JPH0543596A - 扁平上皮がん状物質およびその分離方法 - Google Patents
扁平上皮がん状物質およびその分離方法Info
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Abstract
尿から扁平上皮がん状物質を分離する方法を提供する。 【構成】 ヒト女性尿から分離された偏平上皮がん状物
質、その抗体、イムノアッセイ法により適切なヒト尿サ
ンプルを選択し、当該尿から扁平上皮がん状物質をカラ
ムクロマトグラフイーで分離する各工程を含む分離方法
及びヒト女性尿からの偏平上皮がん状物質を含有する分
析対照物質を含む診断キット。
Description
離および使用に関する。扁平上皮がん状(SCC状)免
疫反応性抗原がヒト女性尿中に認められた。この物質は
腫瘍抗原4(TA−4)のサブフラクションである扁平
上皮がん関連抗原(SCC)と同じあるまいをし、これ
と極めて類似した組成を有する。本発明はまた、前記S
CC状物質の分離および使用に関する。
腫瘍抗原(以下TA−4またはそのサブフラクションS
CCと称する)の診断価値についての文献は数多くあ
る。
よびTA−4は、扁平上皮がんそのものから、あるいは
扁平上皮がんから誘導されたがん細胞株から、あるいは
扁平上皮がんの患者の血清から抽出される。これらの物
質を使用するには固有の困難性がある。すなわち、実際
のがん組織を取扱うこと並びに血清または細胞株に見ら
れる低濃度のTA−4を取扱うことの困難性および障害
である。従って、これら抗原の現在におけるソースを取
扱う際の困難性は、これらの物質の生産およびSCC抗
原並びにTA−4(例えば対照物質)を利用する生成物
の生産を極めて困難かつ高価なものにしている。
m. 1989 年,1079ページ)で、精漿および羊水中にもS
CC状物質を確認している。血清中に見られるものより
高濃度で存在するとはいえ、これらの液を得ることの困
難性は商業的なソースとして実用性のないものにしてい
る。
の認定に関する。この物質は尿中において正常なヒト血
清中よりずっと大きいレベルで存在し、他のヒト関連物
質を取扱うことの困難性を伴わずに分離できる。SCC
状物質の尿中における認定は、従来の物質および方法よ
りずっと安価に生産でき、従来の物質と同じ程有用であ
る物質の分離を可能にした。
CC状物質の分離および使用の技術をも提供するもので
ある。
疫反応性抗原、すなわち、扁平上皮がん関連抗原(SC
C)と同じ振るまいをし、かつ、分子量および等電点の
決定により認められる限りにおいて扁平上皮がん関連抗
原と類似する組成を有することがわかった物質の新規な
ソースの認定に関し、さらにSCC型物質の分離および
使用に関する。
SCC物質の存在が決定される。尿を分析するには競合
イムノアッセイを利用した既知のラジオイムノアッセイ
技術が用いられる( Product SCC-RIA, カタログ番号13
76-22 ,Abbott Laboratories, Diagnostics Div. 販
売)。このアッセイにおいて、放射線同位体で標準化さ
れたSCCと尿サンプルとが市販のキットにより与えら
れた抗体に関して競合する。SCC状物質が、ヒト女性
尿中において、ヒト血清中あるいはヒト男性尿中よりず
っと高いレベルで存在することを発見した。ヒト女性尿
中のSCC状物質のレベルは約40ng/mlから500 ng/ml
付近までの範囲であり、正常ヒト血清中のそれは2.5 ng
/ml未満である。ヒト血清中において、上記2.5 ng/ml
のレベルはがん状態に関連する(Kato等,50 Cancer 19
82年,1294ページ参照)。男性尿中のSCC状物質のレ
ベルは低い(例えば約3ng/ml以下)。競合イムノアッ
セイが尿中に物質を検定したという事実は、その物質が
免疫学的特性において本物のSCC抗原に類似する(全
く同一でない場合でも)ことを示す。
に、いくつかの既知の技術(すなわちゲル濾過およびイ
オン交換技術)を利用してAbbottイムノアッセイキット
における対照物質との比較を行った。その結果は、ヒト
女性尿から得られたSCC状物質ががん組織から抽出し
た本物のSCC物質と同じであることを示した。このよ
うにして、上記技術を用いて、ヒト女性尿から得られた
SCC状物質が本物のSCC物質と物理的に同じであ
り、かつイムノアッセイ技術において同じように振るま
うことがわかった。
る作業を行った。高レベルのSCC状物質を含有するサ
ンプルを認定した後、これらのサンプルを濃縮し、凍結
乾燥した。
らのSCCを他の研究所で使用する種々の用途、すなわ
ち、ヒト血清中のSCC抗原の定量測定および定性測定
のための臨床検定用対照に使用できる物質を開発するよ
うな種々の用途に利用される。
使用に関する本発明の最良態様を構成する。しかしなが
ら、SCC状物質は、ラジオイムノアッセイ、ELIS
Aおよび他の分析技術を含むあらゆる分析工程において
本物のSCCを代替できる。例えば、抗原測定のため、
ほとんどのイムノアッセイは標識化抗原または標識化抗
体を利用する。SCC状物質または抗体は、種々の既知
の方法を用いて標識化できる。これらの方法には、例え
ば、放射性同位体標識、酵素標識、蛍光標識、ケミルミ
ネセント標識または物質を免疫化学的分析技術に有用な
ものとするその他の標識を加えることが含まれる。これ
らはイムノアッセイ中の識別グループとして使用する。
既知の濃度の所望の抗原を含む基準物質または較正物質
も通常必要である。ヒト女性尿中からのSCC状物質ま
たはそれから産生される抗体は上記成分の安価なソース
を提供する。また、本発明は、現在本物のSCCが使用
できる他の分析技術にもヒト女性尿を濃縮あるいは濃縮
せずに利用できるようにする。
抗原として使用できるSCC状物質を提供する。SCC
状物質に対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体またはその他の抗体が作られる。抗体(ポリクローナ
ルまたはモノクローナル)の産生技術は公知である。ポ
リクローナル抗体産生については、ヒトSCC状物質を
所望の動物(通常ウサギ)に注入して免疫反応を生じさ
せ、次にこの動物の血清をSCCの抗体のソースとして
使用する。動物がSCCに特異的な抗体のみを産生し、
外来タンパクに特異的な抗体は産生しないようにするた
めに、免疫原として使用するのに大量の精製SCCを用
いることは特に有益である。モノクローナル抗体の産生
については、ヒトSCC状物質を所望の系統のマウス
(あるいは技術が確立されていれば他の動物)に注入
し、永久抗体分泌細胞株を産生させ、これらの細胞株を
SCC再認のためスクリーニングする。ここでも大量の
精製SCCを用いることによってスクリーニング時間が
短縮されると共にSCCに特異的な抗体を分泌する細胞
株を得る機会が大幅に増大される。
他)産生の分野において、抗体産生の技術は公知であ
る。例えば、Koehler, G. およびC. Milstein, 256 Nat
ure (1975年),495 ページ;そして Davis,
B., R. Dulbecco, H. Eise
n, H. Ginsbergおよび W. Woo
d, Principles of Microbio
logy and Immunology ,2巻,Ha
rper& Row, New York, 1973年を参照のこと。
体を固体支持体上に固定する。例えばアガロース樹脂
(セファローズ(Sepharose) 等)、ガラスビーズ等の種
々の支持体が使用できる。固定されたSCCの抗体は、
粗ソースから純粋なSCCを得るための迅速で有効な純
化手段として作用する。同様にして純粋な抗体が固定さ
れたSCC状物質を用いて得られる。これらイムノアフ
ィニティークロマトグラフィー法は既知である。上記工
程は固定リガンドがどのように使用され得るかの例を示
しているが、その有用性を制限するものではない。例え
ば、固定SCC抗体はSCCを含まない血清を得るため
のストリッピング剤(stripping agent) として使用でき
る。
に説明する。なお、本発明はそれらの実施例に限定され
るものではないことは言うまでもない。
ち、5名の妊婦、6名の妊娠していない女性、および7
名の男性である。妊娠していない群をさらに女性ノンス
モーカー2名、女性スモーカー3名、男性ノンスモーカ
ー4名、男性スモーカー3名、そしてホルモン平衡失調
が報告されている妊娠していない女性3名に再分した。
100 −1000mlのサンプルを採集した。
残し、残りを捨てた。
gnostics Div. から購入したラジオイムノアッセイ(Pro
duct SCC-RIA,カタログ番号1376-22)を用いて扁平上皮
がん抗原の有無について検定した。これは、一定量のI
125 標識化扁平上皮がん抗原が扁平上皮がん抗原抗体に
対して非標識化抗原と競合する競合検定である。一次抗
原抗体複合体のみを沈殿させる第2の抗体によって遊離
した抗原が抗体に結合した抗原から分離される。製造者
の指示に正確に従った。
血清(ウサギ)、第2の抗体(ヤギ)、SCC標準液
(ヒト)0ng/ml,SCC標準液(ヒト)1.5 ,5,1
5,50および150 ng/ml、そして使用指示を含んでい
た。
を割当てられたチューブにピペット取りした。200 マイ
クロリッターのSCCI125 試薬を次に全てのチューブ
にピペット取りした。100 マイクロリッターのSCC抗
血清(ウサギ)を各チューブにピペット取りした。これ
らのチューブをボルテックスし(vortex)、ふたをし、そ
して室温で20−30時間インキュベートした。20−30時間
後、0.5ml の第2の抗体(ヤギ)を各チューブに加え
た。これらのチューブをボルテックスし、次に室温で10
−30分間インキュベートした。これらチューブを20分
間、1000−2500×gで遠心分離した。遠心分離後、チュ
ーブを直ちにデカントし、ペレットを確保した。次にチ
ューブを適切な井戸型ガンマシンチレーションカウンタ
ーで読んだ。
表1に示す。表1は、いくつかの結論を示唆するもので
ある。まず第1に、SCCはヒト女性尿中に高レベルで
存在することが示されている。ヒト血清の正常限界は2.
5 ng/mlに設定されており、2.5 ng/mlを超える値はが
ん状態に関連しているものである。喫煙者の女性は非喫
煙者の約2倍のレベルの尿中SCCを有する。妊娠は、
尿過SCCレベルを実質的に増加させないようである。
しかしながら、このことは、妊娠期間中に尿中SCCレ
ベルが変化するのを否定するものではない。そのような
ことは、まれな所見ではないだろう。そのよい例は、妊
娠中にレベル激的に上下するヒト絨毛性ゴナドトロピン
である。非妊娠女性のホルモン平衡失調は尿中のSCC
レベルを実質的に上げることが示されている。正常男性
尿は高レベルのSCCを有さないことも示されている。
しかしながら、正常男性尿中の高レベルSCCの可能性
は、本実施例のような小さいサンプル集団からの結果か
らでは完全には否定しきれない。正常男性の喫煙は尿中
のSCCレベルを上げないことが示されている。本実施
例の実験から得られた結果および結論は、種々の追加的
な可能性を否定するものではない。それらの可能性に
は、次のものが含まれる(これ以外にもあると思われる
が):すなわち、ヒト女性尿中のSCCレベルは月経周
期に依存するかもしれず、尿中SCCレベルはがん状態
または前がん状態を示す(非観血的テスト法を可能にす
る)かもしれず、そして尿中SCCレベルはホルモン平
衡失調にあることを示すかもしれない。
法である。
マトリックスの網目内に入り込み、よって流れ速度が遅
れるが一方、大きいタンパク質は流れを妨げられずに通
過することに基づく。
2.5 ×22.5cmカラムを0.05Mリン酸カリウム pH7.0で平
衡させた。SCC抗原に近い分子量を有することからブ
タ膵臓アミラーゼ(分子量45,000ダルトン)をカラムを
目盛定めするのに使用した。扁平上皮がん組織から分離
したSCCの分子量は、48,000ダルトンであることが報
告されている(Kato & Torigoe, 1977年)。カラムは室
温で動作され、分別サイズは120 ドロップであった。実
験は、少なくとも2度行った。ブタ膵臓アミラーゼ活動
性のピークは常に16番チューブにおいて見られた。ヒト
女性尿からのSCCの活動性、およびアボット社の本物
のSCCサンプルの活動性のピークは、常に14番チュー
ブにおいて見られた。これらの結果は、ヒト女性尿から
のSCCが、本物のSCCに非常に近いあるいはそれと
同じ分子量を有することを示している。分子量比較は、
タンパク質間の同一性決定にしばしば使用される。例え
ば、Hussa 等(1986年)は、分子量を用いて、子宮頸が
ん組織から得られるSCCとCaSKi子宮頸がん細胞
株から得られるSCCとの間の同一性を示した。このよ
うに、実施例4の実験は、ヒト女性尿からのSCCが扁
平上皮がん組織から分離されたタンパク質と同じタンパ
ク質であることを示している。
他の特性として、等電点がある。等電点泳動技術にとっ
て十分な量が利用できる時にのみ、正確な値が得られ
る。しかしながら、イオン交換クロマトグラフィーによ
って近い推定値が得られる。タンパク質はその等電点よ
り上のpHにおいてアニオン交換体に結合する傾向があ
り、等電点より下のpHにおいては結合する傾向にない。
を、室温で、pH6.5 において、Whatman QA−52アニオ
ン交換体と共に(交換体1g/1ml 濃縮尿)ゆっくりかく
はんした。そのアニオン交換体を重力濾過によって尿か
ら分離し、その上澄に対して実施例2のようにしてSC
Cの検定を行った。検定結果は、上澄がSCC活動性の
ないものであることを示した。10倍濃縮したヒト女性尿
を、室温で、pH5.9 において、Whatman QA−52アニオ
ン交換体と共に(交換体1g/1ml 濃縮尿)ゆっくりかく
はんした。そのアニオン交換体を重力濾過によって尿か
ら分離し、その上澄に対して実施例2のようにしてSC
Cの検定を行った。検定結果は、上澄におけるSCCの
量的回復を示した。上記実験結果は、ヒト女性尿SCC
の等電点が5.9 −6.5 の範囲にあることを示している。
このことは、扁平上皮がん組織からのSCCに関する報
告された値5.9 −6.2 および6.3 −6.6 (Kato等,1984
年)と極めてよく一致する。このように、本実施例はさ
らに、ヒト女性尿からのSCCが扁平上皮がん組織から
分離されたものと同じタンパク質であることを示してい
る。
る。
た。使用の用意ができると、所望の重量に相当する尿が
溶かされた。各容器は満足すべき物性を有しているか検
査した。全ての設備は清浄さを検査され、必要に応じて
最終濾過の設備を蒸気清浄した。SCCラジオイムノア
ッセイを実施例2のように行った。80ng/mlより大きい
値を示したサンプルのみを許容した。次に尿をプール
し、少なくとも0.8 ミクロン補捉のフィルターを用いて
濾過した。濾過助剤として0.5 −1.0 % (w/v)セライト
を用いた。次にその炉液を、濃縮装置(Amicon Stirred
Cell Model 8400,YM10膜使用)を用いて約2,000.00ng
/mlに濃縮した。この時、10,000ダルトン未満の分子量
成分をカットオフした。次にこの濃縮物を、10×10-3M
リン酸カリウム緩衝液 pH6.9(100 倍)に対して一晩
(5℃)透析した。次にこの透析液を0.45ミクロンフィ
ルターを通して蒸気清浄したタンク内に向って濾過し、
清浄ボルトに所望のレベルまでつめた。生成物は−20℃
で冷凍保存するか実施例7に従って凍結乾燥した。
C36F40)を凍結乾燥工程に用いた。サンプルを充填す
る前に保存温度を−29℃の最低温度まで下げた。次に生
成物を充填し、全ての生成物温度が−29℃以下になった
後保存温度を5℃に設定した。全ての生成物の温度が−
1℃に達するまで保存温度を5℃に保った。次に温度を
16℃に上げ、全ての生成物の温度が10℃に達するまでこ
の16℃を保った。全ての生成物の温度が10℃に達したと
ころで保存温度を27℃に上げ、全ての生成物の温度が21
℃に達するまでこの27℃を保った。次に保存温度を43℃
に上げ、全ての生成物の温度が38℃に達するまでこの43
℃を保った。全ての生成物の温度が38℃に達したところ
でさらなる12時間を要した。乾燥サイクルが完了した
後、乾燥機を開け、生成物を取り出した。
例である。
濃縮段階を通して従った。得られた濃縮物を、SCCに
近い分子量を有するブタ膵臓アミラーゼ(製造番号A62
55,シグマケミカル社)を用いて予め目盛決めしたSeph
adex G-150選別カラム(濃縮尿1ml当り約70ml Sepha
dex )に充填した。この予備目盛決めに基づいて、チュ
ーブを集め、実施例2で用いたラジオイムノアッセイを
用いてSCC活動性を検定した。
した。このプールしたものを、10,000未満の分子量成分
をカットオフすることによって約2,000 ng/mlまで濃縮
し、0.45ミクロンフィルターを通して濾過した。得られ
た生成物を各ボトル当り1マイクログラムずつボトルに
充填し、冷凍保存するかまたは実施例7のように凍結乾
燥した。
ー対照の製造工程の例である。
器を溶かした。全タンパク質は5.0−6.0 g/dlの範囲で
あった。ヒト血清はバクテニア汚染の可視兆候を全く示
さなかった。血清および未精製ストック溶液について、
下記に示す全ての成分の内因レベルをテストした。血清
のpHを4N塩酸を用いて6.1 に調節し、pHが約6.8 に達
するまでかくはんした。溶液をヘペス緩衝液中における
1.5 ×10-2Mに作り、pHを6.8 −7.0 に調節した。0.1
−0.5 %のセライトをプールした血清に加え、混合し、
そして少なくとも0.5 ミクロンのパッドを通して濾過し
た。次に以下の成分を所望の量まで、中程度のスピード
で、混合しながら加えた。加えた成分とは、すなわち、
アルファフェトプロテイン、がん胎児抗原、CA125 、
CA19-9、CA50、CA15-3、フェリチン、β−hC
G、免疫エラスターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ(pro
static acid phosphatase)、組織ポリペプチド抗原、お
よびヒト女性尿(SCCのソースとして)である。プー
ルしたものを0.45ミクロンフィルターを通して濾過し、
各ガラスびん当り5.2ml として充填した。生成物を実施
例7のように凍結乾燥した。
のロッドについて促進安定性試験を行った。サンプルを
37℃でインキュベートし、5℃での値を推断する基礎と
した。37℃での5週間は5℃での4年に相当すると考え
た。その結果は、生成物中のSCC成分は5℃で最低4
年間は安定であることを示した。
Claims (16)
- 【請求項1】 ヒト女性尿から分離された扁平上皮がん
状(SCC状)物質。 - 【請求項2】 前記扁平上皮がん状物質がヒトがん組織
または他のヒトソースから抽出された扁平上皮がんの代
替として有用となるように改質されていることを特徴と
する請求項1記載の扁平上皮がん状物質。 - 【請求項3】 前記改質が免疫化学的検定に有用なマー
カーの付加を含むことを特徴とする請求項2記載の扁平
上皮がん状物質。 - 【請求項4】 扁平上皮がん状物質の抗体産生に利用さ
れることを特徴とする請求項1記載の扁平上皮がん状物
質。 - 【請求項5】 請求項4記載の扁平上皮がん状物質の抗
体。 - 【請求項6】 ポリクローナル抗体技術によって産生さ
れることを特徴とする請求項5記載の抗体。 - 【請求項7】 モノクローナル抗体技術によって産生さ
れることを特徴とする請求項5記載の抗体。 - 【請求項8】 ヒト女性尿から扁平上皮がん状物質を分
離する方法であって、 a) 適切なヒト尿サンプルを選択し、 b) 前記尿から扁平上皮がん状物質を分離するか、前記
尿を分析その他の目的に有用な形態に変換する、 各工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項9】 前記選択がイムノアッセイ法の使用を含
むことを特徴とする請求項8記載の方法。 - 【請求項10】 前記分離がカラムクロマトグラフィー
技術の使用を含むことを特徴とする請求項8記載の方
法。 - 【請求項11】 前記変換が扁平上皮がん状物質の濃縮
を含むことを特徴とする請求項8記載の方法。 - 【請求項12】 ヒト女性尿からの扁平上皮がん状物質
を含むことを特徴とする分析対照物質。 - 【請求項13】 扁平上皮がん状物質が、前記分析対照
物質に加えられる前にまずヒト女性尿から分離されるこ
とを特徴とする請求項12記載の分析対照物質。 - 【請求項14】 扁平上皮がん状物質がヒト女性尿のア
リコート使用により導入されることを特徴とする請求項
12記載の分析対照物質。 - 【請求項15】 請求項1−14のいずれか1項記載の物
質または方法により得られた1以上の物質を含む診断キ
ット。 - 【請求項16】 ヒト女性尿からの扁平上皮がん状物質
を含有する分析対照物質を含むことを特徴とする請求項
15記載の診断キット。
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