JPH0510954A - バクテロイデス・インターメデイウス、バクテロイデス・ギンギバリスまたはアクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンスの検出用製品、試験キツトおよびサンドイツチアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】微生物バクテロイデス・インターメディウス、
バクテロイデス・ギンギバリスまたはアクチノバシラス
・アクチノマイセテムコミタンスのいずれか３種の血清
型（Ａ，ＢおよびＣ）のすべてまたはそのいずれかの検
出方法とこの方法に有用な検出用製品および試験キット
を提供する。 【構成】この検出方法は前記微生物の血清型の少なくと
も１種を含む被検体を水不溶性試薬として前記血清型の
いずれかに対する反応性抗体類を少なくとも１種付着し
て有する微孔質膜と接触し、さらに同じ抗原を、検出可
能に標識した前記抗体と同一の反応性を示す抗体類と接
触し、こうして前記膜上にバインディングした免疫学的
サンドイッチ複合体を形成した後、未バインディング物
質を洗い流す工程を含む。水不溶性試薬は、前記抗体類
をバインディングした粒子からなり、この粒子は膜の細
孔内に埋没することなくその膜表面上にほぼすべてが存
在する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、微生物バクテロイデ
ス・インターメディウス(Bacteroides intermedius)、
バクテロイデス・ギンギバリス(Bacteroides gingival
is) およびアクチノバシラス・アクチノマイセテムコミ
タンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)いず
れかの３種の血清型（Ａ，ＢおよびＣ）のいずれかまた
はすべての検出に有用なサンドイッチアッセイに関す
る。また、かかるアッセイに有用な製品およびキットも
提供する。この発明は歯科上の検査および健康管理に有
用である。

【０００２】

【従来の技術】医療、歯科および獣医学上の試験、研究
および診断法において、生物学的流体または被検体中に
存在する生物学的または化学的物質の迅速、かつ正確な
検出または定量に対する依然とした欲求が存在する。た
とえば、ヒトおよび動物の組織、流体および細胞におけ
る各種微生物の存在は、疾患の診断および効果的な処置
にとって非常に有用である。

【０００３】特定の微生物は、ヒトや動物の各種歯周疾
患、例えば歯肉炎および歯周炎に対する指標として関連
付けられてきた。これらの疾患の重大性は、特に長生き
している人々のような世代のヒトにとってますます重要
性が増してきたし、その予防は医療上および商業上著し
く重要性が増大してきた。その上、動物の適切な管理
（歯科上の医療を含む）は、われわれの文化における大
きな関心事である。

【０００４】歯周疾患に随伴する微生物の検出は、培養
技法（一般に時間がかかる）、ＤＮＡプローブ法および
各種の免疫学的な手法、例えば凝集アッセイ、エンザイ
ム・リンクト・イムノソルベント・アッセイ(ELISA）、
免疫蛍光法および免疫沈殿法を用いて行われてきた。こ
れらの免疫学的な手法は、微生物の抗原部位（それらか
ら抽出された成分上に存在してもよい）とそれに特異的
な対応する抗体との免疫反応を伴う。次に、得られた免
疫反応複合体を各種方法で検出することができる。

【０００５】黒色バクテロイデス(Bacteroides) 種は、
グラム陰性菌であり、通常、各種の歯周疾患、歯牙形成
部位の膿腫および歯内病変の原因となる嫌気性杆状菌で
ある。このような種にはバクテロイデス・インターメデ
ィウス（B. intermedius)およびバクテロイデス・ギン
ギバリス (B. gingivalis) 、バクテロイデス・ホルシ
サス（B. forsythus)およびバクテロイデス・エンドド
ンタリス (B. endodontalis) が包含される（以下、バ
クテロイデスを「Ｂ」と称する場合もある）。Ｂ・ギン
ギバリスは当該技術分野でバクテロイデス（ポルフィロ
モナス）・ギンギバリス〔Bacteroides (Porphyromona
s) gingivalis〕またはポルフィロモナス・ギンギバリ
ス(Porphyromonas gingivalis）と称されることもあ
る。本明細書で定義される「歯周疾患」とは、口腔の歯
周で発生するヒトおよび動物の多種多様な疾患を称し、
結合組織、歯槽骨と歯肉の喪失に影響を及ぼす疾患を包
含する。それは、人生のいろいろな時期、例えば幼児、
青年時代、妊娠期間または老年期に発生しうる疾患を包
含する。

【０００６】また、ある細菌種に属する一定の血清群ま
たは血清型は一定の歯周疾患に随伴することも知られて
いる。例えば、Ｂ・インターメディウスの血清型Ｂは主
としてヒトの青年期の歯根膜炎に見られるが、血清型Ｂ
およびＣは成人期の歯根膜炎に応答性であることが見い
出された〔Nakazawaら、Infect.Immun., 56 (6), 1647
〜1651ページ、1988〕。アクチノバシラス・アクチノマ
イセテムコミタンス (Actinobacillus actinomycetemc
omitans) (以下、Ａ・アクチノマイセテムコミタンスと
称する）は、ヘモフィラス（Haemophilus)属微生物に近
似する口内グラム陰性の条件的生物である。この生物
は、細菌性心内膜炎、甲状腺膿瘍、***症、脳膿瘍
および脊椎骨髄炎を初めとする重篤なヒト感染症を引き
起こす可能性がある。それは、一定のタイプの歯周疾
患、特に局所幼年性歯根膜炎およびある種の成人の歯根
膜炎の病原と密接に関連付けられた。Ａ・アクチノマイ
セテムコミタンスのヒト分離株は、Zambonら(Infect.Im
mun., 41, 19〜27ページ、1983) によって、75株(ATCC4
3717)、Ｙ４株(ATCC 43718)および67株(ATCC 43719)と
それぞれ称される株に対応する３種の主要な血清型名、
血清型Ａ，ＢおよびＣに分類された。

【０００７】歯肉間隙の流体および歯肉下の歯プラーク
における前記のような細菌に特異的な臨床上のアッセイ
は、歯周疾患の診断、歯周処置の選択および進捗状況の
評価ならびに時後の歯科試験における患者の状態を決定
する上で有用である。このような生物を同定するのに使
用されている標準的な培養法は、時間および経費がかか
り、そして高水準の経験を持つオペレーターが必要であ
る。また、このような試験は搬入および搬出を通じて厳
密な嫌気性条件が必要であるため低いレベルの生物体の
検出用として十分な感度に欠けるきらいもある。

【０００８】上記各種のイムノアッセイが開発され、あ
る程度成功裏に使用されてきた。特に有用であるのは、
ラジオイムノ沈殿アッセイおよび ELISA試験である。米
国特許第 4,741,999号明細書は、Ａ・アクチノマイセテ
ムコミタンスの抗原に対するモノクローナル抗体とそれ
らの ELISAアッセイでの使用について記載する。いろい
ろなバクテロイデス種に対するモノクローナル抗体およ
びポリクローナル抗体が類似のアッセイ用として調製さ
れてきた〔例えば、Nakazawaら、Infect.Immun., 56
(6), 1647〜1651ページ、1988、およびZambonら、J.Per
iodon., 56 (上述) 、32〜40ページ、1985、参照〕。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】一般的に、従来のアッ
セイは遅くて時間がかかり、そして単一生物体に向けら
れてきた。多くの場合、アッセイは関連する種と高い交
差反応性を示すので有用性が限定されていた。微生物Ａ
・アクチノマイセテムコミタンス、Ｂ・ギンギバリスお
よびＢ・インターメディウス３種のいずれかの存在を検
出するためのスクリーニングアッセイが開発された。こ
のスクリーニング方法は、患者が歯周の治療を必要とす
るが微生物の存在する徴候がないかを開業医が初期の段
階で判断できるので、彼らにとって非常に有用である。

【００１０】スクリーニングが行われ、その結果が陽性
を示した場合には、処置に際しより詳細な指示をできる
ように微生物の存在を測定できる必要性があろう。この
ような処置は早期に初めなければならないだろう。現在
のところ、分別は時間のかかる培養法、ＤＮＡプローブ
法または上記の好ましくない免疫学的方法によって行わ
ねばならないだろう。

【００１１】微生物の存在を測定する方法の一つは、目
的の抗原を直接固体支持体にバインディングしその後適
当な検出可能な抗体と複合体を形成することによる「直
接バインディング」アッセイが知られている。このアッ
セイは速度および感度の点で既知のアッセイを陵駕する
利点を有するが、特異性の領域でいまだ改良が必要であ
る。例えば、ヘモフィラス(Haemophilus) 菌の抗原部位
との交差反応性は直接バインディングアッセイを使用す
るに際してほとんど許容できないことがわかった。この
交差反応性が歯の健康管理をする開業医に高感度で信頼
できる試験を提供することを阻止している。さらに、直
接バインディングアッセイは、低レベルのＡ・アクチノ
マイセテムコミタンスに対する感度が極めて低く、初期
の検出や予防的な歯の保全にとって好ましい水準にな
い。従って、開業医が歯周疾患に随伴する個々の微生物
について患者の試料をアッセイしたい場合には、関連す
る菌種との低い交差反応性を示すアッセイを入手するこ
とが望まれるであろう。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記課題は、下記の工程
を含んでなる微生物バクテロイデス・インターメディウ
ス(Bacteroides intermedius)、バクテロイデス・ギン
ギバリス(Bacteroides gingivalis) またはアクチノバシ
ラス・アクチノマイセテムコミタンス (Actinobacillus
actinomycetemcomitans)いずれかの血清型１種以上を
測定する方法によって解決される： Ａ．微生物バクテロイデス・インターメディウス、バク
テロイデス・ギンギバリスまたはアクチノバシラス・ア
クチノマイセテムコミタンスいずれかの血清型１種以上
から抽出した抗原を含有することが疑われる水性被検体
を、その抗原に対する抗体を付着した水不溶性粒子を含
んでなる水不溶性試薬の実質的にすべてを表面上に付着
して担持する微孔質膜と接触して、前記膜上で前記抗体
類と前記被検体中に存在する抽出抗原との間の水不溶性
免疫複合体を形成する工程、 Ｂ．工程Ａの接触と同時またはその前後に、前記抽出抗
原をその抗原に対する検出可能に標識した水溶性抗体と
接触して、前記膜上に前記標識抗体および水不溶性抗体
の両方と前記被検体中の抽出抗原との標識水不溶性免疫
複合体を形成する工程、 Ｃ．工程Ｂの接触と同時またはその後に、前記微孔質膜
を通して未複合体化物質を洗浄することによりその未複
合体化物質から前記標識水不溶性複合体を分離する工
程、ならびに Ｄ．前記被検体における抗原の存在の指標として前記膜
上の標識複合体を検出する工程。

【００１３】さらに、この発明は、微生物バクテロイデ
ス・インターメディウス、バクテロイデス・ギンギバリ
スまたはアクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタ
ンスいずれかの１種以上の血清型少なくとも１種に向け
た抗体を付着した水不溶性粒子を含んでなる水不溶性試
薬の実質的にすべてを表面上に付着して担持する微孔質
膜からなる水不溶性製品も提供する。

【００１４】またさらに、この発明は、微生物バクテロ
イデス・インターメディウス、バクテロイデス・ギンギ
バリスまたはアクチノバシラス・アクチノマイセテムコ
ミタンスいずれかの１種以上の血清型少なくとも１種に
向けた抗体を付着した水不溶性粒子を含んでなる水不溶
性試薬の実質的にすべてを表面上に付着して担持する微
孔質膜からなる水不溶性製品を含む微生物バクテロイデ
ス・インターメディウス、バクテロイデス・ギンギバリ
スまたはアクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタ
ンスいずれかの血清型１種以上を検出するための試験キ
ットも提供する。

【００１５】この発明は、Ｂ・インターメディウス、Ｂ
・ギンギバリスまたはＡ・アクチノマイセテムコミタン
スいずれかの３種の血清型（Ａ，ＢおよびＣ）１種以上
の抗原（例えば、リポ多糖類、莢膜抗原類または膜タン
パク質類）を迅速かつ感度よく測定するのに使用でき
る。このような抗原類は細胞そのものの一部として検出
できるかも知れないが、通常、それらは生物学的被検体
中に存在する細胞そのものから適当な方法で抽出され
る。限定されるものでないが、このような被検体として
は、咽喉または口に由来する粘液、涙液、ヒトまたは動
物の組織抽出物、歯のプラークおよび歯肉間隙の液体が
挙げられる。一般的に、前記生物体は歯のプラーク、唾
液または歯肉間隙の液体中に検出されている。

【００１６】抗原の抽出は、通常の洗剤（例えば、ドデ
シル硫酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウムまたはデオ
キシコール酸ナトリウム）を用いる方法などの物理的ま
たは化学的手段によって適切に行われる。抗原物質は、
被検体そのものから採取することができるが、場合によ
って、原被検体を水もしくは適当な緩衝剤で適当に希釈
するか、あるいは異物を除去しそしてアッセイで抗原と
抗体の複合体化を促進するために濾過してもよい。一般
的に、抗体を単離すると、必要によりそれらを１種以上
の適当な緩衝剤および防腐剤を含有する緩衝溶液として
保存しそして使用することができる。好ましくは、それ
らを凍結状態で保存する。この緩衝溶液のpHは、一般に
６〜９、好ましくは6.５〜8.５に維持する。有用な緩衝
剤は当業者に自明である。

【００１７】この発明のサンドイッチアッセイを実施す
るに際し、抗体類は、粒状有機体、ポリマー、ガラス、
セラミック、天然もしくは合成の樹脂、珪藻土または磁
性粒子から形成された水不溶性粒状キャリア材料上に適
当な様式で固定化される。これらの粒子は、好ましくは
球状であって、平均径0.01〜10μｍ、好ましくは0.５〜
５μｍを有するが、構造および空間配置はそれらが膜内
に埋没（後述する）しない限り限定されない。平均径
は、前記粒子が膜表面上に残存する（後述する）ように
その膜の細孔サイズとの関連で決定すればよい。得られ
た抗体および粒状水不溶性試薬がこの発明の方法で使用
される。

【００１８】抗体類は、前記材料表面への吸着またはそ
の表面の反応性基との共有結合を初めとする物理的また
は化学的手段によって粒状キャリア材料に付着すること
ができる。共有結合が好ましい。好ましいポリマー粒子
は、それに抗体分子を共有結合するための適当な表面反
応性基を有する。キャリア材料上の抗体分子の密度は、
前記材料の組成、それらのサイズおよび抗体の性質に応
じて変動しうるが、アッセイに適する感度に必要十分な
密度は当業者によって容易に決定できる。場合によって
抗体を結合に適するように変性してもよい。

【００１９】抗体の共有結合は、通常、抗体の遊離アミ
ン、糖質またはスルフヒドリル基と直接または間接的に
（すなわち、タンパク質またはアビジン−ビオチンのよ
うな連結を介して）反応しうる表面反応性基を使用して
達成される。限定されるものでないが、このような表面
反応性基としては、カルボキシル基、エポキシ基、アル
デヒド基、活性ハロ原子、活性２−置換エチルスルホニ
ル基、ビニルスルホニル基および当該技術分野で既知の
他の基が挙げられる。

【００２０】特に有用なポリマー粒子としてはヨーロッ
パ特許公開第323692号公報に記載されるものが挙げられ
る。これらの粒子は、一般的に、平均粒子サイズが0.01
μｍを越える水不溶性ラテックス粒子である。それら
は、少なくとも１つの活性ハロ原子、活性２−置換エチ
ルスルホニル基または活性ビニルスルホニル基を有する
１種以上のエチレン系不飽和重合性モノマーから製造さ
れるポリマー類から構成される。

【００２１】これらのモノマー類の１種以上を、個別に
または組み合わせて重合してホモポリマーまたはコポリ
マーを形成することができる。また、それらの１種以上
が少なくとも１種の他のエチレン系不飽和重合性モノマ
ーと共重合される。一般的にこれらのモノマー類は、疎
水性、分散性または他の特質のような様々な好ましい特
性を提供する。

【００２２】代表的な有用ポリマー類としては次のもの
が挙げられる：ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレ
ン）、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチ
レン−コ−２−ヒドロキシエチルアクリレート)(モル
比、67：30：３）、ポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ−（２
−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン〕（モル
比、96：４）、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−
（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル〕アク
リルアミド｝（モル比、99.3：0.７）、ポリ（ｍ＆ｐ−
クロロメチルスチレン−コ−メタクリル酸)(モル比、9
5：５，98：２および99.8：0.２）、ポリ〔スチレン−
コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）ス
チレン−コ−メタクリル酸〕（モル比、93.5：4.５：
２）、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−（２−クロ
ロエチルスルホニルメチル）フェニル〕アクリルアミド
−コ−メタクリル酸｝（モル比、97.3：0.７：２）およ
びポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレ
ン)(モル比、70：30) 。

【００２３】この発明の重要な点は、上記試薬（抗体粒
子）を付着して水不溶性製品を形成する微孔質水不溶性
膜の使用にある。この膜は、第一の外面と第二の外面を
有し、どのような化学反応または生物学的反応にも不活
性であり、一般的に、アッセイを通じて抗体を付着する
のに十分な統合性を有しそして適切な濾過に必要な多孔
度を有する１種以上の天然または合成材料からなる（通
常、平均細孔サイズ0.５〜10μｍ）。限定されるもので
ないが、有用な膜材料としては、天然もしくは合成ポリ
マーマットもしくは布、焼結ガラス、ガラス製もしくは
ポリマーフィルムもしくは繊維製の膜もしくはフィルタ
ー、多孔質セラミックもしくはセルロース系材料、粘着
性もしくはバインダー物質を一緒に結合したビーズから
なる多孔質粒状構造物が挙げられる。この膜は、表面の
ある程度の不規則性は許容できるが、一般的に平坦であ
り、場合によって一定の曲率を有してもよい。当業者
は、市販または既知の方法で調製した他の有用な材料を
選ぶことも可能であろう。特に有用な材料は、例えばPa
ll Corp.から販売されているような処理済みもしくは未
処理ポリアミド微孔質膜である。

【００２４】これらの微孔質膜は、一般的に0.５〜10μ
ｍの平均細孔サイズを有する。この膜は、アッセイ中に
遭遇する流体および未複合化物質を排出するのに十分な
多孔度を有する。このような未複合化物質としては、未
複合体化抗原、抗体類、細胞残屑、および生物学的被検
体由来の他の非粒子状の異物が挙げられる。したがっ
て、この膜の細孔サイズは、上記物質がその多孔質支持
体を通過するが、前記粒状試薬および得られる抗原との
複合体は残存するようなものでなければならない。

【００２５】この試薬は実質的に膜の表面上に存在す
る。このことは膜内に埋没する試薬の割合が５重量％未
満、好ましくは１重量％未満であることを意味する。
「埋没する」とは、試薬粒子の全体が膜の細孔内に存在
することを意味する。これは試薬粒子が膜外面またはそ
の近傍の細孔内に部分的には埋没できることを意味す
る。一般的に、微孔質膜はその表面内に部分的に埋没し
たある程度の試薬を有してもよいが、ヨーロッパ特許公
開第 200,381号および国際公開第87／03690 号公報が教
示するような相当の量でない。

【００２６】上記粒状試薬は、被検体との接触によって
抗体が抗原と反応しうる限りいずれか適当な方法で膜表
面に付着される。一般的に、製造および処理中に温和な
機械的妨害によって抗体類を失わさないようにそれらが
付着される。さらに、試薬はアッセイ中に膜からほとん
ど漏れ出さない。例えば、試薬は塗布、スポットまたは
噴霧によって機械的に付着し、そして分子間ならびに分
子と膜との間の疎水結合によってその場合に保持され
る。また、適当な化学反応によって共有結合することも
できる。通常、試薬はアッセイに使用する前に乾燥され
るが、乾燥は必ずしも必要はない。

【００２７】膜上に固定化した試薬を親水性、中性また
は正の荷電バインダー材料と混合することが特に有用で
ある。一般的に、バインダー材料の量は、試薬の総重量
当たり20重量％未満である。限定されるものでないが、
特に有用なバインダーとしては、ビニルピロリドンポリ
マー類、アクリルアミドポリマー類、ならびに第四級塩
類および当該技術分野で既知の電荷が中性であるかもし
くは正に荷電した他の基を含有するポリマー類が挙げら
れる。「電荷が中性」とは、ポリマーそのものが電荷を
もたないかあるいは分子中の総電荷が０になるように負
電荷と正電荷の両方を有することを意味する。これらの
ポリマー類は、ホモポリマー類またはコポリマー類であ
ることができ、単一または組み合わせて使用することが
できる。アクリルアミドポリマー類は、メタクリルアミ
ドポリマーを含めた概念である。

【００２８】有用な正荷電ポリマーバインダー類として
は米国特許第 4,069,017号明細書に記載される媒染剤が
挙げられ、この媒染剤は十分な水溶性を示す。十分な水
溶性は、一般的にポリマーの少なくとも50重量％が正荷
電基を含有するモノマー類から構成される。

【００２９】この粒状試薬は、膜表面の１つ以上の分離
区画でその表面に付着することができ、各区画はその総
表面積未満である。また、試薬は膜表面積全体に付着す
ることもできる。こうして、作製された水不溶性製品は
他の備品または試験コンテナ（例えば、流体をコンテナ
中に流し込む支持具など）を必要とすることなくアッセ
イで使用することができる。しかしながら、それを水不
溶性枠または膜支持用構造体を有する水不溶性試験デバ
イスに配置するかまたは固定することが好ましい。各種
の試験デバイスが当該技術分野で知られている。特に有
用なデバイスとしては、抗原物質の検出用スレセル (Su
recell、商標）試験キット(Eastman Kodak Co.) の一部
として市販されているものが挙げられる。

【００３０】好ましい態様では、試験デバイスは被検体
の試験結果を与えならびに正対照および負対照を与える
ように設計された３個の試験ウェルを有する。各試験ウ
ェルは微孔質膜を備えており、そして試験ウェル少なく
とも１つは前記粒状試薬が付着した膜を有する。有用な
試験デバイスの他の変型は当業者の予見できる範囲内で
あろう。

【００３１】一般的、この発明の方法は前記粒状試薬を
付着した膜を、Ｂ・インターメディウス、Ｂ・ギンギバ
リスおよびＡ・アクチノマイセテムコミタンスいずれか
の血清型１種以上から抽出した抗原を含有することが疑
われる水性被検体と接触することによって実施できる。
抗原が存在するならば、膜にバインディングした抗原と
抗体との間の免疫複合体を形成する。

【００３２】抗原と粒状試薬の間の複合体形成と同時ま
たはその前後のいずれかのアッセイ時に、抗原はまた、
水溶性で、かつ検出可能に標識した前記微生物の血清型
１種以上に対する第二の抗体と免疫複合体を形成する。
「検出可能に標識した」とは、分光光度計、放射能測定
装置または他の適当な機器および方法によるか、あるい
は視覚的に直接もしくは間接的に検出できるように抗体
がある成分と共有結合するかまたは組み合わさっている
ことを意味する。間接的な検出は、直接観察できる生成
物をもたらすような適当な試薬と抗体成分を１度以上反
応することによって行うことができる。

【００３３】前記標識抗体と抗原の接触を同時またはそ
の後、未複合体化物質は膜を介したその未複合体化物質
の洗浄によって膜にバインディングした複合体から分離
する。前記物質の膜を介する洗浄は、生物学的被検体の
流体で十分であるが、一般的に、分離のために１種以上
の分離用洗液を使用する。洗液としては当該技術分野で
周知であり、非イオン界面活性剤もしくはアニオン界面
活性剤を含む蒸留水または緩衝液が挙げられる。特に有
用な洗液はデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸ナ
トリウムを含む。

【００３４】膜上のサンドイッチ複合体の検出は、標準
的な検出機器および操作によって行われる。それらは当
業者が容易に気づくように個々の標識に応じて変動する
であろう。標識が酵素である場合には、バインディング
した複合体をその酵素の存在下で色素（発色源または蛍
光源）を供給しうる組成物とさらに接触する。このよう
な組成物は、一般的に酵素に対する基質類などの１種以
上の試薬を含む。これらの試薬は当業者に知られてい
る。

【００３５】不溶性複合体の存在下でひとたび色素が生
成すると、アッセイが被検体中に抗原の存在を示す場合
にはそれを視覚的に評価するか、または分光光度計を用
いて測定することができる。被検体の試験と共に正対照
試験および負対照試験の両者も行うことが好ましい。各
対照試験には適当な試薬類を使用して所期の結果を与え
ることができる。

【００３６】ある態様では、標識がビオチンまたはアビ
ジンである場合、検出は標識を対応する受容体と反応さ
せることによって行うことができる（すなわち、標識と
してのビオチンはアビジンと反応する）。対応する受容
体は検出可能な複合体をもたらす放射性同位体または酵
素で適当に標識することができる。例えば、ビオチンが
標識である場合にはそれが酵素およびアビジンの結合体
と反応することができる。

【００３７】微生物バクテロイデス・インターメディウ
ス(Bacteroides intermedius)、バクテロイデス・ギン
ギバリス(Bacteroides gingivalis) またはアクチノバ
シラス・アクチノマイセテムコミタンス (Actinobacill
us actinomycetemcomitans)いずれかの血清型１種以上
を測定する好ましい方法は次の工程を含んでなる。 Ａ．微生物バクテロイデス・インターメディウス、バク
テロイデス・ギンギバリスまたはアクチノバシラス・ア
クチノマイセテムコミタンスいずれかの血清型１種以上
を抽出する工程、 Ｂ．抽出した抗原を、その抗原に対する抗体を共有結合
したポリマー粒子を含んでなる水不溶性試薬の実質的に
すべてを膜表面上に付着して担持する使い捨て試験デバ
イス中の微孔質膜と接触して、抽出した抗原と前記膜上
に存在する抗体との間で水不溶性免疫複合体を形成する
工程、 Ｃ．この水不溶性複合体を前記抗原に対する酵素標識水
溶性抗体と接触して前記膜上に前記標識抗体および水不
溶性抗体の両者と前記抗原の酵素標識し、かつ水不溶性
の免疫複合体を形成する工程、 Ｄ．その膜を通して未複合体化物質を洗浄する工程、な
らびに Ｅ．膜上の前記酵素標識し、かつ水不溶性の免疫複合体
をその酵素の存在下で色素生成組成物と接触して被検体
中の抗原の存在の指標とする工程。

【００３８】この発明の診断試験キットは、この発明の
製品ならびにこの製品を設計するための個別の血清型ま
たは血清型の組み合わさったものに向ける検出可能に標
識した抗体類を含んでなる。あるキットでは、この製品
と標識した抗体を用いて前記微生物いずれかの血清型を
無差別に検出する。製品が同一微生物の各種血清型を検
出するために別々の反応区画を有する場合には、キット
は相当する標識抗体類を含むことができる。これらのキ
ットの成分は、適当な方法で個別にまたは一緒に包装す
ることができ、そして製品を（単独または試験デバイス
中に）区分けして収容することができるある種のキャリ
アおよび試薬類のバイアルもしくはボトルを含めること
ができる。さらに、場合によって、この前に実施される
スクリーニング法に有用な色素生成組成物、抽出試薬
類、洗液、希釈剤および提供するアッセイホーマットに
関して当業者に既知の他の試薬類の１種以上を含めても
よい。試薬類は乾燥状態または適当な溶液状態で提供す
ることができる。キットの無反応性成分としては説明
書、混合容器、攪拌手段およびピペットなどを含めるこ
とができる。

【００３９】上述したように、この発明の方法を使用し
て同一微生物の血清型のいずれかまたはすべてを検出す
ることができる。ある態様では、各血清型をそれぞれの
血清型用の個別の試験デバイスによって個々に検出する
ことができる。さらに、各血清型を試験デバイスの単一
膜の特定領域で検出することもできる。また、他の２種
の血清型から１種の血清型（例えば、血清型Ｂ）を区別
することもできる。一方、血清型を区別する必要がない
場合は、被検体中に存在する微生物の血清型すべてが効
果的に検出できる。

【００４０】ポリクローナル抗体は次の調製法がそれら
の調製にとって好ましい方法である。細菌株は、Homer
S.Reynolds(SUNY Buffalo, School of Dentistry) によ
って生きた培養物として供給された。分離株をヘミン
（５μｇ／ml）およびメナジオン（0.５μｇ／ml）で強
化したＣＤＣ嫌気性プレート(BBL Laboratories, Balti
more, Md.)で嫌気的に培養した。

【００４１】次に、これらのプレートを嫌気性チャンバ
ー中37℃で24〜48時間インキュベーションした。各菌株
に対する凍結保存試料は、白金耳で細胞コロニーを採取
し、スキムミルクで細胞懸濁液を調製し、次いでこの懸
濁液を−70℃で凍結することによって調製した。凍結保
存試料の生存率は、凍結保存試料の一部をＣＤＣ嫌気性
プレート上に置き、そして上記のようにインキュベーシ
ョンすることによって試験した。生存率が確認される
と、各菌株に対する新鮮な分離株を同様にして得た。細
胞懸濁液は、白金耳でコロニーを採取し、リン酸緩衝溶
液（pH7.５，１ml）にその白金耳を置き、次いで約１分
間激しく攪拌することによって調製した。

【００４２】細胞懸濁液の濃度は、 620nmにおける濁度
を測定することによって分光測光的に測定した。適当な
希釈物を調製して光学濃度範囲を0.１〜１にした。濃度
は１マクファーランド(McFarland) 標準(OD₆₂₀＝0.180
で、約３×10⁸ 細胞／mlに相当する）を用いて測定し
た。ニュージーランド白ウサギに、１ml当たり総生細胞
約５×10⁸ 個を含有する各免疫原のリン酸緩衝溶液(pH
7.3) 0.５mlを静脈内注射した。これらの注射は、 McCa
rtyおよびLancefield (J.Exp.Med., 102, 1〜28ペー
ジ、1955) に示される方法に準じて行った。

【００４３】２度のブースター注射は次のように行っ
た：最初の注射１週間後各ウサギに再度同量の免疫原を
注射し、さらに１週間後同様な注射を各ウサギにした。
最初の注射後15日目に開始し、さらに合計11週間各ウサ
ギに対し１週当たり３度の免疫原（５×10⁸ 細胞／ml）
１mlのブースター注射をした。ブースター注射は各７日
間を通じて１日間隔をとった。これらのウサギから数度
抗血清（各血清型に対する）試料（２ml）を集め、その
都度抗体の性質を調べた。例えば、抗血清試料は最初の
免疫原注射から３週間、６週間および９週間間隔で採取
した。次に、最初の注射から13週目にウサギを殺し、抗
血清を集めた（ウサギ１ワ当たり約 100ml) 。

【００４４】次に、最後の血清を硫酸アンモニウム沈殿
によって精製した。45％飽和が達成されるまで、飽和硫
酸アンモニウム溶液を氷で冷却した各血清試料に攪拌し
ながら滴下した。添加後、混合物をさらに10分間攪拌
し、遠心し、次いで上澄を廃棄した。このペレットをも
との精製された試料の量に等しい容量のリン酸緩衝溶液
（pH7.３）に再懸濁した。上記工程（硫酸アンモニウム
添加、遠心およびペレットの再懸濁）を繰り返した。次
に、混合物を透析バッグに移し、リン酸緩衝溶液（pH7.
３）に対して攪拌しながら４℃で約15時間透析した。約
200〜10,000倍を越える透析緩衝液を使用した。

【００４５】さらに６時間新鮮な緩衝液で透析を繰り返
した。透析バッグから溶液を取り出し、0.22μｍのフィ
ルターを通して濾過した。濾液の一部をリン酸緩衝溶液
で１：10〜１：100 の範囲内に希釈し、 280nmにおける
吸光度を読み取った。抗体濃度は次の式により決定し
た： Ａ₂₈₀ ÷〔1.４×（希釈）〕＝抗体濃度（mg／ml）。 次に抗体溶液をリン酸緩衝溶液（pH7.３）およびマーシ
オレート（0.01重量％）で２〜４mg／mlに希釈し、次い
で４℃で保存した（少量は４℃で、一方多量の試料は−
70℃で保存) 。

【００４６】

【実施例】下記の例はこの発明を具体的に説明する目的
で提供するものであって、いずれかの態様にこの発明の
範囲を限定することを意図するものでない。すべてのパ
ーセンテージは、別に指摘しない限り重量基準である。 例１ バクテロイデス・インターメディウス(Bacteroid
es intermedius) の３種すべての血清型用サンドイッチ
アッセイ この例は、生物学的被検体中のＢ・インターメディウス
の３種すべての血清型の測定についてサンドイッチアッ
セイによるこの発明の方法を具体的に説明する。

【００４７】材料および方法 Surecell (商標) 使い捨て試験デバイス(Eastman Kodak
Co.) を使用し、これはそれぞれ各試験ウェル中に組み
込まれたLoProdyne(商標) ナイロン微孔質膜（５μｍ，
Pall Corp.) を担持する。これらの膜は、Fluorad(商
標) FC 135非イオン界面活性剤（0.05ｇ／ｍ² ，３Ｍ
社）で予め処理した。

【００４８】色素生成組成物は、２−（４−ヒドロキシ
−３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビス（４−
メトキシフェニル）イミダゾール(0.008％) 、ポリ（ビ
ニルピロリドン)(１％）、リン酸ナトリウム緩衝剤（10
ミリモル濃度、pH6.８）、過酸化水素（10ミリモル濃
度）、４′−ヒドロキシアセタニリド電子移動剤（２ミ
リモル濃度）およびジエチレントリアミン五酢酸キレー
ト剤（10マイクロモル濃度）を含むように調製した。

【００４９】Ｂ・インターメディウスの３種の血清型
〔血清型Ａ(ATCC 25611)、血清型Ｂ(NCTC 9336) および
血清型Ｃ(ATCC 49046)〕に対するポリクローナル抗体類
は、上述のようにウサギの静脈内注射によって得た。 I
gG画分は硫酸アンモニウム沈殿によって調製し、リン酸
緩衝溶液（0.３〜0.４％溶液）中４℃で保存した。NCTC
はナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャ
ー(National Collectionof Type Cultures)(London)で
あり、ATCCはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション(American Type Culture Collection)(Rockvill
e, Maryland) である。

【００５０】これらの細菌株を使用して調製した抗血清
をH.S.Reynolds(School of Dentistry, SUNY, Buffalo)
による生きた培養物と同様に供給した。分離株は上述の
ように二次培養した。抗原は、室温で約１分間ドデシル
硫酸ナトリウム（10％）で抽出した。

【００５１】ポリマー抗体試薬は、ヨーロッパ特許公開
第 323,692号公報の教示に準じて製造したポリ〔スチレ
ン−コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチ
ル）スチレン〕（モル比、96：４）にＢ・インターメデ
ィウスの各血清型に対するそれぞれ同量の抗体類を共有
結合することによって調製した。共有結合は、試験管中
のホウ酸緩衝剤(659μｌ，0.05モル濃度、pH8.５）溶液
に前記抗体類（リン酸緩衝溶液67μｌ中56.5μｇ）を添
加し、次いでよく混合することによって達成した。この
抗体組成物にポリマー粒子（固体 13.15％含有懸濁液 2
28μｌ）を加え、得られた懸濁液を室温で14〜24時間回
転してその粒子に抗体を共有結合した。次に、この懸濁
液を10分間 2800rpmで遠心した。上清を廃棄し、マーシ
オレート (0.01％) 含有グリシン緩衝液（１ml，0.01モ
ル濃度、pH8.５）にペレットを懸濁した。この操作を２
度繰り返した。

【００５２】最終的な抗体／粒状試薬は、グリシン緩衝
液（0.１モル濃度、pH8.５）中抗体／粒状試薬（１
％）、ポリアクリルアミドバインダー（５％）およびマ
ーシオレート防腐剤（0.01％) を含めた。次に、この試
薬組成物（２μｌ）を試験デバイスのLoProdyne(商標)
ナイロン微孔質膜に適用し、そして乾燥してこの発明の
製品を形成した。

【００５３】酵素−抗体結合体は、 Yoshitakeら (Eur.
J.Biochem., 101, 395ページ、1979) の方法により血清
型Ａ，ＢおよびＣ画分のIgG を、それぞれワサビペルオ
キシダーゼに結合することによって調製した。この結合
組成物は、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
緩衝液（0.１モル濃度、pH7.５）中結合体（１ml当たり
それぞれ５μｇ）、カゼイン（0.５％）およびマーシオ
レート（0.01％) を含めた。洗液は、水中ドデシル硫酸
ナトリウム (18ｇ／ｌ）を含めた。

【００５４】アッセイ Ｂ・インターメディウスの血清型Ａ，ＢおよびＣに由来
する抗原を含有する抽出抗原（50μｌ）を、膜上にポリ
マー−抗体試薬を含有する上記試験デバイスの試験ウェ
ルに加えた。負対照として各デバイスの試験ウェルの１
つにドデシル硫酸ナトリウム溶液（10％) を加えた。

【００５５】結合組成物 (50μｌ）を加え、試験デバイ
スを５分間室温（18〜25℃) でインキュベーションし
た。この試験ウェルに洗液(240μｌ）を２度加えた。色
素生成組成物（50μｌ）を加え、試験デバイスを２分間
室温でインキュベーションした。膜上に形成した色素を
視覚的に読み取り、反射濃度値を示す検量カラーチャー
トと比較し、次いでWilliams−Clapper 変換 (J.Opt.So
c.Amer., 43, 595ページ、1953) を用いて透過率濃度
（Ｄ_T ）に変換した。

【００５６】アッセイの結果を、絶対Ｄ_T 対絶対細胞濃
度の対数として図１にプロットした。これらは、良好な
感度でＢ・インターメディウスの３種すべての血清型の
検出にこの発明が有用であることを示す。検出限界は約
10⁴細胞であった。

【００５７】例２ Ｂ・インターメディウスに対するア
ッセイで交差反応性の影響を示す比較例 この例は、Ｂ・インターメディウスを検出するためのサ
ンドイッチアッセイを用いるこの発明の実施例と直接バ
インディングアッセイに対するＢ・ロエシェイ(B. loe
scheii)による交差反応性を評価する。直接バインディ
ングアッセイは対照法と称する。

【００５８】サンドイッチアッセイ Ｂ・インターメディウス（上述）およびＢ・ロエシェイ
(ATCC 15930)に相当する細菌株は、H.S.Reynolds (上
述) より入手し、上述したように培養して増殖した。サ
ンドイッチアッセイを例１に記載した方法によって行な
い、Ｂ・ロエシェイを検出した。

【００５９】アッセイの結果を、絶対Ｄ_T 対細胞数の対
数としてグラフにプロットしたものを図２に示す。この
プロットはこの発明の方法でＢ・ロエシェイが検出でき
ないことを示す。従って、Ｂ・インターメディウスに対
してこの微生物による交差反応性は観察されなかった。

【００６０】対照直接バインディングアッセイ Surecell (商標) 使い捨て試験デバイスをこのアッセイ
でも使用した。試験ウェル中に５μｍのBiodyne(商標)
(PallCorp.) 膜を設置し、これらの膜はZonyl(商標) Ｆ
ＳＮ非イオン界面活性剤（0.05ｇ／ｍ²)を塗布した。

【００６１】洗液は、３−シクロヘキシルアミノ−２−
ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（0.05モル濃度)
、Emcol(商標) CC−９カチオン界面活性剤（0.75％, W
itcoChemical Co.) およびマーシオレート (0.01％) を
含めた。細菌抗原の懸濁液は、リン酸緩衝溶液で調製し
た。他のすべての材料はサンドイッチアッセイで使用し
たものと同じであった。

【００６２】試験デバイスの試験ウェルにＢ・インター
メディウスおよびＢ・ロエシェイの両菌株由来の抗原を
含有する抽出抗原溶液（50μｌ）を加え、膜上にバイン
ディングさせた。負対照を示すものとして各デバイスの
試験ウェルの１つにリン酸緩衝溶液を加えた。

【００６３】試験ウェルすべてに結合体溶液 (50μｌ）
を加え、この試験デバイスを５分間室温でインキュベー
ションした。これらの試験ウェルに洗液(240μｌ）を２
度加え、次いで色素生成組成物（50μｌ）を加えた。２
分間室温でインキュベーションした後、膜上の色素を視
覚的に観察し、例１に記載したように透過率濃度に変換
した。この対照法の結果を図３に示す。これからは、Ｂ
・インターメディウス抗体とＢ・ロエシェイ抗原の間
で、特に高い抗原濃度において、相当な交差反応が起こ
ることが明らかである。

【００６４】例３ サンドイッチアッセイによる血清型
の分別 この例は、この発明が単一の使い捨て試験デバイスを用
いて微生物Ｂ・インターメディウスの複数の血清型をど
のように分別できるかを例示するものである。材料および方法 Ｂ・インターメディウスの血清型Ａ，ＢおよびＣに対す
るポリクローナル抗体は、例１に記載したのと同様に調
製した。

【００６５】ポリマー−抗体試薬は、血清型ＢおよびＣ
を用いて例１に記載したように調製した。血清型Ｂの抗
体（２μｌ）を含有する試薬を、例２のサンドイッチア
ッセイについて記載した試験デバイスのウェルに加え
た。血清型Ｃの抗体（２μｌ）を含有する試薬を、例２
で記載した直接バインディングアッセイで使用したよう
な試験デバイスの試験ウェルに加えた。

【００６６】酵素−抗体結合体は、血清型ＢおよびＣの
抗体から、例１に記載した Yoshitakeらの方法を用いワ
サビペルオキシダーゼへの結合によって調製した。各結
合組成物は、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸緩衝液（0.１モル濃度、pH7.５）中前記結合体（溶液
１ml当たりそれぞれの抗体９μｇ）、カゼイン（0.５
％）およびマーシオレート（0.01％) を含めた。血清型
Ａ，ＢおよびＣに対応する細菌株を室温で約１分間ドデ
シル硫酸ナトリウム（0.05％) を用いて抽出した。

【００６７】アッセイ Ａ部 血清型Ｂのポリマー−抗体試薬を含有する試験デバイス
のウェルに血清型Ａ，ＢおよびＣ由来の抗原を含有する
抽出抗原溶液を加えた。負対照として各デバイスの試験
ウェルの１つにドデシル硫酸ナトリウム（0.05％) を入
れた。血清型Ｂに対する抗体を含有する前記結合組成物
（50μｌ）をそれぞれの試験ウェルに加え、このデバイ
スを５分間室温でインキュベーションした。これらの試
験ウェルに洗液(240μｌ）を２度加え、次いで色素生成
組成物（50μｌ）を加えた。２分間室温でインキュベー
ションした後、膜上の色素を視覚的に評価し、上述した
ように透過率濃度に変換した。結果を図４に示すがこの
図は、この発明のサンドイッチアッセイでは血清型Ｂの
抗体に血清型Ｂの抗原が特異的であることを示す。

【００６８】Ｂ部 上記サンドイッチアッセイをＢ・インターメディウスの
血清型Ｃに対する抗体を担持するポリマー−抗体試薬を
用いて繰り返した。結果を図５に示すが、この図は、こ
の発明のサンドイッチアッセイでは血清型Ｃの抗体が血
清型ＡとＣの両方の抗原の検出に使用できることを示
す。

【００６９】例４ アクチノバシラス・アクチノマイセ
テムコミタンスの３種すべての血清型に対する比較アッ
セイ この例は、サンドイッチアッセイによる生物学的被検体
中のＡ・アクチノマイセテムコミタンスの３種すべての
血清型の測定についてこの発明の方法をより具体的に説
明する。また、このアッセイによれば、このアッセイの
抗体がヘモフィラス・パラフロフィラス(Haemophilus
paraphrophilus) およびヘモフィラス・パラインフルエ
ンザ(Haemophilus parainfluenza)と高い交差反応性を
示す直接バインディングアッセイより遙かに低いそれら
のヘモフィラス菌との交差反応性を示す。

【００７０】サンドイッチアッセイ用の材料および方法 Surecell (商標) 使い捨て試験デバイスおよび色素生成
組成物は例１のものと同じであった。Ａ・アクチノマイ
セテムコミタンスの血清型Ａ（株75として同定されてい
る、ATCC 43717) に対する抗血清は、J.J.Zambonおよび
H.S.Reynolds博士(SUNY, Baffalo, New York School of
Dentistry) から入手した。ATCCはアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(American Type Culture C
ollection)(Rockville, Maryland) を示す。 IgG画分を
硫酸アンモニウム沈殿によって調製し、ヨーロッパ特許
公開第 323,692号公報の教示に従って製造したポリ〔ス
チレン−コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメ
チル）スチレン〕（モル比、94：４）に共有結合した。
共有結合は、試験管内のホウ酸緩衝液(659μｌ，0.05モ
ル濃度、pH8.５）に血清型Ａに対する抗体類（リン酸緩
衝溶液67μｌ中56.5μｇ）を添加し、次いでよく混合し
て行った。このポリマー粒子（固体 13.15％含有懸濁
液）を前記抗体組成物に加え、得られた懸濁液を室温で
14〜24時間回転して粒子に抗体類を共有結合した。次
に、この懸濁液を10分間 2800rpmで遠心した。上清を廃
棄し、ペレットをマーシオレート（0.01％) 含有グリシ
ン緩衝液（１ml，0.01モル濃度、pH8.５）に懸濁した。
この操作を２度繰り返した。

【００７１】最終抗体／粒状試薬組成物は、グリシン緩
衝液（0.１モル濃度、pH8.５）中抗体／粒状試薬（１
％）、ポリアクリルアミドバインダー（５％）およびマ
ーシオレート防腐剤（0.01％) を含めた。次に、試験デ
バイス中のLoProdyne(商標) ナイロン微孔質膜のある領
域に適用し、乾燥してこの発明の製品を作製した。

【００７２】酵素−抗体結合体は、 Yoshitakeら (Eur.
J.Biochem., 101, 395ページ、1979) の方法によって血
清型Ａの IgG画分をワサビペルオキシダーゼに結合する
ことによって調製した。この結合体組成物は、３−（Ｎ
−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（0.１モル濃
度、pH7.５）中、前記結合体（2.５μｇ／ml）、カゼイ
ン（0.５％）およびマーシオレート（0.01％) を含め
た。洗液は、水中デシル硫酸ナトリウム（18ｇ／ｌ）を
含めた。

【００７３】Ａ・アクチノマイセテムコミタンスの血清
型Ａに対応する細菌株75、ヘモフィラス・パラフロフィ
ラス(ATCC 29241)およびヘモフィラス・パラインフルエ
ンザ(NCTC 9796) はJ.J.ZambonおよびH.S.Reynolds博士
(SUNY, Buffalo School of Dentistry) より入手し、Za
mbonら (Infect.Immun. 41(1), 19 〜27ページ、1983)
に記載されているように培養した。室温で約１分間かけ
てドデシル硫酸ナトリウム（0.05％) で前記の各菌株か
ら抗原を抽出した。NCTCは、ナショナル・コレクション
・オブ・タイプ・カルチャーズ(National Collection o
f Type Cultures)(London)を表示する。

【００７４】直接バインディングアッセイ用の材料およ
び方法 Zonyl(商標) ＦＳＮ非イオン界面活性剤（0.05ｇ／ｍ²)
を塗布した５μｍのBiodyne(商標) ナイロン微孔質膜(P
all Corp.)を含ましたSurecell (商標) 使い捨て試験デ
バイスを使用した。洗液は、３−クロロヘキシルアミノ
−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸緩衝液（0.
05モル濃度) 中Emcol(商標) CC−９カチオン界面活性剤
（0.75％,Witco Chemical Co.) およびマーシオレート
(0.01％) を含めた。この溶液のpHを、水酸化ナトリウ
ム (0.05規定) の添加によって10まで上昇させた。

【００７５】Ａ・アクチノマイセテムコミタンス、ヘモ
フィラス・パラフロフィラスおよびヘモフィラス・パラ
インフルエンザに対する細菌抗原の懸濁液をリン酸緩衝
溶液として調製した。

【００７６】サンドイッチアッセイ ヘモフィラス・パラフロフィラス、ヘモフィラス・パラ
インフルエンザおよびＡ・アクチノマイセテムコミタン
スに由来する抗原を含有する抽出抗原溶液（50μｌ）
を、前記膜上の血清型Ａの抗体−粒状試薬を含む試験デ
バイスの別個の試験ウェルに加えた。ドデシル硫酸ナト
リウム（50μｌ, 0.05％) を負対照として対照ウェルに
加えた。

【００７７】前記結合組成物 (50μｌ) を加え、そして
この試験デバイスを５分間室温でインキュベーションし
た。洗液(240μｌ) を前記試験ウェルにおける膜上の試
薬の先端に２度加えた。色素生成組成物（50μｌ）を加
え、そしてこれらの試験デバイスを室温で約２分間イン
キュベーションした。膜上に形成した色素を視覚的に観
察し、反射濃度値を示す検量カラーチャートと比較し、
次いでWilliams−Clapper 変換 (J.Opt.Soc. Amer., 4
3, 595ページ、1953) を用いて透過率濃度（Ｄ _T ）に
変換した。アッセイの結果は、絶対Ｄ_T 対絶対細胞濃度
の対数として図６のグラフにプロットした。これらは、
Ａ・アクチノマイセテムコミタンスに対する抗体が対象
にしたヘモフィラス種のいずれとも交差反応性をほとん
ど示さないことを明らかにする。

【００７８】対照直接バインディングアッセイ 前記３種の微生物の抗原を含有する抽出抗原溶液（50μ
ｌ）を、別個の使い捨て試験デバイスの試験ウェルに加
え、試験ウェルの膜にバインディングさせた。リン酸緩
衝溶液を、負対照として使用する特定の試験ウェルに加
えた。

【００７９】前記結合体溶液 (50μｌ) をそれぞれのデ
バイスの試験ウェルすべてに加え、次いで５分間室温で
インキュベーションした。洗液(240μｌ) を２度それら
の試験ウェルに加え、次いで色素生成組成物（50μｌ）
を加えた。２分間室温でインキュベーションした後、膜
上に形成した色素を視覚的に観察し、前記サンドイッチ
アッセイについて記載したようにＤ_T へ変換した。絶対
Ｄ_T 対絶対細胞濃度の対数をプロットした結果を図７に
示す。これらは、両ヘモフィラス種とも、特に高い細胞
濃度で相当の交差反応が起こることを示す。

【００８０】例５ サンドイッチアッセイによる血清型
の分別 この例は、この発明の実施により単一の使い捨て試験デ
バイスでアクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタ
ンスの血清型間の分別ができることを例示する。血清型
Ａの抗体を用いて血清型Ａの抗原と血清型Ｂの抗原と血
清型Ｃの抗原との間の分別が可能である。血清型Ｂの抗
体を使用して血清型Ａの抗原に対する血清型ＢおよびＣ
の抗原間の分別ができる。

【００８１】材料および方法 Surecell (商標) 試験デバイスおよび抗体−粒状試薬
は、例４（サンドイッチアッセイ）で調製しそして使用
したのと同様のものを使用した。酵素−抗体結合体は、
例１の方法に準じて血清型ＡおよびＢの抗体から調製し
た。他のすべての組成物は例４のものと同様である。

【００８２】アッセイ 血清型ＡおよびＢ（各２μｌ）のそれぞれに対する抗体
−粒状試薬を、別個のSurecell (商標) 試験デバイスに
加えた。血清型Ａ，ＢおよびＣ由来の抗原を、サンドイ
ッチアッセイについて例４に記載したように抽出し、こ
れらの溶液（50μｌ) を試験デバイスのすべてのウェル
に加えた。ドデシル硫酸ナトリウム（0.05％溶液50μ
ｌ) を負対照として特定の試験ウェルに加えた。

【００８３】血清型Ａに対する酵素−抗体結合体（50μ
ｌ) を血清型Ａの抗体−粒状試薬を含有する試験デバイ
スに加え、そして血清型Ｂに対する結合体（50μｌ）を
血清型Ｂの抗体−粒状試薬を含有する別の試験デバイス
に加えた。次に、すべての試験デバイスを５分間室温で
インキュベーションした。洗液(240μｌ）を各試験ウェ
ルに２度加え、次いで色素生成組成物（50μｌ）を加え
た。室温で２分間インキュベーションした後、膜上に形
成した色素を視覚的に観察し、次いで例４に記載したよ
うにＤ_T に変換した。

【００８４】細胞濃度の対数に対する試料と負対照ウェ
ル間の差（Δ）のプロットとして結果を図８に示す。図
９は、絶対Ｄ_T を絶対細胞濃度の対数に対してプロット
したものである。図８の結果は、血清型Ａの抗体を使用
してＡ・アクチノマイセテムコミタンスの血清型Ｂまた
はＣいずれかの抗原から血清型Ａの抗原を約10³ 〜約10
⁵ 細胞の範囲で分別できることを示す。図９の結果は、
血清型Ｂの抗体を使用して血清型Ａの抗原から血清型Ｂ
およびＣの抗原を約10³ 〜約10⁶ 細胞の範囲内で分別で
きることを示す。

【００８５】例６ バクテロイデス・ギンギバリスの３
種すべての血清型に対するサンドイッチアッセイ この例は、サンドイッチアッセイによって生物学的被検
体中のバクテロイデス・ギンギバリスの３種すべての血
清型を測定するこの発明の方法の具体的な説明である。材料 Surecell (商標) 使い捨て試験デバイスおよび色素生成
組成物は例１で用いたものと同じである。

【００８６】バクテロイデス・ギンギバリスの３種の血
清型（血清型Ａ，ATCC 33277；血清型Ｂ，ATCC 53978お
よび血清型Ｃ，ATCC 53977) に対するポリクローナル抗
血清は、上述したようにウサギへの静脈内注射によって
得た。 IgG画分を硫酸アンモニウム沈殿で調製し、少量
については４℃でまたは多量については−70℃における
リン酸緩衝溶液（0.３〜0.４％）中に保存した。

【００８７】抗血清を産生するのに用いた細菌株は、生
きた培養物としてH.S.Reynolds(School of Dentistry,
SUNY, Buffalo, New York)より入手した。分離し、そし
て上述したように嫌気性プレート上で二次培養した。前
記の抗原類は室温（約18〜25℃) 中１分間ドデシル硫酸
ナトリウム（10％)で抽出した。

【００８８】ポリマー−抗体試薬類は、バクテロイデス
・ギンギバリスの各血清型に対する抗体類の同量をヨー
ロッパ特許公開第323692号公報の教示に準じて製造した
ポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスル
ホニルメチル）スチレン〕（モル比、96：４）のポリマ
ー粒子に共有結合した。共有結合は、試験管中のホウ酸
緩衝液(659μｌ, 0.05モル濃度、pH8.５）に前記抗体類
（リン酸緩衝溶液67μｌ中56.5μｇ）を加え、次いでよ
く混合して行った。このポリマー粒子（固体 13.15％含
有懸濁液 228μｌ) を前記抗体組成物に加え、得られた
懸濁液を室温で14〜24時間回転させて粒子に抗体類を共
有結合した。次に、この懸濁液を10分間2800rpmで遠心
した。上清を廃棄し、ペレットをマーシオレート防腐剤
(0.01％) を含有グリシン緩衝液 (１ml，0.01モル濃
度、pH8.５）に懸濁した。この操作を２度繰り返した。

【００８９】抗体−粒状試薬組成物は、グリシン緩衝液
（0.１モル濃度、pH8.５）中抗体／粒状試薬（１％）、
ポリアクリルアミドバインダー（５％）およびマーシオ
レート（0.01％) を含めた。次に、この試薬組成物（２
μｌ）を試験デバイスにおけるLoProdyne(商標) ナイロ
ン微孔質膜のある領域に適用し、次いで乾燥してこの発
明の製品を作製した。

【００９０】酵素−抗体結合体は、血清型Ａ，Ｂおよび
Ｃ画分に由来する抗体類を、 Yoshitakeら (Eur.J.Bioc
hem., 101, 395ページ、1979) の方法でワサビペルオキ
シダーゼに結合させて調製した。この結合体組成物は、
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（0.
１モル濃度、pH7.５）中前記結合体（１ml当たり各５μ
ｌ）、カゼイン（0.５％）およびマーシオレート（0.01
％) を含めた。洗浄は水中ドデシル硫酸ナトリウム(18
ｇ／ｌ）を含めた。

【００９１】アッセイ バクテロイデス・ギンギバリスの血清型Ａ，ＢおよびＣ
由来の抗原を含有する抽出抗原溶液（50μｌ）を、膜上
にポリマー抗体試薬を担持する上記試験デバイスの試験
ウェルに加えた。ドデシル硫酸ナトリウムを各デバイス
の１つのウェルに加えて負対照とした。

【００９２】前記結合体組成物 (50μｌ) を加え、この
試験デバイスを５分間室温でインキュベーションした。
洗液(240μｌ) をこれらの試験ウェルに２度加えた。次
に、色素生成組成物（50μｌ）を加え、これらの試験デ
バイスを２分間室温でインキュベーションした。膜上に
形成した色素を視覚的に読み取って、反射濃度を示す検
量カラーチャートと比較し、次いでWilliams−Clapper
変換 (J.Opt.Soc.Amer., 43, 595ページ、1953) によ
って透過率濃度（Ｄ_T ) に変換した。

【００９３】アッセイの結果は、絶対Ｄ_T 対絶対細胞濃
度の対数として図10にプロットした。これらは、この発
明の方法がバクテロイデス（プロフィロモナス）ギンギ
バリスの３種すべての血清型の検出にすぐれた感度で利
用できることを示す。検出限界は約 10⁴細胞である。

【００９４】例７ 低い交差反応性を示すバクテロイデ
ス・ギンギバリス用サンドイッチアッセイ この例は、この発明の方法がＢ・ギンギバリス以外の種
を検出しないことを具体的に説明する。言い換れば他の
バクテロイデス種のものと交差反応性がないことを意味
する。材料およびアッセイは、例６に記載したものと実
質的に同一であった。細菌株Ｂ・ロエシェイ (B. loes
cheii)(ATCC 15930)、Ｂ・アサッカロリティカス (B. as
accharolyticus)(ATCC 25260) およびＢ・インターメデ
ィウス（B. intermedius)(ATCC25611)は、例６の微生
物について記載したのと同様に二次培養しそして抽出し
た。

【００９５】これらの微生物から抽出した抗原溶液 (50
μｌ) を、試験ウェルにおける膜上の例６に記載したよ
うな粒状抗体試薬（すなわち、Ｂ・ギンギバリスの３種
すべての血清型に対する抗体を担持）を含む個別の試験
デバイスに加えた。ドデシル硫酸ナトリウム（10％) を
負対照として使用した。

【００９６】ペルオキシダーゼで標識したＢ・ギンギバ
リスの抗体類を色素生成組成物を加えて、膜上に何等か
の複合体が形成するか否かを観察した。結果は、抗原濃
度 10⁷細胞までは反応が起こらないことを示した。逆
に、Ｂ・ギンギバリス抗原を用いて例６を繰り返したと
ころ反応が起った。

【００９７】

【発明の効果】この発明は、歯周の生物学的被検体にお
ける微生物Ｂ・インターメディウス、Ｂ・ギンギバリス
またはＡ・アクチノマイセテムコミタンスいずれかの血
清型すべてまたはそのいずれかを検出するための迅速か
つ感度のよい方法を提供する。この方法は、開業医が患
者の歯周処置の必要性を迅速に判断できるように数分以
内に最終結果を提供する。さらに、血清型Ａと血清型Ｃ
の抗体の間ではある程度の交差反応性が見られるもの
の、一般的に、各微生物の３種の血清型Ａ，ＢおよびＣ
の各々をこの発明の単一試験デバイスで分別することが
できる。

【００９８】最も重要なことは、Ｂ・インターメディウ
スまたはＢ・ギンギバリスのいずれかに対するこの発明
のアッセイは類似のバクテロイデス微生物〔例えば、Ｂ
・オラリス（B. oralis) 、Ｂ・アサッカロリティカス
（B. asaccharoliticus) またはＢ・ロエシェイ（B.
loescheii)〕との交差反応性が極めて小さいことであ
る。従って、このアッセイの選択性は他のアッセイ（例
えば、直接バインディングアッセイ）のそれより著しく
すぐれている。選択性におけるこの改良は、通常、従来
技術が必要とするような試験検体からの交差反応性抗体
類を除去することなく達成できる。そのため、最大感度
がアッセイの特異性を犠牲にすることなく維持される。

【００９９】さらに、この発明は、歯周の生物学的被検
体における微生物Ａ・アクチノマイセテムコミタンスの
血清型すべてまたはそのいずれかを検出するための迅速
かつ感度のよい方法を提供する。この発明のアッセイ
は、類似のヘモフィラス微生物と最小の交差反応性を示
すので、アッセイの感度は直接バインディングアッセイ
を遙かに陵駕する選択性を有する。同様に重要な点は、
この発明の方法が直接バインディングアッセイよりも遙
かに低い細胞濃度を検出できる程感度が高いため、早期
の予防的歯科上の管理が可能になることである。

【０１００】これらの利点は、アッセイ感度を犠牲にす
ることなく相当な選択性の改良を伴う抽出抗原の検出を
するための前記サンドイッチアッセイによって達成され
る。さらに、このアッセイは複合体形成用の抽出抗原に
対する不溶性抗体を付着した微孔質膜を用いて実施され
る。この膜は、得られた免疫複合体をアッセイにおいて
望ましくない細胞残屑および未複合体化物質から分離す
るのにも使用される。血清型の分別では、この膜が分離
シグナルの存在または不存在が血清型の分別に使用でき
るように適切な対応する抗体類を別個の領域に付着する
こともできる。

【０１０１】この発明で使用する水不溶性試薬は、従来
技術（例えば、ヨーロッパ特許公開第 200,381号および
国際公開第87／03690 号公報、参照）に教示するように
膜の細孔内に埋没していない。埋没した試薬を用いて実
施するアッセイは、得られた複合体が細孔マトリックス
によって検出試薬から妨げられるので、一般に感度が低
い。改良された感度と検出性は成功する商品にとって極
めて重要であり、この発明のように微孔質表面上に試薬
を実質的に置くことがこれらの望ましい結果を提供す
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】サンドイッチアッセイによりＢ・インターメデ
ィウスの血清型すべてを同時に検出したものについて細
胞数の対数に対し絶対透過率濃度（Ｄ_T ) をプロットし
たグラフである（詳細は例１に記載されている）。

【図２】Ｂ・ロエシェイの抗原とＢ・インターメディウ
スに向けた抗体との交差反応性を示す目的でサンドイッ
チアッセイにおける細胞数の対数に対し絶対透過率濃度
（Ｄ_T ) をプロットしたグラフである（詳細は例２に記
載されている）。

【図３】Ｂ・ロエシェイの抗原とＢ・インターメディウ
スに向けた抗体との交差反応性を示す直接バインディン
グアッセイにおける細胞数の対数に対し絶対透過率濃度
（Ｄ_T ) をプロットしたグラフである（例２の対照アッ
セイを示す）。

【図４】サンドイッチアッセイによりＢ・インターメデ
ィウスの血清型Ａ，ＢおよびＣ抗原を検出する目的でＢ
・インターメディウスに対する血清型Ｂの抗体の使用に
ついて、細胞数の対数に対し絶対透過率濃度（Ｄ_T ) を
プロットしたグラフである（詳細は例３に記載されてい
る）。

【図５】サンドイッチアッセイによりＢ・インターメデ
ィウスの血清型ＡおよびＣの抗原を検出する目的でＢ・
インターメディウスに対する血清型Ｃの抗体の使用につ
いて、細胞数の対数に対し絶対透過率濃度（Ｄ_T ) をプ
ロットしたグラフである（詳細は例３に記載されてい
る）。

【図６】Ａ・アクチノマイセテムコミタンスの検出につ
いてこの発明のサンドイッチアッセイで得られたデータ
を示す絶対細胞濃度の対数に対し絶対透過率濃度
（Ｄ_T ) をプロットしたグラフである（このプロットは
例４を参照のこと）。

【図７】例４で比較対照として示したＡ・アクチノマイ
セテムコミタンスについて直接バインディングアッセイ
で得られたデータを示す絶対細胞濃度の対数に対し絶対
透過率濃度（Ｄ_T ) をプロットしたグラフである。

【図８】Ａ・アクチノマイセテムコミタンスについてこ
の発明のサンドイッチアッセイで得られたデータを示す
細胞数の対数に対し絶対透過率濃度（Ｄ_T ) をプロット
したグラフである（これらのプロットは例５を参照のこ
と）。

【図９】図８と同様のデータについて同様にプロットし
たグラフである（これらのプロットは例５を参照のこ
と）。

【図10】サンドイッチアッセイによりＢ・ギンギバリス
の３種すべての血清型を検出る目的で絶対細胞濃度の対
数に対し絶対透過率濃度（Ｄ_T )をプロットしたグラフ
である（これらのデータは例６を参照のこと）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨゼフ ジエイムズ ザムボン アメリカ合衆国，ニユーヨーク 14221， アムハースト，プレジデンツ ウオーク 133 (72)発明者 ジヨン ゲイリー フイツシヤー アメリカ合衆国，ニユーヨーク 14226， アムハースト，コロネイシヨン ドライブ 256 (72)発明者 ポール バーナード コンテスタブル アメリカ合衆国，ニユーヨーク 14624， ロチエスター，ロイヤリスト アベニユ 26 (72)発明者 ホーマー スタンリー レイノルズ アメリカ合衆国，ニユーヨーク 14150， トナワンダ，ノース ブライアー 168 (72)発明者 エリザベス アン グロガン アメリカ合衆国，ニユーヨーク 14624， ロチエスター，ブルツクビユー ロード 22

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物バクテロイデス・インターメディ
   ウス(Bacteroides intermedius)、バクテロイデス・ギ
   ンギバリス(Bacteroides gingivalis) またはアクチノ
   バシラス・アクチノマイセテムコミタンス (Actinobaci
   llus actinomycetemcomitans)いずれかの血清型１種以
   上を測定する方法であって、 Ａ．微生物バクテロイデス・インターメディウス、バク
   テロイデス・ギンギバリスまたはアクチノバシラス・ア
   クチノマイセテムコミタンスいずれかの血清型１種以上
   から抽出した抗原を含有することが疑われる水性被検体
   を、その抗原に対する抗体を付着した水不溶性粒子を含
   んでなる水不溶性試薬の実質的にすべてを表面上に付着
   して担持する微孔質膜と接触して、前記膜上で前記抗体
   類と前記被検体中に存在する抽出抗原との間の水不溶性
   免疫複合体を形成する工程、 Ｂ．工程Ａの接触と同時またはその前後に、前記抽出抗
   原をその抗原に対する検出可能に標識した水溶性抗体と
   接触して、前記膜上に前記標識抗体および水不溶性抗体
   の両方と前記被検体中の抽出抗原との標識水不溶性免疫
   複合体を形成する工程、 Ｃ．工程Ｂの接触と同時またはその後に、前記微孔質膜
   を通して未複合体化物質を洗浄することによりその未複
   合体化物質から前記標識水不溶性複合体を分離する工
   程、ならびに Ｄ．前記被検体中の前記抗原の存在の指標として前記膜
   上の標識複合体を検出する工程、を含んでなる方法。
2. 【請求項２】 微生物バクテロイデス・インターメディ
   ウス、バクテロイデス・ギンギバリスまたはアクチノバ
   シラス・アクチノマイセテムコミタンスいずれかの１種
   以上の血清型少なくとも１種に向けた抗体を付着した水
   不溶性粒子を含んでなる水不溶性試薬の実質的にすべて
   を表面上に付着して担持する微孔質膜からなる水不溶性
   製品。
3. 【請求項３】 微生物バクテロイデス・インターメディ
   ウス、バクテロイデス・ギンギバリスまたはアクチノバ
   シラス・アクチノマイセテムコミタンスいずれかの１種
   以上の血清型少なくとも１種に向けた抗体を付着した水
   不溶性粒子を含んでなる水不溶性試薬の実質的にすべて
   を表面上に付着して担持する微孔質膜からなる水不溶性
   製品を含む微生物バクテロイデス・インターメディウ
   ス、バクテロイデス・ギンギバリスまたはアクチノバシ
   ラス・アクチノマイセテムコミタンスいずれかの血清型
   １種以上を検出するための試験キット。