JPH05203636A - 改質されたクロマトグラフィー用支持体材料 - Google Patents
改質されたクロマトグラフィー用支持体材料Info
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Abstract
理することなく直接カラムへ供給できるように改質され
た親水性外部表面と逆相を持っている多孔質内部表面と
を有するクロマトグラフィー用支持体材料を提供する。 【構成】 この支持体材料の粒子は細孔中に脂肪酸エス
テルからなる疎水性内部表面と親水性外部表面を持って
いる。
Description
フィー用支持体材料、この材料の調製方法およびクロマ
トグラフィーにおける吸着材としてのこの材料の使用に
関する。この材料の粒子はその細孔内に疎水性表面およ
び親水性の外部表面を有している。
や血漿、あるいは尿等の中の低分子量物質をHPLCで
分析するために好ましく用いられるのは逆相充填材料で
ある。時間、費用、更に手間のかかる試料の予備処理段
階が必要であり、その理由はそうでもせずに、蛋白質が
含まれている試料を直接注入した場合には、これら蛋白
質が変質し、クロマトグラフィー用支持体材料の上に蓄
積されるからである。このことはそのクロマトグラフィ
ーカラムをもとに復帰できないような損傷をすることに
なってしまう。このために分析に先立って、沈殿法、膜
濾過法および/または液−液相または液−固相抽出によ
ってそれら蛋白質を定量的に除去することが必要であ
る。このような複雑な操作は極めて多数実施されている
る重要な分析に使われているが、これらの中には薬剤お
よびその代謝物の分析(治療薬剤の追跡監視、ドーピン
グ検査)ならびに種々の内因性物質の分析(臨床化学分
析)および異種生体物質の分析(生物学的監視)が含ま
れている。
質や他の高分子成分を低分子量の分析試料(分子量 < 5
000 ダルトン)の選択的保持と同時に定量的に分離する
ことが可能になるような多孔質支持体材料を製造する試
みが最近なされている理由である。この型の支持体材料
は拡散障壁を持っており、その拡散障壁は限定された分
布相または分布表面にのみ高分子化合物がアクセスする
ことを許すのである。この遮蔽は化学的および/または
物理的な種々の効果によって引き起こすことが可能であ
って、これについては多くの提案方法が最近発表されて
いる: ○ 「遮蔽された疎水性相(SHP)」 D.J.ギシュ、
B.T.ハンター、B.フライブシュ、クロマトグラフィー雑
誌 ( D.J. Gisch、B.T. Hunter、 B. Freibush;J. Chro
matogr.),(1988) 433, 264: ○ 「半透過性表面(SPS)」 L.J. グルンツ( L.
J. Glunz ) 等 : ピッツバーグ会議 ( Pittsburgh Con
ference ) 1990 の報告 No. 490, ○ 「内部表面逆相(ISRP)」 Th. C. ピンカート
ン、H. I. ハーゲスタム( Th.C. Pinkerton、 H.I. Hage
stam ) 米国特許 4,544,485 (1985)、 ヨーロッパ特許
EP 0 173 233 (1989)、 J.ハギナカ( J.Haginaka等 );
分析化学("Anal.Chem." ) 61 (1989) 2445- 2448: ○ 「二重帯域(DZ)」 D.E.ウイリアムス、 P.M.カ
ブラ ( D.E. Williams、P.M. Kabra; 分析化学("Anal.
Chem.")( 1990 ) 62, 807: ○ 「限定されたアクセスの固定相(RASP)」 J.
ハギナカ(J. Haginaka);分析化学の傾向("Trends in A
nalytical Chemistry")(1991) 1, 17: 本発明に最も近い従来技術水準が米国特許第 4,544,485
号(対応ヨーロッパ特許 EP 0 173 233 )およびハギナ
カ( Haginaka ) 等 (1989) によって発表されている。
しかしながら、これらの方法は以下に詳細に説明するよ
うな種々の欠点を伴っている。
マトグラフィー用支持体材料は物理的拡散障壁として狭
い細孔を有しており、これが血清や血漿の蛋白質の疎水
性相への浸透を防いでいる。これらの細孔は8 nm また
はそれ以下の直径を有する。それら粒子の外部表面は親
水性であり、一方疎水性アミノ酸を含むオリゴペプチド
が内部表面に結合している。
ルアラニル−フェニルアラニンのトリペプチドをそのア
ミノ末端を介して 1,1- カルボニルジイミダゾールによ
りグリセリンラジカルのジオール基に化学的に結合する
ことによってグリセリンで誘導体化されたシリカゲルか
ら調製される。その外部表面の上に位置するフェニルア
ラニン残基は次に酵素反応的に除去され、この除去には
カルボキシペプチダーゼAが好ましい。しかしながら、
この場合にそのグリシン残基は殆ど支持体に結合された
ままとどまっている。この理由のためにこの支持体材料
はその外部表面の上でも、特にそれらの細孔の内側にお
いても、負に荷電したカルボキシル基を有している(C
−末端フェニルアラニン)。従ってこれは要求される純
粋な逆相の特性を有していない。その上にその外部表面
の上のこのカチオン交換特性はその試料材料との望まし
くない相互作用を起こす。
ころによれば、ペプチド類がその支持体材料の有効性に
対して疎水性層として重要であると認められている。
的構造をその主鎖中に有し、原則として一般にイオン性
末端基を有している。このことが上記ヨーロッパ特許 E
P 0173 233 に従う支持体材料を用いてはイオン対クロ
マトグラフィーに基づく分離が不可能である理由であ
る。この型の逆相クロマトグラフィーは種々の薬および
それらの代謝物のHPLC分析に特に好適であることが
実証されている。更に、逆相クロマトグラフィーにおい
ては固定相としてオリゴペプチド類を使用することは通
常的ではなく、従って通常の分析方法は変更する必要が
ある。
グラフィーにおいては他の条件が通常的である場合にア
ルキル残基よりも空間充填性が著しく大きい。このこと
がヨーロッパ特許 EP 0 173 233 に従う支持体材料につ
いて達成することのできる疎水性相では表面密度が低い
ことの理由である。この理由のために、この従来技術に
よる材料で充填されたカラムは低い結合容量を有する。
フラクション分画される物質の量および試料の体積は厳
格な制限を受けることになる。
できる種々の逆相の疎水性は通常のアルキル化によって
達成できる疎水性よりも低い。
ミド結合の中の脂肪酸残基よりなるクロマトグラフィー
用支持体材料を開示している。その報告者によれば、こ
のアミド結合は目的とする用途に十分に安定であると認
められている。しかしながらこの材料の調製はヨーロッ
パ特許 EP 0 173 233 による材料の調製よりもより複雑
であり、その外部表面から脂肪酸残基を除去するために
入手するのに困難な特殊な新しい酵素、ポリミキシンア
シラーゼが必要である。この物質は、例えば市販で入手
することはできない。加えてこの酵素反応による除去は
遊離のアミノ基を生じ、種々の阻害作用を避けるために
これを追加の反応の中で「ジオール」相に変換しなけれ
ばならない。
にあげたクロマトグラフィーによる分離操作のための支
持体材料に欠けている部分があり、その材料とは蛋白質
を含む種々の試料を直接供給することを許容するが、し
かしアルキル化相と匹敵する良好な結合容量および高い
疎水性の度合いをも有し、かつ調製の容易な材料を意味
している。したがって、本発明はこのような型の諸特性
を有するクロマトグラフィー用支持体材料およびこれら
の調製方法を提供する目的に基づいている。
とに、この型のクロマトグラフィー用支持体材料が、例
えば 2,3- ジヒドロキシプロポキシ基(-O-CH2-CHOH-CH
2OH;「ジオール」基)により公知の方法で改質されたシ
リカゲル粒子を更にもう1つの段階において脂肪酸誘導
体と反応させてエステル結合を形成させることによって
調製することができることを見出した。次に、その外部
表面上のアシル基をエステラーゼおよび/またはリパー
ゼを用いて酵素反応的に除去する。驚くべきことにこの
反応には粒子に結合させたリパーゼさえも適している。
これによって安定な支持体材料が得られる。この発見は
Haginaka 等の教えるところより見て驚くべきことであ
って、その理由はエステル結合はアミド結合よりも更に
不安定だからである。本発明による材料は従来技術に比
して調製が容易であり、その理由は容易に入手できる酵
素を使用でき、かつその必要な「ジオール」相が追加の
反応を必要とすることなくその表面上で製造することが
できるからである。
そして細孔の内部表面に限定されている脂肪酸残基を逆
相として有する多孔質材料に基づく液体クロマトグラフ
ィー用充填材において、上記脂肪酸残基がエステル結合
の中に存在していることを特徴とする、上記充填材に関
する。各粒子の外部表面は親水性である。
えばシリカゲルや多孔質ガラスを使用することができ
る。この型の多数の材料が市販で入手でき、それらは例
えば、デューレン(Dueren)のマケライ& ナーゲル(Mache
rey & Nagel)社により提供されるヌクレオシル(Nucleos
il) ( 商標)、ダルムシュタットの E. メルク(Merck)
社により提供されるリクロスファー(LiChrospher) ( 登
録商標)、 あるいは米国のエレクトロ−ヌクレオニクス
( Electro-Nucleonics Inc.)社により提供されるコント
ロールド−ポアガラス( Controlled-Pore Glass )(商
標)、マインツのショット社により提供されるビオラン
( Bioran )(登録商標)ガラス等である。これらの材料
は例えば公知の方法により適当な「ジオール」相、すな
わち2,3-ジヒドロキシプロポキシ- 改質された支持体に
変換することができる(英国 IRL-Press 刊行(1985)
のデイーン(Dean), P.D.G.、 ジョンソン(Johnson), W.
S.、ミドル(Middle), F.A.、 : アフィニテイー クロマ
トグラフィー ( "AffinityChromatography"))。
して使用することのできる最終処理済「ジオール」相は
また市販でも入手することが可能であって、すなわち例
えばLiChrospher (登録商標) ジオール(ダルムシュタ
ットの E. Merck 社により提供される)である。
たはコポリマーが同様に本発明による吸着材用出発材料
として適しており、この型の材料も市販で入手すること
ができる。例えば日本の東洋ソーダ社より提供されるT
SK−ゲル(登録商標)、ヴァイターシュタット( Weit
erstadt ) のリョ−ム−ファーマ( Roehm-Pharma) 社よ
り提供されるオイペルギト(Eupergit) ( 登録商標)等
である。一般に、充分なヒドロキシル基密度(すなわち
約2〜6μモル/m2 )を有する全ての親水性多孔質材料
が本発明によるクロマトグラフィー用支持体材料用の出
発材料として適している。
び/または不飽和の、偶数個または奇数個の炭素原子を
有する種々の脂肪酸から導かれる。炭素原子の数は必要
な疎水性の程度に応じて2個と24個との間で、逆相に
基づくクロマトグラフイーについての慣用的方法と同様
に適当に選ぶことができる。それらの残基は直鎖状であ
るのが好ましいけれども、しかしながらまた分枝鎖を有
する化合物も適している。酪酸(C4 )、カプリル酸
(C8 )およびステアリン酸(C18)の残基が特に好ま
しい。
されていて、脂肪酸の残基から成り立っている逆層を有
し、かつ次の工程を有する液体クロマトグラフィー用の
充填材料を製造する工程に関係している: a) 出発材料中にヒドロキシル基が存在してないとき
には、ヒドロキシル基をその支持体材料の中に導入し、 b) 脂肪酸でヒドロキシル基をエステル化し、ただし
粒子の全内部表面および外部表面はカバーされており、 c) 外部表面の上にある脂肪酸エステルを酵素的に加
水分解する。
はモノ−、ジ−およびトリ官能性シラン化合物ならびに
それらの混合物である。モノ−および/またはジ−官能
性シラン化合物と反応して、対応する「ジオール」相が
得られる、表面上にシラノール基の均一分布を有するシ
リカゲル支持体が好ましい。これ以下の反応のための出
発材料として好ましいものはシラノール基を含む種々の
材料(シリカゲル、多孔質ガラス)であり、それらは2
−6μモル/m2 、好ましくは 2.5 - 3.5μモル/m2 の
「ジオール」基をその相表面に有している。
者には公知であり、これらはその酸の対応する酸無水
物、酸アジド類、酸ハロゲン化物、特に酸塩化物であ
る。酪酸(C4 )、カプリル酸(C8 )及びステアリン
酸(C18)の塩化物が好ましい。これはその固定化され
たグリセリン残基(「ジオール」残基)の第1級および
/または第2級ヒドロキシル基がその酸ハロゲン化物と
公知の方法で対応するエステルを形成することを含むの
である。
肪酸ハロゲン化物との反応はその用いた材料の「ジオー
ル」含有量に対して4倍ないし10倍、好ましくは8倍
ないし9倍過剰の酸塩化物を用いて実施される。この反
応は通常は、1ないし3当量の有機塩基、好ましくは
1.5当量のトリエチルアミンの存在のもとに無水の溶
媒、例えばクロロホルム中で行われる。0−10℃、好
ましくは4℃において、冷却した酸ハロゲン化物を滴加
した後にその反応混合物を20−25℃において12〜
15時間反応させる。得られた材料を濾過、分離し、ク
ロロホルム、メタノール、水で数回洗浄し、更に再びメ
タノールで洗浄し、乾燥する。
記述されている( 例えばシュトットガルトのゲオルク−
テイーメ出版社( Georg-Thieme Verlag ) 刊行のフウベ
ン−ヴァイル著( Houben-Weyl )の「有機化学の方法」
( Methoden der OrganischenChemie)のような公知の種
々の方法によって、中でも上記反応に好適であることが
知られている反応条件のもとで合成される。公知の種々
の変法を用いることも可能であるが、これについてはこ
こでは詳述しない。
18- 脂肪酸リガンドはいずれの場合にも出発材料の「ジ
オール」含有量についてその表面の 60 %と 90 %との
間、好ましくは 80 %を占める。
外部表面の上に位置するモノアシル−およびジアシルエ
ステルは、例えば種々のリパーゼ(EC 3.1.1.3)また
はエステラーゼ(EC 3.1.1.1)のようなエステル分解
酵素によって酵素反応的に除去される。豚の膵リパーゼ
II 型を用いるのが好ましい。
支持体材料の場合には、その酵素反応的加水分解を種々
の可溶性酵素を用いて行うことが可能である。と言うの
はこれらは細孔の内側から実質的に排除されているから
である。
いて、外部表面に位置する脂肪酸残基を除去するために
粒子に結合されている種々の酵素が用いられる。この目
的のためには、例えば種々のエステラーゼまたはリパー
ゼを、文献に公知の方法〔英国の IRL-Press Ltd. 刊行
(1985) の "Affinity Chromatography"〕によって、例
えばアガロースゲルに共有結合的に結合させる。一般に
粒子に結合させた酵素は巨大分子基質と僅かしか、また
はまったく反応しないと考えられているから、この型の
酵素調剤が適していることは驚くべきことであり。
素を容易に回収することができるという工程に種々の変
法を許容することになる。例えば Magnogel ( 商標)A
4RまたはMagnogel(商標)AcA44( フランス生物
学工業、 L'Industrie Biologique Francais)のような磁
性を有する担体材料がこの目的のためにそれら酵素を結
合させるのに用いられる。このクロマトグラフィー用支
持体材料の外側に位置する脂肪酸残基が酵素反応的に除
去された後に、その固定化酵素は磁石を用いて反応混合
物から取り除き、再使用することができる。
使用することは、比較的大きな細孔(> 8 nm) を有する
クロマトグラフィー用支持体材料が要求される場合には
有利である。細孔の大きさが広い分布を有する場合に
は、粒子に結合させた酵素を使用することが同様に有利
である。このような場合には、これら酵素が相当な割合
細孔の中に侵入するのを成功裏に防止し、従ってそれら
細孔の内部表面上に位置している脂肪酸残基を望ましく
ない態様で除去することを防止している。
場合には、酵素反応の後に60℃に加熱することにより、
および/または変質性またはカオトロピックな化合物
(例えば尿素、グアジニウム塩酸塩、チオシアニン酸塩
類)で処理することによって溶解することができる。こ
の可溶化した酵素調剤はこの次に濾過によって反応混合
物から除去することができる。
に位置する脂肪酸エステルの酵素反応的加水分解は、例
えば特定の脂肪酸−改質された支持体材料1gを特定の
溶解した、または担体に結合させたリパーゼまたはエス
テラーゼ2,000 ないし 8,000の酵素単位、好ましくは
5,000の酵素単位とともにpH6〜8、好ましくはpH
7.1 の緩衝液の中で 37 ℃において 60 〜 90 時間イン
キュベーションすることにより実施される。
離し、緩衝液、塩化ナトリウム溶液(1モル/リット
ル)および水で数回洗浄する。溶解した酵素を用いた場
合には引き続いてそのクロマトグラフィー用支持体材料
を乾燥させることができる。アガロースの上に固定化さ
れたリパーゼ又はエステラーゼを用いた場合には、得ら
れた材料をまず20重量部の水中に再懸濁させ、60℃にお
いて好ましくは2時間加熱する。これを次に濾過分離
し、塩化ナトリウム溶液(1モル/リットル)、水およ
びメタノールで数回洗浄し、そして乾燥させる。
ている脂肪酸リガンドは元素分析および/また市販で入
手できる遊離脂肪酸の酵素反応検査(例えばドイツ国マ
ンハイムのベーリンガー Boehringer 社より提供され
る)によって求めることができる。
部表面から除去される割合は、可溶性のリパーゼまたは
エステラーゼを用いる場合には、典型的にはその全表面
占有量に対して 10 〜 20 %であり、担体に結合させた
リパーゼまたはエステラーゼを用いる場合には、1〜5
%である。
トグラフィー的に分離する方法に関係し、多孔質粒子が
その内部表面上に脂肪酸エステルよりなる逆相を有して
いるクロマトグラフィー充填材料が使用されることを特
徴としている。
法に関係し、多孔性粒子がその内部表面の上に脂肪酸エ
ステルよりなる逆相を有している材料を使って、随伴し
て妨害する巨大分子量物質を除去することを特徴として
いる。
有し、かつ親水性の外部表面を有する本発明に従って調
製されるクロマトグラフィー用支持体材料はクロマトグ
ラフィー用の充填材として極めて適しており、特にカラ
ムクロマトグラフィーによって種々の蛋白質含有試料を
直接注入、調製、分析するための充填材として適してい
る。
料の調製を実施例によって記述するが、この記述は本発
明に制限を加えるものでない。従来技術水準より一般に
公知のISRP充填材と比較した利点は報告済みの各使
用例から明らかである。実施例 1 2,3-ジヒドロキシプロポキシ基で改質されているシリカ
ゲルより出発して、その細孔の内部表面上にC18−アル
カノイル鎖を有するクロマトグラフィー用支持体 材料の調製 1.1. エポキシド化 10 g の LiChrospher(登録商標)Si(比表面積 350 m
2/g 、粒径 12 μm および平均の細孔直径 7 nm を有す
る球状シリカゲル)を 50 mlのトルエンの中に懸濁させ
る。2.6 ml(3μモル/m2 に相当する)のグリシジルオ
キシプロピルメチルジメトキシシランを加え、次にその
混合物を還流しながら攪拌しながら5時間煮沸する。そ
の材料を濾過分離し、トルエンおよびメタノールで洗浄
し、乾燥する。 1.2. 「ジオール」相を形成するための開環 上記1.1.からの生成物を硫酸水溶液(濃度5重量
%)50 ml の中に懸濁させ、徐々に攪拌しながら3時間
還流しながら煮沸する。次にその反応生成物を濾過分離
し、硫酸イオンがなくなるまで水洗し、メタノールで洗
浄し、乾燥する。2.79μモル/m2 (C 7.0%の含有量か
ら算出)の被覆量を有するジオール−改質シリカゲルが
得られる。 1.3. 塩化ステアロイルとの反応 上記1.2.において得られた支持体材料1gを攪拌機
と温度計とを備えた3つ口フラスコの中で無水のクロロ
ホルム5 ml の中に懸濁させ、冷却したトリエチルアミ
ン 11.7 ミリモルを加える。
させた塩化ステアロイル 7.8 ミリモルを滴加し、その
後にこの懸濁液を 20 ℃において 24 時間攪拌する。
ルム、メタノール、水で2回ずつ洗浄し、最後に再びメ
タノールで洗浄して乾燥させる。
ル鎖(ステアロイル基)の計算結果は 1.98 μモル/m2
の値を示している。 1.4. リパーゼを用いる酵素−触媒的除去 上記1.3.において得られた材料1gを20 ml の緩衝
溶液(2ミリモル トリス HCl、1ミリモル CaCl2 、
7ミリモル NaCl、pH= 7.1)の中に溶解されている
50 mgの豚の膵臓リパーゼ II 型(5,000 酵素単位に相
当)(ドイツ国ミュンヘン、 Muenchenのシグマ化学、Si
gma Chemie社より提供)と混合する。この混合物を振盪
しながら72時間 37 ℃において反応させる。得られた材
料を濾過分離し、続けて2回上記緩衝液 30 mlで、さら
に塩化ナトリウム溶液(1モル/リットル)、水および
エタノールで洗浄し、乾燥させる。酵素反応的除去の後
に元素分析による表面占有C18−アルカノイル鎖の計算
結果は 1.68 μモル/m2 の値を示している。 1.5. 粒子に結合させたリパーゼを用いる酵素−触
媒的除去 上記1.3.において得られた材料1gを20 ml の緩衝
溶液(2ミリモル トリス HCl、1ミリモル CaCl2、
2ミリモル NaCl、 pH= 7.1)の中に溶解された 5,0
00 酵素単位の小麦胚リパーゼ(ドイツ国ミュンヘン、
Muenchenのシグマ化学 Sigma Chemie 社から提供され
た、架橋化(4%)したアガロースに結合させたI−A
型、カタログ No. L 2764 )と混合する。この混合物を
振盪しながら 72 時間 37 ℃において反応させる。得ら
れた材料を濾過分離し、引き続き2回上記緩衝液 30 ml
で、塩化ナトリウム溶液(1モル/リットル)および水
で洗浄する。得られた材料を 20 mlの水に再懸濁させ、
振盪しながら2時間 60 ℃に加熱する。この材料を次に
濾過分離し、 上記の塩化ナトリウム溶液30ml(1モル/
リットル)、水およびメタノールでそれぞれ連続して2
回乾燥する。酵素反応的除去の後に元素分析による表面
占有C18−アルカノイル鎖の計算結果は 1.90μモル/m2
の値を示している。実施例 2 2,3-ジヒドロキシプロポキシ基で改質されているシリカ
ゲルより出発して,その細孔の内部表面上にC8 −アル
カノイル鎖を有するクロマトグラフィー用支持体 材料の調製 この材料の調製は前記1.1.ないし1.5.に記載し
た方法と同様にして塩化ステアロイルの代わりに塩化カ
プリロイルを用いて行なう。実施例 3 2,3-ジヒドロキシプロポキシ基で改質されているシリカ
ゲルより出発して、その細孔の内部表面上にC4 −アル
カノイル鎖を有するクロマトグラフィー用支持体 材料の調製 この材料の調製は前記1.1.ないし1.5.に記述し
た方法と同様にして塩化ステアロイルの代わりに塩化ブ
チリルを用いて行なう。実施例 4 容量係数(k') テオフィリンおよびフェニトインの容量係数(k')を種
々の充填材(実施例1〜3参照)について求めた。これ
らの値はまた従来技術(ヨーロッパ特許 EP 0173 233
)による材料についても比較のために求めた。
線A)および除去後(同曲線B)に本発明による充填材
を検討した。
よって得られた材料(例1.5.)はそのクロマトグラ
フィー的諸特性では溶解したリパーゼを用いて得られた
材料(例1.4.参照)とは大きな差異を示さなかっ
た。
る: k' =(tR - tM)/tM (但し tR = 分析物の保持時間、tM = 移動相の保
持時間) クロマトグラフィー条件は下記のとおりであった: カラム直径 : 30× 4 mm ( 内径) 移動相 : 水 流速 : 0.5 ml/min 検出 : UV 271/205 nm テオフィリン: 9.2 μg/ml フェニトイン: 5 μg/ml 注入体積 : 100 μl 比較試験(* ) 比較試験におけるクロマトグラフィー条件は下記のとお
りであった: 移動相 :85 % (V/V) 0.1 モル K2HPO4 緩衝液
(pH 6.8) 、 10 % (V/V) イソプロパノール) 、 6 % (V/V) テトラヒドロフラン 流速 :1 ml/min このようなクロマトグラフィー条件のもとではヨーロッ
パ特許 EP 0 173 233に記載されているISRPカラム
(米国イリノイ州、モートングローブ MortonGrove の
レギス化学会社 Regis Chemical Company 社の GFF-S 5
-80 )からはフェニトインは溶離し、その k' 値は僅か
に 11.36 である。すなわちこの材料は本発明による材
料についての容量係数の半分よりも低い容量係数を有す
る。結果 : 充填材 容量係数 (* ) テオフィリン フェニトイン ─────────────────────────────────── C-18 (ステアロイル) A 20.7 30 B 18.9 30 26.3 C-8 (カプリロイル) A 3.2 > 30 B 2.5 > 30 24.5 C-4 (ブチリル) A 0.0 20.6 B 0.0 18.6 16.0 ───────────────────────────────────実施例 5 蛋白質溶離挙動 人の血清 500μl を下記のクロマトグラフィー条件のも
とに供給した: 充填材 : 実施例1と同一 カラム寸法 : 10 × 4 mm (内径) 移動相 : 水 流速 : 0.5 ml/min 検出 : UV 280 nm 結果を図1に示す。図1Aは最初の注入についての溶離
挙動を示し、図1Bは第 10 番目の注入についての溶離
挙動を示す。
(実施例1.5.参照)によって得られた材料は溶解し
たリパーゼ(実施例1.4.参照)を用いて得られた材
料とはそのクロマトグラフィー的諸特性において大きな
差異を示さなかった。実施例 6 蛋白質回収 人の血清 500μl を実施例5に記載したクロマトグラフ
ィー条件のもとに何回も供給した。溶離液中の各血清蛋
白質の回収はビューレット法による蛋白質比色分析によ
って測定した。 結果: 注入の番号 回収率(%) 1 99.6 2 102.3 3 98.5 4 101.5 5 99.7実施例 7 人の血漿中のフェニトインを分析するための総合試料調
剤による直接注入 A) 装置の設計 装置の設計は図2から明らかであるが、この図における
標識数字はそれぞれ下記を表わす: 1・・・プレカラム緩衝液 2・・・分析用緩衝液 3・・・HPLCポンプ(L-6000) 4・・・HPLCポンプ(L-6200) 5・・・自動試料供給装置 (AS-4000) 6・・・自動逆転弁(ELV 7000) 7・・・プレカラム 8・・・分析用カラム 9・・・検出装置 10・・・積分器(D-2500) 11・・・排出部 (装置はドイツ国ダルムシュタットの E. メルク Merc
k 社より提供された) B) 自動逆転弁(6)のセット 逆転弁のセットに依存して設定される図2中の各ユニッ
トの間の配管の連結は図3から明らかである。図3Aは
「供給」用設定、図3Bは「注入」用設定を示す。 C) クロマトグラフィー条件 プレカラム : 実施例1と同一 カラム寸法 : 30× 4 mm (内径) プレカラム緩衝液: 0.05モル NaH2PO4 (pH 4.0) 分析用カラム : LiChrospher (登録商標)60 RP-
select B、5μm 125 × 4 mm (内径) 分析用緩衝液 : 0.05モル NaH2PO4 (pH 4.0)/水/
アセトニトリル( 40:40:30 (V:V:V) ) 検出 : UV 205 nm D) 全自動分析サイクル 逆転弁(6)を「供給」用セット位置において血漿試料
(100 μl) を自動試料供給装置(5)によって注入し
た後に、HPLCポンプ(3)により送り込まれたプレ
カラム緩衝液(1)を用いて本発明による吸着材が含ま
れているプレカラム(7)にこの試料を送り込む(流速
0.5 ml/min)。分析物(フェニトイン)は本発明による
特性のためにこのプレカラム(7)の上に選択的に保持
され、一方残余の生物学的マトリックス(各種蛋白質
等)は直接に、かつ定量的に排出部(11)へ 12 分間以
内に送られる。
れた後に、その分析物はHPLCポンプ(4)によって
送り込まれた分析用緩衝液(2)により5分間以内にプ
レカラム(7)から完全に溶離され(流速:0.8 ml/mi
n)、その後に下流の分析用カラム(8)へ送り込まれ
る。
に、アイソクラチック (isocratic)条件のもとに分析的
分離が起こる(流速:0.8 ml/min) 。溶離された化合物
は検出装置(9)の中で検出され、そのデータは積分器
(10)において評価される。同時にプレカラムは新しい
分析サイクルのためにポンプ(3)によって処理され
る。 E) 分析結果 図4は得られた溶離線図を含む。図4A 対照物(フェ
ニトイン1μg :標識数字 14 )、図4B フェニトイ
ン(標識数字14)1μg を含む人の血漿 (100 μl)実施例 8 総合試料調剤による直接注入、イオン対モードでの分
離:人の血清中のトリプトファン代謝物の分析 装置の設計および自動逆転弁の設定は実施例7における
設定と同一である。 C) クロマトグラフィー条件 プレカラム : 実施例1と同一 カラム寸法 : 30× 4 mm (内径) プレカラム緩衝液: 0.1 モル NaH2PO4、5 m モル オ
クタン-1- スルホン酸 pH 4.0 分析用緩衝液 : 0.1 モル NaH2PO4、5 m モル、オ
クタン-1- スルホン酸、20 % (V/V) アセトニトリル、
pH 6.0 検出 : 蛍光、励起 300 nm 、発光 350 n
m D) 全自動分析サイクル 血漿試料(100 μl) を自動試料供給装置(5)によっ
て電気的逆転弁(6)の「供給」用セット位置において
注入した後に、HPLCポンプ(3)により送り込まれ
たプレカラム緩衝液(1)を用いて本発明による吸着材
が含まれているプレカラム(7)に試料を送り込む(流
速 0.5 ml/min)。分析物 5- ヒドロキシインドール酢酸
はその選定pH条件 (pH 4) では中性ではあるが、分析
物である5- ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)は
正電荷を有し、これは親油性イオン対試薬(オクタン-1
- スルホン酸)の添加により平衡が保たれている。この
ようにして両分析物をイオン対クロマトグラフィー条件
のもとでプレカラム(7)に選択的に保持させることが
可能であって、一方残りの生物学的マトリックス(各種
蛋白質等)は直接にかつ定量的に 12 分間以内に排出部
(11) へ送り出される。弁(6)が「注入」セット位置
へ逆転された後に、各分析物はHPLCポンプ(4)に
よって送り込まれた分析用緩衝液(2)により、pHの
上昇(pH6.0 )と有機溶媒の含有量(20 % アセトニト
リル)の結果により3分間以内にプレカラム(7)から
完全に溶離され(流速:1 ml/min)、その後に下流の分
析用カラム(8)へ送られる。
に、アイソクラチック (isocratic)条件のもとに分析的
分離が起こる(流速:0.8 ml/min)。溶離された各化合
物は検出装置(9)の中で検出され、そのデータは積分
器(10)において評価される。同時にプレカラムは新し
い分析サイクルのためにポンプ(3)によって処理され
る。 E) 分析結果 図5は下記の得られた溶離図を含む。 図5A 対照物 5-ヒドロキシインドール酢酸 66.8 p
mol : 標識数字 12 、 5-ヒドロキシトリプタミン 80.2 pmol : 標識数字 1
3 、 図5B 人の血漿 (100 μl)、以下の対照試薬を含有す
る。
: 標識数字 12 、 5-ヒドロキシトリプタミン 89.6 pmol : 標識数字 1
3 、
構成を示す図式図
態様を示す図式図
標識数字 13 溶離図上での 5- ヒドロキシトリプタミンの標
識数字 14 溶離図上でのフェニトインの標識数字
Claims (9)
- 【請求項1】 ヒドロキシル基を含み、粒子の内部表面
に限定されている逆相を有する多孔質材料に基づく、液
体クロマトグラフィー用充填材料において、上記逆相が
脂肪酸エステルよりなることを特徴とする上記充填材
料。 - 【請求項2】 多孔質粒子が 2,3- ジヒドロキシプロポ
キシ基で改質されたシリカゲルよりなることを特徴とす
る請求項1による充填材料。 - 【請求項3】 多孔質粒子が 2,3- ジヒドロキシプロポ
キシ基で改質されたガラスよりなることを特徴とする請
求項1による充填材料。 - 【請求項4】 多孔質粒子がヒドロキシル基を含む有機
ポリマーまたはコポリマーよりなることを特徴とする請
求項1による充填材料。 - 【請求項5】 多孔質粒子の内部表面に限定されてい
て、脂肪酸エステルよりなる逆相を有する液体クロマト
グラフィー用充填材料を製造するに当り、下記の、すな
わち a) 出発材料中にヒドロキシル基が存在していないと
き、ヒドロキシル基をその支持体材料の中に導入し、 b) 各粒子の内部および外部の全表面上でそのヒドロ
キシル基をエステル化させ、 c) 外部表面の上にある脂肪酸エステルをリパーゼお
よび/またはエステラーゼにより酵素的に加水分解する 各工程段階を含む方法。 - 【請求項6】 エステル分解酵素が或る担体に化学的に
結合されており、そしてこの担体の粒径が多孔質粒子の
平均孔直径より大きいことを特徴とする請求項5による
方法。 - 【請求項7】 用いた担体が磁性を有していることを特
徴とする請求項6による方法。 - 【請求項8】 種々の物質の混合物をクロマトグラフィ
ー的に分離する方法において、内部表面が脂肪酸エステ
ルで被覆されている多孔質クロマトグラフィー用充填材
料を用いることを特徴とする方法。 - 【請求項9】 生物学的試料の試料調製方法において、
妨害している随伴する巨大分子物質が内部表面の上に脂
肪酸エステルよりなる逆相を有する多孔質粒子の材料に
よって除去されることを特徴とする方法。
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