JPH0518972A - 免疫学的測定用試薬の前処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】より高感度、高精度な測定を可能とする、不溶
性粒子担体を含む免疫学的測定用試薬の前処理方法の提
供。 【構成】不溶性粒子担体を含む免疫学的測定用試薬に、
マイクロ波を照射して不溶性粒子担体を速やかに分散さ
せることにより前処理を行う。 【効果】本発明は、加温による従来法に比べ前処理に要
する時間を飛躍的に短縮する。本発明によって処理され
た試薬は、感度や再現性の点において従来のものをしの
いでいる。本発明は、免疫学的測定の時間短縮や、精
度、正確度の向上に貢献する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原抗体反応に基づく
免疫学的測定用試薬の前処理方法に関するものである。
具体的には、不溶性粒子担体で構成される免疫学的測定
用試薬の使用にあたり、高感度、高精度な分析を可能と
するための試薬前処理に関するものである。

【０００２】

【従来技術の問題点】免疫学的測定用試薬には、不溶性
粒子担体に免疫学的活性成分を結合させたものがある。
この種の試薬はＢ／Ｆ分離用固相担体として機能する場
合を除けば、主として抗原抗体反応を不溶性粒子担体の
凝集としてとらえる、いわゆる免疫学的粒子凝集反応に
用いられる。不溶性粒子担体の凝集は、目視で定性的に
確認することもできるし、光学測定によって定量的に追
跡することも可能である。この免疫学的粒子凝集反応
は、直接的な検出が困難な抗原と抗体の反応物を不溶性
粒子担体の凝集という形で増幅することによって高感度
に検出するというものである。したがって不溶性粒子担
体の分散状態が測定結果に及ぼす影響は大きい。中でも
光学測定を行う場合には、免疫学的測定用試薬における
不溶性粒子担体の分散状態が、測定結果の再現性、正確
性に重要な影響を与える。不溶性粒子担体は、抗原抗体
反応を行うまでは可能な限り均一に分散している方が好
ましいのである。

【０００３】一般に免疫学的活性成分を結合した高分子
ラテックス、シリカ、カオリン等の不溶性粒子担体は、
粒子自身の比重によって沈澱し、また粒子同士の吸引力
の作用で保存中に自然凝集を起こす傾向がある。試薬中
の不溶性粒子担体の沈澱は容器中に濃度勾配を生じ、そ
のままでは測定に用いることができない。一方不溶性粒
子担体の自然凝集は、特に光学測定を行うときに試薬ブ
ランク値を高め、再現性不良等の原因となる。

【０００４】従来は、不溶性粒子担体の沈澱や自然凝集
の影響を除くために測定に先だって振とうしたり、加温
処理を施す等の対策が採られていた。また試薬を凍結乾
燥しておくことによって、これらの影響を除く試みもあ
る。

【０００５】ところが振とうは沈澱の解消には有効なも
のの、自然凝集に対しては十分な効果を持たず、また操
作の標準化が困難である。一方加温処理は通常３７℃前
後で１時間以上というような条件で行われ、時間的な問
題を持つ。試薬の凍結乾燥は、試薬の溶解という付加的
な操作を要求されるうえに、溶解後の不溶性粒子担体の
分散性には十分な信頼性を期待できないことが多い。

【０００６】

【発明の課題】本発明は、懸濁状態で供給された免疫学
的測定用試薬中の不溶性粒子担体を、より簡便な操作に
よって短時間で均一に分散させるための技術を提供する
ものである。

【０００７】

【発明の構成】本発明は、導電性素材を実質的に含有し
ない不溶性粒子担体に固定された免疫学的活性成分から
構成される免疫学的測定用試薬に、マイクロ波を照射す
ることを特徴とする免疫学的測定用試薬の前処理方法で
ある。

【０００８】本発明による前処理方法の対象となる免疫
学的測定用試薬とは、より具体的には次のようなものを
指す。まず、不溶性粒子担体中に導電性素材を含まない
こと。前処理にマイクロ波を利用するので、金属等の導
電気性素材を含むものはマイクロ波の照射対象として好
ましくない。しかし現在利用されている不溶性粒子担体
の多くは、ポリスチレンやゼラチン等の高分子重合体、
コレステロールやレシチン等の脂質、シリカ、ガラス、
顔料、細菌菌体や動物血球等の天然粒子で構成されてい
るため、現実にはほとんど全ての免疫学的測定用試薬に
対して適用可能と言うことができる。逆に本発明の前処
理に不適当な不溶性粒子担体とは、たとえば磁気による
Ｂ／Ｆ分離を目的とした磁性体封入ラテックス粒子等
で、どちらかというと例外的な試薬であるといえよう。

【０００９】これら不溶性粒子担体は、表面に抗原、ハ
プテン、抗体、抗体断片、それらの変性物等の免疫学的
活性成分を、物理吸着や化学結合によって担持してお
り、直接凝集、受身凝集、凝集阻止等の各種分析系に利
用される。抗原成分としては天然由来のもの、化学合成
したもの、遺伝子操作によって得られた組み換え抗原等
が、また抗体としてはモノクローナル抗体やその断片等
が利用できることは言うまでもない。

【００１０】このような免疫学的測定用試薬を、ガラ
ス、合成樹脂等のマイクロ波透過性容器に入れて市販の
マイクロ波加熱装置によりマイクロ波照射を行う。マイ
クロ波とは、周波数が３００MHz から３００GHz （波長
が１m から１mm）の電磁波につけられた通称であり、こ
の波長帯はテレビ放送等の各種通信用に広く利用されて
いる。家庭用の電子レンジや癌の温熱療法等は、このよ
うな電磁波をエネルギーとして誘電体の加熱に応用した
もので、使用する周波数はＩＳＭ周波数帯として国際的
に定められている。わが国では２４５０MHz 帯が主に利
用されている（高周波の基礎と応用、東京電気大学出版
局）。マイクロ波のこのような性質から、免疫学的活性
成分に対しても破壊作用を及ぼすように思われるが、意
外にも実際には非常に良好な不溶性粒子担体分散効果を
示すのである。

【００１１】本発明に利用するマイクロ波も、基本的に
は同じ電磁波である。しかし本発明においてはマイクロ
波を加熱のための手段としてではなく、免疫学的測定用
試薬の前処理工程に利用するものである。したがって本
発明に好適なマイクロ波は、周波数については同じ帯域
を用いるが、出力の点では数十W から数百W 程度、更に
具体的には５０〜５００W 程度のものが利用しやすい。
これは本発明におけるマイクロ波の照射効果が主として
出力、照射時間、試薬量等に支配されるため、出力があ
まり大きくなると照射時間のわずかな変動が大きな影響
を持つようになり、結果として処理の再現性を確保しに
くくなることが予想されるためである。また極端な場合
には、ほんのわずかな照射にもかかわらず試薬の変性を
起こすような温度上昇につながる可能性もあるので、本
発明に用いるマイクロ波の出力は低い方が扱い易いとい
える。

【００１２】マイクロ波照射の条件を更に具体的に示せ
ば、ポリスチレンラテックス粒子を不溶性粒子担体とし
て０．１％程度含有する免疫学的測定用試薬５mlに対
し、周波数２４５０MHz 、出力１００W のマイクロ波を
照射する場合、３０秒から１分程度で十分な効果を得る
ことができる。出力や照射時間は、試薬量、試薬中の水
分含量等にも左右されるので、不必要な温度上昇を起こ
さない範囲内で、十分な効果が期待できる条件を適宜設
定してやればよい。マイクロ波の照射にあたっては、赤
外線温度センサー等によって温度を管理すれば、試薬の
変性や分散媒の蒸発等につながる不必要な温度上昇を容
易に防止することができるので便利である。

【００１３】本発明による前処理は、光学的測定用をは
じめとして、スライド凝集反応用、マイクロタイター法
用等の幅広い免疫学的測定用試薬に対して有効である
が、光学測定を行う場合にはその効果が最も大きい。

【００１４】

【発明の作用】本発明におけるマイクロ波照射は、免疫
学的測定用試薬中の不溶性粒子担体の分散を促進する作
用を有する。実施例の結果からも分かるように、マイク
ロ波照射によって加温操作では達成することができな
い、非常に良好な分散促進効果を得られる。このこと
は、マイクロ波が単なる加熱作用を持つのみではなく、
マイクロ波に固有の分散促進作用が存在することを示し
ている。以下、実施例に基づいて本発明を詳しく説明す
る。

【００１５】

【実施例】

実施例１．マイクロ波照射の影響 抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）抗体結合ラテッ
クス粒子担体を含む試薬にマイクロ波を照射し、不溶性
粒子担体の分散に及ぼす効果を調査した。１−１．ｈＣ
Ｇ測定用試薬の調製抗ｈＣＧ抗体のアンモニウム緩衝溶
液（抗体濃度：０．１mg/ml ）１０mlに、平均粒径が
０．２３６μのポリスチレンラテックス粒子分散液（ダ
ウ・ケミカル製、固形分濃度：１０重量％）１mlを加
え、３７℃に加温して１時間かくはんした後、２〜４℃
に冷却下３０分間１００００rpm で遠心分離を行った。
上清を傾斜除去し、沈澱した抗ｈＣＧ抗体結合ラテック
スをアンモニウム緩衝液で遠心洗浄後、０．５％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）含有アンモニウム緩衝液で１０
mlに懸濁し、ｈＣＧ測定用試薬を得た。このｈＣＧ測定
試薬を２〜１０℃に６ヶ月静置した。

【００１６】１−２．ｈＣＧ測定用試薬の前処理 １−１で調製後６ヶ月間静置保存したｈＣＧ測定用試薬
５mlをガラス製サンプル瓶に採り、２４５０MHz 、出力
１００W および５０W のマイクロ波を照射して一定時間
毎にｈＣＧ測定用試薬を０．５％ＢＳＡ含有アンモニウ
ム緩衝液で２０倍に希釈して７５０nmにおける吸光度
（光路長：５mm）を測定し分散促進効果を追跡した。な
おマイクロ波照射中の温度は、赤外線温度センサーを利
用して３７℃に保った。一方対照として、同じく５mlの
ｈＣＧ測定用試薬を試験管に採り、３７℃の水浴中で加
温しながら一定時間毎に同じ条件で吸光度測定した。結
果は表１に示すとおりである。

【００１７】

【表１】 出力１００W のマイクロ波を照射したものは、１分間の
処理で十分な分散効果を得ることができ、安定な吸光度
を示すようになった。しかし３７℃加温のものでは試薬
ブランクが安定するまでに約１時間を要した。マイクロ
波の出力を５０W にした場合には１００W に比べ多少効
果は劣るが、加温操作よりもはるかに良好な分散効促進
果を示した。

【００１８】実施例２．マイクロ波照射による測定結果
への影響 抗ヒトＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）抗体結合ラテックス粒子
担体を含む試薬にマイクロ波を照射し、実際の測定結果
に及ぼす効果を調査した。 ２−１．ＣＲＰ測定用試薬の調製 抗ＣＲＰ抗体のアンモニウム緩衝溶液（抗体濃度：０．
２mg/ml ）１０mlに、平均粒径が０．１０９μのポリス
チレンラテックス粒子分散液（ダウ・ケミカル製、固形
分濃度：１０重量％）１mlを加え、３７℃に加温して１
時間かくはんした後、２〜４℃に冷却下３０分間１００
００rpm で遠心分離を行った。上清を傾斜除去し、沈澱
した抗ＣＲＰ抗体結合ラテックスをアンモニウム緩衝液
で遠心洗浄後、０．５％ＢＳＡ含有アンモニウム緩衝液
で１００mlに希釈し、ＣＲＰ測定用試薬を得た。このＣ
ＲＰ測定用試薬を２〜１０℃に６ヶ月静置した。

【００１９】２−２．ＣＲＰ測定用試薬の前処理および
測定 ２−１で調製後６ヶ月間静置保存したＣＲＰ測定用試薬
１０mlをガラス製サンプル瓶に採り、２４５０MHz 、出
力１００W のマイクロ波を１分間照射してから実際にＣ
ＲＰ含有血清の測定を行った。なおマイクロ波照射中の
温度は、赤外線温度センサーを利用して３７℃に保っ
た。一方対照として、同じく１０mlのＣＲＰ測定用試薬
を試験管に採り、３７℃の水浴中で１０分間、および３
０分間の加温後測定を行うもの、ならびに加温処理も行
わずそのまま測定に用いるものを用意した。ＣＲＰ測定
操作は次のとおりである。各処理を行った後のＣＲＰ測
定用試薬１mlに対し、ＣＲＰ含有血清（５０ng/ml ）を
２００μl 添加し、かくはんした後４０秒後から１４０
秒間の５８５nmにおける吸光度変化（光路長：５mm）を
測定した。測定は、各処理に対してそれぞれ１０回繰り
返し再現性を比較した。結果を表２に示す。

【００２０】

【表２】 マイクロ波照射したものは、未処理、あるいは３７℃１
０分間加温したものに比べて吸光度の変化量（平均値）
が大きく、また再現性（標準偏差と変動係数）にも優れ
ている。３７℃で３０分間加温したものに比べても、再
現性の点で優位性を示している。

【００２１】

【発明の効果】本発明によれば、免疫学的測定用試薬の
前処理をきわめて短時間に、しかも効果的に行うことが
できる。実施例中にも示したとおり、本発明による前処
理方法は処理時間の大幅な短縮を可能とする。この時間
短縮効果を数字で示せば、３７℃加温による従来法の１
／３０から１／６０となり、本発明による前処理方法の
効果の大きさを見ることができる。しかも、このような
短時間の処理にもかかわらず前処理した免疫学的測定用
試薬の感度、再現性等は、従来法による処理と同等、あ
るいはそれ以上である。以上のように本発明は、免疫学
的測定用試薬による測定時間の短縮、精度、正確性の向
上に貢献するものである。

Claims (2)

【整理番号】 Ｐ−０００２４７ 【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】導電性素材を実質的に含有しない不溶性粒
   子担体に固定された免疫学的活性成分から構成される免
   疫学的測定用試薬に、マイクロ波を照射することを特徴
   とする免疫学的測定用試薬の前処理方法
2. 【請求項２】免疫学的測定用試薬が、ラテックス粒子担
   体に免疫学的活性成分を結合させたものであることを特
   徴とする請求項１の免疫学的測定用試薬の前処理方法