抗体を使用する２段階操作で調製するこ とができる。このような方法では、抗体自身がハプテンであり、従って第２の抗 体と結合する抗体を得ることが可能であるという事実に基づいている。この方法 では、トキシンＢと結合できる抗体を使用し、動物を免疫する。次いで、その動 物の肺細胞を使用してハイブリドーマ細胞を１１２し、得られたハイブリドーマ 細胞をスクリーニングにかけ、トキシンＢに対する抗体と結合できる抗体を産生 じているクローンを同定する。このような抗体は抗−イディオタイプ抗体からな るものである。この抗体を使用して動物を免疫することができ、そうすれば、抗 −トキシンＢ抗体の生成を誘発することができる。さらに、抗−イディオタイプ 抗体により、動物の免疫応答を誘導し、または増大させる方法が提供される。

本発明の抗体（またはそのフラグメント）は液相で利用でき、または固相担体に 結合できるので、免疫検定に使用するのに特に適している。

抗体またはそのフラグメントは、種々の標識物を使用し、また種々の標識化方法 によって標識化することができる。本発明に使用できる標識物のタイプを例示す れば、酵素標識物、放射性同位元素標識物、非放射活性同位元素標識物、蛍光標 識物、毒素標識物、および化学ルミネッセンス（化学発光）標識物などがあるが 、これらに限定されない。

適当な酵素標識物としては例えば、リンゴ酸ヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレ アーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコール脱水素酵素、 α−グリセリンリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、パーオキシ ダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ 、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコ ース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ などがある。

適当な放射性同位元素標識物としては、１１）（，１１８１１…■、ＩＰ、　” Ｓ、”Ｃ，”Ｃｒ、”Ｔｏ、”Ｃ□、’嘗Ｆｅ、）ＳＳ、、１ｓＩＥｕ、・ＯＹ 、・フ（：、　ｕ、　！１７０ＨＳｔ重ＩＡｊ、１１！ｐｄ、４’ｌｓｃおよび Ｉ（ｌＩＰｄなどがある。

適当な蛍光標識物としては、′Ｓ″Ｅｕ標識物、フルオレセイン標識物、インチ オシアネート標識物、ローダミン標識物、フィコエリスリン標識物、フィコシア ニン標識物、アロフィコシアニン標識物、０−フラールアルデヒド（ｏ−ｐｈｔ ｈａｌｄｅｈｙｄｅ）標識物、フルオレスカミン標識物などがある。

適当な毒素標識物としては、ジフテリア毒、リチン（ｒｉｃｆｎ）およびコレラ 毒がある。化学ルミネッセンス標識物としては、ルミナール標識物、インルミナ ール標識物、芳香族アクリジニウムエステル標識物、イミダゾール標識物、アク リジニウム塩標識物、シュウ酸エステル標識物、ルシフェリン標識物、ルシフェ ラーゼｗ識ｍ、アエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）標識物などがある。

当業者であれば、本発明に使用できる他の適当な標識物が分かるであろう。これ らの標識物と抗体またはそのフラグメントとの結合は当業者が普通知っている常 法によって行うことができる。通常の方法は、Ｋｅｎｎｅｄｙ、　Ｊ、　Ｈ，ら のＣｌ１ｎ、ＣｈｉｔＡｃｔａ　７０：ｌ−３１（１９７６）、および５ｃｈｕ ｒｓ、　Ａ、　Ｈ，Ｔ、　ｋｌ、らのＣＩ　ｉｎ、　ＣｈｉＩｌ、　Ａｃｔａ　 ８１　：１−４０（１９７７）に記載されている。後者で言及しているカップリ ング法はグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、シマレイミド法、園−マレイミ ド−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法であり、これらを引 用によって本明細書に包含させる。

本発明の抗体くまたは抗体のフラグメント）の検出性は、担体を使用することに よって向上させることができる。周知の担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリ プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および 修飾セルロース、ポリアクリルアミド類、アガロース類ならびに磁鉄鉱（マグネ タイト）などがある。本発明の目的では、担体の性質はある程度可溶性であって も、不溶性であってもよい。当業者ならば、モノクローナル抗体を結合させるた めの他の多くの適当な担体を知っており、あるいは通常の実験によってそれらを 突き止めることができる。

本発明の抗体または抗体フラグメントを使用すれば、ト牛シンＢ抗原の存在を定 量的または定性的に検出することができる。このような検出は、種々の免疫検定 法のいずれを使用しても行うことができる。例えば、抗体または抗体フラグメン トを放射活性的に標識するすれば、ラジオイムノアッセイにより５Ｆ−２５抗原 を検出することができる。ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）についての良好な 説明は、ｆｏｒｋ、　Ｔ、　Ｓ、らの１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕ ｅ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏ ｇｙ　［Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ 、ＮＹ（１９７ｇ）コに見いだすことができ、特にＧｈａｒｄ、　Ｔ、による標 題「ラジオイムノアッセイおよび関連技法への導入（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｕ＋ｕｎｅ−＾５ｓａｙａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓ月の章を参考のために挙げておく（これらを引用によって本明細 書に包含させる）。

本発明の結合性分子はさらに、１２点部位」または「サンドウインチＪアッセイ としても知られている免疫測定検定（ｉｓｓｕｎｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓ５ａｙ） に利用するよう適合化することもできる。代表的な免疫測定検定法では、ある量 の非標識化抗体（または抗体のフラグメント）を、試験する液中で溶解しない固 相支持体（即ち、血液、リンパ、液化糞便、組織ホモジネートなど）に結合させ 、固相抗体、抗原および標識化抗体から形成される３成分複合体が検出および／ または定量できるような標識物を担う可溶性抗体の所要量を加える。

通常の免疫測定検定には、固相に結合した抗体をまず試験する試料と接触させ、 固相抗体−抗原の２成分複合体を形成させることにより試料から抗原を抽出する 、フォワード（前進）検定がある。適当なインキュベ−１・時間の後、固相支持 体を洗浄して未反応の抗原を含有し得る液状試料の残余を除去し、次いで未知量 の標識化抗体を含有する溶液と接触させる。標識化抗体が固相支持体に結合した 抗原と非標識化抗体を介して複合化するよう２回目のインキュベートを行った後 、その固相支持体に２度目の洗浄を行い未反応の標識化抗体を除去する。このフ ォワードサンドウィッチ検定のタイプは、抗原が存在するか否かを決定するため の単純な「イエス／ノー」検定であり得、または標識化抗体の測定値を既知量の 抗原を含有する標準試料から得られる測定値と比較することにより、定量が可能 な検定法である。これら「２点部位」または「サンドウィッチ検定法は、Ｋｉｒ ｋｈａｍ　ａｎｄ　Ｈｕｎｔｅｒ＋ε、　＆　Ｓ、　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、 　ｘディンバラ（１９７０）により編集されたＲａｄｉｏｉｉｓｕｎｅ　Ａｓ５ ａｙ　Ｍｅｔｈｏｄの１９９−２０６頁のＷｉｄｅに記載されている。

本発明の抗原についても有用であり得るもうひとつのタイプの「サンドウィッチ 」検定法では、いわゆる「同時Ｊおよび「逆」検定を使用する。同時検定法は、 固相結合抗体およびｖＡ識化抗体を共に試験試料に同時に加えるように、単一イ ンキュベート工程を包含するものである。インキュベートが終了した後、固相支 持体を洗浄し、液状試料の残余および複合化していない標識化抗体を除去する。

次いで、通常の「フォワード」サンドウィッチ検定法で行うように、固相支持体 に付随する標識化抗体の存在を確かめる。

逆検定では、まず標識化抗体の溶液を液状試料に徐々に添加し、次いで適当な時 間だけインキュベートした後、固相支持体に結合した非標識化抗体を添加する。

２回目のインキュベートを行った後、試験試料の残余および未反応の標識化抗体 溶液が無くなるよう常法により固相を洗浄する。次いで、固相支持体に付随する 標識化抗体を同時およびフォワード検定法のようにして測定する。

上記のように、抗原のための免疫測定検定法は、個々の結合性分子を「レポータ ー分子」で標識することが必要である。これらレポーター分子または上記の標識 物は普通のものであり、当業者に周知である。本発明を実施するには、酵素標識 物が好ましいものである。

考えられる免疫測定検定法のいずれにも標識物に使用できる酵素として、単一の 酵素を考えているのではない。そうではなく、個々の検定系に適した酵素はいず れかを決定しなければならない。酵素の決定に当たり重要な基準は、純粋酵素の 回転数（単位時間内において、酵素部位１個で産物に変換される基質分子の数） 、酵素調製物の純度、その産物の検出感度、酵素反応の検出の容易さおよび速度 、試験液中における妨害因子または酵素類似活性の不存在、酵素およびその候補 物質の安定性、酵素およびその候補物質の入手性および価格などである。本発明 の免疫測定検定法にとって好ましい標識物として使用される酵素の中には、ペル オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、 グルコースオキシダーゼ１、グリコアミラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素およびグル コース−６−リン酸脱水素酵素がある。ウレアーゼは、その活性を容易に肉眼で 認知できる発色性ｐＨ指示物質であるので、好ましい酵素の中でも特に好ましい 。

本明細書に使用している、診断試薬（例えば抗体、抗体フラグメントまたはハブ テン）の有効量とは、所望の診断的識別を可能にする量である。診断試験に通常 使用される物質の量は一般には、０゜０ｆ−１μｇであり、好ましくは０．１１ ８ｇである。

本発明は、腸炎を診断する方法を提供することに加え、さらに全腸炎を予防およ び処置するための手段をも提供するものである。１つの態様としては、 Ｃ，ディフィシレの毒素産生株１０４６３および非毒素産生株２０３７、ならび にＣ，ソルデリイ（ｓｏｒｄｅｌ　ｌ１ｉ）、Ｃ，パイファーメンタンス（Ｃ， ｂｉｒｅｒ＊ｅｎｔａｎｓ）、Ｃ５バーフリンジエンス（Ｃ，ｐｅｒｆ　ｉｎｇ ｅｎＳ）は、トーマス・ラモン博士（Ｄｒ、Ｔｈｏｇ＋ａｓ　ＬａＭｏｎｔ）［ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏ５ｐ＋ｔａ１．ボストン、　ＭＡＩから有り難く譲 り受けた。細胞を脳心臓注入ブロス（Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ　１ｎｆｕｓｉｏ ｎ　Ｂｒｏｔｈ）［５ｃｏＬｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、力−ソン、　ＣＡ ］中、３７℃で定常期に達するまで嫌気的に培養した。

毒素精製 細菌上清４００＊（ｌをＹＭ−３０膜［Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、＋　デンバー 、　ＭＡＩで２５倍に濃縮するか、または７０％硫酸アンモニウムを使用して沈 殿させた。次いで、得られた濃縮上清をセファクリル−３００［ファルマシアー ＬＫＢ、ビスカッタウェイ、Ｎ月の９０Ｘ２．５ｃｚカラムで分画化した。次に 、プールした毒素含有画分を、ウォーターズ６５０前進性タンパク質精製系（Ｗ ａｔｅｒｓ　６５０＾ｄｖａｎｃｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベッドフォード、　ＭＡＩに接続 した超微細ＤＥＡＥ−ＴＳＫカラム［Ｔｏｙｏ　５ｏｙａ＋日本］に適用した。

試料を５０ｍＭ　ト！ＪＸ−ｐＨ８，０に入れ、９０ｍＭ　トＩＪ　７．、ＩＭ Ｎａ（Ｊ！。

ｐＨ８，０で溶出した。すべての場合に、細胞毒性検定によってトキシンＢ豊富 なカラム画分を同定した。細胞毒性によって評価した回収効率は陰イオン交換後 で２０％であった。トキシンＡを５ｕｌｌｉｖａｎらの方法により精製した［サ リバン（ＳｕＩＩｉｖａｎ、　Ｎ、　Ｍ、　）のＩｎｆｅｃｔ、　Ｉｓｍｕｎ。

郵：ｌ０３２−１０４（＋（１９８２月。

トキシンＢを２つの方法により不活化した。０．５％ドデシル硫酸ナトリウム中 、１１００ｕ／１１（ｌ　トキシンＢを使用し、ＳＤＳ不活化ト牛シンＢを生成 させ、ｉｏｏ’ｃで９０秒間加熱した。ホルムアルデヒド不活化トキシンＢは、 １ｍｇ／ｚ（）キシンＢを０．４％ポルムアルデヒドとともに３７°Ｃで３６時 間インキュベートすることにより調製した。

動物の免疫およびハイブー月忙１セルラインのｆ−１５１５ボンドの雌性ニュー シーラント白ウサギ、Ｒ４６０にホルムアルデヒド不活化トキシンＢ（１００μ ｇ）を０日、２１日、４２日、６３日、９０日、１１７日および１４４４４日皮 肉注射した。最初の免疫はフロイントの完全アジュバント中で行い、以後のすべ ての注射はフロイントの不完全アジュバント中で行った。最後の免疫を行った後 のｔｉ！Ｉ後に血清を採取した。さらに２匹のウサギ、Ｒ４１５８およびＲ４５ ９を同一計画で、ホルムアルデヒド不活化粗製トキシンＢ２５０μｇを用いて免 疫した。粗製トキシンＢは、ＤＥＡＥクロマトグラフィーによって均−近くにま で精製していない物質である。

雌性ＲＢ　Ｆ／ＤｎＪマウスをジャクソン研究所（Ｂａｒ　）Ｉａｒｂｏｒ、　 ＭＥ）から入手した。Ｏ日日に、フロイントの完全アジュバント中ＳＤＳ不活化 トキシンＢ５μｇをマウスに皮肉投与して免疫し、１９日目にフロイントの不完 全アジュバント中ＳＤＳ不活化トキシンＢ５μｇを腹腔的投与し、３０日目にＳ ＤＳ不活化トキシンＢ５μｇを腹腔的投与し、４２日目にＳＤＳ不活化トキシン Ｂ２μｇを腹腔的投与し、５５日目に熱不活化トキシン８２μｇを静脈内投与し 、１２７２７日目不活化トキシン８１μｇを腹腔的投与し、１２８２８日目不活 化トキシンＢ１μｇを静脈内投与した。１３０３０日目リンパ節および＃臓から 誘導した細胞で融合を行った。

融合スクリーニング ＥＲＡフォーマットでトキシンＢを捕捉できる捕捉能についてハイブリドーマを スクリーニングした。手短に説明すれば、イムロン■平板（１＋＋＋ｎｕｌｏｎ 　［ｐｌａｔｅｓ）［Ｆｉｓｈｅｒ、ボストン、Ｍ＾１を水中、２．８μｇ　ｈ （ｌヤギ抗−マウスＩｇＧ（重鎮および軽鎖耳ベーリンガー・マンハイム・バイ オケミカルズ、インディアナポリス、ｌＮｌ１００μＱで被覆した。次いで、０ ．００５％グルタルアルデヒドｌｏｏμｅを加え、得られた平板を室温に一晩放 置した。次ぎに、その平板を、０．１％アジ化ナトリウムを含有する１０ｍＭ　 リン酸ナトリウムｐＨ７，２で１回洗浄した。次いで、アジドを含有するｌ０５ Ｍ　リン酸ナトリウム中、４％ウシ血清アルブミン２００μぐでその平板を一晩 ブａ７りした。プロ！りした平板にアジドを含有する１０層Ｍリン酸ナトリウム 中、２．５％シ：ｄｉ２００μｌを重層した。次いで、平板を風乾し、乾燥化ポ ーチ中、４℃で保存した。

５０膜Ｍ）リス−ＨＣＱ　ｐＨ７，６，５０％熱不活化子牛血清、０゜０５％Ｔ ｖｅｅｎ２０．０．０２％チメロサールおよび０．００１６％ゲンタマイシンで １：１０に希釈した組織培養上清１００μｅを室温で１時間、各ウェルに加えた 。次いで、得られた平板を０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０（２００μＱ）で５回洗 浄した。その平板を、ウシ胎仔血清希釈物中５００ｎｇ／ｚ（ｊ　トキシンＢと 共に室温で１時間インキュベートした。平板を０．０５％Ｔｖｅｅｎ２０で５回 洗浄し、次いで粗製のトキシンＢに対して生成させた抗血清にコンジユゲートさ せたＨＲＰ１００μＣを重層した。次いで、その平板を０．０５％Ｔ　ｗｅｅｎ ２０で５回以上洗浄し、ＴＭＢ／過酸化水素で呈色させた。

直接ＥＩＡ ９６ウエルのイムロン子平板を室温において一晩、Ｃ，デイフイシレ（ｄｉｆＴ ｉｃｉｌｅ）　１０４６３もしくは２０３７、Ｃ，ソルデワイ（６０ｒｄｅｌｌ ｉｉ）、Ｃ，パイファーメンタンス（Ｃ，ｂｉｆｅｒｗｅｎｔａｎｓ）、または Ｃ。

バーフリンジェンス（Ｃ，ｐｅｒｆ　ｉｎｇｅｎｓ）のいずれかの組織培養上清 １００μｇで被覆した。次いて、リン酸緩衝化食塩水中４％ウシ血清アルブミン 、０．１％アジ化ナトリウムｐＨ７，０で室温において一晩被覆した。次ぎに、 １：１０に希釈したハイブリドーマ組織培養上清１００μ（、またはＢＳＡ−Ｐ ＢＳでｌ　：　５０００１ｉ：希釈したウサギ血清１００μｇを各ウェルに加え 、室温で２時間インキュベートした。次いで、その平板をＰＢＳで５回洗浄し、 次いでヤギ抗−マウスＩｇ（重鎮および軽鎖）または抗−ウサギ（ＩｇＧ　Ｆ（ ａｂ’）ｇ）のいずれかでコンジユゲートしたＨＲＰのＢ　Ｓ　Ａ−Ｐ　Ｂ　Ｓ 中１　：　５０００希釈物１００μｅを１時間加えた。ＰＢ３２００μＣで５回 以上洗浄した後、上記のようにしてウェルを呈色させた。

種々の方法 アイソタイピング試薬（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔｓ）を５ｏｕｔｈ ｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ汀バーミ ンガム、　ＡＬ］から入手した。毒素含有試料をドデシル硫酸ナトリウムポリア クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。試料を電気泳動によ りニトロセルロースに移し、正味のハイブリドーマ組織培養上清またはＢＳＡ− ＰＢＳ中で１：１０００に希釈したボックローナル抗血清のいずれかを使用し、 免疫染色した。検出は、ヒト血清タンパク質とは最小限にしか交叉反応しない抗 −ウサギＩ　ｇＧ　Ｆ　（ａｂ’　）ｙまたはヤギ抗−マウスＩｇ（重鎮および 軽鎖）のいずれかでコンジュゲートしたＨＲＰを使用して行った［Ｐｅｌ　Ｆｒ ｅｅｚ、ロガース、　ＡＲコ。４−クロロ−１−ナフトールを使用し、特異的抗 体を呈色させた。細胞毒性検定は、Ｂａｒｔｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏ ｓｉｔｉｃｓ［ベルギー、ワシントン］から入手したヒト新生児***二倍体フィ ブロブラストで行った。抗−毒素血清によって阻害され得る細胞円が４８時間後 に生成したなら、その試料は細胞毒性が陽性であると判定した。

トキシンＢの精製は、濃縮、サイズ排除クロマトグラフィー、および陰イオン交 換クロマトグラフィーによって行った。濃縮後には実質的に細胞毒性の喪失は無 かった。第１Ａ図は、ゲルクロマトグラフィーによって濃縮した細菌上清の典型 的な画分を示している。

この場合、画分４４から６６をプールした。この工程は細胞毒性の回収効率が６ ０％であった。第１Ｂ図は、ＤＥＡＥカラムから５−３００に精製した材料の溶 出プロフィルを示している。画分６３から７５をプールした。ＤＥＡＥ精製ト精 製トキシン−マシーブルー染色したゲルはタンパク質が殆ど均質であることを示 したが、初期細胞毒性の１０％足らずしか回収されなかった。

ハイブリドーマ プレートした８８６個の融合ウェルのうち、５０２個が発育陽性であり、２１３ 個のウェルがトキシンＢ捕捉検定で反応する抗体を産生じた。６個のウェルをク ローンし、以後の分析のため拡張した。

同様の方法により、非常の低いバーセンテイジの特徴的なウェルが得られた。こ れらの融合物から得られたハイブリドーマは、ウェスターンプロットにおいて、 少ない低分子量の非トキシンＢ夾雑物と反応する抗体を頻繁に産生じた。

直接ＥＩＡ 直接ＥＩＡＩ織培養において、６つすべてのモノクローナル抗体由来の上清が、 精製トキシンＢおよび毒素産生性Ｃ，デイフイシレ（Ｃ，ｄｉＮｉｃｉｌｅ）株 １０４６３由来の上清の両者と強く反応したく第１表）。試験したモノクローナ ル抗体はいずれも、精製トキシンＡまたはＣ，ソルデリイ（ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ ）、Ｃ，パイファーメンタンス（Ｃ，ｂｉｆｅｒｉｅｎＬａｎｓ）、Ｃ，バーフ リンジエンス（Ｃ，ｐｅｒｆ　ｉｎｇｅｎｓ）または非毒素産生性Ｃ，ディフィ シレ株２０３７由来の上清とは反応しなかった。全く対照的に、ポリクローナル 抗血清はすべて、Ｃ，ソルデリイおよびパイファーメンタンスならびに非毒素産 生性Ｃ，デイフイシレ株２０３７と交叉反応した。交叉反応性の程度は様々であ り、抗原の純度に依存していた。ポリクローナル抗血清はトキシンＡまたはＣ， バーフリンジェンスのいずれとも反応しなかった。これらウサギ由来の免疫前血 清は、試験したいずれの抗原とも反応しなかった。

Ｃ，ディフィシレ毒素のウェスターンプロット分析Ｒ４６０、Ｒ４５９、Ｒ４５ ８，５Ｃ８，５Ａ２、ＦＤ８．５Ａ８、ＩＤ５およびＩＧ６を用い、Ｓ−３００ 精製したトキシンＢを５ＤＳ−ＰＡＧＥでウェスターンプロット分析した。抗血 清を１：１０００に希釈し、モノクローナル抗体は組織培養上清として使用した 。すべてのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗血清は、毒素産生性Ｃ， ディフィシレ株１０４６３由来の濃縮上清および精製トキシンＢ（結果は示して いない）の同一バンドと反応した。ポリクローナル抗血清はさらに、約１００ｋ Ｄａの三重バンドの少量の組みを伴った４０および５５ｋＤａの主要なバンドを も認識した。

トキシンＢ特異的なモノクローナル抗体のすべてはさらに、Ｃ。

ディフィシレの濃縮細胞培養上清中に存在する５０ｋＤａのタン／ｆり質の種々 の量を検出した。トリプシン処理した後、Ｃ，ソルデリイおよびトキシンＢのウ ェスターンプロットを行った。Ｃ，デイフイシレ１０’４６３またはＣ，ソルデ リイいずれかの細胞培養上清を７０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、０．ＩＭ　 Ｆリス、ｐ）（８，０中に再懸濁し、２０１１１Ｍトリス−ＨＣ（ｌ　ｐｉ（８ ，０で前もって平衡化させておいたセファデックスＧ−２５カラムで脱塩した。

未消化のＣ。

ディフィシレまたはＣ，ソルデリイのタンパク質を比較した。細菌タンパク質に 対してトリプシン酵素の重量比１：５０でトリプシンを使用し、Ｃ，ディフィシ レまたはＣ、ソルデリイのタンパク質を３７°Ｃで３０分間消化した（結果は示 していない）。この物質は非常に抗原性があるが、高分子量トキシンＢよりも実 質的に毒性が低く（第１Ａ図）、Ｓ　−３００クロマトグラフイーにより除去す ることができた。免疫反応バンド（６０および２５０ｋＤａ）の同様の組みが、 モノクローナル抗体５Ａ２（示さず）および５０８を使用してＣ，ソルデリイの 濃縮細胞培養上清中に認められた。他のモノクローナル抗体はウェスターンプロ ットではＣ８ソルデリイと全く反応しなかった。すべての免疫反応バンドはトリ プシン感受性であったが、同一の分解産物を産生じなかった。Ｃ，デイフイシレ のトキシンＢにおける最も小さな分子量の免疫反応性トリプシンフラグメントは ５０ｋＤａであるが、Ｃ、デイフイシレの最も小さな分子量のトリブシンフラグ メントは７９ｋＤａであった。

く交叉反応するトキシンＡ特異的なモノクローナル抗体の１つが示されているが 、６つのトキシンＢ特異的モノクローナル抗体はいずれもトキシン八とは交叉反 応しなかった。さらに、本明細書に記載のようにして精製したトキシンＢに対し て惹起させたウサギポリクローナル抗血清は、純粋なトキシンＡとは反応しなか った。このことは、当然ながら、これら２つの毒素に保存ドメインが存在するこ とを排除するものでなく、これらドメインは免疫学的に主要なものでないことを 示唆するものである。

この態様ではトキシンＢ特異的ハイブリドーマがより高い頻度で認められるにも 拘わらず、従来の試みは成功を収めるに至っていない。トキシンＢの細胞毒性作 用は、不活化を完全におこなうのに本明細書に記載の最高の操作が必要であった 。この警戒にも拘わらず、マウスは一般に免疫した後、病気に陥った。このこと は、この融合スクリーニング工程に使用した天然抗原を認識する抗体を刺激Ｂ細 胞が類型には産生じないほどに、トキシンＢの変性が雑であったからと説明する ことができよう。さらに、直接トキシンロスクリーニング検定において陽性と評 価された多くのウェルが後に、免疫原を汚染する熱安定な少量のタンパク質と反 応することが判明した。おそらくは、トキシンＢに対するウサギ抗血清を使用し て行うトキシンＢのウェスターンプロットにおいて優勢である同じタンパク質が 存在するのであろう。

Ｃ，ソルデリイの致死的毒素に対する抗血清はトキシンＢとは交叉反応するが、 Ｃ，ディフィシレのトキシンＡとは交叉反応しないことが報告されている［Ｐｏ ｐｏｆｆＪ、Ｒ，＋　ＩｎｆｅｃＬ、Ｉｍｍｕｎ、　５５：３５−４３（１９８ ７）コ。Ｃ，ソルデリイ毒素に対する抗血清はＣ，ディフィシレの細胞毒性を中 和することが既に示されている［Ｃｈａｎｇ、　Ｔ、　Ｙ、らのＩｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、　２２：４１ｇ−４２２（１９７８月。６つのモノクローナル抗体 はいずれも、Ｃ，ソルデリイの細胞培養上清を使用する直接ＥＩＡでは反応しな かった。２つのモノクローナル抗体、５Ｃ８および５Ａ２は、Ｃ１゛ソルデリイ の濃縮細胞培養上清のウェスターンプロットでは高分子量タンパク質を検出した 。このタンパク質様トキシンＢはトリプシン感受性であるが、同じ分子量を有す る免疫反応性フラグメントを産生じなかった。モノクローナル抗体はいずれも直 接ＥＩＡではこの抗原を検出しなかった。おそらくは、発現レベルまたはプラス チックを岐覆する被覆能の相違が、モノクローナル抗体のＣ，ンルデリイとの直 接ＥＩＡにおける反応性の欠如に寄与していると考えられる。また、これらモノ クローナル抗体によって認識されるエピトープが変性Ｃ，ソルデリイ毒素にしか 暴露していないことも有り得る。

本発明のトキシンＢに特異的なウサギ抗血清は、直接ＥＩＡではＣ。

ソルデリイおよびＣ，パイファーメンタンスと反応するが、Ｃ，バーフリンジェ ンスとは反応しない。この反応性はトキシンＢの保存されたエピトープに由来す るものと考えられるが、細胞培養上清中の他の抗原もこの観察された反応性の原 因と言い得る。これは、Ｃ。

ディフィシレの非毒素産生株とウサギ抗血清との直接ＥＩＡにおける反応性が強 いことから支持される。

トキシンＢ特異的ポリクローナル抗血清での結果は、従来報告されたものと同様 である。クーマシー染色ゲルで認められる痕跡量の夾雑は、ウェスターンプロッ トにおいて、毒素産生性Ｃ，ディフィシレの濃縮上清に対する抗血清の反応性の 優位を占めている。従って、この夾雑は免疫原性が高いか、または熱および洗浄 剤変性に対して比較的耐性であることを示している。本明細書に記載のモノクロ ーナル抗体はいずれもこれらのバンドと反応しないので、低分子量フラグメント は高分子量トキシンＢのサブユニットであるか、またはその分解産物ではないよ うである。毒素以外の抗原との高いレベルの反応性および比較的低い毒素特異的 力価は、信頼のおけるＣ。

ディフィシレ診断の発展の妨げとなる。

予備的な証拠は、これらモノクローナル抗体がＣ，ディフィシレ関連疾患の患者 の糞便中にトキシンＢを検出するのに有用であることを示している。

本明細書に記載のすべての文献および特許出願は、本発明の関連する技術分野に おける当業者のレベルを示している。すべての文献および特許出願は、個々の文 献および特許出願が具体的に記載、および引用によって包含させるよう個々に記 載しているのと同程度に、引用によって本明細書に包含されるものである。

本発明の理解をある程度助けるために、上記のように説明および実施例を記載し たが、以下の請求の範囲内においである種の変更および改変が可能であることは 明らかである。

□情報 セルライン５Ａ８および５　Ａ、　２は１９９０年５月１１日にアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクシコン［メリーランド、口・ツクビル］に寄託され、 それぞれＨＢ１０４５４およびＨＢ１０４５５が付されている。

微生物 （寄託機関の名称） アメリカン◆タイプ・カルチャー中コレクション（寄託機関の住所） アメリカ合衆国２０８５２メリーランドロツクビル、パークローン・ドライブ１ ２３０１番（寄託臼）　（受託番号） １９９０年　５月１１日　ＨＢ１０４５４（追加表示） マウスハイブリドーマ、Ｆ１ａ−５Ａ２．Ｃ５，５欧州特許がめられている指定 国に関しては、欧州特許の付与の告示が公表されるまで、または出願が拒絶され もしくは取り下げられ、または取り下げられたとみなされる日まで、寄託された 微生物の試料は、その試料を要求する人により指定された専門家に対して前記の 試料を支給する場合にのみ利用可能である（規則２８（４）ＥＰＯ）。

微生物 （寄託機関の名称） アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（寄託機関の住所） アメリカ合衆国２０８５２メリーランドロツクビル、ハークローン・ドライブ１ ２３０１１（寄託臼）　（受託番号） １９９０年　５月１１日　ＨＢ１０４５５（追加表示） マウス　ハイブリドーマ、Ｆ１ａ−５Ａ８．５欧州特許がめられている指定国に 関しては、欧州特許の付与の告示が公表されるまで、または出願が拒絶されもし くは取り下げられ、または取り下げられたとみなされる日まで、寄託された微生 物の試料は、その試料を要求する人により指定された専門家に対して前記の試料 を支給する場合にのみ利用可能である（規則２８（４）ＥＰＯ）。

時光度　２８０　ｎｍ （□） ＮＯＣＬ　、ＬＩＶ鷹ｉ 糸田ｎｅｔ壽−’ｆｒカイｅｌ）　（１０ｇ）ロムし　Ｌ　／ｌ　２８０ｎｍ （□） 要約書 フロストリ／ラム・ディフィシレのトキシンＢに特異的なモノクローナル抗体を 提供するものである。さらに、該抗体を調製し、使用するための方法、特にＣ， ディフィ／しの検出のための該抗体の使用を提供するものである。

国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡと交叉反応しない、クロスト リジウム・ディフィシレのトキシンＢに特異的なモノクローナル抗体。
2. ２．５Ｃ８、５Ａ２、ＦＤ８、５Ａ８、ＩＤ５およびＩＧ６の中から選ばれるハ イブリドーマから産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. ３．クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡと交叉反応しない、クロスト リジウム・ディフィシレのトキシンＢに特異的なモノクローナル抗体を産生する ハイブリドーマ。
4. ４．５Ｃ８、５Ａ２、ＦＤ８、５Ａ８、ＩＤ５およびＩＧ６の中から選ばれる請 求項３に記載のハイブリドーマ。
5. ５．試料をトキシンＢに特異的な抗体と接触させ、該抗体の存在を検出すること を特徴とする、試料中のトキシンＢの存在を検出するための方法。
6. ６．抗体が標識されている請求項５に記載の方法。
7. ７．抗体が固相支持体と結合している請求項５に記載の方法。
8. ８．試料が生物学的試料である請求項５に記載の方法。
9. ９．試料が糞便試料である請求項８に記載の方法。