JPH05168467A - ファージ耐性乳酸菌及びこれを用いる醤油の製造法 - Google Patents
ファージ耐性乳酸菌及びこれを用いる醤油の製造法Info
- Publication number
- JPH05168467A JPH05168467A JP3353939A JP35393991A JPH05168467A JP H05168467 A JPH05168467 A JP H05168467A JP 3353939 A JP3353939 A JP 3353939A JP 35393991 A JP35393991 A JP 35393991A JP H05168467 A JPH05168467 A JP H05168467A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phage
- lactic acid
- soy sauce
- plate
- colonies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Soy Sauces And Products Related Thereto (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 信頼性の高いファージ耐性乳酸菌、並びにこ
れを用いて高品質の醤油を安定して得る。 【構成】 ファージと直接接触させないレプリカ法によ
ってファージ耐性の乳酸菌を造成し、これを用いて高品
質の醤油を安定して製造する。
れを用いて高品質の醤油を安定して得る。 【構成】 ファージと直接接触させないレプリカ法によ
ってファージ耐性の乳酸菌を造成し、これを用いて高品
質の醤油を安定して製造する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はファージ耐性乳酸菌、並
びに麹及び／又は諸味にファージ耐性醤油乳酸菌を添加
する醤油の製造法の改良に関し、特に信頼性の高いファ
ージ耐性乳酸菌及びこれを用いて高品質の醤油を安定し
て得る醤油の製造法に関する。
びに麹及び／又は諸味にファージ耐性醤油乳酸菌を添加
する醤油の製造法の改良に関し、特に信頼性の高いファ
ージ耐性乳酸菌及びこれを用いて高品質の醤油を安定し
て得る醤油の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】醤油諸味の発酵において醤油乳酸菌［ペ
ディオコッカス・ハロフィルス（Pediococcus halophil
us）］は、糖から乳酸を生成して、諸味のｐＨを好まし
い値にまで低下させる他、アミノ酸類の分解変換、有機
酸の分解生成および還元作用など醤油の品質にとって重
要な働きをなす。従って香味共にバランスのとれた高品
質の醤油を製造するには、優れた性質を持つ醤油乳酸菌
による乳酸発酵を安定して確実に行うことが必要であ
る。
ディオコッカス・ハロフィルス（Pediococcus halophil
us）］は、糖から乳酸を生成して、諸味のｐＨを好まし
い値にまで低下させる他、アミノ酸類の分解変換、有機
酸の分解生成および還元作用など醤油の品質にとって重
要な働きをなす。従って香味共にバランスのとれた高品
質の醤油を製造するには、優れた性質を持つ醤油乳酸菌
による乳酸発酵を安定して確実に行うことが必要であ
る。
【０００３】伝統的な醤油の製造法においては、諸味発
酵は通常開放系で行われており、乳酸菌等の微生物の人
為的添加は殆ど行われず、諸味中で活動する醤油乳酸菌
は総てその醸造場、施設、器具等に自然に住み着いてい
る菌群（ナチュラル・フローラ）の自然混入に委ねられ
ていた。このナチュラルフローラは非常に多種多様であ
り自然混入した乳酸菌の中には醤油の品質上、必ずしも
好ましくない性質の菌が含まれることも有る。また地域
により、あるいは時と共にその内容も変化するので、醸
造場所により製品品質に差がついたり、年間を通じて品
質の一定した醤油が得られない等の欠点があった。
酵は通常開放系で行われており、乳酸菌等の微生物の人
為的添加は殆ど行われず、諸味中で活動する醤油乳酸菌
は総てその醸造場、施設、器具等に自然に住み着いてい
る菌群（ナチュラル・フローラ）の自然混入に委ねられ
ていた。このナチュラルフローラは非常に多種多様であ
り自然混入した乳酸菌の中には醤油の品質上、必ずしも
好ましくない性質の菌が含まれることも有る。また地域
により、あるいは時と共にその内容も変化するので、醸
造場所により製品品質に差がついたり、年間を通じて品
質の一定した醤油が得られない等の欠点があった。
【０００４】この様な見地から、地域的或いは時間的な
制限に囚われずに常に品質の一定した醸造醤油を製造す
ることを目指して、予め選択された、または特に育種し
た、性質の優秀な醤油乳酸菌を人為的に、麹及び／また
は諸味に添加し、仕込み工程における乳酸発酵を安定し
て行わせようとすることが広く行われるようになった。
制限に囚われずに常に品質の一定した醸造醤油を製造す
ることを目指して、予め選択された、または特に育種し
た、性質の優秀な醤油乳酸菌を人為的に、麹及び／また
は諸味に添加し、仕込み工程における乳酸発酵を安定し
て行わせようとすることが広く行われるようになった。
【０００５】しかしながら、通常の醤油の製造法におい
ては、無殺菌の麹を使用し、微生物学的に開放系の容器
で諸味管理を行っているために醤油諸味の乳酸発酵には
特定不能の複雑なトラブル要因が入り込みやすく、添加
した乳酸菌を長期にわたり安定して生育させ、好ましい
乳酸発酵を続けることは非常に難しい状況にあった。
ては、無殺菌の麹を使用し、微生物学的に開放系の容器
で諸味管理を行っているために醤油諸味の乳酸発酵には
特定不能の複雑なトラブル要因が入り込みやすく、添加
した乳酸菌を長期にわたり安定して生育させ、好ましい
乳酸発酵を続けることは非常に難しい状況にあった。
【０００６】そこで、本発明者らは、添加した醤油乳酸
菌を常に安定して生育させ、内容の一定した乳酸発酵を
確実に行うことを目的として、鋭意研究を重ねた結果、
醤油の諸味から、醤油乳酸菌に感染し、これを溶菌する
多種類のファージを検出し、このファージによって添加
した乳酸菌が溶菌あるいは増殖阻害を受けることが乳酸
発酵トラブルの一大要因となっていることを見出し、こ
の要因を解消すれば上記目的が達成できることを知り、
先に、麹及び／又は諸味に醤油乳酸菌を添加する醤油の
製造法において、醤油乳酸菌としてファージ耐性醤油乳
酸菌を使用することを特徴とする醤油の製造法（特開昭
６３ー２１６４４９号公報参照）を開発した。
菌を常に安定して生育させ、内容の一定した乳酸発酵を
確実に行うことを目的として、鋭意研究を重ねた結果、
醤油の諸味から、醤油乳酸菌に感染し、これを溶菌する
多種類のファージを検出し、このファージによって添加
した乳酸菌が溶菌あるいは増殖阻害を受けることが乳酸
発酵トラブルの一大要因となっていることを見出し、こ
の要因を解消すれば上記目的が達成できることを知り、
先に、麹及び／又は諸味に醤油乳酸菌を添加する醤油の
製造法において、醤油乳酸菌としてファージ耐性醤油乳
酸菌を使用することを特徴とする醤油の製造法（特開昭
６３ー２１６４４９号公報参照）を開発した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】この方法において、フ
ァージ耐性醤油乳酸菌の造成は、醤油乳酸菌とファー
ジを接触処理し、自然突然変異によるファージ耐性菌を
分離するか、または醤油乳酸菌に突然変異処理を行
い、これとファージを接触処理し、得られた菌株の中か
ら他の性質は親株と同じでファージ耐性のみ強い［すな
わちファージに感受性の醤油乳酸菌（親株）が全く生育
できないくらいの高濃度のファージ存在下でも寒天平板
培養すると生育し、コロニーを形成する］耐性株を分離
するものである。
ァージ耐性醤油乳酸菌の造成は、醤油乳酸菌とファー
ジを接触処理し、自然突然変異によるファージ耐性菌を
分離するか、または醤油乳酸菌に突然変異処理を行
い、これとファージを接触処理し、得られた菌株の中か
ら他の性質は親株と同じでファージ耐性のみ強い［すな
わちファージに感受性の醤油乳酸菌（親株）が全く生育
できないくらいの高濃度のファージ存在下でも寒天平板
培養すると生育し、コロニーを形成する］耐性株を分離
するものである。
【０００８】しかしながら、こうして得たファージ耐性
醤油乳酸菌は、該乳酸菌の遺伝子の中にファージ遺伝子
を組込んだ、いわゆる溶原菌である可能性があり、継代
培養の繰返しで組込まれたファージ遺伝子が発現し、培
養液中にファージを放出することがあり、この様な場合
この後の乳酸醗酵を続けることが難しくなる。即ち、こ
の方法によって造成されたファージ耐性醤油乳酸菌は信
頼性に欠ける欠点を有していた。
醤油乳酸菌は、該乳酸菌の遺伝子の中にファージ遺伝子
を組込んだ、いわゆる溶原菌である可能性があり、継代
培養の繰返しで組込まれたファージ遺伝子が発現し、培
養液中にファージを放出することがあり、この様な場合
この後の乳酸醗酵を続けることが難しくなる。即ち、こ
の方法によって造成されたファージ耐性醤油乳酸菌は信
頼性に欠ける欠点を有していた。
【０００９】
【発明を解決するための手段】そこで 本発明者らは、
信頼性の高いファージ耐性醤油乳酸菌を造成し、この乳
酸菌を使用して高品質の醤油を安定して得る醤油の製造
法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、ついに本発明を
完成した。
信頼性の高いファージ耐性醤油乳酸菌を造成し、この乳
酸菌を使用して高品質の醤油を安定して得る醤油の製造
法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、ついに本発明を
完成した。
【００１０】即ち本発明は、多数の乳酸菌コロニーを形
成したマスター平板を、滅菌した担体表面に軽く押しつ
け、該マスター平板上のコロニーをプリントし、次いで
この面に予めファージ懸濁液を塗布した平板培地を軽く
押しつけ、前記担体表面上にプリントされたコロニーを
写し取ってレプリカ平板を得、これを培養した後、前記
マスター平板と該レプリカ平板に形成したコロニーを対
比し、該レプリカ平板に形成したコロニーに対応する前
記マスター平板上のコロニーを分離することにより得ら
れたファージ耐性乳酸菌であり、また本発明は、麹及び
／又は諸味にファージ耐性醤油乳酸菌を添加する醤油の
製造法において、該ファージ耐性醤油乳酸菌として、上
記ファージ耐性乳酸菌を使用することを特徴とする醤油
の製造法である。
成したマスター平板を、滅菌した担体表面に軽く押しつ
け、該マスター平板上のコロニーをプリントし、次いで
この面に予めファージ懸濁液を塗布した平板培地を軽く
押しつけ、前記担体表面上にプリントされたコロニーを
写し取ってレプリカ平板を得、これを培養した後、前記
マスター平板と該レプリカ平板に形成したコロニーを対
比し、該レプリカ平板に形成したコロニーに対応する前
記マスター平板上のコロニーを分離することにより得ら
れたファージ耐性乳酸菌であり、また本発明は、麹及び
／又は諸味にファージ耐性醤油乳酸菌を添加する醤油の
製造法において、該ファージ耐性醤油乳酸菌として、上
記ファージ耐性乳酸菌を使用することを特徴とする醤油
の製造法である。
【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
於けるファージ耐性醤油乳酸菌は、醤油乳酸菌に感染
し、これを溶菌させるファージに対して抵抗性のある乳
酸菌で以下の方法によって得ることが出来る。
於けるファージ耐性醤油乳酸菌は、醤油乳酸菌に感染
し、これを溶菌させるファージに対して抵抗性のある乳
酸菌で以下の方法によって得ることが出来る。
【００１２】１．［ファージの分離］ 醤油乳酸菌のファージは、食塩を１０〜２０％含有させ
る以外は通常のファージの検出、分離に用いられる培地
及び方法に準じて分離することが出来る（昭和４５年１
０月１０日、朝倉書店発行、植村定次郎、相田洗 編集
「発酵と微生物１１」第７５〜９２頁「ファージ実験
法」参照）。例えば、任意の醤油乳酸菌に感染するファ
ージを検索するには、ファージの存在が推定される試料
あるいは野性乳酸菌が豊富に生育していると思われる天
然仕込み醤油諸味を濾過して諸味液汁を得、これを孔径
０．２〜０．４μｍのメンブランフィルターで濾過して
微生物を完全に除去し、ファージ含有無菌濾過液を得
る。これを１０〜２０％食塩水で多段に希釈し、その一
部、例えば０．５ｍｌと特定の醤油乳酸菌の培養液０．
５ｍｌとを混ぜ、この混合液の一部、例えば１００μｌ
を、予め調製しておいた寒天平板培地上に一様に塗布
し、通常の乳酸菌の寒天平板培養法に従い、嫌気的条件
下［Gas Pak(Becton-Dickson社製）法または重層培養
法］で、２０〜３０℃で２〜６日間培養する。塗布した
醤油乳酸菌（指示菌）に感染するファージが存在する場
合には、希釈の段階に応じて溶菌斑［プラーク（Plaqu
e)］が現れるので、これを釣菌し、これを再度同一指示
菌と混ぜて寒天平板培養すれば、再び生じたプラークか
ら前記醤油乳酸菌に感染するファージを分離することが
出来る。総ての醤油乳酸菌に対して常にファージが検出
されるとは言い切れないが、分離源に適当な試料を選ん
で実験を繰返せば、その菌株に感染するファージを取得
することができる。
る以外は通常のファージの検出、分離に用いられる培地
及び方法に準じて分離することが出来る（昭和４５年１
０月１０日、朝倉書店発行、植村定次郎、相田洗 編集
「発酵と微生物１１」第７５〜９２頁「ファージ実験
法」参照）。例えば、任意の醤油乳酸菌に感染するファ
ージを検索するには、ファージの存在が推定される試料
あるいは野性乳酸菌が豊富に生育していると思われる天
然仕込み醤油諸味を濾過して諸味液汁を得、これを孔径
０．２〜０．４μｍのメンブランフィルターで濾過して
微生物を完全に除去し、ファージ含有無菌濾過液を得
る。これを１０〜２０％食塩水で多段に希釈し、その一
部、例えば０．５ｍｌと特定の醤油乳酸菌の培養液０．
５ｍｌとを混ぜ、この混合液の一部、例えば１００μｌ
を、予め調製しておいた寒天平板培地上に一様に塗布
し、通常の乳酸菌の寒天平板培養法に従い、嫌気的条件
下［Gas Pak(Becton-Dickson社製）法または重層培養
法］で、２０〜３０℃で２〜６日間培養する。塗布した
醤油乳酸菌（指示菌）に感染するファージが存在する場
合には、希釈の段階に応じて溶菌斑［プラーク（Plaqu
e)］が現れるので、これを釣菌し、これを再度同一指示
菌と混ぜて寒天平板培養すれば、再び生じたプラークか
ら前記醤油乳酸菌に感染するファージを分離することが
出来る。総ての醤油乳酸菌に対して常にファージが検出
されるとは言い切れないが、分離源に適当な試料を選ん
で実験を繰返せば、その菌株に感染するファージを取得
することができる。
【００１３】２．［ファージ耐性醤油乳酸菌の造成］ ファージ耐性醤油乳酸菌は、予め選択された、または特
に育種した、性質の優秀な醤油乳酸菌をそのまま、また
は人工変異処理して得られる多数の醤油乳酸菌コロニー
を形成したマスター平板を、滅菌したビロード、コロニ
ートランスファーパッド等の担体表面に軽く押しつけ、
該マスター平板上のコロニーをプリントし、次いでこの
面に予めファージ懸濁液を塗布した平板培地を軽く押し
つけ、前記担体表面上にプリントされたコロニーを写し
取ってレプリカ平板を得、これを培養した後、前記マス
ター平板と該レプリカ平板に形成したコロニーを対比
し、該レプリカ平板に形成したコロニーに対応する前記
マスター平板上のコロニーを分離することにより得られ
る。
に育種した、性質の優秀な醤油乳酸菌をそのまま、また
は人工変異処理して得られる多数の醤油乳酸菌コロニー
を形成したマスター平板を、滅菌したビロード、コロニ
ートランスファーパッド等の担体表面に軽く押しつけ、
該マスター平板上のコロニーをプリントし、次いでこの
面に予めファージ懸濁液を塗布した平板培地を軽く押し
つけ、前記担体表面上にプリントされたコロニーを写し
取ってレプリカ平板を得、これを培養した後、前記マス
ター平板と該レプリカ平板に形成したコロニーを対比
し、該レプリカ平板に形成したコロニーに対応する前記
マスター平板上のコロニーを分離することにより得られ
る。
【００１４】そして、この中から特にファージ抵抗性の
強い菌株を取得したい場合は、更に次のような操作を行
えば良い。前記マスター平板より得られた菌株を、ファ
ージ液を１％、食塩１５％を添加したＭＲＳ液体培地２
００μｌに白金線で接種し、３０℃、４日培養した後、
菌体の増殖が肉眼ではっきりと認められたものを選抜し
た。更にここで選抜された菌株の培養液を、ファージ液
を１％、食塩１５％を添加したＭＲＳ液体培地、並びに
ファージ液を含まず、食塩１５％を添加したＭＲＳ液体
培地（対比培地）４００μｌにそれぞれ１０μｌづつ接
種し、３０℃で３日間培養し、菌体の増殖を５８０ｎｍ
の吸光度で測定し、対比培地に比べて菌体の生育が良好
で、ファージ添加の影響の無い菌株を選択する。
強い菌株を取得したい場合は、更に次のような操作を行
えば良い。前記マスター平板より得られた菌株を、ファ
ージ液を１％、食塩１５％を添加したＭＲＳ液体培地２
００μｌに白金線で接種し、３０℃、４日培養した後、
菌体の増殖が肉眼ではっきりと認められたものを選抜し
た。更にここで選抜された菌株の培養液を、ファージ液
を１％、食塩１５％を添加したＭＲＳ液体培地、並びに
ファージ液を含まず、食塩１５％を添加したＭＲＳ液体
培地（対比培地）４００μｌにそれぞれ１０μｌづつ接
種し、３０℃で３日間培養し、菌体の増殖を５８０ｎｍ
の吸光度で測定し、対比培地に比べて菌体の生育が良好
で、ファージ添加の影響の無い菌株を選択する。
【００１５】以下、実施例を示して本発明をより具体的
に説明する。
に説明する。
【００１６】
【実施例 １】天然仕込み醤油諸味中より分離したペデ
ィオコッカス・ハロフィルス Ｄ１０（親株）について
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンに
よる突然変異処理を行い、その希釈懸濁液（２，０００
個／ｍｌ）１００μｌを、食塩１５％及び寒天１．５％
を添加したＭＲＳ平板培地（Ｄｉｆｃｏ社製、０８８１
−０１−３）に接種し、３０℃で６日培養して、多数の
醤油乳酸菌が形成したコロニーを有するマスター平板を
得た。ついで、これを滅菌したコロニートランファーパ
ッド（レプリプレート、ＦＭＣ社製）表面に軽く押しつ
け、該マスター平板上のコロニーをレプリプレート表面
上にプリントした。次いで、後述する方法で調製したフ
ァージ懸濁液を塗布した平板培地を上記プリントしたレ
プリプレート表面に軽く押しつけ、コロニーを写し取っ
てレプリカ平板を得た。次いで、これを３０℃で６日培
養した後、前記マスター平板と前記レプリカ平板に形成
したコロニーを対比し、該レプリカ平板に形成したコロ
ニーに対応する該マスター平板上のコロニーを分離する
ことにより目的とする菌株を得た。
ィオコッカス・ハロフィルス Ｄ１０（親株）について
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンに
よる突然変異処理を行い、その希釈懸濁液（２，０００
個／ｍｌ）１００μｌを、食塩１５％及び寒天１．５％
を添加したＭＲＳ平板培地（Ｄｉｆｃｏ社製、０８８１
−０１−３）に接種し、３０℃で６日培養して、多数の
醤油乳酸菌が形成したコロニーを有するマスター平板を
得た。ついで、これを滅菌したコロニートランファーパ
ッド（レプリプレート、ＦＭＣ社製）表面に軽く押しつ
け、該マスター平板上のコロニーをレプリプレート表面
上にプリントした。次いで、後述する方法で調製したフ
ァージ懸濁液を塗布した平板培地を上記プリントしたレ
プリプレート表面に軽く押しつけ、コロニーを写し取っ
てレプリカ平板を得た。次いで、これを３０℃で６日培
養した後、前記マスター平板と前記レプリカ平板に形成
したコロニーを対比し、該レプリカ平板に形成したコロ
ニーに対応する該マスター平板上のコロニーを分離する
ことにより目的とする菌株を得た。
【００１７】次いで、ここで得られた菌株はファージ抵
抗性の弱い株を含んでいたので、更に次のようにしてフ
ァージ抵抗性の強い株を選択した。前記マスター平板よ
り得られた菌株を、ファージ液を１％、食塩１５％を添
加したＭＲＳ液体培地２００μｌに白金線で接種し、３
０℃で４日培養した後、菌体の増殖が肉眼ではっきりと
認められたものを選抜した。次いで、更にここで選抜さ
れた菌株の培養液を、ファージ液を１％、食塩１５％を
添加したＭＲＳ液体培地、並びにファージ液を含まず、
食塩１５％を添加したＭＲＳ液体培地（対比培地）４０
０μｌにそれぞれ１０μｌづつ接種して、３０℃で３日
培養し、菌体の増殖を５８０ｎｍの吸光度で測定し、対
比培地に比べて菌体の生育が良好な菌株を選択した。以
上のようにして親株と比べて菌学的性質は同じだがファ
ージ抵抗性の非常に強い醤油乳酸菌ペディオコッカス・
ハロフィルスＤ１０−Ｎｏ．１株を分離した。
抗性の弱い株を含んでいたので、更に次のようにしてフ
ァージ抵抗性の強い株を選択した。前記マスター平板よ
り得られた菌株を、ファージ液を１％、食塩１５％を添
加したＭＲＳ液体培地２００μｌに白金線で接種し、３
０℃で４日培養した後、菌体の増殖が肉眼ではっきりと
認められたものを選抜した。次いで、更にここで選抜さ
れた菌株の培養液を、ファージ液を１％、食塩１５％を
添加したＭＲＳ液体培地、並びにファージ液を含まず、
食塩１５％を添加したＭＲＳ液体培地（対比培地）４０
０μｌにそれぞれ１０μｌづつ接種して、３０℃で３日
培養し、菌体の増殖を５８０ｎｍの吸光度で測定し、対
比培地に比べて菌体の生育が良好な菌株を選択した。以
上のようにして親株と比べて菌学的性質は同じだがファ
ージ抵抗性の非常に強い醤油乳酸菌ペディオコッカス・
ハロフィルスＤ１０−Ｎｏ．１株を分離した。
【００１８】次に、上記ペディオコッカス・ハロフィル
ス Ｄ１０−Ｎｏ．１のファージ放出の有無について調
べた結果を示す。即ち、上記菌株の懸濁液５０μｌを１
５％食塩添加ＭＲＳ液体培地５ｍｌに接種し、３０℃で
４日間培養し、この培養液５０μｌを上記ＭＲＳ液体培
地に再び接種し、以下同様にして合計５回植え継いだ
後、この培養液を孔径０．２μｍのメンブランフィルタ
ーで濾過し、その透過液２μｌを、親株を塗布した食塩
１５％及び寒天１．５％を添加したＭＲＳ平板培地上に
滴下し３０℃で４日間培養して、溶菌斑の有無により、
培養液中のファージの有無を調べた。この結果、溶菌斑
は全く検出されなかった。
ス Ｄ１０−Ｎｏ．１のファージ放出の有無について調
べた結果を示す。即ち、上記菌株の懸濁液５０μｌを１
５％食塩添加ＭＲＳ液体培地５ｍｌに接種し、３０℃で
４日間培養し、この培養液５０μｌを上記ＭＲＳ液体培
地に再び接種し、以下同様にして合計５回植え継いだ
後、この培養液を孔径０．２μｍのメンブランフィルタ
ーで濾過し、その透過液２μｌを、親株を塗布した食塩
１５％及び寒天１．５％を添加したＭＲＳ平板培地上に
滴下し３０℃で４日間培養して、溶菌斑の有無により、
培養液中のファージの有無を調べた。この結果、溶菌斑
は全く検出されなかった。
【００１９】次に、比較の為従来のファージ耐性醤油乳
酸菌の造成法により得られた乳酸菌のファージ放出の有
無について同様に調べた結果を示す。即ち、親株ペディ
オコッカス・ハロフィルス Ｄ１０について、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる突然
変異処理を行う。次いで、後述する方法で調製したファ
ージ液０．５ｍｌと上記突然変異処理を行った親株培養
液０．５ｍｌとを混合し、この１００μｌを食塩１５％
及び寒天１．５％を添加したＭＲＳ平板培地（Ｄｉｆｃ
ｏ社製、０８８１−０１−３）上に塗布して、３０℃で
６日培養した後、形成してきたコロニーから、他の性質
は親株と同じでファージ耐性のみ強い［すなわちファー
ジに感受性の醤油乳酸菌（親株）が全く生育できないく
らいの高濃度のファージ存在下でも寒天平板培養すると
生育し、コロニーを形成する］耐性株１００株を分離し
た。次に上記で分離した耐性株のファージ放出の有無に
ついて示す。即ち、これらの菌株を１５％食塩を添加し
たＭＲＳ液体培地５ｍｌに接種し、３０℃で４日培養
し、得られた培養液のうち５０μｌを上記ＭＲＳ液体培
地に再び接種し、以下同様にして合計５回植え継いだ。
次いで、この培養液を孔径０．２μｍのメンブランフィ
ルターで濾過し、その透過液２μｌを、親株を塗布した
食塩１５％及び寒天１．５％を添加したＭＲＳ平板培地
上に滴下し、３０℃で４日培養して、溶菌斑の有無を調
べたところ、耐性株として得られた親株（１００株）の
中から１０株について溶菌斑が確認され、ファージが検
出された。この結果から、上記の方法で造成したファー
ジ耐性の親株にはファージ遺伝子を組込んだ菌株が混入
しており、信頼性に欠けることが判った。
酸菌の造成法により得られた乳酸菌のファージ放出の有
無について同様に調べた結果を示す。即ち、親株ペディ
オコッカス・ハロフィルス Ｄ１０について、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる突然
変異処理を行う。次いで、後述する方法で調製したファ
ージ液０．５ｍｌと上記突然変異処理を行った親株培養
液０．５ｍｌとを混合し、この１００μｌを食塩１５％
及び寒天１．５％を添加したＭＲＳ平板培地（Ｄｉｆｃ
ｏ社製、０８８１−０１−３）上に塗布して、３０℃で
６日培養した後、形成してきたコロニーから、他の性質
は親株と同じでファージ耐性のみ強い［すなわちファー
ジに感受性の醤油乳酸菌（親株）が全く生育できないく
らいの高濃度のファージ存在下でも寒天平板培養すると
生育し、コロニーを形成する］耐性株１００株を分離し
た。次に上記で分離した耐性株のファージ放出の有無に
ついて示す。即ち、これらの菌株を１５％食塩を添加し
たＭＲＳ液体培地５ｍｌに接種し、３０℃で４日培養
し、得られた培養液のうち５０μｌを上記ＭＲＳ液体培
地に再び接種し、以下同様にして合計５回植え継いだ。
次いで、この培養液を孔径０．２μｍのメンブランフィ
ルターで濾過し、その透過液２μｌを、親株を塗布した
食塩１５％及び寒天１．５％を添加したＭＲＳ平板培地
上に滴下し、３０℃で４日培養して、溶菌斑の有無を調
べたところ、耐性株として得られた親株（１００株）の
中から１０株について溶菌斑が確認され、ファージが検
出された。この結果から、上記の方法で造成したファー
ジ耐性の親株にはファージ遺伝子を組込んだ菌株が混入
しており、信頼性に欠けることが判った。
【００２０】以上本発明と、比較例の結果から、従来法
によって得られたファージ耐性醤油乳酸菌は信頼性が低
いが、本発明により得られたそれはファージ放出の心配
が全く無く、安全性が非常に高いことが判る。
によって得られたファージ耐性醤油乳酸菌は信頼性が低
いが、本発明により得られたそれはファージ放出の心配
が全く無く、安全性が非常に高いことが判る。
【００２１】ファージ液の調製 天然仕込み醤油諸味を濾過して諸味液汁を得、これを孔
径０．２μｍのメンブランファイルター濾過し微生物を
完全に除去し、ファージ含有無菌濾過液を得る。これを
１５％食塩水で多段に希釈し、０．５ｍｌと親株の培養
液０．５ｍｌとを混ぜ、この混合液１００μｌを、あら
かじめ調整しておいた食塩１５％及び寒天１．５％を添
加したＭＲＳ平板培地上に一様に塗布し通常の乳酸菌の
寒天平板培養法に従い、嫌気条件下［Gas Pak(Becton-D
ickson社製）法］で３０℃で４日培養を行った。希釈の
段階に応じて溶菌斑［プラーク（Plaque)］が現れたの
で、釣菌し、これを再度同一親株と混ぜて液体培養する
と、溶菌が起り、溶菌液を孔径０．２μｍのメンブラン
ファイルター濾過し微生物を完全に除去し、ファージ含
有無菌濾過液を得、これをファージ液とした。
径０．２μｍのメンブランファイルター濾過し微生物を
完全に除去し、ファージ含有無菌濾過液を得る。これを
１５％食塩水で多段に希釈し、０．５ｍｌと親株の培養
液０．５ｍｌとを混ぜ、この混合液１００μｌを、あら
かじめ調整しておいた食塩１５％及び寒天１．５％を添
加したＭＲＳ平板培地上に一様に塗布し通常の乳酸菌の
寒天平板培養法に従い、嫌気条件下［Gas Pak(Becton-D
ickson社製）法］で３０℃で４日培養を行った。希釈の
段階に応じて溶菌斑［プラーク（Plaque)］が現れたの
で、釣菌し、これを再度同一親株と混ぜて液体培養する
と、溶菌が起り、溶菌液を孔径０．２μｍのメンブラン
ファイルター濾過し微生物を完全に除去し、ファージ含
有無菌濾過液を得、これをファージ液とした。
【００２２】
【実施例２】脱脂大豆１００ｋｇと小麦１００ｋｇとを
それぞれ変性処理し、種麹菌アスペルギルス・ソーエ
（Asp. sojae)を接種して、常法により醤油麹を造り、
これを３等分して、各々２５％食塩水１２０ｌと共に別
々のタンクＡ、Ｂ、Ｃに仕込みを行った。次いで、タン
クＡにはペディオコッカス・ハロフィルスＤ１０（ファ
ージ感受性菌）を、タンクＢには上記実施例１で得られ
たペディオコッカス・ハロフィルスＤ１０−Ｎｏ．１
（ファージ耐性菌）をそれぞれ生菌数が１×１０5／ｇ
となるように仕込み時に添加した。そして、タンクＣに
はコントロール（対照）として醤油乳酸菌は添加しなか
った。次に、このように調製した諸味へのファージの自
然出現は前以て予測できないので、ここでは本発明の効
果を確認するためＡ、Ｂ、Ｃの各タンクにペディオコッ
カス・ハロフィルスＤ１０に感染するファージ液を各々
２０ｍｌ接種した。そして、各タンクの諸味間で相互感
染が全く起らぬよう良く注意して攪拌し、通常の諸味管
理を行い、発酵、熟成させた。
それぞれ変性処理し、種麹菌アスペルギルス・ソーエ
（Asp. sojae)を接種して、常法により醤油麹を造り、
これを３等分して、各々２５％食塩水１２０ｌと共に別
々のタンクＡ、Ｂ、Ｃに仕込みを行った。次いで、タン
クＡにはペディオコッカス・ハロフィルスＤ１０（ファ
ージ感受性菌）を、タンクＢには上記実施例１で得られ
たペディオコッカス・ハロフィルスＤ１０−Ｎｏ．１
（ファージ耐性菌）をそれぞれ生菌数が１×１０5／ｇ
となるように仕込み時に添加した。そして、タンクＣに
はコントロール（対照）として醤油乳酸菌は添加しなか
った。次に、このように調製した諸味へのファージの自
然出現は前以て予測できないので、ここでは本発明の効
果を確認するためＡ、Ｂ、Ｃの各タンクにペディオコッ
カス・ハロフィルスＤ１０に感染するファージ液を各々
２０ｍｌ接種した。そして、各タンクの諸味間で相互感
染が全く起らぬよう良く注意して攪拌し、通常の諸味管
理を行い、発酵、熟成させた。
【００２３】そして、仕込み後、５０日目までの諸味の
経日的なｐＨの変化を調べたところ、ファージ耐性株を
接種したＢのタンクでは、ファージの接種があっても乳
酸が次第に諸味中に生成蓄積してｐＨはほぼ正常に下が
ったが、ファージ感受性の醤油乳酸菌を接種したＡのタ
ンクでは乳酸が全く生成せず、ｐＨの経過は乳酸菌を添
加しないコントロールＣとほぼ同様であった。仕込み後
約１ヵ月目に主発酵酵母チゴサッカロミセス・ルーキシ
ーを適量添加し、アルコール発酵を行わせ、以後常法に
より熟成させた後、圧搾して生醤油を得た。
経日的なｐＨの変化を調べたところ、ファージ耐性株を
接種したＢのタンクでは、ファージの接種があっても乳
酸が次第に諸味中に生成蓄積してｐＨはほぼ正常に下が
ったが、ファージ感受性の醤油乳酸菌を接種したＡのタ
ンクでは乳酸が全く生成せず、ｐＨの経過は乳酸菌を添
加しないコントロールＣとほぼ同様であった。仕込み後
約１ヵ月目に主発酵酵母チゴサッカロミセス・ルーキシ
ーを適量添加し、アルコール発酵を行わせ、以後常法に
より熟成させた後、圧搾して生醤油を得た。
【００２４】このようにして得られた生醤油のｐＨと乳
酸を分析し、また熟練したパネル２３名による官能検査
を実施したところ表１に示す如き結果が得られた。な
お、官能検査は風味について、次の基準で採点し、その
合計点で示した。 風味が優れている…１点、風味が劣る…０点。 表１の結果から、醤油乳酸菌としてファージ耐性菌を使
用すると、安定して乳酸発酵が行われ、高品質の醤油が
得られることが判る。
酸を分析し、また熟練したパネル２３名による官能検査
を実施したところ表１に示す如き結果が得られた。な
お、官能検査は風味について、次の基準で採点し、その
合計点で示した。 風味が優れている…１点、風味が劣る…０点。 表１の結果から、醤油乳酸菌としてファージ耐性菌を使
用すると、安定して乳酸発酵が行われ、高品質の醤油が
得られることが判る。
【００２５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中野 衛一 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内
Claims (2)
- 【請求項１】 多数の乳酸菌コロニーを形成したマスタ
ー平板を、滅菌した担体表面に軽く押しつけ、該マスタ
ー平板上のコロニーをプリントし、次いでこの面に予め
ファージ懸濁液を塗布した平板培地を軽く押しつけ、前
記担体表面上にプリントされたコロニーを写し取ってレ
プリカ平板を得、これを培養した後、前記マスター平板
と該レプリカ平板に形成したコロニーを対比し、該レプ
リカ平板に形成したコロニーに対応する前記マスター平
板上のコロニーを分離することにより得られたファージ
耐性乳酸菌。 - 【請求項２】 麹及び／又は諸味にファージ耐性醤油乳
酸菌を添加する醤油の製造法において、該ファージ耐性
醤油乳酸菌として、多数の醤油乳酸菌コロニーを形成し
たマスター平板を、滅菌した担体表面に軽く押しつけ、
該マスター平板上のコロニーをプリントし、次いでこの
面に予めファージ懸濁液を塗布した平板培地を軽く押し
つけ、前記担体表面上にプリントされたコロニーを写し
取ってレプリカ平板を得、これを培養した後前記マスタ
ー平板と該レプリカ平板に形成したコロニーを対比し、
該レプリカ平板に形成したコロニーに対応する前記マス
ター平板上のコロニーを分離することにより得られたフ
ァージ耐性醤油乳酸菌を使用することを特徴とする醤油
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03353939A JP3027460B2 (ja) | 1991-12-19 | 1991-12-19 | ファージ耐性乳酸菌及びこれを用いる醤油の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03353939A JP3027460B2 (ja) | 1991-12-19 | 1991-12-19 | ファージ耐性乳酸菌及びこれを用いる醤油の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05168467A true JPH05168467A (ja) | 1993-07-02 |
| JP3027460B2 JP3027460B2 (ja) | 2000-04-04 |
Family
ID=18434236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03353939A Expired - Fee Related JP3027460B2 (ja) | 1991-12-19 | 1991-12-19 | ファージ耐性乳酸菌及びこれを用いる醤油の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3027460B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013517785A (ja) * | 2010-01-28 | 2013-05-20 | セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ | ファージ耐性に基づいて選択された食品に質感を加えるための乳酸菌 |
| US10392597B2 (en) | 2010-10-22 | 2019-08-27 | Chr. Hanse A/S | Texturizing lactic acid bacteria strains |
| CN115141724A (zh) * | 2022-05-21 | 2022-10-04 | 吕欣怡 | 物质抑菌实验用图章式菌种接种囊 |
-
1991
- 1991-12-19 JP JP03353939A patent/JP3027460B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013517785A (ja) * | 2010-01-28 | 2013-05-20 | セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ | ファージ耐性に基づいて選択された食品に質感を加えるための乳酸菌 |
| US9562221B2 (en) | 2010-01-28 | 2017-02-07 | Chr. Hansen A/S | Lactic bacterium for texturizing food products selected on the basis of phage resistance |
| US10392597B2 (en) | 2010-10-22 | 2019-08-27 | Chr. Hanse A/S | Texturizing lactic acid bacteria strains |
| CN115141724A (zh) * | 2022-05-21 | 2022-10-04 | 吕欣怡 | 物质抑菌实验用图章式菌种接种囊 |
| CN115141724B (zh) * | 2022-05-21 | 2024-06-07 | 吕欣怡 | 物质抑菌实验用图章式菌种接种囊 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3027460B2 (ja) | 2000-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pore | Selective medium for the isolation of Prototheca | |
| Villar et al. | Isolation and characterization of Pediococcus halophilus from salted anchovies (Engraulis anchoita) | |
| JP2009518031A (ja) | マンニトール生成能が優れた耐酸性ロイコノストックメセンテロイデス及びそれを利用したキムチの製造方法 | |
| CN109913386B (zh) | 一株高产茶氨酸的茶树内生菌CsE7及其应用 | |
| JPH05168467A (ja) | ファージ耐性乳酸菌及びこれを用いる醤油の製造法 | |
| Padan et al. | Short-trichome mutant of Plectonema boryanum | |
| JPH08154616A (ja) | 品質改良納豆および新規変異菌株 | |
| JP2017108659A (ja) | 加熱殺菌が可能な納豆 | |
| CN113699069A (zh) | 菌株hscy 2073及其分离筛选和在提高食醋风味品质中的应用 | |
| JPH03297358A (ja) | ビタミンｋ含量の低い納豆の製造方法 | |
| Gichner et al. | Metabolic activation of m-phenylenediamine to products mutagenic in Salmonella typhimurium by medium isolated from tobacco suspension cell cultures | |
| Bertani | Genetic interaction between the nip1 mutation and genes affecting integration and excision in phage P2 | |
| JP4135846B2 (ja) | アミノ酸脱炭酸作用を有しない乳酸菌の取得方法 | |
| JPS63216449A (ja) | 醤油の製造法 | |
| CN115232759B (zh) | 一株葡萄球菌及其应用 | |
| Sullivan et al. | Acid-Production as a Basis for Classifying Lactobacilli From Carious Teeth | |
| AU2021106407A4 (en) | Method for Improving Fermentation Quality of Fish Sauce by Halanaerobium fermentans | |
| JPS6075280A (ja) | プロトプラスト融合による麹菌の製造法 | |
| JPH10215861A (ja) | ファージ耐性納豆菌およびその納豆 | |
| JP3176842B2 (ja) | 新規な醸造用酵母 | |
| JPH10295365A (ja) | 新規麹菌及びその用途 | |
| CN117165481A (zh) | 一株可降解苹果酸的植物乳杆菌及其应用 | |
| EP0103646B1 (en) | Novel killer yeast, process for its production, and application thereof | |
| JPH0716380B2 (ja) | 醤油の製造方法 | |
| JP5713334B2 (ja) | 酵母の自然変異株分離法及び変異株酵母 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |