JPH05123183A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH05123183A JPH05123183A JP3311442A JP31144291A JPH05123183A JP H05123183 A JPH05123183 A JP H05123183A JP 3311442 A JP3311442 A JP 3311442A JP 31144291 A JP31144291 A JP 31144291A JP H05123183 A JPH05123183 A JP H05123183A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 リポプロテイン結合性凝固系インヒビター
（ＬＡＣＩ）の特定部位を認識するモノクローナル抗体
の提供。 【構成】 下記アミノ酸配列 で表わされるポリペプチドを認識するモノクローナル抗
体、及びそれを用いたＬＡＣＩの精製法。
（ＬＡＣＩ）の特定部位を認識するモノクローナル抗体
の提供。 【構成】 下記アミノ酸配列 で表わされるポリペプチドを認識するモノクローナル抗
体、及びそれを用いたＬＡＣＩの精製法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血液凝固インヒビター
の特定部位に結合するモノクローナル抗体に関するもの
である。さらに詳しくは、組織因子インヒビター（Tiss
ue Factor Inhibitor ：ＴＦＩ）、リポプロテイン結合
性凝固系インヒビター（LipoproteinAssociated Coagul
ation Inhibitor：ＬＡＣＩ）あるいは組織因子経路イ
ンヒビター（Tissue Factor Pathway Inhibitor ：ＴＦ
ＰＩ）の特定部位に結合するモノクローナル抗体に関す
るものである。
の特定部位に結合するモノクローナル抗体に関するもの
である。さらに詳しくは、組織因子インヒビター（Tiss
ue Factor Inhibitor ：ＴＦＩ）、リポプロテイン結合
性凝固系インヒビター（LipoproteinAssociated Coagul
ation Inhibitor：ＬＡＣＩ）あるいは組織因子経路イ
ンヒビター（Tissue Factor Pathway Inhibitor ：ＴＦ
ＰＩ）の特定部位に結合するモノクローナル抗体に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】外因系血液凝固は、血液が組織トロンボ
プラスチン（以下、組織因子あるいはＴＦと呼ぶ）に接
触することによって開始される。組織因子（ＴＦ）は、
膜タンパク質であって、特に脳及び肺に多量に存在す
る。ＴＦと接触するとVII 因子またはその活性型VII ａ
因子がＴＦと複合体を形成し、ついで蛋白分解的にＸ因
子がＸａ因子に活性化される。
プラスチン（以下、組織因子あるいはＴＦと呼ぶ）に接
触することによって開始される。組織因子（ＴＦ）は、
膜タンパク質であって、特に脳及び肺に多量に存在す
る。ＴＦと接触するとVII 因子またはその活性型VII ａ
因子がＴＦと複合体を形成し、ついで蛋白分解的にＸ因
子がＸａ因子に活性化される。
【０００３】ＴＦによって開始する外因系血液凝固の調
節に関するこれまでの研究で、ＴＦを血清とともにイン
キュベーションするとそのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性が
抑制されることが明らかにされている。この因子の少く
とも１つは組織因子インヒビター（ＴＦＩ）あるいはリ
ポプロテイン結合性凝固系インヒビター（ＬＡＣＩ）と
定義されるものである。
節に関するこれまでの研究で、ＴＦを血清とともにイン
キュベーションするとそのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性が
抑制されることが明らかにされている。この因子の少く
とも１つは組織因子インヒビター（ＴＦＩ）あるいはリ
ポプロテイン結合性凝固系インヒビター（ＬＡＣＩ）と
定義されるものである。
【０００４】Broze らによれば、Hep Ｇ２細胞（ヒト
ヘパトーマ セルライン）が、血清（血漿）中に存在す
るＴＦＩと同様の特性を有する抑制成分を分泌すること
が示されている（Broze et al; Blood, 69, 150-155 (1
987)）。またＬＡＣＩについてはNature, vol.338, 518
-520 (1989) にアミノ酸配列及び２次構造が記載されて
いる。
ヘパトーマ セルライン）が、血清（血漿）中に存在す
るＴＦＩと同様の特性を有する抑制成分を分泌すること
が示されている（Broze et al; Blood, 69, 150-155 (1
987)）。またＬＡＣＩについてはNature, vol.338, 518
-520 (1989) にアミノ酸配列及び２次構造が記載されて
いる。
【０００５】このリポプロテイン結合性凝固系インヒビ
ター（以下ＬＡＣＩと称す）の生体内における機能、及
び生理的な活性については、最近の研究から、血栓症や
動脈硬化との関連で重要性が示唆されている。
ター（以下ＬＡＣＩと称す）の生体内における機能、及
び生理的な活性については、最近の研究から、血栓症や
動脈硬化との関連で重要性が示唆されている。
【０００６】従って、ＬＡＣＩの作用機構を明らかに
し、また蛋白の構造・活性の相関を解明することができ
れば、基礎医学、臨床医学の領域において非常に重要な
意味を持つと考えられる。
し、また蛋白の構造・活性の相関を解明することができ
れば、基礎医学、臨床医学の領域において非常に重要な
意味を持つと考えられる。
【０００７】一方モノクローナル抗体は単一の抗原決定
基に対して特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗
体を安定的に産生できるという利点から抗原蛋白質の機
能及び構造の解析あるいは免疫測定（ＥＩＡ，ＲＩＡ）
に近年、一般的に広く利用されるようになってきた。特
に生理活性を有する蛋白質の機能解析、分子解析には当
該蛋白の機能に関与する部位、または特殊な構造部位を
認識する抗体を見出すことが有力な手段となり得る。
基に対して特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗
体を安定的に産生できるという利点から抗原蛋白質の機
能及び構造の解析あるいは免疫測定（ＥＩＡ，ＲＩＡ）
に近年、一般的に広く利用されるようになってきた。特
に生理活性を有する蛋白質の機能解析、分子解析には当
該蛋白の機能に関与する部位、または特殊な構造部位を
認識する抗体を見出すことが有力な手段となり得る。
【０００８】そこで本発明者らは、ＬＡＣＩの３個のク
ーニッツ（Kunitz）ドメインと呼ばれる構造部位に着目
し、各クーニッツドメインに対応する部分合成ペプチド
を抗原として研究を進めた結果、本発明のモノクローナ
ル抗体を見出した。
ーニッツ（Kunitz）ドメインと呼ばれる構造部位に着目
し、各クーニッツドメインに対応する部分合成ペプチド
を抗原として研究を進めた結果、本発明のモノクローナ
ル抗体を見出した。
【０００９】
【発明の構成】すなわち本発明は、ＬＡＣＩのＮ端から
３番目のクーニッツ部位（以下、Ｋ３部位と称す）のア
ミノ酸配列： Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly Leu CysArg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val …［Ｉ］ のポリペプチドを認識し、結合するモノクローナル抗体
であり、血液凝固系のインヒビターであるＬＡＣＩを、
高い凝固活性を維持したまま精製することを可能とする
モノクローナル抗体である。
３番目のクーニッツ部位（以下、Ｋ３部位と称す）のア
ミノ酸配列： Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly Leu CysArg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val …［Ｉ］ のポリペプチドを認識し、結合するモノクローナル抗体
であり、血液凝固系のインヒビターであるＬＡＣＩを、
高い凝固活性を維持したまま精製することを可能とする
モノクローナル抗体である。
【００１０】ここで、本明細書において、アミノ酸配列
はＩＵＰＡＣ―ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用さ
れた方法により略記するものとし、たとえば下記の略号
を用いる。 Ala Ｌ―アラニン Arg Ｌ―アルギニン Asn Ｌ―アスパラギン Asp Ｌ―アスパラギン酸 Cys Ｌ―システイン Gln Ｌ―グルタミン Glu Ｌ―グルタミン酸 Gly グリシン His Ｌ―ヒスチジン Ile Ｌ―イソロイシン Leu Ｌ―ロイシン Lys Ｌ―リジン Met Ｌ―メチオニン Phe Ｌ―フェニルアラニン Pro Ｌ―プロリン Ser Ｌ―セリン Thr Ｌ―スレオニン Trp Ｌ―トリプトファン Tyr Ｌ―チロシン Val Ｌ―バリン
はＩＵＰＡＣ―ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用さ
れた方法により略記するものとし、たとえば下記の略号
を用いる。 Ala Ｌ―アラニン Arg Ｌ―アルギニン Asn Ｌ―アスパラギン Asp Ｌ―アスパラギン酸 Cys Ｌ―システイン Gln Ｌ―グルタミン Glu Ｌ―グルタミン酸 Gly グリシン His Ｌ―ヒスチジン Ile Ｌ―イソロイシン Leu Ｌ―ロイシン Lys Ｌ―リジン Met Ｌ―メチオニン Phe Ｌ―フェニルアラニン Pro Ｌ―プロリン Ser Ｌ―セリン Thr Ｌ―スレオニン Trp Ｌ―トリプトファン Tyr Ｌ―チロシン Val Ｌ―バリン
【００１１】本発明のモノクローナル抗体を用いて精製
されたＬＡＣＩは後述の実施例で示される如く、高いＸ
ａ因子阻害活性とＴＦ阻害活性を有する。
されたＬＡＣＩは後述の実施例で示される如く、高いＸ
ａ因子阻害活性とＴＦ阻害活性を有する。
【００１２】しかして本発明はまた、ヒトＬＡＣＩに対
する上記モノクローナル抗体を不溶性担体と結合させた
吸着体に、ヒトＬＡＣＩ含有混合物を接触せしめて、該
吸着体にヒトＬＡＣＩを結合せしめることを特徴とする
ヒトＬＡＣＩ含有混合物からの高い凝固活性を有するヒ
トＬＡＣＩの分離方法及び精製方法である。
する上記モノクローナル抗体を不溶性担体と結合させた
吸着体に、ヒトＬＡＣＩ含有混合物を接触せしめて、該
吸着体にヒトＬＡＣＩを結合せしめることを特徴とする
ヒトＬＡＣＩ含有混合物からの高い凝固活性を有するヒ
トＬＡＣＩの分離方法及び精製方法である。
【００１３】本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞はケーラーとミルシュタインの方法
［Kohler & Milstein; Nature: 256, 495-497 (1975)］
によって得られる。
イブリドーマ細胞はケーラーとミルシュタインの方法
［Kohler & Milstein; Nature: 256, 495-497 (1975)］
によって得られる。
【００１４】すなわち、前記アミノ酸配列［Ｉ］で表わ
される、ＬＡＣＩの部分合成ペプチドでマウスを免疫し
た後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と
融合させ、得られたハイブリドーマ細胞はマイクロタイ
タープレートに固定された前記ペプチドと反応する抗体
に対し、系統的に検査し、選択される。
される、ＬＡＣＩの部分合成ペプチドでマウスを免疫し
た後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と
融合させ、得られたハイブリドーマ細胞はマイクロタイ
タープレートに固定された前記ペプチドと反応する抗体
に対し、系統的に検査し、選択される。
【００１５】本発明のモノクローナル抗体はかかる新規
なハイブリドーマ細胞が産生する産生物から得られ、ヒ
トＬＡＣＩのＫ３部位に対し、特異的に作用する。
なハイブリドーマ細胞が産生する産生物から得られ、ヒ
トＬＡＣＩのＫ３部位に対し、特異的に作用する。
【００１６】本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＬＡ
ＣＩのＫ３部位に対し高度に特異的に結合する性質を有
するため、ヒトＬＡＣＩを高い凝固活性を維持したまま
分離・精製する場合、非常に有利である。すなわち、不
溶性担体に本発明におけるモノクローナル抗体の１種類
を固定化し、血液または、他のヒトＬＡＣＩ含有混合
物、あるいはそれらの粗抽出物、粗精製物及び溶液から
ヒトＬＡＣＩを吸着、分離し、適当な緩衝液（例えば２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ，０．５ＭＮａＣｌ，ｐＨ
７．４）で洗浄後、溶液をカオトロピックイオンを含む
溶液等（例えば３Ｍ ＮａＳＣＮ，ｐＨ７．０）に置き
換えて高活性のヒトＬＡＣＩを溶出することができる。
ＣＩのＫ３部位に対し高度に特異的に結合する性質を有
するため、ヒトＬＡＣＩを高い凝固活性を維持したまま
分離・精製する場合、非常に有利である。すなわち、不
溶性担体に本発明におけるモノクローナル抗体の１種類
を固定化し、血液または、他のヒトＬＡＣＩ含有混合
物、あるいはそれらの粗抽出物、粗精製物及び溶液から
ヒトＬＡＣＩを吸着、分離し、適当な緩衝液（例えば２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ，０．５ＭＮａＣｌ，ｐＨ
７．４）で洗浄後、溶液をカオトロピックイオンを含む
溶液等（例えば３Ｍ ＮａＳＣＮ，ｐＨ７．０）に置き
換えて高活性のヒトＬＡＣＩを溶出することができる。
【００１７】次に本発明におけるモノクローナル抗体を
製造する具体的方法について詳細に説明する。
製造する具体的方法について詳細に説明する。
【００１８】Ａ．抗原 本発明において用いられる抗原としては、下記式［Ｉ］ Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly Leu CysArg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val …［Ｉ］ で表わされるアミノ酸配列を有する合成ペプチド、特
に、該ペプチドをＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin
）などのキャリアー蛋白に結合したものが好ましい。
に、該ペプチドをＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin
）などのキャリアー蛋白に結合したものが好ましい。
【００１９】Ｂ．上記抗原によるマウスの免疫 雌Balb／ｃマウスを用いることができるが、他の系（st
rain）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画、
及び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けた、リンパ
球が形成されるように選ばれるべきである。例えばマウ
スに５０μｇの抗原を２週間間隔で腹腔に３回免疫後、
さらに３０μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日後に
融合のために脾臓細胞をとり出す。
rain）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画、
及び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けた、リンパ
球が形成されるように選ばれるべきである。例えばマウ
スに５０μｇの抗原を２週間間隔で腹腔に３回免疫後、
さらに３０μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日後に
融合のために脾臓細胞をとり出す。
【００２０】Ｃ．細胞融合 上記の如く免疫したマウスの脾臓を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対、骨髄腫
細胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０8 個の脾臓細胞について０．５〜１．５mlの
融合媒体の使用が適当である。
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対、骨髄腫
細胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０8 個の脾臓細胞について０．５〜１．５mlの
融合媒体の使用が適当である。
【００２１】細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、良
く知られているが、本発明では、Ｐ３―Ｘ６３―Ａｇ８
―Ｕ１細胞（Ｐ３―Ｕ１）［Yelton, D.F et al, Curre
nt.Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1
978) 参照］が好ましい。
く知られているが、本発明では、Ｐ３―Ｘ６３―Ａｇ８
―Ｕ１細胞（Ｐ３―Ｕ１）［Yelton, D.F et al, Curre
nt.Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1
978) 参照］が好ましい。
【００２２】好ましい融合促進剤としては、例えば、平
均分子量１０００〜４０００ポリエチレングリコールを
有利に使用できるが、この分野で知られている他の融合
促進剤を使用することもできる。
均分子量１０００〜４０００ポリエチレングリコールを
有利に使用できるが、この分野で知られている他の融合
促進剤を使用することもできる。
【００２３】Ｄ．融合した細胞の選択 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の脾臓細胞，未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地
は、薬物抵抗性（例えば８―アザグアニン抵抗性）で未
融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えばＨ
ＡＴ培地）が使用される。この選択培地中では、未融合
の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫
瘍性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅す
る。これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の
腫瘍性と、親脾細胞の性質を合せ持つため、選択培地中
で生存できる。
合の脾臓細胞，未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地
は、薬物抵抗性（例えば８―アザグアニン抵抗性）で未
融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えばＨ
ＡＴ培地）が使用される。この選択培地中では、未融合
の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫
瘍性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅す
る。これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の
腫瘍性と、親脾細胞の性質を合せ持つため、選択培地中
で生存できる。
【００２４】Ｅ．各容器中の抗体の確認 かくして、ハイブリドーマ細胞が検出された後、その培
養上清を採取し、前期式［Ｉ］の合成ペプチドに対する
抗体について酵素免疫定量法（Enzyme LinkedImmuno-So
rbent Assay) によりスクリーニングする。
養上清を採取し、前期式［Ｉ］の合成ペプチドに対する
抗体について酵素免疫定量法（Enzyme LinkedImmuno-So
rbent Assay) によりスクリーニングする。
【００２５】Ｆ．目的の抗体を産生するハイブリドーマ
細胞のクローン化 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ば、ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養
することにより、その培養上清からそのハイブリドーマ
細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺
伝子、または半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射す
ることができる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹
水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。
細胞のクローン化 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ば、ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養
することにより、その培養上清からそのハイブリドーマ
細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺
伝子、または半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射す
ることができる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹
水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。
【００２６】Ｇ．ヒトＬＡＣＩ含有混合物からのヒトＬ
ＡＣＩの分離・精製 本発明のヒトＬＡＣＩに対するモノクローナル抗体を不
溶性担体に固定化または結合させて吸着体を得る。その
際使用される不溶性担体としては、モノクローナル抗体
を用いた測定試薬または測定用キットの基材として一般
的に使用されるものであればよい。例えば材質としてセ
ファローズ、ポリアクリルアミド、セルロース、デキス
トラン、またはマレイン酸ポリマーあるいはこれらの混
合物が好ましく用いられる。これら不活性担体の形態と
しては、粉末状、粒状、ペレット状、ビーズ状、繊維状
など種々の形態であることができる。また一般に血漿、
またはその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹
状のくぼみを有するプレート（ウエル）を用いることが
有利である。
ＡＣＩの分離・精製 本発明のヒトＬＡＣＩに対するモノクローナル抗体を不
溶性担体に固定化または結合させて吸着体を得る。その
際使用される不溶性担体としては、モノクローナル抗体
を用いた測定試薬または測定用キットの基材として一般
的に使用されるものであればよい。例えば材質としてセ
ファローズ、ポリアクリルアミド、セルロース、デキス
トラン、またはマレイン酸ポリマーあるいはこれらの混
合物が好ましく用いられる。これら不活性担体の形態と
しては、粉末状、粒状、ペレット状、ビーズ状、繊維状
など種々の形態であることができる。また一般に血漿、
またはその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹
状のくぼみを有するプレート（ウエル）を用いることが
有利である。
【００２７】前記吸着体を用い、これにヒトＬＡＣＩ含
有混合物を接触せしめると、該吸着体に固着したモノク
ローナル抗体とヒトＬＡＣＩとが結合して、結果的にヒ
トＬＡＣＩが該吸着体に結合する。かくすることにより
ヒトＬＡＣＩを分離または除去することが可能である。
有混合物を接触せしめると、該吸着体に固着したモノク
ローナル抗体とヒトＬＡＣＩとが結合して、結果的にヒ
トＬＡＣＩが該吸着体に結合する。かくすることにより
ヒトＬＡＣＩを分離または除去することが可能である。
【００２８】また前記の如くしてヒトＬＡＣＩを吸着体
に結合させ、出来れば残余の混合物を洗滌して除去し、
次いで吸着体に結合したヒトＬＡＣＩをカオトロピック
イオン（ＳＣＮ- ）等を含む適当な溶液と接触または洗
滌すると、ヒトＬＡＣＩは該吸着体から離脱し、これを
単離することによって、高い凝固活性を有するヒトＬＡ
ＣＩを単離することができる。
に結合させ、出来れば残余の混合物を洗滌して除去し、
次いで吸着体に結合したヒトＬＡＣＩをカオトロピック
イオン（ＳＣＮ- ）等を含む適当な溶液と接触または洗
滌すると、ヒトＬＡＣＩは該吸着体から離脱し、これを
単離することによって、高い凝固活性を有するヒトＬＡ
ＣＩを単離することができる。
【００２９】かくして前記本発明の分離法によれば、ヒ
トＬＡＣＩを含有する混合物からのヒトＬＡＣＩの除
去、該混合物からのヒトＬＡＣＩの分離及び精製、該混
合物中のヒトＬＡＣＩの含有量の測定などが極めて簡単
な操作で達成される。
トＬＡＣＩを含有する混合物からのヒトＬＡＣＩの除
去、該混合物からのヒトＬＡＣＩの分離及び精製、該混
合物中のヒトＬＡＣＩの含有量の測定などが極めて簡単
な操作で達成される。
【００３０】本発明者らは別に、ＬＡＣＩのＮ端から第
１番目のクーニッツを認識するモノクローナル抗体を作
成し、それを用いてＬＡＣＩの精製を試みたが、得られ
たＬＡＣＩは弱い活性を有するものであった。
１番目のクーニッツを認識するモノクローナル抗体を作
成し、それを用いてＬＡＣＩの精製を試みたが、得られ
たＬＡＣＩは弱い活性を有するものであった。
【００３１】以下、実施例により本発明を更に詳しく説
明する。
明する。
【００３２】
【実施例１】合成ペプチド―ヘモシアニン（ＫＬＨ）複合体の作製 ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin ）０．３mgと合成
ペプチド［アミノ酸配列；Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gl
y Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe TyrTyr Asn S
er Val ］１mgを０．５mlの蒸留純水に溶解した。この
溶液にＥＤＣＩ（１―ethyl ―３―（３―dimethylamin
opropyl) carbodiimide ―ＨＣｌ）３０mgを加え、遮光
して室温で１晩反応させた。反応液を蒸留水２リットル
に対して充分に透析した。かくして合成ペプチド結合Ｋ
ＬＨ溶液（約０．６mg／ml濃度）を得た。該溶液を抗原
として免疫に用いた。
ペプチド［アミノ酸配列；Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gl
y Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe TyrTyr Asn S
er Val ］１mgを０．５mlの蒸留純水に溶解した。この
溶液にＥＤＣＩ（１―ethyl ―３―（３―dimethylamin
opropyl) carbodiimide ―ＨＣｌ）３０mgを加え、遮光
して室温で１晩反応させた。反応液を蒸留水２リットル
に対して充分に透析した。かくして合成ペプチド結合Ｋ
ＬＨ溶液（約０．６mg／ml濃度）を得た。該溶液を抗原
として免疫に用いた。
【００３３】
【実施例２】マウスの免疫 実施例１で得られた合成ペプチド結合ＫＬＨ溶液（０．
６mg／ml）０．５mlと完全フロインド アジュバント
（Complete Freund's Adjuvant）０．５mlとを連結した
２本の注射筒を用いて混合し、この混合液を２匹のマウ
スの腹腔に０．５mlずつ投与した。
６mg／ml）０．５mlと完全フロインド アジュバント
（Complete Freund's Adjuvant）０．５mlとを連結した
２本の注射筒を用いて混合し、この混合液を２匹のマウ
スの腹腔に０．５mlずつ投与した。
【００３４】２週間後に、同様にマウスの腹腔に上記混
合液を０．５mlずつ投与した。続いて４週間後に合成ペ
プチド結合ＫＬＨ溶液（０．６mg／ml）０．５mlと不完
全フロインド アジュバント（Incomplete Freund's Ad
juvant）０．５mlとを混合し、この混合液を上記マウス
の腹腔に０．５mlずつ投与した。４週間後に合成ペプチ
ド結合ＫＬＨ溶液５０μｇ／１００μｌを上記２匹のマ
ウスに静脈内投与し、その３日後に脾臓を摘出し、以
下、実施例３に示すように細胞融合を行なった。
合液を０．５mlずつ投与した。続いて４週間後に合成ペ
プチド結合ＫＬＨ溶液（０．６mg／ml）０．５mlと不完
全フロインド アジュバント（Incomplete Freund's Ad
juvant）０．５mlとを混合し、この混合液を上記マウス
の腹腔に０．５mlずつ投与した。４週間後に合成ペプチ
ド結合ＫＬＨ溶液５０μｇ／１００μｌを上記２匹のマ
ウスに静脈内投与し、その３日後に脾臓を摘出し、以
下、実施例３に示すように細胞融合を行なった。
【００３５】
【実施例３】細胞融合及び目的とするモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞の選択と取得 摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（Ｐ３Ｕ１）とを約６：１の割合で混合し、５０％ポリ
エチレングリコール１５４０を融合促進剤として細胞融
合を行なった。融合後の細胞は１×１０6 cells ／mlの
細胞濃度となるように１０％牛血清を含むＲＰＭＩ １
６４０培地に懸濁し、９６ウエル マイクロプレートに
１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。
ハイブリドーマ細胞の選択と取得 摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（Ｐ３Ｕ１）とを約６：１の割合で混合し、５０％ポリ
エチレングリコール１５４０を融合促進剤として細胞融
合を行なった。融合後の細胞は１×１０6 cells ／mlの
細胞濃度となるように１０％牛血清を含むＲＰＭＩ １
６４０培地に懸濁し、９６ウエル マイクロプレートに
１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。
【００３６】ハイブリドーマ（融合細胞）は、ＣＯ2 イ
ンキュベーター（５％ＣＯ2 ，３７℃）中で培養し、ヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地
（ＨＡＴ培地）で培地交換を行ない、ＨＡＴ培地中で増
殖させて、脾臓細胞と骨髄腫細胞からなるハイブリドー
マのスクリーニングを行なった。
ンキュベーター（５％ＣＯ2 ，３７℃）中で培養し、ヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地
（ＨＡＴ培地）で培地交換を行ない、ＨＡＴ培地中で増
殖させて、脾臓細胞と骨髄腫細胞からなるハイブリドー
マのスクリーニングを行なった。
【００３７】ハイブリドーマの培養上清中の抗体は、前
記合成ペプチドを吸着させたマイクロタイタープレート
を用い、ＥＬＩＳＡ法により検出した。抗体産生陽性ウ
エルのうちハイブリドーマの増殖能、及び前記合成ペプ
チドに対する結合性の強い、８ウエルについて限界希釈
法によるクローニングを２回繰り返して行なった。ＥＬ
ＩＳＡ法により、抗体産生能が高く抗原結合性が強いモ
ノクローン４個を選別した。得られたクローンは、１０
％ＤＭＳＯを含む９０％牛血清溶液中に懸濁させ、液体
窒素中に保存した。各クローンの産生するモノクローナ
ル抗体は、クローンをBalb／ｃマウスの腹腔内で増殖さ
せ、その腹水からプロテインＡ―セファロース４Ｂカラ
ムを用いて精製した。
記合成ペプチドを吸着させたマイクロタイタープレート
を用い、ＥＬＩＳＡ法により検出した。抗体産生陽性ウ
エルのうちハイブリドーマの増殖能、及び前記合成ペプ
チドに対する結合性の強い、８ウエルについて限界希釈
法によるクローニングを２回繰り返して行なった。ＥＬ
ＩＳＡ法により、抗体産生能が高く抗原結合性が強いモ
ノクローン４個を選別した。得られたクローンは、１０
％ＤＭＳＯを含む９０％牛血清溶液中に懸濁させ、液体
窒素中に保存した。各クローンの産生するモノクローナ
ル抗体は、クローンをBalb／ｃマウスの腹腔内で増殖さ
せ、その腹水からプロテインＡ―セファロース４Ｂカラ
ムを用いて精製した。
【００３８】
【実施例４】精製モノクローナル抗体のクラスの決定 マウス腹水から精製した各クローンのＩｇＧについてオ
クタロニー法によりサブクラスを選定した。
クタロニー法によりサブクラスを選定した。
【００３９】
【表１】
【００４０】２Ａ１Ｃ５と２Ａ１Ｈ８とは異なるエピト
ープを認識し、サンドイッチ法での利用が可能であっ
た。３Ｂ１Ｅ７と３Ｂ１Ｇ３は競合阻害した。２Ａ１系
と３Ｂ１系は全く異なるエピトープを認識した。２Ａ１
Ｃ５と２Ａ１Ｈ８でＬＡＣＩを精製したら両方とも高活
性のＬＡＣＩが得られた。その１例を以下に示す。
ープを認識し、サンドイッチ法での利用が可能であっ
た。３Ｂ１Ｅ７と３Ｂ１Ｇ３は競合阻害した。２Ａ１系
と３Ｂ１系は全く異なるエピトープを認識した。２Ａ１
Ｃ５と２Ａ１Ｈ８でＬＡＣＩを精製したら両方とも高活
性のＬＡＣＩが得られた。その１例を以下に示す。
【００４１】
【実施例５】ヒト肝細胞（Hep Ｇ２）無血清培養上清からのモノクロ
ーナル抗体カラムによるＬＡＣＩの精製 実施例４記載のモノクローナル抗体２Ａ１Ｈ８ ５mgを
ブロムシアン（ＣＮＢｒ）活性化セファロース（ファル
マシア（株））にカップリングさせ、抗体セファロース
カラム２．５mlを作製した。続いてヒト肝細胞（Hep Ｇ
２）の無血清培養上清（ＩＴＥＳ―ｅＲＤＦ培地）１リ
ットルを該カラムに４０ml／時間の流速で通し、接触せ
しめた。０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Tween ２０及
び１０Ｕ／mlアプロチニンを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ―
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２００mlでカラムを洗浄後、３Ｍ
ＮａＳＣＨ（ｐＨ７．０）１５mlでカラムに吸着した
蛋白を溶出した。溶出した画分の総蛋白量は、約５０μ
ｇであった。
ーナル抗体カラムによるＬＡＣＩの精製 実施例４記載のモノクローナル抗体２Ａ１Ｈ８ ５mgを
ブロムシアン（ＣＮＢｒ）活性化セファロース（ファル
マシア（株））にカップリングさせ、抗体セファロース
カラム２．５mlを作製した。続いてヒト肝細胞（Hep Ｇ
２）の無血清培養上清（ＩＴＥＳ―ｅＲＤＦ培地）１リ
ットルを該カラムに４０ml／時間の流速で通し、接触せ
しめた。０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Tween ２０及
び１０Ｕ／mlアプロチニンを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ―
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２００mlでカラムを洗浄後、３Ｍ
ＮａＳＣＨ（ｐＨ７．０）１５mlでカラムに吸着した
蛋白を溶出した。溶出した画分の総蛋白量は、約５０μ
ｇであった。
【００４２】
【実施例６】モノクローナル抗体カラムにより精製したＬＡＣＩのＸ
ａ因子活性に及ぼす影響 モノクローナル抗体（２Ａ１Ｈ８）カラムにより精製
し、いろいろな濃度に調製したＬＡＣＩ １０μｌとＸ
ａ因子（ウシ、０．１５μｇ／ml）１０μｌ、及び５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ ｐＨ７．８（０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５mg／mlＢＳＡ、５ｍＭ ＣａＣｌ2 を含有）
１０μｌとを混合し、３７℃で１０分間反応した。続い
て、あらかじめ１６０μｌ／ウエル５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
―ＨＣｌｐＨ７．８（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５mg／ml
ＢＳＡを含有）を入れた９６ウエル マイクロプレート
に該反応液２０μｌを加えた。最後に２．５ｍＭ Spec
trozyme Ｘａ（合成基質ＭｅＯ―ＣＯ―Ｄ―ＣＨＧ―Ｇ
ｌｙ―Ａｒｇ―ｐＮＡ）１０μｌをウエルに加え、ＥＬ
ＩＳＡ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（東洋測器（株）、ＥＴＹ―
９６）で吸光度Ａ405 ｎｍを測定した。
ａ因子活性に及ぼす影響 モノクローナル抗体（２Ａ１Ｈ８）カラムにより精製
し、いろいろな濃度に調製したＬＡＣＩ １０μｌとＸ
ａ因子（ウシ、０．１５μｇ／ml）１０μｌ、及び５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ ｐＨ７．８（０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５mg／mlＢＳＡ、５ｍＭ ＣａＣｌ2 を含有）
１０μｌとを混合し、３７℃で１０分間反応した。続い
て、あらかじめ１６０μｌ／ウエル５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
―ＨＣｌｐＨ７．８（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５mg／ml
ＢＳＡを含有）を入れた９６ウエル マイクロプレート
に該反応液２０μｌを加えた。最後に２．５ｍＭ Spec
trozyme Ｘａ（合成基質ＭｅＯ―ＣＯ―Ｄ―ＣＨＧ―Ｇ
ｌｙ―Ａｒｇ―ｐＮＡ）１０μｌをウエルに加え、ＥＬ
ＩＳＡ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（東洋測器（株）、ＥＴＹ―
９６）で吸光度Ａ405 ｎｍを測定した。
【００４３】その結果、ＬＡＣＩは濃度依存的にＸａ因
子の活性を阻害することが判明した。
子の活性を阻害することが判明した。
【００４４】
【実施例７】モノクローナル抗体カラムにより精製したＬＡＣＩのＴ
Ｆ活性に及ぼす影響 ウサギ脳トロンボプラスチン（４０mgアセトン粉末、シ
グマ社、２ml）を１mg／mlＢＳＡを含む０．１２５Ｍ
ＮａＣｌ溶液によって１／２０に希釈し、ＴＦ溶液を調
製した。ＴＦ溶液２００μｌと２５ｍＭ ＣａＣｌ2 溶
液２０μｌとを混合し、３７℃で２分間反応させた。こ
のうち２００μｌを、２０μｇ／ml濃度のＬＡＣＩ溶液
２０μｌを添加したヒト血漿１２０μｌに加え、プロト
ロンビン時間（ＰＴ）を血液凝固時間測定装置（Sysmex
社、ＣＡ―１００）を用いて測定した。
Ｆ活性に及ぼす影響 ウサギ脳トロンボプラスチン（４０mgアセトン粉末、シ
グマ社、２ml）を１mg／mlＢＳＡを含む０．１２５Ｍ
ＮａＣｌ溶液によって１／２０に希釈し、ＴＦ溶液を調
製した。ＴＦ溶液２００μｌと２５ｍＭ ＣａＣｌ2 溶
液２０μｌとを混合し、３７℃で２分間反応させた。こ
のうち２００μｌを、２０μｇ／ml濃度のＬＡＣＩ溶液
２０μｌを添加したヒト血漿１２０μｌに加え、プロト
ロンビン時間（ＰＴ）を血液凝固時間測定装置（Sysmex
社、ＣＡ―１００）を用いて測定した。
【００４５】その結果、ＬＡＣＩはＴＦ活性を阻害し、
血液凝固時間（ＰＴ）を延長することが判明した。
血液凝固時間（ＰＴ）を延長することが判明した。
【００４６】以上の実施例６及び実施例７の検討の結果
から、モノクローナル抗体２Ａ１Ｈ８によって精製した
ＬＡＣＩは、Ｘａ因子阻害活性とＴＦ阻害活性を有する
ことが確かめられた。
から、モノクローナル抗体２Ａ１Ｈ８によって精製した
ＬＡＣＩは、Ｘａ因子阻害活性とＴＦ阻害活性を有する
ことが確かめられた。
【００４７】
配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe 1 5 10 15 Tyr Tyr Asn Ser Val 20
【図１】モノクローナル抗体カラムによって精製したＬ
ＡＣＩのＸａ因子活性に及ぼす影響を示したものであ
る。
ＡＣＩのＸａ因子活性に及ぼす影響を示したものであ
る。
【図２】モノクローナル抗体カラムによって精製したＬ
ＡＣＩのＴＦ活性に及ぼす影響を示したものである。
ＡＣＩのＴＦ活性に及ぼす影響を示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 アミノ酸配列 Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly Leu CysArg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val のポリペプチドを認識し、結合するモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】 リポプロテイン結合性凝固系インヒビタ
ー（Lipoprotein Associated Coagulation Inhibitor：
ＬＡＣＩ）のＮ端から３番目のクーニッツ部位を認識
し、結合するモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 組織因子阻害活性と血液凝固Ｘａ因子阻
害活性とを有する蛋白物質を認識し結合するモノクロー
ナル抗体。 - 【請求項４】 上記第１，２及び３項のいずれかのモノ
クローナル抗体を不溶性担体に結合させた吸着体に、ヒ
トＬＡＣＩ含有混合物を接触せしめ、該吸着体にヒトＬ
ＡＣＩを結合せしめることを特徴とするヒトＬＡＣＩ含
有混合物からの高活性ヒトＬＡＣＩの分離方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3311442A JPH05123183A (ja) | 1991-10-31 | 1991-10-31 | モノクローナル抗体 |
| EP92118497A EP0539975A1 (en) | 1991-10-31 | 1992-10-29 | Method for immunological assay of free lipoprotein-associated coagulation inhibitor (LACI) and kit therefor |
| US07/969,368 US5369038A (en) | 1991-10-31 | 1992-10-30 | Method for immunological assay of free lipoprotein associated coagulation inhibitor (LACI) and kit therefor |
| CA002081878A CA2081878A1 (en) | 1991-10-31 | 1992-10-30 | Method for immunological assay of free lipoprotein associated coagulation inhibitor (laci) and kit therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3311442A JPH05123183A (ja) | 1991-10-31 | 1991-10-31 | モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05123183A true JPH05123183A (ja) | 1993-05-21 |
Family
ID=18017267
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3311442A Pending JPH05123183A (ja) | 1991-10-31 | 1991-10-31 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05123183A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013533871A (ja) * | 2010-06-30 | 2013-08-29 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 組織因子経路インヒビターに特異的に結合することが可能な抗体 |
-
1991
- 1991-10-31 JP JP3311442A patent/JPH05123183A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013533871A (ja) * | 2010-06-30 | 2013-08-29 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 組織因子経路インヒビターに特異的に結合することが可能な抗体 |
| JP2017025104A (ja) * | 2010-06-30 | 2017-02-02 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 組織因子経路インヒビターに特異的に結合することが可能な抗体 |
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