JPH05163290A - Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、これを有効成分とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規化合物を基質として用いることにより、
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧａ
ｓｅ）活性を効率よく、正確に測定する。 【構成】 基質として用いる化合物は、一般式 【化１】 （式中のＺはＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残
基、Ｒ¹〜Ｒ³はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン
原子、又はニトロ基を意味する）で表わされるＮ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体である。該化合物を
ＮＡＧａｓｅ含有試料に加え、酵素反応により生成する
フルオレセイン・モノエーテルを定量してＮＡＧａｓｅ
活性を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なＮ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミン誘導体、該誘導体を有効成分とす
るＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定
用試薬及び該誘導体を用いてＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニダーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定する
方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼ（以下、ＮＡＧａｓｅという）は、腎尿細管上皮に
多く含まれるリソソーム（Ｌｙｓｏｓｏｍｅ）中の酵素
の１つであり、糖蛋白やムコ多糖類の分解に関与してい
る。尿中ＮＡＧａｓｅは急性腎不全や糸球体腎炎などの
各種腎臓疾患や腎臓の術後においては上昇し、また糖尿
病においては、尿中ばかりでなく血清中ＮＡＧａｓｅも
上昇することが認められている。こういった各種腎臓疾
患の診断及び経過観察の一助として、また薬物の腎毒性
検討の指標としても、臨床及び動物実験面でＮＡＧａｓ
ｅの測定が注目されている。

【０００３】そして従来、ＮＡＧａｓｅ活性の測定用基
質としては、例えばｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．，
２７，１１８０（１９８１）］及び４−メチルウンベリ
フェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃ
ｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ，２４，１８９（１９
６９）］、 ｍ−クレゾールスルホンフタレイニル−Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃｌｉｎ． Ｃｈ
ｅｍ．，２９，１７１３（１９８３）］が知られてい
る。

【０００４】しかしながら、これらの化合物をＮＡＧａ
ｓｅ活性の測定用基質として用いた場合は、酵素作用に
よって生成したアグリコンを定量する際、反応液のｐＨ
を１０〜１１程度という高アルカリ性とする必要がある
ために、一旦酵素反応を停止させて酵素活性を測定する
いわゆるエンドポイント法しか適用できず、酵素活性測
定法として最適のレイトアッセイ法を採用することがで
きないなどの欠点を有している。

【０００５】最近、酵素反応進行中に直接吸光度変化を
計測して酵素活性を測定する前記レイトアッセイ法が適
用可能な基質として、２−クロロ−４−ニトロフェニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ．，３４，２１４０（１９８８）］やソジオ−
３，３′−ジクロロフェノールスルホンフタレイニル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（特開昭６３−
３０９１９９号）が提案されている。

【０００６】しかしながら、これらはいずれもＮＡＧａ
ｓｅの至適ｐＨである４．５〜５．０においては十分な
感度を示すことができず、また２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドはＮ
ＡＧａｓｅ活性測定に必要十分な量を溶解させることが
困難であるなどの欠点を有している。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬及びそれを用いる
測定方法が有する欠点を克服し、ＮＡＧａｓｅ活性を効
率よく、かつ正確に測定し得る溶解性の優れた試薬とし
て好適な新規化合物を提供するとともに、これを試薬と
した新規なＮＡＧａｓｅ活性の測定方法を提供すること
を目的としてなされたものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ＮＡＧａｓｅ
活性測定用試薬として、特定の新規なＮ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミン誘導体が極めて好適であり、これを
用いてＮＡＧａｓｅ活性を測定することにより、その目
的を達成し得ることを見出し、この知見に基づいて本発
明を完成するに至った。

【０００９】すなわち、本発明は、一般式

【化２】 （式中のＺはＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残
基、Ｒ¹〜Ｒ³はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン
原子、又はニトロ基を意味する）で表わされるＮ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、該一般式（Ｉ）の
化合物を有効成分とするＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬、
及びＮＡＧａｓｅ含有試料に、該一般式（Ｉ）の化合物
を加え、酵素反応によって生成するフルオレセイン・モ
ノエーテルを定量することを特徴とするＮＡＧａｓｅ活
性の測定方法を提供するものである。

【００１０】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明の前記一般式（Ｉ）で表わされるＮ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミン誘導体において、ＺはＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミン残基であり、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³
はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（塩素、
ヨウ素、フッ素若しくは臭素原子）、又はニトロ基であ
る。そして、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物とＮ
ＡＧａｓｅとの酵素反応によって生成するフルオレセイ
ン・モノエーテルの発色性の観点から、Ｒ¹とＲ²の少な
くとも一方がハロゲン原子であることが好ましい。

【００１１】このような前記一般式（Ｉ）で表わされる
化合物としては、例えば２′，７′−ジクロロフルオレ
セイン−ジ−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド）、４′，５′−ジヨードフルオレセイン−ジ−（Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）、４′，５′−
ジブロモ−２′，７′−ジニトロフルオレセイン−ジ−
（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）、フルオレ
セイン−ジ−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド）、２′，４′，５′，７′−テトラヨードフルオレ
セイン−ジ−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド）、２′，４′，５′，７′−テトラブロモフルオレ
セイン−ジ−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド）、２′，４′，５′，７′−テトラヨード−４，
５，６，７−テトラクロロフルオレセイン−ジ−（Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）、４，５，６，７
−テトラクロロフルオレセイン−ジ−（Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミニド）などが挙げられる。

【００１２】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされるＮ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体は文献未載の
新規な化合物であって、その製造方法については特に制
限はなく、任意の方法を用いることができるが、例えば
次の方法によって製造することができる。

【００１３】すなわち、一般式

【化３】 （式中のＸはアシル基、Ｙはハロゲン原子を意味する）
で表わされるハロゲノ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ン誘導体に、一般式

【化４】 （式中のＲ¹〜Ｒ³は前記と同じ意味をもつ）で表わされ
るフルオレセイン類を作用させた後、Ｏ−アシル基を脱
離させることにより製造することができる。

【００１４】前記一般式（ＩＩ）で表わされるハロゲノ
−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン誘導体において、Ｘ
のアシル基としては炭素数２〜７のものが好ましく、中
でもアセチル基が特に好ましい。また、Ｙはハロゲン原
子（塩素、ヨウ素、フッ素又は臭素原子）であるが、塩
素又は臭素原子が好ましい。

【００１５】前記一般式（ＩＩ）で表わされる化合物
は、例えば市販のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンにア
シルハライド、例えばアセチルクロリド、アセチルブロ
マイドなどを作用させて製造することができる［Ｍｅｔ
ｈ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．，６，２８２
（１９７２）］。このような前記一般式（ＩＩ）で表わ
される化合物としては、例えば 1−クロロ−１−デオキ
シ−２，３，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコ
サミン、１−ブロモ−１−デオキシ−２，３，４，６−
テトラアセチル−α−Ｄ−グルコサミンなどが挙げられ
る。

【００１６】また、前記一般式（ＩＩＩ）で表わされる
フルオレセイン類は市販品を用いてもよく、あるいは適
宜の方法で製造して得たものを用いてもよい。このよう
な前記一般式（ＩＩＩ）で表わされる化合物としては、
例えばフルオレセイン、２′，７′−ジクロロフルオレ
セイン、４′，５′−ジブロモフルオレセイン、４′，
５′−ジヨードフルオレセイン、４，５，６，７−テト
ラクロロフルオレセイン、２′，４′，５′，７′−テ
トラヨードフルオレセイン、４′，５′−ジブロモ−
２′，７′−ジニトロフルオレセイン、２′，４′，
５′，７′−テトラブロモ−４，５，６，７−テトラク
ロロフルオレセインなど、さらにはこれらのナトリウム
塩、カリウム塩などが挙げられる。

【００１７】次に、前記一般式（Ｉ）で表わされるＮ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体の製造法につき
例示する。先ず、前記一般式（ＩＩ）で表わされるハロ
ゲノ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン誘導体に、溶媒
及び触媒の存在下で、前記一般式（ＩＩＩ）で表わされ
るフルオレセイン類を作用させるのであるが、このとき
の該一般式（ＩＩＩ）で表わされる化合物に対する該一
般式（ＩＩ）で表わされる化合物の添加量は、通常２〜
１００倍モル当量、好ましくは５〜２０倍モル当量であ
る。

【００１８】溶媒としては、ケトン類、例えばアセト
ン、メチルエチルケトンなど、ニトリル類、例えばアセ
トニトリルなど、ハロゲン化炭化水素類、例えばジクロ
ロメタン、クロロホルム、ジクロロエタンなど、ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（Ｄ
ＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメ
チルホスホラミド（ＨＭＰＡ）などが挙げられ、中でも
アセトニトリルが特に好ましい。また、これらは単独又
は組み合わせて用いられる。その量は、通常、前記一般
式（ＩＩＩ）で表わされる化合物の重量の５〜１０００
倍量、好ましくは５０〜５００倍量である。

【００１９】触媒としては、銀塩、例えば Ａｇ₂Ｏ、Ａ
ｇＣｌＯ₄、ＡｇＮＯ₃、Ａｇ₂ＣＯ₃など、カリウム塩、
例えばＫＯＨ，Ｋ₂ＣＯ₃など、水銀塩、例えばＨｇＯ、
Ｈｇ（ＣＮ）₂など、カドミウム塩、例えばＣｄＣＯ₃、
三級アミン類、例えばトリエチルアミン、トリブチルア
ミンなどが挙げられ、中でもＡｇ₂Ｏやトリエチル アミ
ンが好ましい。また、これらは単独又は組み合わせて用
いられる。その量は、通常、前記一般式（ＩＩ）で表わ
される化合物の１〜１００倍モル当量、好ましくは １
〜１０倍モル当量である。

【００２０】反応温度及び反応時間は前記一般式（Ｉ
Ｉ）で表わされる化合物、前記一般式（ＩＩＩ）で表わ
される化合物、溶媒及び触媒の種類によって異なるが、
通常は２０〜６０℃で１〜６０時間連続して反応させ
る。

【００２１】こうして得られたものに塩基を作用させて
Ｏ−アシル基を脱離させることにより、前記一般式
（Ｉ）で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ン誘導体が得られる。塩基としては、例えばＫＯＨ、Ｋ
₂ＣＯ₃、ＮａＯＨ、Ｎａ₂ＣＯ₃などのアルカリ金属塩、
例えばナトリウムメチラート、ナトリウムフェノラート
などのアルカリ金属のアルコラート、アンモニアなどが
挙げられ、ナトリウムメチラートが特に好ましい。

【００２２】次いで、このようにして得られたものを常
法により精製して前記一般式（Ｉ）で表わされる目的化
合物を得ることができる。精製法としては、例えば適宜
の有機溶媒などを用いる析出法、シリカゲル、ＯＤＳ
（オクタデシルシリルシリカゲル）などを用いるカラム
クロマトグラフィなどが挙げられる。

【００２３】以上のようにして得られた前記一般式
（Ｉ）で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ン誘導体は、ＮＡＧａｓｅ活性の測定に極めて有用であ
り、この化合物を用いてＮＡＧａｓｅ活性をレイトアッ
セイ法により高感度、高精度で測定することができる。

【００２４】ＮＡＧａｓｅを測定するための有利な系と
しては、例えば前記一般式（Ｉ）で表わされるＮ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体を１〜２０ｍＭ及び
緩衝剤を２〜２００ｍＭ含有する系（ｐＨ４．０〜６．
０）などが挙げられる。この系に用いられる緩衝剤とし
ては、例えばリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸
塩、フタル酸塩などが挙げられる。また必要に応じて溶
解補助剤、安定化剤として、例えばグリセリン、トリト
ンＸ−１００などの界面活性剤、クラウンエーテル類、
シクロデキストリン類、グライコール類などを加えても
よい。

【００２５】本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した
形で用いてもよく、薄膜状の担体、例えばシート、含浸
性の紙などに含浸させて用いてもよい。このような本発
明の試薬を用いることにより、各種の試料に含有される
ＮＡＧａｓｅの活性を簡単な操作で正確に、かつ高感度
で測定することができる。

【００２６】次に、本発明のＮＡＧａｓｅ活性の測定法
の好適な１例について説明する。先ず、ＮＡＧａｓｅを
含む試料に、前記一般式（Ｉ）で表わされるＮ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体を１〜２０ｍＭ、好ま
しくは２〜５ｍＭ及び緩衝剤を添加した後、２０〜６０
℃、ｐＨ４．０〜６．０の条件にて１分以上、好ましく
は３〜１０分間酵素反応させ、生成するフルオレセイン
・モノエーテルの吸光度を直接分光光度計を用いて測定
し、単位時間当りの吸光度の変化量を求める。そして予
め同様にして測定したＮＡＧａｓｅ標品の吸光度変化量
と対比させて試料中のＮＡＧａｓｅ活性を算出する。

【００２７】本発明に用いられるＮＡＧａｓｅ含有試料
については、ＮＡＧａｓｅを含有するものであればよ
く、特に制限はないが、具体的には微生物の培養液、植
物の抽出液、あるいは動物の体液や尿や組織及びそれら
の抽出液などを用いることができる。また緩衝剤として
は、例えばリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸
塩、フタル酸塩などが挙げられる。その他、必要に応じ
て還元物質の影響を少なくするために、前処理や酸化剤
の添加を行なってもよい。

【００２８】

【発明の効果】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体は、新規な
化合物であって、ＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬として極
めて有用であり、このものを用いることにより、試料中
に含まれるグルコース、ビリルビン、ヘモグロビンなど
の影響を受けることなく、ＮＡＧａｓｅ活性を自動分析
法などにより精度よく、容易に測定することができる。

【００２９】

【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に
説明する。 実施例１ ２′，７′−ジクロロフルオレセイン−ジ−（Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミニド）（Ｒ¹＝Ｃｌ、Ｒ²＝Ｒ
³＝Ｈ）の製造 １−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラア
セチル−α−Ｄ−グルコサミン２０．０ｇ（５４．９ｍ
ｍｏｌ）をアセトニトリル２００ｍｌに溶解し、これに
２′，７′−ジクロロフルオレセイン２．２ｇ（５．４
９ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン７６ｍｌ（５４９ｍ
ｍｏｌ）を加え、６０℃で１６時間攪拌しながら反応さ
せた。次いで、溶媒を留去したのち、シリカゲルクロマ
トグラフィにより精製し、クロロホルム−メタノール混
液（容量比４：１）で溶出した区分より、２′，７′−
ジクロロフルオレセイン−ジ−（２，３，４，６−テト
ラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）３．３１ｇ
（３．１３ｍｍｏｌ、収率５６．９％）を得た。

【００３０】融点： ２０６−２０７℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（ＥｔＯＨ）：吸収極大
波長［λmax］＝２８１，２２６ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） ７．９０−８．０５（３Ｈ，ｍ），７．７０−７．８５
（２Ｈ，ｍ），７．３０−７．４０（１Ｈ，ｍ），７．
２８（２Ｈ，ｓ），６．８５（２Ｈ，ｓ），５．４８
（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｔ，
Ｊ＝９．５Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５Ｈ
ｚ），４．９８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），４．０
０−４．３０（８Ｈ，ｍ），２．１２（６Ｈ，ｓ），
２．０３（６Ｈ，ｓ），１．９６（６Ｈ，ｓ），１．７
７（３Ｈ，ｓ），１．７５（３Ｈ，ｓ）

【００３１】このようにして得た２′，７′−ジクロロ
フルオレセイン−ジ−（２，３，４，６−テトラアセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド）１．５ｇ（１．４２ｍｍ
ｏｌ）をメタノール（９０ｍｌ）−クロロホルム（５０
ｍｌ）混液に溶解し、これに２８％ナトリウムメチラー
ト−メタノール溶液 ０．３２ｍｌ（１．６６ｍｍｏ
ｌ）を加え、氷冷下、３時間攪拌しながら反応させた。
次いで、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて反応液を
中和し、溶媒を減圧留去したのち、ＯＤＳ（ＹＭＣ・Ｇ
ＥＬ ＯＤＳ−ＡＱ １２０−Ｓ５０）カラムクロマト
グラフィにより精製し、アセトニトリル−水混液（容量
比４：６）で溶出した区分を凍結乾燥すると、２′，
７′−ジクロロフルオレセイン−ジ−（Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミニド）０．７７ｇ（０．９５ｍｍｏ
ｌ、収率：６７．３％）を得た。

【００３２】融点：１６３−１６４℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（Ｈ₂Ｏ）：吸収極大波
長［λmax］＝２８１，２２７ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） ８．００−８．０５（１Ｈ，ｍ），７．７０−７．８５
（４Ｈ，ｍ），７．２５−７．４０（３Ｈ，ｍ），６．
７８（２Ｈ，ｓ），５．２０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈ
ｚ），４．６０−５．１０（６Ｈ，ｍ），３．１５−
３．８５（１２Ｈ，ｍ），１．７９（３Ｈ，ｓ），１．
７７（３Ｈ，ｓ）

【００３３】実施例２ ４′，５′−ジヨードフルオレセイン−ジ−（Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミニド）（Ｒ¹＝Ｈ、Ｒ²＝Ｉ、
Ｒ³＝Ｈ）の製造 １−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラア
セチル−α−Ｄ−グルコサミン１０．０ｇ（２７．３ｍ
ｍｏｌ）をアセトニトリル２００ｍｌに溶解し、これに
４′，５′−ジヨードフルオレセイン１．６ｇ（２．７
４ｍｍｏｌ）及び酸化銀（Ａｇ₂Ｏ）６．４ｇ（２７．
６ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で１６時間攪拌しながら反
応させた。次いで、未反応のＡｇ₂Ｏを濾別し、濾液の
アセトニトリルを留去したのち、シリカゲルクロマトグ
ラフィにより精製し、クロロホルム−メタノール混液
（容量比４：１）で溶出した区分より、４′，５′−ジ
ヨードフルオレセイン−ジ−（２，３，４，６−テトラ
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）１．０６ｇ（０．
８５ｍｍｏｌ、収率３１．２％）を得た。

【００３４】融点： １９３−１９５℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（ＥｔＯＨ）：吸収極大
波長［λmax］＝２８３，２２８ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） ７．９５−８．１０（３Ｈ，ｍ），７．６５−７．８０
（２Ｈ，ｍ），７．２５−７．３５（１Ｈ，ｍ），６．
６０−６．９５（４Ｈ，ｍ），５．６０−５．００（６
Ｈ，ｍ），３．９５−４．３５（８Ｈ，ｍ），２．１６
（６Ｈ，ｓ），２．０７（６Ｈ，ｓ），２．００（６
Ｈ，ｓ），１．８１（３Ｈ，ｓ），１．７９（３Ｈ，
ｓ）

【００３５】このようにして得た４′，５′−ジヨード
フルオレセイン−ジ−（２，３，４，６−テトラアセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド）０．８ｇ（０．６４ｍｍ
ｏｌ）をメタノール（５０ｍｌ）−クロロホルム（２５
ｍｌ）混液に溶解し、これに２８％ナトリウムメチラー
ト−メタノール溶液 ０．１５ｍｌ（０．７８ｍｍｏ
ｌ）を加え、氷冷下、２時間攪拌しながら反応させた。
次いで、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて反応液を
中和し、溶媒を減圧留去したのち、ＯＤＳ（ＹＭＣ・Ｇ
ＥＬ ＯＤＳ−ＡＱ １２０−Ｓ５０）カラムクロマト
グラフィにより精製し、アセトニトリル−水混液（容量
比４：６）で溶出した区分を凍結乾燥すると、４′，
５′−ジヨードフルオレセイン−ジ−（Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミニド）０．４２ｇ（０．４２ｍｍｏ
ｌ、収率：６５．９％）を得た。

【００３６】融点：１５０−１５３℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（Ｈ₂Ｏ）：吸収極大波
長［λmax］＝２８３，２２９ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） ８．００−８．１０（１Ｈ，ｍ），７．６５−７．８５
（４Ｈ，ｍ），７．３０−７．４０（１Ｈ，ｍ），６．
６０−６．９５（４Ｈ，ｍ），５．２４（２Ｈ，ｄ，Ｊ
＝８．５Ｈｚ），４．６０−５．１０（６Ｈ，ｍ），
３．１５−３．８５（１２Ｈ，ｍ），１．８３（３Ｈ，
ｓ），１．８１（３Ｈ，ｓ）

【００３７】実施例３ ＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬 （１）試薬の組成 含有物 濃度 基質試薬：２′，７′−ジクロロフルオレセイン−ジ− （Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド） ２．０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０） ５０．０ｍＭ 精製水

【００３８】（２）測定法 基質試薬１ｍｌを３７℃で５分間加温したのち、試料液
５０μｌを加え、３７℃で５分間加温後からの５分間の
４９０ｎｍにおける吸光度の変化量を測定する。この吸
光度変化量と予め作成した検量線から算出して、試料液
中のＮＡＧａｓｅ活性の測定を行なうことができる。な
お、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲を超えた
場合は、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を用
いて相当する倍数の希釈を行なったのち、再測定を行な
う。

【００３９】実施例４ ＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬 （１）試薬の組成 含有物 濃度 基質試薬：４′，５′−ジヨードフルオレセイン− ジ−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ ミニド） ２．０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０） ５０．０ｍＭ 精製水 （２）測定法 基質試薬１ｍｌを３７℃で５分間加温したのち、試料液
５０μｌを加え、３７℃で５分間加温後からの５分間の
５０５ｎｍにおける吸光度の変化量を測定する。この吸
光度変化量と予め作成した検量線から算出して、試料液
中のＮＡＧａｓｅ活性の測定を行なうことができる。な
お、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲を超えた
場合は、５０ｍＭクエン酸緩衝液（測定を行なう。

【００４０】実施例５ ＮＡＧａｓｅ活性の測定方法 （１）基質液の調製 実施例１で得た２′，７′−ジクロロフルオレセイン−
ジ−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）８０．
７ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を取り、５０ｍＭクエン酸緩
衝液（ｐＨ＝５．０）を加えて全量を５０ｍｌとして基
質液とする。 （２）標品ＮＡＧａｓｅ液の調製 市販品の酵素活性既知のＮＡＧａｓｅを５０ｍＭクエン
酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を用いて数種類の濃度に希釈
して標品ＮＡＧａｓｅ液とする。

【００４１】（３）検量線の作成 基質液１ｍｌに、各濃度の標品ＮＡＧａｓｅ液５０μｌ
を加え、３７℃で５分間加温後からの５分間の４９０ｎ
ｍにおける吸光度の変化量の関係により検量線を作成す
る。シグマ社製ＮＡＧａｓｅ（２５ｕ／０．５ｍｌ）を
使用した場合、検量線の式は Ｕ＝１．９５×（△Ａ）×１０³ （Ｕ：酵素活性ｕ／ｌ、△Ａ：吸光度変化量／分）とな
る。そのグラフを図１に示す。 （４）試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定 基質液１ｍｌに試料液５０μｌを加え、３７℃で５分間
加温後からの５分間の４９０ｎｍにおける吸光度の変化
量を測定する。この吸光度変化量と（３）で作成した検
量線から算出して試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定を
行なうことができる。なお、試料液の酵素活性の値が検
量線の測定範囲（０−２５０ｕ／ｌ）を超えた場合は、
５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を用いて相当
する倍数の希釈を行なったのち、再測定を行なう。

【００４２】実施例６ ＮＡＧａｓｅ活性の測定方法 （１）基質液の調製 実施例２で得た ４′，５′−ジヨードフルオレセイン
−ジ−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）９
９．０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を取り、５０ｍＭクエン
酸緩衝液（ｐＨ＝ ５．０）を加えて全量を５０ｍｌと
して基質液とする。 （２）標品ＮＡＧａｓｅ液の調製 実施例５に記載したと同様にして調製する。 （３）検量線の作成 基質液１ｍｌに、各濃度の標品ＮＡＧａｓｅ液５０μｌ
を加え、３７℃で５分間加温後からの５分間の５０５ｎ
ｍにおける吸光度の変化量の関係により検量線を作成す
る。シグマ社製ＮＡＧａｓｅ（２５ｕ／０．５ｍｌ）を
使用した場合、検量線の式は Ｕ＝３．２１×（△Ａ）×１０³ （Ｕ：酵素活性ｕ／ｌ、△Ａ：吸光度変化量／分）とな
る。そのグラフを図２に示す。

【００４３】（４）試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定 基質液１ｍｌに試料液５０μｌを加え、３７℃で５分間
加温後からの５分間の５０５ｎｍにおける吸光度の変化
量を測定する。この吸光度変化量と（３）で作成した検
量線から算出して試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定を
行なうことができる。なお、試料液の酵素活性の値が検
量線の測定範囲（０−２５０ｕ／ｌ）を超えた場合は、
５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を用いて相当
する倍数の希釈を行なったのち、再測定を行なう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例５におけるＮＡＧａｓｅ活性の測定に
用いる検量線のグラフ

【図２】 実施例６におけるＮＡＧａｓｅ活性の測定に
用いる検量線のグラフ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山次 信幸 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (54)【発明の名称】 Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、これを有効成分とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グ ルコサミニダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ 活性の測定方法

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中のＺはＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残
   基、Ｒ¹〜Ｒ³はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン
   原子、又はニトロ基を意味する）で表わされるＮ−アセ
   チル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体。
2. 【請求項２】請求項１記載のＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
   ルコサミン誘導体を有効成分とするＮ−アセチル−β−
   Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬。
3. 【請求項３】Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダー
   ゼ含有試料に、請求項１記載のＮ−アセチル−β−Ｄ−
   グルコサミン誘導体を加え、酵素反応によって生成する
   フルオレセイン・モノエーテルを定量することを特徴と
   するＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサニダーゼ活性の測
   定方法。