JPH05170785A - オリゴ糖誘導体の製造 - Google Patents

オリゴ糖誘導体の製造

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JPH05170785A
JPH05170785A JP15478192A JP15478192A JPH05170785A JP H05170785 A JPH05170785 A JP H05170785A JP 15478192 A JP15478192 A JP 15478192A JP 15478192 A JP15478192 A JP 15478192A JP H05170785 A JPH05170785 A JP H05170785A
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oligosaccharide
nitrophenyl
pyridine
maltoheptaoside
solvent
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JP15478192A
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Christopher B Jackson
クリストファー・ビー・ジャクソン
Farhat K Siddique
ファーハット・ケイ・シディック
David R Stevens
デイビッド・アール・スティーブンス
Stephen P Moore
スティーブン・ピー・ムーア
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Genzyme Ltd
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    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 α-アミラーゼの基質として有用なオリゴ多
糖の簡便な誘導体化法を提供する。 【構成】 少なくとも３つの反復グルコース単位を含有
するオリゴ糖であって、その還元末端に、ニトロフェニ
ル、２-クロロ-４-ニトロフェニル、４-メチルウンベリ
フェロン、ルシフェリンおよび色素原フェノール類など
のアグリコン単位を有するオリゴ糖の末端非還元グルコ
ース単位の直接シリル化反応が、 (ａ)溶媒中にオリゴ糖の溶液を形成させ； (ｂ)塩基の存在下でオリゴ糖をシリル化保護試薬と反応
させ； (ｃ)その反応混合物からモノシリル化オリゴ糖誘導体を
回収する；ことからなる、従来法より簡便で低コストの
製造法によって効率よく生産できることを発見した。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はオリゴ糖誘導体の製造に
関し、より具体的には、α-アミラーゼの検定のための
基質として使用できる６-Ｏ-セキシルジメチルシリル-
ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マルトヘプタオシド(6-O-the
xyldimethylsilyl-p-nitrophenyl-α-D-maltoheptaosid
e)の製造および精製に関する。
【０００２】
【従来の技術】尿および血清中のα-アミラーゼの測定
は、腹部疾患の鑑別診断のために広く行われており、上
昇したレベルは膵炎などの膵臓障害を示す。α-アミラ
ーゼを決定するための既知の方法では、この酵素の作用
によって小さい断片に分断されるオリゴ糖基質を使用す
る。これらの断片自体は糖分析の方法によって決定する
ことができるか、あるいはこれらの断片にα-グルコシ
ダーゼ、β-グルコシダーゼまたはグルコアミラーゼな
どの第２のエキソ酵素の活性を作用させることによっ
て、さらに糖分子を放出させるか、もしくは発色からそ
の活性を評価することを可能にする色素原を放出させる
ことができる。
【０００３】エンド酵素であるα-アミラーゼを含有す
る試料を混合する前にこの検定中に加えられるエキソ酵
素による基質切断の防止は、基質の非還元末端に遮断置
換基を付加することによって達成されてきた。この型の
化合物はRaucherらによるＵＳ-Ａ-４７０９０２０およ
びBlairによるＵＳ-Ａ-４６４９１０８に記述されてお
り、彼らはさらにこのような検定においてその性能を増
大させるためにグルコアミラーゼを使用することをも記
述している。
【０００４】このようなオリゴ糖類、一般的に従来法に
よるその製造ならびにα-アミラーゼの検定のための改
善された基質としてのその使用は、ＥＰ-Ａ-４５２０６
７に記述されている。その中には、ｐ-ニトロフェニル-
４,６-Ｏ-ベンジリデン-α-Ｄ-マルトヘプタオシド[化
合物(２)]から出発する５段階操作による６-Ｏ-セキシ
ルジメチルシリル-ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マルトヘ
プタオシド[化合物(５)]の合成が記述されている(添付
の図１を参照のこと)。
【０００５】この５段階合成の出発物質であるｐ-ニト
ロフェニル-α-Ｄ-マルトヘプタオシドは、例えば化学
的経路(これはBurnsら(ＧＢ-Ａ-１５７０１５２)の経路
に基づくものであってもよい)か、あるいはグルカノト
ランスフェラーゼを用いる酵素反応(Frenchら,JACS,76,
2987-2990,(1954))によって得ることができる。
【０００６】これらの段階を添付の図１を参照して次に
説明する。 (１)ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マルトヘプタオシド[化
合物(１)]からのｐ-ニトロフェニル-４,６-Ｏ-ベンジリ
デン-α-Ｄ-マルトヘプタオシド[化合物(２)]の製造： (２)化合物(２)の過アセチル化-ｐ-ニトロフェニル-４,
６-Ｏ-ベンジリデン-α-Ｄ-マルトヘプタオシド[化合物
(３)]への変換： (３)化合物(３)中のベンジリデン保護基の除去による過
アセチル化-４,６-ジヒドロキシ-ｐ-ニトロフェニル-α
-Ｄ-マルトヘプタオシド[化合物(４)]の製造: (４)化合物(４)の過アセチル化-６-Ｏ-セキシルジメチ
ルシリル-ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マルトヘプタオシ
ドへの変換： (５)その分子からアセテート基を除去することによる、
目的の６-Ｏ-セキシルジメチルシリル-ｐ-ニトロフェニ
ル-α-Ｄ-マルトヘプタオシド[化合物(５)]の製造。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】この５段階法はいくつ
かの不都合な点をもっている。保護基の使用は冗長な多
段階工程を導く。この工程の実行に伴う時間は高コスト
を招く。かなりの量の物質を扱う必要がある場合に必然
的に起こる困難な濾過および機械的損失のために、中間
体類の単離には問題が多い。多段階化学プラント工程の
コストが高いことはよく知られているので、より短くよ
り簡単な工程が常に相当な関心事である。
【０００８】概論として、本発明は化合物(１)を驚くべ
きことに一段階で直接的に化合物(５)に変換する有利な
製造に関する。さらに本発明は、化合物(５)が単一の最
多量シリル化分子種であるシリル化ｐ-ニトロフェニル-
α-Ｄ-マルトヘプタオシド類の混合物からの化合物(５)
の精製に関する。極めて高純度で、しかも充分な規模と
制限された操作数の両方に関して商業的使用に適した方
法でこの化合物を得るためには、このような精製が必要
である。実例として、化合物(５)が２０％ｗ／ｗ未満し
か存在しない粗生成物から、化学純度９９％工程収率４
５％で化合物(５)を精製することが、本直接シリル化反
応の有用性の主要な点である。さらにシリル化ｐ-ニト
ロフェニル-α-Ｄ-マルトヘプタオシド類の粗混合物３
００gをわずか１０ｘ６０cmのカラムに充填してもその
充填物上に沈澱が生じないことは驚くべきことであると
言わざるを得ない。
【０００９】臨床的決定のための酵素基質の必要条件
は、その分子が既知の構造をもった単一の化学物質であ
るということである。このα-アミラーゼ基質の場合に
ついてより具体的に記述すると、非遮断グルコシドの混
入は有効期間の減少と初期吸光度の上昇をもたらすであ
ろう。Ｏ-セキシルジメチルシリル-ｐ-ニトロフェニル-
α-Ｄ-マルトヘプタノシドの他の異性体はこの酵素に対
して異なる速度論を示すことが知られており、それゆえ
にこれらの異性体が仮に存在するとすれば、２％以上で
試料中のα-アミラーゼの正確な決定を妨害するであろ
う。
【００１０】２級アルコール類の存在下で１級アルコー
ル類を選択的にシリル化し得ることはよく知られてい
る。例えばC.M.Shartsら(Organic Prep.Proced.Int.,19
86,8,345-52)は、２種類の２級アルコール存在下におけ
る胆汁アルコール誘導体のＣ24１級アルコールのｔ-ブ
チルジメチルシリル-またはｔ-ブチルジフェニルシリル
-エーテルの生成を報告した。
【００１１】P.J.Gaudemansら(J.Org.Chem.,1987,52,52
55-60)は硝酸銀触媒を用いてＣl置換されたガラクトシ
ド類の１級６-ヒドロキシルを選択的にシリル化してい
るが、この開示はオリゴ糖でこれを達成する方法につい
て教示するものではないし、またそれを示唆するもので
もない。しかしこの試薬は高価であるので、いずれにし
てもこれは拡大し得る商業的工程ではない。
【００１２】F.FrankeとR.D.Guthrie(Aust.J.Chem.,197
7,30,639-47)は、ピリジン中のｔ-ブチルジメチルシリ
ルクロリドを用いてメチル-α-Ｄ-グルコピラノシドの
６位を選択的にシリル化している。これと同じ著者らが
モノシリル化を促進するであろう条件下(即ち、ショ糖
過剰)でこの操作を実行することによって二糖(ショ糖)
のモノシリル誘導体を形成させようと試みたところ、目
的の誘導体は生成物の複雑な混合物中に１０.５％の率
で生成した。ショ糖分子中の３つの１級ヒドロキシル基
はすべてこの反応に関与して種々の生成物を与えたの
で、この混合物の他の成分は過剰シリル化に起因するも
のであった。この報文はモノシリル化生成物を商業的規
模で精製する方法を示していない。さらに重要なこと
に、この１０.５％という収率はほとんど数学的確率通
りに二糖から予期されるものである。したがってヘプタ
オシドの場合に予期される収率は約３％であろう。それ
ゆえに、このような数値を上回る選択的シリル化が得る
ことは驚異的であり、１０％程度のかなり高い数値を得
ることは注目に値する。
【００１３】したがって、例示した事例では２または３
個の２級ヒドロキシルの存在下で１級ヒドロキシルの選
択的シリル化を達成したに過ぎない。α-アミラーゼの
検定のための基質として使用するに適した化合物を生産
するために、本発明での要求は、末端非還元グルコース
単位上の１級６-ヒドロキシル基のシリル化であった。
目的の生成物[化合物(５)]を非保護の出発物質ｐ-ニト
ロフェニル-α-Ｄ-マルトヘプタオシド[化合物(１)]か
ら直接製造するためには、他のグルコースの一級ヒドロ
キシルが６個と１５個の２級ヒドロキシル(即ち、合計
２１個の他の反応性基)が存在する下で、末端グルコー
ス単位の１級６-ヒドロキシルの選択的シリル化を得る
ことが必要であった。とりわけ、ショ糖のシリル化に関
するFrankeとGuthrieらの報告に基づき、当業者は、目
的のモノシリル化生成物の含有量が極めて低いモノシリ
ル化分子種の極めて複雑な混合物を予期するであろう。
出発物質(１)とシリル化試薬を直接組み合わせて目的の
化合物(５)を生産するためには、末端グルコースの６-
ヒドロキシルだけでシリル化が起こらなければならな
い。これは、この物質を他のモノ-およびポリ-シリル化
分子種の処理可能な混合物から良い収率で回収できる程
度に充分な選択性を伴って起こらなくてはならない。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは本発明にお
いて予想外にも、末端グルコースの１級６-ヒドロキシ
ルを、このグルコース単位および他の６つのグルコース
単位上の他の非保護ヒドロキシルの存在下で選択的にシ
リル化し得ることを発見した。本発明の好ましい方法に
よって得られるシリル化生成物の混合物では、驚くべき
ことに目的の化合物(５)が最多量成分である。
【００１５】また本製造法が特に温度依存性ではないこ
とも予期せぬ発見であった。化学反応の選択性を改善す
るためには、実用上可能な限り温度を下げることが普通
である。本製造法の場合、反応は室温でも例えば−１０
℃と同様にうまく進行する。ここに記述する製造法は、
分子の還元末端にアグリコンを有するオリゴ糖類である
という点で化合物(１)に類似している種々の出発物質に
適用できる。したがって、例えば本発明の製造法をα-
アミラーゼの種々の基質に適用できる。オリゴ糖は７グ
ルコース単位以外を含有することもでき、３またはそれ
以上が典型的である。アグリコンは一般にα-アミラー
ゼの活性の検出に直接的あるいは間接的に適した基から
なり、より具体的には、ニトロフェニル、２-クロロ-４
-ニトロフェニル、４-メチルウンベリフェロンまたはル
シフェリン、ならびに他の色素原フェノール類などであ
る。
【００１６】概論として、本発明の好ましい方法は、適
切な溶媒中、塩基の存在下でのｐ-ニトロフェニル-α-
Ｄ-マルトヘプタオシド[化合物(１)]と適切なシリル化
試薬との反応からなる。
【００１７】より具体的には本発明は、少なくとも３つ
の反復グルコース単位を含有するオリゴ糖であって、そ
の還元末端に、ニトロフェニル、２-クロロ-４-ニトロ
フェニル、４-メチルウンベリフェロン、ルシフェリン
および色素原フェノール類から選択されるアグリコン単
位を有するオリゴ糖の末端非還元グルコース単位の直接
シリル化のための工程を提供する。この工程は、 (ａ)溶媒を用いてオリゴ糖の溶液を形成させ； (ｂ)塩基の存在下でオリゴ糖をシリル化保護試薬と反応
させ； (ｃ)その反応混合物からモノシリル化オリゴ糖誘導体を
回収する；ことからなる。
【００１８】使用し得るシリル化試薬の例には、セキシ
ルジメチルシリル-クロリド、-ブロミド、-ヨウジドま
たは-トリフルオロメタンスルホネート、および当業者
に知られている他のシリル化試薬、例えばクロロトリメ
チルシラン、ビス-トリメチルシリルアセタミド、クロ
ロトリフェニルシランおよびクロロ-ｔ-ブチル-ジメチ
ルシランなどが含まれる。セキシルジメチルシリルクロ
リドが一般的に好ましい。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド
およびピリジンなどの溶媒、あるいは他の非反応性溶媒
を使用できる。本製造法に好ましい溶媒はピリジンであ
る。使用する塩基は例えばトリエチルアミン、ジイソプ
ロピルアミン、ピリジンあるいはイミダゾールなどであ
り得る。好ましい塩基は一般的にピリジンである。この
方法では、例えばピリジンが塩基としても溶媒としても
働き得る。反応ｐＨは一般に７.０より高くなくてはな
らない。
【００１９】反応温度は例えば−４０〜＋３０℃であ
り、好ましい温度は−１５〜＋５℃である。
【００２０】
【実施例】次の実施例は本発明のいくつかの好ましい側
面を例示するものである。
【００２１】実施例１ 撹拌機と温度計を装着した２０lフラスコにピリジン(１
０l)およびｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マルトヘプタオシ
ド(１kg)を充填した。この混合物を１６時間撹拌するこ
とによって透明な溶液を得た。この溶液を−１０℃に冷
却し、ジメチルセキシルシリルクロリド(３０９ml)を２
時間かけてゆっくり加えた。次にこの溶液を室温に温め
ながら１６時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、目的生成物
への１６.９％変換と５０％の出発物質が存在すること
を示した(カラム:“SPHERISORBODS" ２５cmｘ４.６mm；
移動相：メタノール／水-勾配；検出：ＵＶ３０５nm；
注入体積：２０μl)。出発物質をさらに消費することに
よって目的生成物の収率を改善するために、上記のシリ
ルクロリド化合物をさらに追加する必要があった。した
がって、−１０℃に再冷却したのち上記のシリルクロリ
ド化合物(１３ml)を追加した。この溶液を室温に温めな
がら１６時間撹拌した。この溶液を−５℃に再冷却し、
上記のシリルクロリド化合物(１６ml)を追加した(試料
採取および目的化合物の濃度のＨＰＬＣ決定の操作をシ
リル化試薬の追加と組み合わせて、収率を最大化するの
に必要なだけ繰り返すことができる)。５時間撹拌した
後、メタノール(１００ml)を加えることによって反応を
クエンチした。減圧下で揮発物を留去することにより、
目的生成物２００g(これは出発物質に基づいて２０％収
率である)を含有する粗固体１７８２gを得た。
【００２２】実施例２ ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マルトヘプタオシド(１１０
g)をピリジン(１１０ml)中窒素下室温(約２０℃)で終夜
撹拌することにより、濁った溶液を得た。この溶液を−
１０℃に冷却し、ジメチルエキシルクロリド(２５.８６
ml)を加えた。この混合物を−１０℃で３.７５時間撹拌
した後、５℃に保存した。この反応をＨＰＬＣで監視す
ることによって、いつ最適変換率が達成されたかを決定
した。合計４６.２５時間の後、メタノール(５ml)を加
えることによってこの反応をクエンチした。この溶液を
減圧下で留去することにより、目的のモノシリル化生成
物２０gを含有する粗固体１７７.３gを得た。
【００２３】実施例３ ピリジン(４０ml)中のｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マルト
ヘプタオシド(２g)の溶液を−２５℃に冷却した。ジメ
チルセキシルシリルトリフルオロメタンスルホネート
(０.８ml)を加え、その混合物を室温に温めながら１６
時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、目的のモノシリル化生
成物への１５.６％変換を示した。
【００２４】実施例４ Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ml)およびジイソプロ
ピルアミン(１.７１ml)中のｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-
マルトヘプタオシド(５g)の溶液を−１０℃に冷却し
た。ジメチルセキシルシリルクロリド(１.９３ml)を加
え、その混合物を−１０℃で２時間撹拌した後、＋５℃
で１９.５時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、目的のモノ
シリル化生成物への１５.４％変換を示した。
【００２５】実施例５ 実施例１の粗生成物(３００g)をメタノール(０.７５l)
と混合し、次いでアセトニトリル(７５ml)および脱塩水
(０.６７５l)を加え、６-Ｏ-セキシルジメチルシリル-
ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マルトヘプタオシドを完全に
可溶化した。この溶液(１.７５l)をＣ18誘導体化シリカ
粒子のカートリッジ(１０ｘ６０cm)(Bondpak)に充填
し、径圧５００psi(３４３５Kpu)をかけた。充填物質
は、使用前にメタノール:水＝５５:４５(ｖ／ｖ)中の
０.２５％酢酸で洗浄しておいた。水:メタノール(０.１
g／l Trizma(ｐＨ８.０)を含む)＝４５:５５(ｖ／ｖ)の
移動相を用いて流速０.６９l／分で分離を実行した。生
成物は単一ピーク中に収率７５％で回収された(添付の
図２を参照のこと)。この生成物分画を減圧下４０℃で
濃縮することによってメタノールを除去した後、１０℃
で凍結乾燥することによって目的の生成物１５gを得
た。これは粗生成物からの精製収率４４.５％を表して
いる。精製した生成物のＨＰＬＣ(ＮＨ2マイクロボンダ
パック(micorbondapak)、ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ:７２／７８
(ｖ／ｖ)流速２ml／分による溶出、検出３１３nm)によ
る分析は約９９.２％の純度を示した。
【００２６】ここでは例示のために本発明の製造法の好
ましい側面を、１つのオリゴ糖誘導体６-Ｏ-セキシルジ
メチルシリル-ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マルトヘプタ
オシドを例に挙げて広く記述した。しかしながら、当業
者には理解されるであろうように、本製造法は例えば鎖
長の異なる類似の誘導体あるいは構造または置換基に非
干渉性の変化を有する類似の誘導体の製造にも適用でき
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 従来法による６-Ｏ-セキシルジメチルシリル
-ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マルトヘプタオシドの５段
階製造工程を表す。
【図２】 本発明の一段階生成反応によって得た混合物
からの６-Ｏ-セキシルジメチルシリル-ｐ-ニトロフェニ
ル-α-Ｄ-マルトヘプタオシドの精製におけるＨＰＬＣ
クロマトグラフィーを表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ファーハット・ケイ・シディック イギリス、イングランド、サフォーク、ヘ イバーヒル、コルン・バリー・ロード８番 (72)発明者 デイビッド・アール・スティーブンス イギリス、イングランド、サフォーク、ヘ イバーヒル、ウィザーズフィールド・ロー ド10番 (72)発明者 スティーブン・ピー・ムーア イギリス、イングランド、ケント、レナ ム、ザ・スクエアー、ウィッカム・プレイ ス６番

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも３個の反復グルコース単位を
    含有するオリゴ糖であって、その還元末端に、ニトロフ
    ェニル、２-クロロ-４-ニトロフェニル、４-メチルウン
    ベリフェロン、ルシフェリンおよび色素原フェノール類
    から選択されるアグリコン単位を有するオリゴ糖の末端
    非還元グルコース単位の直接シリル化法であって、 (ａ)溶媒を用いて該オリゴ糖の溶液を形成させ； (ｂ)塩基の存在下で該オリゴ糖をシリル化保護試薬と反
    応させ； (ｃ)その反応混合物からモノシリル化オリゴ糖誘導体を
    回収する；ことからなる方法。
  2. 【請求項２】 オリゴ糖がｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マ
    ルトヘプタオシドである請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 モノシリル化オリゴ糖誘導体が６-Ｏ-セ
    キシルジメチルシリル-ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-マル
    トヘプタオシドである請求項１または請求項２の方法。
  4. 【請求項４】 シリル化保護試薬が、セキシルジメチル
    シリル-クロリド、-ブロミド、-ヨウジドまたは-トリフ
    ルオロメタンスルホネート、クロロトリメチルシラン、
    ビス-トリメチルシリルアセタミド、クロロトリフェニ
    ルシランおよびクロロ-ｔ-ブチル-ジメチルシランから
    選択される請求項１から請求項３までの方法。
  5. 【請求項５】 シリル化保護試薬がセキシルジメチルシ
    リルクロリドである請求項４の方法。
  6. 【請求項６】 溶媒がＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミドまた
    はピリジンである請求項１から請求項５までの方法。
  7. 【請求項７】 溶媒がピリジンである請求項６の方法。
  8. 【請求項８】 塩基が、トリエチルアミン、ジイソプロ
    ピルアミン、ピリジンおよびイミダゾールから選択され
    る請求項１から請求項７までの方法。
  9. 【請求項９】 塩基がピリジンである請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】 ピリジンが溶媒としても塩基としても
    働く請求項１から請求項９までの方法。
  11. 【請求項１１】 反応温度が−４０〜＋３０℃である請
    求項１から請求項１０までの方法。
  12. 【請求項１２】 反応温度が−１５〜＋５℃である請求
    項１１の方法。
  13. 【請求項１３】 モノシリル化オリゴ糖誘導体をＨＰＬ
    Ｃによって回収する請求項１から請求項１２までの方
    法。
JP15478192A 1991-06-17 1992-06-15 オリゴ糖誘導体の製造 Pending JPH05170785A (ja)

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