JPH0751063A - Trehalase having reverse reactivity and production of alpha,alpha-trehalose - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a new trehalase capable of producing alpha,alpha-trehalose useful as a stabilizer for the freezing and drying of bio-membrane and protein from glucose. CONSTITUTION:This trehalase is originated from microorganisms which belong to the genus Penicilllum, Aspergillus, Mucor, Pichia, Hansenula, Candida, Rhodosporidium, Saccharomyces, Escherichla or Klebsiella, capable of decomposing trehalose to produce two glucose molecules and active exclusively to trehalose having alpha,alpha-1,1 bond. It has an optimum pH of 4-5, exhibits reverse reactivity, has sugar resistance even at a high glucose concentration, stable pH of e.g. <=6.0 and optimum temperature of 40-45 deg.C, completely remains by the treatment at 50 deg.C for 30 min, has a molecular weight of 169,000 (SDS-PAGE) and an isoelectric point of 5.1 and contains sugar chain decomposable with endoglycosidase H. It can be produced e.g. by the culture of Penicilllum sp. c320 (FERM BP-4322).

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の背景】発明の分野 本発明は、逆反応性を有するトレハラーゼ、およびそれ
を用いたα，α−トレハロースの製造法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to trehalase having reverse reactivity and a method for producing α, α-trehalose using the trehalase.

【０００２】背景技術 α，α−トレハロースは酵母、かび、放線菌、細菌、海
藻等の天然物中に広く存在する非還元性二糖である。近
年、α，α−トレハロースは生体膜や蛋白質の凍結や乾
燥に対する安定剤として、医薬品、化粧品、食品等の原
料に用いる事が検討されている。 [0002] alpha, alpha-trehalose is a non-reducing disaccharide which exists widely yeasts, molds, actinomycetes, bacteria, natural products in seaweed and the like. In recent years, α, α-trehalose has been studied for use as a stabilizer against freezing and drying of biological membranes and proteins, as a raw material for pharmaceuticals, cosmetics, foods and the like.

【０００３】この物質を得る方法としては、従来、上記
天然物から抽出する方法が知られている。また、微生物
を用いた発酵法も知られており、例えば、アースロバク
ター(Arthrobacter)属に属する微生物（Agric.Biol.Che
m.,33,No.2,190,1969,SuzukiT,Tanaka K & Kinoshita S
）、ノカルディア(Nocardia)属に属する微生物（特開
昭50-154485 ）、スクレロチウム(Sclerotium)属または
リゾクトニア(Rhizoctonia) 属に属する微生物（特開平
3-130084）など用いて製造されている。しかしながら、
これらいずれの方法も収量が低く、また生成物が不純物
を多く含むため多段階の精製工程が必要であり、実用的
には満足できないものである。As a method for obtaining this substance, a method of extracting from the above-mentioned natural product has been conventionally known. Fermentation methods using microorganisms are also known, for example, microorganisms belonging to the genus Arthrobacter (Agric.Biol.Che).
m., 33, No.2,190,1969, SuzukiT, Tanaka K & Kinoshita S
), A microorganism belonging to the genus Nocardia (Japanese Patent Application Laid-Open No. 50-154485), a microorganism belonging to the genus Sclerotium or Rhizoctonia (Japanese Patent Application Laid-Open No.
3-130084) and the like. However,
All of these methods have low yields, and since the product contains many impurities, a multi-step purification process is required, which is not practically satisfactory.

【０００４】また酵素を用いた方法も知られている。例
えば、ユーグレナ・グラチリス(Euglena gracilis)等の
生産するトレハロースホスホリラーゼ及びネイセリア・
メニンギデイス(Neisseria meningitidis)等の生産する
マルトースホスホリラーゼを用いて、マルトースからト
レハロースを生成する方法が知られている（特公昭63-6
0998）。しかし、この方法にあっては、二種の酵素が必
要なうえ、この酵素の大量かつ安価な調製が困難である
ため、実用的には満足できないものである。A method using an enzyme is also known. For example, trehalose phosphorylase produced by Euglena gracilis and Neseria
There is known a method for producing trehalose from maltose using maltose phosphorylase produced by Meningitidis (Neisseria meningitidis) and the like (Japanese Patent Publication No. 63-6).
0998). However, this method is not practically satisfactory because it requires two kinds of enzymes and it is difficult to prepare the enzymes in large quantities at low cost.

【０００５】また、トレハラーゼの逆反応によってグル
コースからα，α−トレハロースが得られるという知見
もケトミウム・レクトピリウム(Chaetomium rectopiliu
m)ATCC22431 のトレハラーゼについて知られている（Bi
ochem.Eng.--Stuttgart,[Proc.Int.Symp.],2nd,126,199
0,Kulbe K.D ）。しかし、このケトミウム・レクトピリ
ウムの酵素は最大生成量が１３ g/l、収率２．５％と、
逆反応性が低いという欠点を有しており、トレハロース
の製造という観点からは実用性に乏しいものである。ま
た、最近、緑藻 Lobosphaera sp.由来のトレハラーゼの
逆反応によって６０％(w/w) （約７６％(w/v) ）のグル
コース溶液から、収率５％（約３８ g/l）のα，α−ト
レハロースが得られるとの知見も報告されている（日本
農芸化学会、１９９４年大会要旨集、ｐ２２４、中野
ら）。なお、トレハラーゼは、本来、α，α−トレハロ
ースを分解する酵素であり、広く天然界に存在が知られ
ている。しかしながら、この酵素が逆反応によって、グ
ルコースからα，α−トレハロースを生成させること
は、これら菌株由来のもののほかには全く知られていな
い。[0005] Further, the finding that α, α-trehalose can be obtained from glucose by the reverse reaction of trehalase is also known as Chaetomium rectopiliu.
(m) Known for trehalase of ATCC22431 (Bi
ochem.Eng .-- Stuttgart, [Proc.Int.Symp.], 2nd, 126,199
0, Kulbe KD). However, the maximum amount of this enzyme of ketodium rectopyrium was 13 g / l and the yield was 2.5%.
It has a drawback of low reverse reactivity and is not practical from the viewpoint of producing trehalose. Also, recently, a 60% (w / w) (about 76% (w / v)) glucose solution was obtained by a reverse reaction of trehalase from the green alga Lobosphaera sp. , .Alpha.-trehalose has been reported to be obtained (Agricultural Chemical Society of Japan, 1994 Annual Meeting, p224, Nakano et al.). In addition, trehalase is originally an enzyme that decomposes α, α-trehalose, and its existence is widely known in the natural world. However, other than those derived from these strains, it is completely unknown that this enzyme produces α, α-trehalose from glucose by a reverse reaction.

【０００６】以上のように従来の方法には低収量、精製
工程の繁雑さ、低生産量、酵素調製の繁雑さなどの問題
があり、よってより効率のよいα，α−トレハロースの
製造法の確立が望まれているといえる。As described above, the conventional methods have problems such as low yield, complicated purification steps, low production amount, and complicated enzyme preparation. Therefore, a more efficient method for producing α, α-trehalose is required. It can be said that establishment is desired.

【０００７】[0007]

【発明の概要】従って本発明は、有用なα，α−トレハ
ロースの効率のよい、実用的な製造方法、ならびにそれ
に好ましく用いられるトレハラーゼの提供をその目的と
している。SUMMARY OF THE INVENTION Therefore, the object of the present invention is to provide an efficient and practical method for producing a useful α, α-trehalose, and a trehalase preferably used therein.

【０００８】本発明者らは、α，α−トレハロースの製
造法について研究を進めた結果、ある種のトレハラーゼ
によると、その逆反応を利用して、グルコースからα，
α−トレハロースが効率よく製造できることを見出し
た。本発明は、その知見に基づくものである。The present inventors have conducted research on a method for producing α, α-trehalose, and as a result, according to a certain type of trehalase, the reverse reaction thereof was utilized to convert α, α-trehalose from glucose into α, α-trehalose.
It was found that α-trehalose can be efficiently produced. The present invention is based on that finding.

【０００９】すなわち、本発明によるトレハラーゼは、
ペニシリウム属、アスペルギルス属、ムコール属、ピキ
ア属、ハンセニュラ属、カンジダ属、ロドスポリジウム
属、サッカロミセス属、エシェリヒア属、またはクレブ
ジエラ属に属する微生物由来のトレハラーゼである。ま
た、本発明によるα，α−トレハロースの製造法は、前
記トレハラーゼと、グルコースとを接触させる工程を含
んでなるもの、である。That is, the trehalase according to the present invention is
It is a trehalase derived from a microorganism belonging to the genus Penicillium, Aspergillus, Mucor, Pichia, Hansenula, Candida, Rhodosporidium, Saccharomyces, Escherichia, or Klebziella. Further, the method for producing α, α-trehalose according to the present invention comprises a step of bringing the trehalase into contact with glucose.

【００１０】[0010]

【発明の具体的説明】逆反応性を有するトレハラーゼおよびそれを産生する微
生物 本明細書において、トレハラーゼとは、α，α−トレハ
ロースを分解して二分子のグルコースを生成させる活性
を有する酵素を意味する。Detailed Description of the Invention Trehalase with reverse reactivity and micro-organisms producing it
Organism In the present specification, trehalase means an enzyme having an activity of degrading α, α-trehalose to produce bimolecular glucose.

【００１１】本発明者らはこのトレハラーゼの逆反応に
ついて検討した。その結果、ペニシリウム(Penicilliu
m) 属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、ムコール(Mu
cor)属、ピキア(Pichia)属、ハンセニュラ(Hansenula)
属、カンジダ(Candida) 属またはロドスポリジウム(Rho
dosporidium)属、サッカロミセス(Saccheromyces) 属、
エシェリヒア(Escherichi)属、またはクレブジエラ(Kle
bsiella)属に属する糸状菌類、酵母類等、または細菌な
どの生産するトレハラーゼが高い逆反応性を示す事を見
いだした。The present inventors examined the reverse reaction of trehalase. As a result, Penicillium
m) genus, Aspergillus genus, Mucor (Mu
genus cor), genus Pichia, Hansenula
Genus, Candida or Rhodosporidium (Rho
genus dosporidium, genus Saccheromyces,
The genus Escherichia or Klebziella (Kle
We found that trehalases produced by filamentous fungi, yeasts, or bacteria belonging to the genus bsiella) show high reverse reactivity.

【００１２】上記したように、従来、逆反応の進むトレ
ハラーゼとしてはケトミウム・レクトピリウム(Chaetom
ium rectopilium)ＡＴＣＣ２２４３１、および緑藻 Lob
osphaera sp.由来のものが知られるのみであり、それ以
外の微生物のトレハラーゼが逆反応性を有することは未
だ知られていない。このような状況にあって、ある種の
微生物に由来するトレハラーゼが高い逆反応性を有して
いることは意外であった。[0012] As described above, conventionally, as a trehalase in which the reverse reaction proceeds, a chaetomium rectopyrium (Chaetom) is used.
ium rectopilium) ATCC 22431 and green alga Lob
Only those derived from osphaera sp. are known, and it is not yet known that trehalases of other microorganisms have reverse reactivity. Under such circumstances, it was surprising that trehalase derived from a certain type of microorganism has high reverse reactivity.

【００１３】ここで、逆反応性とは次の平衡式におい
て、事実上正逆反応が進行することをいう。The term "reverse reactivity" as used herein means that the forward and reverse reactions actually proceed in the following equilibrium equation.

【数１】 本発明によるトレハラーゼは、好ましくは平衡定数Ｋｅ
ｑ値３〜５を有する。[Equation 1] The trehalase according to the invention preferably has an equilibrium constant Ke.
It has a q value of 3-5.

【００１４】さらに、本発明によるトレハラーゼは、高
いグルコース濃度においても耐糖性であり、そのグルコ
ースからα，α−トレハロースを効率よく生成する。す
なわち、高いグルコース濃度にあっても基質阻害を受け
ず、高い逆反応速度を維持することができる。その結
果、高いグルコース濃度においても上記記載の理論上の
平衡に達するまでα，α−トレハロースの生成反応が進
行する。逆反応性が知られた従来のトレハラーゼは、高
いグルコース濃度となると、顕著に基質阻害を受け、
α，α−トレハロースの生産量が大幅に低下しまう。一
方、本発明によるトレハラーゼは上記のように高いグル
コース濃度においても基質阻害を受けず、従って、平衡
定数に従いグルコース濃度が高いほどα，α−トレハロ
ースの生産量が大きくなる点で極めて有利である。Furthermore, the trehalase according to the present invention is glucose-tolerant even at a high glucose concentration and efficiently produces α, α-trehalose from the glucose. That is, even when the glucose concentration is high, the substrate is not inhibited and a high reverse reaction rate can be maintained. As a result, the α, α-trehalose formation reaction proceeds until the theoretical equilibrium described above is reached even at a high glucose concentration. Conventional trehalase, which is known to have reverse reactivity, is significantly substrate-inhibited at high glucose concentrations,
The production amount of α, α-trehalose is significantly reduced. On the other hand, the trehalase according to the present invention does not undergo substrate inhibition even at a high glucose concentration as described above, and therefore, the higher the glucose concentration according to the equilibrium constant, the more advantageous the production amount of α, α-trehalose is.

【００１５】具体的には、従来の逆反応の進むトレハラ
ーゼが強い阻害作用を受けるグルコース濃度３０％以上
の濃度にあっても、本発明によるトレハラーゼは基質阻
害を受けず、α，α−トレハロースを生成する。更に、
５０％以上のグルコース濃度においても高い逆反応速度
を維持する。Specifically, the trehalase according to the present invention is not subject to substrate inhibition even at a glucose concentration of 30% or more, which is a strong inhibitory effect of conventional trehalase in which the reverse reaction proceeds, and α, α-trehalose To generate. Furthermore,
It maintains a high reverse reaction rate even at glucose concentrations above 50%.

【００１６】本発明のより好ましい態様によれば、本発
明によるトレハラーゼは下記の(1)〜(4) の性質を有す
る、酸性トレハラーゼである。 (1) 作用：トレハロースを分解して二分子のグルコース
を生成。 (2) 基質特異性：α，α−１，１結合を有するトレハロ
ースのみに作用。 (3) 至適ｐＨ：４〜５の酸性域 (4) 逆反応性を有し、高グルコース濃度においても耐糖
性である。According to a more preferred embodiment of the present invention, the trehalase according to the present invention is an acid trehalase having the following properties (1) to (4). (1) Action: Decomposes trehalose to produce two molecules of glucose. (2) Substrate specificity: Acts only on trehalose having α, α-1,1 bond. (3) Optimum pH: acidic range of 4 to 5 (4) It has reverse reactivity and is glucose resistant even at high glucose concentration.

【００１７】次の第１表は、本発明による酵素の好まし
い具体例の酵素学的性質を示したものである。The following Table 1 shows the enzymological properties of preferred embodiments of the enzyme according to the invention.

【００１８】[0018]

【表１】 [Table 1]

【００１９】第１表から明らかなように、本発明による
好ましい酵素は、酸性域に指摘ｐＨを有し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにおいてスメアーなバンドであり、分子量が１４
万前後以上と高分子量である、酸性トレハラーゼであ
る。As is apparent from Table 1, the preferred enzyme according to the present invention has an indicated pH in the acidic range and SDS-P
It is a smear band in AGE and has a molecular weight of 14
It is an acid trehalase with a high molecular weight of around 10,000 or more.

【００２０】本発明の最も好ましい態様によれば、従来
知られているトレハラーゼであるケトミウム・レクトピ
リウム由来のトレハラーゼと比較して、生成量において
実に１０倍以上、転換率にして５倍以上、緑藻 Lobosph
aera sp.由来のトレハラーゼと比較して、生産量におい
て３．６倍以上、転換率にして２．７倍以上で、α，α
−トレハロースを効率よく生成する。According to the most preferred embodiment of the present invention, in comparison with the conventionally known trehalase, trehalase derived from Ketomium rectopyrium, the production amount is 10 times or more, the conversion rate is 5 times or more, and the green alga Lobosph
Compared with trehalase derived from aera sp., the production amount was 3.6 times or more, and the conversion rate was 2.7 times or more.
-Produces trehalose efficiently.

【００２１】本発明によるトレハラーゼを産生する上記
属の菌株の具体例としては次のようなものが挙げられ
る。ペニシリウム属に属する微生物としては、ペニシリ
ウム・シトリナムＩＦＯ４６３１株、ペニシリウム・パ
ープレッセンスＩＡＭ７０２８株、ペニシリウム・スピ
ヌロスムＩＡＭ７０４９株、ペニシリウム・トルツビン
スキＩＡＭ７１８５株、ペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０
株などが、アスペルギルス属に属する微生物としては、
アスペルギルス・オリゼＩＦＯ４０７５株、ＪＣＭ２０
６７株、ＪＣＭ２２２６株、ＪＣＭ２２３６株、および
ＪＣＭ２２４２株、アスペルギルス・アワモリＩＦＯ４
０３３株、アスペルギルス・ニガーＪＣＭ５５４８株、
ＪＣＭ５５４９株、およびＩＦＯ６０６８株、アスペル
ギルス・ソーエＩＦＯ４３８６株、アスペルギルス・テ
レウスＩＦＯ６１２３株、ＩＦＯ６３４６株、およびＪ
ＣＭ２５９８株、アスペルギルス・カーボナリウスＩＦ
Ｏ５８６４株などが、ムコール属に属する微生物として
は、ムコール・ラセモサスＩＦＯ４５８１株などが、ピ
キア属に属する微生物としては、ピキア・アカシエＩＦ
Ｏ１６８１株、ピキア・ナカザワエＩＦＯ１６６９株な
どが、ハンセニュラ属に属する微生物としては、ハンセ
ニュラ・アノマラＩＦＯ０７２１株などが、カンジダ属
に属する微生物としては、カンジダ・トロピカリスＪＣ
Ｍ１５４１株などが、ロドスポリジウム属に属する微生
物としては、ロドスポリジウム・トルロイデスＩＦＯ８
７６６株などが、サッカロミセス属に属する微生物とし
ては、サッカロミセス・セレビシエＡＴＣＣ９７６７株
などが、エシェリヒア属に属する微生物としては、エシ
ェリヒア・コリＩＦＯ１６４９株などが、そしてクレブ
ジエラ属に属する微生物としては、クレブジエラ・オキ
シトカＪＣＭ１６６５株、クレブジエラ・テリゲナＪＣ
Ｍ１６８７株などを挙げる事ができる。Specific examples of the strains of the above genus that produce trehalase according to the present invention include the following. Examples of the microorganism belonging to the genus Penicillium include Penicillium citrinum IFO4631 strain, Penicillium perpressens IAM7028 strain, Penicillium spinulosum IAM7049 strain, Penicillium tortubinski IAM7185 strain, Penicillium sp. C320
As a microorganism belonging to the genus Aspergillus, such as a strain,
Aspergillus oryzae IFO4075 strain, JCM20
67 strains, JCM2226 strain, JCM2236 strain, and JCM2242 strain, Aspergillus awamori IFO4
033 strain, Aspergillus niger JCM5548 strain,
JCM5549 strain, IFO6068 strain, Aspergillus soue IFO4386 strain, Aspergillus terreus IFO6123 strain, IFO6346 strain, and J
CM2598 strain, Aspergillus carbonarius IF
The O5864 strain and the like belong to the Mucor genus, Mucor racemosus IFO4581 strain and the like belong to the Pichia genus, Pichia acacia IF
The O1681 strain, Pichia nakagawae IFO1669 strain and the like are Hansenula anomala IFO0721 strains as microorganisms belonging to the genus Hansenula, and the Candida tropicalis JC strain as microorganisms belonging to the genus Candida.
The microorganisms belonging to the genus Rhodosporidium, such as the M1541 strain, are Rhodosporidium toruloides IFO8.
Strains such as 766 strains belong to the genus Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae strain ATCC 9767, microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli IFO 1649 strain, and microorganisms belonging to the genus Klebziella, Klebziella oxytoca JCM1665. Klebziella terrigena JC
Examples include M1687 strain.

【００２２】これらの属に属する微生物は、逆反応性を
持つトレハラーゼを有する限り本発明による方法に使用
する事ができることは言うまでもない。It goes without saying that microorganisms belonging to these genera can be used in the method according to the present invention as long as they have trehalase having a reverse reactivity.

【００２３】（ペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０株）これ
らの微生物の中で、ペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０株は
本発明者らが群馬県の土壌から分離した菌株であって、
次のような性質を示すものである。 (1) 形態的性質 本菌株は、麦芽汁寒天培地、バレイショ・ブドウ糖寒天
培地、サブロー寒天培地などで比較的良好に生育し、分
生子の着生も比較的良好である。ツァペック寒天培地、
バレイショ・ブドウ糖寒天培地、サブロー寒天培地など
で生育したコロニーを顕微鏡観察すると、胞子は１細
胞、菌糸は隔壁があり胞子および他の器官は透明〜黄緑
色である。ほふく性菌糸または気生菌糸から分生子柄が
直生し分生子柄の先端は膨らまず群生したとっくり型の
フィアライドから分生子を直鎖状に連鎖して着生するフ
ィアロ型分生子形成がみとめられた。ペニシラスはいず
れも複輪生ー対称体、単輪生のものも見られる。フィア
ライドの大きさは６〜１２×２〜４μｍで３〜６個着生
する。分生子は球形〜亜球形で、大きさは１．５〜２．
０μｍである。(Penicillium sp. C320 strain) Among these microorganisms, Penicillium sp. The C320 strain is a strain isolated by the present inventors from the soil of Gunma prefecture,
It has the following properties. (1) Morphological properties This strain grows relatively well on a wort agar medium, potato / glucose agar medium, Sabouraud agar medium and the like, and conidia are also relatively well established. Czapek agar,
Microscopic observation of colonies grown on potato-glucose agar medium, Sabouraud agar medium and the like shows that spores are 1 cell, hyphae have septa, and spores and other organs are transparent to yellow-green. The conidia stalk directly grows from the hyphae or aerial hyphae, the tip of the conidia stalk does not swell, and the conidia formed by linear concatenation of conidia formed from clustered phyllides. Was given. Penicillus can be seen in both compound and monolithic forms. The size of the phialide is 6 to 12 × 2 to 4 μm, and 3 to 6 epiphytes grow. Conidia are spherical to subspherical and have a size of 1.5 to 2.
It is 0 μm.

【００２４】(2) 各培地上での性状 各種培地上で２５℃、７日間培養した場合の肉眼的観察
結果は、第２表に示される通りである。(2) Properties on each medium Table 2 shows the macroscopic observation results when the cells were cultured on various mediums at 25 ° C for 7 days.

【００２５】[0025]

【表２】 [Table 2]

【００２６】表から明らかなように、本菌株はこれら全
ての培地上で、菌の生育に伴う色素等の分泌液及び菌核
の形成は観察されなかった。またコロニーは緑〜深緑〜
灰緑色であった。As is clear from the table, the formation of secretory fluid such as pigments and sclerotia associated with the growth of the bacterium was not observed on all of these media. The colony is green ~ deep green ~
It was grey-green.

【００２７】(3) 生育最適条件 ｐＨ：２〜１０の範囲で生育し、最適生育ｐＨは４〜７ 温度：１５〜３７℃の範囲で生育し、最適生育温度は２
５〜３０℃ (4) 好気性、嫌気性の区別：好気性 以上の性状中、形態観察の結果から本菌株はPenicilliu
m 属に属する菌株であり、従って本菌株をペニシリウム
・ｓｐ．Ｃ３２０（Penicillium sp. C320）と命名し
た。(3) Optimum growth conditions pH: grows in the range of 2 to 10, optimum growth pH grows in the range of 4 to 7 temperature: 15 to 37 ° C., optimum growth temperature is 2
5-30 ° C (4) Distinction between aerobic and anaerobic: aerobic From the results of morphological observation, the strain is Penicilliu.
Since it is a strain belonging to the genus m, this strain is designated as Penicillium sp. It was named C320 (Penicillium sp. C320).

【００２８】なお、本菌株は工業技術院生命工学工業技
術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４３２２のもと寄
託されている。The strain has been deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology under the deposit number FERM BP-4322.

【００２９】上記菌株の培養にあたっては、培地は液体
でも固体でもよく、通常は液体培地による振とう培養ま
たは通気撹拌培養が用いられる。これら微生物を培養す
る培地としては、生育に適するものであれば特に限定さ
れない。例えば、炭素源としては、例えばグルコース、
トレハロース、フラクトース、マルトース、シュークロ
ース、澱粉、マルトオリゴ糖等が用いられる。窒素源と
しては、例えばペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉
エキス、大豆粉、綿実粉、コーンステイープリカー、各
種アミノ酸類、及びその塩類、硝酸塩等が用いられる。
その他、燐酸マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、
カリウム、鉄、マンガン等の無機塩類、さらに必要に応
じてその他の栄養物を程よく含有する合成培地または天
然培地を使用する事ができる。また、培養条件も上記生
育可能な温度およびｐＨのもとであれば特に限定されな
い。In culturing the above strain, the medium may be liquid or solid, and shaking culture or aeration-agitation culture in a liquid medium is usually used. The medium for culturing these microorganisms is not particularly limited as long as it is suitable for growth. For example, as the carbon source, for example, glucose,
Trehalose, fructose, maltose, sucrose, starch, maltooligosaccharides and the like are used. As the nitrogen source, for example, peptone, yeast extract, malt extract, meat extract, soybean powder, cottonseed flour, corn stay liquor, various amino acids, salts thereof, nitrates and the like are used.
In addition, magnesium phosphate, calcium, sodium,
It is possible to use a synthetic medium or a natural medium which appropriately contains inorganic salts such as potassium, iron and manganese and, if necessary, other nutrients. Further, the culture conditions are not particularly limited as long as they are at the above-mentioned temperature and pH at which they can grow.

【００３０】α，α−トレハロースの製造 本発明によるα，α−トレハロースの製造法は、上記微
生物が産生するトレハラーゼの逆反応によってグルコー
スからα，α−トレハロースを製造するものである。従
って、上記微生物が産生するトレハラーゼがグルコース
に作用可能な態様である限り、トレハラーゼとグルコー
スの接触の態様は特に限定されない。具体的には、上記
微生物の菌体、菌体破砕物または培養上澄中から粗酵素
を得て、場合によってさらに精製された酵素を得て、そ
の酵素をグルコースに作用させてもよい。さらに、その
ようにして得た酵素を担体に固定化し、固定化された酵
素とグルコースと接触させてもよい。なお、上記微生物
の複数種から得られた二以上のトレハラーゼを共存させ
てグルコースと接触させてもよい。 Production of α, α-trehalose The method for producing α, α-trehalose according to the present invention is to produce α, α-trehalose from glucose by the reverse reaction of trehalase produced by the above microorganism. Therefore, the mode of contact between trehalase and glucose is not particularly limited, as long as the trehalase produced by the above microorganism can act on glucose. Specifically, a crude enzyme may be obtained from the cells of the above-mentioned microorganism, a disrupted product of the cells, or the culture supernatant, and a further purified enzyme may be obtained, and the enzyme may be allowed to act on glucose. Further, the enzyme thus obtained may be immobilized on a carrier, and the immobilized enzyme may be brought into contact with glucose. It should be noted that two or more trehalases obtained from a plurality of the above microorganisms may coexist and contact with glucose.

【００３１】トレハラーゼ産生のための微生物の培養条
件は、トレハラーゼを産生する範囲内で適宜選択されて
よいが、液体振とう培養または通気撹拌培養の場合、ｐ
Ｈ４〜７（好ましくは５〜６）、培養温度２５〜３０℃
（好ましくは２５〜２８℃）で、２〜５日間の培養が適
当である。The culture conditions of the microorganism for producing trehalase may be appropriately selected within the range of producing trehalase, but in the case of liquid shaking culture or aeration and agitation culture, p
H4-7 (preferably 5-6), culture temperature 25-30 ° C
Culturing at (preferably 25 to 28 ° C.) for 2 to 5 days is suitable.

【００３２】本発明において利用されるトレハラーゼは
菌体の細胞壁、菌体内、培養上清などに存在する。従っ
て、トレハラーゼは菌体、菌体破砕物または培養上清な
どから常法に従って粗酵素を得て、さらにそれを精製し
てもよい。精製は、常法により得られた菌体、菌体破砕
物を音波法、凍結融解、自己消化、酵素処理して得た抽
出物、または培養上清を、限外瀘過などにより濃縮する
か、またはそのまま硫安塩析し、ゲル瀘過、もしくはイ
オン交換樹脂、疎水性吸着樹脂などの各種吸着樹脂、ま
たはこれらの組み合わせにより行うことができる。The trehalase used in the present invention exists in the cell wall of bacterial cells, bacterial cells, culture supernatant and the like. Therefore, trehalase may be obtained by obtaining a crude enzyme from cells, disrupted cells, culture supernatant, etc. according to a conventional method and further purifying it. For purification, whether the cells obtained by a conventional method, the cell crushed product are subjected to sonication, freeze-thawing, autolysis, an enzyme-treated extract, or the culture supernatant is concentrated by ultrafiltration or the like. Alternatively, salting out with ammonium sulfate as it is, gel filtration, or various adsorption resins such as ion exchange resins and hydrophobic adsorption resins, or a combination thereof can be performed.

【００３３】また、原料としてのグルコースの濃度は、
トレハラーゼの比活性、反応温度などを考慮して適宜選
択されてよいが、３０〜１００％（wt/vol）の範囲とす
るのが一般的であり、好ましくは６０〜９０％（wt/vo
l）、反応速度の面からより好ましくは８０〜８５％（w
t/vol）の範囲である。反応温度は３０〜７０℃程度が
一般的であり、好ましくは４０〜５０℃の範囲であり、
また反応ｐＨは４〜７の範囲が一般的であり、好ましく
は４．５〜５．５の範囲である。The concentration of glucose as a raw material is
It may be appropriately selected in consideration of the specific activity of trehalase, reaction temperature, etc., but it is generally in the range of 30 to 100% (wt / vol), preferably 60 to 90% (wt / vo).
l), more preferably 80 to 85% (w
t / vol) range. The reaction temperature is generally about 30 to 70 ° C., preferably 40 to 50 ° C.,
Further, the reaction pH is generally in the range of 4 to 7, and preferably in the range of 4.5 to 5.5.

【００３４】生成されたα，α−トレハロースは公知の
方法に従い精製する事ができる。すなわち、得られた反
応上清をイオン交換樹脂にて脱塩し、活性炭、陰イオン
交換樹脂(HSO₃ 型) 、または陽イオン交換樹脂(Ca 型)
等を分離剤とするクロマトグラフィーによってα，α−
トレハロース画分を分離し、続いてこれを濃縮し、佐藤
＆津村（日本農芸化学会誌、27,412,1953 ）等の方法に
よりエタノール水溶液中で結晶化、または本出願人によ
る特願平4-321135に記載された方法によって結晶化し、
α，α−トレハロースを得る事ができる。The α, α-trehalose produced can be purified by a known method. That is, the obtained reaction supernatant is desalted with an ion exchange resin and then activated carbon, anion exchange resin (HSO ₃ type), or cation exchange resin (Ca type) is used.
Α, α-
The trehalose fraction was separated, then concentrated, and crystallized in an aqueous ethanol solution by the method of Sato & Tsumura (Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry, 27,412,1953), or Japanese Patent Application No. 4-321135 by the applicant. Crystallize by the method described,
It is possible to obtain α, α-trehalose.

【００３５】[0035]

【実施例】本発明を以下の実施例によってさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。実施例１ （１） 菌体粗酵素の調製 ペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０株、およびアスペルギル
ス・オリゼＪＣＭ２２４２株の菌体をホモジナイザーで
穏やかに破砕し、吸引濾過し、その後生理食塩水で洗浄
した。この破砕菌体を菌体粗酵素とした。なお、トレハ
ラーゼ活性は、４０℃、ｐＨ５．５においてα，α−ト
レハロースから１分間に１μｍｏｌのグルコースを精製
する酵素量を１unitとした。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples. Example 1 (1) Preparation of crude enzyme of Penicillium sp. The cells of the C320 strain and Aspergillus oryzae JCM2242 strain were gently disrupted with a homogenizer, suction filtered, and then washed with physiological saline. This crushed microbial cell was used as a microbial cell crude enzyme. In the trehalase activity, 1 unit was defined as the amount of enzyme for purifying 1 μmol glucose per minute from α, α-trehalose at 40 ° C. and pH 5.5.

【００３６】（２） 菌体粗酵素を用いたトレハロース
生成反応 ７０％グルコース溶液１５ｍｌに上記（１）で得られた
株菌体粗酵素を１unit/ml となるよう添加し、５０℃、
ｐＨ４．５にて反応を行った。(2) Trehalose production reaction using crude enzyme of cell strain: The crude enzyme of bacterial strain obtained in (1) above was added to 15 ml of 70% glucose solution at 1 unit / ml, and at 50 ° C.
The reaction was carried out at pH 4.5.

【００３７】その後、反応液の一部を下記の条件で高速
液体クロマトグラフィー（HPLC）により分析した。な
お、対照として、ケトミウム・レクトピリウムＡＴＣＣ
２２４３１株を図４に示されるグルコース濃度にて同様
に反応させたもの、およびブタ由来のトレハラーゼを４
０％グルコース溶液に添加し、４０℃、ｐＨ５にて反応
したものを用意し、同様に分析した。 カラム： TOSOH TSK-gel Amide-80(4.6×250mm) 溶媒 ： ７５％アセトニトリル 流速 ： １. ０ml/min 温度 ： 室温 検出機： 示差屈折計Then, a part of the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions. In addition, as a control, ketodium rectopyrium ATCC
Strain 22431 was similarly reacted at the glucose concentration shown in FIG. 4, and trehalase derived from pig was 4
What was added to a 0% glucose solution and reacted at 40 ° C. and pH 5 was prepared and analyzed in the same manner. Column: TOSOH TSK-gel Amide-80 (4.6 x 250 mm) Solvent: 75% acetonitrile Flow rate: 1.0 ml / min Temperature: Room temperature Detector: Differential refractometer

【００３８】ペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０株の結果
は、図１に示される通りである。未反応のグルコースの
他にα，α−トレハロースと同一の保持時間を示す二糖
の反応生成物が検出された。この反応生成物は図２に示
すように時間経過とともに増加し、およそ１２０〜１４
４時間で平衡に達した。この反応生成物を分取し、 ¹Ｈ
−ＮＭＲにより解析を行ったところ、α，α−トレハロ
ース標品（Sigma 社製、Ｔ５２５１）と同一のチャート
を示し、α，α−トレハロースであると同定された（図
３参照）。また、アスペルギルス・オリゼ JCM 2242 株
についても同様の結果が得られた。Penicillium sp. The result of the C320 strain is as shown in FIG. In addition to unreacted glucose, a disaccharide reaction product having the same retention time as α, α-trehalose was detected. This reaction product increases with time as shown in FIG.
Equilibrium was reached in 4 hours. Was taken and the reaction product, ¹ H
When analyzed by NMR, it showed the same chart as an α, α-trehalose preparation (Sigma, T5251), and was identified as α, α-trehalose (see FIG. 3). Similar results were obtained for Aspergillus oryzae JCM 2242 strain.

【００３９】また、各グルコース濃度での平衡時の最大
α，α−トレハロース生成量を種々の菌株について調
べ、比較した。その結果は、図４に示される通りであ
る。図より明らかなように、ペニシリウム・ｓｐ，Ｃ３
２０株、およびアスペルギルス・オリゼ JCM 2242 株
は、それぞれ８４％（wt/vol）、および８９％（wt/vo
l）の時にα，α−トレハロース生成量は最大となり、
それぞれ５０g/l 、および６８．４g/l に達した。ま
た、その時のトレハロース生成速度はそれぞれ１．１g/
l/hr、１．５g/l/hrであった。一方、対照のケトミウム
・レクトピリウムＡＴＣＣ２２４３１については、糖濃
度が４０〜５０％以上になると、その反応性が著しく低
下した。また、市販のブタ由来のトレハラーゼについて
は、α，α−トレハロースの生成は全く認められなかっ
た。The maximum α, α-trehalose production in equilibrium at each glucose concentration was examined for various strains and compared. The result is as shown in FIG. As is clear from the figure, Penicillium sp, C3
20 and Aspergillus oryzae JCM 2242 strains are 84% (wt / vol) and 89% (wt / vo), respectively.
l), the amount of α, α-trehalose produced becomes maximum,
It reached 50 g / l and 68.4 g / l, respectively. The trehalose production rate at that time was 1.1 g /
It was l / hr and 1.5 g / l / hr. On the other hand, with respect to the control, Ketomium rectopyrium ATCC22431, the reactivity was remarkably lowered when the sugar concentration was 40 to 50% or more. In addition, no α, α-trehalose was observed in commercially available trehalase derived from pigs.

【００４０】実施例２ （１） 培養上清精製酵素の調製 ペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０株の培養上清９Ｌを限外
濾過によって濃縮し、得られた濃縮液６ｍｌを、１０ｍ
Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したDEAEト
ヨパール（φ５０×１００mm）に吸着させ、０〜０．３
Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液のリニアグラジェントで溶
出させた。さらに０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液
で平衡化したSuperdex200 （φ１６×６００mm）でゲル
濾過を行った。得られた活性画分は限外濾過によって２
ｍｌに濃縮した後、一夜透析を行った。この操作で得ら
れた精製酵素はSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて単一蛋白であることが確認された。酵素活性は３
９６units 、比活性は２３４units/mg proteinであっ
た。アスペルギルス・オリゼＩＦＯ４０７５株、アスペ
ルギルス・オリゼＪＣＭ２２４２株、およびピキア・ナ
カザワエＩＦＯ１６６９株についても同様に精製操作を
行った。その結果、比活性はそれぞれ２８５units/mg p
rotein、２７９units/mg protein、および１７３units/
mg proteinであった。 Example 2 (1) Preparation of Culture Supernatant Purified Enzyme Penicillium sp. 9 L of the culture supernatant of the C320 strain was concentrated by ultrafiltration, and 6 ml of the obtained concentrated liquid was added to 10 m.
Adsorbed on DEAE Toyopearl (φ50 × 100mm) equilibrated with M sodium phosphate buffer (pH 7), 0-0.3
Elution was performed with a linear gradient of the same buffer containing M NaCl. Further, gel filtration was performed using Superdex 200 (φ16 × 600 mm) equilibrated with the same buffer solution containing 0.15 M NaCl. The active fraction obtained is 2 by ultrafiltration.
After concentration to ml, dialysis was performed overnight. The purified enzyme obtained by this operation was confirmed to be a single protein by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Enzyme activity is 3
96 units, specific activity was 234 units / mg protein. The Aspergillus oryzae IFO4075 strain, the Aspergillus oryzae JCM2242 strain, and the Pichia nakagawae IFO1669 strain were similarly purified. As a result, the specific activity was 285 units / mg p each.
rotein, 279 units / mg protein, and 173 units /
It was mg protein.

【００４１】さらにこれら酵素の酵素学的性質について
次のように調べた。それらの結果は、前記した第１表に
示される通りであった。 （ａ）分子量 ネイティブな状態での精製酵素の分子量の測定を、ゲル
瀘過クロマトグラフィー（カラム：TSK-gel G3000SW ）
により行った。マーカー蛋白質として、ミオシン（200,
000 ）、フォスフォリラーゼｂ（97,400）、ウシ血清ア
ルブミン（66,300）、卵白アルブミン（43,000）、カル
ボニックアンヒドラーゼ（31,000）、ミオグロビン（1
7,000）、リゾリーム（14,400）を用いた。サブユニッ
トの分子量測定には、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳
動により行った。マーカー蛋白質として、ミオシン（20
0,000 ）、β−ガラクトシダーゼ（116,300 ）、フォス
フォリラーゼｂ（97,400）、ウシ血清アルブミン（66,3
00）、グルタミックデヒドロゲナーゼ（55,400）、乳酸
デヒドロゲナーゼ（36,500）、カルボニックアンヒドラ
ーゼ（31,000）、トリプシンインヒビタ−（21,500）、
リゾリーム（14,400）を用いた。 （ｂ）等電点 アガロースゲル等電点電気泳動により等電点の測定を行
った。 （ｃ）安定性 得られた精製酵素の種々の温度、ｐＨにおける安定性を
測定した。安定ｐＨの測定は、ｐＨ２〜４の間はグリシ
ン塩酸系緩衝液を、ｐＨ３．５〜６の間は酢酸ナトリウ
ム系緩衝液を、ｐＨ８〜１０の間はトリス塩酸系緩衝液
を用い、室温にて１２時間放置後、実施例１と同様に測
定した。安定温度の測定は、各安定ｐＨにて測定した。 （ｄ）反応性 得られた精製酵素の種々の温度、ｐＨにおける反応性を
測定した。最適ｐＨの測定は、ｐＨ２〜４の間はグリシ
ン塩酸系緩衝液を、ｐＨ３．５〜６の間は酢酸ナトリウ
ム系緩衝液を、ｐＨ８〜１０の間はトリス塩酸系緩衝液
を用い、実施例１と同様に測定した。 （ｅ）基質特異性 基質として、トレハロース、ラクトース、シュークロー
ス、マルトース、イソマルトース、ニゲロース、または
セロビオースを用い、それらの基質を用いた以外は実施
例１と同様にして反応を行い、グルコースの生成の有無
を調べた。その結果、トレハロースのみを特異的に加水
分解し、二分子のグルコースを生成した。 （ｆ）Ｋｍ値の測定 トレハロース濃度１ｍＭ〜６ｍＭ、グルコース濃度０．
４Ｍ〜１．５Ｍにおける反応諸速度を測定し、Hanes-Wo
olf protによりトレハロース、またはグルコースに対す
るMichaelis 定数、すなわちＫｍ値を求めた。 （ｇ）エンドグリコシダーゼＨ（エンドＨ）によるトレ
ハラーゼ蛋白質からの糖鎖の除去後の分子量の測定 J.Biological Chemistry 265(13)7440-7448(1990) に記
載の方法により、トレハラーゼ蛋白質からの糖鎖の除去
を行い、（ａ）と同一の条件にてＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、分子量を測定した。Further, the enzymatic properties of these enzymes were examined as follows. The results were as shown in Table 1 above. (A) Molecular weight The molecular weight of the purified enzyme in its native state was measured by gel filtration chromatography (column: TSK-gel G3000SW).
Went by. As a marker protein, myosin (200,
000), phosphorylase b (97,400), bovine serum albumin (66,300), ovalbumin (43,000), carbonic anhydrase (31,000), myoglobin (1
7,000) and lysolyme (14,400) were used. The molecular weight of the subunit was measured by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. As a marker protein, myosin (20
0,000), β-galactosidase (116,300), phosphorylase b (97,400), bovine serum albumin (66,3)
00), glutamic dehydrogenase (55,400), lactate dehydrogenase (36,500), carbonic anhydrase (31,000), trypsin inhibitor (21,500),
Rhizoreme (14,400) was used. (B) Isoelectric point The isoelectric point was measured by agarose gel isoelectric focusing. (C) Stability The stability of the obtained purified enzyme at various temperatures and pHs was measured. The stable pH is measured by using a glycine hydrochloric acid buffer between pH 2 and 4, a sodium acetate buffer between pH 3.5 and 6, and a tris hydrochloric acid buffer between pH 8 and 10 at room temperature. After standing for 12 hours, the same measurement as in Example 1 was performed. The stable temperature was measured at each stable pH. (D) Reactivity The reactivity of the obtained purified enzyme at various temperatures and pHs was measured. The optimum pH was measured by using a glycine hydrochloric acid buffer between pH 2 and 4, a sodium acetate buffer between pH 3.5 and 6, and a tris hydrochloric acid buffer between pH 8 and 10. The measurement was performed in the same manner as 1. (E) Substrate specificity As a substrate, trehalose, lactose, sucrose, maltose, isomaltose, nigerose, or cellobiose was used, and the reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that those substrates were used to produce glucose. Was checked for. As a result, only trehalose was specifically hydrolyzed to produce two molecules of glucose. (F) Measurement of Km value Trehalose concentration 1 mM to 6 mM, glucose concentration 0.
Measure various reaction velocities from 4M to 1.5M, and use Hanes-Wo
The Michaelis constant for trehalose or glucose, that is, the Km value was determined by olf prot. (G) Measurement of molecular weight after removal of sugar chain from trehalase protein by endoglycosidase H (endo H) According to the method described in J. Biological Chemistry 265 (13) 7440-7448 (1990), sugar chain from trehalase protein. Was removed, and SDS polyacrylamide gel electrophoresis was performed under the same conditions as in (a) to measure the molecular weight.

【００４２】（２） 精製酵素を用いたα，α−トレハ
ロース生成反応 図６に示される濃度のグルコース溶液３ｍｌに上記
（１）で得た精製酵素を１０ units/ml となるよう添加
し、５０℃、ｐＨ４．５にて反応を行った。その後、反
応液の一部を実施例１と同一条件の高速液体クロマトグ
ラフィー（HPLC）により分析した。その結果は、図５に
示される通りである。図から明らかなように、精製酵素
はα，α−トレハロースを生成した。また、反応生成物
は時間経過とともに増加し、およそ１２０〜１４４時間
で平衡に達した。(2) α, α-trehalose production reaction using purified enzyme The purified enzyme obtained in (1) above was added to 3 ml of glucose solution having the concentration shown in FIG. The reaction was carried out at ℃ and pH 4.5. Then, a part of the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) under the same conditions as in Example 1. The result is as shown in FIG. As is clear from the figure, the purified enzyme produced α, α-trehalose. Moreover, the reaction product increased with the passage of time and reached equilibrium in about 120 to 144 hours.

【００４３】また、平衡時のα，α−トレハロースの最
大生成量は、図６に示される通りである。すなわち、ペ
ニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０株、アスペルギルス・オリ
ゼＩＦＯ４０７５株、およびアスペルギルス・オリゼＪ
ＣＭ２２４２株は、それぞれ１０１％（wt/vol）、９９
％（wt/vol）、および１０４％（wt/vol）の時に、α，
α−トレハロースの生成量は、それぞれ１３１g/l 、１
２１g/l 、および１４０g/l であり、収率はそれぞれ１
３．０％、１２．２％、および１３．５％に達した。ま
た、トレハロースの生成速度はグルコース濃度の影響を
受け、５０〜８５％（wt/vol）程度の時に高く、それぞ
れ１０〜２１g/l/hr、１０〜１７g/l/hr、および１１〜
１９g/l/hrであった。それ以上の濃度では基質阻害の影
響を受けると考えられ、２〜７g/l/hrに低下した。ま
た、以上の測定結果より、前記条件での本発明によるト
レハラーゼの平衡定数を計算した。その結果、平衡定数
Ｋｅｑ値はいずれのトレハラーゼにおいても、およそ４
以下であることがわかった。The maximum amount of α, α-trehalose produced at equilibrium is as shown in FIG. That is, Penicillium sp. C320 strain, Aspergillus oryzae IFO4075 strain, and Aspergillus oryzae J
CM2242 strains are 101% (wt / vol) and 99, respectively.
% (Wt / vol) and 104% (wt / vol), α,
The amount of α-trehalose produced was 131 g / l and 1 respectively.
21 g / l and 140 g / l with yields of 1 respectively
Reached 3.0%, 12.2%, and 13.5%. The production rate of trehalose is influenced by the glucose concentration, and is high at about 50 to 85% (wt / vol), 10 to 21 g / l / hr, 10 to 17 g / l / hr, and 11 to 11, respectively.
It was 19 g / l / hr. At higher concentrations, it was considered to be influenced by substrate inhibition, and the concentration decreased to 2 to 7 g / l / hr. Further, the equilibrium constant of the trehalase according to the present invention under the above conditions was calculated from the above measurement results. As a result, the equilibrium constant Keq value was about 4 for all trehalases.
It turned out to be:

【００４４】実施例３ 第３表に挙げた微生物について、実施例１（２）と同様
にしてα，α−トレハロース生成能を調べた。その結果
は、第３表に示される通りである。いずれの微生物由来
のトレハラーゼもα，α−トレハロースを生成している
ことがわかる。 Example 3 The microorganisms listed in Table 3 were examined for α, α-trehalose-producing ability in the same manner as in Example 1 (2). The results are as shown in Table 3. It can be seen that trehalase derived from any microorganism produces α, α-trehalose.

【００４５】[0045]

【表３】 [Table 3]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例１で得たペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０
株由来のトレハラーゼ逆反応による生成物のHPLCによる
分析結果を示す。FIG. 1 shows the Penicillium sp. C320
The analysis result by HPLC of the product by the trehalase reverse reaction derived from a strain is shown.

【図２】実施例１で得たペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０
株由来のトレハラーゼ逆反応によって得られたα，α−
トレハロースの累積生産量の経時的変化を示すグラフで
ある。FIG. 2 shows the Penicillium sp. C320
Α, α-obtained by the reverse reaction of strain-derived trehalase
It is a graph which shows the time-dependent change of the cumulative production amount of trehalose.

【図３】実施例１で得たペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０
株由来のトレハラーゼ逆反応によって得られたα，α−
トレハロースのＮＭＲチャート（ａ）、および、α，α
−トレハロース標品ののＮＭＲチャート（ｂ）である。FIG. 3 shows the Penicillium sp. C320
Α, α-obtained by the reverse reaction of strain-derived trehalase
Trehalose NMR chart (a) and α, α
-NMR chart (b) of a trehalose preparation.

【図４】実施例１で得たペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０
株、およびアスペルギルス・オリゼＪＣＭ２２４２株由
来のトレハラーゼ逆反応と基質グルコース濃度との関係
を示すグラフである。FIG. 4 shows the Penicillium sp. C320
3 is a graph showing the relationship between the trehalase reverse reaction derived from the strain and Aspergillus oryzae JCM2242 strain and the substrate glucose concentration.

【図５】実施例２で得たペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０
株由来のトレハラーゼ逆反応による生成物のHPLCによる
分析結果を示す。FIG. 5: Penicillium sp. C320
The analysis result by HPLC of the product by the trehalase reverse reaction derived from a strain is shown.

【図６】実施例２で得たペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０
株、アスペルギルス・オリゼＩＦＯ４０７５株、および
アスペルギルス・オリゼＪＣＭ２２４２株由来のトレハ
ラーゼ逆反応と基質グルコース濃度との関係を示すグラ
フである。FIG. 6 shows the Penicillium sp. C320
It is a graph which shows the relationship between the trehalase reverse reaction derived from a strain, Aspergillus oryzae IFO4075 strain, and Aspergillus oryzae JCM2242 strain, and substrate glucose concentration.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:665） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:785） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:78） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI Technical indication (C12N 9/26 C12R 1:69) (C12N 9/26 C12R 1:72) (C12N 9/26 C12R 1: 645) (C12N 9/26 C12R 1: 865) (C12N 9/26 C12R 1:19) (C12N 9/26 C12R 1:22) (C12N 9/26 C12R 1: 665) (C12N 9/26 C12R 1: 685) (C12N 9/26 C12R 1:66) (C12N 9/26 C12R 1: 785) (C12N 9/26 C12R 1:84) (C12N 9/26 C12R 1:78)

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】ペニシリウム属、アスペルギルス属、ムコ
ール属、ピキア属、ハンセニュラ属、カンジダ属、ロド
スポリジウム属、サッカロミセス属、エシェリヒア属、
またはクレブジエラ属に属する微生物由来の、トレハラ
ーゼ。1. A Penicillium genus, Aspergillus genus, Mucor genus, Pichia genus, Hansenula genus, Candida genus, Rhodosporidium genus, Saccharomyces genus, Escherichia genus,
Or trehalase derived from a microorganism belonging to the genus Klebziella. 【請求項２】下記の酵素学的性質を有する、請求項１記
載のトレハラーゼ。 (1) 作用：トレハロースを分解して二分子のグルコース
を生成。 (2) 基質特異性：α，α−１，１結合を有するトレハロ
ースのみに作用。 (3) 至適ｐＨ：４〜５の酸性域 (4) 逆反応性を有し、高グルコース濃度においても耐糖
性である。2. The trehalase according to claim 1, which has the following enzymatic properties. (1) Action: Decomposes trehalose to produce two molecules of glucose. (2) Substrate specificity: Acts only on trehalose having α, α-1,1 bond. (3) Optimum pH: acidic range of 4 to 5 (4) It has reverse reactivity and is glucose resistant even at high glucose concentration. 【請求項３】下記の酵素学的性質をさらに有する請求項
２記載のトレハラーゼ。 ・安定ｐＨ：６．０以下 ・至適温度：４０〜４５℃ ・温度安定性：５０℃、３０分で１００％残存 ・分子量：１６９０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ・等電点：５．１ ・エンドグリコシダ−ゼＨで分解を受ける糖鎖を有する3. The trehalase according to claim 2, which further has the following enzymatic properties. -Stable pH: 6.0 or less-Optimum temperature: 40 to 45 ° C-Temperature stability: 50 ° C, 100% remaining after 30 minutes-Molecular weight: 169000 (SDS-PAGE) -Isoelectric point: 5.1-End Has a sugar chain that is degraded by glycosidase H 【請求項４】下記の酵素学的性質をさらに有する請求項
２記載のトレハラーゼ。 ・安定ｐＨ：６．５以下 ・至適温度：約４０℃ ・温度安定性：５０℃、３０分で１００％残存 ・分子量：１５５０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ・等電点：３．９ ・エンドグリコシダ−ゼＨで分解を受ける糖鎖を有する4. The trehalase according to claim 2, which further has the following enzymatic properties.・ Stable pH: 6.5 or less ・ Optimal temperature: about 40 ° C ・ Temperature stability: 50 ° C, 100% remaining in 30 minutes ・ Molecular weight: 155000 (SDS-PAGE) ・ Isoelectric point: 3.9 ・ Endoglyco Has a sugar chain that is degraded by sidase H 【請求項５】下記の酵素学的性質をさらに有する請求項
２記載のトレハラーゼ。 ・安定ｐＨ：７．０以下 ・至適温度：約３５℃ ・温度安定性：５０℃、３０分で８０％残存 ・分子量：１４５０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ・等電点：３．９5. The trehalase according to claim 2, which further has the following enzymatic properties.・ Stable pH: 7.0 or less ・ Optimal temperature: about 35 ° C ・ Temperature stability: 50 ° C, 80% remaining in 30 minutes ・ Molecular weight: 145000 (SDS-PAGE) ・ Isoelectric point: 3.9 【請求項６】下記の酵素学的性質をさらに有する請求項
２記載のトレハラーゼ。 ・安定ｐＨ：５．０以下 ・至適温度：約４０℃ ・温度安定性：５０℃、３０分で３０％残存 ・分子量：１６３０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ・等電点：４．７6. The trehalase according to claim 2, which further has the following enzymatic properties.・ Stable pH: 5.0 or less ・ Optimal temperature: about 40 ° C ・ Temperature stability: 50 ° C, 30% remaining in 30 minutes ・ Molecular weight: 163000 (SDS-PAGE) ・ Isoelectric point: 4.7 【請求項７】ペニシリウム・シトリナム、ペニシリウム
・パープレッセンス、ペニシリウム・スピヌロスム、ペ
ニシリウム・トルツビンスキ、およびペニシリウム・ｓ
ｐ．Ｃ３２０が属する種に属する微生物、 アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・アワモリ、
アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ソーエ、ア
スペルギルス・テレウス、アスペルギルス・カーボナリ
ウス、 ムコール・ラセモサス、 ピキア・アカシエ、ピキア・ナカザワエ、 ハンセニュラ・アノマラ、 カンジダ・トロピカリス、 ロドスポリジウム・トルロイデス、 サッカロミセス・セレビシエ、 エシェリヒア・コリ、またはクレブジエラ・オキシト
カ、クレブジエラ・テリゲナ由来の、請求項２記載のト
レハラーゼ。7. Penicillium citrinum, Penicillium perpressens, Penicillium spinulosum, Penicillium tortubinski, and Penicillium s.
p. Microorganisms belonging to the species to which C320 belongs, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori,
Aspergillus niger, Aspergillus sohe, Aspergillus terreus, Aspergillus carbonarius, Mucor racemosus, Pichia acacie, Pichia nakazawae, Hansenula anomala, Candida tropicaris, Rhodes polydium toruroydes, saccharomyces cerevisiae cerevisiae cerevisiae cerevisiae cerevisia cerevisae Or trehalase according to claim 2, which is derived from Klebziella oxytoca or Klebziella terrigena. 【請求項８】ペニシリウム・シトリナムＩＦＯ４６３１
株、ペニシリウム・パープレッセンスＩＡＭ７０２８
株、ペニシリウム・スピヌロスムＩＡＭ７０４９株、ペ
ニシリウム・トルツビンスキＩＡＭ７１８５株、ペニシ
リウム・ｓｐ．Ｃ３２０株、 アスペルギルス・オリゼＩＦＯ４０７５株、ＪＣＭ２０
６７株、ＪＣＭ２２２６株、ＪＣＭ２２３６株、または
ＪＣＭ２２４２株、アスペルギルス・アワモリＩＦＯ４
０３３株、アスペルギルス・ニガーＪＣＭ５５４８株、
ＪＣＭ５５４９株、またはＩＦＯ６０６８株、アスペル
ギルス・ソーエＩＦＯ４３８６株、アスペルギルス・テ
レウスＩＦＯ６１２３株、ＩＦＯ６３４６株、またはＪ
ＣＭ２５９８株、アスペルギルス・カーボナリウスＩＦ
Ｏ５８６４株、 ムコール・ラセモサスＩＦＯ４５８１株、 ピキア・アカシエＩＦＯ１６８１株、ピキア・ナカザワ
エＩＦＯ１６６９株、 ハンセニュラ・アノマラＩＦＯ０７２１株、 カンジダ・トロピカリスＪＣＭ１５４１株、 ロドスポリジウム・トルロイデスＩＦＯ８７６６株、 サッカロミセス・セレビシエＡＴＣＣ９７６７株、 エシェリヒア・コリＩＦＯ１６４９株、 クレブジエラ・オキシトカＪＣＭ１６６５株、またはク
レブジエラ・テリゲナＪＣＭ１６８７株由来の請求項７
記載のトレハラーゼ。8. A Penicillium citrinum IFO 4631.
Strain, Penicillium perpressens IAM7028
Strains, Penicillium spinulinum IAM7049 strain, Penicillium tortubinski IAM7185 strain, Penicillium sp. C320 strain, Aspergillus oryzae IFO4075 strain, JCM20
67 strains, JCM2226 strain, JCM2236 strain, or JCM2242 strain, Aspergillus awamori IFO4
033 strain, Aspergillus niger JCM5548 strain,
JCM5549 strain, or IFO6068 strain, Aspergillus soue IFO4386 strain, Aspergillus terreus IFO6123 strain, IFO6346 strain, or J
CM2598 strain, Aspergillus carbonarius IF
O5864 strain, Mucor racemosus IFO4581 strain, Pichia acacie IFO1681 strain, Pichia nakazawae IFO1669 strain, Hansenula anomala IFO0721 strain, Candida tropicalis JCM1541 strain, Rhodosporidium toluroides IFO87766 strain, Saccharomyces cerevisiae strain, Saccharomyces cerevisiae. Claim 7 derived from E. coli IFO1649 strain, Klebziella oxytoca JCM1665 strain, or Klebziella terrigena JCM1687 strain
The described trehalase. 【請求項９】アスペルギルス・オリゼＪＣＭ２２４２
株、アスペルギルス・オリゼＩＦＯ４０７５株、ピキア
・ナカザワエＩＦＯ１６６９株、またはペニシリウム・
ｓｐ．Ｃ３２０株由来のトレハラーゼ。9. Aspergillus oryzae JCM2242
Strain, Aspergillus oryzae IFO4075 strain, Pichia Nakazawae IFO1669 strain, or Penicillium
sp. Trehalase derived from C320 strain. 【請求項１０】請求項１〜５いずれか一項記載のトレハ
ラーゼと、グルコースとを接触させる工程を含んでな
る、α，α−トレハロースの製造法。10. A method for producing α, α-trehalose, which comprises the step of contacting trehalase according to any one of claims 1 to 5 with glucose. 【請求項１１】ペニシリウム・ｓｐ．Ｃ３２０株。11. Penicillium sp. C320 strain.