JPH05268963A - Ｄｎａの固相抽出精製 - Google Patents
Ｄｎａの固相抽出精製Info
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- JPH05268963A JPH05268963A JP4113578A JP11357892A JPH05268963A JP H05268963 A JPH05268963 A JP H05268963A JP 4113578 A JP4113578 A JP 4113578A JP 11357892 A JP11357892 A JP 11357892A JP H05268963 A JPH05268963 A JP H05268963A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
- C07H1/08—Separation; Purification from natural products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、あらゆる形態のあらゆる源からＤ
ＮＡを精製する方法を提供する。 【構成】 本発明の方法は、ＤＮＡの精製において水溶
性有機溶媒を使用することからなる。水溶性有機溶媒、
例えばエタノール、プロパノール、およびイソプロパノ
ールを使用することにより、ＤＮＡは高い回収率をもっ
て精製される。さらに水溶性有機溶媒の使用により、カ
オトロプのような腐食性かつ有毒な組成物の使用が避け
られる。
ＮＡを精製する方法を提供する。 【構成】 本発明の方法は、ＤＮＡの精製において水溶
性有機溶媒を使用することからなる。水溶性有機溶媒、
例えばエタノール、プロパノール、およびイソプロパノ
ールを使用することにより、ＤＮＡは高い回収率をもっ
て精製される。さらに水溶性有機溶媒の使用により、カ
オトロプのような腐食性かつ有毒な組成物の使用が避け
られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は分子生物学の分野に関す
る。特に、本発明はデオキシリボ核酸の精製の分野に関
する。
る。特に、本発明はデオキシリボ核酸の精製の分野に関
する。
【０００２】
【従来の技術】分子生物学および関連する学問分野の絶
え間ない進歩は、前進した技術を十分に理解しおよび発
展させるために、改良された手段を継続的に必要とす
る。
え間ない進歩は、前進した技術を十分に理解しおよび発
展させるために、改良された手段を継続的に必要とす
る。
【０００３】様々な技術に、デオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）を種々の形態で使用することが含まれる。例えば、
組換えＤＮＡ技術の領域の進歩は、常にＤＮＡをプロー
ブ、ゲノムＤＮＡ、およびプラスミドＤＮＡの形状で用
いることを要求する。
Ａ）を種々の形態で使用することが含まれる。例えば、
組換えＤＮＡ技術の領域の進歩は、常にＤＮＡをプロー
ブ、ゲノムＤＮＡ、およびプラスミドＤＮＡの形状で用
いることを要求する。
【０００４】診断分野の進歩もまた、ＤＮＡを種々の方
法で用い続けている。例えば、ＤＮＡプローブは、ヒト
の病原因子の検出および診断に日常的に用いられてい
る。同様にＤＮＡは遺伝疾患の検出に用いられている。
ＤＮＡはまた食品汚染の検出にも用いられている。さら
に、ＤＮＡは遺伝地図の作製からクローニングおよび組
換え発現におよぶ種々の理由により、興味あるＤＮＡの
位置確認、同定および単離において日常的に用いられて
いる。
法で用い続けている。例えば、ＤＮＡプローブは、ヒト
の病原因子の検出および診断に日常的に用いられてい
る。同様にＤＮＡは遺伝疾患の検出に用いられている。
ＤＮＡはまた食品汚染の検出にも用いられている。さら
に、ＤＮＡは遺伝地図の作製からクローニングおよび組
換え発現におよぶ種々の理由により、興味あるＤＮＡの
位置確認、同定および単離において日常的に用いられて
いる。
【０００５】多くの場合、ＤＮＡは極めて少量でしか入
手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要
する。このしばしば時間を浪費する煩雑な操作はＤＮＡ
の損失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアの
カルチャーから得られた試料のＤＮＡの精製において
は、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じると
いう危険性も加わる。
手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要
する。このしばしば時間を浪費する煩雑な操作はＤＮＡ
の損失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアの
カルチャーから得られた試料のＤＮＡの精製において
は、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じると
いう危険性も加わる。
【０００６】典型的なＤＮＡ精製手法には、腐食性で有
毒な組成物の使用が含まれる。典型的なＤＮＡ精製手法
は、高濃度のカオトロピック塩（例えばヨウ化ナトリウ
ムおよび過塩素酸ナトリウム）を使用する。
毒な組成物の使用が含まれる。典型的なＤＮＡ精製手法
は、高濃度のカオトロピック塩（例えばヨウ化ナトリウ
ムおよび過塩素酸ナトリウム）を使用する。
【０００７】ＤＮＡの精製には多くの手法が存在する。
ＤＮＡ精製分野での最近の活動が示しているように、最
適なＤＮＡ精製手法を求めて絶え間無い探究が行われて
いる。米国特許第４，９２３，９７８号に開示されてい
るＤＮＡの精製法では、蛋白質とＤＮＡの溶液を水酸基
を持たせた支持体に通過させて蛋白質を結合させ、そし
てＤＮＡを溶出している。米国特許第４，９３５，３４
２号で開示されているＤＮＡの精製法では、ＤＮＡを選
択的に陰イオン交換体に結合させ、つづいて溶出してい
る。米国特許第４，９４６，９５２号は、水溶性のケト
ンで沈澱させることよりなるＤＮＡの単離法を開示して
いる。カオトロピック剤を用いたＤＮＡの精製手法およ
び透析されたＤＮＡが、米国特許第４，９００，６７７
号に開示されている。
ＤＮＡ精製分野での最近の活動が示しているように、最
適なＤＮＡ精製手法を求めて絶え間無い探究が行われて
いる。米国特許第４，９２３，９７８号に開示されてい
るＤＮＡの精製法では、蛋白質とＤＮＡの溶液を水酸基
を持たせた支持体に通過させて蛋白質を結合させ、そし
てＤＮＡを溶出している。米国特許第４，９３５，３４
２号で開示されているＤＮＡの精製法では、ＤＮＡを選
択的に陰イオン交換体に結合させ、つづいて溶出してい
る。米国特許第４，９４６，９５２号は、水溶性のケト
ンで沈澱させることよりなるＤＮＡの単離法を開示して
いる。カオトロピック剤を用いたＤＮＡの精製手法およ
び透析されたＤＮＡが、米国特許第４，９００，６７７
号に開示されている。
【０００８】現在知られているＤＮＡ精製手法はその目
的を達成することが可能であるとは言え、そのような腐
食性で有毒な化合物（例えば最もしばしば用いられるカ
オトロピック剤）の使用なしにＤＮＡを精製し、かつ増
大量のＤＮＡを取得できることが望ましい。
的を達成することが可能であるとは言え、そのような腐
食性で有毒な化合物（例えば最もしばしば用いられるカ
オトロピック剤）の使用なしにＤＮＡを精製し、かつ増
大量のＤＮＡを取得できることが望ましい。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は非腐食性で非
毒性の溶媒を用いることよりなるＤＮＡの精製法を提供
する。
毒性の溶媒を用いることよりなるＤＮＡの精製法を提供
する。
【００１０】本発明の一態様においては、水溶性有機溶
媒を添加してＤＮＡを親水性表面に結合させることより
なる、溶液からＤＮＡを精製する方法が提供される。
媒を添加してＤＮＡを親水性表面に結合させることより
なる、溶液からＤＮＡを精製する方法が提供される。
【００１１】好ましい態様においては、次の工程からな
る溶液からのＤＮＡの精製方法が提供される： (a) 親水性表面を溶液に添加する； (b) 水溶性有機溶媒を添加する； (c) 工程(a) および(b) からのＤＮＡ溶液を液体画分と
非液体画分に分離する； (d) 工程(c) の非液体画分を洗浄する； (e) 工程(d) の非液体画分から液体画分を除去する； (f) (e) の非液体画分からＤＮＡを遊離させる。
る溶液からのＤＮＡの精製方法が提供される： (a) 親水性表面を溶液に添加する； (b) 水溶性有機溶媒を添加する； (c) 工程(a) および(b) からのＤＮＡ溶液を液体画分と
非液体画分に分離する； (d) 工程(c) の非液体画分を洗浄する； (e) 工程(d) の非液体画分から液体画分を除去する； (f) (e) の非液体画分からＤＮＡを遊離させる。
【００１２】本発明は、より大量の精製ＤＮＡを得るた
めに特に有用である。加えて、ＤＮＡは任意の親水性表
面に結合させて精製することができる。また、精製は室
温で好適に行うことができる。
めに特に有用である。加えて、ＤＮＡは任意の親水性表
面に結合させて精製することができる。また、精製は室
温で好適に行うことができる。
【００１３】本発明は任意のＤＮＡ精製手法で提唱され
ている結合バッファーの代わりに水溶性有機溶媒を用い
て行うことができる。本明細書中で用いられる「精製」
とは実質的に細胞屑その他を含まないＤＮＡを取得する
ことを意味する。
ている結合バッファーの代わりに水溶性有機溶媒を用い
て行うことができる。本明細書中で用いられる「精製」
とは実質的に細胞屑その他を含まないＤＮＡを取得する
ことを意味する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】ＤＮＡの精製または単離
工程の出発時には、どの場合も所望のＤＮＡを供給源か
ら取得することが必要である。血清、尿およびバクテリ
アのカルチャー等の試料からＤＮＡを得る典型的手法は
よく知られており、日常的方法で行うことができる。同
様にゲノムライブラリー等からＤＮＡを得る技術も日常
的方法が知られている。
工程の出発時には、どの場合も所望のＤＮＡを供給源か
ら取得することが必要である。血清、尿およびバクテリ
アのカルチャー等の試料からＤＮＡを得る典型的手法は
よく知られており、日常的方法で行うことができる。同
様にゲノムライブラリー等からＤＮＡを得る技術も日常
的方法が知られている。
【００１５】本発明は個々の供給源から得られたＤＮＡ
の精製に関する。本発明の実施に際してＤＮＡの起源は
キーポイントではない。発明のキーポイントは供給源か
ら取得した後にＤＮＡを精製する能力である。ＤＮＡを
得るための典型的方法は、ＤＮＡを溶液中に懸濁させた
段階で終わっている。生物学的サンプルからＤＮＡを単
離するための文献には次のものが含まれる：Ｈａｒｄｉ
ｎｇ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．，Ｂｅｂｅ
ｅ，Ｒ．，Ｓｉｍｍｓ，Ｄ．，Ｋｔｅｖａｎ，Ｌ．，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：
６９４７（１９８９）およびＭａｒｋｏ，Ｍ．Ａ．，Ｃ
ｈｉｐｐｅｒｆｉｅｌｄ，Ｒ．，およびＢｉｒｎｂｏｉ
ｍ，Ｈ．Ｃ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，１２１：３８２（１９８２）。プラスミド
ＤＮＡの単離方法は、Ｌｕｔｚｅ，Ｌ．Ｈ．，Ｗｉｎｅ
ｇａｒ，Ｒ．Ａ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ２０：６１５０（１９９０）に記載され
ている。生物学的サンプルからの二本鎖ＤＮＡの抽出
は、Ｙａｍａｄａ，Ｏ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．，
Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｈａｇｒｉ，Ｓ．，Ｋａｍ
ａｈｏｒａ，Ｔ．，Ｕｅｙａｍａ，Ｈ．，Ｋｉｓｈｉ，
Ｙ．，Ｕｅｍｕｒａ Ｈ．，Ｋｕｒｉｍｕｒａ，Ｔ．，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ２７：２０３（１９９０）に記載されてい
る。大部分のＤＮＡ溶液は、ＤＮＡを適当なバッファー
（例えばＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ）、ＴＥＡバッファー
（４０mMトリス−酢酸，１mM ＥＤＴＡ））中またはラ
イゼート中に含んでいる。
の精製に関する。本発明の実施に際してＤＮＡの起源は
キーポイントではない。発明のキーポイントは供給源か
ら取得した後にＤＮＡを精製する能力である。ＤＮＡを
得るための典型的方法は、ＤＮＡを溶液中に懸濁させた
段階で終わっている。生物学的サンプルからＤＮＡを単
離するための文献には次のものが含まれる：Ｈａｒｄｉ
ｎｇ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．，Ｂｅｂｅ
ｅ，Ｒ．，Ｓｉｍｍｓ，Ｄ．，Ｋｔｅｖａｎ，Ｌ．，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：
６９４７（１９８９）およびＭａｒｋｏ，Ｍ．Ａ．，Ｃ
ｈｉｐｐｅｒｆｉｅｌｄ，Ｒ．，およびＢｉｒｎｂｏｉ
ｍ，Ｈ．Ｃ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，１２１：３８２（１９８２）。プラスミド
ＤＮＡの単離方法は、Ｌｕｔｚｅ，Ｌ．Ｈ．，Ｗｉｎｅ
ｇａｒ，Ｒ．Ａ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ２０：６１５０（１９９０）に記載され
ている。生物学的サンプルからの二本鎖ＤＮＡの抽出
は、Ｙａｍａｄａ，Ｏ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．，
Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｈａｇｒｉ，Ｓ．，Ｋａｍ
ａｈｏｒａ，Ｔ．，Ｕｅｙａｍａ，Ｈ．，Ｋｉｓｈｉ，
Ｙ．，Ｕｅｍｕｒａ Ｈ．，Ｋｕｒｉｍｕｒａ，Ｔ．，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ２７：２０３（１９９０）に記載されてい
る。大部分のＤＮＡ溶液は、ＤＮＡを適当なバッファー
（例えばＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ）、ＴＥＡバッファー
（４０mMトリス−酢酸，１mM ＥＤＴＡ））中またはラ
イゼート中に含んでいる。
【００１６】ＤＮＡを適当な溶液中に取得した後、典型
的には結合マトリックスをこの溶液に添加する。一般に
用いられる結合マトリックスは、ガラスまたは珪そう土
の形態のシリカである。
的には結合マトリックスをこの溶液に添加する。一般に
用いられる結合マトリックスは、ガラスまたは珪そう土
の形態のシリカである。
【００１７】結合マトリックスをＤＮＡの溶液に添加し
た後、結合バッファーを添加する。本発明は、結合バッ
ファーとして水溶性有機溶媒を使用する。「水溶性有機
溶媒」とは、ＤＮＡを溶液の状態に保持することを可能
にする有機特性を有することを意味する。
た後、結合バッファーを添加する。本発明は、結合バッ
ファーとして水溶性有機溶媒を使用する。「水溶性有機
溶媒」とは、ＤＮＡを溶液の状態に保持することを可能
にする有機特性を有することを意味する。
【００１８】粒子、ビーズ、その他の親水性表面を用い
て本発明を実施する好ましい工程は、結合工程、洗浄工
程、乾燥工程および溶出工程を含んでいる。結合工程は
一般に、ＤＮＡを含有する溶液への親水性表面の添加、
水溶性有機溶媒からなる溶液の添加（親水性表面および
水溶性有機溶媒の添加順序は重要ではない）、撹拌、遠
心分離、および液体画分の除去を含んでいる。結合工程
は、通常、少なくとも一回反復される。洗浄工程は、一
般に、溶媒を除去するための洗浄バッファーの添加（例
えば５０％エタノールおよび５０％（４０mM トリス，
４mM ＥＤＴＡ，０．８Ｎ ＮａＣｌ，ｐＨ７．
４））、撹拌、遠心分離、および液体の除去を含んでい
る。乾燥工程は、一般に、約４０−７０℃で約２ないし
２０分間乾燥することよりなる。溶出工程は、一般に、
溶出バッファーの添加（表面からＤＮＡを遊離させるた
め：例えば（１０mM トリス，１mM ＥＤＴＡ，ｐＨ
８．０））、約３０秒間の渦巻撹拌、約４０−７０℃に
おける約１０分間の加熱、約２分間の遠心分離および液
体の回収を含んでいる。この時点で液体中にＤＮＡが含
まれる。この溶出工程は通常少なくとも１回反復され
る。
て本発明を実施する好ましい工程は、結合工程、洗浄工
程、乾燥工程および溶出工程を含んでいる。結合工程は
一般に、ＤＮＡを含有する溶液への親水性表面の添加、
水溶性有機溶媒からなる溶液の添加（親水性表面および
水溶性有機溶媒の添加順序は重要ではない）、撹拌、遠
心分離、および液体画分の除去を含んでいる。結合工程
は、通常、少なくとも一回反復される。洗浄工程は、一
般に、溶媒を除去するための洗浄バッファーの添加（例
えば５０％エタノールおよび５０％（４０mM トリス，
４mM ＥＤＴＡ，０．８Ｎ ＮａＣｌ，ｐＨ７．
４））、撹拌、遠心分離、および液体の除去を含んでい
る。乾燥工程は、一般に、約４０−７０℃で約２ないし
２０分間乾燥することよりなる。溶出工程は、一般に、
溶出バッファーの添加（表面からＤＮＡを遊離させるた
め：例えば（１０mM トリス，１mM ＥＤＴＡ，ｐＨ
８．０））、約３０秒間の渦巻撹拌、約４０−７０℃に
おける約１０分間の加熱、約２分間の遠心分離および液
体の回収を含んでいる。この時点で液体中にＤＮＡが含
まれる。この溶出工程は通常少なくとも１回反復され
る。
【００１９】本発明をフィルターのような親水性表面で
実施するには、好ましい工程は結合工程、洗浄工程およ
び溶出工程を含む。結合工程は一般に、ＤＮＡを含有す
る溶液への水溶性有機溶媒の添加、生じた溶液のフィル
ターへの通過（典型的には、ブロッターのウェル、また
は他の任意の濾過システム（例えば、シリンジ濾過器）
を用いる）、および所望によりこのフィルターに水溶性
有機溶媒を通過させることを含んでいる。濾過の後フィ
ルターを軽く風乾する（約１分間）。洗浄工程は、一般
に、フィルターへバッファーを通過させること（溶媒を
除去するため）からなる。一般に、このフィルターを軽
く風乾する（約１分間）。溶出工程は一般にフィルター
からＤＮＡを除去することからなる。溶液に接触したフ
ィルターの部分を切り取って遠心管に入れる。次に、溶
出バッファー（フィルターからＤＮＡを遊離させるた
め）を添加して、約４０−６０℃で約１０分間加熱す
る。そして、ＤＮＡを含んだ液体を取り出す。
実施するには、好ましい工程は結合工程、洗浄工程およ
び溶出工程を含む。結合工程は一般に、ＤＮＡを含有す
る溶液への水溶性有機溶媒の添加、生じた溶液のフィル
ターへの通過（典型的には、ブロッターのウェル、また
は他の任意の濾過システム（例えば、シリンジ濾過器）
を用いる）、および所望によりこのフィルターに水溶性
有機溶媒を通過させることを含んでいる。濾過の後フィ
ルターを軽く風乾する（約１分間）。洗浄工程は、一般
に、フィルターへバッファーを通過させること（溶媒を
除去するため）からなる。一般に、このフィルターを軽
く風乾する（約１分間）。溶出工程は一般にフィルター
からＤＮＡを除去することからなる。溶液に接触したフ
ィルターの部分を切り取って遠心管に入れる。次に、溶
出バッファー（フィルターからＤＮＡを遊離させるた
め）を添加して、約４０−６０℃で約１０分間加熱す
る。そして、ＤＮＡを含んだ液体を取り出す。
【００２０】適する水溶性有機溶液には、エタノール、
プロパノール、イソプロパノールおよびアセトニトリル
が含まれる。本発明の実施のためには水溶性有機溶媒を
種々の濃度で用いることもできる。好ましくは、溶媒は
１００％イソプロパノール、エタノールまたはプロパノ
ールである。最も好ましくは、溶媒はイソプロパノール
である。水溶性有機溶媒の適する濃度は、エタノール、
プロパノール、イソプロパノール、およびアセトニトリ
ルの１％ないし１００％溶液を包含する。好ましくは、
その濃度は２０％ないし８０％である。最も好ましく
は、この濃度は４０ないし６０％である。典型的には、
溶媒の濃度を種々に低下させることは水によるが、しか
しながら、複数溶媒の組み合わせを用いることもでき
る。溶媒の好ましい組み合わせには、イソプロパノール
とエタノール、イソプロパノールとプロパノール、およ
びプロパノールとエタノールが含まれる。
プロパノール、イソプロパノールおよびアセトニトリル
が含まれる。本発明の実施のためには水溶性有機溶媒を
種々の濃度で用いることもできる。好ましくは、溶媒は
１００％イソプロパノール、エタノールまたはプロパノ
ールである。最も好ましくは、溶媒はイソプロパノール
である。水溶性有機溶媒の適する濃度は、エタノール、
プロパノール、イソプロパノール、およびアセトニトリ
ルの１％ないし１００％溶液を包含する。好ましくは、
その濃度は２０％ないし８０％である。最も好ましく
は、この濃度は４０ないし６０％である。典型的には、
溶媒の濃度を種々に低下させることは水によるが、しか
しながら、複数溶媒の組み合わせを用いることもでき
る。溶媒の好ましい組み合わせには、イソプロパノール
とエタノール、イソプロパノールとプロパノール、およ
びプロパノールとエタノールが含まれる。
【００２１】本発明の実施に用いるために適する結合マ
トリックスには、任意の親水性表面が含まれる。本発明
の実施の使用に適する親水性表面の例には、ニトロセル
ロース、セライト珪そう土、シリカポリマー、グラスフ
ァイバー、珪酸マグネシウム、シリコーン窒素化合物
（例えばＳｉＮ4 ）、珪酸アルミニウム、および二酸化
珪素が含まれる。親水性表面が有することのできる多く
の形状も本発明における使用に適する。親水性表面の適
する形状には、ビーズ、ポリマー、粒子、およびフィル
ター（例えば膜）が含まれる。
トリックスには、任意の親水性表面が含まれる。本発明
の実施の使用に適する親水性表面の例には、ニトロセル
ロース、セライト珪そう土、シリカポリマー、グラスフ
ァイバー、珪酸マグネシウム、シリコーン窒素化合物
（例えばＳｉＮ4 ）、珪酸アルミニウム、および二酸化
珪素が含まれる。親水性表面が有することのできる多く
の形状も本発明における使用に適する。親水性表面の適
する形状には、ビーズ、ポリマー、粒子、およびフィル
ター（例えば膜）が含まれる。
【００２２】結合バッファー、例えばよく知られている
カオトロピック剤は、その水和性のため溶液中のＤＮＡ
を親水性表面に結合させると信じられる。カオトロピッ
ク剤の水和性は、水の分子とＤＮＡとの相互作用を低下
させると信じられる。そのため、ＤＮＡと親水性表面を
取り囲む水の分子との相互作用が強いられ、このことが
水素結合による親水性表面へのＤＮＡの結合を生じさせ
ると信じられる。
カオトロピック剤は、その水和性のため溶液中のＤＮＡ
を親水性表面に結合させると信じられる。カオトロピッ
ク剤の水和性は、水の分子とＤＮＡとの相互作用を低下
させると信じられる。そのため、ＤＮＡと親水性表面を
取り囲む水の分子との相互作用が強いられ、このことが
水素結合による親水性表面へのＤＮＡの結合を生じさせ
ると信じられる。
【００２３】理論により拘束や制限を受けることは望ま
ないが、本発明は水溶性有機溶媒を「結合バッファー」
として用いることにより、ＤＮＡ溶液の水溶液としての
特性を低下させると信じられる。ＤＮＡ溶液の水溶液と
しての特性を減じることにより、ＤＮＡと親水性表面と
の相互作用が強いられ、これにより固相抽出が奏される
と信じられる。これに加え、後記実施例で証明するよう
に、本発明は親水性表面への結合を介して精製が行わ
れ、精製は沈澱によるものではない。
ないが、本発明は水溶性有機溶媒を「結合バッファー」
として用いることにより、ＤＮＡ溶液の水溶液としての
特性を低下させると信じられる。ＤＮＡ溶液の水溶液と
しての特性を減じることにより、ＤＮＡと親水性表面と
の相互作用が強いられ、これにより固相抽出が奏される
と信じられる。これに加え、後記実施例で証明するよう
に、本発明は親水性表面への結合を介して精製が行わ
れ、精製は沈澱によるものではない。
【００２４】本発明は、多様な供給源からおよび多様な
形態のＤＮＡの精製に用いることができる。精製のため
のＤＮＡの供給源には、バクテリア、バクテリオファー
ジ、標本、植物、動物、およびその他が含まれる。ＤＮ
Ａは多様な形態で見出され、そのような形態には一本
鎖、二本鎖、環状、および直鎖状が含まれる。本発明は
任意の供給源からの任意の形態のＤＮＡについて実施す
ることができる。
形態のＤＮＡの精製に用いることができる。精製のため
のＤＮＡの供給源には、バクテリア、バクテリオファー
ジ、標本、植物、動物、およびその他が含まれる。ＤＮ
Ａは多様な形態で見出され、そのような形態には一本
鎖、二本鎖、環状、および直鎖状が含まれる。本発明は
任意の供給源からの任意の形態のＤＮＡについて実施す
ることができる。
【００２５】以下の実施例において、本明細書中に説明
されている発明の特定の態様を説明する。当業者に明ら
かなとおり、種々の変更および修飾が可能であり、それ
らは本発明の範囲内である。
されている発明の特定の態様を説明する。当業者に明ら
かなとおり、種々の変更および修飾が可能であり、それ
らは本発明の範囲内である。
【００２６】
【００２７】
【実施例１】この実験は、６Ｍ ＮａＣｌＯ4（プレッ
プ ア ジーン（ｐｒｅｐ−ａ−ｇｅｎｅ））に対する
各結合バッファーの結合特性を比較する。すべての実験
は、プレップ ア ジーン マトリックス（Ｐｒｅｐ−
ａ−ｇｅｎｅキット、バイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）、リッチモンド、ＣＡ）中で行い、結合バッファー
を変える以外は同じ条件で行う。
プ ア ジーン（ｐｒｅｐ−ａ−ｇｅｎｅ））に対する
各結合バッファーの結合特性を比較する。すべての実験
は、プレップ ア ジーン マトリックス（Ｐｒｅｐ−
ａ−ｇｅｎｅキット、バイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）、リッチモンド、ＣＡ）中で行い、結合バッファー
を変える以外は同じ条件で行う。
【００２８】物質 ： ＬＯＴ ＃ ポリエチレングリコール フルカ(フルカケミカル 24718584 MW （ＰＥＧ） コーポレーション、ロンコン、 ＮＹ) 尿素 フィッシャー(フィッシャー 895704 サイエンティフィック、 ノークロス、ＧＡ) ＫＳＣＮ シグマ(シグマケミカル 488-0409 (チオシアン酸 カンパニー、セントルイス、 カリウム) Ｍｏ．) エタノール(EtOH) フィッシャー 902233 ブタノール(BuOH) フィッシャー 890783 グリセロール シグマ 104F-0026 塩酸グアニジン ＢＲＬ 9DB209 水酸化ナトリウム(NaOH) フィッシャー 862699 水酸化アンモニウム フィッシャー 860118 (NH4OH) 硫酸(H2SO4) フィッシャー 860102 アセトニトリル(CH3CN) フィッシャー 890789 酢酸ナトリウム(NaOAc) シグマ S-2889 ロット19F-0010 プレップ ア ジーン バイオラッド コントロール キット 41180 λＤＮＡ ＢＲＬ(ベセスダリサーチ 56125A (503μｇ/803μｌ) ラブズ、グランドアイランド、 ＮＹ)方法 ：１３すべての結合バッファーを同じ条件で使用し
た。
た。
【００２９】各１３サンプルに２０μｌのプレップ ア
ジーン 珪そう土溶液を加えて、次に７５０μｌの結
合バッファーを軽く渦巻撹拌し、そして５分間４５℃に
おいてインキュベートし、２分間遠心分離し、上清を捨
て、そして結合工程を繰り返した。５００μｌの洗浄バ
ッファーで洗浄し、遠心分離し、バッファーを捨て、そ
して繰り返した。２５μｌの溶出バッファーを加えて、
渦巻撹拌し、５分間５０℃においてインキュベートし、
遠心分離し、上清を保管し、そして繰り返した。各１３
サンプルおよび一つのスタンダードをゲル電気泳動し
た。
ジーン 珪そう土溶液を加えて、次に７５０μｌの結
合バッファーを軽く渦巻撹拌し、そして５分間４５℃に
おいてインキュベートし、２分間遠心分離し、上清を捨
て、そして結合工程を繰り返した。５００μｌの洗浄バ
ッファーで洗浄し、遠心分離し、バッファーを捨て、そ
して繰り返した。２５μｌの溶出バッファーを加えて、
渦巻撹拌し、５分間５０℃においてインキュベートし、
遠心分離し、上清を保管し、そして繰り返した。各１３
サンプルおよび一つのスタンダードをゲル電気泳動し
た。
【００３０】以下の結合バッファーを使用のために示
す： １）プレップ ア ジーン キットのスタンダード６Ｍ
ＮａＣｌＯ4（過塩素酸ナトリウム） ２）１０％ ＰＥＧ ３）２０％ ＰＥＧ ４）６Ｍ グリセロール ５）９５％ エタノール ６）１００％ ブタノール ７）６Ｍ ＫＳＣＮ ８）６Ｍ 尿素 ９）８Ｍ 塩酸グアニジン １０）３０％ ＮＨ4ＯＨ １１）１０％ Ｈ2ＳＯ4 １２）１００％ ＣＨ3ＣＮ １３）６Ｍ ＮａＯＡｃ １４）スタンダードλＤＮＡ １３の溶出ＤＮＡサンプルとオリジナルＤＮＡサンプル
（λＤＮＡ）とを比較したゲル電気泳動の結果によれ
ば、エタノールは固相上（プレップ ア ジーンマトリ
ックス）におけるＤＮＡの保持に関して、試験された６
Ｍ過塩素酸ナトリウムおよび他のどの結合バッファーよ
りも優れている。アセトニトリルも良好であった。
す： １）プレップ ア ジーン キットのスタンダード６Ｍ
ＮａＣｌＯ4（過塩素酸ナトリウム） ２）１０％ ＰＥＧ ３）２０％ ＰＥＧ ４）６Ｍ グリセロール ５）９５％ エタノール ６）１００％ ブタノール ７）６Ｍ ＫＳＣＮ ８）６Ｍ 尿素 ９）８Ｍ 塩酸グアニジン １０）３０％ ＮＨ4ＯＨ １１）１０％ Ｈ2ＳＯ4 １２）１００％ ＣＨ3ＣＮ １３）６Ｍ ＮａＯＡｃ １４）スタンダードλＤＮＡ １３の溶出ＤＮＡサンプルとオリジナルＤＮＡサンプル
（λＤＮＡ）とを比較したゲル電気泳動の結果によれ
ば、エタノールは固相上（プレップ ア ジーンマトリ
ックス）におけるＤＮＡの保持に関して、試験された６
Ｍ過塩素酸ナトリウムおよび他のどの結合バッファーよ
りも優れている。アセトニトリルも良好であった。
【００３１】
【実施例２】この実験は、実施例１において得られた結
果を拡張するものである。この実験において、エタノー
ルとＣＨ3ＣＮが良好なＤＮＡ結合バッファーであるこ
とが示された。この実験において、どの程度の％のエタ
ノール、ＣＨ3ＣＮおよびメタノールが結合バッファー
中に存在することができ、そしてＤＮＡの良好な分離お
よび回収が得られるかが測定される。すべての実験はプ
レップ ア ジーンマトリックスを使用して実施され
る。
果を拡張するものである。この実験において、エタノー
ルとＣＨ3ＣＮが良好なＤＮＡ結合バッファーであるこ
とが示された。この実験において、どの程度の％のエタ
ノール、ＣＨ3ＣＮおよびメタノールが結合バッファー
中に存在することができ、そしてＤＮＡの良好な分離お
よび回収が得られるかが測定される。すべての実験はプ
レップ ア ジーンマトリックスを使用して実施され
る。
【００３２】物質： プレップ ア ジーン キット バイオラッド エタノール フィッシャー メタノール フィッシャー ＣＨ3ＣＮ フィッシャー １％アガロースゲル λＤＮＡ ＢＲＬ 56125A，９モル 104 503μｇ(803
μl中)実験 １５画分／実験が使用される結合バッファー中のみを変
更して行われた。洗浄バッファー、溶出バッファーおよ
び固相はすべてプレップ ア ジーン キットのもので
あった。その方法は、実質的に実施例１に教示されたと
おり実施される。１．３μｌのλＤＮＡを各画分におい
て使用する。
μl中)実験 １５画分／実験が使用される結合バッファー中のみを変
更して行われた。洗浄バッファー、溶出バッファーおよ
び固相はすべてプレップ ア ジーン キットのもので
あった。その方法は、実質的に実施例１に教示されたと
おり実施される。１．３μｌのλＤＮＡを各画分におい
て使用する。
【００３３】画分（１００％以外は水で希釈する） １）１００％ エタノール（水溶液） ２）８０％ エタノール（水溶液） ３）６０％ エタノール（水溶液） ４）４０％ エタノール（水溶液） ５）２０％ エタノール（水溶液） ６）１００％ メタノール（水溶液） ７）８０％ メタノール（水溶液） ８）６０％ メタノール（水溶液） ９）４０％ メタノール（水溶液） １０）２０％ メタノール（水溶液） １１）１００％ ＣＨ3ＣＮ（水溶液） １２）８０％ ＣＨ3ＣＮ（水溶液） １３）６０％ ＣＨ3ＣＮ（水溶液） １４）４０％ ＣＨ3ＣＮ（水溶液） １５）２０％ ＣＨ3ＣＮ（水溶液） １５の試験画分から溶出されたＤＮＡはゲル電気泳動に
より分析され、そしてスタンダードＤＮＡサンプル（４
８μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中の１．３μｌのλＤＮ
Ａ）と比較された。その結果、１００％エタノールが最
良の結合バッファーであり、２番目が１００％アセトニ
トリルであった。結合バッファーに付与されたより有機
的な特性がより良好なＤＮＡの保持をもたらす。
より分析され、そしてスタンダードＤＮＡサンプル（４
８μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中の１．３μｌのλＤＮ
Ａ）と比較された。その結果、１００％エタノールが最
良の結合バッファーであり、２番目が１００％アセトニ
トリルであった。結合バッファーに付与されたより有機
的な特性がより良好なＤＮＡの保持をもたらす。
【００３４】
【実施例３】この実験は、結合能力に関して、プロパノ
ール（ＰｒＯＨ）、イソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）お
よびエタノール（ＥｔＯＨ）と、それらの互いの希釈物
並びにＮａＣｌＯ4とを比較している。プレップ ア
ジーン マトリックスに対するＤＮＡの結合への有機的
効果を最大にすることを目的とする。
ール（ＰｒＯＨ）、イソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）お
よびエタノール（ＥｔＯＨ）と、それらの互いの希釈物
並びにＮａＣｌＯ4とを比較している。プレップ ア
ジーン マトリックスに対するＤＮＡの結合への有機的
効果を最大にすることを目的とする。
【００３５】物質： プレップ ア ジーン キット バイオラッド コント
ロール(キット)41492、 マトリックス 40523 λＤＮＡ(503μｇ/803μｌ) BRL 56125A、 9モル 104 １％アガロースゲル ＥｔＯＨ フィッシャー 902233 ＰｒＯＨ フィッシャー 744241 ｉＰｒＯＨ アルドリッヒ 06208T
W ＤＭＳＯ アルドリッヒ 9624HC (ジメチルスルフォキシド)方法 ：１３画分について行われた。各１３画分に使用さ
れた結合バッファーを以下に示す。すべて、結合バッフ
ァー以外はプレップ ア ジーン キット材料を用いて
行われ、そして実質的には実施例１の教示によるプレッ
プ ア ジーン方法を用いて行われた。
ロール(キット)41492、 マトリックス 40523 λＤＮＡ(503μｇ/803μｌ) BRL 56125A、 9モル 104 １％アガロースゲル ＥｔＯＨ フィッシャー 902233 ＰｒＯＨ フィッシャー 744241 ｉＰｒＯＨ アルドリッヒ 06208T
W ＤＭＳＯ アルドリッヒ 9624HC (ジメチルスルフォキシド)方法 ：１３画分について行われた。各１３画分に使用さ
れた結合バッファーを以下に示す。すべて、結合バッフ
ァー以外はプレップ ア ジーン キット材料を用いて
行われ、そして実質的には実施例１の教示によるプレッ
プ ア ジーン方法を用いて行われた。
【００３６】使用された結合バッファー： １） １００％ プロパノール ２） ８０％ プロパノール ２０％ Ｈ2Ｏ ３） １００％ イソプロパノール ４） ８０％ イソプロパノール ２０％ Ｈ2Ｏ ５） １００％ ＤＭＳＯ ６） ８０％ ＤＭＳＯ ２０％ Ｈ2Ｏ ７） ２０％ プロパノール ８０％ エタノール ８） ４０％ プロパノール ６０％ エタノール ９） ６０％ プロパノール ４０％ エタノール １０） ２０％ イソプロパノール ８０％ エタノー
ル １１） ４０％ イソプロパノール ６０％ エタノー
ル １２） ６０％ イソプロパノール ４０％ エタノー
ル １３） プレップ ア ジーン結合バッファー ６Ｍ
ＮａＣｌＯ4 １４） スタンダードＤＮＡ（λＤＮＡ） 溶出されたＤＮＡをゲル電気泳動により分析し、そして
スタンダードＤＮＡサンプルと比較した。その結果、１
００％イソプロパノールが最良の結合バッファーである
ことが示唆される。１００％プロパノールも良好なＤＮ
Ａの保持をもたらした。イソプロパノールおよびプロパ
ノールは水に８０％に希釈することができ、ＤＮＡの保
持をもたらすことができた。この試験により、エタノー
ル中のイソプロパノールおよびプロパノールの％が増加
すると共に保持するＤＮＡの量も増加した。
ル １１） ４０％ イソプロパノール ６０％ エタノー
ル １２） ６０％ イソプロパノール ４０％ エタノー
ル １３） プレップ ア ジーン結合バッファー ６Ｍ
ＮａＣｌＯ4 １４） スタンダードＤＮＡ（λＤＮＡ） 溶出されたＤＮＡをゲル電気泳動により分析し、そして
スタンダードＤＮＡサンプルと比較した。その結果、１
００％イソプロパノールが最良の結合バッファーである
ことが示唆される。１００％プロパノールも良好なＤＮ
Ａの保持をもたらした。イソプロパノールおよびプロパ
ノールは水に８０％に希釈することができ、ＤＮＡの保
持をもたらすことができた。この試験により、エタノー
ル中のイソプロパノールおよびプロパノールの％が増加
すると共に保持するＤＮＡの量も増加した。
【００３７】多量の高分子量のＤＮＡ（電気泳動の始点
にほぼ近い位置のＤＮＡ）はｉＰｒＯＨ（１００％）を
用いると保持し、これは使用された結合バッファー中で
最も高かった。ＤＭＳＯはＤＮＡを保持しなかった。
にほぼ近い位置のＤＮＡ）はｉＰｒＯＨ（１００％）を
用いると保持し、これは使用された結合バッファー中で
最も高かった。ＤＭＳＯはＤＮＡを保持しなかった。
【００３８】以下に、結合バッファーがＤＮＡを保持す
る能力に関して、スタンダードと比較して好ましいもの
から順にゲル電気泳動の分析に基づく結果を集約する。
る能力に関して、スタンダードと比較して好ましいもの
から順にゲル電気泳動の分析に基づく結果を集約する。
【００３９】ＤＮＡを保持するもの 保持しないもの １）ｉＰｒＯＨ １０％ ＰＥＧ ２）ＥｔＯＨ ２０％ ＰＥＧ ３）６Ｍ ＮａＣｌＯ4 ６Ｍ グリセロール ４）６０％ ｉＰｒＯＨ ４０％ ＥｔＯＨ ６Ｍ 尿素 ５）６０％ ＰｒＯＨ ４０％ ＥｔＯＨ ３０％ ＮＨ4ＯＨ ６）ＰｒＯＨ １０％ Ｈ2ＳＯ4 ７）Ａ）４０％ ｉＰｒＯＨ ６０％ ＥｔＯＨ ６Ｍ ＮａＯＡＣ Ｂ）４０％ ＰｒＯＨ ６０％ ＥｔＯＨ ８）Ａ）８０％ ｉＰｒＯＨ ２０％ Ｈ2Ｏ ＭｅＯＨ １００％ Ｂ）８０％ ＰｒＯＨ ２０％ Ｈ2Ｏ または水による希釈液 ９）Ａ）２０％ ＰｒＯＨ ８０％ ＥｔＯＨ １００％未満のＥｔＯＨ Ｂ）２０％ ＰｒＯＨ ８０％ ＥｔＯＨ １０）８Ｍ塩酸グアニジン １００％未満のＣＨ3ＣＮ １１）６Ｍ ＫＳＣＮ １００％未満のＤＭＳＯ １２）ＣＨ3ＣＮ １３）ＮａＩ １４）ＢｕＯＨ １５）６Ｍ グアニジンＨＳＣＮ １６）６Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4 １７）６Ｍ ＮａＣｌ
【００４０】
【実施例４】この実験は、さまざまなフィルター（膜）
に対するＤＮＡの固着能力に関して、結合バッファーＮ
ａＯ3ＣｌとｉＰｒＯＨを比較している。
に対するＤＮＡの固着能力に関して、結合バッファーＮ
ａＯ3ＣｌとｉＰｒＯＨを比較している。
【００４１】物質：ゲルマンサイエンス（Ｇｅｌｍａｎ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）フィルター（ゲルマン
サイエンス社、アンアーバー、ＭＩ）タイプＡＥグラス
フィルター（ロット６０３２０２）。
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）フィルター（ゲルマン
サイエンス社、アンアーバー、ＭＩ）タイプＡＥグラス
フィルター（ロット６０３２０２）。
【００４２】ＭＳＩグラスファイバーフィルター（ミク
ロンセパレーション（ＭｉｃｒｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ，Ｉｎｃ．）、ウエストボール、ＭＡ）（ロット１９
５７１）。
ロンセパレーション（ＭｉｃｒｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ，Ｉｎｃ．）、ウエストボール、ＭＡ）（ロット１９
５７１）。
【００４３】ワットマンＧＦ／Ｂ（ワットマン社（Ｗｈ
ａｔｍａｎ Ｌｔｄ．）、イングランド、英国）コント
ロール ７８２３ ワットマンＧＦ／Ｄ（コントロール ４７０６） ワットマンＧＦ／Ｃ（コントロール １５０５） λＤＮＡ（ＢＲＬ）ロット９ ｍｏ １１０４（５０３
μｇ／８０３μｌ） ニトロセルロース（シュライヒャー アンド シュエル
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）、キー
ン、ＮＨ）４４０３１６２１ プレップ ア ジーン（バイオラッド）コントロール
４００４。
ａｔｍａｎ Ｌｔｄ．）、イングランド、英国）コント
ロール ７８２３ ワットマンＧＦ／Ｄ（コントロール ４７０６） ワットマンＧＦ／Ｃ（コントロール １５０５） λＤＮＡ（ＢＲＬ）ロット９ ｍｏ １１０４（５０３
μｇ／８０３μｌ） ニトロセルロース（シュライヒャー アンド シュエル
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）、キー
ン、ＮＨ）４４０３１６２１ プレップ ア ジーン（バイオラッド）コントロール
４００４。
【００４４】 ｉＰｒＯＨ フィッシャー ７４４２４１装置 ：ブロッター（バイオラッド社のバイオ／ドット装
置）方法 ：ＤＮＡを捕まえるのに使用される膜を各々の場合
に変える以外は、同じ方法により６画分を調製した。約
１．３μｌのλＤＮＡを約２４８μｌのＴＥバッファー
に溶解する。これを約７５０μｌのｉＰｒＯＨで希釈
し、そしてフィルターを通過させることによりブロッタ
ーに添加する。すべての液体が通過した後、約１分間風
乾する。再び約７５０μｌのｉＰｒＯＨを添加し、約１
分間風乾する。すべてのｉＰｒＯＨが通過した後、約７
５０μｌのプレップ ア ジーン洗浄バッファーを添加
し、通過後約１分間風乾する。
置）方法 ：ＤＮＡを捕まえるのに使用される膜を各々の場合
に変える以外は、同じ方法により６画分を調製した。約
１．３μｌのλＤＮＡを約２４８μｌのＴＥバッファー
に溶解する。これを約７５０μｌのｉＰｒＯＨで希釈
し、そしてフィルターを通過させることによりブロッタ
ーに添加する。すべての液体が通過した後、約１分間風
乾する。再び約７５０μｌのｉＰｒＯＨを添加し、約１
分間風乾する。すべてのｉＰｒＯＨが通過した後、約７
５０μｌのプレップ ア ジーン洗浄バッファーを添加
し、通過後約１分間風乾する。
【００４５】ウエルのところでフィルターを切る。切っ
た部分を遠心チューブに入れる。５０μｌのプレップ
ア ジーン溶出バッファーを添加する。約６０℃におい
て約２０分間加熱する。ゲル電気泳動による結果から、
イソプロパノールがワットマンＧＦ／Ｂ、ワットマンＧ
Ｆ／Ｃ、ＭＳＩグラス、ゲルマンＡＥおよびニトロセル
ロースに適していることが示唆される。イソプロパノー
ルとゲルマンＡＥフィルターはほぼ１００％のＤＮＡを
保持した。
た部分を遠心チューブに入れる。５０μｌのプレップ
ア ジーン溶出バッファーを添加する。約６０℃におい
て約２０分間加熱する。ゲル電気泳動による結果から、
イソプロパノールがワットマンＧＦ／Ｂ、ワットマンＧ
Ｆ／Ｃ、ＭＳＩグラス、ゲルマンＡＥおよびニトロセル
ロースに適していることが示唆される。イソプロパノー
ルとゲルマンＡＥフィルターはほぼ１００％のＤＮＡを
保持した。
【００４６】
【実施例５】この実験は、１）ＤＮＡの結合に対するｐ
Ｈの効果、２）結合表面としてのＣＥＬＩＴＥ（珪そう
土）の効果、および３）シラン化表面（即ち、疎水性）
へのＤＮＡ固着に対するｉＰｒＯＨの効果を測定する。
Ｈの効果、２）結合表面としてのＣＥＬＩＴＥ（珪そう
土）の効果、および３）シラン化表面（即ち、疎水性）
へのＤＮＡ固着に対するｉＰｒＯＨの効果を測定する。
【００４７】物質： シラン化表面 プレップ ア ジーン ｉＰｒＯＨ １Ｎ ＮａＯＨ １Ｎ ＨＣｌ １×ＴＥバッファー中の１％ アガロースゲル ＴＥバッファー 泳動マーカー染色液 λ ＤＮＡ方法 ：２４８μｌのＴＥおよび１．３μｌのλ ＤＮＡ
を含む７つのサンプルを調製した。サンプル１−３には
３つのシラン化表面（ジーンクリーンマトリックス（バ
イオ１０１、ラ ジョラ、ＣＡ）、サークルプレップマ
トリックス（バイオ１０１）、およびプレップ ア ジ
ーン マトリックス（バイオラッド）の内の１つを添加
し、次に７５０μｌのｉＰｒＯＨを添加する。６０℃に
おいて１０分間加熱する。
を含む７つのサンプルを調製した。サンプル１−３には
３つのシラン化表面（ジーンクリーンマトリックス（バ
イオ１０１、ラ ジョラ、ＣＡ）、サークルプレップマ
トリックス（バイオ１０１）、およびプレップ ア ジ
ーン マトリックス（バイオラッド）の内の１つを添加
し、次に７５０μｌのｉＰｒＯＨを添加する。６０℃に
おいて１０分間加熱する。
【００４８】この間、他の３つのサンプルには２０μｌ
のプレップ ア ジーン マトリックスを添加し、４番
目には５０％セライト５４５（フィッシャー）および５
０％ＴＥバッファーの溶液２０μｌを添加する。セライ
トサンプルおよび他の３つのサンプルのうちの１つには
７５０μｌのプレップ ア ジーンバッファーを添加
し、１サンプルには１Ｎ水酸化ナトリウムで調整したｐ
Ｈ１１．０のプレップア ジーンバッファー７５０μｌ
を添加する。１サンプルには１Ｎ塩酸で調整したｐＨ
０．１のプレップ ア ジーンバッファー７５０μｌを
添加する。４つすべてを１０分間６０℃において加熱す
る。
のプレップ ア ジーン マトリックスを添加し、４番
目には５０％セライト５４５（フィッシャー）および５
０％ＴＥバッファーの溶液２０μｌを添加する。セライ
トサンプルおよび他の３つのサンプルのうちの１つには
７５０μｌのプレップ ア ジーンバッファーを添加
し、１サンプルには１Ｎ水酸化ナトリウムで調整したｐ
Ｈ１１．０のプレップア ジーンバッファー７５０μｌ
を添加する。１サンプルには１Ｎ塩酸で調整したｐＨ
０．１のプレップ ア ジーンバッファー７５０μｌを
添加する。４つすべてを１０分間６０℃において加熱す
る。
【００４９】７サンプルを遠心分離し、そして結合バッ
ファーをデカントにより除く。各サンプルに対して、最
初に使用したのと同じ結合バッファー７５０μｌを添加
する。６０℃において５分間加熱する。遠心分離し、そ
して結合バッファーをデカントにより除く。各サンプル
に対して５００μｌのプレップ ア ジーン洗浄バッフ
ァーを添加し、５分間撹拌／振盪し、遠心分離し、デカ
ントし、６０℃において１０分間乾燥する。２５μｌの
プレップ ア ジーン溶出バッファーを添加し、６０℃
において１０分間加熱し、遠心分離し、バッファーを集
め、溶出段階を繰り返す。
ファーをデカントにより除く。各サンプルに対して、最
初に使用したのと同じ結合バッファー７５０μｌを添加
する。６０℃において５分間加熱する。遠心分離し、そ
して結合バッファーをデカントにより除く。各サンプル
に対して５００μｌのプレップ ア ジーン洗浄バッフ
ァーを添加し、５分間撹拌／振盪し、遠心分離し、デカ
ントし、６０℃において１０分間乾燥する。２５μｌの
プレップ ア ジーン溶出バッファーを添加し、６０℃
において１０分間加熱し、遠心分離し、バッファーを集
め、溶出段階を繰り返す。
【００５０】溶出された画分をゲル電気泳動により分析
し、そしてスタンダードＤＮＡサンプルと比較した。そ
の結果、シラン化表面からはＤＮＡが回収されず、即
ち、前の実験においてＤＮＡは表面に結合せず、沈殿し
なかったことが証明された（沈殿物は表面に結合せず、
そして洗浄段階で洗浄された）。
し、そしてスタンダードＤＮＡサンプルと比較した。そ
の結果、シラン化表面からはＤＮＡが回収されず、即
ち、前の実験においてＤＮＡは表面に結合せず、沈殿し
なかったことが証明された（沈殿物は表面に結合せず、
そして洗浄段階で洗浄された）。
【００５１】
【実施例６】この実験は、ニトロセルロース膜に対する
ＤＮＡの結合能力に関して、結合バッファーを比較す
る。
ＤＮＡの結合能力に関して、結合バッファーを比較す
る。
【００５２】出発物質： 洗浄バッファー（５０％ＥｔＯＨ ５０％（４０ｍＭト
リス、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．
４）） 結合バッファー（５０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、６Ｍ ＮａＣｌＯ4、ｐＨ７．５） 溶出バッファー（１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０） ニトロセルロース（５．０μＭ ＡＥ９８ オーダー
＃１９０２０ ロット６４３３１７ Ｓ＆Ｓ） ニトロセルロース（０．４５μｍ ＢＡ８５ ロット
＃９０３９／７ Ｓ＆Ｓ） １×ＴＡＥ（１×＝８９ｍＭ トリス−ホウ酸、２ｍＭ
ＥＤＴＡ、８９ｍＭホウ酸）中の１％アガロースゲル 泳動マーカー染色液 ＴＥバッファー ｉＰｒＯＨ ＥｔＯＨ ＫＳＣＮ ８Ｍ 塩酸グアニジン ＴＢＳバッファー ＮａＣｌＯ4 プレップ ア ジーン キット方法 ：７つの同一サンプル（２４８μｌのＴＥバッファ
ーおよび１．３μｌのλ ＤＮＡ）を調製した。各工程
で結合バッファーを変える以外は実施例４と正確に同じ
方法で、ブロッターを使用して７サンプルをニトロセル
ロース膜に結合させる。
リス、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．
４）） 結合バッファー（５０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、６Ｍ ＮａＣｌＯ4、ｐＨ７．５） 溶出バッファー（１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０） ニトロセルロース（５．０μＭ ＡＥ９８ オーダー
＃１９０２０ ロット６４３３１７ Ｓ＆Ｓ） ニトロセルロース（０．４５μｍ ＢＡ８５ ロット
＃９０３９／７ Ｓ＆Ｓ） １×ＴＡＥ（１×＝８９ｍＭ トリス−ホウ酸、２ｍＭ
ＥＤＴＡ、８９ｍＭホウ酸）中の１％アガロースゲル 泳動マーカー染色液 ＴＥバッファー ｉＰｒＯＨ ＥｔＯＨ ＫＳＣＮ ８Ｍ 塩酸グアニジン ＴＢＳバッファー ＮａＣｌＯ4 プレップ ア ジーン キット方法 ：７つの同一サンプル（２４８μｌのＴＥバッファ
ーおよび１．３μｌのλ ＤＮＡ）を調製した。各工程
で結合バッファーを変える以外は実施例４と正確に同じ
方法で、ブロッターを使用して７サンプルをニトロセル
ロース膜に結合させる。
【００５３】ＤＮＡ溶液を７５０μｌの結合バッファー
に添加し、次にウエルに添加する。液体を通過させ、１
分間風乾する。ウエルにそれぞれの結合バッファー７５
０μｌを添加し、液体の通過後１分間風乾する。７５０
μｌの洗浄バッファーで洗浄する。液体の通過後１分間
風乾する。
に添加し、次にウエルに添加する。液体を通過させ、１
分間風乾する。ウエルにそれぞれの結合バッファー７５
０μｌを添加し、液体の通過後１分間風乾する。７５０
μｌの洗浄バッファーで洗浄する。液体の通過後１分間
風乾する。
【００５４】各ウエルを以下のように丸く切り、遠心チ
ューブに入れる。溶出バッファー５０μｌを添加し、６
０℃において１０分間加熱する。
ューブに入れる。溶出バッファー５０μｌを添加し、６
０℃において１０分間加熱する。
【００５５】溶出されたＤＮＡサンプルをゲル電気泳動
により分析し、そしてスタンダードＤＮＡサンプルと比
較する。この結果から、イソプロパノール、プロパノー
ル、およびエタノールがＤＮＡを保持したが、カオトロ
プによるＤＮＡの保持は顕著に少ないことが示唆され
る。
により分析し、そしてスタンダードＤＮＡサンプルと比
較する。この結果から、イソプロパノール、プロパノー
ル、およびエタノールがＤＮＡを保持したが、カオトロ
プによるＤＮＡの保持は顕著に少ないことが示唆され
る。
【００５６】
【実施例７】この実験の目的は、クラミジア（Ｃｈｌａ
ｍｙｄｉａ）溶解物に加えたλＤＮＡが、イソプロパノ
ールを結合バッファーとして用いた場合に珪そう土に結
合するか否かを測定するものである。
ｍｙｄｉａ）溶解物に加えたλＤＮＡが、イソプロパノ
ールを結合バッファーとして用いた場合に珪そう土に結
合するか否かを測定するものである。
【００５７】物質： イソプロパノール（アルドリッヒ、ミルウオーキー、Ｗ
Ｉ ０２６１０ＭＷ） プレップ ア ジーン キット（バイオラッド ４１６
４０） λＤＮＡ −（ＢＲＬ ５０３μｇ／８０３μｌ） クラミジア（−）溶解物 ウエイクカントリー ヘルス部門（Ｗａｋｅ Ｃｏｕｎ
ｔｒｙ ＨｅａｌｔｈＤｅｐｔ．）のクラミジア（−）
溶解物 ＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８） ＴＡＥバッファー（１×） エチジウム ブロマイド（１０ｍｇ／１ｍｌストック
（シグマ Ｃａｔ ＃Ｅ−８７５ ロット ＃９７Ｅ−
３７２２）） １×ＴＡＥバッファー中の４％ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖ
ｅ）アガロース φＸ１７４ ＲＦ ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ分解物（ＢＲ
Ｌ Ｃａｔ ＃５６１１ＳＡ ロット ＃９４０１０
３） λ ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解物（ＢＲＬ Ｃａｔ
＃５６１２ＳＡ ロット＃９４０１０４） タイプＩＩ電気泳動マーカー染色液（２５％フィコル、
０．２５％ブロムフェノールブルー、０．２５％ キシ
レンシアノール） 電気泳動ユニット：ＢＲＬ ホライズン ５８ サブマリンユニット パワーユニット：ファルマシア タイプ ＥＰＳ ５０
０／４００ 写真装置：ポラロイド タイプ ５０ランドカメラ ポラロイド タイプ ５７フィルム フォトダイン ライト ボックス ＵＶ その他：シリコン化された滅菌ミクロ遠心チューブ ゲル／ローディングピペット チップス（ストラタジー
ン、ラジョラ、ＣＡ） サンプル、調製および方法：それぞれ２５０μｌのクラ
ミジア（−）ヒト サンプルを含む１３サンプルを調製
する。各サンプルにλＤＮＡの１：１０希釈液を１０μ
ｌずつ添加する。１４番目のサンプルは水２５０μｌお
よびλＤＮＡの１：１０希釈液１０μｌを含み、クラミ
ジア（−）ヒト サンプルを含まないように調製され
る。
Ｉ ０２６１０ＭＷ） プレップ ア ジーン キット（バイオラッド ４１６
４０） λＤＮＡ −（ＢＲＬ ５０３μｇ／８０３μｌ） クラミジア（−）溶解物 ウエイクカントリー ヘルス部門（Ｗａｋｅ Ｃｏｕｎ
ｔｒｙ ＨｅａｌｔｈＤｅｐｔ．）のクラミジア（−）
溶解物 ＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８） ＴＡＥバッファー（１×） エチジウム ブロマイド（１０ｍｇ／１ｍｌストック
（シグマ Ｃａｔ ＃Ｅ−８７５ ロット ＃９７Ｅ−
３７２２）） １×ＴＡＥバッファー中の４％ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖ
ｅ）アガロース φＸ１７４ ＲＦ ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ分解物（ＢＲ
Ｌ Ｃａｔ ＃５６１１ＳＡ ロット ＃９４０１０
３） λ ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解物（ＢＲＬ Ｃａｔ
＃５６１２ＳＡ ロット＃９４０１０４） タイプＩＩ電気泳動マーカー染色液（２５％フィコル、
０．２５％ブロムフェノールブルー、０．２５％ キシ
レンシアノール） 電気泳動ユニット：ＢＲＬ ホライズン ５８ サブマリンユニット パワーユニット：ファルマシア タイプ ＥＰＳ ５０
０／４００ 写真装置：ポラロイド タイプ ５０ランドカメラ ポラロイド タイプ ５７フィルム フォトダイン ライト ボックス ＵＶ その他：シリコン化された滅菌ミクロ遠心チューブ ゲル／ローディングピペット チップス（ストラタジー
ン、ラジョラ、ＣＡ） サンプル、調製および方法：それぞれ２５０μｌのクラ
ミジア（−）ヒト サンプルを含む１３サンプルを調製
する。各サンプルにλＤＮＡの１：１０希釈液を１０μ
ｌずつ添加する。１４番目のサンプルは水２５０μｌお
よびλＤＮＡの１：１０希釈液１０μｌを含み、クラミ
ジア（−）ヒト サンプルを含まないように調製され
る。
【００５８】サンプルのうちの５つとスタンダードに
は、２０μｌのプレップ ア ジーンローディング マ
トリックスを添加し、次に７５０μｌのイソプロパノー
ルを添加して室温で１０分間撹拌する。他の８サンプル
には最初にイソプロパノールを添加し、次に結合マトリ
ックスを添加して撹拌する。後の実験は１３サンプルす
べてとスタンダードについて全く同様に実施した。
は、２０μｌのプレップ ア ジーンローディング マ
トリックスを添加し、次に７５０μｌのイソプロパノー
ルを添加して室温で１０分間撹拌する。他の８サンプル
には最初にイソプロパノールを添加し、次に結合マトリ
ックスを添加して撹拌する。後の実験は１３サンプルす
べてとスタンダードについて全く同様に実施した。
【００５９】サンプルを室温で１０分間撹拌後、１分間
遠心分離し、デカントし、そして上清を捨てる。７５０
μｌのイソプロパノールで洗浄し、室温で１０分間撹拌
し、遠心分離し、デカントし、そして上清を捨てる。５
０℃で１０分間加熱して結合マトリックスを乾燥させ
る。２５μｌのプレップ ア ジーン溶出バッファーを
添加する。５０℃で１０分間加熱し、１．５分間遠心分
離する。上清を集めて、各１４サンプルから得られた溶
出画分を混ぜて溶出段階を繰り返すことにより、１４の
（５０μｌ）溶出ＤＮＡサンプルが得られる。これらの
溶出サンプルをゲル電気泳動により分析することによ
り、どのＤＮＡが溶出されたかを測定する。
遠心分離し、デカントし、そして上清を捨てる。７５０
μｌのイソプロパノールで洗浄し、室温で１０分間撹拌
し、遠心分離し、デカントし、そして上清を捨てる。５
０℃で１０分間加熱して結合マトリックスを乾燥させ
る。２５μｌのプレップ ア ジーン溶出バッファーを
添加する。５０℃で１０分間加熱し、１．５分間遠心分
離する。上清を集めて、各１４サンプルから得られた溶
出画分を混ぜて溶出段階を繰り返すことにより、１４の
（５０μｌ）溶出ＤＮＡサンプルが得られる。これらの
溶出サンプルをゲル電気泳動により分析することによ
り、どのＤＮＡが溶出されたかを測定する。
【００６０】この実験から、ＤＮＡは細胞残渣（即ち、
炭素化合物、蛋白質、核酸、等々）を含むサンプルから
取得できることが証明される。コントロールのλＤＮＡ
とヒトＤＮＡは共にサンプルから取得される。また、こ
の実験から、多くの異なるプロトコルはイソプロパノー
ルを結合バッファーとして使用することができ、そして
サンプルから高いパーセンテージでＤＮＡを取得するこ
とも証明される（例えば、結合段階において加熱を行う
か否か、２つの結合段階が使用できるか１つの結合段階
が使用できるか、洗浄段階は５０％エタノールおよび５
０％の低濃度のＥＤＴＡ、ｐＨ８．０バッファーを使用
できるかまたは洗浄しないかである。試薬の添加順序は
重要でなく、言い換えれば、結合バッファーまたは結合
マトリックスを最初に添加しても各サンプルから回収さ
れるＤＮＡの量に顕著な差はない。）。
炭素化合物、蛋白質、核酸、等々）を含むサンプルから
取得できることが証明される。コントロールのλＤＮＡ
とヒトＤＮＡは共にサンプルから取得される。また、こ
の実験から、多くの異なるプロトコルはイソプロパノー
ルを結合バッファーとして使用することができ、そして
サンプルから高いパーセンテージでＤＮＡを取得するこ
とも証明される（例えば、結合段階において加熱を行う
か否か、２つの結合段階が使用できるか１つの結合段階
が使用できるか、洗浄段階は５０％エタノールおよび５
０％の低濃度のＥＤＴＡ、ｐＨ８．０バッファーを使用
できるかまたは洗浄しないかである。試薬の添加順序は
重要でなく、言い換えれば、結合バッファーまたは結合
マトリックスを最初に添加しても各サンプルから回収さ
れるＤＮＡの量に顕著な差はない。）。
【００６１】本発明は特定の修飾に関して記述されてい
るが、それらの詳細は限定のための構成ではなく、本発
明の趣旨および目的から離れる事なく、さまざまな等価
物、変化および修飾を加えてもよく、そしてそのような
等価物が本明細書に含まれることが理解される。
るが、それらの詳細は限定のための構成ではなく、本発
明の趣旨および目的から離れる事なく、さまざまな等価
物、変化および修飾を加えてもよく、そしてそのような
等価物が本明細書に含まれることが理解される。
Claims (10)
- 【請求項１】 親水性表面にＤＮＡを結合させるため
に、水溶性有機溶媒を添加することよりなる、溶液から
ＤＮＡを精製する方法。 - 【請求項２】 水溶性有機溶媒が、イソプロパノール、
プロパノールおよびエタノールからなる群から選択され
る溶媒である、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 水溶性有機溶媒が、約１％ないし約９９
％のエタノール、約１％ないし約９９％のイソプロパノ
ールおよび約１％ないし約９９％のプロパノールからな
る群から選択される溶媒である、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 親水性表面が、セライト珪そう土、シリ
カポリマー、珪酸マグネシウム、シリコーン窒素化合
物、珪酸アルミニウムおよび二酸化珪素からなる群から
選択される、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 親水性表面がセライト珪そう土である、
請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 下記工程からなる、溶液からＤＮＡを精
製する方法： (a) 前記溶液に親水性表面を添加し； (b) 水溶性有機溶媒を添加し； (c) (a) および(b) 工程からの成分を含むＤＮＡ溶液を
液体画分と非液体画分に分離し； (d) (c) 工程からの非液体画分を洗浄し； (e) (d) 工程からの非液体画分から液体画分を分離し；
そして (f) (e) 工程からの非液体画分からＤＮＡを遊離させ
る。 - 【請求項７】 親水性表面が、セライト珪そう土、シリ
カポリマー、珪酸マグネシウム、シリコーン窒素化合
物、珪酸アルミニウムおよび二酸化珪素からなる群から
選択される、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 水溶性有機溶媒が、イソプロパノール、
プロパノールおよびエタノールからなる群から選択され
る溶媒である、請求項６記載の方法。 - 【請求項９】 水溶性有機溶媒が、約１％ないし約９９
％のイソプロパノール、約１％ないし約９９％のプロパ
ノールおよび約１％ないし約９９％のエタノールからな
る群から選択される溶媒である、請求項６記載の方法。 - 【請求項１０】 さらに溶出バッファーを添加する工程
(g) を含む、請求項６記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69511391A | 1991-05-03 | 1991-05-03 | |
| US695113 | 1991-05-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05268963A true JPH05268963A (ja) | 1993-10-19 |
| JPH0751065B2 JPH0751065B2 (ja) | 1995-06-05 |
Family
ID=24791623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4113578A Expired - Fee Related JPH0751065B2 (ja) | 1991-05-03 | 1992-05-06 | Ｄｎａの固相抽出精製 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5405951A (ja) |
| EP (1) | EP0512767B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0751065B2 (ja) |
| CA (1) | CA2067711C (ja) |
| DE (1) | DE69212216T2 (ja) |
| SG (1) | SG49924A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JP2020024202A (ja) * | 2018-08-06 | 2020-02-13 | 積水化学工業株式会社 | 分析用具及び洗浄方法 |
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|---|---|---|---|---|
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