JPH05203636A - 改質されたクロマトグラフィー用支持体材料 - Google Patents

改質されたクロマトグラフィー用支持体材料

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JPH05203636A
JPH05203636A JP4243540A JP24354092A JPH05203636A JP H05203636 A JPH05203636 A JP H05203636A JP 4243540 A JP4243540 A JP 4243540A JP 24354092 A JP24354092 A JP 24354092A JP H05203636 A JPH05203636 A JP H05203636A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 液体クロマトグラフィー分析用の試料を前処
理することなく直接カラムへ供給できるように改質され
た親水性外部表面と逆相を持っている多孔質内部表面と
を有するクロマトグラフィー用支持体材料を提供する。 【構成】 この支持体材料の粒子は細孔中に脂肪酸エス
テルからなる疎水性内部表面と親水性外部表面を持って
いる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は改善されたクロマトグラ
フィー用支持体材料、この材料の調製方法およびクロマ
トグラフィーにおける吸着材としてのこの材料の使用に
関する。この材料の粒子はその細孔内に疎水性表面およ
び親水性の外部表面を有している。
【０００２】
【従来の技術】生物学的材料および体液類、例えば血清
や血漿、あるいは尿等の中の低分子量物質をＨＰＬＣで
分析するために好ましく用いられるのは逆相充填材料で
ある。時間、費用、更に手間のかかる試料の予備処理段
階が必要であり、その理由はそうでもせずに、蛋白質が
含まれている試料を直接注入した場合には、これら蛋白
質が変質し、クロマトグラフィー用支持体材料の上に蓄
積されるからである。このことはそのクロマトグラフィ
ーカラムをもとに復帰できないような損傷をすることに
なってしまう。このために分析に先立って、沈殿法、膜
濾過法および／または液−液相または液−固相抽出によ
ってそれら蛋白質を定量的に除去することが必要であ
る。このような複雑な操作は極めて多数実施されている
る重要な分析に使われているが、これらの中には薬剤お
よびその代謝物の分析（治療薬剤の追跡監視、ドーピン
グ検査）ならびに種々の内因性物質の分析（臨床化学分
析）および異種生体物質の分析（生物学的監視）が含ま
れている。
【０００３】このことが、直接注入された試料中の蛋白
質や他の高分子成分を低分子量の分析試料（分子量 < 5
000 ダルトン）の選択的保持と同時に定量的に分離する
ことが可能になるような多孔質支持体材料を製造する試
みが最近なされている理由である。この型の支持体材料
は拡散障壁を持っており、その拡散障壁は限定された分
布相または分布表面にのみ高分子化合物がアクセスする
ことを許すのである。この遮蔽は化学的および／または
物理的な種々の効果によって引き起こすことが可能であ
って、これについては多くの提案方法が最近発表されて
いる： ○ 「遮蔽された疎水性相（ＳＨＰ）」 D.J.ギシュ、
B.T.ハンター、B.フライブシュ、クロマトグラフィー雑
誌 ( D.J. Gisch、B.T. Hunter、 B. Freibush;J. Chro
matogr.),(1988) 433, 264: ○ 「半透過性表面（ＳＰＳ）」 L.J. グルンツ（ L.
J. Glunz ) 等 : ピッツバーグ会議 ( Pittsburgh Con
ference ) 1990 の報告 No. 490, ○ 「内部表面逆相（ＩＳＲＰ）」 Th. C. ピンカート
ン、H. I. ハーゲスタム( Th.C. Pinkerton、 H.I. Hage
stam ) 米国特許 4,544,485 (1985)、 ヨーロッパ特許
EP 0 173 233 (1989)、 J.ハギナカ( J.Haginaka等 );
分析化学（"Anal.Chem." ) 61 (1989) 2445- 2448: ○ 「二重帯域（ＤＺ）」 D.E.ウイリアムス、 P.M.カ
ブラ ( D.E. Williams、P.M. Kabra; 分析化学("Anal.
Chem.")( 1990 ) 62, 807: ○ 「限定されたアクセスの固定相（ＲＡＳＰ）」 J.
ハギナカ(J. Haginaka);分析化学の傾向（"Trends in A
nalytical Chemistry"）(1991) 1, 17: 本発明に最も近い従来技術水準が米国特許第 4,544,485
号（対応ヨーロッパ特許 EP 0 173 233 ）およびハギナ
カ（ Haginaka ) 等 (1989) によって発表されている。
しかしながら、これらの方法は以下に詳細に説明するよ
うな種々の欠点を伴っている。
【０００４】ヨーロッパ特許 EP 0 173 233 によるクロ
マトグラフィー用支持体材料は物理的拡散障壁として狭
い細孔を有しており、これが血清や血漿の蛋白質の疎水
性相への浸透を防いでいる。これらの細孔は８ nm また
はそれ以下の直径を有する。それら粒子の外部表面は親
水性であり、一方疎水性アミノ酸を含むオリゴペプチド
が内部表面に結合している。
【０００５】これらの材料は、例えばグリシル−フェニ
ルアラニル−フェニルアラニンのトリペプチドをそのア
ミノ末端を介して 1,1- カルボニルジイミダゾールによ
りグリセリンラジカルのジオール基に化学的に結合する
ことによってグリセリンで誘導体化されたシリカゲルか
ら調製される。その外部表面の上に位置するフェニルア
ラニン残基は次に酵素反応的に除去され、この除去には
カルボキシペプチダーゼＡが好ましい。しかしながら、
この場合にそのグリシン残基は殆ど支持体に結合された
ままとどまっている。この理由のためにこの支持体材料
はその外部表面の上でも、特にそれらの細孔の内側にお
いても、負に荷電したカルボキシル基を有している（Ｃ
−末端フェニルアラニン）。従ってこれは要求される純
粋な逆相の特性を有していない。その上にその外部表面
の上のこのカチオン交換特性はその試料材料との望まし
くない相互作用を起こす。
【０００６】ヨーロッパ特許 EP 0 173 233 が教えると
ころによれば、ペプチド類がその支持体材料の有効性に
対して疎水性層として重要であると認められている。
【０００７】種々のペプチド類はいずれの場合にも親水
的構造をその主鎖中に有し、原則として一般にイオン性
末端基を有している。このことが上記ヨーロッパ特許 E
P 0173 233 に従う支持体材料を用いてはイオン対クロ
マトグラフィーに基づく分離が不可能である理由であ
る。この型の逆相クロマトグラフィーは種々の薬および
それらの代謝物のＨＰＬＣ分析に特に好適であることが
実証されている。更に、逆相クロマトグラフィーにおい
ては固定相としてオリゴペプチド類を使用することは通
常的ではなく、従って通常の分析方法は変更する必要が
ある。
【０００８】疎水性相としてペプチド類は逆相クロマト
グラフィーにおいては他の条件が通常的である場合にア
ルキル残基よりも空間充填性が著しく大きい。このこと
がヨーロッパ特許 EP 0 173 233 に従う支持体材料につ
いて達成することのできる疎水性相では表面密度が低い
ことの理由である。この理由のために、この従来技術に
よる材料で充填されたカラムは低い結合容量を有する。
フラクション分画される物質の量および試料の体積は厳
格な制限を受けることになる。
【０００９】総括するならば、ペプチド類を用いて達成
できる種々の逆相の疎水性は通常のアルキル化によって
達成できる疎水性よりも低い。
【００１０】Haginaka 等 (1989) はその疎水性相がア
ミド結合の中の脂肪酸残基よりなるクロマトグラフィー
用支持体材料を開示している。その報告者によれば、こ
のアミド結合は目的とする用途に十分に安定であると認
められている。しかしながらこの材料の調製はヨーロッ
パ特許 EP 0 173 233 による材料の調製よりもより複雑
であり、その外部表面から脂肪酸残基を除去するために
入手するのに困難な特殊な新しい酵素、ポリミキシンア
シラーゼが必要である。この物質は、例えば市販で入手
することはできない。加えてこの酵素反応による除去は
遊離のアミノ基を生じ、種々の阻害作用を避けるために
これを追加の反応の中で「ジオール」相に変換しなけれ
ばならない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】このように、本文頭初
にあげたクロマトグラフィーによる分離操作のための支
持体材料に欠けている部分があり、その材料とは蛋白質
を含む種々の試料を直接供給することを許容するが、し
かしアルキル化相と匹敵する良好な結合容量および高い
疎水性の度合いをも有し、かつ調製の容易な材料を意味
している。したがって、本発明はこのような型の諸特性
を有するクロマトグラフィー用支持体材料およびこれら
の調製方法を提供する目的に基づいている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者等は驚くべきこ
とに、この型のクロマトグラフィー用支持体材料が、例
えば 2,3- ジヒドロキシプロポキシ基（-O-CH2-CHOH-CH
2OH;「ジオール」基）により公知の方法で改質されたシ
リカゲル粒子を更にもう１つの段階において脂肪酸誘導
体と反応させてエステル結合を形成させることによって
調製することができることを見出した。次に、その外部
表面上のアシル基をエステラーゼおよび／またはリパー
ゼを用いて酵素反応的に除去する。驚くべきことにこの
反応には粒子に結合させたリパーゼさえも適している。
これによって安定な支持体材料が得られる。この発見は
Haginaka 等の教えるところより見て驚くべきことであ
って、その理由はエステル結合はアミド結合よりも更に
不安定だからである。本発明による材料は従来技術に比
して調製が容易であり、その理由は容易に入手できる酵
素を使用でき、かつその必要な「ジオール」相が追加の
反応を必要とすることなくその表面上で製造することが
できるからである。
【００１３】すなわち本発明はヒドロキシル基を含み、
そして細孔の内部表面に限定されている脂肪酸残基を逆
相として有する多孔質材料に基づく液体クロマトグラフ
ィー用充填材において、上記脂肪酸残基がエステル結合
の中に存在していることを特徴とする、上記充填材に関
する。各粒子の外部表面は親水性である。
【００１４】出発材料として多孔質珪酸塩含有材料、例
えばシリカゲルや多孔質ガラスを使用することができ
る。この型の多数の材料が市販で入手でき、それらは例
えば、デューレン(Dueren)のマケライ& ナーゲル(Mache
rey & Nagel)社により提供されるヌクレオシル(Nucleos
il) ( 商標）、ダルムシュタットの E. メルク(Merck)
社により提供されるリクロスファー(LiChrospher) ( 登
録商標)、 あるいは米国のエレクトロ−ヌクレオニクス
( Electro-Nucleonics Inc.)社により提供されるコント
ロールド−ポアガラス（ Controlled-Pore Glass )（商
標）、マインツのショット社により提供されるビオラン
( Bioran )（登録商標）ガラス等である。これらの材料
は例えば公知の方法により適当な「ジオール」相、すな
わち2,3-ジヒドロキシプロポキシ- 改質された支持体に
変換することができる（英国 IRL-Press 刊行（1985)
のデイーン(Dean), P.D.G.、 ジョンソン(Johnson), W.
S.、ミドル(Middle), F.A.、 : アフィニテイー クロマ
トグラフィー ( "AffinityChromatography")）。
【００１５】しかしながら本発明による親水性支持体と
して使用することのできる最終処理済「ジオール」相は
また市販でも入手することが可能であって、すなわち例
えばLiChrospher (登録商標) ジオール（ダルムシュタ
ットの E. Merck 社により提供される）である。
【００１６】更にまたヒドロキシル基を含むポリマーま
たはコポリマーが同様に本発明による吸着材用出発材料
として適しており、この型の材料も市販で入手すること
ができる。例えば日本の東洋ソーダ社より提供されるＴ
ＳＫ−ゲル（登録商標）、ヴァイターシュタット( Weit
erstadt ) のリョ−ム−ファーマ( Roehm-Pharma) 社よ
り提供されるオイペルギト（Eupergit) ( 登録商標）等
である。一般に、充分なヒドロキシル基密度（すなわち
約２〜６μモル/m2 ）を有する全ての親水性多孔質材料
が本発明によるクロマトグラフィー用支持体材料用の出
発材料として適している。
【００１７】本発明によればその脂肪酸残基は飽和およ
び／または不飽和の、偶数個または奇数個の炭素原子を
有する種々の脂肪酸から導かれる。炭素原子の数は必要
な疎水性の程度に応じて２個と２４個との間で、逆相に
基づくクロマトグラフイーについての慣用的方法と同様
に適当に選ぶことができる。それらの残基は直鎖状であ
るのが好ましいけれども、しかしながらまた分枝鎖を有
する化合物も適している。酪酸（Ｃ4 ）、カプリル酸
（Ｃ8 ）およびステアリン酸（Ｃ18）の残基が特に好ま
しい。
【００１８】本発明は更に多孔質粒子の内部表面に限定
されていて、脂肪酸の残基から成り立っている逆層を有
し、かつ次の工程を有する液体クロマトグラフィー用の
充填材料を製造する工程に関係している： ａ） 出発材料中にヒドロキシル基が存在してないとき
には、ヒドロキシル基をその支持体材料の中に導入し、 ｂ） 脂肪酸でヒドロキシル基をエステル化し、ただし
粒子の全内部表面および外部表面はカバーされており、 ｃ） 外部表面の上にある脂肪酸エステルを酵素的に加
水分解する。
【００１９】ヒドロキシル基を導入するのに適したもの
はモノ−、ジ−およびトリ官能性シラン化合物ならびに
それらの混合物である。モノ−および／またはジ−官能
性シラン化合物と反応して、対応する「ジオール」相が
得られる、表面上にシラノール基の均一分布を有するシ
リカゲル支持体が好ましい。これ以下の反応のための出
発材料として好ましいものはシラノール基を含む種々の
材料（シリカゲル、多孔質ガラス）であり、それらは２
−６μモル/m2 、好ましくは 2.5 - 3.5μモル/m2 の
「ジオール」基をその相表面に有している。
【００２０】エステル化に適合した脂肪酸誘導体は当業
者には公知であり、これらはその酸の対応する酸無水
物、酸アジド類、酸ハロゲン化物、特に酸塩化物であ
る。酪酸（Ｃ4 ）、カプリル酸（Ｃ8 ）及びステアリン
酸（Ｃ18）の塩化物が好ましい。これはその固定化され
たグリセリン残基（「ジオール」残基）の第１級および
／または第２級ヒドロキシル基がその酸ハロゲン化物と
公知の方法で対応するエステルを形成することを含むの
である。
【００２１】上述した「ジオール」含有支持体材料と脂
肪酸ハロゲン化物との反応はその用いた材料の「ジオー
ル」含有量に対して４倍ないし１０倍、好ましくは８倍
ないし９倍過剰の酸塩化物を用いて実施される。この反
応は通常は、１ないし３当量の有機塩基、好ましくは
１．５当量のトリエチルアミンの存在のもとに無水の溶
媒、例えばクロロホルム中で行われる。０−１０℃、好
ましくは４℃において、冷却した酸ハロゲン化物を滴加
した後にその反応混合物を２０−２５℃において１２〜
１５時間反応させる。得られた材料を濾過、分離し、ク
ロロホルム、メタノール、水で数回洗浄し、更に再びメ
タノールで洗浄し、乾燥する。
【００２２】それら脂肪酸誘導体はまた、例えば文献に
記述されている( 例えばシュトットガルトのゲオルク−
テイーメ出版社( Georg-Thieme Verlag ) 刊行のフウベ
ン−ヴァイル著（ Houben-Weyl )の「有機化学の方法」
( Methoden der OrganischenChemie）のような公知の種
々の方法によって、中でも上記反応に好適であることが
知られている反応条件のもとで合成される。公知の種々
の変法を用いることも可能であるが、これについてはこ
こでは詳述しない。
【００２３】好ましく用いられるＣ4-、Ｃ8- およびＣ
18- 脂肪酸リガンドはいずれの場合にも出発材料の「ジ
オール」含有量についてその表面の 60 ％と 90 ％との
間、好ましくは 80 ％を占める。
【００２４】本発明の追加の段階においてそれら粒子の
外部表面の上に位置するモノアシル−およびジアシルエ
ステルは、例えば種々のリパーゼ（ＥＣ 3.1.1.3）また
はエステラーゼ（ＥＣ 3.1.1.1）のようなエステル分解
酵素によって酵素反応的に除去される。豚の膵リパーゼ
II 型を用いるのが好ましい。
【００２５】８ nm よりも小さな平均細孔直径を有する
支持体材料の場合には、その酵素反応的加水分解を種々
の可溶性酵素を用いて行うことが可能である。と言うの
はこれらは細孔の内側から実質的に排除されているから
である。
【００２６】本発明の特に好ましい１つの実施態様にお
いて、外部表面に位置する脂肪酸残基を除去するために
粒子に結合されている種々の酵素が用いられる。この目
的のためには、例えば種々のエステラーゼまたはリパー
ゼを、文献に公知の方法〔英国の IRL-Press Ltd. 刊行
(1985) の "Affinity Chromatography"〕によって、例
えばアガロースゲルに共有結合的に結合させる。一般に
粒子に結合させた酵素は巨大分子基質と僅かしか、また
はまったく反応しないと考えられているから、この型の
酵素調剤が適していることは驚くべきことであり。
【００２７】粒子に結合させた酵素を使用することは酵
素を容易に回収することができるという工程に種々の変
法を許容することになる。例えば Magnogel ( 商標）Ａ
４ＲまたはMagnogel（商標）ＡｃＡ４４( フランス生物
学工業、 L'Industrie Biologique Francais)のような磁
性を有する担体材料がこの目的のためにそれら酵素を結
合させるのに用いられる。このクロマトグラフィー用支
持体材料の外側に位置する脂肪酸残基が酵素反応的に除
去された後に、その固定化酵素は磁石を用いて反応混合
物から取り除き、再使用することができる。
【００２８】粒子に結合させた酵素をこの発明に従って
使用することは、比較的大きな細孔（> 8 nm) を有する
クロマトグラフィー用支持体材料が要求される場合には
有利である。細孔の大きさが広い分布を有する場合に
は、粒子に結合させた酵素を使用することが同様に有利
である。このような場合には、これら酵素が相当な割合
細孔の中に侵入するのを成功裏に防止し、従ってそれら
細孔の内部表面上に位置している脂肪酸残基を望ましく
ない態様で除去することを防止している。
【００２９】酵素の担体としてアガロースゲルを用いた
場合には、酵素反応の後に60℃に加熱することにより、
および／または変質性またはカオトロピックな化合物
（例えば尿素、グアジニウム塩酸塩、チオシアニン酸塩
類）で処理することによって溶解することができる。こ
の可溶化した酵素調剤はこの次に濾過によって反応混合
物から除去することができる。
【００３０】クロマトグラフィー用支持体の外部表面上
に位置する脂肪酸エステルの酵素反応的加水分解は、例
えば特定の脂肪酸−改質された支持体材料１ｇを特定の
溶解した、または担体に結合させたリパーゼまたはエス
テラーゼ2,000 ないし 8,000の酵素単位、好ましくは
5,000の酵素単位とともにｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ
7.1 の緩衝液の中で 37 ℃において 60 〜 90 時間イン
キュベーションすることにより実施される。
【００３１】この酵素反応の後に得られた材料を濾過分
離し、緩衝液、塩化ナトリウム溶液（１モル／リット
ル）および水で数回洗浄する。溶解した酵素を用いた場
合には引き続いてそのクロマトグラフィー用支持体材料
を乾燥させることができる。アガロースの上に固定化さ
れたリパーゼ又はエステラーゼを用いた場合には、得ら
れた材料をまず20重量部の水中に再懸濁させ、60℃にお
いて好ましくは２時間加熱する。これを次に濾過分離
し、塩化ナトリウム溶液（１モル／リットル）、水およ
びメタノールで数回洗浄し、そして乾燥させる。
【００３２】その酵素処理の前後において表面を占有し
ている脂肪酸リガンドは元素分析および／また市販で入
手できる遊離脂肪酸の酵素反応検査（例えばドイツ国マ
ンハイムのベーリンガー Boehringer 社より提供され
る）によって求めることができる。
【００３３】そのクロマトグラフィー用支持体材料の外
部表面から除去される割合は、可溶性のリパーゼまたは
エステラーゼを用いる場合には、典型的にはその全表面
占有量に対して 10 〜 20 ％であり、担体に結合させた
リパーゼまたはエステラーゼを用いる場合には、１〜５
％である。
【００３４】本発明は更に種々の物質の混合物をクロマ
トグラフィー的に分離する方法に関係し、多孔質粒子が
その内部表面上に脂肪酸エステルよりなる逆相を有して
いるクロマトグラフィー充填材料が使用されることを特
徴としている。
【００３５】最後に本発明は生物学的試料の試料調製方
法に関係し、多孔性粒子がその内部表面の上に脂肪酸エ
ステルよりなる逆相を有している材料を使って、随伴し
て妨害する巨大分子量物質を除去することを特徴として
いる。
【００３６】細孔の内部に封じ込められた逆相の特性を
有し、かつ親水性の外部表面を有する本発明に従って調
製されるクロマトグラフィー用支持体材料はクロマトグ
ラフィー用の充填材として極めて適しており、特にカラ
ムクロマトグラフィーによって種々の蛋白質含有試料を
直接注入、調製、分析するための充填材として適してい
る。
【００３７】
【実施例】以下に本発明に従うクロマトグラフィー用材
料の調製を実施例によって記述するが、この記述は本発
明に制限を加えるものでない。従来技術水準より一般に
公知のＩＳＲＰ充填材と比較した利点は報告済みの各使
用例から明らかである。実施例 １ 2,3-ジヒドロキシプロポキシ基で改質されているシリカ
ゲルより出発して、その細孔の内部表面上にＣ18−アル
カノイル鎖を有するクロマトグラフィー用支持体 材料の調製 １．１． エポキシド化 10 g の LiChrospher（登録商標）Si（比表面積 350 m
2/g 、粒径 12 μm および平均の細孔直径 7 nm を有す
る球状シリカゲル）を 50 mlのトルエンの中に懸濁させ
る。2.6 ml（３μモル/m2 に相当する）のグリシジルオ
キシプロピルメチルジメトキシシランを加え、次にその
混合物を還流しながら攪拌しながら５時間煮沸する。そ
の材料を濾過分離し、トルエンおよびメタノールで洗浄
し、乾燥する。 １．２． 「ジオール」相を形成するための開環 上記１．１．からの生成物を硫酸水溶液（濃度５重量
％）50 ml の中に懸濁させ、徐々に攪拌しながら３時間
還流しながら煮沸する。次にその反応生成物を濾過分離
し、硫酸イオンがなくなるまで水洗し、メタノールで洗
浄し、乾燥する。2.79μモル/m2 （Ｃ 7.0％の含有量か
ら算出）の被覆量を有するジオール−改質シリカゲルが
得られる。 １．３． 塩化ステアロイルとの反応 上記１．２．において得られた支持体材料１ｇを攪拌機
と温度計とを備えた３つ口フラスコの中で無水のクロロ
ホルム５ ml の中に懸濁させ、冷却したトリエチルアミ
ン 11.7 ミリモルを加える。
【００３８】５ ml の冷却したクロロホルムの中に溶解
させた塩化ステアロイル 7.8 ミリモルを滴加し、その
後にこの懸濁液を 20 ℃において 24 時間攪拌する。
【００３９】得られた材料をそれぞれ 20 mlのクロロホ
ルム、メタノール、水で２回ずつ洗浄し、最後に再びメ
タノールで洗浄して乾燥させる。
【００４０】元素分析による表面占有Ｃ18−アルカノイ
ル鎖（ステアロイル基）の計算結果は 1.98 μモル/m2
の値を示している。 １．４． リパーゼを用いる酵素−触媒的除去 上記１．３．において得られた材料１ｇを20 ml の緩衝
溶液（２ミリモル トリス HCl、１ミリモル CaCl2 、
７ミリモル NaCl、ｐＨ＝ 7.1）の中に溶解されている
50 mgの豚の膵臓リパーゼ II 型（5,000 酵素単位に相
当）（ドイツ国ミュンヘン、 Muenchenのシグマ化学、Si
gma Chemie社より提供）と混合する。この混合物を振盪
しながら72時間 37 ℃において反応させる。得られた材
料を濾過分離し、続けて２回上記緩衝液 30 mlで、さら
に塩化ナトリウム溶液（１モル／リットル）、水および
エタノールで洗浄し、乾燥させる。酵素反応的除去の後
に元素分析による表面占有Ｃ18−アルカノイル鎖の計算
結果は 1.68 μモル/m2 の値を示している。 １．５． 粒子に結合させたリパーゼを用いる酵素−触
媒的除去 上記１．３．において得られた材料１ｇを20 ml の緩衝
溶液（２ミリモル トリス HCl、１ミリモル CaCl2、
２ミリモル NaCl、 ｐＨ＝ 7.1）の中に溶解された 5,0
00 酵素単位の小麦胚リパーゼ（ドイツ国ミュンヘン、
Muenchenのシグマ化学 Sigma Chemie 社から提供され
た、架橋化（４％）したアガロースに結合させたＩ−Ａ
型、カタログ No. L 2764 ）と混合する。この混合物を
振盪しながら 72 時間 37 ℃において反応させる。得ら
れた材料を濾過分離し、引き続き２回上記緩衝液 30 ml
で、塩化ナトリウム溶液（１モル／リットル）および水
で洗浄する。得られた材料を 20 mlの水に再懸濁させ、
振盪しながら２時間 60 ℃に加熱する。この材料を次に
濾過分離し、 上記の塩化ナトリウム溶液30ml（１モル／
リットル）、水およびメタノールでそれぞれ連続して２
回乾燥する。酵素反応的除去の後に元素分析による表面
占有Ｃ18−アルカノイル鎖の計算結果は 1.90μモル/m2
の値を示している。実施例 ２ 2,3-ジヒドロキシプロポキシ基で改質されているシリカ
ゲルより出発して，その細孔の内部表面上にＣ8 −アル
カノイル鎖を有するクロマトグラフィー用支持体 材料の調製 この材料の調製は前記１．１．ないし１．５．に記載し
た方法と同様にして塩化ステアロイルの代わりに塩化カ
プリロイルを用いて行なう。実施例 ３ 2,3-ジヒドロキシプロポキシ基で改質されているシリカ
ゲルより出発して、その細孔の内部表面上にＣ4 −アル
カノイル鎖を有するクロマトグラフィー用支持体 材料の調製 この材料の調製は前記１．１．ないし１．５．に記述し
た方法と同様にして塩化ステアロイルの代わりに塩化ブ
チリルを用いて行なう。実施例 ４ 容量係数（k'） テオフィリンおよびフェニトインの容量係数（k'）を種
々の充填材（実施例１〜３参照）について求めた。これ
らの値はまた従来技術（ヨーロッパ特許 EP 0173 233
）による材料についても比較のために求めた。
【００４１】外部に存在する酸残基の除去前（図１の曲
線Ａ）および除去後（同曲線Ｂ）に本発明による充填材
を検討した。
【００４２】粒子に結合したリパーゼによる加水分解に
よって得られた材料（例１．５．）はそのクロマトグラ
フィー的諸特性では溶解したリパーゼを用いて得られた
材料（例１．４．参照）とは大きな差異を示さなかっ
た。
【００４３】容量係数（k'）は次のようにして計算す
る： k' ＝（tR - tM)/tM （但し tR ＝ 分析物の保持時間、tM ＝ 移動相の保
持時間） クロマトグラフィー条件は下記のとおりであった： カラム直径 ： 30× 4 mm ( 内径） 移動相 ： 水 流速 ： 0.5 ml/min 検出 ： UV 271/205 nm テオフィリン： 9.2 μg/ml フェニトイン： 5 μg/ml 注入体積 ： 100 μl 比較試験（* ） 比較試験におけるクロマトグラフィー条件は下記のとお
りであった： 移動相 ：85 % (V/V) 0.1 モル K2HPO4 緩衝液
(pH 6.8) 、 10 % (V/V) イソプロパノール) 、 6 % (V/V) テトラヒドロフラン 流速 ：1 ml/min このようなクロマトグラフィー条件のもとではヨーロッ
パ特許 EP 0 173 233に記載されているＩＳＲＰカラム
（米国イリノイ州、モートングローブ MortonGrove の
レギス化学会社 Regis Chemical Company 社の GFF-S 5
-80 ）からはフェニトインは溶離し、その k' 値は僅か
に 11.36 である。すなわちこの材料は本発明による材
料についての容量係数の半分よりも低い容量係数を有す
る。結果 ： 充填材 容量係数 （* ） テオフィリン フェニトイン ─────────────────────────────────── Ｃ-18 （ステアロイル） A 20.7 30 B 18.9 30 26.3 Ｃ-8 （カプリロイル） A 3.2 ＞ 30 B 2.5 ＞ 30 24.5 Ｃ-4 （ブチリル） A 0.0 20.6 B 0.0 18.6 16.0 ───────────────────────────────────実施例 ５ 蛋白質溶離挙動 人の血清 500μl を下記のクロマトグラフィー条件のも
とに供給した： 充填材 ： 実施例１と同一 カラム寸法 ： 10 × 4 mm （内径） 移動相 ： 水 流速 ： 0.5 ml/min 検出 ： UV 280 nm 結果を図１に示す。図１Ａは最初の注入についての溶離
挙動を示し、図１Ｂは第 10 番目の注入についての溶離
挙動を示す。
【００４４】粒子に結合させたリパーゼによる加水分解
（実施例１．５．参照）によって得られた材料は溶解し
たリパーゼ（実施例１．４．参照）を用いて得られた材
料とはそのクロマトグラフィー的諸特性において大きな
差異を示さなかった。実施例 ６ 蛋白質回収 人の血清 500μl を実施例５に記載したクロマトグラフ
ィー条件のもとに何回も供給した。溶離液中の各血清蛋
白質の回収はビューレット法による蛋白質比色分析によ
って測定した。 結果： 注入の番号 回収率（％） １ 99.6 ２ 102.3 ３ 98.5 ４ 101.5 ５ 99.7実施例 ７ 人の血漿中のフェニトインを分析するための総合試料調
剤による直接注入 Ａ） 装置の設計 装置の設計は図２から明らかであるが、この図における
標識数字はそれぞれ下記を表わす： １・・・プレカラム緩衝液 ２・・・分析用緩衝液 ３・・・ＨＰＬＣポンプ（L-6000) ４・・・ＨＰＬＣポンプ（L-6200) ５・・・自動試料供給装置 (AS-4000) ６・・・自動逆転弁（ELV 7000) ７・・・プレカラム ８・・・分析用カラム ９・・・検出装置 １０・・・積分器（D-2500) １１・・・排出部 （装置はドイツ国ダルムシュタットの E. メルク Merc
k 社より提供された） Ｂ） 自動逆転弁（６）のセット 逆転弁のセットに依存して設定される図２中の各ユニッ
トの間の配管の連結は図３から明らかである。図３Ａは
「供給」用設定、図３Ｂは「注入」用設定を示す。 Ｃ） クロマトグラフィー条件 プレカラム ： 実施例１と同一 カラム寸法 ： 30× 4 mm （内径） プレカラム緩衝液： 0.05モル NaH2PO4 (pH 4.0) 分析用カラム ： LiChrospher （登録商標）60 RP-
select B、5μm 125 × 4 mm （内径） 分析用緩衝液 ： 0.05モル NaH2PO4 (pH 4.0)/水/
アセトニトリル（ 40:40:30 (V:V:V) ) 検出 ： UV 205 nm Ｄ） 全自動分析サイクル 逆転弁（６）を「供給」用セット位置において血漿試料
（100 μl) を自動試料供給装置（５）によって注入し
た後に、ＨＰＬＣポンプ（３）により送り込まれたプレ
カラム緩衝液（１）を用いて本発明による吸着材が含ま
れているプレカラム（７）にこの試料を送り込む（流速
0.5 ml/min)。分析物（フェニトイン）は本発明による
特性のためにこのプレカラム（７）の上に選択的に保持
され、一方残余の生物学的マトリックス（各種蛋白質
等）は直接に、かつ定量的に排出部（11）へ 12 分間以
内に送られる。
【００４５】弁（６）が「注入」用セット位置へ逆転さ
れた後に、その分析物はＨＰＬＣポンプ（４）によって
送り込まれた分析用緩衝液（２）により５分間以内にプ
レカラム（７）から完全に溶離され（流速：0.8 ml/mi
n）、その後に下流の分析用カラム（８）へ送り込まれ
る。
【００４６】弁（６）が「供給」位置へ逆転された後
に、アイソクラチック (isocratic)条件のもとに分析的
分離が起こる（流速：0.8 ml/min) 。溶離された化合物
は検出装置（９）の中で検出され、そのデータは積分器
（10）において評価される。同時にプレカラムは新しい
分析サイクルのためにポンプ（３）によって処理され
る。 Ｅ） 分析結果 図４は得られた溶離線図を含む。図４Ａ 対照物（フェ
ニトイン１μg ：標識数字 14 ）、図４Ｂ フェニトイ
ン（標識数字14）１μg を含む人の血漿 (100 μl)実施例 ８ 総合試料調剤による直接注入、イオン対モードでの分
離：人の血清中のトリプトファン代謝物の分析 装置の設計および自動逆転弁の設定は実施例７における
設定と同一である。 Ｃ） クロマトグラフィー条件 プレカラム ： 実施例１と同一 カラム寸法 ： 30× 4 mm （内径） プレカラム緩衝液： 0.1 モル NaH2PO4、5 m モル オ
クタン-1- スルホン酸 pH 4.0 分析用緩衝液 ： 0.1 モル NaH2PO4、5 m モル、オ
クタン-1- スルホン酸、20 % (V/V) アセトニトリル、
pH 6.0 検出 ： 蛍光、励起 300 nm 、発光 350 n
m Ｄ） 全自動分析サイクル 血漿試料（100 μl) を自動試料供給装置（５）によっ
て電気的逆転弁（６）の「供給」用セット位置において
注入した後に、ＨＰＬＣポンプ（３）により送り込まれ
たプレカラム緩衝液（１）を用いて本発明による吸着材
が含まれているプレカラム（７）に試料を送り込む（流
速 0.5 ml/min)。分析物 5- ヒドロキシインドール酢酸
はその選定ｐＨ条件 (pH 4) では中性ではあるが、分析
物である5- ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）は
正電荷を有し、これは親油性イオン対試薬（オクタン-1
- スルホン酸）の添加により平衡が保たれている。この
ようにして両分析物をイオン対クロマトグラフィー条件
のもとでプレカラム（７）に選択的に保持させることが
可能であって、一方残りの生物学的マトリックス（各種
蛋白質等）は直接にかつ定量的に 12 分間以内に排出部
(11) へ送り出される。弁（６）が「注入」セット位置
へ逆転された後に、各分析物はＨＰＬＣポンプ（４）に
よって送り込まれた分析用緩衝液（２）により、ｐＨの
上昇（pH6.0 ）と有機溶媒の含有量（20 % アセトニト
リル）の結果により３分間以内にプレカラム（７）から
完全に溶離され（流速：1 ml/min）、その後に下流の分
析用カラム（８）へ送られる。
【００４７】弁（６）が「供給」位置へ逆転された後
に、アイソクラチック (isocratic)条件のもとに分析的
分離が起こる（流速：0.8 ml/min）。溶離された各化合
物は検出装置（９）の中で検出され、そのデータは積分
器（10）において評価される。同時にプレカラムは新し
い分析サイクルのためにポンプ（３）によって処理され
る。 Ｅ） 分析結果 図５は下記の得られた溶離図を含む。 図５Ａ 対照物 5-ヒドロキシインドール酢酸 66.8 p
mol : 標識数字 12 、 5-ヒドロキシトリプタミン 80.2 pmol : 標識数字 1
3 、 図５Ｂ 人の血漿 (100 μl)、以下の対照試薬を含有す
る。
【００４８】5-ヒドロキシインドール酢酸 4.0 pmol
: 標識数字 12 、 5-ヒドロキシトリプタミン 89.6 pmol : 標識数字 1
3 、
【図面の簡単な説明】
【図１】例５の蛋白質溶離挙動の比較を示す溶離線図
【図２】本発明のクロマトグラフィー分析装置の１例の
構成を示す図式図
【図３】自動逆転弁のセット切り換えによる装置の運転
態様を示す図式図
【図４】例７の薬剤分析試験の溶離線図
【図５】例８の薬剤分析試験の溶離線図
【符号の説明】
１ プレカラム緩衝液 ２ 分析用緩衝液 ３ ＨＰＬＣポンプ ４ ＨＰＬＣポンプ ５ 自動試料注入装置 ６ 逆転弁 ７ プレカラム ８ 分析用ムカラム ９ 検出装置 １０ 積分器 １１ 排出部 １２ 溶離図上での 5- ヒドロキシインドール酢酸の
標識数字 １３ 溶離図上での 5- ヒドロキシトリプタミンの標
識数字 １４ 溶離図上でのフェニトインの標識数字
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 7/62 8114−4Ｂ (72)発明者 カール−ジークフリート ボース ドイツ連邦共和国 デー−6100 ダルムシ ュタット フランクフルター シュトラー セ 250 (72)発明者 アンドレアス カテリーネ アー． ヴァ ルフォルト ドイツ連邦共和国 デー−6100 ダルムシ ュタット フランクフルター シュトラー セ 250 (72)発明者 フリートヘルム アイゼンバイス ドイツ連邦共和国 デー−6100 ダルムシ ュタット フランクフルター シュトラー セ 250 (72)発明者 ディーター ルプダ ドイツ連邦共和国 デー−6100 ダルムシ ュタット フランクフルター シュトラー セ 250

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒドロキシル基を含み、粒子の内部表面
    に限定されている逆相を有する多孔質材料に基づく、液
    体クロマトグラフィー用充填材料において、上記逆相が
    脂肪酸エステルよりなることを特徴とする上記充填材
    料。
  2. 【請求項２】 多孔質粒子が 2,3- ジヒドロキシプロポ
    キシ基で改質されたシリカゲルよりなることを特徴とす
    る請求項１による充填材料。
  3. 【請求項３】 多孔質粒子が 2,3- ジヒドロキシプロポ
    キシ基で改質されたガラスよりなることを特徴とする請
    求項１による充填材料。
  4. 【請求項４】 多孔質粒子がヒドロキシル基を含む有機
    ポリマーまたはコポリマーよりなることを特徴とする請
    求項１による充填材料。
  5. 【請求項５】 多孔質粒子の内部表面に限定されてい
    て、脂肪酸エステルよりなる逆相を有する液体クロマト
    グラフィー用充填材料を製造するに当り、下記の、すな
    わち ａ） 出発材料中にヒドロキシル基が存在していないと
    き、ヒドロキシル基をその支持体材料の中に導入し、 ｂ） 各粒子の内部および外部の全表面上でそのヒドロ
    キシル基をエステル化させ、 ｃ） 外部表面の上にある脂肪酸エステルをリパーゼお
    よび／またはエステラーゼにより酵素的に加水分解する 各工程段階を含む方法。
  6. 【請求項６】 エステル分解酵素が或る担体に化学的に
    結合されており、そしてこの担体の粒径が多孔質粒子の
    平均孔直径より大きいことを特徴とする請求項５による
    方法。
  7. 【請求項７】 用いた担体が磁性を有していることを特
    徴とする請求項６による方法。
  8. 【請求項８】 種々の物質の混合物をクロマトグラフィ
    ー的に分離する方法において、内部表面が脂肪酸エステ
    ルで被覆されている多孔質クロマトグラフィー用充填材
    料を用いることを特徴とする方法。
  9. 【請求項９】 生物学的試料の試料調製方法において、
    妨害している随伴する巨大分子物質が内部表面の上に脂
    肪酸エステルよりなる逆相を有する多孔質粒子の材料に
    よって除去されることを特徴とする方法。
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