JPH08184597A

JPH08184597A - 炭素ゾルラベルを用いるイムノアッセイ

Info

Publication number: JPH08184597A
Application number: JP7138578A
Authority: JP
Inventors: Amerongen Aart Van; アメロンゲン、アールトファン; Jan H Wichers; ヘルマンヴィッヘルス、ヤン; Lucienne Bernaardina Johanna Maria Berendsen; ベルダルディナヨハンナマリアベレンドセン、ルシエンヌ; Doorn Albert Willem Jacob Van; ドールン、アルベルトヴィレムヤコブファン
Original assignee: STAAT DER NEDERLAND DIENST LANDBOUKUNDICH ONDERZOEK DLO; Sutaato Der Nederland D-Nsuto Randoboukundeihi Onderutsuooku D L O; Nederlanden Staat
Current assignee: STAAT DER NEDERLAND DIENST LANDBOUKUNDICH ONDERZOEK DLO; Sutaato Der Nederland D-Nsuto Randoboukundeihi Onderutsuooku D L O; Nederlanden Staat
Priority date: 1994-05-12
Filing date: 1995-05-12
Publication date: 1996-07-16
Also published as: AU693523B2; CA2149062C; NZ272119A; IL113682A0; IL113682A; CN1114423A; FI952281A; CA2149062A1; AU1797995A; FI952281A0; CN1120986C

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】テスト試料中にて特異的に結合する蛋白質及
びその対応する結合性物質の間の反応成分を測定する方
法においてラベルとして有用な水性炭素ゾル、及び該ゾ
ルを用いる該方法を提供すること。【構成】試料を、カーボンブラックの本質的に安定化
されていない水性ゾルを含む炭素ラベルされた成分と接
触させること（ここで、コロイド炭素粒子は、その表面
に分析物を特異的に認識できる結合成分を直接コンジュ
ゲートしている）、及び該試料中の分析物の存在の指標
又は量の尺度としての、得られる分析物／炭素粒子複合
体の存在又は不存在を測定することによる試料中の分析
物の存在又は量を測定する方法。該方法に用いるのに適
した組成物、及びそれを調製するための方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、テスト試料中にて、特
異的に結合する蛋白質及びその対応する結合性物質の間
の反応成分を、測定されるべき成分の相互反応性及び、
該成分に直接に水性炭素ゾル粒子をカップリング又は吸
着することによって得られる炭素ラベルされた成分を用
いて測定する方法であって、反応中又は反応の完了の後
に、場合により結合したラベルされた成分と遊離のラベ
ルされた成分を分離した後に、該テスト試料中にて又は
分離後に得られた画分の一つ中にて、炭素ラベルの存在
及び／又は量を、測定されるべき成分の定性又は定量の
指標を得る目的に適した方法により測定することを含む
方法に関する。

【０００２】本発明は更に、特異的に結合する蛋白質及
びその対応する結合性物質の間の反応の炭素ラベルされ
た成分を、成分に直接に炭素ゾルの粒子をカップリング
又は吸着することにより調製する方法、及び水性テスト
試料中の免疫成分の測定に有用な組成物に関する。

【０００３】本明細書中で、語句「特異的に結合する蛋
白質及びその対応する結合性物質の間の反応成分」は、
細胞の表面に存在しうる物質又はその一部、例えば受容
体蛋白質及び抗原決定基、及び、種々の媒体、特に体液
例えば血漿、血清等、又は細胞培養液中に存在しうる免
疫化学的物質、例えばハプテン、抗原及び抗体を云う。

【０００４】従って、本発明は、その中で、免疫化学的
反応が起こるが、また、カップリング又は吸着がコロイ
ド炭素ラベル及び他の（巨大）分子構造物、例えば酵
素、ストレプトアビジン、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ等の
間で起こりうるところの多くの組織学、例えば組織及び
細胞の染色の分野に関係する。これらの分野に加えて、
本発明はまた、例えば診断目的（水性テスト試料中の抗
体、抗原又はハプテンの決定）のためのイムノアッセイ
の分野にも関係する。

【０００５】以下の明細書中で、本発明を、直前に記し
た分野、即ち診断イムノアッセイへの本発明の適用を特
に参照して、更に詳細に記載するが、本発明は、組織学
的な及び組織化学的な試験法に同様に適用できるので、
このような適用に限定されると解釈されるべきではな
い。

【０００６】上記で定義した方法は、ヨーロッパ特許出
願公開第０３２１００８号公報（ヴァンドールンら）
に記載されている。その中で開示されているように、非
金属元素及びいずれの金属成分をも含まない無機化合物
の水性ゾルが、ラベルとして用いられることができ、そ
してその中で挙げられている非金属元素の一つは炭素で
ある。

【０００７】

【従来の技術】米国特許第４，７６０，０３０号明細書
（ペーターソンら）は、試料中の、特異的に結合するペ
アのメンバー（ｓｂｐメンバー）の存在を測定するため
の方法を開示している。その方法は、ｓｂｐメンバーの
存在下で、凝集できる不透明な粒子を用いた凝集アッセ
イを含む。不透明な粒子は、０．２〜５．０μｍの粒子
サイズを有する炭素粒子から由来しうる。炭素粒子は、
ｓｂｐメンバーの特異的に結合するパートナーとコンジ
ュゲートされて、ｓｂｐメンバーの存在下で、それらを
凝集できるように変える。例えば、もし測定されべきｓ
ｂｐメンバー（即ち「分析物（ａｎａｌｙｔｅ）」）が
リューマチ因子（即ち、ＩｇＧのＦｃ領域に結合する自
己抗体の異種の集団）であれば、炭素粒子及びＩｇＧを
含む懸濁物が調製される。テスト結果を、テスト後のア
ッセイ媒体の光学密度（３５０〜８００ｎｍの波長にて
測定）を、凝集テスト前のアッセイ媒体の光学密度と比
較することにより読みとった。光学密度の変化は、試料
中の分析物の存在を示している。炭素粒子の自己凝集を
避けるために、ｓｂｐメンバーの特異的に結合するパー
トナーでそれらをコートする前に、、それらをアミノ
酸、例えばグリシンの水性溶液中に懸濁し、そして、ア
ッセイを、このようなアミノ酸を不透明な粒子の自己凝
集を減少するのに十分な量で含むアッセイ媒体中で行っ
た。

【０００８】また、米国特許第５，２５２，４９６号明
細書（カングら）は、微粒子のカーボンブラックを、水
性媒体中でのこれらのカーボンブラックの分散性を最大
とするために、安定化剤、例えポリアルキレングリコー
ル又はデキストランのようなポリサッカライドで前処理
することが好ましいということを教示している。この安
定化剤による前処理後、ｓｂｐメンバーは、半共有結合
性の架橋剤、例えば、フルオレセインイソチオシアネー
トを介して、カーボンブラック粒子／安定化剤複合体に
結合される。得られた免疫化学ラベルは、ラベルに水性
媒体、例えば水又は低イオン強度の緩衝液中での懸濁性
を付与するために、引き続き、少なくとも一つのイオン
性又は非イオン性の界面活性剤で処理されなければなら
ない。

【０００９】ベルグクィストとワラー、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏ．Ｍｅｔｈ．、６１、３３９−３４４（１９８３）
は、（もしあれば）試料中のＩｇＧ抗体の存在を測定す
るために、墨汁中に含有された炭素粒子を用いた炭素イ
ムノアッセイ（ＣＩＡ）を開示している。墨汁は、特異
的な結合特性を有する。墨汁は、例えば、ウサギＩｇＧ
に結合し、それ故、特定の抗原に対するウサギＩｇＧ抗
体を検出するためのアッセイで用いられ得る。墨汁はま
た、ブドウ球菌類に結合する。該類は、ヒトＩｇＧ抗体
に結合することが知られているプロテインＡを含む。こ
れらの特性は、寄生トキソプラズマゴンディー（Ｔｏｘ
ｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ）に対するヒトＩｇＧ抗
体の素早い検出のために利用されうる。テストは、ラベ
ルされた試薬を調製するために活性墨汁をプロテインＡ
と混合することを含み、該試薬は、次いで、Ｔ．ゴンデ
ィータキゾイト（ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅｓ）（微粒子抗
原として作用する）及びＴ．ゴンディーに対するヒトＩ
ｇＧ抗体を含んでいると予想される試料と混合される。
テスト結果は、光学顕微鏡下で読まれうる。Ｔ．ゴンデ
ィータキゾイトは、陽性のＣＩＡ反応の場合は付着した
炭素粒子のために黒に見え、逆の場合は白のままであ
る。ＣＩＡテストは、かなり感度が鈍いが、その単純性
故に魅力あると主張されている。

【００１０】用いられる微粒子炭素ラベルは、例えば、
低コスト、（バルク）調製の容易さ、広範囲の波長での
低い吸収、例えば固相−、計量棒−又は凝集（阻害）ゾ
ル粒子（イムノ）アッセイにおいて光呈色したバックグ
ランドに対するコントラストの点での最適な特徴、及び
コロイド炭素粒子の表面で広範囲の全く異なる結合蛋白
質及び／又は結合性物質を吸着する能力等の特性を有す
るのが望ましい。感度、特異性及び再現性の点で制御で
きるテスト性能を有するアッセイ系を開発するために
は、コロイド炭素ラベル粒子の表面特性の徹底した知識
を有することが重要である。

【００１１】文献は、イムノアッセイにおいてラベルと
しての炭素粒子の使用を示唆しているけれども（ピータ
ーソンら、カングら、ベルグクィストとワラー）、これ
らの実施例のいずれも、炭素粒子の特性の点でもまた炭
素粒子の大きさの点でも、炭素粒子が有する適性と適合
していない。これら全て、（ピーターソンら、カング
ら、及びベルグクィストとワラー）は、推測される水性
媒体中での炭素粒子への結合蛋白質のカップリングに先
だって、これらの粒子が、既に、グリシン等のアミノ酸
（ピーターソンら）、ポリアルキレングリコール又はデ
キストランのようなリサッカライド（カングら）、又は
アラビアゴムのような他の安定化剤及び樹脂（これはイ
ンディアインク炭素粒子が用いられた場合である）（ベ
ルグクィストとワラー）により安定化されていなければ
ならないということを示している。このような安定化剤
の添加無しでは、ピーターソンら、カングら、及びベル
グクィストとワラーによって記載された炭素粒子は、水
性媒体、例えば純水又は低イオン強度の緩衝液中で、安
定な、自己凝集しないコロイド懸濁物を形成しない。従
って、従来技術のこれらの安定化された水性炭素ゾル
は、特異的に結合する蛋白質及びその対応する結合性物
質の添加に先だって、水性媒体中に、炭素粒子に対する
安定化剤の添加又は存在が必要である。

【００１２】イムノアッセイ中のラベル系としてのこの
ような安定化された水性炭素ゾルの使用は、以下の如く
の欠点を有する。

【００１３】粒子は、みずから凝集する傾向にあるの
で、ゾルは取り扱うのが難しい。

【００１４】炭素粒子の表面に結合蛋白質が現実にカッ
プリングする証明がない。ピーターソンら、及びベルグ
クィストとワラーは共に、凝集デバイスにおいて、それ
らの安定化された水性炭素ゾルを単独で用いている。懸
濁された２００〜５００ｎｍのサイズのコロイド粒子の
存在下での、抗体−抗原沈降物の形成は、このような
（巨大）粒子を、ともかく共沈降へと導く。

【００１５】炭素粒子の表面はまず、水性媒体中でコロ
イド懸濁物を安定化させるために、アミノ酸、ポリアル
キレングリコール、デキストランのようなポリサッカラ
イド、又は樹脂によって覆われるので、結合蛋白質は、
引き続くカップリング段階において、炭素粒子の実際の
表面に対する疎水作用により、直接にカップリングする
ことが妨害されるらしい。事実、カングらは、結合蛋白
質が、過剰の架橋剤の助けにより炭素ラベルに結合され
るところの、時間のかかるカップリング段階を必要とし
ている。このようなカップリング方法は、退屈であり、
そして、テスト法の感度及び精度の点で、変化する、再
現性のない結果をもたらす。

【００１６】安定化された水性炭素ゾルは、大きなバッ
チ間変動を有する、水中での安定化成分及び炭素粒子の
複合体混合物である。この変動故に、このようなゾルの
取り扱いは、簡単ではなく、かつ、経済的観点より少な
くとも好ましくない。

【００１７】イオン性又は非イオン性の界面活性剤を用
いた免疫化学的炭素ラベルの処理（カングら）は、（免
疫）反応性の減少（結合蛋白質の変性、又は例えばｓｂ
ｐメンバーとその対応する結合性物質の間の相互作用力
の減少）、又は炭素粒子からの固定化された結合性物質
の脱着をもたらしうる［ゲルソニーとパラード、Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３１、１（１９８３）、スピ
ノーラとキャノン、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、
８１、１６１（１９８５）、ヴェデーゲとスベンビー、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．、８８、２３３（１９８
６）、ヴェデーゲら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．、
１１３、５１（１９８８）、バードら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏ．Ｍｅｔｈ．、１０６、１７５（１９８８）、ストッ
ト、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．、１１９、１５３
（１９８９）、チリアナキスら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍ
ｅｔｈ．、１６２、２７３（１９９３）］。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の一つの目的
は、テスト試料中にて、特異的に結合する蛋白質及びそ
の対応する結合性物質の間の反応成分を測定する方法に
おいて、本質的に安定化されておらず、かつ、ラベルと
して有用な水性炭素ゾルを提供することである。

【００１９】本発明のもう一つの目的は、テスト試料中
にて、特異的に結合する蛋白質及びその対応する結合性
物質の間の反応成分を測定する方法であって、そこで
は、本質的に安定化されていない水性炭素ゾルをラベル
として用いる方法を提供することである。

【００２０】本発明の更なる目的は、特異的に結合する
蛋白質及びその対応する結合性物質の間の反応の炭素ラ
ベルされた成分（を調製する方法）であって、そこで
は、本質的に安定化されていない水性炭素ゾルが、該成
分をラベルするために用いられるところの成分（又は方
法）を提供することである。

【００２１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々のタ
イプの炭素の特性及び性質が、水性溶媒中でのそれらの
分散性の点より、何らかの予報的な価値を有するかいな
かについて検討した。本発明者らは、本発明者らによっ
て作られた本質的に安定化されていない水性炭素ゾルに
ついての実験データに関して、特性及び性質、例えば、
ジェットインデックス（ｊｅｔｎｅｓｓｉｎｄｅ
ｘ）、表面積−Ｎ₂、一次粒子直径、ジブチフタレート
値、着色力、揮発分、密度等（これらは、カーボンブラ
ックの製造者により与えられている）を評価した。

【００２２】驚くべきことに、本発明者らは、本質的に
安定化されていない炭素ゾルとしての水性媒体中の微粒
子カーボンブラックの分散性が、パラメーター、即ちジ
ブチルフタレート（ＤＢＰ）値、揮発分（ＶＣ）及び一
次粒子直径（ＰＰＤ）の関数としてモデル化されうると
いうことを見いだした。

【００２３】一次式予測（ｌｉｎｅａｒｐｒｅｄｉｃ
ｔｏｒ）値（Ｖ）のための推定されるモデル式は、

【００２４】

【数６】Ｖ＝ -138.954 - 0.987×DBP + 15.609×VC +
3.994×PPD である。

【００２５】微粒子カーボンブラックの正の一次式予測
値（Ｖ＞０）は、それが本質的に安定化されていない水
性炭素ゾルを調製するために適していることを示してい
る。微粒子カーボンブラックの一次式予測値Ｖ≦０は、
それが本質的に安定化されていない水性炭素ゾルを調製
するために適していないことを示している。これらの後
者のカーボンブラックは、安定化された水性炭素ゾルを
形成するために、安定化剤の添加又は存在を必要とする
（ピーターソンら、ベルグクィストとワラー、カング
ら）。

【００２６】従って、本発明者らは、驚くべきことに、
ある炭素のグレード又はタイプが、本質的に安定化され
ていない水性炭素ゾルを調製するための開始物質として
用いられるのに適しているかいなかが、確実な方法で予
測できることを見いだした。該予測は、３つの異なった
パラメーター（これらは、目的の炭素タイプを特徴づけ
る）に基づいて成されうる。

【００２７】それ故、本発明に従って、本発明の上記目
的が実現されうること、特には、ラベルとして用いられ
ることができ、かつ他のラベルよりも優れた利点を有す
ることができる本質的に安定化されていないコロイド炭
素粒子が作られうることが見いだされた。

【００２８】従って、本発明は、コロイド炭素粒子の表
面に分析物を特異的に認識できる結合成分を直接コンジ
ュゲートした水性炭素ゾルからなる炭素ラベルされた成
分と試料を接触させること、及び該試料中の分析物の存
在の指標又は量の尺度としての、得られた分析物／炭素
粒子複合体を測定することを含む、試料中の分析物の存
在又は量を測定するための方法であって、該方法が、一
次式予測値Ｖ＞０、ここで

【００２９】

【数７】Ｖ＝ -138.954 - 0.987×DBP + 15.609×VC +
3.994×PPD であって、ＤＰＢは、ＤＩＮ５３６０１に従って決定さ
れる、ジブチルフタレート吸着（ｍｌ／１００ｇ）であ
り、ＶＣは、ＤＩＮ５３５５２に従って決定される揮発
分（％）であり、及びＰＰＤは、平均一次粒子直径（ナ
ノメーター）である、を有するカーボンブラックを、該
炭素ラベルされた成分を調製するために用いられるとこ
ろの、本質的に安定化されていない水性炭素ゾルを調製
するために用いることを特徴とする方法を提供する。

【００３０】本発明は更に、試料中の分析物を測定する
のに有用な組成物であって、該組成物が、コロイド炭素
粒子の表面に該分析物を特異的に認識できる結合成分を
直接コンジュゲートした水性炭素ゾルを含み、かつ該水
性炭素ゾルが、一次式予測値Ｖ＞０、ここで

【００３１】

【数８】Ｖ＝ -138.954 - 0.987×DBP + 15.609×VC +
3.994×PPD であって、ＤＰＢは、ＤＩＮ５３６０１に従って決定さ
れる、ジブチルフタレート吸着（ｍｌ／１００ｇ）であ
り、ＶＣは、ＤＩＮ５３５５２に従って決定される揮発
分（％）であり、及びＰＰＤは、平均一次粒子直径（ナ
ノメーター）である、を有するカーボンブラックから由
来する本質的に安定化されていない水性炭素ゾルである
ことを特徴とする組成物を提供する。

【００３２】本発明はまた、水性炭素ゾルを調製するこ
と、及びコロイド炭素粒子の表面に分析物を特異的に認
識できる結合成分を直接コンジュゲートすることを含
む、試料中の分析物を測定するのに有用な組成物を調製
するための方法であって、該水性炭素ゾルが、一次式予
測値Ｖ＞０、ここで

【００３３】

【数９】Ｖ＝ -138.954 - 0.987×DBP + 15.609×VC +
3.994×PPD であって、ＤＰＢは、ＤＩＮ５３６０１に従って決定さ
れる、ジブチルフタレート吸着（ｍｌ／１００ｇ）であ
り、ＶＣは、ＤＩＮ５３５５２に従って決定される揮発
分（％）であり、及びＰＰＤは、平均一次粒子直径（ナ
ノメーター）である、を有するカーボンブラックから由
来する本質的に安定化されていない水性炭素ゾルである
ことを特徴とする方法を提供する。

【００３４】本発明の一つの実施態様において、分析物
は、細胞表面に存在する受容体蛋白質及びエピトープか
ら成る群より選ばれる。本発明の他の実施態様におい
て、分析物は、ハプテン、抗原、酵素、抗体及び抗体フ
ラグメント、ＤＮＡ及びＲＮＡから成る群より選ばれ
る。コロイド炭素粒子にコンジュゲートされた結合成分
は、好ましくは、ハプテン、抗原、酵素、抗体及び抗体
フラグメント、受容体蛋白質、エピトープ、ＤＮＡ及び
ＲＮＡから成る群より選ばれる。一次コロイド炭素粒子
が１〜１００ｎｍの範囲内の平均粒子サイズを有するこ
と、及び本質的に安定化されていない水性炭素ゾルがゾ
ル安定化剤を含まないことが好ましい。本発明の方法の
好ましい実施態様は、固相イムノアッセイ及びイムノク
ロマトグラフィーアッセイ（例えば、計量棒イムノアッ
セイ）である。

【００３５】以下、本発明を更に詳細に説明する。

【００３６】本発明に従って、炭素ラベルされた成分を
調製するために用いる水性炭素ゾルは、一次式予測値Ｖ
＞０、ここで

【００３７】

【数１０】Ｖ＝ -138.954 - 0.987×DBP + 15.609×VC
+ 3.994×PPD であって、ＤＰＢは、ＤＩＮ５３６０１に従って決定さ
れる、ジブチルフタレート吸着（ｍｌ／１００ｇ）であ
り、ＶＣは、ＤＩＮ５３５５２に従って決定される揮発
分（％）であり、及びＰＰＤは、平均一次粒子直径（ナ
ノメーター）である、を有するカーボンブラックの本質
的に安定化されていない水性ゾルである。

【００３８】語句「本質的に安定化されていない水性炭
素ゾル」又は「本質的に安定化されていないコロイド炭
素粒子」は、水性媒体、例えば純水又は低イオン強度の
緩衝系を含む水の中の炭素ゾルを云い、該炭素ゾルは、
安定化のために安定化剤を加えることを要求せず、そし
て好ましくはいずれの安定化剤も含まない。語句「本質
的に安定化されていない」とは、ゾル安定化効果を有し
うる物質を含みうるが、該物質の不存在下でもまた安定
である水性炭素ゾルを含むことを意図する。しかしなが
ら、最も好ましくは、該本質的に安定化されていない水
性炭素ゾルは、ゾル安定化剤を含まない。

【００３９】微粒子カーボンブラックの特性及び性質
（例えば、ジェットインデックス、表面積−Ｎ₂、一次
粒子直径、ジブチルフタレート値、着色力、揮発分、密
度等）を、本質的に安定化されていない水性炭素ゾルの
調製のための開始物質としての、ある種の微粒子カーボ
ンブラックの実験的に確かめられる有用性について評価
した。分散性は二値変数（微粒子カーボンブラックは、
本質的に安定化されていない水性炭素ゾルとして分散で
きるか又は分散できないかのいずれかである）として測
定されるので、モデルの確率論的な部分は、二項分布に
従うと仮定した。モデルの決定論的な部分、即ち変数Ｄ
ＢＰ、ＶＣ及びＰＰＤの一次の組み合わせは、ロジット
リンク（ｌｏｇｉｔｌｉｎｋ）関数により、従属変
数、即ち本質的に安定化されていない水性炭素ゾルとし
ての水性媒体中の微粒子カーボンブラックの分散性と関
連づけられる（マクラフとネルデン、一般化された一次
式モデル、第２版、１９８９、第４章、チャップマンア
ンドホール、ＩＳＢＮ０−４１２−３１７６０−
５）。一般化された一次式モデルを用いて、分散性を、
種々の微粒子カーボンブラックの上記した特性及び性質
の全ての可能な組み合わせの関数としてモデル化した。
モデルは、統計のコンピューターパッケージジーンス
タット（Ｇｅｎｓｔａｔ）（ペインとレーン（編）、１
９８７、ジーンスタット５参照マニュアル、クラレンド
ンプレス、オックスフォード）を用いて、データに近似
させた。

【００４０】驚くべきことに、これらの近似させたモデ
ルのうち、３つの変数、即ち、ＤＢＰ値、揮発分（Ｖ
Ｃ）及び一次粒子直径（ＰＰＤ）の一次組み合わせは、
本質的に安定化されていない水性炭素ゾルとしての微粒
子カーボンブラックの分散性に相関していることが発明
された。

【００４１】該３つのパラメーターの第一のパラメータ
ー、ＤＢＰ値は、ＤＩＮ５３６０１に従ってジブチルフ
タレート吸着（ＤＢＰ、ｍｌ／１００ｇ）であり、それ
は、二次粒子構造の尺度である。

【００４２】第二のパラメーター、揮発分ＶＣ（％）
は、ＤＩＮ５３５５２に従って、炭素試料を９５０℃に
て７分間維持することによって決定される。高い揮発分
は、より多くの極性基での表面酸化を示している。

【００４３】第三のパラメーターは、平均一次粒子直径
ＰＰＤ（ナノメーター）であり、それは、電子顕微鏡下
で得られる、数及びサイズの測定値から算出される。

【００４４】一次式予測値Ｖのための推定されたモデル
式は、

【００４５】

【数１１】Ｖ＝ -138.954 - 0.987×DBP + 15.609×VC
+ 3.994×PPD である。

【００４６】本質的に安定化されていない炭素ゾルとし
て水性媒体中で分散できる炭素（分散性＝１）、及び本
質的に安定化されていない炭素ゾルとして水性媒体中で
分散できない微粒子カーボンブラック（分散性＝０）へ
の、種々の微粒子カーボンブラックの分布は、ロジット
リンク関数の逆数によって定義される。

【００４７】

【数１２】分散性（％）＝１００×［ｅ^v／（１＋ｅ^v）］ある種の微粒子カーボンブラックの、正の一次式予測値
（Ｖ＞０）及び、それ故分散性（％）＞５０％は、それ
が本質的に安定化されていない水性炭素ゾルを調製する
ために適していることを示している。ある種の微粒子カ
ーボンブラックの、一次式予測値（Ｖ≦０）及び、それ
故分散性（％）≦５０％は、それが本質的に安定化され
ていない水性炭素ゾルを調製するために適していないこ
とを示している。これら後者のカーボンブラックは、安
定化された水性炭素ゲルを形成するために、安定化剤の
添加又は存在を必要とする（ピーターソンら、ベルグク
ィストとワラー、カングら）。

【００４８】カングらは、例えば、−２８．９０〜−１
７１．４０の間を変化するＶ−値、即ち分散性（％）値
＜＜５０を有するキャボット（Ｃａｂｏｔ）微粒子カー
ボンブラックを用いて、それらのカーボンブラックが本
質的に安定化されていない水性炭素ゾルを調製するため
に適していないことを示している。

【００４９】表１及び図１は共に、実験データ及び予測
値（Ｖ及び分散性）の両者に基づいて、分散性＝１の炭
素（Ｄｉｓｐ．１；炭素、本質的に安定化されていない
炭素ゾルとして水性溶媒中で分散できる）及び分散性＝
０（Ｄｉｓｐ．０；炭素、本質的に安定化されていない
炭素ゾルとして水性溶媒中で分散できない）の炭素へ
の、種々の粒状カーボンブラックの分布を示している。

【００５０】

【表１】これは、試験した微粒子カーボンブラックの内、デグッ
サ微粒子カーボンブラックファルブラス（Ｆａｒｂｒｕ
ｓｓ）ＦＷ２００、ファルブラスＦＷ２、スペツィアル
−シュバルツ（Ｓｐｅｚｉａｌｓｃｈｗａｒｚ）ＳＳ
６、スペツィアル−シュバルツＳＳ５、スペツィアル−
シュバルツＳＳ４、プリンテックス（Ｐｒｉｎｔｅｘ）
１５０Ｔ、スペツィアル−シュバルツＳＳ２５０及びス
ペツィアル−シュバルツＳＳ１００が、本質的に安定化
されていない炭素ゾルとして水性媒体中で分散できるこ
とを示している。

【００５１】テスト試料中にて、特異的に結合する蛋白
質及びその対応する結合性物質の間の１以上の反応成分
を測定する方法におけるラベルとしての、本質的に安定
化されていないコロイド炭素粒子の使用は、他のラベル
より優れたいくつかの利点、例えば、低コスト、（バル
ク）調製の容易さ、広範囲の波長での光吸収、例えば固
相−、計量棒−又は凝集（阻害）ゾル粒子（イムノ）ア
ッセイにおいて光呈色したバックグランドに対するコン
トラストの点での最適な特徴、及びコロイド炭素粒子の
表面で広範囲の全く異なる結合蛋白質及び／又は結合性
物質を吸着する能力を有する。

【００５２】本発明に従って用いられるべき本質的に安
定化されていない炭素ゾル粒子は、安定化されたコロイ
ド炭素粒子に比べて、そして他のコロイド粒子ラベルに
比べて多くの利点を有する。驚くべきことに、本発明者
らは、何らの安定化剤又は他の成分を用いることなしに
水性媒体中で安定なコロイド炭素懸濁物、即ち安定化さ
れいない水性炭素ゾルを製造することが非常に容易であ
ることを見いだした。適した炭素の例は、いくつかの微
粒子のチャンネルブラック（ｃｈａｎｎｅｌｂｌａｃ
ｋ）／フランスブラック（ｆｕｒａｎｃｅｂｌａｃｋ）
炭素タイプである。

【００５３】これらの安定化されていない水性炭素ゾル
が、テスト試料中にて特異的に結合する蛋白質及びその
対応する結合性物質の間の１以上の反応成分を測定する
方法においてラベルとして用いられた場合は、それらの
ゾルは、ピーターソンら、カングら、及びベルグクィス
トとワラーによって記載された安定化された水性炭素ゾ
ルに比べていくつかの利点を有する。

【００５４】これらの利点は、以下のものを含む、上記
炭素は、安定化剤（例えばアミノ酸、ポリアルキレング
リコール、デキストランのようなポリサッカライド、樹
脂又は界面活性剤）と保存剤の複合混合物の添加の必要
無しに、水性媒体、例えば純水又は低イオン強度の緩衝
液中で、それ自身で、安定な、コロイド懸濁物を形成で
きる。

【００５５】上記炭素は、ピーターソンらによって記載
されたように、ＥＤＴＡ及びＨＣｌを用いた精製後に、
モーター中で、炭素を粗く粉砕する必要無しに、規定さ
れた、厳密に定められたサイズクラスにて入手でき、全
コロイド粒子範囲をカバーする。また、カングらは、炭
素ラベル調製のそれらの最初の段階において、原料の炭
素物質及び安定化剤の混合物を粉砕することを記載して
いる。

【００５６】上記炭素開始物質は、非常に大きなバルク
量で入手可能であり、バッチ間変動（墨汁については、
ベルグクィストとワラー参照に）に関連した問題が減少
される。それ故、微粒子カーボンブラックの特性及び性
質に関しての炭素ゾルの再現性が、考慮すべき問題では
ないと判った。

【００５７】安定化されていない水性炭素ゾルは、高価
でなく、容易に大量に調製されることができ、そして非
常に安定で、それ故長い保存寿命を有する。

【００５８】コロイド炭素粒子に巨大分子（例えば、蛋
白質、抗原、ＤＮＡ／ＲＮＡ）をカップリングする前及
び間において、安定化されていない水性炭素ゾル中には
何らの安定化剤も存在しないので、コロイド炭素粒子の
表面上で、これらの巨大分子と全ての可能な、活性（例
えば疎水性）結合部位との間の、実際の、直接の相互作
用がある。

【００５９】更に、例えば物理的吸着を介しての、巨大
分子をコロイド炭素粒子上にカップリングするための条
件は、公知であり、そして、厳密に規定されることがで
きかつ制御されることができる。（殆どの墨汁の組成物
は具体的に記載されておらず（ベルグクィストとワラ
ー）、そして、グリシン或いはデキストラン、炭素粒子
及び結合蛋白質間の相互作用は、多かれ少なかれ曖昧で
ある。（ピーターソンら、カングら））。

【００６０】結局、巨大分子を安定化されていない水性
炭素ゾル上にカップリングするのが非常に容易である。
得られた炭素／巨大分子コンジュゲートは、感受性、特
異性及び精度の点で、正確であるばかりでなく、再現性
の良い結果を与える。

【００６１】上記炭素は、規定された、厳格に定められ
たサイズクラスにて入手できる。一次炭素粒子は、好ま
しくは、１〜約１００ｎｍの範囲の平均粒子直径を有す
る。開始物質として用いられる炭化水素の加熱、蒸発、
燃焼及び粉砕を含む製造／大量生産工程故に、冷却中
に、一次粒子が互いに融合して、より大きな、より高次
の構造となった粒子（「二次粒子」と呼ばれる）となる
ことが起こるかもしれない。ある微粒子カーボンブラッ
クの一次及び二次粒子の表面特性は同じであり、従っ
て、それらは、水性媒体、例えば水又は低イオン強度の
緩衝液中で、コロイド化学的な安定性の点で類似的に挙
動する。好ましくは、二次粒子の平均粒子サイズは、４
００ｎｍを超えない。更に好ましくは、コロイド炭素粒
子は、１〜２００ｎｍの範囲内の平均粒子サイズを有す
る。

【００６２】安定化されていない水性炭素ゾルのこれら
の粒子サイズは、それらを、例えば、イムノクロマトグ
ラフィーアッセイにおけるラベルとしての使用に非常に
適したものとしている。このようなイムノクロマトグラ
フィーアッセイの好ましい例は、計量棒アッセイであ
り、そこでは、固相支持体（ストリップ）が多孔性又は
繊維性の物質、例えば天然又は合成ポリマー及び誘導
体、例えば０．２０μｍ〜１５μｍの孔サイズ及び約１
００μｍのストリップ厚を有するニトロセルロース又は
ナイロンからなる。ストリップ上にて、例えば、抗体又
は抗原が、吸着、吸収又は共有結合により固定化され
る。結合ペアの固定化されたメンバーと特異的に反応す
る分析物を含む試料物質を、支持体物質に適用し、そし
て、ストリップを通してクロマトグラフ展開させた。そ
こでは、分析物は、その対応する結合ペアメンバーとの
反応により固定化される。次いで、反応されない試料物
質は、例えば、洗浄段階により除かれ、その後、サンド
イッチタイプアッセイの場合には、炭素ラベルされた試
薬が、支持体物質に適用される。

【００６３】該炭素ラベルされた試薬は、相対的に小さ
い粒子サイズの結果として容易にクロマトグラフィー的
に移動するので、固定化された分析物と反応することが
でき、そして固定化された分析物によって固定化され
る。

【００６４】炭素ラベルされた試薬は、支持体物質に液
体形態で適用されうるが、或いは、それは、スプレーさ
れることもでき、そして例えば、メタ−可溶性蛋白質及
び／又はポリサッカライドの存在下でクロマトグラフィ
ー媒体上で乾燥されうる。

【００６５】炭素ゾルの調製及び使用本質的に安定化されていない水性炭素ゾルの調製は、非
常に容易でありかつ高価でない。一次式予測値Ｖ＞０に
従って好適な微粒子カーボンブラックを選択し、そして
選択された乾燥炭素粉末のある量に純水又は低イオン強
度の緩衝液を添加した後に、いくつかの方法、例えばソ
ニケーターを用いて、安定なブラックゾルを得ることが
できる。本質的に安定化されていない（だけども安定
な）炭素ゾルは、水又は低イオン強度の緩衝液で、強く
希釈されうる。希釈されたゾルは過剰のＮａＣｌを添加
した後に凝集し、そして数分以内に、黒い凝集物のペレ
ットと澄んだ、透明な上澄みが形成される。この凝集現
象は、安定化されていない水性炭素ゾルの場合のみ、炭
素粒子上への巨大分子の物理的吸着をモニターするため
のツールとして用いられ得る。

【００６６】例えば、希釈された安定化されていない水
性炭素ゾルへの、低イオン強度の緩衝液中の巨大分子の
懸濁物の添加は、適した条件下で、そして穏和な混合の
後、とりわけ、疎水相互作用を介して、巨大分子のコロ
イド炭素粒子上へのカップリングを結果する。この巨大
分子のコーティングの結果として、コロイド炭素粒子
は、初めて、過剰のＮａＣｌの添加による凝集から保護
されて、炭素／巨大分子コンジュゲート懸濁物となる。

【００６７】ある種の巨大分子が、その量を増加しなが
ら、厳密に規定されかつ制御された条件下で、安定化さ
れていない水性炭素ゾルの固定量と共にインキュベート
されるところの設定された系統立てた実験において、あ
る巨大分子／コロイド炭素粒子比が達成された場合に
は、過剰量のＮａＣｌの添加はもはやゾルの凝集を引き
起こさない。巨大分子のこの量（「最少保護量」（ＭＰ
Ａ）と呼ばれる）は、安定化されていない水性炭素ゾル
上への巨大分子のカップリング方法において重要なパラ
メーターであり、そして、ＭＰＡ値は、とりわけ、カッ
プリングされるべき巨大分子の性質、コロイド炭素粒子
の性質及び量、及びｐＨ及びイオン強度に関してのカッ
プリング条件に依存する。

【００６８】それ故、安定化されていない水性炭素ゾル
上への巨大分子のカップリングは、凝集テストを行いそ
してＭＰＡを測定することによって確かめられ得るが、
また、炭素／巨大分子コンジュゲートを遠心分離により
ペレット化した後に上清の光吸収を測定することによっ
て（二重）検定されうる。巨大分子の最少保護量を安定
化されていない水性炭素ゾルに添加し、そして適した条
件下で短時間インキュベーションした後に、炭素−巨大
分子コンジュゲートの繰り返しの遠心分離、引き続き、
何らの（他の）巨大分子なしで、出来上がったペレット
の水性媒体中への繰り返しの再懸濁、懸濁されたペレッ
トへのＮａＣｌの添加を行ったが、それでも凝集は引き
起こさなかった。このことは、不可逆的な巨大分子−炭
素結合が形成されたことを示す。

【００６９】コロイド炭素粒子の表面への巨大分子（例
えば、抗体）のこの強力な付着は、安定化されていない
水性炭素ゾルを凝集（阻害）イムノアッセイにおいてラ
ベルとして働くのに適するようにするばかりでなく、こ
れらのゾルを、全ての種類の固相イムノアッセイ、例え
ば膜クロマトグラフィーイムノアッセイにおいてただ一
つ生じるラベルとして働くのにも非常に適したものとし
ている。このようなクロマトグラフィーイムノアッセイ
におけるラベルとしての使用を考慮すると、本発明の比
較的良く規定された粒子サイズ分布の種々の安定化され
ていない水性炭素ゾルがまた、ピーターソンら、ベルグ
クィストとワラー、及びカングらの水性炭素ゾルに比べ
て有利である。

【００７０】本質的に安定化されていない水性炭素ゾル
におけるホモゲナイゼーション段階は、超音波処理を用
いて行われるのが有利であるが、安定化剤なしで、炭素
粒子及び水性媒体の混合物を振とう又は（撹拌しながら
又はしないで）沸騰させることによっても達成されう
る。

【００７１】純水又は低イオン強度の緩衝液中での炭素
の超音波処理、及びそれに続く、穏和な混合条件下での
このコロイド炭素懸濁物の（同じ）低イオン強度の緩衝
液中の巨大分子の懸濁物との混合は、単純であり、高価
でなくそして全種類のイムノアッセイのための炭素ゾル
粒子ラベルを開発するための、速やかな行程である。

【００７２】超音波処理による（短い）ホモゲナイゼー
ション段階の間での、炭素粉末及び水の混合物に対す
る、低イオン強度の緩衝液中の巨大分子（例えば蛋白
質）の懸濁物の添加（最終巨大分量は、ＭＰＡレベルで
ある）は、該巨大分子を有するコロイド炭素粒子ラベル
の形成をもたらし、次いで該粒子ラベルはイムノアッセ
イに適用されうる。

【００７３】炭素ゾル粒子でラベルされた免疫成分は、
水性テスト媒体、例えば体液例えば血漿、血清等、又は
細胞培養液中の、例えばハプテン、抗原、抗体及びＤＮ
Ａ／ＲＮＡを明らかにし、定量するために、試薬とし
て、通常は他の試薬と組み合わせて用いられる。そのた
めに、ラジオイムノアッセイ及び酵素イムノアッセイで
使用されるような全ての種類の免疫化学的技術が適して
いる。従って本発明はまた、このような免疫化学的技術
で使用するためのテストキットに関し、そして最も重要
な成分として免疫成分を含む。

【００７４】慣用の免疫化学的技術の一つは、競争イム
ノアッセイであり、それは、免疫成分を明らかにし、測
定するために用いられうる。例えば、ある抗原を明らか
にするために、この方法は、未知量の抗原を含むテスト
試料を、炭素でラベルされている所定量の目的の抗原及
びこの抗原に対する不溶性の抗体、又は、所定量の不溶
性の抗原及び炭素でラベルされたこの抗原に対した向け
られる抗体のいずれかと接触させることを含む。

【００７５】反応完了後に、炭素の量を、結合された又
は遊離の分画中にて測定する。この測定は、測定される
べき抗原の定性の又は定量の指標を与えることができ
る。必要に応じて変更を加えて、類似の方法が、他の免
疫成分の決定のために適用される。

【００７６】頻繁に用いられる他の方法は、いわゆる、
サンドイッチ技術であり、それはまた、本発明に従って
ラベルされた成分の使用のために特に適している。これ
らの技術に従って、免疫成分、例えば抗原が決定されな
ければならない場合は抗体が、それを固体支持体に対し
てカップリングすることにより不溶性となる。

【００７７】この固体支持体は、例えば、免疫化学反応
がその中で導かれるところの反応容器の内部表面であ
る。また、ニトロセルロース膜に基づいた、又はナイロ
ン膜或いはポリスチレンロッドに基づいた計量棒を、固
相支持体として用いることができる。第一のインキュベ
ーションの後（引き続き洗浄段階を行うことが可能であ
る）、第二のインキュベーションは、炭素でラベルされ
た抗体とともになされ、その後、該炭素が、結合された
又は遊離の相中で測定される。

【００７８】炭素でラベルされた免疫成分はまた、いわ
ゆる均一イムノアッセイ、即ち、免疫化学的反応におい
て結合されたラベルされた免疫学的成分と、なお遊離し
ているラベルされた免疫化学的成分との間の分離が不必
要であるところのイムノアッセイに非常に向いている。
このようなアッセイは、実施が単純であり、所望の情報
を比較的速く提供し、そして自動化に向いているという
利点を有する。

【００７９】実際のアッセイでは、例えば、測定される
べき抗原を含むテスト試料（又は、標準溶液）は、マイ
クロタイタープレートのウェル中で、ラベルされた抗体
と一緒にインキュベーションされる。抗原及び（ラベル
された）抗体の間での免疫化学的反応は、凝集を結果す
る。それ故、炭素のゾル中の粒子の誘発された凝集は、
光吸収の変化を伴い、それは、例えば、分光光学的に又
は裸眼にてモニターされうる。

【００８０】免疫化学的な観点で一価である小さな抗原
を決定するために、凝集−阻害反応が用いられ、これは
同じ原理に基づく。

【００８１】上記した技術に加えて、炭素でラベルされ
た免疫成分が試薬として用いられうるところの無数の他
の免疫化学的技術がある。しかしながら、最も好ましく
は、本発明の方法が固相イムノアッセイであり、特に
は、イムノクロマトグラフィーアッセイ、例えば計量棒
イムノアッセイである。

【００８２】分析物は、液体テスト試料中において、溶
液中に存在する可溶性物質であり得る。好ましくは、分
析物は、細胞表面上に存在する受容体蛋白質及びエピト
ープからなる群から選ばれ、また、溶液中に可溶性の分
析物を含む液体試料の場合は、ハプテン、抗原及び抗体
からなる群より選べれる。

【００８３】好ましくは、コロイド炭素粒子にコンジュ
ゲートされた結合成分は、ハプテン、抗原、抗体、ＤＮ
Ａ及びＲＮＡからなる群より選ばれる。

【００８４】反応混合物のある相中の炭素の性質及び／
又は濃度の測定は、数多くの公知の技術に従って達成さ
れうる。

【００８５】

【実施例】下記のすべての工程は、特記なき限り、室温
で実施された。カーボンゾルの調製方法Ａ：超音波処理貯蔵懸濁物：１ｇのカーボン（デグッサ社、Ｐrintex１
５０Ｔ）を、脱イオン水中に懸濁させて１００ｍｌの最
終体積（１％ｗ／ｖ）にした。Ｂｒａｎｓｏｎモデル２
５０ソニファイアー：出力コントロール３〜２７ワッ
ト、２０ＫＨｚを用いて、懸濁物を１５分間均質化した
（この超音波処理は、所望により氷上で行うことができ
る）。

【００８６】２９ｎｍの平均一次粒子直径を有する球状
カーボン粒子より成る、真黒なコロイド状カーボン懸濁
物が形成された。この貯蔵Ｃ懸濁物を４℃で保存した。

【００８７】方法Ｂ：超音波処理デグッサ社の粒状カーボンブラックＦarbruss ＦＷ２０
０、Ｆarbruss ＦＷ２、Ｓpezialschwarz ６、Ｓpezial
schwarz ５、Ｓpezialschwarz ４、Ｓpezialschwarz ２
５０及びＳpezialschwarz １００に対して、方法Ａの手
順を適用した。夫々、平均一次粒子直径１３、１３、１
７、２０、２５、５６及び５０ｎｍを有する球状カーボ
ン粒子より成る、真黒なコロイド状カーボン懸濁物が形
成された。この貯蔵Ｃ懸濁物を４℃で保存した。

【００８８】方法Ｃ：渦流混合及び差分遠心分離０．０５ｇのカーボン（デグッサ社、Ｐrintex１５０
Ｔ）に脱イオン水を加えて５ｍｌの最終体積（１％ｗ／
ｖ）にした。渦流ミキサー中で２５００ｒｐｍで１０分
間渦巻混合することにより、懸濁物を均質化した。１
３，８００×ｇで１０分間遠心分離し、各回５ｍｌの脱
イオン水中にペレットを再懸濁することにより、懸濁物
を３回洗った。最後に、１，０００×ｇで１０分間、懸
濁物を遠心分離して、凝集したコロイド状カーボン粒子
を除去した。上澄を注意深くデカンテーションし、４℃
で保存した。

【００８９】懸濁物の処理中に生じる物質の損失を考慮
して、カーボン濃度を、５００ｎｍの波長における１の
分光分析吸光に標準化された。

【００９０】方法Ｄ：沸騰及び差分遠心分離０．２５ｇのカーボン（デグッサ社、Ｐrintex１５０
Ｔ）に脱イオン水を加えて、２５ｍｌの最終体積（１％
ｗ／ｖ）とした。磁気撹拌装置で撹拌しながら、懸濁物
を加熱プレート上の密閉ガラス容器中で１５分間おだや
かに沸騰させた。室温に冷却後、懸濁物を方法Ｃに従う
差分遠心分離に付した。カーボンゾルの使用

【００９１】

【実施例１】ニトロセルロース片上にスポットされたヤギ抗ヒトフィ
ブリノーゲン抗体の、一連の直線的な希釈物を用いての
ヒトフィブリノーゲンの検出カーボン粒子‐フィブリノーゲンコンジュゲートの調製使用（たとえば、蛋白質の物理的吸着）の前に、貯蔵カ
ーボン（Ｃ）懸濁物（方法Ａで作られたもの）を、０．
２５ｍＭＴris-ＨＣｌ、ｐＨ８．５により５倍希釈し
た。

【００９２】１５ｍｇのウシフィブリノーゲン、タイプ
ｉ‐ｓ（シグマ社）を５ｍｌの２．５ｍＭＴris-ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．５に溶解した。これを溶液Ａと呼ぶ。

【００９３】１５ｍｇのヒトフィブリノーゲン、画分Ｉ
（シグマ社）をまた５ｍｌの２．５ｍＭＴris-ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．５に溶解した。これを溶液Ｂと呼ぶ。

【００９４】２．５ｍＭＴris-ＨＣｌ、ｐＨ８．５中
の０．２％（ｗ／ｖ）Ｃゾルの５ｍｌを、溶液Ａの５ｍ
ｌ及び溶液Ｂの５ｍｌの両者に加えた。懸濁物を３〜４
時間撹拌下にインキュベートした。続いて、形成された
コンジュゲートを、５ｍＭＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）Ｂ
ＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃ 、ｐＨ８．５を用
い、１３，６３６×ｇで１５分間遠心分離することによ
り３回洗った。各洗浄工程において形成された最初の上
澄を、１３，６３６×ｇで１５分間、再び遠心分離し、
その後で、ペレットを一緒にまとめた。この追加の遠心
分離は、物質の損失を最小にするよう役立つ。第３回か
つ最後の洗浄工程の後に、ペレットを出発体積の半分に
再懸濁した（カーボン濃度は再び０．２％（ｗ／ｖ）で
あった）。この洗浄されたコンジュゲートを４℃で暗所
に保存した。

【００９５】ヤギ抗ヒトフィブリノーゲン抗体の一連の
直線的希釈物をその上にスポットされたニトロセルロー
ス片の調製ポリクローナルヤギ抗ヒトフィブリノーゲン抗体の下
記の一連の直線的希釈物を、ニトロセルロース膜（シュ
ライヒャーアンドシュエル（Ｓchleicherand Ｓchu
ell）、タイプＢＡ８５／２３、０．４５μｍの孔直
径を有する）上にスポットした：１０００ｎｇ、５００
ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇ、６２ｎｇ、３１ｎｇ、
１５ｎｇ、８ｎｇ、４ｎｇ、２ｎｇ。

【００９６】一連の希釈は、１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ
７．２を用いて行われた。１スポット当り１μｌの溶液
を用いた。スポットの直径は２ｍｍ未満であった。スポ
ットの施与後に、膜を３時間風乾した。膜を１０ｍＭ
ＰＢＳ、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）
ＮａＮ₃ 、ｐＨ７．２中に３７℃で１．５時間浸漬する
ことによって、ニトロセルロースのフリーの位置をブロ
ックした。膜を再び風乾し、その後に膜を粘着性プラス
チックキャリア物質（コスターセロクラスタープレー
トシーラーズ：Ｃostar Ｓerocluster Ｐlatesealer
s）上に付着し、最後に５×５０ｍｍの大きさに切断し
た。これら片を、暗所で室温で乾燥状態に保った。テスト手順４．５ｍｌの閉じうるポリスチレン管（グレイナー：Ｇ
reiner）中で、「ヤギ抗ヒトフィブリノーゲン片」を、
下記と共にインキュベートした。

【００９７】

【表２】インキュベーションの５分後に、テストＡにお
ける片は５つの明瞭に着色したスポット（１０００〜６
２ｎｇ）を示し、これらの強度は低減していた。インキ
ュベーションの１．５時間後に、スポットはその最大色
強度に達した。

【００９８】テストＢにおいては、片は色の付いたスポ
ットを全く示さなかった。

【００９９】

【実施例２】モノクローナルラット抗マウス κ／λ（ＲＡＭκ／
λ）コンジュゲートによりモノクローナルマウス免疫グ
ロブリンのイソタイプを決定するためのイソタイプ別け
テストコロイド状カーボン粒子上に物理的に吸着されたモノク
ローナルラット抗マウス κ／λ（ＲＡＭκ／λ）‐
抗体のための「最小保護量」（ＭＰＡ）の決定最小保護量（ＭＰＡ）は、１４．３ｇ／ｌのＮａＣｌ
（最終濃度）により電解質的に誘発される凝集化に対し
て特定のコロイド状懸濁物の１リットルを保護するため
に必要なマクロ分子の最小量である。ＭＰＡは、カップ
リングが起る条件に依存するのみでなく、カップルされ
るべき分子の大きさ及び特定のコロイド状懸濁物の１リ
ットル中に存在する総ての粒子の利用しうる全表面積に
も依存する。

【０１００】テストは下記のように行われた。カーボン
ゾル（２．５ｍＭＴris-ＨＣｌ、ｐＨ１０．５中の
０．０１％（ｗ／ｖ）のデグッサＰrintex１５０Ｔ）の
ｐＨを調べ、もし必要なら、ｐＨ１０．５に調節する。
２．５ｍＭＴris-ＨＣｌ、ｐＨ１０．５中に０．９４
ｍｇ／ｍｌを含むＲＡＭκ／λ‐蛋白質の貯蔵溶液を調
製し、そして同じ緩衝液を用いて希釈して、２．５ｍＭ
Ｔris-ＨＣｌ、ｐＨ１０．５中の０〜０．９４ｍｇ／
ｍｌＲＡＭκ／λ‐蛋白質の直線的濃度範囲を達成し
た。カーボンゾル（２．５ｍＭＴris-ＨＣｌ、ｐＨ１
０．５中の０．０１％（ｗ／ｖ）のデグッサＰrintex
１５０Ｔ）の５００μｌを、各ＲＡＭκ／λ‐蛋白質溶
液の１００μｌに加え、これを渦流ミキサー中で完全に
混合した。１０分間のインキュベーション期間の後に、
１００μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液を各カーボ
ンゾル／蛋白質懸濁物に加え、これを再び完全に混合し
た。１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液を加えてから正確に
５分後に、黒いカーボンの塊（これは急速に黒いペレッ
トへと／として凝集し、透明な無色の上澄を残す傾向が
あった）の出現について、夫々のゾル／蛋白質懸濁物を
視覚的にスクリーンした。

【０１０１】テストの対照は、下記の通りであった。 1. ５００μｌのカーボンゾル＋２×１００μｌの２．
５ｍＭＴris-ＨＣｌ、ｐＨ１０．５（ＲＡＭκ／λ‐
蛋白質により完全に保護されているカーボンゾルを模
倣）、 2. ５００μｌのカーボンゾル＋１００μｌの２．５ｍ
ＭＴris-ＨＣｌ、ｐＨ１０．５＋１００μｌの１０％
（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液（反応混合物の外観に対する完
全な凝集の視覚的効果を決定するため）。

【０１０２】この凝集テストの結果は、２．５ｍＭＴ
ris-ＨＣｌ、ｐＨ１０．５中の０．０１％（ｗ／ｖ）の
デグッサＰrintex１５０Ｔカーボンゾルの５００μｌ
を１４．３ｇ／ｌのＮａＣｌによる凝集に対して保護す
るために、少くとも３７．５μｇのＲＡＭκ／λ‐蛋白
質が必要であったことを示す。従って、記載したカップ
リング条件下で、２．５ｍＭＴris-ＨＣｌ、ｐＨ１
０．５中の０．０１％（ｗ／ｖ）のデグッサＰrintex
１５０Ｔカーボンゾルの１リットル（１０００ｍｌ）
を、電解質により誘発される凝集に対して十分に保護す
るためには、ＲＡＭκ／λ‐蛋白質のためのＭＰＡは７
５ｍｇである。

【０１０３】カーボン粒子‐ＲＡＭコンジュゲートの調
製貯蔵カーボン（Ｃ）溶液（方法Ａにより作られたもの）
を脱イオン水で１００倍希釈し、次に１ＭＫ₂ＣＯ₃溶
液でｐＨを１０．４に設定した。

【０１０４】２０ｍＭＴris-ＨＣｌ、１５０ｍＭＮ
ａＣｌ、ｐＨ８．０中の４．５ｍｇ／ｍｌのＲＡＭ（ユ
ーロクローン：Ｅuroclone）の貯蔵溶液から出発して、
１６７μｌのＲＡＭ蛋白質懸濁物を１０ｍｌのゾルに加
えた（〜７５μｇＲＡＭ／カーボンゾルｍｌ）。懸濁物
を撹拌下に６０分間インキュベートした。次に、形成さ
れたコンジュゲートを、２．５ｍＭＴris-ＨＣｌ、５
ｍＭＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％
（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃ 、ｐＨ８．５を用い、１３，８００
×ｇで１５分間遠心分離することにより３回洗った。洗
われたコンジュゲートを暗所で４℃で保存した。テスト手順４．５ｍｌの閉じうるポリスチレン管（グレイナー）中
で、ＨＢＴ‐サブイソタイプ別けテスト片（ＨＢＴ、N
o.１０．１０／Ｌ１０．２０）を下記と共にインキュベ
ートした。

【０１０５】

【表３】Ａ．５００μｌ２０ｍＭＴris-ＨＣｌ、６００ｍＭ
ＮａＣｌ、１％(ｗ／ｖ)カゼイン、０．２％(ｖ／ｖ)
Ｔween‐２０、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃ 、ｐＨ
８．５５００μｌＲＰＭＩ(Ｇibco)中の１０μｇ／ｍｌＩ
ｇＧ１および１０μｇ／ｍｌＩｇＧ３、１０％(ｖ
／ｖ)ウシ胎児血清１ｍｌＣ‐ＲＡＭコンジュゲート又はＢ．５００μｌ２０ｍＭＴris-ＨＣｌ、６００ｍＭ
ＮａＣｌ、１％(ｗ／ｖ)カゼイン、０．２％(ｖ／ｖ)
Ｔween‐２０、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃ 、ｐＨ
８．５５００μｌＲＰＭＩ（Ｇibco）、１０％（ｖ／ｖ）ウ
シ胎児血清１ｍｌＣ‐ＲＡＭコンジュゲート片を含む管を
（注意深く）連続的に振とうしながら５〜３０分間のイ
ンキュベーション後に、テスト結果を読むことができ
た。

【０１０６】片Ａは、位置１．３及びカッパにおけるス
ポットの特異的な着色を示した。

【０１０７】片Ｂは、着色を全く示さなかった。

【０１０８】

【実施例３】（コロイド状）カーボン‐抗‐ヒト絨毛性性腺刺激ホル
モン（ｈＣＧ）を用いるｈＣＧの検出のための一段階及
び二段階テスト片カーボン粒子抗‐α‐ｈＣＧコンジュゲートの調製方法１抗‐α‐ｈＣＧマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を
物理的に吸着する前に、５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄緩衝液、ｐ
Ｈ６．２を用いて貯蔵Ｃ懸濁物（デグッサＳpezialsc
hwarz ４）を５倍希釈した。

【０１０９】５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄緩衝液、ｐＨ６．２中
の０．２％（ｗ／ｖ）Ｃゾルの１ｍｌに、抗α‐ｈＣＧ
ＭＡＢ（７５０μｇ／ｍｌゾル）を加えた。懸濁物を
３時間、振とうしながらインキュベートした。続いて、
形成したコンジュゲートを、５ｍＭＮａＣｌ、１％
（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃、ｐ
Ｈ８．５を用いて、１３，６３６×ｇで１５分間遠心分
離して３回洗った。各洗浄工程で生じた初めの上澄を再
び１３，６３６×ｇで１５分間遠心分離し、その後にペ
レットを一緒にまとめた。（実施例１参照。）第３回か
つ最後の洗浄工程後にペレットを出発体積に再懸濁し
た。洗われたコンジュゲートを暗所で４℃で保存した。方法２上記の代りに、８ｍｇの乾燥カーボン粉末（たとえばデ
グッサ Spezialschwartz 100）に４ｍｌの抗‐α‐ｈＣ
ＧＭＡＢ（５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄緩衝液、ｐＨ６．２中
に７５０μｇの抗‐α‐ｈＣＧＭＡＢ／ｍｌを含む）
を加えることによって、カーボン粒子抗‐α‐ｈＣＧコ
ンジュゲートを調製した。７５０μｇ抗‐α‐ｈＣＧ
ＭＡＢ／ｍｌ、０．２％（ｗ／ｖ）カーボン粒子を有す
る該懸濁物を、Bransonモデル２５０ソニファイアー、
出力コントロール３〜２７ワット、２０ＫＨｚを用いて
１分間、氷上で均質化した。

【０１１０】コロイド状カーボン粒子／抗‐α‐ｈＣＧ
ＭＡＢコンジュゲートの真黒な安定な懸濁物が形成さ
れた。在るかもしれない未結合の抗‐α‐ｈＣＧＭＡ
Ｂを除去するために、形成されたコンジュゲートを遠心
分離により洗った（方法１を参照）。

【０１１１】ニトロセルロース片の調製ニトロセルロース片は、下記を用いて作られた。

【０１１２】ａ．ニトロセルロース片上にスポットされ
た抗‐β‐ｈＣＧマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ）
の一連の直線的希釈物、ｂ．その上にブロットされたラット抗マウスモノクロー
ナル抗体を有するスロット（ネガティブテストスロッ
ト）及び抗‐β‐ｈＣＢＭＡＢを有するスロット（ポ
ジティブテストスロット）。

【０１１３】ａ．実施例１を参照。

【０１１４】１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１００
０ｎｇ、５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇ、６２ｎ
ｇ、３１ｎｇ、１５ｎｇ、８ｎｇ、４ｎｇ、２ｎｇの抗
‐β‐ｈＣＧＭＡＢの一連の希釈物をスポットした。

【０１１５】ｂ．真空スロットブロット装置（ＰＲ‐６
００，Hoefer Scientific Instruments）を用いて、ニ
トロセルロース膜（Schleicher and Schuell、タイプAE
-99、８．０μｍの孔直径を有する）上の列当りに、１
０００ｎｇのラット抗マウスモノクローナル抗体を有す
るスロット及び５００ｎｇの抗β‐ｈＣＧＭＡＢを有
するスロットがブロットされた。ブロットした後に、膜
を３時間風乾した。膜を１０ｍＭＰＢＳ、２％（ｗ／
ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃、ｐＨ７．
２中に３７℃で１．５時間浸漬することによって、ニト
ロセルロースのフリーの位置をブロックした。膜を再び
風乾し、その後に膜を粘着性プラスチックキャリア物質
（コスターセロクラスタープレートーシーラーズ：
Costar Serocluster Platesealers）上に付着し、最後
に１０×７５ｍｍの大きさに切断した。これら片を、暗
所で室温で乾燥状態に保った。テスト手順；２工程法インビトロ実験４．５ｍｌの閉じられるポリスチレン管（グレイナー：
Greiner）中で、７つの一連の「抗‐β‐ｈＣＧ片」を
下記と共に振とうしながら予備インキュベートした。

【０１１６】

【表４】５００μｌ２０ｍＭＴris‐ＨＣｌ、６００ｍＭ
ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．２％（ｖ／ｖ）
Ｔween‐２０、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃、ｐＨ
８．５５００μｌ緩衝液と一緒にした後にｈＣＧの最終濃度
が５０、５、１、０．５、０．１、０．０５、又は０Ｕ
／ｍｌとなるような量の精製されたｈＣＧ(シグマ社)と
共に２．５ｍＭＴris‐ＨＣｌ、ｐＨ８．５。

【０１１７】予備インキュベーション後に、片を１０ｍ
ＭＰＢＳ‐Ｔ、ｐＨ７．２で３度、そして脱イオン水
で１度すすいだ。片を下記と共に、後インキュベートし
た。

【０１１８】

【表５】５００μｌ２０ｍＭＴris‐ＨＣｌ、６００ｍＭ
ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）カゼイン、０．２％（ｖ／
ｖ）Ｔween‐２０、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃、ｐ
Ｈ８．５５００μｌ２．５ｍＭＴris‐ＨＣｌ、ｐＨ８．５１ｍｌＣゾル抗‐β‐ｈＣＧコンジュゲート。

【０１１９】このｈＣＧ濃度（５０〜０．１Ｕ／ｍｌ）
において、初めの４つのスポットが約５分後に起った。
インキュベーションの１時間後に、５０Ｕ／ｍｌｈＣ
Ｇの片は、強度が減少する７つのスポットを示し、５Ｕ
／ｍｌｈＣＧの片は、強度が減少する５つのスポット
を示し、１Ｕ／ｍｌｈＣＧの片は、強度が減少する４
つのスポットを示し、０．５Ｕ／ｍｌｈＣＧの片は、
強度が減少する４つのスポットを示し、０．１Ｕ／ｍｌ
ｈＣＧの片は、強度が減少する４つのスポットを示
し、０．０５Ｕ／ｍｌｈＣＧの片は、すべて低い強度
を有する４つのスポットを示し、０Ｕ／ｍｌｈＣＧの
片は、スポットを全く示さなかった。インビボ実験４．５ｍｌの閉じうるポリスチレン管（グレイナ−）中
で２つの「抗‐β‐ｈＣＧ片」を下記と共に振とうしな
がら予備インキュベートした。

【０１２０】

【表６】対照片：２５０μｌ２．５ｍＭＴris‐ＨＣｌ、ｐＨ８．５２５０μｌ２０ｍＭＴris‐ＨＣｌ、６００ｍＭ
ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．２％（ｖ／ｖ）
Ｔween‐２０、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃、ｐＨ
８．５５００μｌ受胎４週間前の妊娠していない女性の尿テスト片：２５０μｌ２．５ｍＭＴris‐ＨＣｌ、ｐＨ８．５２５０μｌ２０ｍＭＴris‐ＨＣｌ、６００ｍＭ
ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．２％（ｖ／ｖ）
Ｔween‐２０、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃、ｐＨ
８．５５００μｌネガティブテストにおけると同じ女性の
尿、但し、ここでは受胎１６日後の尿。

【０１２１】予備インキュベーション後に、片を１０ｍ
ＭＰＢＳ‐Ｔ、ｐＨ７．２で３度、そして脱イオン水
で１度すすいだ。片を下記と共に、後インキュベートし
た。

【０１２２】

【表７】５００μｌ２．５ｍＭＴris‐ＨＣｌ、６００ｍＭ
ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）カゼイン、０．２％（ｖ／
ｖ）Ｔween‐２０、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃、ｐ
Ｈ８．５５００μｌ２．５ｍＭＴris‐ＨＣｌ、ｐＨ８．５１ｍｌＣゾル抗‐α‐ｈＣＧコンジュゲート。

【０１２３】２〜３分後に３つのスポットがテスト片に
現われた。一方、対照片は、一夜のインキュベーション
後にさえ全くスポットを示さなかった。

【０１２４】テスト手順：一工程法ＲＡＭ及び抗‐β‐ｈＣＧＭＡＢのスロットを有する
２つのニトロセルロース片（Schleicher and Schuell、
タイプAE99）を、１０μｌの１０ｍＭＰＢＳ‐Ｔ、１
％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃、
ｐＨ７．３（流れる液体）で施与の場所上で予備湿潤化
し、その後直ちに、同じ施与の場所上に１０μｌＣゾ
ル抗‐α‐ｈＣＧコンジュゲートを適用した。

【０１２５】続いて、夫々、４０Ｕ／ｍｌｈＣＧを有
する２ｍｌの流れる液体（ポジティブテスト）、５ｍＵ
／ｍｌｈＣＧを有する２ｍｌの流れる液体（ポジティ
ブテスト）及びｈＣＧなしの２ｍｌの流れる液体（ネガ
ティブテスト）を含むガラス容器中に、片を、施与が行
なわれた面で浸漬した。液体の前線が片の全長に行き渡
った時に（これは約３〜５分間要した）、ポジティブテ
スト片は、ＲＡＭスロット及び抗‐β‐ｈＣＧスロット
の両者の黒い着色を示し、一方、ネガティブテスト片上
ではＲＡＭスロットのみが着色した。

【０１２６】

【実施例４】（コロイド状）カーボン抗ｈＣＧコンジューゲートを用
いてヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を検出する
ための一工程イムノクロマトグラフテストカーボン粒子抗‐α‐ｈＣＧコンジュゲートの調製ｈＣＧのα‐サブユニットに向けられたモノクローナル
抗体（ＭＡＢ）を、５ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．７
に溶解し、そして０．７５ｍｇ／ｍｌの蛋白質最終濃度
までの量の同じ緩衝液中でコロイド状カーボン（Printe
x 150T）懸濁物（２ｍｇ／ｍｌ；方法Ａにより作られ
た）と共にインキュベートした。インキュベーション及
び洗浄（実施例３参照）後に、最終的なペレットを５ｍ
ＭＴris‐ＨＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２
％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃、ｐＨ８．５中に再懸濁して、元
の体積とした。コンジュゲートをガラス管中で４℃で貯
蔵した。

【０１２７】ニトロセルロース片の調製ニトロセルロース片（Schleicher and Schuell,タイプ
AE99）を、０．５ｃｍ当り１μｌ（１μｇ）で、Lino
mat IV（ＣＡＭＡＧ）を用いて、抗‐β‐ｈＣＧ及びＲ
ＡＭ（対照）ＭＡＢ（実施例３参照）でラインスレプー
した。片を、０．１Ｍホウ酸塩、１％（ｗ／ｖ）ＢＳ
Ａ、５％（ｗ／ｖ）トレハロース、０．０５％（ｖ／
ｖ）Ｔween‐２０、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃、ｐ
Ｈ８．９でブロックした。

【０１２８】一工程実験試料窓及びテスト結果窓を有する装置中に片を置いた。
妊娠していない女性の尿を緩衝し（最終濃度０．５Ｍ
Ｔris‐ＨＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔween‐２０、
ｐＨ８．５）、そして５〜３００ｍＩＵ／ｍｌの連続的
希釈でｈＣＧを加えた（スパイクした）。スパイクされ
たヒト尿（５０μｌ）を、リザーバ上の試料窓に与え
た。結果は約１分後に現れた。このテスト法の感度は、
１０ｍＩＵｈＣＧ／ｍｌであった。

【０１２９】

【実施例５】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のためのカーボンゾル粒
子イムノアッセイカーボン粒子抗‐α‐ＨＳＡコンジュゲートの調製ＨＳＡに向けられたモノクローナル抗体（０．７５ｍｇ
／ｍｌの最終濃度）を、２．５ｍＭＴris‐ＨＣｌ、
ｐＨ８中のコロイド状カーボン粒子（デグッサSpezials
chuwarz 100、０．２％（ｗ／ｖ））上にカップルさせ
た。懸濁物を室温で３時間おだやかに攪拌した。吸着が
成功したかどうかを評価するために、実施例２と同様に
凝集テストを行った。安定なコンジュゲートを、実施例
１に従って３度洗った。出来上ったペレットを緩衝液に
再懸濁して、元の体積にした。コンジュゲートを４℃で
貯蔵した。

【０１３０】ニトロセルロース片の調製１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．４中の８つの連続的希釈
（１０００〜７．８ｎｇ）でＨＳＡをニトロセルロース
片（Schleicher and Schuell, BA-85/23、孔直径０．４
５μｍ）上にスポットした。乾燥した片を１０ｍＭＰ
ＢＳ、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｎ
ａＮ₃、ｐＨ７．４中で３７℃で９０分間ブロックし
た。片をセロクラスタープレートシーラー（Costar、
英国ケンブリッジ）によりプラスチック裏張りした。一工程実験ＨＳＡは、ＳＰＩＡテスト法により検出された。片は、
４．５ｍｌのプラスチック管（グレイナー）中に入れら
れ、２５０μｌ緩衝液（すなわち２０ｍＭＴris‐Ｈ
Ｃｌ、６００ｍＭＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、
０．２％（ｖ／ｖ）Ｔween‐２０、０．０２％（ｗ／
ｖ）ＮａＮ₃、ｐＨ８．５）、７００μｌ蒸留水及び５
０μｌのコロイド状カーボン‐モノクローナル抗体コン
ジュゲートを含む懸濁物中でインキュベートした（３０
分間〜１６時間）。結果を視覚検査及びコンピュータイ
メージ分析で評価した。片上にスポットされた７ｎｇ
ＨＳＡの量を視覚で検出できた。各スポットの平均の灰
色レベルの定量化はコンピュータイメージ分析により行
われた。灰色レベルの等級はスポットされたＨＳＡの量
の対数の関数として表わされた。用いられたコロイト状
カーボンコンジュゲートについて、７〜５００ｎｇのＨ
ＳＡのスポットの平均灰色レベルが区別できた。プロッ
トされたカーブの形は、比較しうるＥＬＩＳＡにより得
られるカーブの形に似ていた。

【０１３１】競合テスト手順において、６２ｎｇのＨＳ
Ａがその上にスポットされていたニトロセルロース片
を、コロイド状カーボン‐抗‐ＨＳＡモノクローナル抗
体コンジュゲートを混合された遊離のＨＳＡの増大する
量（０．２５〜６．７５μｇ）を含む同じ緩衝液中で、
２５０μｌの２０ｍＭＴris‐ＨＣｌ、６００ｍＭＮ
ａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．２％（ｖ／ｖ）
Ｔween‐２０、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃、ｐＨ
８．５を含む１ｍｌの合計体積にてインキュベートし
た。インキュベーションを、視覚的に及びコンピュータ
イメージ分析により評価した。視覚検査により、０．２
５μｇの遊離ＨＳＡがすでに、抑制的量として判定され
た。結果の計数化は、灰色レベルの等級と、加えられた
遊離ＨＳＡの量の対数との間の良好な相間（ｒ＝０．９
９６）を与えた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、一次式予測値（Ｖ）と水性媒体中にお
けるデグッサ／キャボット粒状カーボンブラック分散性
との間の関係を示す。実験データ（分散物１又は分散物
０）は、計算されたＶに対してプロットされる。

【符号の説明】

○は分散物１（実験データ）であり、 △は分散物２（実験データ）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ベレンドセン、ルシエンヌベルダルディナヨハンナマリアオランダ国、6702 シーエーワゲニンゲン、ソルベッケストラート 252 (72)発明者ファンドールン、アルベルトヴィレムヤコブオランダ国、6813 ジェイエックスアーンヘム、ヤコブマリスラーン 60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コロイド炭素粒子の表面に分析物を特異
的に認識する結合成分を直接コンジュゲートした水性炭
素ゾルを含む炭素ラベルされた成分と試料を接触させる
こと、及び該試料中の分析物の存在の指標又は量の尺度
としての、得られた分析物／炭素粒子複合体の存在又は
不存在を測定することを含む、試料中の該分析物の存在
又は量を測定するための方法であって、一次式予測値Ｖ
＞０、ここで【数１】Ｖ＝ -138.954 - 0.987×DBP + 15.609×VC +
3.994×PPD であって、ＤＰＢは、ＤＩＮ５３６０１に従って決定さ
れる、ジブチルフタレート吸着（ｍｌ／１００ｇ）であ
り、ＶＣは、ＤＩＮ５３５５２に従って決定される揮発
分（％）であり、及びＰＰＤは、平均一次粒子直径（ナ
ノメーター）である、を有するカーボンブラックを、該
炭素ラベルされた成分を調製するために用いられるとこ
ろの、本質的に安定化されていない水性炭素ゾルを調製
するために用いることを特徴とする方法。
【請求項２】分析物が、細胞表面に存在する受容体蛋
白質及びエピトープから成る群より選ばれる、請求項第
１項記載の方法。
【請求項３】分析物が、ハプテン、抗原、酵素、抗体
及び抗体フラグメント、ＤＮＡ及びＲＮＡから成る群よ
り選ばれる、請求項第１項記載の方法。
【請求項４】コロイド炭素粒子にコンジュゲートされ
た結合成分が、ハプテン、抗原、酵素、抗体及び抗体フ
ラグメント、受容体蛋白質、エピトープ、ＤＮＡ及びＲ
ＮＡから成る群より選ばれる、請求項第１項記載の方
法。
【請求項５】固相イムノアッセイである請求項第１項
記載の方法。
【請求項６】イムノクロマトグラフィーアッセイであ
る請求項第１項記載の方法。
【請求項７】計量棒（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）イムノアッ
セイである請求項第１項記載の方法。
【請求項８】一次コロイド炭素粒子が１〜１００ｎｍ
の範囲内の平均粒子サイズを有する、請求項第１項記載
の方法。
【請求項９】該本質的に安定化されていない水性炭素
ゾルがゾル安定化剤を含まない、請求項第１項記載の方
法。
【請求項１０】試料中の分析物を測定するための有用
な組成物であって、該組成物が、コロイド炭素粒子の表
面に該分析物を特異的に認識する結合成分を直接コンジ
ュゲートした水性炭素ゾルを含み、かつ、該水性炭素ゾ
ルが、一次式予測値Ｖ＞０、ここで【数２】Ｖ＝ -138.954 - 0.987×DBP + 15.609×VC +
3.994×PPD であって、ＤＰＢは、ＤＩＮ５３６０１に従って決定さ
れる、ジブチルフタレート吸着（ｍｌ／１００ｇ）であ
り、ＶＣは、ＤＩＮ５３５５２に従って決定される揮発
分（％）であり、及びＰＰＤは、平均一次粒子直径（ナ
ノメーター）である、を有するカーボンブラックから由
来する本質的に安定化されていない水性炭素ゾルである
ことを特徴とする組成物。
【請求項１１】コロイド炭素粒子にコンジュゲートさ
れた結合成分が、ハプテン、抗原、酵素、抗体及び抗体
フラグメント、受容体蛋白質、エピトープ、ＤＮＡ及び
ＲＮＡから成る群より選ばれる、請求項第１０項記載の
組成物。
【請求項１２】水性炭素ゾルを調製すること、及びコ
ロイド炭素粒子の表面に分析物を特異的に認識する結合
成分を直接コンジュゲートすることを含む、試料中の該
分析物を測定するための有用な組成物を調製するための
方法であって、該水性炭素ゾルが、一次式予測値Ｖ＞
０、ここで【数３】Ｖ＝ -138.954 - 0.987×DBP + 15.609×VC +
3.994×PPD であって、ＤＰＢは、ＤＩＮ５３６０１に従って決定さ
れる、ジブチルフタレート吸着（ｍｌ／１００ｇ）であ
り、ＶＣは、ＤＩＮ５３５５２に従って決定される揮発
分（％）であり、及びＰＰＤは、平均一次粒子直径（ナ
ノメーター）である、を有するカーボンブラックから由
来する本質的に安定化されていない水性炭素ゾルである
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】コロイド炭素粒子の表面にハプテン、
抗原、酵素、抗体及び抗体フラグメント、受容体蛋白
質、エピトープ、ＤＮＡ及びＲＮＡから成る群より選ば
れる物質を直接コンジュゲートした本質的に安定化され
ていない水性炭素ゾルを調製するために、一次式予測値
Ｖ＞０、ここで【数４】Ｖ＝ -138.954 - 0.987×DBP + 15.609×VC +
3.994×PPD であって、ＤＰＢは、ＤＩＮ５３６０１に従って決定さ
れる、ジブチルフタレート吸着（ｍｌ／１００ｇ）であ
り、ＶＣは、ＤＩＮ５３５５２に従って決定される揮発
分（％）であり、及びＰＰＤは、平均一次粒子直径（ナ
ノメーター）である、を有するカーボンブラックを用い
る方法。
【請求項１４】炭素ラベルされたイムノアッセイ試薬
を調製すべく、ハプテン、抗原、酵素、抗体及び抗体フ
ラグメント、受容体蛋白質、エピトープ、ＤＮＡ及びＲ
ＮＡから成る群より選ばれる物質をラベルするために、
一次式予測値Ｖ＞０、ここで【数５】Ｖ＝ -138.954 - 0.987×DBP + 15.609×VC +
3.994×PPD であって、ＤＰＢは、ＤＩＮ５３６０１に従って決定さ
れる、ジブチルフタレート吸着（ｍｌ／１００ｇ）であ
り、ＶＣは、ＤＩＮ５３５５２に従って決定される揮発
分（％）であり、及びＰＰＤは、平均一次粒子直径（ナ
ノメーター）である、を有するカーボンブラックの本質
的に安定化されていない水性炭素ゾルを用いる方法。